JPH06335397A - ビッグエンドセリン−３に対する抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ラットビッグエンドセリン-３を感度よく特異
的に定量する方法を提供する。 【構成】ラットビッグエンドセリン-３のＣ端部に特異
的に反応する抗体を得た。この抗体を単独あるいはビッ
グエンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体と組み合わ
せて用いることにより、 ビッグエンドセリン−３を高感
度にかつ特異的に定量することができる。 【効果】本発明の抗体は、ビックエンドセリン−３が関
与する種々の疾病、特にアルツハイマー病の診断剤とし
て有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビッグエンドセリン-
３のＣ端部に特異的結合性を有する抗体、それを産生す
る細胞および該抗体の用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリンには、エンドセリン−１、
エンドセリン−２、およびエンドセリン−３の３種類の
アイソタイプが存在する。エンドセリン−１は、血管内
皮細胞をはじめとしてさまざまな細胞により産生され、
脳血管攣縮や虚血性の心疾患、腎疾患などの病態に深く
関与していると考えられているが、エンドセリン−２お
よびエンドセリン−３の生理学的および病態生理学的役
割については、まだほとんど明らかにされていない。こ
れらエンドセリン−２およびエンドセリン−３の生理学
的および病態生理学的役割の解明には、高感度かつ特異
的な測定法の開発が必須であり、特にエンドセリン−３
の場合、その前駆体であるビッグエンドセリン−３の高
感度かつ特異的な測定法の開発が望まれる。この場合、
これらの測定法は、臨床上のみならず動物実験上も有用
であることが望ましく、種々の動物、とりわけ多くの疾
患モデルが確立されているラットのエンドセリン−３お
よびビッグエンドセリン−３を測定できるかどうかが重
要な点となる。これまでエンドセリンのような低分子ペ
プチドの測定には，１種類の抗体を用いる競合法の免疫
測定法が用いられてきたが、最近２種類の抗体を用いる
サンドイッチ-免疫測定法が、エンドセリンの測定に感
度、特異性のいずれの点においても競合法より優れてい
ることが明らかにされてきた（鈴木ら、臨床検査第35巻
第3号 p242-247, 1991、 H. Matsumoto et. al., Bioch
em. Biophys. Res. Commun. 164, 74-80, 1989、あるい
は N. Suzuki et al., J. Cardiovascular Pharmacolog
y 17(Suppl. 7):S420-S422, 1991, Raven Press, Ltd.,
New York）。しかしながら、これらの方法ではヒトの
ビックエンドセリンを測定することはできるが、ラット
のエンドセリン-３の測定を行うことができず、疾患モ
デルの確立には適していない。

【０００３】なお、ビッグエンドセリン−３の配列に
は、そのＣ端部に動物種間でアミノ酸置換が認められ
る。以下に、ラットのビックエンドセリン−３の全アミ
ノ酸配列（配列番号：１−ＮＨ₂）、ラットのビックエ
ンドセリン−３のＣ端部の２０アミノ酸配列（配列番
号：２−ＮＨ₂）、 ヒトのビッグエンドセリン−３のＣ
端部の２０アミノ酸配列（配列番号：３−ＮＨ₂）およ
びヒトのビッグエンドセリン−３のＣ端部の２１アミノ
酸配列（配列番号：４）を示す。 配列番号：１−ＮＨ₂ Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ (R. Shiba et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 588-594, 1992) 配列番号：２−ＮＨ₂ Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ (K.D.Bloch et. al., J. Biol. Chem. 264, 18156-18161,1989) 配列番号：３−ＮＨ₂ Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ (H.Onda, et. al., FEBS Lett. 261, 327-330, 1990) 配列番号：４ Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly (R. Shiba et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 588-594, 1992)

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、これ
までに報告されたビッグエンドセリン−３の測定法のな
かで、ラットおよびヒトのビッグエンドセリン−３を測
定できるものは知られていない。即ち、エンドセリン−
３に深い関心が寄せられているにもかかわらず、臨床上
において、また、ラットなどの動物実験上においても有
用なビッグエンドセリン−３の測定法はこれまで開発さ
れていない。そこで、本発明はラットまたは（および）
ヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部領域に対して異な
る特異性を有する新規モノクローナル抗体を提供し、こ
れらを用いて臨床上も、また、動物実験上も有用なビッ
グエンドセリン−３の測定法を提供することを目的とす
る。さらには、この抗体を用いて、ビックエンドセリン
−３が関与している疾病を解明し、該抗体を医療の分野
でビックエンドセリン−３が関与している各種疾病の診
断に利用できる技術を提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記目的
を達成するため、ラットビッグエンドセリン−３のＣ端
部を認識する複数のモノクローナル抗体を作製し、種々
検討を重ねた結果、これら抗体が予想外にもヒトまたは
（および）ラットビッグエンドセリン−３を感度良く測
定することができることを見い出した。そして、該抗体
を用いてさらに研究を行った結果、アルツハイマー病患
者の血中においてビックエンドセリン−３の濃度が減少
しているという、いまだかつて報告も示唆もされていな
い全く新しい知見を得ることに成功し、これに基づいて
さらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明はビッグエンドセリン−３に特異的に
反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞、該抗体を用いた競合法あ
るいはサンドイッチ法によるビッグエンドセリン−３の
免疫測定法、および該抗体を含有するアルツハイマー病
診断剤に関する。具体的には、本発明は、（１）ラット
ビッグエンドセリン−３のＣ端部に反応する抗体、
（２）ラットビッグエンドセリン−３が式 Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ （配列番号：１−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドである第
（１）項記載の抗体、（３）ラットビッグエンドセリン
-３のＣ端部が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ （配列番号：２−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドである第
（１）〜（２）項記載の抗体、

【０００６】（４）抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドおよび式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドのいずれとも交差反応しない第
（１）〜（３）項記載の抗体、（５）抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドとは反応するが、式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドとは交差反応しない第（１）〜
（３）項記載の抗体、（６）抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドおよび式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端ペプチドのいずれとも反応する第（１）
〜（３）項記載の抗体、（７）抗体がモノクローナル抗
体である第（１）〜（６）項記載の抗体、（８）抗体が
ＲｂＥ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体である
第（４）項記載の抗体、

【０００７】（９）抗体がＲｂＥ−３２ａで標示される
モノクローナル抗体である第（５）項記載の抗体、（１
０）抗体がＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル
抗体である第（６）項記載の抗体、（１１）第（７）項
記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞、（１２）第（８）項記載のモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞、（１３）第（９）項記載の
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞、
（１４）第（１０）項記載のモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞、（１５）第（１）項記載の抗
体と、被検液および標識化ラットあるいはヒトビッグエ
ンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合し
た標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定すること
を特徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定量
法、

【０００８】（１６）被検液と担体上に不溶化した抗体
および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応
させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定するこ
とを特徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定
量法において、一方の抗体がビッグエンドセリン−３の
Ｎ端部を認識する抗体で、他方の抗体が第（１）項記載
の抗体であることを特徴とする被検液中のビッグエンド
セリン−３の定量法、および（１７）第（１）項記載の
抗体と、被検液および標識化ラットあるいはヒトビッグ
エンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合
した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定して、
被検液中のビッグエンドセリン−３を定量することを特
徴とするアルツハイマー病の診断方法、（１８）被検液
と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体とを
同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の
標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグエンドセリ
ン−３を定量するアルツハイマー病の診断方法におい
て、一方の抗体がビッグエンドセリン−３のＮ端部を認
識する抗体で、他方の抗体が第（１）項記載の抗体であ
ることを特徴とするアルツハイマー病の診断方法、およ
び（１９）第（１）項記載の抗体を含有することを特徴
とするアルツハイマー病診断剤に関する。

【０００９】さらに具体的には、（２０）第（１）項記
載の抗体が第（２）、（３）または（４）項記載の抗体
である第（１５）項記載のビッグエンドセリン−３の定
量法、（２１）第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３０ａ
またはＲｂＥ−３２ａで標示されるモノクローナル抗体
であり、ビックエンドセリン−３がラットビックエンド
セリン−３である第（１５）項記載のビッグエンドセリ
ン−３の定量法、（２２）第（１）項記載の抗体がＲｂ
Ｅ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体であり、ビ
ックエンドセリン−３がラットビックエンドセリン−３
またはヒトビックエンドセリン−３である第（１５）項
記載のビッグエンドセリン−３の定量法、（２３）ビッ
グエンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体がＡＥＴ−
３０ａで標示されるモノクローナル抗体である第（１
６）項記載のビッグエンドセリン−３の定量法、（２
４）第（１）項記載の抗体が第（２）、（３）または
（４）項記載の抗体である第（１６）または（２３）項
記載のビッグエンドセリン−３の定量法、（２５）第
（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａ
またはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体
である第（１６）または（２３）項記載のビッグエンド
セリン−３の定量法、（２６）ビッグエンドセリン−３
のＮ端部を認識する抗体がＡＥＴ−３０ａで標示される
モノクローナル抗体であり、第（１）項記載の抗体がＲ
ｂＥ−３０ａまたはＲｂＥ−３２ａで標示されるモノク
ローナル抗体であり、ビックエンドセリン−３がラット
ビックエンドセリン−３である第（１６）項記載のビッ
グエンドセリン−３の定量法、

