KR100742115B1 - 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법 - Google Patents
조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조피볼락의 뇌하수체를 채취하여 조피볼락 황체형성호르몬을 정제하고, 상기 조피볼락 황체형성호르몬의 서브 유니트인 당단백질성 알파(GPα) 및 황체형성호르몬 베타(LHβ)를 분리 후 각각에 대한 다클론 항체을 얻은 다음, 황체형성호르몬 베타(LHβ)에 대한 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성 성숙도를 판정하도록 함으로써 국내 주요 양식대상 어종인 볼락류의 중요한 성 성숙을 진단할 수 있는 목적으로 이용할 수 있을 뿐 아니라, 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 국내연안의 내분비계장애물질로 인한 생식내분비계에 미치는 환경영향평가를 보다 경제적이며, 또한 정확하고 간편하게 조기에 진단할 수 있도록 하는 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법에 관한 것이다.
본 발명은 조피볼락(rockfish:RF)의 뇌하수체를 채취 후 정제하여 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 얻고, 상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)를 분리 후 각각에 대한 다클론 항체을 얻고, 상기 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성숙도를 판정하도록 하는 것에 특징이 있다.
조피볼락, 황체형성호르몬, 다클론 항체, 효소면역측정계, 성숙도
Description
도 1은 본 발명에 다른 조피볼락의 황체형성호르몬 정제과정도.
도 2는 본 발명의 실시예에 있어 조피볼락 뇌하수체를 추출하여 단백질정제장치에 연결된 겔 크로마토그래피 컬럼에 0.05몰 암모니움 아세테이트로 용출한 분취물(S3)이 조피볼락 황체형성호르몬을 함유한 피크 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어 분취물(S3)을 단백질정제장치에 연결된 음이온 크로마토그래피 컬럼에 암모니움 아세테이트 농도를 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 몰로 단계적으로 높이면서 용출한 분취물(S3DE5)이 조피볼락 황체형성호르몬(GPα 및 LHβ)의 두 서브 유니트가 이량체로 결합된 상태의 피크 그래프.
도 4는 본 발명의 실시예에 있어 분취물(S3DE5)을 동결건조 및 TFA로 처리한 후, 역상 HPLC에 흡착시켜 아세트나이테르의 농도구배로 용출한 피크 그래프.
도 5는 본 발명의 실시예에 있어 분취물(S3DE5W9와 S3DE5W12)의 전기영동 및 웨스턴 부롯팅 사진.
도 6은 본 발명의 실시예에 있어 조피볼락 황체형성호르몬 β 서브 유니트 항체를 이용하여 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬 분비 세포의 분포 조사사진.
도 7은 본 발명의 실시예에 있어 개발된 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계로 혈액중 황체형성호르몬 농도를 정확히 측정되는지를 검증하기 위한 회수율 검증 그래프.
도 8은 본 발명의 실시예에 있어 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계에 있어서 표준품의 표준곡선과 성숙한 조피볼락 암컷 뇌하수체 추출물 및 동일 개체 혈장의 계배희석액과의 평행선 검정 그래프.
도 9는 본 발명의 실시예에 있어 생체내 실험을 통한 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계로 혈중 황체형성호르몬 농도를 측정 가능성 검증 그래프.
본 발명은 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 조피볼락(rockfish: 이하 'RF'로 병기(倂記)함)의 뇌하수체를 채취하여 조피볼락 황체형성호르몬(이하 'RF LH'라 함)을 정제하고, 이 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(Glycoprotein α: 이하 'RF GPα'라함) 및 황체형성호르몬 베타(Leuteinizing hormoneβ : 이하 'RF LHβ'라함)를 분리 후, 각각에 대한 다클론 항체을 얻은 다음, 상기 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)의 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성 성숙도를 판정하도록 함으로써 국내 주요 양식대상 어종인 볼락류의 중요한 성 성숙을 진단할 수 있는 목적으로 이용할 수 있을 뿐 아니라, 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 국내연안의 내분비계장애물질로 인한 생식내분비계에 미치는 환경영향평가를 보다 경제적이며, 또한 정확하고 간편하게 조기에 진단할 수 있도록 하는 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법에 관한 것이다.
일반적으로 어류의 생식선자극호르몬(gonadotropin hormone)(이하 'GTH'라함)은 타 척추동물과 마찬가지로 여포자극호르몬(follicle-stimulating hormone)(이하 'FSH'라함)과 황체형성호르몬(luteinizing hormone)(이하 'LH'라함)의 물리화학적 조성 및 내분비학적인 기능이 틀린 2종류의 호르몬으로 구성되어져 있으며, FSH는 주로 초기 난성숙 과정 때 분비되어 난모세포 성장에 작용하며 황체형성호르몬(LH)은 최종 성숙 및 배란에 주로 관여하는 것으로 알려져 있다.
