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Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der europäischen
Anmeldung Nr. 87305005.8 (EP-A-0 248 678).
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Diese Erfindung betrifft Klone für die Dde
I-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase sowie entsprechende
Verfahren zur Herstellung dieser Klone und Enzyme.
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Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen,
welche natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von
anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt
werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet
werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen.
Diese Eigenschaft ermöglicht DNA-Molekülen, eindeutig
identifiziert und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert zu
werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als
unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung
erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren" mittels welcher
Gentechnologie und -analyse durchgeführt werden.
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Restriktionsendonukleasen wirken durch ein Erkennen und
Binden an bestimmte Nukleotidsequenzen (die
"Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Wenn sie gebunden sind,
spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der
Sequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen haben
Affinitäten für unterschiedliche Erkennungssequenzen. Fast
einhundert unterschiedliche Restriktionsendonukleasen
wurden unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies
identifiziert, die bis heute untersucht wurden.
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Bakterien neigen dazu, meistens nur eine kleine Anzahl an
Restriktionsendonukleasen pro Spezies zu besitzen. Die
Endonukleasen werden typischerweise nach den Bakterien
benannt, von denen sie abgeleitet sind. So synthetisiert
die Spezies Haemophilus aegyptius beispielsweise 3 unter-
schiedliche Restriktionsendonukleasen, die Hae I, Hae II
und Hae III genannt werden. Jene Enzyme erkennen und
spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC.
Escherichia coli RY13 synthetisiert andererseits nur ein Enzym
EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
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In der Natur spielen Restriktionsendonukleasen eine
Schutzrolle für das Wohlergehen der Bakterienzelle. Sie
ermöglichen Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle,
wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie sonst
zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen eine
Resistenz, indem sie die Längen der infizierenden
DNA-Moleküle abtasten und diese jedesmal spalten, wenn die
Erkennungssequenz auftritt. Das Aufbrechen, welches auftritt,
macht viele der infizierenden Gene unbrauchbar und macht
die DNA empfänglich für einen weiteren Abbau durch
unspezifische Endonukleasen.
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Ein zweiter Bestandteil der bakteriellen Schutzsysteme sind
die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind zu den
Restriktionsendonukleasen komplementär und sie stellen das
Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien befähigt
werden, ihre eigene DNA zu identifizieren und sie von fremder,
infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen
erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz
wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, jedoch
anstatt die DNA zu zertrennen, modifizieren sie das eine
oder andere Nukleotid innerhalb der Sequenz chemisch durch
die Addition einer Methylgruppe. Nach dieser Methylierung
wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die
Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer
Bakterienzelle ist aufgrund ihrer Modifikationsmethylase
immer vollständig modifiziert und sie ist daher völlig
unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen
Restriktionsendonuklease. Es ist lediglich nicht
modifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, welche emp-
findlich für eine Erkennung und einen Angriff der
Restriktionsendonuklease ist.
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Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich,
Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, für welche
sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie
durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich waren.
Der Schlüssel zur Isolierung von
Restriktionsendonukleaseklonen ist es, ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zu
entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer
"Bibliotheken", d.h. Klonpopulationen, die durch
"Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, zu identifizieren, wenn sie mit
so niedrigen Häufigkeiten wie 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;³ auftreten.
Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die
unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die
seltenen erwünschten Klone überleben.
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Restriktions-Modifikationssysteme vom Typ II werden mit
wachsender Geschwindigkeit kloniert. Die ersten klonierten
Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als ein
Mittel zum selektiven Isolieren von
Restriktionsendonukleaseklonen (Pst I Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74,
1503-1507 (1981), Hha II Mann et al. Gene 3: 97-112
(1981)). Da das Vorliegen von
Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diesen ermöglicht, einer Infektion
durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche
klonierte Restriktions-Modifikationsgene tragen, im Prinzip
selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden,
welche einem Phagen ausgesetzt waren. Es wurde jedoch
gefunden, daß dieses Verfahren nur einen begrenzten Wert
hat. Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte
Restriktions-Modifikationsgene nicht immer hinreichende
Phagenresistenz zeigen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen.
Ein anderer Klonierungsansatz umfaßt ein Übertragen von
Systemen, welche anfänglich als plasmid-getragen
charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (EcoRV,
Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 129: 3659-3676, 1984;
PaeR7, Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:
402-406, 1983, Theriault und Roy, 1982; Pvu II, Blumenthal
et al., J. Bacteriol. 164: 501-509, 1985). Schließlich wird
eine wachsende Anzahl an Systemen nun durch Selektion auf
ein aktives Methylasegen kloniert (BsuR I, Kiss et al.,
Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421, 1986; Taq I); da die zwei
Gene häufig eng verbunden sind, werden beide Gene
gleichzeitig kloniert. Die Methylaseselektion ergibt jedoch nicht
immer ein vollständiges Restriktionssystem (BspR 1,
Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225, 1980; Msp I, Walder et al.,
J. Biol. Chem. 258: 1235-1241, 1983). Auch Versuche, um
größere Bereiche, welche zu dem Methylasegen benachbart
sind, zu klonieren, können dabei fehlschlagen, ein aktives
Endonukleasegen zu produzieren.
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In manchen Systemen kann das Klonierungsproblem in dem
Versuch liegen, das Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen,
welcher nicht angemessen durch Methylierung geschützt ist.
Wenn das Methylasegen und Endonukleasegen auf einem
gemeinsamen DNA-Fragment eingeführt werden, muß das erstere
Genprodukt den Wirt modifizieren, bevor das letztere
Genprodukt das Wirtsgenom spaltet.
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Ein anderes Hindernis beim Klonieren dieser Systeme in E.
coli wurde im Verlauf des Klonierens unterschiedlicher
Methylasen entdeckt. Viele E. coli-Stämme (einschließlich
jener, welche normalerweise beim Klonieren verwendet
werden) haben Systeme, welche das Einführen von DNA, die eine
heterologe Cytosinmethylierung enthält, in die Zellen
blokkieren (Raleigh und Wilson, zur Veröffentlichung
eingereicht). Daher ist es ebenfalls erforderlich, sorgfältig
abzuwägen, welchen E. coli-Stamm (welche E. coli-Stämme)
man für das Klonieren verwendet.
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Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem
geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen, nützliche
Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor
sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Verfahren zu
entwickeln, um Bakterienstämme zu erhalten, welche diese
Enzyme im Überschuß synthetisieren. Derartige Stämme würden
nützlich sein, weil sie die Aufgabe der Reinigung
vereinfachen würden, wie auch das Mittel zur Herstellung in
kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß wird ein neuer Ansatz zur Herstellung von
Restriktionsenzymen und/oder den entsprechenden
Modifikationsenzymen zur Verfügung gestellt, indem Gene, welche für
diese codieren, kloniert werden und dafür gesorgt wird, daß
die Gene mit erhöhten Niveaus exprimiert werden.