【００１０】（２７）ビッグエンドセリン−３のＮ端部
を認識する抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクロ
ーナル抗体であり、第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３
４ａで標示されるモノクローナル抗体であり、ビックエ
ンドセリン−３がラットビックエンドセリン−３または
ヒトビックエンドセリン−３である第（１６）項記載の
ビッグエンドセリン−３の定量法、（２８）第（１）項
記載の抗体が第（２）、（３）または（４）項記載の抗
体である第（１７）項記載のアルツハイマー病の診断方
法、（２９）第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３０ａま
たはＲｂＥ−３２ａで標示されるモノクローナル抗体で
あり、ビックエンドセリン−３がラットビックエンドセ
リン−３である第（１７）項記載のアルツハイマー病の
診断方法、（３０）第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３
４ａで標示されるモノクローナル抗体であり、ビックエ
ンドセリン−３がラットビックエンドセリン−３または
ヒトビックエンドセリン−３である第（１７）項記載の
アルツハイマー病の診断方法、（３１）ビッグエンドセ
リン−３のＮ端部を認識する抗体がＡＥＴ−３０ａで標
示されるモノクローナル抗体である第（１８）項記載の
アルツハイマー病の診断方法、（３２）第（１）項記載
の抗体が第（２）、（３）または（４）項記載の抗体で
ある第（１８）または（３１）項記載のビッグエンドセ
リン−３の定量法、（３３）第（１）項記載の抗体がＲ
ｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで
標示されるモノクローナル抗体である第（１８）または
（３１）項記載のアルツハイマー病の診断方法、（３
４）ビッグエンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体が
ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体であ
り、第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３０ａまたはＲｂ
Ｅ−３２ａで標示されるモノクローナル抗体であり、ビ
ックエンドセリン−３がラットビックエンドセリン−３
である第（１８）項記載のアルツハイマー病の診断方
法、および（３５）ビッグエンドセリン−３のＮ端部を
認識する抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクロー
ナル抗体であり、第（１）項記載の抗体がＲｂＥ−３４
ａで標示されるモノクローナル抗体であり、ビックエン
ドセリン−３がラットビックエンドセリン−３またはヒ
トビックエンドセリン−３である第（１８）項記載のア
ルツハイマー病の診断方法に関する。

【００１１】さらに、本発明は（３６）ビックエンドセ
リン−３を認識する抗体と、被検液および標識化ビッグ
エンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合
した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定して、
被検液中のビッグエンドセリン−３を定量することを特
徴とするアルツハイマー病の診断方法、（３７）ビック
エンドセリン−３を認識する抗体がＡＥＴ−３０ａ、ｂ
ＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ、ＲｂＥ−３０ａ、Ｒｂ
Ｅ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクロ
ーナル抗体である第（３６）項記載のアルツハイマー病
の診断方法、（３８）ＡＥＴ−３０ａ、ＲｂＥ−３０
ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示される
モノクローナル抗体と、被検液および標識化ラットビッ
グエンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結
合した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定し
て、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量すること
を特徴とするラットのアルツハイマー病の診断方法、
（３９）ＡＥＴ−３０ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３
２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル
抗体と、被検液および標識化ヒトビッグエンドセリン−
３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッ
グエンドセリン−３の割合を測定して、被検液中のビッ
グエンドセリン−３を定量することを特徴とするヒトの
アルツハイマー病の診断方法、（４０）被検液と担体上
に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時ある
いは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定して、被検液中のビッグエンドセリン−３を
定量することを特徴とするアルツハイマー病の診断方法
において、一方の抗体がビッグエンドセリン−３のＮ端
部を認識する抗体で、他方の抗体がビッグエンドセリン
−３のＣ端部を認識する抗体であることを特徴とするア
ルツハイマー病の診断方法、（４１）ビッグエンドセリ
ン−３のＮ端部を認識する抗体がＡＥＴ−３０ａで標示
されるモノクローナル抗体である第（４０）項記載のア
ルツハイマー病の診断方法、

【００１２】（４２）ビッグエンドセリン−３のＣ端部
を認識する抗体がｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ、Ｒ
ｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで
標示されるモノクローナル抗体である第（４０）または
（４１）項記載のアルツハイマー病の診断方法、（４
３）被検液と担体上に不溶化した抗体および標識化され
た抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグ
エンドセリン−３を定量することを特徴とするアルツハ
イマー病の診断方法において、一方の抗体がＡＥＴ−３
０ａで標示されるモノクローナル抗体で、他方の抗体が
ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａ
で標示されるモノクローナル抗体であることを特徴とす
るラットのアルツハイマー病の診断方法、（４４）被検
液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体と
を同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグエンドセ
リン−３を定量することを特徴とするアルツハイマー病
の診断方法において、一方の抗体がＡＥＴ−３０ａで標
示されるモノクローナル抗体で、他方の抗体がｂＥＴ−
３１ａ、ｂＥＴ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示さ
れるモノクローナル抗体であることを特徴とするヒトの
アルツハイマー病の診断方法、（４５）エンドセリン−
３を認識する抗体と、被検液および標識化エンドセリン
−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化エ
ンドセリン−３の割合を測定して、被検液中のエンドセ
リン−３を定量することを特徴とするアルツハイマー病
の診断方法、（４６）エンドセリン−３を認識する抗体
がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体であ
る第（４５）項記載のアルツハイマー病の診断方法、
（４７）ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル抗
体と、被検液および標識化エンドセリン−３とを競合的
に反応させ、該抗体に結合した標識化エンドセリン−３
の割合を測定して、被検液中のエンドセリン−３を定量
することを特徴とするラットまたはヒトのアルツハイマ
ー病の診断方法、

【００１３】（４８）被検液と担体上に不溶化した抗体
および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応
させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定して、
被検液中のエンドセリン−３を定量することを特徴とす
るアルツハイマー病の診断方法において、一方の抗体が
エンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗
体がエンドセリン−３のＣ端部を認識する抗体であるこ
とを特徴とするヒトのアルツハイマー病の診断方法、
（４９）ビッグエンドセリン−３または（および）エン
ドセリン−３を認識する抗体を含有することを特徴とす
るアルツハイマー病診断剤、（５０）ビッグエンドセリ
ン−３または（および）エンドセリン−３を認識する抗
体がＡＥＴ−３０ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２
ａ、ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３
４ａで標示されるモノクローナル抗体である第（４９）
項記載のアルツハイマー病診断剤、（５１）ＡＥＴ−３
０ａ、ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−
３４ａで標示されるモノクローナル抗体を含有すること
を特徴とするラットのアルツハイマー病診断剤、および
（５２）ＡＥＴ−３０ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３
２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル
抗体を含有することを特徴とするヒトのアルツハイマー
病診断剤に関する。

【００１４】より詳しくは、本発明者等は、配列番
号：２で示されるラットビッグエンドセリン−３のＣ端
ペプチドに特異的であり、配列番号：３および配列番
号：４で示されるヒトビッグエンドセリン−３のＣ端ペ
プチドとは交差反応しない抗体（以下、クラス１抗体と
略す場合がある）、配列番号：２および配列番号：３
で示されるＣ端部にアミド基を有するラットおよびヒト
ビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドに反応し、配列
番号：４で示されるＣ端部が遊離カルボン酸であるヒト
ビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドとは交差反応し
ない抗体（以下、クラス２抗体と略す場合がある）およ
び配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４で
示されるＣ端部の構造および種差をとわず、いずれのビ
ッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドとも同程度に反応
する抗体（以下、クラス３抗体と略す場合がある）の３
種類のモノクローナル抗体を作製し、これらの抗体とビ
ッグエンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体と組み合
わせることにより、ビッグエンドセリン−３を高感度に
かつ特異的に検出し得るサンドイッチ−免疫測定法を開
発した。とりわけ、クラス２あるいはクラス３の抗体を
用いるサンドイッチ−免疫測定法は、臨床上も、また、
ラットなどの動物実験上も有用な測定法を提供する。

【００１５】本明細書においてアミノ酸等を略号で表示
する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commision on Biochemi
cal Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ
る慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。ア
ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示し
なければＬ−体を示すものとする。 ＰＡＭ ：フェニルアセタミドメチル Ｂｏｃ ：ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｃｌ−Ｚ：２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル Ｂг−Ｚ：２−ブロモーベンジルオキシカルボニル Ｂｚｌ ：ベンジル ＯｃＨｅｘ：シクロヘキシルエステル ＯＢｚｌ：ベンジルエステル Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルホニル ＨＯＢｔ：１−ベンゾトリアゾール ＭｅＢｚｌ：４−メチルベンジル Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド Ｇｌｙ ：グリシン Ａｌａ ：アラニン Ｖａｌ ：バリン Ｌｅｕ ：ロイシン

【００１６】Ｉｌｅ ：イソロイシン Ｓｅｒ ：セリン Ｔｈｒ ：スレオニン Ｃｙｓ ：システイン Ｍｅｔ ：メチオニン Ｇｌｕ ：グルタミン酸 Ａｓｐ ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ ：リジン Ａｒｇ ：アルギニン Ｈｉｓ ：ヒスチジン Ｐｈｅ ：フェニルアラニン Ｔｙｒ ：チロシン Ｔｒｐ ：トリプトファン Ｐｒｏ ：プロリン Ａｓｎ ：アスパラギン Ｇｌｎ ：グルタミン 本発明で得られた抗ラットビッグエンドセリン−３のＣ
端抗体を産生するハイブリドーマ細胞のうち、ＲｂＥ−
３０、ＲｂＥ−３２およびＲｂＥ−３４はそれぞれ平成
５年２月２６日から通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に次に示す受託番号で寄託され
ている。 ハイブリドーマ細胞 受託番号 ＲｂＥ−３０ ＦＥＲＭ ＢＰ-４２０７ ＲｂＥ−３２ ＦＥＲＭ ＢＰ-４２０８ ＲｂＥ−３４ ＦＥＲＭ ＢＰ-４２０９ なお、各ハイブリドーマ細胞から得られる抗体について
は、細胞名の後にａを付けた形で表している。