또한, 척추동물 및 타 어종과 마찬가지로 조피볼락의 경우에서도 뇌하수체에서 생성·분비되는 황체형성호르몬은 물리화학적으로 공통의 α쇄와 특이적인 β쇄가 이형결합체로 구성된 당단백질성의 호르몬으로 양볼락과 어류의 성성숙·배란 및 임신 조절에 관여하는 가장 주된 호르몬이다.
조피볼락(rockfish:RF)(학명:Sebatis schelagilli)은 태생어류로 우리나라, 일본, 중국 연안에 서식하며, 국내에서는 수산자원증강을 위한 방류어 및 양식 어종으로써 종묘생산을 하고 있으나, 친어관리 차원에서 성숙도를 판정하기 어려운 어종이다.
특히 암수 구별이 어려운 어류에 있어서 이러한 성숙도를 판정하는 기준은 대부분 육안으로 의존하고 있으며, 이러한 기준은 개체 및 사람의 기준에 따라 많은 차이가 있음에 따라 이러한 단점을 보완하기 위해 보다 과학적으로 어류 성 성숙에 직접적으로 관여하는 황체형성호르몬(LH)의 양을 정확히 측정하는 것이 중요하다.
그리고 최근 환경오염지역에서 내분비계 장애물질에 대한 어류의 시상하부- 뇌하수체-생식소 축으로 연결되는 생식내분비계에 미치는 환경영향평가의 생물학적 지표로 이용되고 있다.
본 발명은 어류 성성숙에 관련된 생리·내분비적 리듬의 연구뿐만 아니라 사회적으로 문제가 되고 있는 내분비계 장애물질에 대한 환경영향평가의 생물학적 지표를 보다 간편하고 신속 정확하게 판정할 수 있는 검색기법을 확립하는 것을 기술적 과제로 한다.
본 발명은 본 발명은 조피볼락(rockfish:RF)의 뇌하수체를 채취 후 정제하여 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 얻고, 상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)를 분리 후 각각에 대한 다클론 항체을 얻고, 상기 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성숙도를 판정하도록 하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명에 따른 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법을 첨부된 도면에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.
1988년 일본 키사사토대학 카와우치(Kawauchi) 교수 그룹에서 세계 최초로 어류에서 타 척추동물과 마찬가지로 2종류의 생식선자극호르몬(GTH)인 여포자극호르몬(follicle-stimulating hormone;FSH)와 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)을 연어뇌하수체(동결건조중량 50g)에서 에탄올법에 의해 당단백질을 추출한 추 출물을 액체 크로마토그래피법 및 고압 액체크로마토그래피법에 의해 분리·정제하였다.
또한, 이들 호르몬에 대한 특이항체를 제작하여 방사선면역측정법 (radioimmunoassay)에 의한 혈중 농도계를 개발하여 이들이 서로 다른 내분비학적인 기능을 가지는 것을 밝혔다.
그러나 에탄올법에 의한 추출법은 당단백질을 추출하는 과정에서 다량의 뇌하수체를 필요로 하며, 또한 추출과정에서 많은 시간이 소요됨에 따라 당단백질의 변성 및 소실되는 경향이 있으므로 본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위해서 단백질 추출방법을 개선하였다.
따라서 조피볼락(RF)과 같은 어종의 해산어류는 뇌하수체 크기(연어 뇌하수체의 약 1/20 정도)도 작을 뿐만 아니라 어체 가격도 비싸 다량의 뇌하수체를 확보하기에 경제적인 뒷받침이 요구되는 실정이다.
또한, 지금까지 혈중 황체형성호르몬을 직접 정량 할 수 있는 다양한 진단법이 연구되어왔는데, 크게 방사선면역측정법(radioimmunoassay; RIA)과 효소면역측정법(enzymeimmunoassay; EIA)으로 나눌 수 있다.
첫 번째로 방사선면역측정법은 스즈키 등(Suzuki et a: 1990)에 의해 확립되어 무지개송어, 메기류, 참돔 등의 어류에서 사용되었으나 방사선 물질을 황체형성호르몬에 직접 표지하는 방법이 어렵고, 또한 방사선 측정 시설을 갖춘 한정된 공간에서 취급해야하는 단점을 가지고 있다.
