JP2647847B2

JP2647847B2 - ＢａｍＨＩ制限修飾系のクローニング

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Publication number: JP2647847B2
Application number: JP62141310A
Authority: JP
Inventors: ジヨアン・ブルツクス; キンバリー・ハワード
Original assignee: NYUU INGURANDO BAIOREIBUSU Inc
Current assignee: NYUU INGURANDO BAIOREIBUSU Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1997-08-27
Anticipated expiration: 2012-08-27
Also published as: ATE113653T1; DE3751730T2; DE3750708D1; EP0248678A3; EP0248678B1; AU607141B2; DE3751923T2; JPS6387982A; EP0248678A2; EP0618295B1; CN87104039A; DE3751923D1; US5320957A; US5137823A; EP0618295A1; EP0618296B1; DE3750708T2; DE3751730D1; EP0618296A1; AU7389287A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、BamH I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼのクローン、及びこれらのクローン及び酵素を
産生するための関連方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在してい
る酵素の一類である。他の細菌成分不純物から精製され
た制限エンドヌクレアーゼはDNA分子を厳密なフラグメ
ントに分断するために実験室で使用することができる。
この特性によりDNA分子を個々に同定することができ、
構成遺伝子に断片化することができる。制限エンドヌク
レアーゼは、最近の遺伝子研究で不可欠な手段であるこ
とが立証された。制限エンドヌクレアーゼは遺伝子工学
及び分析に用いられる生化学的「はさみ」（scissors）
である。

制限エンドヌクレアーゼはDNA分子に沿って特定のヌ
クレオチド配列（「認識配列」）を認識し且つ該配列に
結合する機能を有する。制限エンドヌクレアーゼはいっ
たん結合すると、該配列の範囲内又はその片側で分子を
開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼは夫々異なる
認識配列に対して親和性を有している。今日までに試験
されている数百種類の細菌種のうちで、100種類に近い
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。

細菌は、多くても種当たり非常に少数の制限エンドヌ
クレアーゼしか保有しないという傾向がある。エンドヌ
クレアーゼは典型的には起源となる細菌に従って命名さ
れている。Haemophilus aegyptius種は例えば３種類の
異なる制限エンドヌクレアーゼ、Hae I、Hae II及びHae
IIIを合成する。これらの酵素は夫々配列（AT）GGCC
（AT）、PuGCGCPy及びGGCCを認識し、開裂する。他方、
大腸菌（Escherichia coli）RY13は、配列GAATTCを認識
するただ１種類の酵素EcoR Iしか合成しない。

天然には、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄
において保護の役割を果たす。制限エンドヌクレアーゼ
は、細菌を殺すか又はこれに寄生するウイルス及びプラ
スミドのような外来DNA分子による感染に対する耐性を
細菌に与える。制限エンドヌクレアーゼは、感染DNA分
子の長さを走査し、認識配列が出現する毎にこの長さを
切断することにより耐性を与える。切断が生じると、感
染遺伝子の多くは不能になり、そのDNAは非特異的エン
ドヌクレアーゼにより更に分解される。

細菌保護系の第２の成分は修飾メチラーゼである。こ
れらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに相補的であり、
細菌に自己のDNAを認識させ、外来感染DNAから区別させ
る手段を構成する。修飾メチラーゼは、対応する制限エ
ンドヌクレアーゼと同一のヌクレオチド認識配列を認識
し、これに結合するが、DNAを切断する代わりに、メチ
ル基を加えることにより該配列内で所定のヌクレオチド
を化学的に修飾する。このメチル化の結果、認識配列は
もはや制限エンドヌクレアーゼにより結合又は開裂され
ない。細菌細胞のDNAはその修飾メチラーゼにより常に
完全に修飾されており、従って、内因性制限エンドヌク
レアーゼの存在に対して無感応である。制限エンドヌク
レアーゼの認識及び攻撃に対して感応性を有するのは、
未修飾、従って外来性と判断されるDNAに限られる。

遺伝子工学技術の出現に伴い、遺伝子をクローニング
し、遺伝子によりコードされるタンパク質及び酵素を従
来の精製技術で得られるよりも大量に生産することが今
日では可能である。制限エンドヌクレアーゼクローンを
単離するための鍵は、10^-4〜10^-3程度の低い頻度で発生
する場合、複合「ライブラリー」、即ち「ショットガ
ン」法により得られるクローン集団内でこのようなクロ
ーンを同定するための簡単で信頼できる方法を開発する
ことにある。好ましくは該方法は、不要な大多数のクロ
ーンが破壊され且つ数少ない所望のクローンが生存でき
るように選択的とすべきである。

II型の制限修飾系のクローニングは非常な勢いでされ
つつある。最初にクローニングされた系では、制限エン
ドヌクレアーゼクローンを選択的に単離する手段として
バクテリアオファージ感染を使用した（Pst I Walder
他、Proc.Nat.Acad.Sci.74 1503−1507（1981）,HhaIIM
ann他、Gene ３:97−112（1981））。細菌中に制限修飾
系が存在していることにより、該系はバクテリアファー
ジによる感染に抵抗し得るので、クローニングされた制
限修飾遺伝子をもっている細胞は、原則としてファージ
にさらされたライブラリーから生存体として選択的に単
離され得る。しかしながら、この方法の価値は限られた
ものであることがわかった。具体的にいうと、クローニ
ングされた制限修飾遺伝子は選択的な生存をもたらすに
十分なファージ耐性を常に示すとは限らないことがわか
った。別のクローニングのアプローチは、プラスミド耐
性として初期に特徴付けられた系を大腸菌クローニング
プラスミドに形質転換するものである（EcoR V、Bougue
leret他、Nucl.Acid.Res.129:3659−3676 1984;PaeR7、
Gingeras及びBrooks,Proc.Nal.Acad.Sci.USA 80:402−4
06 1983,Theriault及びRoy,1982;Pvu II,Blumenthal
他、J.Bacteriol.164:501−509 1985）。更に、今日で
は活性メチラーゼ遺伝子を選択することによりクローニ
ングされる系の数が増しつつある（BsuR I,Kiss他、Nuc
l.Acid.Res.13:6403−6421 1986;Taq I）。２つの遺伝
子は多くの場合近接して連結しているので、同時にクロ
ーニングされる。しかしながら、メチラーゼ選択は必ず
しも完全な制限系をもたらさない（BspR I,Szomolanyi
他、Gene 10:219−225 1980;Msp I,Walder他、J.Biol.C
hem.258:1235−1241 1983）。メチラーゼ遺伝子に隣接
するより大きい領域をクローニングしても、活性なエン
ドヌクレアーゼ遺伝子を作製することはできるとは限ら
ない。

所定の系では、メチル化により十分に保護されていな
い宿主にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとする
際にクローニングの問題が生じ得る。メチラーゼ遺伝子
とエンドヌクレアーゼ遺伝子とが共通のDNAフラグメン
トに導入される場合、メチラーゼ遺伝子生成物はエンド
ヌクレアーゼ遺伝子生成物が宿主ゲノムを開裂する前に
宿主を修飾しなければならない。

各種のメチラーゼをクローニングする過程で、これら
の系を大腸菌中にクローニングする際の別の障害が発見
された。多くの大腸菌株（一般にクローニングで使用さ
れているものを含む）は、異種メチル化シトシンを含む
DNAが細胞に導入されるのを阻止する系を有している（R
aleigh及びWilson）。従って、どの大腸菌株をクローニ
ングに使用すべきかについて入念に検討することも必要
である。

精製された制限エンドヌクレアーゼ、及び修飾メチラ
ーゼについても、これらは実験室でDNAを特徴付け及び
再配列するための有用な手段であるので、これらの酵素
を大量に合成する細菌株を得る方法を開発することは産
業上奨励されている。このような菌株は精製作業を単純
化すると共に産業上有効な量を産生する手段を提供する
という点で有用である。

本発明によると、制限酵素及び／又は対応する修飾酵
素をコードする遺伝子をクローニングし、遺伝子を高い
レベルで発現できるようにすることにより、制限酵素及
び／又は対応する修飾酵素を産生する新規アプローチが
提供される。より特定的には、これらの酵素をクローニ
ングする新規方法、こうして作製されたクローン、及び
酵素自体の産生方法が提供され、この産生方法は、メチ
ル化により宿主を十分に保護するように適当な宿主内で
メチラーゼ遺伝子をクローニング及び発現させ、第２段
階として、メチラーゼ遺伝子に比較して低いレベルでエ
ンドヌクレアーゼを発現するベクター上のエンドヌクレ
アーゼ遺伝子を、メチラーゼクローンを含む宿主にクロ
ーニング及び導入することから成る。

以下、夫々Desulfovibrio desulfuricans及びBacillu
s amyloiquefaciensのDde I及びBamH I制限及び修飾遺
伝子にこの方法を適用する例、及びこの方法により作製
され、Dde I及びBamH I制限及び修飾酵素を精製するた
めの新規で有益な方法の基礎となるクローンについて詳
細に説明する。

本発明は、２段階法を使用する制限修飾系をクローニ
ングし、該方法によって産生された制限酵素を採取する
ための新規アプローチを提供するものである。このアプ
ローチは、対応する制限遺伝子の認識配列がクローン又
は宿主内に存在している場合、このような修飾遺伝子を
含んでいるクローンを含んでいる宿主が対応する制限遺
伝子の認識配列内でそれ自体のDNAをメチル化するとい
う事実を利用するものである。従って、このようなクロ
ーンは対応する制限エンドヌクレアーゼによるin vitro
での消化に耐性である。従って、これらのクローンを含
んでいる宿主に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入す
ると、メチラーゼで保護された宿主が選択的に生存す
る。