【００１７】本発明のラットビックエンドセリン−３の
Ｃ端部に反応する抗体は、配列番号：１−ＮＨ₂で表さ
れるアミノ酸配列を有するラットビックエンドセリン−
３のＣ端部のペプチドを特異的に認識する抗体（ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体など）である。該Ｃ
端部のペプチドとしては、例えば配列番号：２−ＮＨ₂
で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドなどが挙げ
られる。このような特徴を有する抗体であれば何れの抗
体であってもよいが、例えばさらに （１）配列番号：３−ＮＨ₂で表わされるアミノ酸配列
を有するヒトビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドお
よび配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒ
トビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドのいずれとも
交差反応しないという特徴を有する抗体、 （２）配列番号：３−ＮＨ₂で表わされるアミノ酸配列
を有するヒトビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドと
は反応するが、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列
を有するヒトビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドと
は交差反応しないという特徴を有する抗体、 （３）配列番号：３−ＮＨ₂で表わされるアミノ酸配列
を有するヒトビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドお
よび配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を有するヒ
トビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチドのいずれとも
反応するという特徴を有する抗体などが用いられる。こ
のような抗体の中でも、モノクローナル抗体が好適であ
る。

【００１８】上記（１）に該当する具体的なモノクロー
ナル抗体としては、ＲｂＥ−３０ａで標示されるモノク
ローナル抗体などが用いられ、上記（２）に該当する具
体的なモノクローナル抗体としては、ＲｂＥ−３２ａで
標示されるモノクローナル抗体などが用いられ、上記
（３）に該当する具体的なモノクローナル抗体として
は、ＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体な
どが用いられる。このように、本発明の抗体はラットビ
ックエンドセリン−３のＣ端部に反応するという点では
共通するが、ヒトビックエンドセリン−３のＣ端ペプチ
ドに対する反応性が異なるとういユニークな性質を有す
るものである。特に、上記（３）の特徴を有す抗体（例
えば、ＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体
など）は、ラットおよびヒトのビックエンドセリン−３
のＣ端部のペプチドを認識することができるユニークな
抗体である。以下に、抗原の調製方法およびモノクロー
ナル抗体の作成方法について詳細に説明する。 （１）抗原の調製 本発明の抗体を調製するために使用するラットビッグエ
ンドセリン−３のＣ端部ペプチドとしては、 動物より
調製した天然精製標品、該ラットビッグエンドセリン−
３を加水分解して得られるフラグメント、または 該ビ
ッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチドと同一の抗原決
定基を１種あるいは２種以上有する合成標品等いずれも
使用できる（以下、これらを単に「ラットビッグエンド
セリン−３のＣ端部ペプチド抗原」と称することもあ
る)。

【００１９】ラットビッグエンドセリン−３を加水分解
して得られるフラグメントとしては、例えば、アミノペ
プチダーゼやカルボキシペプチダーゼなどのエキソプロ
テアーゼによりＮ末端および／あるいはＣ末端から順次
加水分解して得られるフラグメントおよびそれらの混合
物、または種々のエンドペプチダーゼにより加水分解し
て得られるフラグメントおよびそれらの混合物を例示す
ることができる。また、合成ペプチドとしては、例えば
上述した天然より精製したラットビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチド抗原と同一の構造を有するものや、
ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチドのア
ミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のア
ミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミ
ノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなど
を例示することができる。本発明で用いられるペプチド
の合成は、公知の常套手段で行いうるものであり、固相
合成法、液相合成法のいずれによってもよい。ペプチド
合成の方法としては、例えば以下の報告に記載された方
法がある。B. Merrifield 〔ジャーナルオブ アメリカ
ン ケミカル ソサイェティ(J. Am. Chem. Soc.),85. 21
49(1963)〕, M. BodanszkyおよびM. A. Ondetti〔ペプ
チド シンセーシス(Peptide Synthesis), Interscience
Publishers, New York,1966年〕, SchroderおよびLubk
e〔ザ ペプチド(The Peptide), Academic Press, New Y
ork, 1965年〕、泉屋信夫他〔ペプチド合成の基礎と実
験、丸善、1985年〕矢島治明および榊原俊平〔生化学実
験講座１、タンパク質の化学IV, 205,1977年〕等。

【００２０】例えば固相法によりラットビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド抗原を合成する場合には、不
溶性樹脂として当該技術分野で知られたもの、例えばク
ロロメチル樹脂、４−オキシメチルフェニルアセタミド
メチル樹脂等これら何れかの樹脂を用い、ラットビッグ
エンドセリン−３のＣ端部ペプチド抗原のＣ末端側から
保護アミノ酸を常法に従って順次縮合する。次いでフッ
化水素処理で全保護基を除去して、高速液体クロマトグ
ラフィー等のそれ自体公知の方法による精製後、目的と
するラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド抗
原を得ることが出来る。例えば、Ｎ−保護アミノ酸とし
ては、α−アミノ基はＢｏｃ基で保護し、さらに例えば
セリンおよびスレオニンの水酸基はＢｚｌ基で保護し、
グルタミン酸、アスパラギン酸のω−カルボン酸はＯＢ
ｚｌ基で保護し、リジンのε−アミノ基はＣｌ−Ｚ基で
保護し、チロシンの水酸基はＢｒ−Ｚ基で保護し、アル
ギニンのグアニド基はＴｏｓ基で保護し、ヒスチジンの
イミダゾール基はＢｏｍ基で保護する方法で製造するこ
とが出来る。ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド抗原は、適当な担体に結合または吸着させ、複合
体としたのち免疫してもよい。該担体および担体（キャ
リアー）とラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプ
チド抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるい
は吸着させた該Ｃ端部ペプチド抗原に対して抗体が効率
よく出来れば、どの様なものをどの様な比率で結合ある
いは吸着させてもよく、 通常ハプテン抗原に対する抗
体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高
分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の
割合で結合あるいは吸着させたものを使用することがで
きる。天然の高分子担体としては、ウシ、ウサギあるい
はヒトなどの動物の血清アルブミンやウシ、ウサギなど
の動物のチログロブリン、ウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジ
などの動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモ
シアニン等が用いられる。合成の高分子担体としては、
ポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポ
リビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重
合物などの各種ラテックスなどを例示することができ
る。

【００２１】また、ハプテンとキャリアーのカプリング
には、種々の縮合剤を用いることが出来る。例えば、チ
ロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジ
アゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基
同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド
化合物、トルエン-２, ４−ジイソシアネートなどのジ
イソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，
Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド
化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活
性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋
するカルボジイミド化合物等が好都合に用いられる。ま
た、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基に
ジチオピリジル基を有する活性エステル試薬を反応させ
た後還元することによりチオール基を導入し、他方のア
ミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド
基を導入後、両者を反応させることもできる。 （２）モノクローナル抗体の作製 （ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製 縮合生成物は温血動物に対して投与により抗体産生が可
能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与
される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フ
ロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント
を投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、
計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物として
は、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、
マウスおよびラットが好ましく用いられる。

【００２２】モノクローナル抗体産生細胞の作製に際し
ては、ビッグエンドセリン−３抗原を免疫された温血動
物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択
し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取
し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合
させることにより、抗ラットビッグエンドセリン−３の
Ｃ端部ペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
を調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、
例えば後記の標識化ラットビッグエンドセリン−３のＣ
端部ペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合
した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合
操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの
方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い
実施できる。融合促進剤としてはポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、
好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としてはた
とえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１など
があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用い
られる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との
好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ
（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０
〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好まし
くは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートするこ
とにより効率よく細胞融合を実施できる。抗ラットビッ
グエンドセリン−３のＣ端部ペプチド抗体産生ハイブリ
ドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できる
が、たとえばラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相
（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を
添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グ
ロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場
合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）または
プロテインＡを加え、固相に結合した抗ラットビッグエ
ンドセリン−３のＣ端部ペプチドモノクローナル抗体を
検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン
Ａを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加
し、放射性物質や酵素などで標識したラットビッグエン
ドセリン−３のＣ端部ペプチドを加え、固相に結合した
抗ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチドモノ
クローナル抗体を検出する方法などがあげられる。

【００２３】抗ラットビッグエンドセリン−３モノクロ
ーナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方
法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細
胞用培地で行なわれる。選別および育種用培地として
は、ハイビリドーマが生育できるものならばどのような
培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは
１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培
地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純
薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培
地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いるこ
とができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましく
は約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好
ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸
ガス下で行なわれる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価
は、上記の抗血清中の抗ラットビックエンドセリン−３
のＣ端部ペプチド抗体価の測定と同様にして測定でき
る。 （ｂ）モノクロナール抗体の精製 抗ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチドモノ
クローナル抗体の分離精製は通常のポリクローナル抗体
の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、
塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動
法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超
遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテイン
ＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体の
みを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製
法〕に従って行われる。以上の（１）および（２）の方
法に従って製造させる本発明の抗体は、ラットまたは
（および）ヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部を特異
的に認識することができるので、被検液中のラットまた
は（および）ヒトビッグエンドセリン−３の定量、特に
サンドイッチ免疫測定法による定量などに使用すること
ができる。

【００２４】すなわち、本発明は、（１）本発明のラッ
トヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部に反応する抗体
と、被検液および標識化ラットあるいはヒトビッグエン
ドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した
標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定することを
特徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定量
法、および（２）被検液と担体上に不溶化した抗体およ
び標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させ
たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを
特徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定量法
において、一方の抗体がビッグエンドセリン−３のＮ端
部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のラットヒト
ビッグエンドセリン−３のＣ端部に反応する抗体である
ことを特徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の
定量法を提供する。上記の定量法において、本発明のラ
ットヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部に反応する抗
体としては、前述の特徴を有するＲｂＥ−３０ａ、Ｒｂ
Ｅ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクロ
ーナル抗体などが用いられ、ビッグエンドセリン−３の
Ｎ端部を認識する抗体としては、ＡＥＴ−３０（FERM B
P-2523）で標示されるハイブリドーマから産生されるＡ
ＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体などが用
いられる。上記の定量法（１）の好ましい態様として
は、（１ａ）ＲｂＥ−３０ａまたはＲｂＥ−３２ａで標
示されるモノクローナル抗体と、被検液および標識化ラ
ットビッグエンドセリン−３とを競合的に反応させ、該
抗体に結合した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を
測定することを特徴とする被検液中のラットビッグエン
ドセリン−３の定量法、（１ｂ）ＲｂＥ−３４ａで標示
されるモノクローナル抗体と、被検液および標識化ラッ
トビッグエンドセリン−３またはヒトビッグエンドセリ
ン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化
ビッグエンドセリン−３の割合を測定することを特徴と
する被検液中のラットビッグエンドセリン−３またはヒ
トビッグエンドセリン−３の定量法などが挙げられる。