두 번째로는 황체형성호르몬을 표지하지 않고 직접 혈중 황체형성호르몬을 측정할 수 있는 효소면역측정법을 들 수 있는데, 최근 국외 연구자에 의해 개발되어 농어에서 사용되고 있으며, 특히 효소면역측정법은 현장에서 특별한 시설 없이 측정이 가능할 뿐만 아니라, 진단 키트(KIT)로도 간단히 제작이 가능한 장점을 가지고 있다. 따라서 본 발명에서도 조피볼락의 성숙도를 판정하기 위한 측정법으로 황체형성호르몬에 대한 효소면역측정법 (EIA)을 개발하였다.
본 발명은 조피볼락(RF)의 뇌하수체를 채취하여 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 정제하고, 이 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)를 분리 후, 각각에 대한 다클론 항체을 얻은 다음, 상기 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)의 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성 성숙도를 판정하도록 하는 것으로, 먼저 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 정제하는 과정을 설명하면 다음과 같다.
성숙중인 조피볼락 뇌하수체(742마리, 동결건조 685㎎)를 채취하는 뇌하수체 채취단계(101)를 실행한 다음, 상기 채취된 뇌하수체를 0.2몰 암모니움 아세테이트(pH 6.1) 호모게나이져 후, 중력가속도 15,000g에서 30분간 원심 분리하여 침전물인 뇌하수체 호르몬을 얻는 뇌하수체 호르몬 추출단계(102)를 수행한다.
상기 뇌하수체 호르몬 추출단계(102)에서 얻어진 뇌하수체 호르몬을 단백질정제장치(FPLC)에 연결된 겔 크로마토그래피 컬럼(세파크릴-100, φ2.6 x70cm)에 용출용 0.05몰 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 버퍼로 정제하여 균질화 한 후, 유속 3㎖/200s/ tube로 용출하여 분취물(S3)을 얻는 겔 크로마토그래피법에 의한 정제단계(103)(도 2)를 수행한다.
상기 뇌하수체 호르몬 추출단계(102)에서 얻어진 뇌하수체 호르몬을 단백질정제장치(FPLC)에 연결된 겔 크로마토그래피 컬럼(세파크릴-100, φ2.6 x70cm)에 용출용 0.05몰 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 버퍼로 정제하여 균질화 한 후, 유속 3㎖/200s/ tube로 용출하여 분취물(S3)을 얻는 겔 크로마토그래피법에 의한 정제단계(103)(도 2)를 수행한다.
상기 겔 크로마토그래피법에 의한 정제단계(103)를 통해 얻어진 분취물(S3)을 전기영동으로 확인 후, 단백질정제장치(FPLC)에 연결된 음이온 크로마토그래피 컬럼(DE-52, φ10 x100mm)에 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 몰로 용출용 버퍼인 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 농도를 한 단계씩 증가시켜 각 농도별로 분취물(S3DE5)을 얻는 이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 정제단계(104)(도 3)를 수행하게 된다.
상기 이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 정제단계(104)의 수행이 완료되면 역상 고속액체크로마토그래피(rpHPLC)(Wakosil Ⅱ 5C18-HG, 0.46X25cm)컬럼에 흡착시켜 아세트나이테르의 농도구배를 만들어 용출하는 고속액체크로마토그래피 컬럼에 의한 고순도 정제단계(105)(도 4)를 수행함으로써 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH) 정제과정(100)을 완료하였다.
상기 이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 정제단계(104)를 통해 얻어진 분취물(S3DE5)을 명확한 검증 및 특이 항혈청을 제작하기 위해 기 보고된 조피볼락 황체형성호르몬의 각 서브 유니트 인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 뉴크레오타이드 결과에서 연역된 아미노산 서열 결과와 확인, 검증하기 위해 고압액체크로마토그래피(rpHPLC)법에 의한 RF GPα 및 RF LHβ 서브 유니트를 분리하였다.
다음은 상기 조피볼락의 황체형성호르몬 정제과정(100)을 통해 수득한 조피볼락의 황체형성호르몬을 전기영동법에 의한 정제물질의 검증과, 아미노산서열 분석기에 의한 정제물질의 검증과, 면역조직화학법에 의한 항체를 검증하는 조피볼락의 황체형성호르몬 검증과정을 수행하였다.