第１段階で所望の制限遺伝子に対応するメチラーゼ遺
伝子はクローニングされ、好ましくは高レベルのメチラ
ーゼを発現する誘導体が構成される。次に第２段階で制
限遺伝子はメチラーゼ遺伝子を含んでいる宿主にクロー
ニングされ、エンドヌクレアーゼ活性をスクリーニング
される。対応するメチラーゼ遺伝子により十分保護され
た宿主内でエンドヌクレアーゼ遺伝子は発現される。

理論に拘束されるつもりはないが、発明者らの確信す
る処では、従来のクローニングシステムは共通のDNAフ
ラグメント上のメチラーゼ遺伝子及びエンドヌクレアー
ゼ遺伝子を宿主に導入しなければならず、クローン及び
その宿主のメチル化が不十分であるので、対応するエン
ドヌクレアーゼが宿主ゲノムを開裂することを許すの
で、しばしば、活性エンドヌクレアーゼ遺伝子を産生す
ることができなかった。本発明によるとこのような問題
は、まずメチラーゼ遺伝子を導入及び発現させるか又は
その発現の程度を増加させ、次にメチラーゼに比較して
低いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するベクター上
にエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることに
より克服される。

制限遺伝子を好適にクローニング及び発現させる本発
明の方法は、以下の段階を含んでいる。

A.メチラーゼ遺伝子のクローニング 1.クローニングすべき細菌種のDNAを精製する。ウイル
スも制限修飾系を含んでおり、従って原料として使用し
てもよいことが最近になって発見された。

2.DNAを適当な制限エンドヌクレアーゼで部分的又は完
全に消化させる。

3.得られたフラグメントを、pBR322、pUC8,9,18もしく
は19又はpBR328のようなクローニング用ベクター、ある
いは例えばリンカーを含むこれらの誘導体に連結反応さ
せ、混合物を使用して大腸菌細胞のような適当な宿主細
胞を形質転換させる。

4.DNA/細胞混合物を形質転換細胞に選択的な抗生物質培
地で平板培養する。インキュベーション後、形質転換細
胞コロニーを集め、懸濁させ、飽和に達するまで増殖さ
せて一次細胞ライブラリーを形成する。

5.一次細胞ライブラリーから組換体プラスミドを完全に
精製し、一次プラスミドライブラリーを形成する。

6.次に、所望のメチラーゼ遺伝子に対応する制限酵素で
プラスミドライブラリーをin vitroで完全に消化させ
る。エキソヌクレアーゼ及び／又はフォスファターゼを
消化物に加えて非メチラーゼクローンの破壊を助長して
もよい。

7.消化されたDNAを大腸菌に形質転換させ、抗生物質プ
レートで平板培養すると形質転換コロニーが再び得られ
る。これらのコロニー、即ち二次細胞個体のいくつかを
採取し、それらのDNAにメチラーゼ遺伝子が存在してい
るかどうかを分析できる。残っているコロニーを掻き集
めて二次細胞ライブラリーを形成し、その後このライブ
ラリーから二次プラスミドライブラリーを作成する。

8.二次プラスミドライブラリーを制限エンドヌクレアー
ゼ（エキソヌクレアーゼ又はフォスファターゼを併用す
るか又は併用せずに）で再び消化し、選択を繰り返し、
三次細胞個体、三次細胞ライブラリー及び三次プラスミ
ドライブラリーを回収する。

9.各回の制限エンドヌクレアーゼ消化により、非メチラ
ーゼクローンを選択的に破壊し、所望のメチラーゼを有
するクローンの相対頻度を増加させる。

10.二次及び三次集団のうちで生存しているコロニーを
採取し、メチラーゼ遺伝子の存在を分析する。

11.以下に述べる４種類の簡単な試験により、メチラー
ゼスクリーニングを実施する。

（ａ）クローンの組換体プラスミドDNA分子を精製し、i
n vitroで選択制限エンドヌクレアーゼにさらし、消化
に対して耐性であることを確認する。プラスミドベクタ
ーがエンドヌクレアーゼに対応する部位を数個有してい
るのであれば、耐性は突然変異による部位損失よりも修
飾を意味する。

（ｂ）供与体細胞DNAを断片化するために初めに使用し
た酵素で組換体プラスミドを消化させる。クローン中に
存在しているフラグメントは、メチラーゼ遺伝子をコー
ドするのに十分な大きさ（即ち500塩基対を上回る）を
有していると理解されるべきであり、最も重要な点とし
て、各種の独立して形成されたクローンに共通して言え
ることであるが、全クローンに同一のフラグメントが存
在しているべきである。

（ｃ）クローンの全クロモソームDNA、又は細胞中で増
殖したファージから細胞又はDNAに導入された第２のプ
ラスミドDNAを精製し、選択的制限エンドヌクレアーゼ
にさらす。クローンがメチラーゼ遺伝子をもっているな
ら、細菌クロモソーム、プラスミド又はファージDNAは
部分的又は完全にメチル化され、消化に耐性であるべき
である。

（ｄ）クローンからの細胞抽出物を調製し、メチラーゼ
活性をin vitroで試験する（メチラーゼ保護及び放射線
標識）。特異的なメチラーゼ活性がしばしば認められ
る。

12.メチラーゼ遺伝子をシトシン又はアデニンメチラー
ゼのいずれかとして特徴付け、対応するエンドヌクレア
ーゼ遺伝子をクローニングするための適当な宿主を決定
する。あるいは一連の宿主系を使用してメチラーゼ遺伝
子をクローニングし、そのメチル化特異性を決定しても
よい。

B.エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング 1.エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場
合近接して結合しているので、メチラーゼ遺伝子を含ん
でいるクローンを同種タンパク質から構成されたエンド
ヌクレアーゼ遺伝子のプローブとして使用するサザンブ
ロットにより、ゲノム上のメチラーゼ遺伝子を包囲して
いる領域をマッピングする。地図中でのメチラーゼクロ
ーンと細菌クロムソームとの間に何らかの不一致によ
り、DNA再配列が発生した位置が確認され、実際にエン
ドヌクレアーゼ遺伝子の位置が示される。

2.制限地図を利用して細菌種のDNAを再び適当な制限酵
素で消化させる。プローブにハイブリダイズする適当な
寸法範囲のフラグメントを精製し、メチラーゼに比較し
て低いレベルでエンドヌクレアーゼを発現するクローニ
ング用ベクターに連結反応させる。適当なベクターは、
好ましくはメチラーゼ遺伝子を含むクローニング用ベク
ターに適合性のベクターである。この混合物を使用して
次にメチラーゼプラスミドを有している宿主細胞を形質
転換させる。好適な例ではないが、エンドヌクレアーゼ
遺伝子の発現が低いか又はプロモーターにより厳重に制
御されるなら、メチラーゼ遺伝子を含むクローニング用
ベクターにエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入してもよ
い。混合物を使用し、メチラーゼプラスミドを使用する
か又は使用せずに宿主細胞を形質転換させる。いずれの
場合も、DNA/細胞混合物は形質転換細胞に選択的な抗生
物質培地で平板培養する。

3.制限エンドヌクレアーゼスクリーニングは以下に述べ
る３種類の方法で実施することができる。

（ａ）クローンからの細胞抽出物を調製し、感受性DNA
を消化する能力をin vitroで試験した。制限エンドヌク
レアーゼ活性が認められるべきである。

（ｂ）細胞自体がファージ感染に抵抗する能力をin vit
roで試験する。ファージ感染に対する耐性は、制限修飾
系の存在を意味している。

（ｃ）エンドヌクレアーゼ遺伝子に対して形成されたオ
リゴヌクレオチドプローブの配列に相補的な配列及び／
又はメチラーゼ遺伝子のプローブに隣接し且つ該プロー
ブ中に含まれない領域が形質転換コロニーに存在してい
るか否かをハイブリダイゼーションにより試験すること
もできる。

以上要約した段階は本発明を実施するための好適方法
を示すものであるが、当該技術分野で既知の技術に従っ
て上記方法を変更できることは当業者に自明であろう。

Dde I及びBamH Iの制限及び修飾遺伝子を含んでいる
クローンを、本発明に従って作製した。上記遺伝子を含
むDNAの原料は、Desulfoibrio desulfuricans（Dde I）
（NCIB83120）及びBacillus amyloiquefaciens H BamH
I（試料はAmerican Type Culture CollectionにATCC534
95で寄託されている）とした。

制限及び修飾遺伝子の適切なクローニングを妨げる一
因は、宿主として使用される大腸菌株にある。多くの細
菌は大腸菌を含む制限修飾系を有している。大腸菌で最
もよく知られている系は、宿主特異性決定基又はHsd系
であるが、特にP1及びEcoR系のような他の系も存在して
いる（Roberts,R.J.,Nucl.Acids Res.12S:R167−204（1
984））。これらの系は形質転換中にもたらされるDNAを
破壊するので、クローニングを干渉し、形質転換体の数
は少なく非典型的なライブラリーが形成される。従っ
て、一般に本発明の実施にあたり、好適な大腸菌は制限
形が突然変異又は欠失によって不活性化されているよう
な種類である。これらの系が不活性化されているか又は
不在であり且つ一般的なクローニングの目的で使用でき
る好適な菌株は、HB101（hsdR^-M^-）ATCC33694、RR1（hs
dR^-M^-）ATCC31343、K802（hsdR^-M^-）ATCC33526、K803
（hsdR^-M^-）ATCC27065及びMM294（hsdR^-M^-）ATCC33625
及びER1467（hsdR^-M^-）を含み、このうち最後の菌株の
試料はAmerican Type Culture CollectionにATCC53496
で寄託してある。