【００２５】上記の定量法（２）の好ましい態様として
は、（２ａ）被検液と担体上に不溶化した抗体および標
識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させたの
ち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴
とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定量法にお
いて、一方の抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノク
ローナル抗体で、他方の抗体がＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ
−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクロー
ナル抗体であることを特徴とする被検液中のラットビッ
グエンドセリン−３の定量法、（２ｂ）被検液と担体上
に不溶化した抗体および標識化された抗体とを同時ある
いは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の
活性を測定することを特徴とする被検液中のビッグエン
ドセリン−３の定量法において、一方の抗体がＡＥＴ−
３０ａで標示されるモノクローナル抗体で、他方の抗体
がＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体であ
ることを特徴とする被検液中のヒトビッグエンドセリン
−３の定量法などが挙げられる。本発明のラットビッグ
エンドセリン−３のＣ端部ペプチドを認識するモノクロ
ーナル抗体（以下、抗ビッグエンドセリン−３抗体と称
する場合がある）を用いてビッグエンドセリン−３の測
定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこと
もできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用い
てもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')₂ 、Ｆａｂ'、あ
るいはＦａｂ画分を用いてもよい。本発明の抗体を用い
る測定法は、 特に制限されるべきものではなく、被測
定液中の抗原量（例えばビッグエンドセリン−３量）に
対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化
学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗
原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する
測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例え
ば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およ
びサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性
の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ま
しい。

【００２６】標識物質を用いる測定法に用いられる標識
剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物
質などが挙げられる。放射性同位元素としては、例えば
¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ，³Ｈ，¹⁴Ｃなどが、上記酵素としては、
安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラ
クトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等
が、蛍光物質としては、フルオレスカミン、フルオレッ
センイソチオシアネートなどが、発光物質としては、ル
ミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニ
ンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体あるいは抗
原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いるこ
ともできる。抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物
理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等
を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる
方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラ
ン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポ
リアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガ
ラス等が挙げられる。サンドイッチ法においては不溶化
した抗ビッグエンドセリン−３抗体に被検液を反応させ
（１次反応）、さらに標識化抗ビッグエンドセリン−３
抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標
識剤の活性を測定することにより被検液中のビッグエン
ドセリン−３量を定量することができる。１次反応と２
次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なっても
よいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および
不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。ま
た、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用
抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１
種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的
で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

【００２７】本発明のサンドイッチ法によるビッグエン
ドセリン−３の測定法においては、１次反応と２次反応
に用いられる抗ビッグエンドセリン−３抗体はビッグエ
ンドセリン−３の結合する部位が相異なる抗体が好まし
く用いられる。即ち、１次反応および２次反応に用いら
れる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、ビ
ッグエンドセリン−３のＣ端部を認識する場合、１次反
応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えば
Ｎ端部を認識する抗体が用いられる。ビッグエンドセリ
ン−３のＮ端部は、エンドセリン−３と共通であり、さ
らに、これまでエンドセリン−３に動物種によるアミノ
酸置換は認められないことから、ビッグエンドセリン−
３のＮ端部に対する抗体としては、エンドセリン−３の
Ｎ端部に対する抗体が好ましく用いられる。具体的に
は、ＡＥＴ−３０（FERM BP-2523）で標示されるハイブ
リドーマ細胞から産生されるＡＥＴ−３０ａで標示され
るモノクローナル抗体などが用いられる。本発明の抗ラ
ットビッグエンドセリン−３のＣ端ペプチド抗体のう
ち、クラス１の抗体、即ちラットビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチドに特異的に反応し、ヒトビッグエン
ドセリン−３のＣ端部ペプチド（Ｃ端部がＡｒｇアミド
基およびＧｌｙカルボン酸いずれの場合も含む）に交差
反応しない抗体と、エンドセリン−３のＮ端部に対する
抗体とを組み合わせることにより、ラットビッグエンド
セリン−３に特異的であり、ヒトビッグエンドセリン−
３と反応しないサンドイッチ-免疫測定法を確立するこ
とができる。また、本発明の抗ラットビッグエンドセリ
ン−３のＣ端ペプチド抗体のうち、クラス２の抗体、即
ちＣ端部にＡｒｇアミド基を有するラットビッグエンド
セリン−３のＣ端部ペプチドおよびヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチドと特異的に反応し、Ｃ端部に
Ｇｌｙカルボン酸を有するヒトビッグエンドセリン−３
のＣ端部ペプチドに交差反応しない抗体と、エンドセリ
ン−３のＮ端部に対する抗体とを組み合わせることによ
り、Ｃ端部にＡｒｇアミド基を有するビッグエンドセリ
ン−３に特異的であり、Ｃ端部にＧｌｙカルボン酸を有
するビッグエンドセリン−３と反応しないサンドイッチ
-免疫測定法を確立することができる。

【００２８】また、本発明の抗ラットビッグエンドセリ
ン−３のＣ端ペプチド抗体のうち、クラス３の抗体、即
ちＣ端部がＡｒｇアミド基かＧｌｙカルボン酸かにかか
わらず、ヒトおよびラットビッグエンドセリン−３と特
異的に反応する抗体と、エンドセリン−３のＮ端部に対
する抗体とを組み合わせることにより、Ｃ端部の構造に
かかわらず動物種を越えて広くビッグエンドセリン−３
を検出できるサンドイッチ-免疫測定法を確立すること
ができる。本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ
法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリ
ック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができ
る。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に
対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と
(Ｆ）と抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ
／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液
中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶
性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、
前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、およ
び、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、
第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗
体を用いる固相化法とが用いられる。イムノメトリック
法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識
化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離する
か、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体と
を反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体
を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次
に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を
定量する。また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは
溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量
を測定する。被検液中の抗原量僅かであり、少量の沈降
物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレ
ーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

【００２９】これら個々の免疫学的測定法を本発明法に
適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必
要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操
作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてビッグエンド
セリン−３の測定系を構築すればよい。これらの一般的
な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照す
ることができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノア
ッセイ〕（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続
ラジオイムノアッセイ〕（講談社、昭和５４年発行）、
石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３
年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）
（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免
疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、
「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Te
chniques(Part A))、 同書 Vol.73(Immunochemical Tec
hniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Tec
hniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Tec
hniques(Part D:SelectedImmunoassays))、 同書 Vol.
92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Ant
ibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 V
ol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma
Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカ
デミックプレス社発行)など参照〕。以上のように、本
発明の抗体を用いることによって、ビックエンドセリン
−３を感度良く定量することができる。さらに、本発明
者らは、後述する実施例１２において本発明のビックエ
ンドセリン−３のＣ端部に対する抗体を用いて、アルツ
ハイー病患者におけるビックエンドセリン−３の脳脊髄
液中の濃度を測定したところ、ビックエンドセリン−３
の有意な減少が見られた。このことから、ビックエンド
セリン−３または（および）エンドセリン−３がアルツ
ハイマー病の診断上有用なマーカーとなり、またその減
少がアルツハイマー病の要因の１つであることが考えら
れる。したがって、本発明の抗体を用いる上記の定量法
を用いることによって、アルツハイー病の診断を行なう
ことができる。

【００３０】すなわち、本発明は、（１）本発明のラッ
トビックエンドセリン−３のＣ端部ペプチドを認識する
抗体と、被検液および標識化ラットあるいはヒトビッグ
エンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合
した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定して、
被検液中のビッグエンドセリン−３を定量することを特
徴とするアルツハイマー病の診断方法、および（２）被
検液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体
とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体
上の標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグエンド
セリン−３を定量するアルツハイマー病の診断方法にお
いて、一方の抗体がビッグエンドセリン−３のＮ端部を
認識する抗体で、他方の抗体が本発明のラットビックエ
ンドセリン−３のＣ端部ペプチドを認識する抗体である
ことを特徴とするアルツハイマー病の診断方法を提供す
る。上記の診断方法において、ラットビックエンドセリ
ン−３のＣ端部ペプチドを認識する抗体としては前述し
た特徴を有する抗体、すなわち、例えばＲｂＥ−３０
ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示される
モノクローナル抗体などが用いられる。ビッグエンドセ
リン−３のＮ端部を認識する抗体としては、例えばＡＥ
Ｔ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体などが用い
られる。上記の診断方法（１）の好ましい態様として
は、例えば（１ａ）ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａま
たはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体
と、被検液および標識化ラットビッグエンドセリン−３
とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッグ
エンドセリン−３の割合を測定して、被検液中のビッグ
エンドセリン−３を定量することを特徴とするラットの
アルツハイマー病の診断方法、（１ｂ）ＲｂＥ−３４ａ
で標示されるモノクローナル抗体と、被検液および標識
化ヒトビッグエンドセリン−３とを競合的に反応させ、
該抗体に結合した標識化ビッグエンドセリン−３の割合
を測定して、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量
することを特徴とするヒトのアルツハイマー病の診断方
法などが挙げられる。