즉, 상기 고속액체크로마토그래피 컬럼에 의한 고순도 정제단계(105)를 통해 수득한 정제물을 역상 고속액체크로마토그래피의 피크들을 전기영동법으로 확인하는 전기영동법에 의한 정제물질의 검증을 수행한 다음, 피크 9번(S3DE5W9)과 12번(S3DE5W12)을 N-말단 아미노산 서열분석기를 통해 N-말단부터 9개 정도의 아미노산 서열을 밝히는 아미노산 서열 분석기에 의한 정제물질의 검증을 표 1에 나타낸 바와 같이 수행함으로써 아미노산 서열을 밝혔으며, 이것을 기 보고된 조피볼락 각 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 뉴크레오타이드 결과에서 연역된 아미노산 결과와 비교하여 확인, 검증하였다.
즉, 상기 고속액체크로마토그래피 컬럼에 의한 고순도 정제단계(105)를 통해 수득한 정제물을 역상 고속액체크로마토그래피의 피크들을 전기영동법으로 확인하는 전기영동법에 의한 정제물질의 검증을 수행한 다음, 피크 9번(S3DE5W9)과 12번(S3DE5W12)을 N-말단 아미노산 서열분석기를 통해 N-말단부터 9개 정도의 아미노산 서열을 밝히는 아미노산 서열 분석기에 의한 정제물질의 검증을 표 1에 나타낸 바와 같이 수행함으로써 아미노산 서열을 밝혔으며, 이것을 기 보고된 조피볼락 각 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 뉴크레오타이드 결과에서 연역된 아미노산 결과와 비교하여 확인, 검증하였다.
다음은 정제된 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 각 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 항체 특이성을 검증하기 위해 다클론 항체의 제작과정 및 웨스턴 이뮤노 부롯팅법과 면역조직화학법(Immunocytochemistry)에 의한 항체 검증을 수행하였다.
즉, 다클론 항체의 제작과정은 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 각 서브 유니트 인 당단백질성 알파(RF GPα:S3DE5W9) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ:S3DE5W12)에 대한 특이 항체를 만들기 위해 RF GPα 및 RF LHβ 50㎍를 제각기 동량의 프룬드 컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 두 마리의 뉴질랜드산 화이트 토끼의 임파선에 주사하여 면역시키는 제1정제품 면역단계를 실행한 후, 10일 간격으로 RF GPα 및 RF LHβ 50㎍와 동량의 프룬드 인컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 피하에 4회 주사하는 제2정제품 면역단계를 수행하였다.
상기 제2정제품 면역단계를 통해 조피볼락 황체형성호르몬(LH)의 서브 유니트 RF GPα 및 RF LHβ를 토끼에 4회 마지막 주사 후 면역 확인을 위하여 토끼 혈액으로부터 혈청을 분리하여 웨스턴 이뮤노 부롯팅법으로 항체 특이성을 조사하였다.
즉, 토끼의 경동맥을 절단하여 전 채혈하는 채혈단계를 수행한 다음, 채혈된 혈액을 4℃에서 16시간 동안 비등화 시킨 후, 중력가속도 10,000g에서 30분간 원심 분리하여 항혈청을 분리하는 항혈청분리단계를 수행하였으며, 분리된 각각의 항혈청은 1㎖씩 분주 및 동결 건조시킨 후, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
또한 면역조직화학법으로 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬(RF LH) 분비세포의 분포 구성을 통해 항체 특이성을 재확인하였다(도 6).
즉, 토끼의 경동맥을 절단하여 전 채혈하는 채혈단계를 수행한 다음, 채혈된 혈액을 4℃에서 16시간 동안 비등화 시킨 후, 중력가속도 10,000g에서 30분간 원심 분리하여 항혈청을 분리하는 항혈청분리단계를 수행하였으며, 분리된 각각의 항혈청은 1㎖씩 분주 및 동결 건조시킨 후, 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.
또한 면역조직화학법으로 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬(RF LH) 분비세포의 분포 구성을 통해 항체 특이성을 재확인하였다(도 6).
다음은 상기 다클론 항체의 제작과정을 통해 분취물(S3DE5)로서 제작된 다클론 항체를 이용하여 효소면역측정계(ELISA)를 개발 및 이를 검증하는 효소면역측정계 개발 및 검증과정을 수행하였다.
즉, 조피볼락의 혈중 황체형성호르몬(LH) 농도를 정량하기 위해 항체와 표준물질을 이용한 효소면역측정계 개발(도 7)은 조피볼락 황체형성호르몬에 대한 RF GPα 및 RF LHβ와 다클론 항체를 이용한 경쟁적 방법의 효소면역측정계를 사용하였으며, 상기 효소면역측정계의 검증과정은 다음과 같다.