特に外来制限及び／又は修飾遺伝子の大腸菌クローニ
ングに関しては、適切なクローニングを妨害する別の系
も存在している。系は不明であり、“Rgl"系と呼称され
る（Revel,H.R.,Bacteriophage T4,pp.156−165 Americ
an Society of Microbiology（1983）及びRevel他、Ann
ual Review of Genetics 4:177−192（1970））。より
特定的には、大腸菌Rgl系はメチル化シトシン残基を有
するDNA分子を制限し、従ってまさに単離すべき自己メ
チル化されたプラスミドクローンを破壊する。Rgl系はm
crB（ｍodified ｃytosine ｒestriction,Raleigh及びW
ilson前掲）と命名されている遺伝子座により調節され
ることが最近示された。従って、このようなメチラーゼ
遺伝子をクローニングするためには、Hsd（普遍）系及
びRgl（特異）系の両方を欠失している大腸菌宿主を使
用すると好適である。‘mcrB'遺伝子座をTn10挿入で不
活性化することにより、新規系のクローニング株を構成
した。メチラーゼ遺伝子がシトシン型のクローンである
場合に好適に使用されるこのような菌株の一例はER1467
であり、この菌株はmcrBにTn10挿入を含むJC1552の誘導
株（Bachman,Bacteriol.Rev.36:525;1972）である。し
かしながら、クローニングされたメチラーゼ遺伝子の総
てが感受性という訳ではない。より特定的には、アデニ
ン残基をメチル化する遺伝子はシトシン残基をメチル化
する遺伝子に較べてRgl系による影響を全く受けないよ
うに思われる。

理論に拘束される意図はないが、発明者らの確信する
処では、Rgl系はRgl A及びRgl Bと呼称される２種の成
分から構成されている。Rgl Bはシトシン−メチラーゼ
を含む多くのDNAを制限するが、現時点ではRgl Aはただ
１種の特異性クローン（Hpa II）しか制限しないものと
して知られている。

特徴付けされていない制限−修飾系の制限及び／又は
修飾遺伝子、又はシトシンをメチル化することがかって
いる該遺伝子をクローニングするための宿主を選択する
に当たり、好適な宿主は三重突然変異株である大腸菌株
であり、即ちHsd、Rgl A及びRgl B系を欠失している菌
株である。このような菌株にはK802がある。Dde Iに好
適な宿主はhstR^-M^-及びrglA⁺B^-であるER1467である。他
方、修飾系がアデニン−メチラーゼ型の系であるとわか
っている場合、宿主のRgl活性は無視できる。rglはアデ
ニンメチラーゼに干渉しないが、大腸菌に於ける他の更
に貧弱にしか特徴付けられていない系もアデニンメチル
化に作用し得る。従って、宿主の選択はクローニングす
べき修飾遺伝子の特徴に依存する。第Ｉ表は、数種類の
修飾遺伝子のクローニングに関する数種類の大腸菌株の
適合性を要約したものである。

なお以下に、本発明を要約する。

（ｉ） Bacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし、第７図
の1750bpから4600bpまでのXmn−Hind III間に示される
ような制限部位を有する、単離されたDNA。

（ii） Bacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ上記
（ｉ）に記載の制限部位を有するDNAセグメントがベク
ター内に挿入されたものからなる組換えDNAベクター。

（iii） Bacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼを
コードし、第７図の0bpから4600bpまでのHind III−Hin
d III間に示されるような制限部位を有する、単離され
たDNA。

（iv） Bacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼを
コードし、且つ上記（iii）に記載の制限部位を有する
単離DNAがベクター内に挿入されたものからなるクロー
ニングベクター。

（ｖ） Bacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ上記
（ｉ）に記載の制限部位を有するDNAセグメントがベク
ター内に挿入されたものからなる組換えDNAベクター
か、又はBacillus amyloliquefaciensによって産生さ
れるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼを
コードし且つ上記（iii）に記載の制限部位を有する単
離DNAがベクター内に挿入されたものからなるクローニ
ングベクター、によって形質転換された原核宿主細胞。

（vi） BamH I制限エンドヌクレアーゼの製造方法であ
って、Bacillus amyloliquefaciensによって産生され
るBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ上記
（ｉ）に記載の制限部位を有するDNAセグメントがベク
ター内に挿入されたものからなる組換えDNAベクター
か、又はBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラー
ゼをコードし且つ上記（iii）に記載の制限部位を有す
る単離DNAがベクター内に挿入されたものからなるクロ
ーニングベクター、によって形質転換され、BamH Iによ
る切断から防御された原核宿主細胞を、前記エンドヌク
レアーゼの発現に適する条件下で培養することを包含す
る前記方法。

以下の実施例は、現在好適に実施される本発明の実施
態様を示すためのものである。これらの実施例は例示に
過ぎず、本発明は特許請求の範囲に示されている以外は
これらの実施例に限定されないものと理解されたい。

実施例Ｉ（参考例） Dde I制限−修飾遺伝子のクローニング A.メチラーゼ遺伝子のクローニング及びその活性の特徴
付け 1.DNA精製： D.desulfuricans DNAを以下の方法により精製した。5
gの凍結細胞を20mlの25％ショ糖、50mM Tris,pH8.0に再
懸濁した。10mlの0.25M EDTA、pH8.0と、0.25M Tris,pH
8.0中の10mg/mlのリゾチーム6.0mlとを加えた。懸濁液
を氷上に２時間放置した。その後、24mlの溶菌緩衝液
（１％Triton X−100,50mM Tris,pH8.0,67mM EDTA）
と、5mlの10％SDSとを加えて混合し、細胞を溶解させ
た。等量のフェノール（100mM Tris,pH8.0で平衡化）を
加え、溶液を振蕩により乳化させた。次に70mlのクロロ
ホルムを加え、10分間振蕩させた。次に混合物をBeckma
n遠心基で10Kで30分間遠心し、DNAを含んでいる頂部水
層を新しいびんに移し、フェノール／クロロホルムで更
に２回再抽出した。

次に10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0を４回交換して24時間
にわたって水層を透析した。透析したDNA溶液を0.1容量
のRNアーゼ（10mg/ml）で37℃で１時間処理した。最終
濃度が0.4M NaClに達するまで5M NaCl溶液を加え、２容
量のエタノールを溶液の頂部に積層させた。DNAをガラ
ス棒に巻き付け、70％エタノールで１回洗い、次に15ml
の10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0に溶解させた。DNAを−20
℃で凍結保存した。5gの細胞から、1.5mgの精製DNAが回
収された。

2.完全消化： 100μの反応液中で、Hind III緩衝液（10mM Tris,p
H7.5;10mM MgCl₂;50mM NaCl;10mM B−メルカプトエタノ
ール）中の15単位のHind IIIと共に10μｇの精製D.desu
lfuricans DNAを37℃で１時間インキュベートすること
により、D.desulfuricansライブラリーを作成した。

3.連結反応 1000単位のT4 DNAリガーゼ（New England Biolabs）
と共に50mM Tris,pH7.5,10mM MgCl₂,10mM DTT,0.5mM AT
Pを含む100μの反応液容量中で、消化されたDNA4μｇ
を、Hind IIIで開裂し脱リン酸化したpBR322（New Engl
and Biolabs）２μｇに連結反応させた。連結反応は16
℃で４時間継続した。次に試料をクロロホルムで処理
し、（50mM CaCl₂中の）200μの氷冷コンピテントRR1
細胞を形質転換させるために使用した。細胞に42℃で２
分間熱ショックを与え、5mlのルリアブロス（Ｌ−Brot
h）で希釈し、37℃で飽和に達するまで増殖した。

4.形質転換細胞を遠心分離（4K,10分,Beckman遠心機）
により採取し、250μのＬ−ブロスに再懸濁させ、100
μg/mlのアンピシリンを含むＬ寒天プレート上にのせ、
37℃で一晩インキュベートした。2.5mlの10mM Tris,pH
7.5,10mM MgCl₂緩衝液を使用し、約10⁵の形質転換体か
ら成る混合集団をプレートから洗別した。

5.この混合物を100μg/mlのアンピシリンを含む500mlの
LBに接種し、37℃で一晩インキュベートした。培養株を
37℃で一晩振蕩させ、その後、細胞を再び回収した（4
K,5分）。細胞を室温で10mlの25％ショ糖、50mM Tris,p
H8.0に再懸濁させた。5mlの0.25M EDTA pH8.0及び3mlの
10mg/mlリゾチームを加えた。溶液を４℃に１時間維持
し、12mlの溶菌緩衝液を加えて細胞懸濁液を静かに混合
した。溶解後、溶解物を15Kで１時間遠心した。上清を
チーズクロースで傾瀉した。固体塩化セシウム（0.93g/
ml）を加え、臭化エチジウムを濃度100μg/mlまで加え
た。管に充填し、平衡化し、Beckman超遠心機のBeckman
Ti70ヘッドで44000rpmで17℃で48時間遠心した。エチ
ジウム染色したDNAのバンドを注射器で抽出し、凍結
時、DNAをエタノールに沈降させた。12Kで20分間遠心す
ることにより、プラスミドDNAを収集した。1mlの10mM T
ris,pH8.0,1mM EDTAに再懸濁後、DNAをフェノールで１
回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、２容量のエタノ
ールに沈降させ、乾燥させ、100μの10mM Tris,pH8.
0,1mM EDTA緩衝液に再懸濁させた。