Insbesondere wird ein neues Verfahren zum Klonieren dieser Enzyme,
die so hergestellten Klone, sowie Verfahren zum Herstellen
der Enzyme selbst zur Verfügung gestellt, welches umfaßt:
Klonieren und Exprimieren des Methylasegens in einem
geeigneten Wirt, um den Wirt angemessen durch Methylierung zu
schützen, und in einem zweiten Schritt Klonieren und
Einführen des Endonukleasegens auf einem Vektor, welcher die
Endonuklease bezogen auf das Methylasegen auf einem
niedrigeren Niveau exprimiert, in den Wirt, der den Methylaseklon
enthält.
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Die Anwendung dieses Verfahrens auf die Dde
I-Restriktions- und Modifikationsgene von Desulfovibrio desulfuricans ist
im Detail beschrieben, zusammen mit den resultierenden
Klonen, welche die Basis für ein neues und nützliches
Verfahren zum Reinigen der Dde I-Restriktions- und
Modifikationsenzyme bilden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figur 1 stellt die Tn5-Kartierung des methylasetragenden
Plasmids pDde3.0a und die Konstruktion von pDdeM1.6, des
Klons, welcher hohe Niveaus an Dde I-Methylase exprimiert,
dar.
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Figur 2 stellt die Ergebnisse eines in vivo-Schutzassays
für M.Dde I-Klone dar.
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Figur 3 zeigt, daß M.Dde I eine Methylase vom Cytosintyp
ist.
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Figur 4 stellt eine Southern Blot-Analyse und
Restriktionskarte von Dde I-Klonen dar. Fig. 4A stellt einen Southern
Blot unter Verwendung eines 3,0 kb Hind III-Inserts aus
pDdeM3.0a, um genomische DNA-Verdaus zu sondieren, dar.
Fig. 4B stellt die Restriktionskarte des D. desulfuricans-
Genoms in dem Bereich, welcher das Dde I-System enthält,
und Plasmidderivate dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Ansatz zum
Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen unter
Verwendung eines Zweischrittverfahrens und Erntens der dabei
produzierten Restriktionsenzyme zur Verfügung. Dieser
Ansatz nutzt die Tatsache aus, daß Klone und Wirte, die Klone
enthalten, welche Modifikationsgene enthalten, ihre eigene
DNA innerhalb der Erkennungssequenz des entsprechenden
Restriktionsgens methylieren werden, wenn solche Sequenzen
in dem Klon oder Wirt vorliegen. Solche Klone werden daher
resistent gegenüber einem in vitro-Verdau durch die
entsprechende Restriktionsendonuklease sein. Daraus folgt, daß
die Einführung des Restriktionsendonukleasegens in Wirte,
welche diese Klone enthalten, in dem selektiven Überleben
der methylasegeschützten Wirte resultieren wird.
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In dem ersten Schritt wird das Methylasegen, welches dem
gewünschten Restriktionsgen entspricht, kloniert und
vorzugsweise ein Derivat konstruiert, welches hohe Methylase-
niveaus exprimiert. In dem zweiten Schritt wird das
Restriktionsgen dann in einen Wirt kloniert, welcher das
Methylasegen enthält, und auf Endonukleaseaktivität hin
getestet. Die Expression des Endonukleasegens tritt in
Wirten auf, welche durch das entsprechende Methylasegen
hinreichend geschützt wurden.
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Während man nicht durch eine Theorie gebunden sein möchte,
wird angenommen, daß vorherige Klonierungssysteme, welche
das Einführen des Methylasegens und Endonukleasegens auf
einem gemeinsamen DNA-Fragment in einen Wirt mit sich
bringen, aufgrund von ungenügender Methylierung des Klons und
seines Wirtes, welcher dann erlaubt, daß die entsprechende
Endonuklease das Wirtsgenom spaltet, häufig darin
fehlgehen, ein aktives Endonukleasegen zu erzeugen.
Erfindungsgemäß werden derartige Probleme überwunden indem zuerst das
Methylasegen eingeführt und exprimiert oder verstärkt
exprimiert wird und dann das Endonukleasegen auf einem
Vektor kloniert wird, welcher die Endonuklease bezüglich der
Methylase bei niedrigeren Niveaus exprimiert.
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Die Verfahren, welche hierin beschrieben werden, durch
welche Restriktionsgene vorzugsweise kloniert und exprimiert
werden, schließen die folgenden Schritte ein:
A. Klonieren des Methylasegens
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1. Die DNA der Bakterienspezies, welche kloniert werden
soll, wird gereinigt. Es wurde kürzlich herausgefunden,
daß Viren ebenfalls Restriktions-Modifikationssysteme
enthalten, und demzufolge ebenfalls als ein
Ausgangsmaterial verwendet werden können.
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2. Die DNA wird teilweise oder vollständig mit einer
passenden Restriktionsendonuklease verdaut.
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3. Die sich ergebenden Fragmente werden in einem
Klonierungsvektor, wie beispielsweise pBR322, PUC 8, 9, 18
oder 19 oder pBR328 oder ein Derivat davon, welches
z.B. Linker enthält, ligiert und die Mischung wird
verwendet, um eine geeignete Wirtszelle, wie
beispielsweise E. coli-Zellen zu transformieren.
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4. Die DNA/Zell-Mischung wird auf antibiotischen Medien,
welche für transformierte Zellen selektiv sind,
plattiert. Nach einer Inkubation werden die transformierten
Zellkolonien vereinigt, suspendiert und bis zur
Sättigung kultiviert, um eine primäre Zellbibliothek zu
bilden.
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5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus der
primären Zellbibliothek gereinigt, um eine primäre
Plasmidbibliothek herzustellen.
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6. Die Plasmidbibliothek wird dann vollständig in vitro
mit dem Restriktionsenzym verdaut, dessen
entsprechendes Methylasegen gesucht wird. Exonuklease und/oder
Phosphatase können ebenfalls zu dem Verdau zugegeben
werden, um die Zerstörung von Nicht-Methylaseklonen zu
verstärken.
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7. Die verdaute DNA wird in E. coli transformiert und
transformierte Kolonien werden wiederum erhalten, indem
auf antibiotischen Platten plattiert wird. Manche
dieser Kolonien - sekundäre Zell-Individuen - können
ausgewählt werden und ihre DNA kann auf das Vorliegen des
Methylasegens hin analysiert werden. Die verbleibenden
Kolonien können zusammengeschabt werden, um eine
sekundäre Zellbibliothek zu bilden, aus welcher anschließend
eine sekundäre Plasmidbibliothek hergestellt werden
kann.
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8. Die sekundäre Plasmidbibliothek kann erneut mit
Restriktionsendonuklease verdaut werden (mit oder ohne
Exonuklease oder Phosphatase), um die Selektion zu
wiederholen, was zu der Gewinnung von tertiären Zellindi
viduen, tertiären Zellbibliotheken und tertiären
Plasmidbibliotheken führt.