【００３１】上記の診断方法（２）の好ましい態様とし
ては、例えば（２ａ）被検液と担体上に不溶化した抗体
および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応
させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定して、
被検液中のビッグエンドセリン−３を定量するアルツハ
イマー病の診断方法において、一方の抗体がＡＥＴ−３
０ａで標示されるモノクローナル抗体で、他方の抗体が
ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａ
で標示されるモノクローナル抗体であることを特徴とす
るラットのアルツハイマー病の診断方法、（２ｂ）被検
液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体と
を同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグエンドセ
リン−３を定量するアルツハイマー病の診断方法におい
て、一方の抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクロ
ーナル抗体で、他方の抗体がＲｂＥ−３４ａで標示され
るモノクローナル抗体であることを特徴とするヒトのア
ルツハイマー病の診断方法などが挙げられる。これらの
診断方法は、前述したビッグエンドセリン−３の定量法
あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができ
る。このように本発明のビッグエンドセリン−３のＣ端
部に反応する抗体は、アルツハイマー病の診断剤として
使用することができる。さらに、本発明のアルツハイマ
ー病の診断方法において使用される抗体としては、本発
明のラットビックエンドセリン−３のＣ端部ペプチドを
認識する抗体に限らず、公知のビックエンドセリン−３
を認識する抗体、エンドセリン−３を認識する抗体やこ
れから見いだされであろうビックエンドセリン−３を認
識する抗体、エンドセリン−３を認識する抗体なども用
いることができる。これら抗体が認識する抗原は、ラッ
ト、ヒトに限られず、マウス、モルモット、ブタ、ウ
シ、ヒツジ、サル、トリ、イヌ由来のビックエンドセリ
ン−３またはエンドセリン−３であってよい。また、こ
れら抗体の認識部位は、Ｃ端部ペプチド、Ｎ端部ペプチ
ド、中心部ペプチドなど何れの部位でもよい。

【００３２】すなわち、本発明は、（１）ビックエンド
セリン−３を認識する抗体と、被検液および標識化ビッ
グエンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結
合した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定し
て、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量すること
を特徴とするアルツハイマー病の診断方法、（２）被検
液と担体上に不溶化した抗体および標識化された抗体と
を同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上
の標識剤の活性を測定して、被検液中のビッグエンドセ
リン−３を定量することを特徴とするアルツハイマー病
の診断方法において、一方の抗体がビッグエンドセリン
−３のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体がビッグエ
ンドセリン−３のＣ端部を認識する抗体であることを特
徴とするアルツハイマー病の診断方法、（３）エンドセ
リン−３を認識する抗体と、被検液および標識化エンド
セリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標
識化エンドセリン−３の割合を測定して、被検液中のエ
ンドセリン−３を定量することを特徴とするアルツハイ
マー病の診断方法、および（４）被検液と担体上に不溶
化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは連
続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定して、被検液中のエンドセリン−３を定量すること
を特徴とするアルツハイマー病の診断方法において、一
方の抗体がエンドセリン−３のＮ端部を認識する抗体
で、他方の抗体がエンドセリン−３のＣ端部を認識する
抗体であることを特徴とするアルツハイマー病の診断方
法を提供する。

【００３３】上記の診断方法において、ビックエンドセ
リン−３を認識する抗体としては、例えばＡＥＴ−３０
ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ、ＲｂＥ−３０
ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示される
モノクローナル抗体などが用いられる。エンドセリン−
３を認識する抗体としては、例えばＡＥＴ−３０ａで標
示されるモノクローナル抗体などが用いられる。より具
体的に分類すると、ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノク
ローナル抗体はラット、ヒトなどのビックエンドセリン
−３またはエンドセリン−３のＮ端部ペプチドを認識す
る抗体である。ｂＥＴ−３１ａまたはｂＥＴ−３２ａで
標示されるモノクローナル抗体はヒトビックエンドセリ
ン−３のＮ端部ペプチドを認識する抗体である。ＲｂＥ
−３０ａまたはＲｂＥ−３２ａで標示されるモノクロー
ナル抗体はヒトビックエンドセリン−３のＣ端部ペプチ
ドを認識する抗体である。ＲｂＥ−３４ａで標示される
モノクローナル抗体はラット、ヒトなどのビックエンド
セリン−３のＣ端部ペプチドを認識する抗体である。上
記の診断方法（１）の好ましい態様としては、（１ａ）
ＡＥＴ−３０ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ、Ｒ
ｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで
標示されるモノクローナル抗体と、被検液および標識化
ビッグエンドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体
に結合した標識化ビッグエンドセリン−３の割合を測定
して、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量するこ
とを特徴とするアルツハイマー病の診断方法、、（１
ｂ）ＡＥＴ−３０ａ、ＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａ
またはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体
と、被検液および標識化ラットビッグエンドセリン−３
とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッグ
エンドセリン−３の割合を測定して、被検液中のビッグ
エンドセリン−３を定量することを特徴とするラットの
アルツハイマー病の診断方法、（１ｃ）ＡＥＴ−３０
ａ、ｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａまたはＲｂＥ−３
４ａで標示されるモノクローナル抗体と、被検液および
標識化ヒトビッグエンドセリン−３とを競合的に反応さ
せ、該抗体に結合した標識化ビッグエンドセリン−３の
割合を測定して、被検液中のビッグエンドセリン−３を
定量することを特徴とするヒトのアルツハイマー病の診
断方法などが挙げられる。

【００３４】上記の診断方法（２）の好ましい態様とし
ては、（２ａ）被検液と担体上に不溶化した抗体および
標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定して、被検液
中のビッグエンドセリン−３を定量することを特徴とす
るアルツハイマー病の診断方法において、一方の抗体が
ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル抗体で、他
方の抗体がｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ、ＲｂＥ−
３０ａ、ＲｂＥ−３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示さ
れるモノクローナル抗体であることを特徴とするアルツ
ハイマー病の診断方法、（２ｂ）被検液と担体上に不溶
化した抗体および標識化された抗体とを同時あるいは連
続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を
測定して、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量す
ることを特徴とするアルツハイマー病の診断方法におい
て、一方の抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクロ
ーナル抗体で、他方の抗体がＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−
３２ａまたはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナ
ル抗体であることを特徴とするラットのアルツハイマー
病の診断方法、（２ｃ）被検液と担体上に不溶化した抗
体および標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反
応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定し
て、被検液中のビッグエンドセリン−３を定量すること
を特徴とするアルツハイマー病の診断方法において、一
方の抗体がＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナル
抗体で、他方の抗体がｂＥＴ−３１ａ、ｂＥＴ−３２ａ
またはＲｂＥ−３４ａで標示されるモノクローナル抗体
であることを特徴とするヒトのアルツハイマー病の診断
方法などが挙げられる。

【００３５】上記の診断方法（３）の好ましい態様とし
ては、（３ａ）ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクロー
ナル抗体と、被検液および標識化エンドセリン−３とを
競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化エンドセリ
ン−３の割合を測定して、被検液中のエンドセリン−３
を定量することを特徴とするアルツハイマー病の診断方
法、（３ｂ）ＡＥＴ−３０ａで標示されるモノクローナ
ル抗体と、被検液および標識化ラットあるいはヒトエン
ドセリン−３とを競合的に反応させ、該抗体に結合した
標識化エンドセリン−３の割合を測定して、被検液中の
エンドセリン−３を定量することを特徴とするラットま
たはヒトのアルツハイマー病の診断方法などが挙げられ
る。これらの診断方法は、前述したビッグエンドセリン
−３の定量法あるいはそれに準じる方法に従って行なう
ことができる。このようにビッグエンドセリン−３また
は（および）エンドセリン−３を認識する抗体は、アル
ツハイマー病の診断剤として使用することができる。

【００３６】

【実施例】以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるべきものでは
ない。

【実施例１】ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド（２２−４１）ＮＨ₂： Ile-Asn-Thr-Pro-Glu-Gln-Thr-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Se
r-Asn-His-Arg-Gly-Ser-Leu-Arg-NH₂（配列番号：２−
ＮＨ₂）の製造 市販のp-メチルBHA樹脂（アプライド バイオシステムズ
社製）０．７６ｇ（０．５ミリモル）を用い、ペプチド
合成機（アプライド バイオシステムズ社製モデル４３
０Ａ）を使用し合成した。樹脂上のアミノ基に２ミリモ
ルのBoc-Arg(Tos）をHOBt/DCCで活性化して縮合した。
樹脂上のＢｏｃ基を５０％トリフルオロ酢酸/塩化メチ
レンで処理しアミノ基を遊離させた後、このアミノ基に
各２ミリモルのBoc-Leu, Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-
Arg(Tos), Boc-His(Bom), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Bo
c-Pro, Boc-Val, Boc-Thr(Bzl), Boc-Gln, Boc-Glu(OcH
ex), Boc-Ileをラットビッグエンドセリン−３のＣ端部
ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂のアミノ酸配列通りにHOB
t/DCCで活性化して縮合し、保護ラットビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂樹脂
２．２９ｇを得た。この樹脂０．３８ｇをｐ-クレゾー
ル共存下無水弗化水素１０ｍｌで０℃、６０分間処理し
た後、弗化水素を減圧留去し残渣をエーテル１０ｍｌで
２回洗浄した。これを５０％−酢酸水で抽出し、不溶物
を濾去し５０％−酢酸水で洗浄した。濾液、洗浄液を合
わせ、減圧濃縮し、１Ｎ−酢酸２ｍｌに溶解した。これ
を１Ｎ−酢酸水で充填したセファデックスＬＨ−２０の
カラム（２．０×８５ｃｍ）に付し、同溶媒で展開し
た。主要画分を集め凍結乾燥し黄白色の粉末８３ｍｇを
得た。 アミノ酸分析値:Gly 2.00(2), Val 0.92(1), Leu 2.00
(2), Ile 0.97(1), Pro 1.92(2), Ser 1.91(2), Thr 2.
06(2), Asp 1.95(2), Glu 2.11(2), His 0.95(1), Arg
2.05(2),Tyr 0.97(1) 質量分析による(M+H)+ ２２３９．１（理論値 ２２３
９．５） ＨＰＬＣ溶出時間 １６．２分 カラム条件 カラム：Wakosil-５Ｃ₁₈ ＨＧ （４．６×１００ｍｍ） 溶離液：Ａ液（０．１％−トリフルオロ酢酸水溶液） Ｂ液（０．１％−トリフルオロ酢酸含有アセトニトリ
ル） を用いＡ液からＢ液へ直線型濃度勾配溶出（５０分） 流速：１．０ ｍｌ／分