6.Dde I開裂 10mM Tris.pH7.5,10mM MgCl₂,10mM B−メルカプトエ
タノール、100mM NaClを含む100μの反応液中で、５
μｇの一次プラスミドプールを80単位のDde Iエンドヌ
クレアーゼで１時間消化した。

7.形質転換： 10μの反応混合物を使用して200μのRRl細胞を上
述のように形質転換させた。２分間熱処理後、直ちに、
形質転換混合物をＬ−寒天に100μg/mlアンピシリンを
加えたプレート培地上にまいた。プレートを37℃で一晩
インキュベートした。Dde Iで処理した組換体プラスミ
ドと処理しないものとを比較した処、10³の選択性が認
められた。アンピシリンを含む10mlのＬ−ブロスにコロ
ニーを接種してミニ培養株を作製し、LB及びアンピシリ
ンプレートで画線培養した。

8.ミニプレップ手順：各培養株を次のように処理した。一晩培養した10mlの
培養株を6K rpm5分間でペレット状にし、1mg/mlのリゾ
チームを含む1mlの25mM Tris,pH8.0,10mM EDTA,50mMグ
ルコースに再懸濁させた。室温で10分間経過後、2mlの
0.2M NaOH,1％ SDS溶液を加え、管を混合し、５分間４
℃にした。1.5mlの3M酢酸ナトリウムpH4.8を加え、混合
し、氷上で５分間インキュベートした。混合物を15K rp
mで10分間遠心分離した。3.0mlのイソプロパノールを含
む遠心分離管に上清を注入した。室温で10分間放置後、
管を15K rpmで10分間遠心した。ペレットを室温で空気
乾燥し、0.85mlの10mM Tris,1mM EDTA pH8.0に再懸濁さ
せた。75μの5M NaClを加え、DNAイソプロパノールを
再び室温で沈降させた。eppendorf遠心器で１分間遠心
後、ペレットを空気乾燥させ、20μg/mlのRNアーゼを含
有する50μの10mM Tris,pH8.0,1mM EDTAに再懸濁させ
た。

9.メチラーゼ遺伝子クローン：プラスミドミニプレップをまずDde I感作により分析
し、次にHind III消化により分析した。生存株のうち
で、２種類の型がDde Iエンドヌクレアーゼによる開差
に対して耐性であった。これらの型はpBR322に関して逆
の方位に3.0kbのHind IIIフラグメントを有していた。
これらのプラスミドはその後、Dde I修飾メチラーゼ遺
伝子を有していることが認められた。Gingeras及びBroo
ks,PNAS（米国）80:402（1985）に記載の標準命名法を
使用して、この２種類のプラスミドをpDdeM3.0a及びpDd
eM3.0bと呼称した。これらのクローンの粗抽出物（後述
のＢ−５の欄を参照のこと）はDde Iエンドヌクレアー
ゼ活性を示さなかった。

3.0kb Hind IIIフラグメント内におけるメチラーゼの
位置は、一連のTn5突然変異誘発実験（第１図Ａ）によ
り決定した（Berg,D.E.（1977）DNA Insertions Elemen
ts,Plasmids,and Episomes,Bukhari,A.I.,Shapiro,J.A.
及びAdhyan,S.L.編集,pp205−212,Cold Spring Harbor
Laboratoires,New York）。メチラーゼプラスミドpDdeM
3.0a又はpDdeM3.0bを有しているHB101（recA）を、100
μg/mlアンピシリンと0.2％マルトースとを含むＬ−ブ
ロスで30℃で一晩増殖させた。飽和した培養株を5mlのL
B＋アンピシリン＋マルトースで1:100に希釈し、細胞密
度が約10⁹/mlに達するまで増殖させた。これらの細胞1m
lをm.o.i.＝0.1でTn5を有するバクテリオファージ（E.R
aleighを介してN.Klecknerから入手したλ467::Tn5）と
混合した。混合物を30℃で２時間インキュベートした。
50μg/mlのカナマイシンと、100μg/mlのアンピシリン
とを含むLBプレート上に0.2mlのアリコートをのせた。
プレートを30℃で48時間インキュベートした。

コロニーを5mlの25mM Tris,pH8.0,10mM EDTA,50mMグ
ルコースでプレートから洗別し、上述のようにミニプレ
ップを作成した（ミニプレップの手順に関する８欄参
照）。

ミニプレップを使用して200μの氷冷コンピテントH
B101細胞（50mM CaCl₂中）を形質転換させた。細胞に42
℃で２分間熱ショックを与え、1mlのＬ−ブロスで希釈
し、１時間インキュベートした。Ｌ−ブロスに50μg/ml
のカナマイシンと100μg/mlのアンピシリンとを加えて
細胞を平板培養した。

プラスミドDNAのミニプレップをHind IIIで消化させ
ることにより、形質転換体にTn5を有するプラスミドが
存在しているかどうかをスクリーニングした。ミニプレ
ップをDde Iエンドヌクレアーゼで感作することによ
り、Tn5を有するプラスミドのDde Iメチラーゼ活性を試
験した。

第１図（Ａ）に示すように、Cla IとHind III部位と
の間にTn5が挿入されているだけで、Dde Iメチラーゼ活
性の損失が生じ、遺伝子がこれらの部位間の領域に含ま
れていることが暗示される。pDdeM3.0aのCla I欠失株を
作成することにより、メチラーゼ活性を維持しているサ
ブクローンpDdeM1.6が形成され、メチラーゼ遺伝子がこ
の1.6kb領域内に位置していることが確認された（第１
図（Ｂ））。

以下に述べるようなin vivo保護アッセイ及びin vitr
o³H−メチル取り込みアッセイを使用して、３種類のM.D
de Iクローンのメチラーゼ活性を比較した。

a. in vitro³H−メチル取り込みアッセイ（Gingeras及
びBrooks,前掲）：メチル化を試験するために、３種類の混合物を調製し
た。

1. 10×メチル化緩衝液:1M NaCl,0.5M Tris,pH7.5,0.1M
EDTA及び50mm β−メルカプトエタノール。

2.メチル化反応混合物:EcoR Iで線状化した基質pBR322
を次のように調製した。100mM NaCl,10mM Tris,pH7.5,1
0mM MgCl₂中に20μg/mlの濃度で溶解された20倍過剰のE
coR Iと共にpBR322をインキュベートした。37℃で１時
間インキュベート後、線状化したプラスミドをフェノー
ル抽出し、エタノール沈降させ、ペレットを空気乾燥さ
せた。線状化したプラスミドの最終濃度が1mg/mlに達す
るまでDNAを10mM Tris,pH8.0,1mM EDTAに再懸濁させ
た。メチル化反応混合物は、１μｇ（＝１μ）の線状
化したpBR322と2.5μの10×メチル化緩衝液と0.5μ
の³H−Ｓ−アデノシル−メチオニン及び20μまでのH₂
Oを含んでいた。

3.細胞抽出物を次のように調製した。

試験すべきクローンの培養株5mlを100μg/mlのアンピ
シリンを含むＬ−ブロスで37℃一晩増殖させた。飽和
後、5K rpmで10分間分離することにより細胞をペレット
状にした。ペレットを500μの音波処理緩衝液（10mM
Tris,pH7.5,10mM β−メルカプトエタノール）に再懸濁
させた。この混合物に25μのリゾチーム（10mg/ml）
と50μのEDTA（100mM）とを加えた。試料を凍結させ
てから氷上で融解させた。単一の10秒バーストを使用し
てこれらの試料を音波処理した。５μの1M MgCl₂を加
えた後、微量分離機で試料を５分間遠心した。

細胞抽出物を検出するために、５μの抽出物を20μ
のメチル化反応混合物に加え、37℃で30分間インキュ
ベートした。25μの全反応液を１インチ平方の3mmの
紙にピペットで移した。紙を空気乾燥後、10％T.C.A.
（150ml）で２回洗い、次に200mlのイソプロパノールで
２回洗った。紙を再び空気乾燥後、管に配置し、シンチ
レーション流体（Omniflour,NEW）で被覆した。メチル
化のレベルを検出するために、試料の^３−メチル取り込
みを計数した。

b. in vivoλ保護アッセイ上述の形質転換手順により、メチラーゼを含有するプ
ラスミドpDdeM3.0a、pDdeM3.0b及びpDdeM1.6を菌株ER14
67に形質転換させた。これらのクローンを100μg/mlの
アンピシリンを含むＬ−ブロス中で飽和に達するまで増
殖させた。アンピシリンを含む10mlのＬ−ブロスに1:10
0で接種後、細胞を対数中期段階まで増殖させ、その
後、5K rpmで５分間遠心分離によりペレット状にした。
細胞ペレットを10mM Tris,pH7.4,5mM MgCl₂ 0.2M NaCl,
0.1％ゲルから成るファージ緩衝液1mlに再懸濁させた。
100μのλファージ（10¹¹ファージ/ml）を加え、混合
し、37℃で30分間インキュベートした。9mlのファージ
緩衝液を加えることにより混合物を希釈し、5Krpmで10
分間再び遠心分離した。100μg/mlアンピシリンを含む1
0mlのＬ−ブロスにペレットを再懸濁させ、37℃で一晩
インキュベートした。