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9. Jeder Zyklus eines Restriktionsendonukleaseverdaus
bewirkt die selektive Zerstörung von
Nicht-Methylaseklonen und führt zu einer Erhöhung der relativen
Häufigkeit der erwünschten methylasetragenden Klone.
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10. Überlebende Kolonien unter der sekundären und tertiären
Population werden ausgewählt und auf das Vorliegen des
Methylasegens hin analysiert.
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11. Ein Methylase-Screenen kann durch vier einfache Tests
durchgeführt werden:
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(a) Das rekombinante Plasmid-DNA-Molekül des Klons kann
gereinigt werden und in vitro der ausgewählten
Restriktionsendonuklease ausgesetzt werden, um zu bestätigen,
daß es gegenüber einem Verdau resistent ist.
Vorausgesetzt, daß der Plasmidvektor mehrere Stellen für jene
Endonuklease trägt, zeigt eine Resistenz eher eine
Modifikation als einen mutationsbedingten Verlust der
Stelle an.
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(b) Das rekombinante Plasmid kann mit dem Enzym verdaut
werden, welches anfänglich benutzt wurde, um die
bakterielle Donor-DNA zu fragmentieren. Die Fragmente, die
in dem Klon vorliegen, sollten faßbar sein, hinreichend
groß sein, um ein Methylasegen zu codieren (d.h. über
500 Basenpaare), und am wichtigsten, einer Reihe von
unabhängig gebildeten Klonen gemeinsam sein: dasselbe
Fragment oder dieselben Fragmente sollten bei
sämtlichen Klonen vorliegen.
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(c) Die gesamte chromosomale DNA des Klons oder eine zweite
Plasmid-DNA, welche in die Zelle eingeführt wurde, oder
DNA aus Phagen, welche auf der Zelle gewachsen sind,
können gereinigt werden und der selektiven
Restriktionsendonuklease ausgesetzt werden. Wenn der Klon das
Methylasegen trägt, sollte das bakterielle Chromosom,
die Plasmid- oder Phagen-DNA teilweise oder vollständig
methyliert sein und es sollte gefunden werden, daß sie
resistent gegenüber dem Verdau ist.
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(d) Der Zellextrakt aus dem Klon kann hergestellt werden
und in vitro auf Methylaseaktivität hin getestet
werden. (Methylase-Schutz und radioaktive Markierung.)
Eine spezifische Methylaseaktivität wird oft gefunden.
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12. Das Methylasegen wird als entweder eine Cytosin- oder
Adeninmethylase charakterisiert, um den geeigneten Wirt
zum Klonieren des entsprechenden Endonukleasegens zu
bestimmen. Alternativ kann eine Reihe von Wirten
verwendet werden, um das Methylasegen zu klonieren und
dann seine Methylierungsspezifität zu bestimmen.
B. Klonieren des Endonukleasegens
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1. Da die Endonuklease- und Methylasegene häufig eng
verknüpft sind, wird der Bereich, welcher das Methylasegen
umgibt, auf dem Genom kartiert, d.h. durch Southern
Blots unter Verwendung des Klons, der das Methylasegen
als eine Sonde enthält, und einer Sonde für das
Endonukleasegen, welche aus homogenem Protein konstruiert
wurde. Jegliche Inkonsistenz in der Karte zwischen dem
Methylaseklon und dem bakteriellen Chromosom kann
signalisieren, wo eine DNA-Neuanordnung aufgetreten ist,
und kann in der Tat den Ort des Endonukleasegens
anzeigen.
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2. Unter Verwendung der Restriktionskarte wird die DNA der
bakteriellen Spezies wiederum mit einem passenden
Restriktionsenzym verdaut. Fragmente eines geeigneten
Größenbereiches, welche mit den Sonden hybridisieren,
werden gereinigt und in einen Klonierungsvektor
ligiert, welcher Endonuklease bezüglich der Methylase
bei niedrigeren Niveaus exprimiert. Geeignete Vektoren
sind vorzugsweise jene, welche mit dem
Klonierungsvektor, der das Methylasegen enthält, kompatibel sind.
Diese Mischung wird dann verwendet, um die Wirtszelle
zu transformieren, welche das Methylaseplasmid trägt.
Obwohl dies nicht bevorzugt ist, kann das
Endonukleasegen in den Klonierungsvektor, welcher das Methylasegen
enthält, eingeführt werden, vorausgesetzt, daß die
Expression des Endonukleasegens niedrig ist oder stark
durch einen Promotor kontrolliert wird. Die Mischung
wird verwendet, um die Wirtszelle mit oder ohne
Methylaseplasmid zu transformieren. In jedem Fall wird die
DNA/Zellmischung auf antibiotischen Medien plattiert,
welche selektiv für transformierte Zellen sind.
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3. Ein Restriktionsendonuklease-Screenen kann auf drei
Wegen durchgeführt werden:
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(a) Der Zellextrakt aus dem Klon kann hergestellt werden
und in vitro auf seine Fähigkeit, empfindliche DNA zu
verdauen, getestet werden. Es sollte
Restriktionsendonukleaseaktivität gefunden werden.
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(b) Die Zellen selbst können in vivo auf ihre Fähigkeit,
einer Phageninfektion zu widerstehen, getestet werden.
Resistenz gegenüber einer Phageninfektion zeigt das
Vorliegen eines Restriktions-Modifikationssystemes an.
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(c) Transformantenkolonien können durch Hybridisierung auf
das Vorliegen von Sequenzen getestet werden, welche
komplementär zu jenen der Oligonukleotidsonde sind,
welche zu dem Endonukleasegen und/oder Bereichen, die
benachbart aber nicht in der Sonde des Methylasegens
eingeschlossen sind, hergestellt wurde.
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Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte
Weise zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung
darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben
beschriebene Ansatz gemäß im Stand der Technik
bekannten Techniken variieren kann.
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Klone, welche die Restriktions- und Modifikationsgene
von Dde I enthalten, wurden erfindungsgemäß
hergestellt. Die Quelle für die DNA, welche die obigen Gene
enthält, war Desulfovibrio desulfuricans (Dde I) (NCIB
83120.
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Ein wichtiger Faktor, welcher das erfolgreiche
Klonieren von Restriktions- und Modifikationsgenen
beeinflußt, ist der E. coli-Stamm, welcher als der Wirt
verwendet wird. Viele Bakterien, einschließlich E. coli,
haben Restriktions-Modifikationssysteme. Das häufigste
System in E. coli ist das wirtsspezifische
Determinanten- oder "Hsd"-System, aber andere Systeme,
insbesondere P1 und die EcoR-Reihen kommen ebenfalls vor
(Roberts, R.J., Nucl. Acids Res. 125: R167-204 (1984)).