【００３７】

【実施例２】ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド（２２−４１）ＮH₂を含む免疫原の作製 上記実施例１で得られたラットビッグエンドセリン−３
のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂と牛チログロブ
リン（ＢＴＧ）との複合体を作製し免疫原とした。即
ち、ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド
（２２−４１）ＮＨ₂ ２．６ｍｇ（１．１μｍｏｌ）
を０．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８に溶
解させ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリロキシ）サクシニ
ミド（ＧＭＢＳ）６．４ｍｇ（２３μｍｏｌ)を含むＤ
ＭＦ溶液１００μｌと混合し、室温で４５分間反応させ
た。セファデックスＧ−２５カラムで分画し、マレイミ
ド基導入ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチ
ド（２２−４１）ＮＨ₂２ｍｇ（０．８μｍｏｌ）を得
た。一方、ＢＴＧ２０ｍｇを、０．１Ｍ ＮａＣｌを含
む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１．４ｍｌに
溶解させ、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリミジル
ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）２．５ｍｇ（８．
０μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液１００μｌと混合し、室
温で６０分間反応させた。この反応液に、ジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）２４．６ｍｇ（１６０μｍｏｌ）を含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００μｌを加
え、室温で３０分間還元した後、０．１Ｍリン酸緩衝液
を展開溶媒とするセファデックスＧ−２５カラムで分画
し、ＳＨ基導入ＢＴＧ１４ｍｇを得た。次に、マレイミ
ド基の導入されたラットビッグエンドセリン−３のＣ端
部ペプチド（２２−４１）ＮH₂ ２ｍｇとＳＨ基の導入
されたＢＴＧ ８ｍｇとを混合し、４℃で１日間反応さ
せた。反応後、生理食塩水に対し、４℃で２日間透析し
た。

【００３８】

【実施例３】免疫 ６〜８週令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウスに上記実施例２記載
の免疫原ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチ
ド（２２−４１）ＮＨ₂−ＢＴＧ複合体、約８０μｇ／
匹を完全フロイントアジュバントとともに皮下免疫し
た。以後３週間おきに同量の免疫原を不完全フロイント
アジュバントとともに２〜３回追加免疫した。

【００３９】

【実施例４】西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標
識化ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド
（２２−４１）ＮＨ₂の作製 上記実施例１で得られたラットビッグエンドセリン−３
のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂とＨＲＰとの複
合体を作製し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識体とし
た。即ち、ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプ
チド（２２−４１）ＮＨ₂ ２．６ｍｇ（１．１μｍｏ
ｌ）を０．４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．８
に溶解させ、ＧＭＢＳ２．２ｍｇ（８．０μｍｏｌ）を
含むＤＭＦ溶液５０μｌと混合し、室温で４０分間反応
させた。セファデックスＧ−２５カラムで分画し、マレ
イミド基導入ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド（２２−４１）ＮＨ₂２ｍｇ（０．８μｍｏｌ）
を得た。一方、ＨＲＰ５ｍｇを、０．１M ＮａＣｌを含
む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１ｍｌに溶解
させ、ＳＰＤＰ０．３ｍｇ(１μｍｏｌ）を含むＤＭＦ
溶液５０μｌと混合し、室温で45分間反応させた。この
反応液に、ＤＴＴ２．３ｍｇ（１５μｍｏｌ）を含む
０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５００μｌを加え、
室温で３０分間還元した後、セファデックスＧ−２５カ
ラムで分画し、ＳＨ基導入ＨＲＰ４ｍｇを得た。次に、
マレイミド基の導入されたラットビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂２ｍｇとＳＨ
基の導入されたＨＲＰ４ｍｇを混合し、４℃で１日間反
応させた。反応後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ−
ファルマシア社製）カラムで分画し、ＨＲＰ標識化ラッ
トビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４
１）ＮＨ₂を得た。

【００４０】

【実施例５】ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド（２２−４１）ＮＨ₂を免疫したマウスの抗血清
中の抗体価の測定 ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２
−４１）ＮＨ₂を免疫したマウス抗血清中の抗体価を測
定した。抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプ
レートを作製するため、まず抗マウスイムノグロブリン
抗体（ＩｇＧ画分、カッペル社製）を１００μｇ／ｍｌ
含む０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェル
マイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で２４
時間放置した。次に、プレートをＰＢＳで洗浄した後、
ウエルの余剰の結合部位をふさぐため２５％ブロックエ
ース（雪印乳業社製）を含むＰＢＳを３００μｌずつ分
注し、少なくとも４℃で２４時間処理した。上記、抗マ
ウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレートの各ウ
エルにバッファーＥＣ〔１０％ブロックエース、０．２
％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、2ｍＭ ＥＤＴＡ、０．
０５％ＣＨＡＰＳ｛３-〔(コラミドプロピル)ジメチル
アンモニオ〕プロパンスルホン酸}および０．１％ Ｎａ
Ｎ₃を含む０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〕５０
μｌ、バッファーＥＣで希釈したマウス抗ラットビッグ
エンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ
₂抗血清１００μｌを加え４℃で１６時間反応させた。
次に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例
４で作製したＨＲＰ標識化ラットビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂をバッファー
Ｃ〔１％ＢＳＡ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〕で３０００
倍希釈し、１００μｌを加え４℃で１日反応させた。次
に、該プレートをＰＢＳで洗浄したのち、固相上の酵素
活性をＴＭＢマイクロウエルパーオキシダーゼ基質シス
テム（KIRKEGAARD＆PERRY LAB, INC、フナコシ薬品取扱
い）１００μｌを加え室温で１０分間反応させることに
より測定した。反応を１Ｍリン酸１００μｌ加えること
により停止させたのち、４５０ｎｍの吸収をプレートリ
ーダー（ＭＴＰ−３２、コロナ社製）で測定した。結果
を〔図１〕に示す。免疫した８匹のマウス全てにラット
ビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４
１）ＮＨ₂に対する抗体価の上昇が認められた。

【００４１】

【実施例６】細胞融合 比較的高い抗体価を示したマウスに対して２００〜３０
０μｇの免疫原を生理食塩水０．２５〜０．３ｍｌに溶
解させたものを静脈内に接種することにより最終免疫を
行なった。最終免疫３〜４日後のマウスから脾臓を摘出
し、ステンレスメッシュで圧迫、ろ過し、イーグルズ・
ミニマム・エッセンシャルメデイウム（ＭＥＭ）に浮遊
させ、脾臓細胞浮遊液を得た。細胞融合に用いる細胞と
して、ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３.Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を用いた〔カレント ト
ピックス イン マイクロバイオロジー アンド イムノロ
ジー、81、1(1978)〕。細胞融合は、原法〔ネイチャ
ー、256、495(1975)〕 に準じて行なった。即ち、脾臓
細胞およびＰ３Ｕ１をそれぞれ血清を含有しないＭＥＭ
で３度洗浄し、脾臓細胞とＰ３Ｕ１数の比率を５：１に
なるよう混合して、８００回転で１５分間遠心を行なっ
て細胞を沈澱させた。上清を充分に除去した後、沈殿を
軽くほぐし、４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
６０００（コッホライト社製）を０．３ｍｌ加え、３７
℃温水槽中で７分間静置して融合を行なった。融合後細
胞に毎分２ｍｌの割合でＭＥＭを添加し、合計１５ｍｌ
のＭＥＭを加えた後６００回転１５分間遠心して上清を
除去した。この細胞沈殿物を１０％牛胎児血清を含有す
るＧＩＴメデイウム（和光純薬）(ＧＩＴ−１０ＦＣ
Ｓ）にＰ３Ｕ１が１ｍｌ当り２×１０⁵個になるように
浮遊し、２４穴マルチデイシュ（リンブロ社製）に１ウ
ェル１ｍｌずつ１２０ウェルに播種した。播種後、細胞
を３７℃で５％炭酸ガスインキュベーター中で培養し
た。２４時間後ＨＡＴ（ヒポキサンチン１×１０^-4Ｍ、
アミノプテリン４×１０^-7Ｍ、チミジン１．６×１０^-3
Ｍ）を含んだＧＩＴ−１０％ＦＣＳ培地（ＨＡＴ培地）
を１ウェル当り１ｍｌずつ添加することにより、ＨＡＴ
選択培養を開始した。ＨＡＴ選択培養は、培養開始３、
６、９日後に旧液を１ｍｌ捨てたあと、１ｍｌのＨＡＴ
培地を添加することにより継続した。ハイブリドーマの
増殖は、細胞融合後９〜１４日で認められ、培養液が黄
変したとき（約１×１０⁶セル／ｍｌ)、上清を採取し、
実施例５に記載の方法に従って抗体価を測定した。

【００４２】

【実施例７】モノクローナル抗ラットビッグエンドセリ
ン−３抗体の作製 高い抗体価が認められた１４種類のハイブリドーマの培
養上清について、ラットビッグエンドセリン−３のＣ端
部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂、ヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂(特開平
０４−１５２８９４公報)、およびヒトビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド（２２−４２）(特開平０４
−１５２８９４公報)に対する反応特異性を下記に示す
方法により調べた。即ち、実施例５に記載の方法に従っ
て、抗マウスイムノグロブリン抗体結合マイクロプレー
トとＨＲＰ標識化ラットビッグエンドセリン−３のＣ端
部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂（５０μｌ）およびハ
イブリドーマ培養上清（５０μｌ）とを、４℃で１日反
応させることにより培養上清の抗体価を調べた。このと
き、１μｇ／ｍｌのラットビッグエンドセリン−３のＣ
端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂、ヒトビッグエンド
セリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂、ヒ
トビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４
２）を５０μｌ、あるいは対照としてバッファーＣを５
０μｌ加え、ＨＲＰ標識化ラットビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂の抗体への結
合が阻害されるかどうか調べた。結果を〔表１〕に示
す。選択したモノクローナル抗体１４種類のうち、３種
類がラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド
（２２−４１）ＮＨ₂に特異的に反応し(クラス１抗
体)、７種類がラットおよびヒトビッグエンドセリン−
３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂に特異的に反
応し(クラス２抗体)、４種類がヒトビッグエンドセリン
−３のＣ端部ペプチド（２２−４２）を含む上記３種類
のペプチドいずれにも反応した(クラス３抗体)。