次のようにしてファージDNAを調製した。溶解細胞を
遠心管に移し、３滴のクロロホルムを加えた。試料に渦
形成してから10Krpmで10分間遠心分離した。ペレットを
廃棄し、等量のフェノールを加え、渦形成し、5Krpmで
５分間遠心分離することにより、上清をフェノール抽出
した。次に水層をクロロホルムで抽出し、渦形成し、再
度遠心分離した。頂部層を新しい管に移し、これに２容
量のエタノールを加えてDNAを沈降させた。10Krpmで20
分間遠心分離後、ペレットを空気乾燥し、1mlの10mM Tr
is,pH8.0,1mM EDTA,20μg/ml RNアーゼに再懸濁させ
た。

ファージDNAの修飾を試験するために、20〜40μの
ファージDNAを（50μの反応容量中の）５μの10Dde
I緩衝液（1M NaCl,10mM Tris,pH7.5及び100mM MgCl₂）
及び1.5μのDde Iエンドヌクレアーゼ（10,000単位/m
l）と混合した。試料全体を第２図に示すようにゲル電
気泳動により分析した。

in vitro及びin vivoアッセイの結果、メチラーゼ活
性の段階が明らかになり、pDdeM3.0bは最低の活性を有
しており、pDdeM1.6は最高の活性を有しており、pDdeM
1.6のみがλファージをin vivoで完全に保護するに十分
な活性を有していた。in vitroアッセイはこれらの結果
に一致していた。従って、この後の試みではpDdeM1.6を
使用してエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングした
（以下参照）。

λDNAは2532位でオーバーラップするSau3a（GATC）及
びDde I（CTNAG）部位:5′−GATCTCAG−３′を含んでい
ることから、M.Dde Iはアデニンメチラーゼよりもむし
ろシトシンメチラーゼであると立証することが可能であ
る。（Suggs,S.V.,Wallace,R.B.,Hirose,T.,Kawashima,
E.H.及びItakura,K.（1981） PNAS（米国）78,6613−66
17,Sanger,F.,Coulson,A.R.,Hong,GF.,Hill,D.F.及びPe
tersen,G.B.（1982）J.Moh Biol.162,729−773）。

λDNAをSau3aで開裂すると、この領域から165bp及び4
87bpのフラグメントが形成される。5.0kb Mlu Iフラグ
メントは、オーバーラップするSau3a及びDde I部位を含
んでいる。関連するSau3aフラグメントを良好に視覚化
できるようにこのフラグメントを単離した。このλフラ
グメントをM.Dde Iで処理後、Sau3aで感作した。M.Dde
Iがアデニンメチラーゼであるなら、Sau3a認識部位の外
側のこの配列内で第２のアデニンに修飾が形成されよ
う。従って、Sau3a開裂により正常な165bp及び487bpフ
ラグメントが形成される。一方、M.Dde Iがシトシンメ
チラーゼであるなら、Sau3a認識配列内でシトシンに修
飾が生じるであろう。Sau3a部位内に半メチル化が形成
されるとSau3aの開裂が阻止され、単に一重鎖のニッキ
ングが形成される（Streek,R.E.（1980）Gene12,26
7）。Sau3a処理の結果、新しい652bpフラグメントが出
現する。第３図に示すように、実際に新しいバンドが現
れ、M.Dde Iがシトシンメチラーゼであることが示され
る。

M.Dde Iがシトシンメチラーゼであることがわかった
ので、次の現象を説明し易くなった。pDdeM1.6を有する
ほとんどのメチラーゼを産生するクローンは本発明のク
ローニング株RR1中のpDdeM3.0bよりも生存能力が著しく
低かった。pDdeM1.6を有しているRR1の培養株が静止相
に達した時、RR1単独から成る類似の培養株と同様に生
存可能な細胞の数は６％に過ぎなかった（第II表）。あ
る種の大腸菌株はシトシンメチル化を含むDNAの導入を
阻止するシステムを有していることが最近になって明ら
かにされ（Raleigh他、印刷中）、この活性に関与する
遺伝子座は‘mcrB'（ｍodified ｃytosine ｒestrictio
n）と呼称された。RR1の場合、この遺伝子座は大腸菌Ｂ
から誘導され、異なる特異性と明らかに弱い活性とを有
している（Raleigh他、前掲、Revel,H.R.（1967）,Viro
logy 31,688−701）。mcrB遺伝子座をTn10挿入で不活性
化することにより、新しい系列のクローニング株が構成
された。本発明のメチラーゼクローンをこれらの菌株の
１つER1467に導入し、pDdeM3.0a、pDdeM3.0b、pDdeM1.6
及びER1467単独を比較した処、生存能力が完全に復元さ
れていることが分かり、飽和状態におけるコロニー形成
単位（c.f.u.）の数が若干異なるのみであった。従っ
て、ER1467でDde I系を更にクローニング及び特徴付け
した。

B.エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子は多くの場
合近接に連結しているので、R.Dde I遺伝子はメチラー
ゼ遺伝子と近接する領域に位置していると予想すること
が妥当であると思われる。D.desulfuricansゲノム上の
メチラーゼ遺伝子の周囲の領域をpDdeM3.0aからの3.0kb
Hind IIIフラグメントでサザンブロット分析によりマ
ッピングした。結果を第４図（Ａ）に示す。

エンドヌクレアーゼ遺伝子の５′末端に特異的なオリ
ゴヌクレオチドプローブを合成した。

段階1:Dde Iエンドヌクレアーゼの精製による均一化 Dde Iエンドヌクレアーゼ精製 D.desulfuricansの凍結ペレット23gを氷上で融解さ
せ、120mlの音波処理緩衝液（10mM KPO₄,pH6.9,10mM β
−メルカプトエタノール,0.1mM EDTA）,50mM NaClに再
懸濁した。以下に記載する全段階は４℃で実施した。最
終濃度が300μg/mlに達するまでリゾチームを加え、細
胞を音波処理により破裂させた。細胞溶解物を10,000×
ｇで45分間遠心分離した。

音波緩衝液150mM NaClで平衡化した2.5×15cmのホス
ホセルロースP11（Whatman）カラムに120mlの上清を充
填した。150mM〜1MのNaCl700mlの直線勾配で酵素を溶出
させた。エンドヌクレアーゼは約0.5MのNaClで溶出し
た。ピークフラクションを収集し、音波処理緩衝液50mM
NaClで透析した。

ホスホセルロースカラムからの酵素プール170mlを、
音波処理緩衝液25mM NaClで平衡化した1.5×15cmのヘパ
リンセルロース（Pharmacia）カラムに充填した。25mM
〜1MのNaClの勾配340mlを使用した処、酵素は約0.5M Na
Clで溶出した。エンドヌクレアーゼ活性を有するフラク
ションをプールし、HPLC緩衝液（20mM Tris,pH7.5,10mM
β−メルカプトエタノール）,50mM KClで透析した。

10mlの酵素プールをMono Qカラム（Pharmacia）及びP
olyanion SIカラム（Pharmacia）に通し、50mM KClで１
×8cmのMono Sカラム（Pharmacia）に吸着させた。50mM
〜1MのKClで53mlの直線勾配を構成した。エンドヌクレ
アーゼは約0.2M KClで単一のピークとして溶出した。

Maters Associatesの液体クロマトグラフを使用して
次のようにタンパク質配列用の試料を作成した。Dde I
エンドヌクレアーゼ試料（15μｇ）をVyadac C4 214TP5
4（５μm,4.6×300mm）300オングストローム多孔逆相カ
ラムでクロマトグラフィにかけ、1ml/minの流量で25分
にわたって0.1％トリフルオロ酢酸中の５％のアセトニ
トリルの直線勾配で展開させ、214nmで検出した。個々
のピークを手作業で収集し、凍結乾燥した。

段階2:タンパク質配列及びエンドヌクレアーゼプローブ
の合成 Applied Biosystems470A型気相シーケンサー（Strick
ler,J.E.,Hunkapiller,M.W.及びWilson,K.S.（1984）An
alytical Biochemistry 140,553−566）を使用してタン
パク質の逐次分解を実施した。従来の記載（Hunkapille
r,M.W.及びHood,L.E.（1983）Methods in Enzymology,H
irs,C.H.W.及びTimasheff,S.N.Eds.,Vol91,pp.486−49
3,Academic Press,New York）の勾配変化を僅かに変え
てIBM Cyano（μm,4.5×250mm）カラムて高性能液体ク
ロマトグラフィを実施した処、最初の19個のフェニルチ
オヒダントインがはっきりと同定された。

タンパク質配列を使用して最小の縮重でDNAを誘導し
た。この14ヌクレオチドフラグメントはDNA合成キット
（New England Biolabs）を使用して合成し、Water Ass
ociates C8（10μm,0.5×10cm）Radial Pakカラムでク
ロマトグラフィ精製した。

エンドヌクレアーゼの最初の19種のアミノ酸は、Met
−Lys−Ala−Ala−Thr−Asp−Gln−Glu−Leu−Arg−Lys
−Leu−Ile−Val−Leu−Tyr−Asn−Asn−Valである。下
線で示した５種類のアミノ酸を使用して、配列５′−AT
G−AAR−GCN−GCN−AC−３′（ＲはヌクレオチドＡ又は
Ｇ、ＮはヌクレオチドA,G,C又はＴ）により混合14ヌク
レオチドフラグメントプローブを作成した。ゲノムDNA
消化物のサザンブロットをプローブでハイブリダイズし
た。エンドヌクレアーゼプローブはメチラーゼ遺伝子を
含んでいることがわかっている3.0kb Hind IIIフラグメ
ントにハイブリダイズしない。