Diese Systeme stören eine Klonierung, weil sie die
Zerstörung der eintretenden DNA während der Transformation
bewirken, wodurch sich niedrige Zahlen an
Transformanten und nicht-repräsentative Bibliotheken ergeben. Im
allgemeinen ist daher beim Durchführen der vorliegenden
Erfindung die bevorzugte E. coli eine, in welcher die
Restriktionssysteme durch Mutation oder Verlust
inaktiviert wurden. Bevorzugte Stämme, in welchen diese
Systeme inaktiviert wurden oder abwesend sind und
welche für allgemeine Klonierungszwecke verwendet werden
können, schließen ein: HB101 (hsdR&supmin;M&supmin;) ATCC 33694, RR1
(hsdR&supmin;M&supmin;) ATCC 31343, K802 (hsdR&supmin;M&spplus;) ATCC 33526, K803
(hsdR&supmin;M&supmin;)
ATCC 27065 und MM294 (hsdR&supmin;M&spplus;) ATCC 33625 und
ER1467 (hsdR&supmin;M&supmin;), wovon eine Probe bei der American
Type Culture Collection ATCC 53496 hinterlegt wurde.
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Unter besonderer Berücksichtigung des Klonierens
fremder Restriktions- und/oder Modifikationsgene in E. coli
gibt es ein zusätzliches System, welches ein
erfolgreiches Klonieren stört. Das System ist unklar und wird
als das "Rgl"-System bezeichnet (Revel, H.R.,
Bacteriophage T4, S. 156-165 American Society of Microbiology
(1983) und Revel et al., Annual Review of Genetics 4:
177-192 (1970)). Insbesondere spaltet das E. coli-Rgl-
System DNA-Moleküle, welche methylierte Cytosinreste
tragen und zerstört demzufolge gerade die
selbst-methylierten Plasmidklone, welche isoliert werden sollen. Es
wurde kürzlich gezeigt, daß das Rgl-System durch einen
Locus kontrolliert wird, welcher mit "mcrB"
(modifizierte Cytosin-Restriktion, Raleigh und Wilson,
supra) bezeichnet wurde. Um derartige Methylasegene zu
klonieren, ist es daher bevorzugt, E. coli-Wirte zu
verwenden, welche sowohl im Hinblick auf das
Hsd(allgemeine)-System als auch das Rgl(spezifische)-
System defekt sind. Eine neue Serie an
Klonierungsstämmen wurde durch Inaktivieren des "mcrB"-Locus mit Tn10-
Insertionen konstruiert. Ein solcher Stamm, der
vorzugsweise verwendet wird, wobei das Methylasegen ein
Klon des Cytosintyps ist, ist ER1467, welcher ein
Denvatstamm aus JC1552 ist (Bachman, Bacteriol. Rev. 36:
525; 1972), der eine Tn10-Insertion in mcrB enthält.
Jedoch sind nicht alle klonierten Methylasegene
empfindlich. Insbesondere jene, welche Adeninreste
methylieren, erscheinen gänzlich unbeeinflußt durch das Rgl-
System, im Gegensatz zu solchen, welche Cytosinreste
methylieren.
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Während man nicht an eine Theorie gebunden sein möchte,
wird angenommen, daß das Rgl-System aus zwei Bestand-
teilen aufgebaut ist, welche mit "Rgl A" und "Rgl B"
bezeichnet werden. Es scheint, daß Rgl B viele
Cytosinmethylase enthaltende DNAs spaltet, wogegen von Rgl A
gegenwärtig bekannt ist, daß es nur einen spezifischen
Klon (Hpa II) spaltet.
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Beim Auswählen eines Wirtes zum Klonieren der
Restriktions- und/oder Modifikationsgene aus einem nicht
charakterisierten Restriktions-Modifikationssystem oder
einem, von dem bekannt ist, daß es an Cytosinen
methyliert, ist ein bevorzugter Wirt ein E. coli-Stamm,
welcher eine Dreifachmutante ist, d.h. einer, dem die
Hsd-, Rgl A- und Rgl B-Systeme fehlen. Solche Stämme
schließen K802 ein. Ein bevorzugter Wirt für Dde I ist
ER1467, welcher hsdR&supmin;M&supmin; und rglA&spplus;B&supmin; ist. Wenn
andererseits bekannt ist, daß das Modifikationssystem ein
System vom Adeninmethylase-Typ ist, kann die
Rgl-Aktivität des Wirts ignoriert werden. Obwohl Rgl Adenin-
Methylasen nicht stört, scheint es, daß andere noch
schwach charakterisierte Systeme auf E. coli mit
Adenin-Methylierung arbeiten können. Die Wahl des Wirtes
hängt demzufolge von dem Charakter des
Modifikationsgens ab, welches kloniert werden soll. Tabelle I faßt
die Eignung unterschiedlicher E. coli-Stämme zum
Klonieren von unterschiedlichen Modifikationsgenen
zusammen.
Geeignete Stämme von E.coli
Typ der Modifikations-Methylase
Restriktions-Modifikations-System
Adenin-Methylase (bekannt oder vermutet)
Cytosin-Methylase (bekannt oder vermutet) (Rgl B-empfindlich)
Tytosin-Methylase (Rgl A-emfindlich)
geeignet
ungeeignet
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Die folgenden Beispiele werden angegeben, um zusätzlich
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen,
wie sie derzeit bevorzugt praktiziert wird. Man wird
verstehen, daß diese Beispiele zur Veranschaulichung dienen
und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten
Ansprüchen angegeben, nicht als darauf beschränkt betrachtet
werden soll.
BEISPIEL I
Klonieren des Dde I-Restriktions-Modifikationsgens
A. Klonieren des Methylasegens und Charakterisierung
seiner Aktivität
1. DNA-Reinigung:
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D. desulfuricans-DNA wurde durch das folgende Verfahren
gereinigt: 5 Gramm an gefrorenen Zellen wurden in 20 ml 25%
Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M
EDTA, pH 8,0, plus 6,0 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris,
pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde zwei Stunden
auf Eis gelassen. Anschließend wurden 24 ml Lysepuffer (1%
Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) plus 5 ml 10%
SDS zugegeben und gemischt, und man ließ die Zellen
lysieren. Ein gleiches Volumen an Phenol (äquilibriert mit
100 mM Tris, pH 8,0) wurde hinzugegeben und die Lösung
durch Schütteln emulgiert. Dann wurden 70 ml an Chloroform
zugegeben und für 10 Minuten geschüttelt. Die Mischung
wurde dann bei 10K für 30 Minuten in einer Beckman-
Zentrifuge zentrifugiert; die obere wäßrige Schicht, welche
die DNA enthielt, wurde in eine frische Flasche überführt
und zwei weitere Male mit Phenol/Chloroform reextrahiert.