【００４３】次に、〔表１〕に記載のNo.1、No.2、No.
3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.11の８つのハイブリド
ーマを限界希釈法によるクローニングに付した。クロー
ニングに際しては、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／Ｃ
マウスの胸腺細胞をウェル当り５×10⁵ 個になるように
加えた。クローニング後得られたモノクローナルハイブ
リドーマのうち、〔表１〕記載のNo.4、No.7およびNo.1
1由来のものをそれぞれＲｂＥ−３２（FERM BP-420
8）、ＲｂＥ−３４（FERM BP-4209）およびＲｂＥ−３
０（FERM BP-4207）と呼び、それらが産生するモノクロ
ーナル抗体をそれぞれＲｂＥ−３２ａ、 ＲｂＥ−３４
ａ およびＲｂＥ−３０ａと呼ぶ。これらのハイブリド
ーマを、あらかじめミネラルオイル０．５ｍｌを腹腔内
投与されたマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）に１〜３×１０⁶セ
ル／匹を腹腔内投与したのち、６〜２０日後に抗体含有
腹水を採取した。 モノクローナル抗体は得られた腹水
よりプロテイン−Ａカラムにより精製した。即ち、腹水
６〜２０ｍｌを等量の結合緩衝液（３．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０５％ＮａＮ₃を含む１．５Ｍグリシン、ｐＨ
９．０）で希釈したのち、あらかじめ結合緩衝液で平衡
化したリコンビナントプロテイン−Ａ−セファロース
（Repligen社製）カラムに供し、特異抗体を溶離緩衝液
（０．０５％ＮａＮ₃を含む０．１Ｍクエン酸緩衝液、
ｐＨ３．０）で溶出した。溶出液はＰＢＳに対して４
℃、２日間透析したのち、０．２２μｍのフィルター
（ミリポア社製）により除菌濾過し４℃あるいは−８０
℃で保存した。モノクローナル抗体のクラス・サブクラ
スの決定に際しては、MOUSE MONOCLONAL ANTIBODY ISOT
YPING KIT（アマシャム・ジャパン（株）社製）を用い
て行った〔表１〕。

【００４４】

【表１】 対照として用いたｂＥＴ−３１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−２
９４９で標示されるハイブリドーマ細胞から産生される
抗ビックエンドセリン−３抗体を示す。

【００４５】

【実施例８】競合法酵素免疫測定法（競合法−ＥＩＡ） ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２
−４１）ＮＨ₂に対して高い特異性を示したモノクロー
ナル抗体ＲｂＥ−３０ａ（ＩｇＧ１，κ）、ラットおよ
びヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２
−４１）ＮＨ₂に対して反応特異性を示したモノクロー
ナル抗体ＲｂＥ−３２ａ（ＩｇＧ１，λ）、ヒトビッグ
エンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４２）を含
む上記３種類のペプチドいずれにも反応性を示したモノ
クローナル抗体ＲｂＥ−３４ａ（ＩｇＧ２ａ，κ）の反
応性特異性を競合法−ＥＩＡにより調べた。まず、各モ
ノクローナル抗体溶液の抗体価を実施例５記載の方法に
より調べ、競合法−ＥＩＡに用いる抗体濃度として、標
識体の結合量が飽和結合量の約４０％となる抗体濃度
（１００ｎｇ／ｍｌ）を決定した。次に、抗マウスイム
ノグロブリン抗体結合マイクロプレートに、決定された
濃度にバッファーＣで希釈された抗体溶液５０μｌ、上
記実施例４記載ＨＲＰ標識化ラットビッグエンドセリン
−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂(バッファー
Ｃで１０００倍希釈）を５０μｌ、種々の濃度のビッグ
エンドセリン部分ペプチド、即ちラットビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂、ヒト
ビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４
１）ＮＨ₂、ヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプ
チド（２２−４２）、ヒトビッグエンドセリン−１のＣ
端部ペプチド（２２−３８）（特開平０２−２３８８９
４公報）、ヒトビッグエンドセリン−２のＣ端部ペプチ
ド（２２−３７）（特願平０２−２８２０２４公報)の
バッファーＣ溶液 ５０μｌを加え、４℃で１６時間反
応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄したのち固相上の酵素
活性を上記実施例５記載の方法により測定した。結果を
〔図２〕に示す。

【００４６】ＲｂＥ−３０ａはラットビッグエンドセリ
ン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂に特異的
であり他のペプチドとは交差反応性を示さなかった。
ＲｂＥ−３２ａはヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部
ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂に対し２０％の交差反応
性を有していたが、 他のペプチドとは交差反応性を示
さなかった。一方、ＲｂＥ−３４ａはラットおよびヒト
ビッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４
１）ＮＨ₂およびヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部
ペプチド（２２−４２）に対して同等の反応性を有して
おり、僅かにヒトビッグエンドセリン−１のＣ端部ペプ
チド（２２−３８）と交差反応性（０．５％以下)を示
した。また、これらの抗体を用いる競合法−ＥＩＡによ
りおよそ０．２ｐｍｏｌ／wellのラットビッグエンドセ
リン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）ＮＨ₂を測定
可能であった〔（Ｂ／Ｂ。）＝０．８を与える濃度とし
て計算〕。

【００４７】

【実施例９】ＨＲＰ標識化モノクローナル抗体Ｆ(ａ
ｂ')₂ 画分の調製 上記実施例７記載のＲｂＥ−３０ａ、ＲｂＥ−３２ａお
よびＲｂＥ−３４ａ各３５ｍｇをコロジオンバッグ(エ
ムエス機器社製）で２ｍｌにまで濃縮したのち、０．１
Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液に対し透析し
た。該抗体溶液にペプシン（シグマ社、２回結晶）２ｍ
ｇを加え、３７℃、４８時間反応させたのち、０．１Ｍ
リン酸緩衝液、ｐＨ６．８で平衡化したスーパーロース
１２カラムを用いるＦＰＬＣ（ファルマシア社製）でＦ
(ａｂ')₂画分を精製した。ＲｂＥ−３０ａあるいはＲｂ
Ｅ−３２ａのＦ(ａｂ')₂ 画分６ｍｇ（４０ｎｍｏｌ）
を含む０．１Ｍリン酸緩衝液１ｍｌにＧＭＢＳ、０．１
４ｍｇ（５００ｎｍｏｌ）を含むＤＭＦ５０μlを加
え、室温で４０分反応させた。反応液をセファテックス
Ｇ−２５カラム（１×３０ｃｍ、溶離液、０．１Ｍリン
酸緩衝液、ｐＨ６．７）で分離し、得られたマレイミド
基の導入されたＦ(ａｂ')₂ 画分４ｍｇと、上記実施例
４記載の方法により調製されたＳＨ基の導入されたＨＲ
Ｐ７ｍｇとを混合し、コロジオンバッグで約０．３ｍｌ
にまで濃縮したのち、４℃で１６時間放置した。反応液
を溶離液に０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．５を用いる
ウルトロゲルＡｃＡ３４カラム（１０φ×４０ｃｍ）に
供し、Ｆ(ａｂ')₂−ＨＲＰ複合体画分を精製した。同様
に、 ＲｂＥ−３４ａのＦ(ａｂ')₂ 画分４．４ｍｇ（２
９ｎｍｏｌ）とＧＭＢＳ０．１ｍｇ（３６０ｎｍｏｌ）
を反応させ、抗体にマレイミド基を導入した。一方、上
記実施例４記載の方法に従ってＨＲＰ３０ｍｇ（７５０
ｎｍｏｌ）にＳＰＤＰ０．７ｍｇ（２２００ｎｍｏｌ）
を反応させた後、ＤＴＴ４ｍｇを加え還元することによ
り、ＨＲＰにＳＨ基を導入した。両者を反応させＲｂＥ
−３４ａ-Ｆ(ａｂ')₂を作製した。

【００４８】

【実施例１０】サンドイッチ法−ＥＩＡによるラットビ
ッグエンドセリン−３の測定 サンドイッチ法−ＥＩＡの一般的な方法を以下に示す。
まず、エンドセリン−３に対するモノクローナル抗体Ａ
ＥＴ−３０ａ（Biochem. Biophys. Res. Commun.164, 7
4-80, 1989）を１０μｇ／ｍｌ含む０．１Ｍ炭酸緩衝
液、ｐＨ９．６溶液を９６ウェルマイクロプレートに１
００μｌずつ分注し、４℃で２４時間放置した。ウェル
の余剰の結合部位をＰＢＳで４倍希釈したブロックエー
ス３００μｌを加え不活化した。以上のように調製した
プレートに、バッファーＥＣで希釈したビッグエンドセ
リン−３標準液あるいは試料溶液１５０μｌを加え、４
℃で２４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記
実施例９で作製したＲｂＥ−３０ａ−ＨＲＰ, ＲｂＥ−
３２ａ−ＨＲＰまたはＲｂＥ−３４ａ−ＨＲＰ（バッフ
ァーＣで１５００倍希釈）１００μｌを加え、４℃で２
４時間反応させた。ＰＢＳで洗浄したのち、上記実施例
５記載の方法によりＴＭＢを用いて固相上の酵素活性を
測定した（酵素反応２０分）。