(1) 항원(황체형성호르몬 표준품)의 웰 플레이트에 코팅 및 항체와 샘플의 반응;
제작된 황체형성호르몬(LH) 표준품을 0.5몰 탄산완충액(pH 9.6)으로 20ng/㎖ 농도씩 희석한 후, 100㎕ 씩 96공 웰 플레이트에 분주하여 4℃에서 18시간 반응시켰다. 또한, 폴리에칠렌 재질의 튜브(φ10x70mm)에 동일 용량의 황체형성호르몬 베타 서브 유니트(LHβ) 항체(2,000배 희석)와 조피볼락 혈액 샘플, 동일 용량의 황체형성호르몬 베타 서브 유니트(LHβ) 항체(2,000배 희석)와 100~0.2ng/㎖로 계대 희석한 조피볼락 황체형성호르몬 표준품을 제각기 제작하여 4℃에서 18시간 반응시켰다.
(2) 부로킹;
웰 플레이트과 항원과의 비 특이적인 결합을 막기 위해 2% 소혈청 알부민(BSA)을 웰 플레이트에 200㎕ 씩 분주하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 인산완충액(0.05% Tween 20 in PBS)으로 3회 세척하였다.
(3) 코팅 항원과의 경쟁적 결합반응;
인산완충액으로 세척한 웰 플레이트에 항체와 혈액시료 및 표준품 제각기 반응시킨 반응액을 각 웰에 100㎕ 씩 분주하여 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응시킨 후, 인산 완충액(0.05% Tween 20 in PBS)으로 3회 세척하였다.
(4) 제2항체 반응;
세척한 웰 플레이트에 호스라디쉬 페록시디아제(horseradish peroxidase) 결합-토끼 이뮤노 글로부린 G양 항혈청(goat anti-rabbit IgG)을 1,000배로 인산완충액에 희석하여 각 웰에 100㎕ 씩 분주하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.
(5) 발색 반응;
같은 방법으로 플레이트를 3회 세척 후, 33',55'-테트라메틸벤지딘 (tetrametylbenzidine)을 각 웰에 100㎕ 씩 분주하여 20분간 실온에서 반응시킨 후, 1N H3PO4를 100㎕씩 첨가하여 반응을 중지시켰다.
(6) 측정;
발색정지 5분후, 450nm의 효소면역측정 기기로 흡광도를 측정하였다.
이하 본 발명에 따른 조피볼락의 황체형성호르몬 정제방법 및 그 정제방법에 의해 얻어진 항혈청을 이용한 성숙도 판정방법을 실시예를 들어 설명하면 다음과 같다.
(실시예)
먼저, 조피볼락 뇌하수체에서 황체형성호르몬 정제품(표준품)의 수득하기 위해 성숙중인 조피볼락 뇌하수체(742마리, 동결건조 685㎎)를 0.2몰 암모니움 아세테이트(20mM PMSF, 50mMEDTA 함유, pH 6.1)로 균질화 한 다음, 4℃에서 18시간 배양 후, 15,000g 에서 30분간 원심분리 하였으며, 상층액은 도 2에 도시된 바와 같이 단백질정제장치에 연결된 겔 크로마토그래피 컬럼(세파크릴-100, φ2.6 x70cm)에 용출용 버퍼 0.05몰 암모니움 아세테이트(pH 9.0)로 용출하여 분취물(S3)(황체형성호르몬 표준품)을 얻었다.
(도 2는 단백질정제장치에 연결된 겔 크로마토그래피 컬럼(세파크릴-100, φ 2.6 x70cm)에 용출용 버퍼 0.05몰 암모니움 아세테이트 (pH 9.0)로 용출유속은 3㎖/200초/튜브, 분취물(S3)이 조피볼락 황체형성호르몬을 함유한 피크 그래프이다.)
상기 분취물(S3)을 단백질정제장치에 연결된 음이온 크로마토그래피 컬럼(DE-52, φ10 x100mm)에 용출용 버퍼인 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 농도를 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 몰로 용출하여 분취물(S3DE5)을 얻었으며, 상기 분취물(S3DE5)인 황체형성호르몬(LH)은 도 3에서와 같이 조피볼락 황체형성호르몬의 각 서브 유니트 인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)가 이량체로 결합된 상태이다.
(도 3은 분취물(S3)을 단백질정제장치에 연결된 음이온 크로마토그래피 컬럼(DE-52, φ10 x100mm)에 용출용 버퍼인 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 농도를 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 몰로 단계적으로 높이면서 용출 유속은 3㎖/200초/튜브, S3DE5가 조피볼락 황체형성호르몬의 두 서브 유닛트인 RF GPα 및 RF LHβ가 이량체로 결합된 상태인 피크 그래프이다.)