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Die wäßrige Schicht wurde dann gegen vier Wechsel 10 mM
Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, über 24 Stunden dialysiert. Die
dialysierte DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen RNAse (10
mg/ml) eine Stunde bei 37ºC behandelt. 5 M NaCl Lösung
wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M NaCl
zugegeben und die Lösung wurde mit zwei Volumina an Ethanol
überschichtet. Die DNA wurde mit einem Glasstab aufgewickelt,
einmal mit 70% Ethanol gewaschen und dann in 15 ml 10 mM
Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 aufgelöst. Die DNA wurde gefroren
bei -20ºC gelagert. Aus 5 Gramm Zellen wurden 1,5 mg
gereinigte DNA erhalten.
2. Vollständiger Verdau:
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Die D. desulfuricans-Bibliothek wurde hergestellt, indem 10
µg gereinigter D. desulfuricans-DNA mit 15 Einheiten Hind
III in Hind III-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;; 50
mM NaCl; 10 mM β-Mercaptoethanol) in einer 100 µl Reaktion
1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert wurden.
3. Ligation
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4 µg der verdauten DNA wurden mit 2 µg Hind III-gespaltenem
und dephosphoryliertem pBR322 (New England Biolabs) in
einem Reaktionsvolumen von 100 µl, welches 50 mM Tris, pH
7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 MM ATP enthielt, mit 1000
Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die
Ligation setzte sich bei 16ºC über 4 Stunden fort. Die
Probe wurde dann mit Chloroform behandelt und verwendet, um
200 µl eisgekühlte kompetente RR1-Zellen (in 50 mM CaCl&sub2;)
zu transformieren. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 42
ºC einem "Hitzeschock" unterworfen; in 5 ml
Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und bei 37ºC bis zur Sättigung
kultiviert.
4.
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Die transformierten Zellen wurden durch Zentrifugation
geerntet (4K, 10 Minuten, Beckman-Zentrifuge), in 250 µl L-
Nährlösung resuspendiert und auf L-Agarplatten mit 100
µg/ml Ampicillin plattiert, und über Nacht bei 37ºC inku-
biert. Eine gemischte Population von ungefähr 10&sup5;
Transformanten wurde mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;
Puffer von den Platten gewaschen.
5.
-
Diese Mischung wurde verwendet, um 500 ml LB, welches
100 µg/ml Ampicillin enthielt, zu inokulieren und wurde
über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde über Nacht
bei 37ºC geschüttelt und die Zellen dann wieder geerntet
(4K, 5 Minuten). Die Zellen wurden in 10 ml 25% Sucrose, 50
mM Tris, pH 8,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml
0,25 M EDTA pH 8,0 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym. Die Lösung
wurde für eine Stunde bei 4ºC gehalten; dann wurden 12 ml
Lysepuffer zugegeben und die Zellsuspension wurde sanft
gemischt. Nach der Lyse wurde das Lysat bei 15K für eine
Stunde zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Mull
dekantiert. Festes Cäsiumchlorid (0,93 g/ml) und Ethidiumbromid
bis zu einer Konzentration von 100 µg/ml wurde zugegeben.
Die Röhrchen wurden gefüllt, ausgeglichen und in einem
Beckman Ti70 Rotor (head) in einer Beckman-Ultrazentrifuge
bei 44.000 UpM für 48 Stunden bei 17ºC zentrifugiert. Die
Ethidium-gefärbten DNA-Banden wurden mittels einer Spritze
extrahiert und die DNA wurde in Ethanol bei Tiefkühlung
präzipitiert. Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren
bei 12 K für 20 Minuten gesammelt. Nach dem Resuspendieren
in 1 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurde die DNA einmal
Phenol-extrahiert, einmal Chloroform-extrahiert und dann in
2 Volumina Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 100 µl
10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA Puffer resupendiert.
6. Dde I-Spaltung:
-
5 µg des primären Plasmidpools wurden mit 80 Einheiten an
Dde I-Endonuklease für 1 Stunde in 10 mM Tris, pH 7,5, 10
mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, 100 mM NaCl in einer 100
µl Reaktion verdaut.
7. Transformation:
-
10 µl der Reaktionsmischung wurden verwendet, um 200 µl an
RR1-Zellen wie oben beschrieben zu transformieren. Nach
zwei Minuten Wärmebehandlung wurde die
Transformationsmischung sofort auf L-Agar plus 100 µg/ml Ampicillin
plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Ein Vergleich von Dde I-behandelten und unbehandelten
rekombinanten Plasmiden ergab eine 10³-Selektion. Die
Kolonien wurden in 10 ml L-Nährlösung, welche Ampicillin
enthielt, inokuliert, um eine Minikultur herzustellen und
wurden auf LB und Ampicillinplatten ausgestrichen.
8. Miniprep-Verfahren:
-
Jede Kultur wurde wie folgt verarbeitet: die 10
ml-Übernachtkultur wurde bei 6K UpM 5 Minuten lang pelletiert und
in 1 ml 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose mit 1
mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei
Raumtemperatur wurden 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS-Lösung zugegeben; die
Röhrchen wurden gemischt und 5 Minuten lang bei 4ºC
abgestellt. 1,5 ml an 3 M Natriumacetat, pH 4,8, wurden hinzu
gegeben, gemischt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die
Mischung wurde bei 15K UpM für 10 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen,
welches 3,0 ml Isopronanol enthielt. Nach 10 Minuten bei
Raumtemperatur wurde das Röhrchen für 10 Minuten bei 15K
UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde bei Raumtemperatur
luftgetrocknet und in 0,85 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,
resuspendiert. 75 µl 5 M NaCl wurden hinzugegeben und die
DNA wurde bei Raumtemperatur wieder mit Isopropanol
gefällt. Nach dem Zentrifugieren für 1 Minute in einer
Eppendorf-Zentrifuge wurde das Pellet luftgetrocknet und in
50 µl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, welche 20 µl/ml RNase
enthielten, resuspendiert.
9. Methylasegen-Klone:
-
Die Plasmid-Minipreps wurden nachfolgend analysiert, indem
sie zunächst init Dde 1 herausgefordert und dann durch Hind
III-Verdau analysiert wurden. Unter den Überlebenden waren
zwei Typen resistent gegen eine Spaltung durch Dde
I-Endonuklease. Diese trugen ein 3,0 kb-Hind III-Fragment in
entgegengesetzten Orientierungen relativ zu pBR322. Es wurde
anschließend gezeigt, daß diese Plasmide das Dde 1
Modifikations-Methylasegen trugen. Die beiden Plasmide wurden mit
pDdeM3.0a und pDdeM3.0b bezeichnet, indem das
Standardverfahren der Nomenklatur verwendet wurde, welches in Gingeras
und Brooks, PNAS (USA) 80: 402 (1985) beschrieben ist.
Rohextrakte dieser Klone (siehe Abschnitt B-5, infra) zeigten
keinerlei Dde I-Endonukleaseaktivität.