【００４９】試料として、 ラット血漿中のビッグエン
ドセリン−３を測定した結果を〔図３〕に示す。ラット
血漿、 ｍｌをＰＢＳで５倍希釈したのち、 ＡＥＴ−
３０ａ結合トレシルトヨパール〔３ｍｇの精製抗体を１
ｇのトレシルトヨパールゲル（東ソー（株））に指針書
に従い結合させたもの〕に通し、３ｍｌの６０％アセト
ニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ)で
溶出した。溶出液を濃縮したのち、逆相-ＨＰＬＣで分
離した。分離条件を下記に示す。 カラム: ＴＳＫ ＯＤＳ−８０ＴＭ〔４．５×２５０ｍ
ｍ、東ソー（株）〕 溶出液 Ａ：０．０５％ＴＦＡを含む５％アセトニトリ
ル水溶液 溶出液 Ｂ：０．０５％ＴＦＡを含む６０％アセトニト
リル水溶液 溶出条件: 溶出液Ｂの比率： ０〜４０％直線濃度勾配
（５分間） ４０〜６５％直線濃度勾配（２５分間） ６５〜１００％直線濃度勾配（５分間） 溶出速度：１ｍｌ／分 分取：０．５ｍｌ／チューブ 溶出液はバッファーＥＣで５倍に希釈したのち、サンド
イッチ-ＥＩＡの試料とした。〔図４〕に示すように、
ＲｂＥ−３０ａ−ＨＲＰ, ＲｂＥ−３２ａ−ＨＲＰ,お
よびＲｂＥ−３４ａ−ＨＲＰいずれを用いるサンドイッ
チ−ＥＩＡにおいても、 ラット血漿中のビッグエンド
セリン−３が単一ピークとして検出された。

【００５０】

【実施例１１】サンドイッチ法−ＥＩＡによるヒトビッ
グエンドセリン−３の測定 標識体としてＲｂＥ−３２ａ−ＨＲＰあるいはおよびＲ
ｂＥ−３４ａ−ＨＲＰを用いるサンドイッチ-ＥＩＡに
おいて、試料としてヒトビッグエンドセリン−３（１−
４１）ＮＨ₂（ペプチト研より購入）を用いたときの標
準曲線を〔図４〕に示す。いずれのサンドイッチ-ＥＩ
Ａも３〜４ｐｇ／wellのヒトビッグエンドセリン-３
（１−４１）ＮＨ₂を検出した。

【００５１】

【実施例１２】アルツハイマー病患者脳脊髄液中のビッ
グエンドセリン−３の測定 アルツハイマー病患者（ｎ＝５、年齢６４±８歳)、 ア
ルツハイマー型老年痴呆患者（ｎ＝７、年齢７８±５
歳)、および対照患者（非アルツハイマー患者、例えば結
核性髄膜炎、パーキンソン症候群など、ｎ＝１０、年齢
５６±８歳)の脳脊髄液をバッファーＥＣで３倍希釈し
たのち、 実施例１０記載のＲｂＥ−３４ａ−ＨＲＰを用
いるサンドイッチ−ＥＩＡによりビッグエンドセリン−
３を測定した。 結果を〔表２〕に示す。

【００５２】

【表２】 〔表２〕より、アルツハイマー病患者およびアルツハイ
マー型老年痴呆患者においては、対照患者と比較して有
意にビッグエンドセリン−３濃度が減少していることが
分かった。

【００５３】

【発明の効果】本発明の抗体を用いることにより、感度
が良く、優れた特異性を有するビッグエンドセリン−３
測定法が提供される。それらのなかには、ヒトおよびラ
ットビッグエンドセリン−３いずれをも、また、Ｃ端部
がアミド基でもカルボン酸でも、いずれをも認識する測
定法が含まれており、臨床上もラットなどの動物実験上
も極めて有用な測定法として使用できる。また、アルツ
ハイマー病患者では、ビックエンドセリン−３の血中濃
度が増加していることから、ビックエンドセリン−３を
感度良く認識できる本発明の抗体は、アルツハイマー病
の診断剤として使用できる。

【００５４】

【配列表】

【配列番号：１】 配列の長さ：４１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg

【００５５】

【配列番号：２】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg

【００５６】

【配列番号：３】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ

【００５７】

【配列番号：４】 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｇｌｙ

【００５８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ラットビッグエンドセリン−３（２２−４１）
ＮＨ₂をマウスに免疫した際の各マウスの抗体価をパー
オキシダーゼ標識ラットビッグエンドセリン−３（２２
−４１）ＮＨ₂を用いる酵素免疫測定法で調べた結果を
示す。

【図２】パーオキシダーゼ標識ラットビッグエンドセリ
ン−３（２２−４１）ＮＨ₂を用いる競合法酵素免疫測
定法により本発明のモノクローナル抗体ＲｂＥ−３０
ａ、ＲｂＥ−３２ａおよびＲｂＥ−３４ａの反応特異性
を調べた結果を示す。図中の記号はそれぞれ、ラットビ
ッグエンドセリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４１）
ＮＨ₂（○）、ヒトビッグエンドセリン−３のＣ端部ペ
プチド（２２−４１）ＮＨ₂（△）、ヒトビッグエンド
セリン−３のＣ端部ペプチド（２２−４２）（□）、ヒ
トビッグエンドセリン−１のＣ端部ペプチド（２２−３
８）（●）、ヒトビッグエンドセリン−２のＣ端部ペプ
チド（２２−３７）（■）を表す。また、図中、Ｂは抗
原存在下での標識抗原の抗体への結合量を、またＢ。は
抗原非存在下での標識抗原の抗体への結合量を示す。

【図３】本発明のサンドイッチ-酵素免疫測定法によ
り、逆相−ＨＰＬＣで分離されたラット血漿中のビッグ
エンドセリン−３を検出した結果を示す。ＲｂＥ−３０
ａ、ＲｂＥ−３２ａおよびＲｂＥ−３４ａいずれの酵素
標識体を用いるサンドイッチ−酵素免疫測定法において
もラット血漿中のビッグエンドセリン−３が単一ピーク
として検出された。

【図４】ＲｂＥ−３２ａおよびＲｂＥ−３４ａを用いる
サンドイッチ−酵素免疫測定法におけるヒトビッグエン
ドセリン−３（１−４１）ＮＨ₂の標準曲線を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 7/08 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部に
   反応する抗体。
2. 【請求項２】ラットビッグエンドセリン−３が式 Cys Thr Cys Phe Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Cys Val Tyr Tyr Cys His Leu Asp Ile Ile Trp Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ （配列番号：１−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドである請求
   項１記載の抗体。
3. 【請求項３】ラットビッグエンドセリン−３のＣ端部が
   式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn His Arg Gly Ser Leu Arg-NH₂ （配列番号：２−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するペプチドである請求
   項１〜２記載の抗体。
4. 【請求項４】抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドおよび式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドのいずれとも交差反応しない請
   求項１〜３記載の抗体。
5. 【請求項５】抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドとは反応するが、式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドとは交差反応しない請求項１〜
   ３記載の抗体。
6. 【請求項６】抗体が式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg-NH₂ （配列番号：３−ＮＨ₂） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドおよび式 Ile Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr Arg Gly Ser Phe Arg Gly （配列番号：４） で表わされるアミノ酸配列を有するヒトビッグエンドセ
   リン−３のＣ端ペプチドのいずれとも反応する請求項１
   〜３記載の抗体。
7. 【請求項７】抗体がモノクローナル抗体である請求項１
   〜６記載の抗体。
8. 【請求項８】抗体がＲｂＥ−３０ａで標示されるモノク
   ローナル抗体である請求項４記載の抗体。
9. 【請求項９】抗体がＲｂＥ−３２ａで標示されるモノク
   ローナル抗体である請求項５記載の抗体。
10. 【請求項１０】抗体がＲｂＥ−３４ａで標示されるモノ
    クローナル抗体である請求項６記載の抗体。
11. 【請求項１１】請求項７記載のモノクローナル抗体を産
    生するハイブリドーマ細胞。
12. 【請求項１２】請求項８記載のモノクローナル抗体を産
    生するハイブリドーマ細胞。
13. 【請求項１３】請求項９記載のモノクローナル抗体を産
    生するハイブリドーマ細胞。
14. 【請求項１４】請求項１０記載のモノクローナル抗体を
    産生するハイブリドーマ細胞。
15. 【請求項１５】請求項１記載の抗体と、被検液および標
    識化ラットあるいはヒトビッグエンドセリン−３とを競
    合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッグエンド
    セリン−３の割合を測定することを特徴とする被検液中
    のビッグエンドセリン−３の定量法。
16. 【請求項１６】被検液と担体上に不溶化した抗体および
    標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
    のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特
    徴とする被検液中のビッグエンドセリン−３の定量法に
    おいて、 一方の抗体がビッグエンドセリン−３のＮ端
    部を認識する抗体で、他方の抗体が請求項１記載の抗体
    であることを特徴とする被検液中のビッグエンドセリン
    −３の定量法。
17. 【請求項１７】請求項１記載の抗体と、被検液および標
    識化ラットあるいはヒトビッグエンドセリン−３とを競
    合的に反応させ、該抗体に結合した標識化ビッグエンド
    セリン−３の割合を測定して、被検液中のビッグエンド
    セリン−３を定量することを特徴とするアルツハイマー
    病の診断方法。
18. 【請求項１８】被検液と担体上に不溶化した抗体および
    標識化された抗体とを同時あるいは連続的に反応させた
    のち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定して、被検液
    中のビッグエンドセリン−３を定量するアルツハイマー
    病の診断方法において、 一方の抗体がビッグエンドセ
    リン−３のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が請求
    項１記載の抗体であることを特徴とするアルツハイマー
    病の診断方法。
19. 【請求項１９】請求項１記載の抗体を含有することを特
    徴とするアルツハイマー病診断剤。