그 다음 역상 고압액체크로마토그래피 (rpHPLC)법에 의한 RF GPα 및 RF LHβ 서브 유니트 분리 및 아미노산 서열분석에 의한 검증을 위해 음이온 크로마토그래피로 용출된 분취물(S3DE5)을 동결건조 후, 역상 고압액체크로마토그래피에 흡착시켜 도 4에서와 같이 아세트나이테르(acetnitrile)의 농도구배를 만들어 용출하였으며, 도 5에 도시된 바와 같이 피크들은 전기영동법으로 확인 후, 피크 9번(S3DE5W9)과 12번(S3DE5W12)를 N-말단 아미노산 서열분석기에 의해 아래의 표 1에서와 같이 확인하였다.
(표 1)
상기 표 1은 조피볼락 뇌하수체에서 정제된 황체형성호르몬의 각 서브 유니트인 RF GPα 및 RF LHβ를 N-말단 아미노산 서열기에 의해 아미노산 서열을 밝힘과 동시에 본 출원인에 의해 기 발표된(공개특허 제2006-77227호, 공개일자:2006.07. 05) 조피볼락 황체형성호르몬의 각 서브 유니트(RF GPα 및 RF LHβ)에 대한 cDNA 뉴크레오타이드에서 연역된 아미노산과 비교표이다.
여기서 상단(RF GPα)의 프리딕티드 펩티드(predicted peptide)는 RF GPα의 cDNA 뉴크레오타이드에서 연역된 아미노산 서열과 네이티브 펩티드(native peptide)가 본 발명에 의한 정제품(RF GPα)의 서열과 100% 일치하는 것을 알 수 있으며, 또한 하단(RF LHβ)의 프리딕티드 펩티드(predicted peptide)는 RF LHβ의 cDNA 뉴크레오타이드에서 연역된 아미노산 서열과 네이티브 펩티드(native peptide)는 본 발명에 의한 정제품(RF LHβ)의 서열과의 본 출원인에 의해 기 발표된(공개특허 제2006-77227호) 것과 100% 일치하는 것을 알 수 있다.
(도 4는 분취물(S3DE5)을 동결건조 및 TFA로 처리한 후, 역상 HPLC(WakosilⅡ 5C18-HG,0.46X25cm)에 흡착시켜 아세트나이테르의 농도구배로 용출한 피크 그래 프로서, 피크 9번(S3DE5W9)은 조피볼락 황체형성호르몬의 α 서브 유니트(RF GPα)이며, 피크 12번(S3DE5W12)은 조피볼락 황체형성호르몬의 β 서브 유니트(RF LHβ)이다.)
그 다음 다클론 항체의 제작 및 웨스턴 이뮤노 부롯팅법과 면역조직화학법에 의한 항체 특이성 검증하기 위해 RF GPα(S3DE5W9) 및 RF LHβ(S3DE5W12) 각 50㎍/㎖를 동량의 프룬드 컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 에멸젼 상태로 토끼 임파선에 주사(1차 주사)하고, 10일 간격으로 정제품(RF GPα 및 RF LHβ) 50㎍와 동량의 프룬드 인컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 피하에 각각 주사(2∼4차)하였으며, 4회 마지막 주사 후 면역 확인을 위하여 토끼 혈액으로부터 혈청을 분리하여 웨스턴 이뮤노 부롯팅법으로 도 5에서와 같이 항체 특이성을 조사하였다
또한, 일주일 후, 토끼의 경동맥을 절단하여 전 채혈하였고, 채혈된 혈액을 4℃에서 16시간 동안 비등화시킨 후 중력가속도 10,000g 에서 30분간 원심 분리하여 항혈청을 분리하였으며, 분리된 각각의 항혈청은 1㎖씩 분주 및 동결 건조시킨 후 사용할 때까지 -80℃에 보관한 후, 도 6에서와 같이 면역조직화학법 (Immunocytochemistry)으로 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬 분비세포의 분포 구성을 통해 항체 특이성을 재확인하였다.
즉, 도 5는 분취물(S3DE5)의 전기영동(Electrophoresis) 및 웨스턴 부롯팅(Western blotting)사진으로서, A는 도 4의 피크 9번(S3DE5W9), 피크 10번 및 피크 12번(S3DE5W12)의 전기영동 사진이며, 염색은 코마시 블루(CBB)로 하였다.