サザンハイブリダイゼーション： 1.ニックトランスレートされたフラグメントの使用推薦される条件（New England Biolabs）に従って１
〜２μｇのゲノムDNAを20倍過剰のエンドヌクレアー
ゼ、即ちPst I,Sal I,Bgl II,Bcl I,Hind III,EcoR I,B
amH Iで消化させた。消化物をアガロースゲル電気泳動
にかけ、消化されたDNAをサザン法（Southern,E.M.（19
75）J.Mol.Biol.98,503−517）によりニトロセルロース
紙に移した。

これらのニトロセルロースフィルターをpDdeM3.0aか
らの3.0kbのHind IIIフラグメントでハイブリダイズし
た。このフラグメントは次のようなゲル精製法により作
成した。即ちpDdeM3.0aを20倍過剰のHind IIIで消化さ
せ、１％アガロース、0.5μg/ml臭化エチジウムで構成
したゲル上で電気泳動にかけた。Dde Iメチラーゼ遺伝
子を含んでいる3.0kbフラグメントをゲルから切り出
し、21.5ゲージ針で押し出して細分し、Tris−酢酸塩緩
衝液に懸濁させ、４℃で35分間SW50.1型ローター（Beck
man）で290,000×ｇで超遠心分離した。上清を0.4M NaC
lに加え、DNAをイソプロパノールで沈降させた。DNAを
再懸濁させ、フェノールで２回抽出し、エタノールで沈
降させ、10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0に再懸濁させた。10
0pmolα³²P−dATP（New England Biolabs 800Ci/mmol）
を６μのフラグメント（１μｇ）、１μの10×ニッ
クトランスレーション緩衝液（0.5M Tris,pH7.2,0.1M M
gSO₄,1mM DTT,500μg/ml BSA）、１μのdGTP（1mM）,
dTTP（1mM）,dCTP（1mM）混合物、１μの大腸菌DNAポ
リメラーゼＩ（New England.Biolabs）、及び１μのD
NアーゼＩ（Sigma）希釈液（3mg/mlのストック３μを
10mlのH₂Oで希釈）と結合することにより、このフラグ
メント１μｇをニックトランスレートした。15℃で２時
間インキュベート後、50μの20mM EDTA及び200μの
10mM Tris,pH8.0,1mM EDTAを加えた。これをフェノール
で１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、変性したサ
ケ精子DNA6μｇを加えた。10mM Tris,pH8.0,1mM EDTAで
容量を1mlまで増加させた。10分間煮沸後、ニックトラ
ンスレートしたフラグメントをニトロセルロースフィル
ターに加えるように準備した。

ニックトランスレートしたプローブをハイブリダイズ
する以前に、3mlの50×Denhardtのストック（5g Ficol
l,5gポリビニルピロリドン、5g BSA,500mlまでのH
₂O）、4.5mlの20×SSPEストック（174g NaCl,27.6g NaH
₂PO₄.H₂O,7.4g EDTA;pHはNaOHで7.4に調整、１までの
H₂O）、0.3mlの10％SDS、3mlの50％デキストラン硫酸、
4.2mlのH₂Oから成るプレハイブリダイゼーション混合物
中で室温で４時間プレハイブリダイズした。

ハイブリダイズするために、ニックトランスレートし
たプローブをプレハイブリダイズしたフィルター（プレ
ハイブリダイゼーション混合物を含む）に加え、65℃で
一晩インキュベートした。ハイブリダイズしたフィルタ
ーを２×SSPE（100ml）で室温で５分間２回洗い、２×S
SPEと0.5％SDSとで55℃で30分間２回洗った。次にフィ
ルターを空気乾燥させ、Ｘ線フィルムに露光させた。

2.オルゴヌクレオチドプローブの使用１〜２μｇのゲノムDNA又は0.5〜１μｇのプラスミド
DNAを消化させ、ゲル電気泳動にかけ、従来記載されて
いるようにニトロセルロースフィルターに移した。これ
らのフィルムを次のようにオリゴヌクレオチドプローブ
にハイブリダイズした。２μのプローブ（25〜50μg/
ml）と2.5μの10×緩衝液（0.5M Tris,pH7.6,0.1M Mg
Cl₂,50mM DTT,1mM スペルミジン,1mM EDTA）、15μの
H₂O、５μのγ−³²P−ATP（New England Nuclear,300
0Ci/mmol）、及び0.5μのポリヌクレオチドキナーゼ
（New England Biolabs又はBoehringer Mannheim）を混
合し、37℃で30分間インキュベートした。次に混合物を
65℃まで10分間加熱した。標識したプローブに1mlの10m
M Tris,pH7.0,1mM EDTAを加えた。これをプレハイブリ
ダイズしたニトロセルロースフィルター（上記記載）に
加え、室温で一晩インキュベートした。

ハイブリダイズしたフィルターを２×SSPE（200ml）
で室温で５分間２回洗い、２×SSPEと0.5％SDSとで30℃
で30分間２回洗った。次にフィルターを空気乾燥し、Ｘ
線フィルムに露光した。

サザンブロットを使用して第４図（Ｂ）に示すような
制限地図を作成した。２種類の酵素消化物は、両方のプ
ローブにハイブリタイズし且つメチラーゼ及び／又はエ
ンドヌクレアーゼをコードするに十分な大きさを有する
フラグメントを形成した。両方のプローブは第４図
（Ａ）の（ａ）列に示すような単一のPst Iフラグメン
トにハイブリダイズするので、エンドヌクレアーゼ及び
メチラーゼ遺伝子の両方ともこの4.8kb片のDNAに位置し
ていることが考えられる。更に、両方のプローブは第４
図（Ａ）の（ｇ）列に示すように5.3kb BamH Iフラグメ
ントにハイブリダイズする。このフラグメントはメチラ
ーゼ遺伝子の一部を含んでおり、完全なエンドヌクレア
ーゼ遺伝子をコードするのに十分な大きさを有してい
る。

エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を別々に適
合性のプラスミドに導入した。D.desulfuricans DNAの
2.3kb BamH IフラグメントをpACYC184（Chang及びCohe
n,J.Bacteriol,134:1131（1978））に次のようにクロー
ニングした。50μｇのD.desulfuricans DNAをBamH Iで
切断し、電気泳動にかけた。適当な寸法範囲のフラグメ
ントを従来記載されているようにゲル精製し、約100ng
のDNAを回収し、この量をBamH Iで切断し且つ脱リン酸
化したpACYC184に仔ウシ腸アルカリフォスファターゼ
（Boehringer Man.）を使用して連結反応させた。この
連結反応混合物を使用してM.Dde IクローンpDDEM1.6を
有するER1467細胞を形質転換させた。Ｌ−寒天に100μg
/mlのアンピシリン、30μg/mlのクロラムフェニコール
を加えた培地で平板培養することにより、形質転換体を
選択した。培地は37℃で一晩インキュベートした。

5.制限エンドヌクレアーゼスクリーニング：夫々100μのＬ−ブロスと100μg/mlのアンピシリン
と30μg/mlのクロラムフェニコールとを含んでいる微量
滴定ウェル（Nunc）に無菌よう枝を挿入して50個の形質
転換体を任意に採取した。37℃で６時間インキュベート
後、Ｌ−寒天、アンピシリン、クロラムフェニコール及
び10⁴〜10⁸ファージ／培地からのλ_virファージ希釈液
を含んでいる６個のプレートでレプリカ平板培養した。
これらのプレートを37℃で一晩インキュベート後、１個
の形質転換体は約10^-1のレベルでファージを制限した。
活性Dde Iエンドヌクレアーゼの存在を確認するため
に、この形質転換体の粗抽出物（従来記載）を作成し
た。１μｇのpBR322（＝１μ）に、５μの10×dDe
I緩衝液（100mM Tris,pH7.5,100mM MgCl₂及び1M NaC
l）、43μのH₂O及び１μの粗抽出物を加え、37℃で
30分間インキュベート後、アガロースゲル電気泳動にか
けた。このクローンからのDNAを作成し、予備的制限マ
ッピングを行った処、この2.3kb BamH Iフラグメントは
第６図に示すようにpDDEM1.6のHind III部分にBamH Iを
オーバーラップすることがわかった。従って、Dde I系
は2.9kbのD.desulfuricans DNAに含まれている。

実施例II BamH I制限修飾遺伝子のクローニング A. BamH Iメチラーゼ遺伝子のクローニング及びその活
性の特徴付け 1.Bacillus amyloliquefaciens HのDNAを作成するため
に、5gの新たに増殖した細胞ペーストを25％ショ糖、50
mM Tris,pH8.0に再懸濁させた。10mlの0.25M EDTA,pH8.
0と6.0mlの10mg/mlリゾチーム（0.25M Tris pH8.0中）
を加えた。懸濁液を氷上に２時間放置した。その後、24
mlの溶菌緩衝液（１％Triton X−100,50mM Tris pH8.0
67mM EDTA）と5mlの10％SDSとを加え、混合し、細胞を
溶解させた。等量のフェノール（100mM Tris,pH8で平衡
化）を加え、溶液を振蕩により乳化させた。次に70mlの
クロロホルムを加え、10分間振蕩させた。次に混合物を
Beckman遠心機で10Kで30分間遠心し、DNAを含んでいる
頂部水相を新しいびんに移し、フェノール−クロロホル
ムで更に２回再抽出した。