-
Die Position des Methylasegens innerhalb des 3,0 kb-Hind
III-Fragmentes wurde durch eine Reihe von Tns
Mutageneseexperimenten bestimmt (Fig. 1A) (Berg, D.E. (1977) in DNA
Insertions Elements, Plasmids, and Episomes, Bukhari, A.I.,
Shapiro, J.A. und Adhya, S.L. Eds., Seiten 205-212, Cold
Spring Harbor Laboratoires, New York). HB101 (recA)-Zellen,
welche das Methylaseplasmid pDdeM3.0a oder pDdeM3.0b
trugen, wurden über Nacht bei 30ºC in L-Nährlösung plus 100
µl/ml Ampicillin plus 0,2% Maltose kultiviert. Die
gesättigten Kulturen wurden in 5 ml LB plus Ampicillin plus
Maltose 1:100 verdünnt und zu einer Zelldichte von etwa 10&sup9;
Zellen/ml kultiviert. 1 ml dieser Zellen wurde mit dem Tn5-
tragenden Bakteriophagen (lambda 467::Tn5 von N. Kleckner
via E. Raleigh) bei einer m.o.i.--0,1 gemischt. Die Mischung
wurde bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. 0,2 ml-Aliquots
wurden auf LB-Platten, welche 50 µg/ml Kanamycin, 100 µg/ml
Ampicillin enthielten, plattiert. Die Platten wurden bei
30ºC 48 Stunden lang inkubiert.
-
Die Kolonien wurden mit 5 ml 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM
EDTA, 50 mM Glucose von den Platten gewaschen und Minipreps
wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (siehe Abschnitt
8, Miniprep-Verfahren).
-
Die Minipreps wurden verwendet, um 200 µl eisgekühlte
kompentente HB101-Zellen (in 50 mM CaCl&sub2;) zu transformieren.
Die Zellen wurden einem "Hitzeschock" unterworfen, dann für
2 Minuten bei 42ºC in 1 ml L-Nährlösung verdünnt und für 1
Stunde inkubiert. Die Zellen wurden auf L-Nährlösung plus
50 µg/ml Kanamycin, 100 µg/ml Ampicillin plattiert.
-
Die Transformanten wurden auf das Vorliegen von
Tn5-enthaltenden Plasmiden durch ein Verdauen von Minipreps der
Plasmid-DNA mit Hind III gescreent. Plasmide mit Tn5 wurden auf
Dde I-Methylaseaktivität getestet, indem die Minipreps mit
Dde I-Endonuklease herausgefordert wurden.
-
Wie in Fig. 1A gezeigt, führten lediglich Tn5-Insertionen
zwischen Cla I und Hind III-Stellen zu dem Verlust der
Dde I-Methylaseaktivität, was nahelegte, daß das Gen in dem
Bereich zwischen diesen Stellen enthalten war. Indem eine
Cla I-Deletion von pDdeM3.0a hergestellt wurde, wurde ein
Subklon, welcher mit pDdeM1.6 bezeichnet wurde, erzeugt,
der Methylaseaktivität aufrechterhält, was bestätigt, daß
das Methylasegen vollständig innerhalb dieses 1,6
kb-Bereiches (Fig. 1B) liegt.
-
Die Methylaseaktivität der drei M.Dde I-Klone wurde
verglichen, indem ein in vivo-Schutzassay und ein in vitro ³H-
Methyleinbautest wie folgt verwendet wurden:
-
a. In vitro ³H-Methyleinbautest (Gingeras und Brooks,
supra):
-
Um auf Methylierung zu testen, wurden drei Mischungen
hergestellt:
-
1. 10x Methylierungspuffer: 1 M NaCl, 0,5 M Tris, pH 7,5,
0,1 M EDTA und 50 mm β-Mercaptoethanol.
-
2. Methylierungsreaktionsmischung: Das Substrat pBR322,
linearisiert mit Ecor I, wurde wie folgt hergestellt:
pBR322 wurde mit 20-fachem Überschuß an Ecor I in 100 mM
NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; bei einer
Konzentration von 20 µg/ml inkubiert. Nach dem Inkubieren für eine
Stunde bei 37ºC wurde das linearisierte Plasmid
phenolextrahiert, ethanolpräzipitiert und das Pellet
luftgetrocknet. Die DNA wurde in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zu
einer Endkonzentration von 1 mg/ml linearisiertem Plasmid
resuspendiert. Die Methylierungsreaktionsmischung enthielt
1 µg (= 1 µl) an linearisiertem pBR322 plus 2,5 µl 10x
Methylierungspuffer, 0,5 µl ³H-S-Adenosylmethionin und H&sub2;O
auf 20 µl.
3. Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt:
-
Eine 5 ml-Kultur des zu testenden Klons wurde über Nacht in
L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin bei 37ºC kultiviert.
Nach der Sättigung wurden die Zellen durch Zentrifugation
bei 5 K UpM für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden
in 500 µl Beschallungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM β-
Mercaptoethanol) resuspendiert. Zu dieser Mischung wurden
25 µl Lysozym (10 mg/ml) und 50 µl EDTA (100 mM) zugegeben.
Die Proben wurden gefroren und dann auf Eis aufgetaut.
Diese wurden unter Verwendung eines einzelnen 10 Sekunden-
Stoßes beschallt. Nach dem Zugeben von 5 µl 1 M MgCl&sub2;
wurden die Proben in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten
zentrifugiert.
-
Um die Zellextrakte zu testen, wurden 5 µl des Extraktes zu
20 µl der Methylierungsreaktionsmischung zugegeben und für
30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die gesamte 25 µl-Reaktion
wurde dann auf 3 mm Papier, abgegrenzt in 2,54 cm (1 Inch)
Quadrate, pipettiert. Das Papier wurde luftgetrocknet, dann
zweimal mit 10% T.C.A. (150 ml), dann zweimal mit 200 ml
Isopropanol gewaschen. Das Papier wurde wiederum
luftgetrocknet und dann in einem Röhrchen angeordnet und mit
Szintillationsflüssigkeit (Omniflour, NEN) bedeckt. Um den
Methylierungsgrad zu bestimmen, wurden die Proben auf ³H-
Methyleinbau hin gezählt.
b. In vivo Lambda-Schutzassay
-
Die Methylase-enthaltenden Plasmide pDdeM3.0a, pDdeM3.0b
und pDdeM1.6 wurden durch das zuvor beschriebene
Transformationsverfahren in den Stamm ER1467 transformiert. Diese
Klone wurden in L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin bis
zur Sättigung kultiviert. Nach Inokulierung 1:100 in 10 ml
L-Nährlösung plus Ampicillin wurden die Zellen zum
mittleren logarithmischen Stadium kultiviert, dann durch
Zentrifugation bei 5K UpM für 5 Minuten pelletiert. Die
Zellpellets wurden in 1 ml des folgenden Phagenpuffers: 10 mM
Tris, pH 7,4, 5 mM MgCl&sub2;, 0,2 M NaCl, 0,1% Gel resuspen
diert. 100 µl Lambda-Phagen (10¹¹ Phagen/ml) wurden dann
hinzugefügt, gemischt und bei 37ºC für 30 Minuten
inkubiert. Die Mischung wurde durch Zugeben von 9 ml
Phagenpuffer verdünnt, dann wiederum bei 5 K UpM für 10 Minuten
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml L-Nährlösung plus 100
µg/ml Ampicillin resuspendiert und über Nacht bei 37ºC
inkubiert.