또한, B와 C는 피크 9번(S3DE5W9), 피크 10번 및 피크 12번(S3DE5W12)을 제 각기 참치(tuna) GPα 및 LHβ 항혈청을 이용하여 웨스턴 부롯팅법에 의해 분취물을 검정한 것이다.
그리고 D와 E는 피크 9번(S3DE5W9; RF GPα) 및 피크 12번(S3DE5W12; RF LHβ)에 대한 각각의 조피볼락(RF) 항혈청(다클론항체)을 제작하여 웨스턴 부롯팅법으로 각 항체의 특이성을 검정한 것이다.
또한, 도 6은 조피볼락 황체형성호르몬 β 서브 유니트 항체(Anti-RF LHβ serum)를 이용하여 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬 분비 세포의 분포 조사한 것으로서, (가)는 대조구로서 항체(Anti-RF LHβ serum)가 함유되어 있지 않은 인산버퍼로 처리한 사진이며, (나)는 조피볼락 황체형성호르몬 β 서브 유니트 항체(Anti-RF LHβ serum)를 1,000배 희석하여 처리한 사진으로 갈색 부분이 조피볼락 뇌하수체내 황체형성호르몬 분비 세포를 나타낸다.)
그 다음은 실시예에 의한 효소면역측정계로 혈액중 황체형성호르몬 농도를 정확히 측정되고 있는지를 알기 위하여 조사하였다. 회수율의 상관 관계식은 Y=0.980X+0.069(r2=0.9958)로 나타났으며, 도 7에서와 같이 시료 0.76ng/㎖은 0.94±0.23ng/㎖로, 6.2ng/㎖은 6.1±0.26ng/㎖로, 50ng/㎖은 50.5.50±1.8ng/㎖로, 그리고 400ng/㎖은 425±51.3ng/㎖로 측정되어, 각각의 회수율은 81%, 99%, 101%, 106% 였고, 평균 회수율은 96.8%로 정확히 측정되고 있음을 알 수 있었다.
(도 7은 본 발명에서 개발된 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계로 혈액중 황체형성호르몬 농도를 정확히 측정되는지를 검증하기 위한 회수율 검증 그 래프로서, 회수율은 평균 96.8 %로 정확히 측정 가능함을 나타낸 것이다.)
그리고 조피볼락 황체형성호르몬에 대한 효소면역측정계에 있어서 성숙한 조피볼락 암컷 뇌하수체 추출물의 계배희석액과 동일 개체의 혈장의 계배희석액이 표준품의 계배희석액과의 2 X 2 점검법에 의한 평행선 검정 결과 도 8에서와 같이 샘플의 계배희석액과 표준품의 계배희석액이 평행하게 이루어져 뇌하수체 및 혈장중의 황체형성호르몬을 정확하게 측정 가능한 것이 검정되었다.
(도 8은 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계에 있어서 표준품의 표준곡선(●-●)과 성숙한 조피볼락 암컷 뇌하수체 추출물(○-○) 및 동일 개체 혈장(▲-▲)의 계배희석액과의 평행선 검정 결과 그래프로서, 뇌하수체 및 혈장중의 황체형성호르몬을 정확하게 측정 가능한 것이 검정되었다.)
또한, 도 9에서와 같이 조피볼락 황체형성호르몬에 대한 효소면역측정계에 있어서 엇세이내 변동계수(intra-assay coefficient of variation)와 엇세이 간 변동계수(inter-assay coefficient of variation)를 각각 조사한 결과 5.2%(n=6), 7.8%(n=12)로 나타나 측정계가 매우 안정적인 것이 증명되었다.
실제적으로 도 9에서와 같이 생체내(in vivo) 실험을 통한 혈중 황체형성호르몬 농도를 측정 가능한지 시도하였다.
우선 황체형성호르몬을 분비시키는 생식선자극호르몬방출호르몬(gonadotropin -releasing hormone)을 어체 체중 g당 0.1㎍ 농도로 주사한 난황형성기의 암컷 조피볼락 그룹(5마리)과 해산어용 생리식염수만 주사한 난황형성기의 암컷 조피볼락 그룹(대조구; 5마리)으로 나누어 투여 후, 실시간으로 혈액을 채취하여 본 발명품인 조피볼락 황체형성호르몬에 대한 효소면역측정계로 측정한 결과 투여 1시간 후 혈중 황체형성호르몬 농도가 서서히 증가하기 시작하여, 12시간 후에는 가장 높은 수치를 나타내었으며, 그 이후 서서히 감소하였다. 반면 대조구의 경우 실험 기간동안 유의한 변화는 나타나지 않았다.