次に上部層を４×１ TE（10mM Tris,1mM EDTA,pH8.
0）で24時間以上透析した。透析後、DNAを0.1容量のRN
アーゼ（10μg/ml）で37℃で１時間処理した。最終濃度
が0.4M NaClに達するまで5M NaCl溶液を加え、頂部に２
容量のエタノールを積層した。DNAをガラスロッドに巻
き取り、70％EDTAで１回洗い、次に15mlのTEに再溶解さ
せ、−20℃で凍結保存した。DNAの最終濃度は100μg/ml
であった。

2.部分消化:2mlのBam DNA（100μg/ml）をHind III緩衝
液（10mM Tris pH7.5;10mM MgCl₂,50mM NaCl,10mMメル
カプトエタノール）中で10本の管に加えた（200μ／
管）。Hind III酵素を一連の２×希釈液として管に加
え、即ち40単位を管１に加え、20単位を管２に加え、以
下同様とした。消化は37℃で１時間実施し、反応物を72
℃で15分間インキュベートすることにより、酵素を熱で
不活化した。各消化物710μｇを除去し、ゲル電気泳動
により分析した。部分開裂を示す試料を混合し、使用し
た。

3.連結反応:50mM Tris pH7.5、10mM MgCl₂、10mM DTT、
0.5mM ATP及び1000単位のT4DNAリガーゼ（N.E.Biolab
s）を含む100μの反応容量中で、Hind IIIにより消化
した４μｇのBam DNAをアルカリフォスファターゼで処
理したpBR322（New England Biolabs）２μｇと16℃で
４時間連結反応させた。試料をクロロホルムて処理し、
10個のアリコートに分割し、夫々を使用して200μの
氷冷コンピテントRRl細胞（50Mm CaCl₂中）を形質転換
した。細胞に42℃で２分間熱ショックを与え、5mlのル
リアブロス（Ｌ−ブロス）で希釈し、37℃で飽和に達す
るまで増殖した。

4.形質転換した細胞を遠心分離（4K 10分）により採取
し、250μのＬ−ブロスに再懸濁させ、100μg/mlのア
ンピシリンを含むＬ寒天プレートにのせ、37℃で一晩イ
ンキュベートした。形質転換体を2.5mlの10mM Tris pH
7.5;10mM MgCl₂で培地から洗別した。

5.この混合物を使用して、100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ−ブロス500mlに接種した。培養株を37℃で一晩
振蕩させた後、細胞を再採取した（4K,5分）。細胞を10
mlの25％ショ糖、室温の50mM Tris pH8.0,5mlの0.25M E
DTA pH8及び3mlの10mg/mlリゾチーム（H₂O中）に再懸濁
させた。溶液を40℃に一時間維持した後、12mlの溶菌緩
衝液を加え、細胞懸濁液を静かに混合した。溶解後、溶
解物を15Kで１時間遠心した。上清をチーズクロースで
傾瀉した。固体CsClを加え（0.93g/ml）、濃度が100μg
/mlに達するまで臭化エチジウムを加えた。管に充填
し、平衡化し、Beckman超遠心機のBeckman Ti70ヘッド
で17℃で48時間44,000rpmで遠心した。エチジウム染色
したDNAバンドを注射器で収集した。２容量のエタノー
ルを加えて凍結させることによりプラスミドを沈降さ
せ、12,000rpmで20分間遠心することによりプラスミドD
NAを収集した。DNAを1mlのTE緩衝液に再懸濁させた後、
フェノールで１回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、
その後、２容量のエタノールに沈降させ、乾燥させ、10
0μのTE緩衝液に再懸濁させた。

6.Bam感作:10mM Tris pH7.5,10mM MgCl₂,100mM NaCl;10
mM β−メルカプトエタノール中に20μｇのプラスミドD
NAを含有する５×100μのアリコート反応液中で、一
次プラスミドプール（100μ中に約100μｇのDNAを含
む）を消化させた。100単位のBamH I（N.E.Biolabs）を
第１の管に加え、50単位を第２の管に加え、以下同様に
して管を37℃で１時間インキュベートした。

7.形質転換：各反応液からの10μを使用してRRl細胞1
00μを上述のように形質転換させた。２分間熱処理し
た直後に形質転換混合物を平板にのせ、Ｌ−寒天及びア
ンピシリン上で37℃で一晩インキュベートした。

その後の実験で明らかになったことであるが、2.5単
位のエキソヌクレアーゼIII（N.E.Biolabs）又は10単位
のアルカリフォスファターゼ（Boehringer）を加える制
限反応処理の結果、選択性は10³又は10⁴増加した。生存
数が最小のプレートから約200個のコロニーを採取し
た。

8.各コロニーを10mlのＬ−ブロスとアンピシリンとに接
種し、同様にLBとアンピシリンを含むマスタープレート
上で画線培養した。

各培養株を使用して「ミニプレップ」DNAを次のよう
に作成した。10mlの培養株を採取し（6Kで５分間）、1m
lの25mM Tris,10mM EDTA,50mMグルコース,pH8及び1mg/m
lのリゾチームに再懸濁させた。室温で10分間維持した
後、2mlの0.2M NaOH,1％SDS溶液を加え、管を混合し、
５分間４℃に維持した。1.5mlの3M酢酸ナトリウムpH4.8
を加え、混合し、氷上で５分間インキュベートした。混
合物を15Kで10分間遠心し、上清を傾瀉し、3.0mlのイソ
プロパノールに加えた。室温に10分間維持した後、管を
15Kで10分間遠心した。ペレットを乾燥し、0.85mlのTE
に再懸濁した。75μの5M NaClを加え、DNAをアルコー
ルで室温でもう一度沈降させた。Eppendorf遠心機で１
分間遠心分離後、DNAペレットを乾燥し、20μg/mlのRN
アーゼを含んでいる50μのTE pH8.0に再懸濁させた。

次に、個体プラスミド調製物のHind IIIフラグメント
の成分及びBamH Iエンドヌクレアーゼに対する耐性を試
験した。

４個の各コロニーがBamH Iに耐性であり複数のHind I
IIフラグメントを含んでいることが認められた。４個の
コロニーの各々を更に分析した。各クローンの少量（10
ml）の細胞培養株を増殖させ、完全クロモソームDNAを
作成した（１欄参照）。このうち１個はBamH I開裂に耐
性の宿主DNAを含んでおり、その後の実験に使用した。

9.メチラーゼアッセイ：実施例Ｉの記載と同様にしてBamH I抽出物のin vitro
及びin vivoアッセイを実施した。但しin vitroアッセ
イで使用した基質は連結反応したBamH Iリンカー（dpCG
GATCCG）（N.E.Biolabs）とし、以下に述べる方法で調
製した。

1000単位のT4 DNAリガーゼ（N.E.Biolabs）と共に50m
M Tris,pH8;20mM DTT,2mM ATP,10mM MgCl₂50g/mlウシ血
清アルブミン（Pentax）を含む100μの反応液中で、1
0.D.単位のBamH Iリンカーを室温で一晩連結反応させ
た。反応液を10分間70℃に加熱して不活性化させた。0.
0050D単位のリンカーを各メチラーゼ反応液に加え、［³
H］−Ｓ−アデノシルメチオニンと反応させた。

in vivoアッセイは実施例Ｉで述べたようにλファー
ジを使用して実施した。

同様にメチラーゼクローンのエンドヌクレアーゼ活性
を試験した［粗抽出物のエンドヌクレアーゼアッセイ
は、10単位のPst Iエンドヌクレアーゼ（N.E.Biolabs）
で線状化した１μｇのpBR322を基質として使用した以外
は実施例Ｉと同様に実施した］。活性は何ら検出されな
かった。

B.エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング： 1.メチラーゼプラスミドのマッピング製造業者の推薦する条件の従って制限エンドヌクレア
ーゼで一連の二重消化物を形成することにより、Hind I
IIフラグメントの順序を決定した（第５図）。

更に、同種BamH Iエンドヌクレアーゼから推定した配
列から作成したオリゴヌクレオチドプローブ（Ddeプロ
ーブに類似、実施例Ｉを参照）を使用して、次のように
Hind IIIフラグメントを配列した。

10mM Tris pH7.5,10mM MgCl₂,50mM NaCl中に15μｇの
Bamメチラーゼプラスミドを含有する反応液150μを混
合し、９個の管に収容し、最初の管には30μを収容し
た。２単位のHind IIIエンドヌクレアーゼ［N.E.Biolab
s］を第１の管に加え、容量の２分の１を第２の管に移
し、以下同様にして連続的希釈液を作成した。１時間
後、反応（37℃でインキュベート）を終了させ、消化物
を0.7％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。次に実
施例Ｉに記載したように電気泳動材料をニトロセルロー
スフィルターに移し、これを使用してオルゴヌクレオチ
ドプローブとハイブリダイズさせた。尚、該プローブに
は実施例Ｉで述べたように、γ³²P ATP［New England N
uclear］及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ［N.E.Biolab
s］で処理することにより放射活性を与えておいた。こ
うしてプローブにハイブリダイズする2.2kbのフラグメ
ントが見いだされた。

2.メチラーゼ遺伝子のマッピング及びサブクローニングメチラーゼ遺伝子を含んでいるプラスミド（pDH1と呼
称する）をCaCl₂処理によりHB101細胞に形質転換させ
た。５欄に詳述したように、プラスミドDNAをCsCl勾配
で精製した。

ａ）pDH1を含んでいるHB101細胞をλ467:Tn5で感染さ
せ、トランスポゾン突然変位誘発によりメチラーゼ機能
をマッピングした。この方法の詳細については実施例Ｉ
に示した。