-
Die Phagen-DNA wurde auf die folgende Weise hergestellt.
Die lysierten Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen
übertragen und drei Tropfen Chloroform wurden hinzugefügt.
Die Proben wurden verwirbelt und dann bei 10 K UpM 10
Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der
Überstand wurde phenolextrahiert, indem ein gleiches Volumen an
Phenol zugegeben wurde, verwirbelt und bei 5 K UPM für 5
Minuten zentrifugiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde dann
chloroformextrahiert, verwirbelt und erneut zentrifugiert.
Die oberste Schicht wurde in ein frisches Röhrchen übertra-
gen, zu welchem 2 Volumina Ethanol hinzugefügt wurden, um
die DNA zu präzipitieren. Nach Zentrifugieren bei 10 K UpM
für 20 Minuten wurde das Pellet luftgetrocknet und in 1 ml
10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 20 µg/ml RNase
resuspendiert.
-
Um die Phagen-DNA auf Modifikation zu testen, haben wir 20
bis 40 µl der Phagen-DNA mit dem folgenden gemischt: 5 µl
10 Dde I-Puffer (1 M NaCl, 100 mM Tris, pH 7,5 und 100 mM
MgCl&sub2;) und 1,5 µl Dde I-Endonuklease (10.000 Einheiten/ml)
in einem Reaktionsvolumen von 50 µl. Die gesamte Probe
wurde durch Gel-Elektrophorese analysiert, wie in Fig. 2
gezeigt ist.
-
Sowohl die in vitro- als auch die in vivo-Tests ergaben
eine Abstufung der Methylaseaktivität, wobei pDdeM3.0b die
niedrigste Aktivität und pDdeM1.6 die höchste aufwies;
lediglich pDdeM1.6 hat hinreichend Aktivität, um
Lambda-Phagen in vivo vollständig zu schützen. Die in vitro-Teste
stimmten mit diesen Ergebnissen überein. pDdeM1.6 wurde
daher in späteren Versuchen verwendet, um das Endonukleasegen
zu klonieren (siehe unten).
-
Es ist möglich, auf dem folgenden Weg zu zeigen, daß M.Dde
I eher eine Cytosin- als eine Adeninmethylase ist: Lambda-
DNA enthält überlappende Sau3a- (GATC) und Dde I- (CTNAG)
Stellen bei Position 2532: 5'-GATCTCAG-' Suggs, S.V.,
Wallace, R.B., Hirose, T., Kawashima, E.H. und Itakura, K.
(1981) PNAS (USA) 78, 6613-6617, Sanger, F., Coulson, A.R.,
Hong GF., Hill, D.F. und Petersen, G.B. (1982) J. Moh Biol.
162, 729-773.
-
Die Spaltung von Lambda-DNA mit Sau3a führt zu 165 bp- und
487 bp-Fragmenten aus diesem Bereich. Ein 5,0 kb-Mlu I-
Fragment enthält die überlappenden Sau3a- und Dde
I-Stellen. Dieses Fragment wurde isoliert, so daß die relevanten
Sau3a-Fragmente besser sichtbar gemacht werden konnten. Wir
haben dieses Lambda-Fragment mit M.Dde 1 behandelt und dann
mit Sau3a herausgefordert. Wenn M.Dde 1 eine
Adeninmethylase wäre, würde die Modifikation an dem zweiten Adenin
innerhalb dieser Sequenz auftreten, außerhalb der
Sau3a-Erkennungsstelle. Die Sau3a-Spaltung würde daher zu den
normalen 165 bp- und 487 bp-Fragmenten führen. Wenn jedoch
M.Dde I eine Cytosinmethylase ist, würde eine Modifikation
an dem Cytosin innerhalb der Sau3a-Erkennungssequenz
auftreten. Eine Hemi-Methylierung innerhalb der Sau3a-Stelle
blockiert die Sau3a-Spaltung; lediglich
Einzelstrang-Nicking tritt auf (Streek, R.E. (1980) Gene 12, 267). Eine
Sau3a-Behandlung würde dann zu dem Erscheinen eines neuen
652 bp-Fragmentes führen. Wie in Fig. 3 gezeigt, erscheint
die neue Bande tatsächlich, ein Anzeichen, daß M.Dde I eine
Cytosin-Methylase ist.
-
Ein Erkennen, daß M.Dde I eine Cytosin-Methylase ist,
hilft, das folgende Phänomen zu erklären. Der Klon, welcher
die meiste Methylase produziert, der pDdeM1.6 trägt, war
merklich weniger lebensfähig als pDdeM3.0b-Konstrukte in
unserem Klonierungsstamm RR1. Wenn eine Kultur aus RR1,
welche pDdeM1.6 trug, die stationäre Phase erreichte, hatte
sie lediglich 6% der Anzahl an lebensfähigen Zellen, wie in
einer Parallelkultur aus RR1 allein (Tab. II). Es wurde
kürzlich gezeigt, daß gewisse E. coli-Stämme Systeme haben,
welche die Einführung von DNA, die Cytosin-Methylierung
enthält, blockieren (Raleigh, E.A. und Wilson, G. (1986)
"Escherichia coli K12 restricts DNA containing
5-methylcytosine." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9094); der
Locus, welcher für diese Aktivität verantwortlich ist,
wurde mit "mcrB" bezeichnet (modifizierte Cytosin
Restriktion). In RR1 ist dieser Locus von E. coli B abgeleitet und
ist von unterschiedlicher Spezifität und scheinbar
schwächerer Aktivität (Raleigh et al., supra, Revel, H.R.
(1967), Virology 31, 688-701). Eine neue Reihe von
Klonierungsstämmen wurde durch Inaktivieren des mcrB Locus mit
Tn10-Insertionen konstruiert. Wir haben unsere Methylase-
klone in einen dieser Stämme, ER1467, eingeführt: ein
Vergleich von pDdeM3.0a, pDdeM3.0b, pDdeM1.6 und ER1467 allein
zeigt eine vollständige Widerherstellung der
Lebensfähigkeit; es gab einen vernachlässigbaren Unterschied in der
Anzahl der koloniebildenden Einheiten (c.f.u.) bei
Sättigung, Tabelle II. Daher wurde eine weitere Klonierung und
Charakterisierung des Dde I Systems in ER1467 getätigt.
TABELLE II: LEBENSFÄHIGKEIT VON METHYLASEKLONEN IN RR1
GEGEN ER1467
Wirt
MDdeI PLASMID
Lebensfähigkeit
1 Lebensfähigkeit ist definiert als das Verhältnis von
c.f.u./ml des Teststammes zu den c.f.u./ml
des Wirts (RR1
oder ER1467)allein bei Sättigung.