(도 9는 생체내(in vivo) 실험을 통한 본 발명의 조피볼락 황체형성호르몬 효소면역측정계로 혈중 황체형성호르몬 농도를 측정 가능성 검증 그래프로서, GnRHa는 생식선자극호르몬방출호르몬(gonadotropin-releasing hormone)의 유사체로서 황체형성호르몬(LH)을 분비·촉진시키는 호르몬이다.)
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 조피볼락의 뇌하수체를 채취하여 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 정제하고, 상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)를 분리 후 각각에 대한 다클론 항체을 얻은 다음, 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성 성숙도를 판정하도록 함으로써 국내 주요 양식대상 어종인 볼락류의 중요한 성 성숙을 진단할 수 있는 목적으로 이용할 수 있을 뿐 아니라, 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 국내연안의 내분비계장애물질로 인한 생식내분비계에 미치는 환경영향평가를 보다 경제적이며, 또한 정확하고 간편하게 조기에 진단할 수 있도록 한 것이다.
이러한 본 발명은 지금까지 해산어의 황체형성호르몬를 대상으로 개발된 효소면역측정계로는 유일한 방법이며, 경제적 가치가 높은 본 종에 대한 중요한 내분비 검색 시스템이므로 국내 주요 양식대상 어종인 볼락류의 중요한 성 성숙을 진단할 수 있는 목적으로 이용할 수 있을 뿐 아니라, 사회적으로 큰 문제가 되고 있는 국내연안의 내분비계장애물질로 인한 생식내분비계에 미치는 환경영향평가를 보다 경제적이며, 또한 정확하고 간편하게 조기에 진단하는 효과가 있는 것이다.
Claims (5)
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- 조피볼락(rockfish:RF)의 뇌하수체를 채취 후 정제하여 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)을 얻고,상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)의 서브 유니트인 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)를 분리 후 각각에 대한 다클론 항체을 얻고,상기 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 다클론 항체를 이용한 효소면역측정계로서 성숙도를 판정하도록 하는 것을 특징으로 하는 조피볼락 황체형성호르몬의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법.
- 제3항에 있어서 상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH)은,성숙중인 조피볼락(RF)의 뇌하수체를 채취하는 뇌하수체 채취단계와,상기 뇌하수체 채취단계에서 채취된 뇌하수체를 0.2몰 암모니움 아세테이트(pH 6.1) 호모게나이져 후, 중력가속도 15,000g에서 30분간 원심분리하여 침전물인 뇌하수체 호르몬을 얻는 뇌하수체 호르몬 추출단계와,상기 뇌하수체 호르몬 추출단계에서 얻어진 뇌하수체 호르몬을 크로마토그래피 컬럼에 0.05몰 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 버퍼로 정제하여 분취물(S3)을 얻는 겔 크로마토그래피법에 의한 정제단계와,상기 겔 크로마토그래피법에 의한 정제단계에서 얻어진 분취물(S3)을 음이온 크로마토그래피 컬럼에 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 1.0 몰의 암모니움 아세테이트(pH 9.0) 버퍼로 정제하여 분취물(S3DE5)을 얻는 이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 정제단계와,상기 이온 크로마토그래피 컬럼에 의한 정제단계에서 얻어진 분취물(S3DE5)을 역상 고속액체크로마토그래피 컬럼에 흡착시켜 아세트나이테르의 농도구배로 정제하는 고속액체크로마토그래피 컬럼에 의한 고순도 정제단계로 추출되는 것을 특징으로 하는 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서 상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH) 서브 유니트의 황체형성호르몬 베타(RF LHβ)에 대한 다클론 항체는,상기 조피볼락 황체형성호르몬(RF LH) 서브 유니트의 당단백질성 알파(RF GPα) 및 황체형성호르몬 베타(RF LHβ) 50㎍를 동량의 프룬드 컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 토끼의 임파선에 주사하는 제1정제품 면역단계와,상기 제1정제품 면역단계 후, 10일 간격으로 RF GPα 및 RF LHβ 50㎍와 동량의 프룬드 인컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 피하에 4회 주사하는 제2정제품 면역단계와,상기 제2정제품 면역단계 후, 토끼의 혈액을 채혈하는 채혈단계와,상기 채혈된 혈액을 4℃에서 16시간 동안 비등화 시킨 후, 중력가속도 10,000g에서 30분간 원심 분리하여 항혈청을 분리하는 항혈청분리단계로 제조되는 것을 특징으로 하는 조피볼락의 다클론 항체를 이용한 성숙도 판정방법.
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