ｂ）メチラーゼ遺伝子は2.2kbのHind IIIフラグメント
に位置しているようであった。100μｇのpDHl DNAをHin
d IIIで完全に消化させ、予備の0.7％アガロースゲル上
で泳動させた。2.2kbのフラグメントを長波長UVで可視
化させ、メスで切り出し、製造業者の指示に従ってIBI
型UEA分析電気溶出装置で電気溶出させた。フラグメン
トを２容量のエタノールに沈降させ、300μのTEに再
懸濁させ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出し、エ
タノールと0.2MのLiClで再沈降させた。次にDNAフラグ
メントを100μのTEに再懸濁させ、−20℃で凍結させ
た。

ｃ）２μｇのこのフラグメントを0.1μｇの（アルカリ
フォスファターゼ処理した）pBR322−Hind III又はアル
カリフォスファターゼ化した0.1μｇのpUC19−Hind III
に連結反応させ、連結反応物を室温で一晩インキュベー
トした。連結反応混合物（連結反応の詳細についてはＡ
−３の欄を参照）をクロロホルムで１回抽出し、次にこ
れを使用してコンピテントHB101細胞を形質転換させ
た。形質転換体をミニプレップとし、プラスミドのメチ
ラーゼ活性（Ａ−９の欄参照）を試験した。pBR322及び
pUC19の両方に2.2kbのフラグメントを含んでいる構成物
はBamメチラーゼ産生するものであった。これらのプラ
スミドを夫々pDH2及びpDH3と呼称した。

ｄ）pDH2を標準手段によりマッピングし、同様にエンド
ヌクレアーゼプローブをフラグメントにマッピングした
（第６図）。適当なXmn I部位が１つのHind III部位の
上流約450bpで且つオリゴヌクレオチドプローブがハイ
ブリダイズしていた位置に近接する場所に位置してい
た。

10μｇの精製した2.2kbフラグメントをXmn Iエンドヌ
クレアーゼで徹底的に消化し、反応混合物をフェノール
で抽出し、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈降さ
せ、再懸濁させた。５μｇのこのDNAをHind III及びSma
Iで二重に消化させた0.5μｇのpUC8に連結反応させ
た。連結反応混合物を使用してコンピテントK802細胞を
形質転換させた。個々の形質転換体をミニプレップ化
し、プラスミド構造を観察すると共に、クローンのBam
メチラーゼ活性を（in vivoで）試験した。１つのクロ
ーンは1.75kbのHind III−Xmn Iフラグメント及びメチ
ラーゼ活性を有していることが認められた（0.45kbのフ
ラグメントを有している他のクローンはエンドヌクレア
ーゼプローブに対して維持され、Bamメチラーゼ活性を
有していなかった）。依然としてBamメチラーゼ陽性で
あったこの短縮された構成体をpDH5と呼称した。

ｅ）エンドヌクレアーゼ遺伝子のBamクロモソームへの
マッピング精製したBacillus amyloiquefaciens DNAを標準条件
下で一連の制限エンドヌクレアーゼで消化させ、消化物
を0.5％アガロースゲル上で泳動させた。実施例Ｉに詳
細に記載したようにDNAをニトロセルロースフィルター
に移した。次にサザンブロット転移体をキナーゼ化Bam
オリゴヌクレオチドプローブ［配列:5′TCC（Ｔ）TTC
（Ｔ）TCG（TCA）ACC（Ｔ）TCCAT3′］及びニックトラ
ンスレートした精製2.2kbフラグメント［ニックトラン
スレーション手順は実施例Ｉに記載した］と同様にハイ
ブリダイズした。

オリゴプローブハイブリダイゼーション及び洗浄はあ
まり厳重には実施せず、従って特異的なハイブリダイゼ
ーションは余り形成されないが、どちらの部分もBamク
ロモソームの同一領域にハイブリダイズしていることは
明らかであった（第７図）。特に、両方のプローブはBa
mクロモソームの4.5kb Hind IIIフラグメントにハイブ
リダイズした。

3.エンドヌクレアーゼ遺伝子の発見 100μｇの精製BamDNAを200単位のHind IIIエンドヌク
レアーゼで完全に消化させた。DNAを予備0.5％アガロー
スゲル上で泳動させ、切り出し、上述のように電気溶出
させた。

10μｇの精製4.5kbフラグメントを、Hind IIIで消化
させアルカリフォスファターゼで処理した１μｇのpACY
C184ベクターに連結反応させた。連結反応混合物をクロ
ロホルム処理後、100〜300μに希釈した。100μを
使用して、あらかじめpDH5で形質転換されているコンピ
テントK802細胞を形質転換させた。

Amp^RCam^Rに相当する形質転換体を選択した。よう枝を
挿入してこれらの形質転換体の350個を採取し、100の
Ｌ−ブロス＋Amp＋Cam（クロラムフェニコール；最終濃
度30μg/ml）を含む無菌微量滴定皿［Nunc］に移し、37
℃で一晩増殖させた。翌日、多枝接種装置を使用してコ
ロニーをLB＋Amp＋Camプレートに押し当て、プレート当
たり50コロニーの割合で37℃で一晩インキュベートし
た。

エンドヌクレアーゼ活性の試験:7個のマスタープレー
トに5mlの音波緩衝液（100mM,Tris pH8,10mMメルカプト
エタノール）を加え、コロニーをプレートの表面から洗
別した。細胞懸濁液を5Kで10分間遠心して細胞を採取
し、0.5mlの音波緩衝液に再懸濁させた。細胞を25μ
のリゾチーム（10mg/ml）と50μの0.1M EDTA pH7.0と
で処理後、マイクロチップで15秒間音波処理し、凍結融
解させた。10μの1M MgCl₂を添加後、低速遠心分離
（Eppendorfで５分間）により音波処理物からの細胞破
片を除去した。10μのPst Iを反応混合物（10mM,Tri
s,pH8,10mM MgCl₂,100mM NaCl）に加えることにより、
直線化した１μｇのpBR322DNAを、プールした各抽出物
１μを使用して消化した。アガロースゲルで消化物を
分離後、プレート＃５に有望な徴候が認められた。従っ
て、各コロニーからの細胞を5mlのLB＋Amp＋Camに接種
し、一晩増殖させ、夫々個々に採取し、BamH Iエンドヌ
クレアーゼ活性を試験した。

更に、コロニーのファージ制限を検査した（実施例Ｉ
参照）。Bamエンドヌクレアーゼ活性を有するコロニー
が１つ認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図はメチラーゼを有するプラスミドpDdeM3.0aのTn
マッピング及び、高いレベルのDde Iメチラーゼを発現
するクローンであるpDdeM1.6の構造を示しており、第２
図はM.Dde Iクローンのin vivo保護アッセイの結果を示
す写真であり、第３図はM.Dde Iがシトシン型メチラー
ゼであることを示す写真であり、第４図はDde Iクロー
ンのサザンブロック分析及び制限地図を示しており、第
４図はゲノムDNA消化物をプローブするためにpDdeM3.0a
からの3.0kbのHind IIIインサートを使用するサザンブ
ロットの写真（Ａ）及びDde I系及び誘導体プラスミド
を含んでいる領域におけるD.desulfuricansゲノムの制
限地図（Ｂ）を示しており、第５図はメチラーゼを有す
るプラスミドのBamH Iに関するマッピングを示してお
り、第６図はpDH2エンドヌクレアーゼを有するプラスミ
ドのBamH Iに関するマッピングを示しており、第７図は
Bamクロモソームを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．18, （1985），Ｐ6403〜6421

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Bacillus amyloliquefaciensによって産
生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし、下
図に示されるような制限部位を有する、単離されたDN
A。
【請求項２】Bacillus amyloliquefaciensによって産
生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ
下図に示されるような制限部位を有するDNAセグメント
がベクター内に挿入されたものからなる組換えDNAベク
ター。
【請求項３】Bacillus amyloliquefaciensによって産
生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラー
ゼをコードし、下図に示されるような制限部位を有す
る、単離されたDNA。
【請求項４】Bacillus amyloliquefaciensによって産
生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラー
ゼをコードし且つ下図に示されるような制限部位を有す
る単離DNAがベクター内に挿入されたものからなるクロ
ーニングベクター。
【請求項５】Bacillus amyloliquefaciensによって産
生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ
下図（ｉ）に示されるような制限部位を有するDNAセグ
メントがベクター内に挿入されたものからなる組換えDN
Aベクターか又は、Bacillus amyloliquefaciensによっ
て産生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチ
ラーゼをコードし且つ下図（ii）に示されるような制限
部位を有する単離DNAがベクター内に挿入されたものか
らなるクローニングベクター、によって形質転換された
原核宿主細胞。
【請求項６】BamH I制限エンドヌクレアーゼの製造方法
であって、Bacillus amyloliquefaciensによって産生
されるBamH I制限エンドヌクレアーゼをコードし且つ下
図（ｉ）に示されるような制限部位を有するDNAセグメ
ントがベクター内に挿入されたものからなる組換えDNA
ベクターか又は、Bacillus amyloliquefaciensによっ
て産生されるBamH I制限エンドヌクレアーゼおよびメチ
ラーゼをコードし且つ下図（ii）に示されるような制限
部位を有する単離DNAがベクター内に挿入されたものか
らなるクローニングベクター、によって形質転換され、
BamH Iによる切断から防御された原核宿主細胞を、前記
エンドヌクレアーゼの発現に適する条件下で培養するこ
とを包含する前記方法。