B. KLONIEREN DES ENDONUKLEASEGENS
-
Da Endonuklease- und Methylasegene häufig eng verknüpft
sind, erschien es sinnvoll zu erwarten, daß das R.Dde I-Gen
in einem Bereich angrenzend an das Methylasegen liegen
würde. Der Bereich auf dem D. desulfuricans-Genom um das
Methylasegen herum wurde durch Southernblot-Analyse
kartiert, indem das 3,0 kb-Hind III-Fragment aus pDdeM3.0a als
eine Sonde verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 4A
gezeigt.
-
Eine Oligonukleotid-Sonde, die spezifisch für das 5'-Ende
des Endonukleasegens war, wurde synthetisiert.
Schritt I: Reinigen der Dde I-Endonuklease zur Homogenität:
Dde I-Endonuklease-Reinigung
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Die 23 Gramm gefrorenes Pellet aus D.desulfuricans wurden
auf Eis aufgetaut und in 120 ml Beschallungspuffer (10 mM
KPO&sub4;, pH 6,9, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA), 50 mM
NaCl resuspendiert. Sämtliche Schritte, die unten
beschrieben sind, wurden bei 4ºC durchgeführt. Lysozym wurde bis zu
einer Endkonzentration von 300 µg/ml zugegeben und Zellen
wurden durch Beschallung aufgebrochen. Das Zellysat wurde
bei 10.000 x g für 45 Minuten zentrifugiert.
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Die 120 ml Überstand wurden auf eine 2,5 x 15 cm
Phosphocellulose P11-Säule (Whatman) gegeben, welche mit dem
Beschallungspuffer, 150 mM NaCl äquilibriert war. Das Enzym
wurde mit einem linearen 700 ml-Gradienten von 150 mM bis 1
M NaCl eluiert. Die Endonuklease eluiert ungefähr bei 0,5 M
NaCl. Die Peakfraktionen wurden gesammelt und gegen
Beschallungspuffer, 50 mM NaCl dialysiert.
-
Der 170 ml-Enzympool aus der Phosphocellulosesäule wurde
auf eine 1,5 x 15 cm Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia)
gegeben, welche mit dem Beschallungspuffer, 25 mM NaCl
äquilibriert war. Ein 340 ml-Gradient von 25 mM bis 1 M
NaCl wurde verwendet, und das Enzym eluierte bei ungefähr
0,5 M NaCl. Fraktionen mit Endonukleaseaktivität wurden
gepoolt und gegen HPLC-Puffer (20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM β-
Mercaptoethanol), 50 mM KC1 dialysiert.
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Der 10 ml-Enzym-Pool wurde durch eine Mono-Q-Säule
(Pharmacia) und eine Polyanionen-SI-Säule (Pharmacia)
geschickt und dann auf einer 1 x 8 cm Mono-S-Säule
(Pharmacia) bei 50 mM KC1 absorbiert. Ein linearer 53 ml-
Gradient wurde von 50 mM bis 1 M KC1 entwickelt. Die
Endonuklease eluierte als ein einzelner Peak bei ungefähr 0,2 M
KC1.
-
Es wurde ein Waters Associates Flüssig-Chromotograph
verwendet, um die Probe zur Proteinsequenzierung auf die
folgende Weise herzustellen. Dde I-Endonukleaseproben (15 µg)
wurden einer Chromatographie auf einer Vyadac C4 214TP54 (5
µm, 4,6 x 300 mm) 300 Angström Poren-Umkehrphasensäule
ausgesetzt, mit einem linearen Gradienten aus 5% Acetonitril
in 0,1% Trifluoressigsäure über 25 Minuten bei einer
Flußrate von 1 ml/min mit Messung bei 214 nm entwickelt.
Einzelne Peaks wurden manuell gesammelt und lyophilisiert.
Schritt 2: Protein-Sequenzierung und Synthese der
Endonuklease-Sonde
-
Der sequentielle Proteinabbau wurde mit einem Applied
Biosystems Modell 470A Gasphasen-Sequenzierer, Strickler,
J.E., Hunkapiller, M.W. und Wilson, K.S. (1984) Analytical
Biochemistry 140, 553-566, durchgeführt. Die ersten 19
Phenylthiohydantoine wurden durch
Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer IBM Cyano (µm, 4,5 x 250 mm)
Säule mit leichten Gradientmodifikationen zu jenen, welche
zuvor von Hunkapiller, M.W. und Hood, L.E. (1983) in
Methods in Enzymology, Hirs, C.H.W. und Timasheff, S.N.
Herausg., Bd 91, Seiten 486-493, Academic Press, New York,
beschrieben wurden, eindeutig identifiziert.
-
Die Proteinsequenz wurde verwendet, um eine DNA-Sequenz mit
minimaler Degeneriertheit abzuleiten. Dieses Tetradecamer
wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesekits (New England
Biolabs) synthesisiert und durch Chromatographie auf einer
Water Associates C8 (10 µm, 0,5 x 10 cm) Radial Pak-Säule
gereinigt.
-
Die ersten 19 Aminosäuren der Endonuklease sind Met-Lys-
Ala-Ala-Thr-Asp-Gln-Glu-Leu-Arg-Lys-Leu-Ile-Val-Leu-Tyr-
Asn-Asn-Val. Unter Verwendung der fünf unterstrichenen
Aminosäuren wurde eine gemischte Tetradekamersonde mit der
Sequenz: 5'-ATG-AAR-GCN-GCN-AC-3' (R, Nukleotid A oder G;
N, Nukleotid A,G,C oder T) hergestellt. Southern Blots der
Genom-DNA-Verdaus wurden mit der Sonde hybridisiert. Die
Endonukleasesonde hybridisiert nicht mit dem 3,0 kb-Hind
III-Fragment, von welchem bekannt ist, daß es das
Methylasegen enthält.
Southern Hybridisierungen:
1. Verwendung des nicktranslatierten Fragmentes
-
1-2 µg der Genom-DNA wurden mit 20-fachem Überschuß der
folgenden Endonukleasen: Pst I, Sal I, Bgl II, Bcl I, Hind
III, EcoR I, BamH I unter den empfohlenen Bedingungen (New
England Biolabs) verdaut. Die Verdaus wurden einer
Agarosegelelektrophorese unterworfen und die verdaute DNA wurde
nach dem Verfahren von Southern (Southern, E.M. (1975) J.
Mol. Biol. 98, 503-517) auf Nitrocellulosepapier
übertragen.
-
Diese Nitrocellulosefilter wurden mit dem 3,0 kb Hind III-
Fragment aus pDdeM3.0a hybridisiert. Dieses Fragment wurde
durch das Verfahren der Gelreinigung wie folgt hergestellt:
pDdeM3.0a wurde mit 20-fachem Überschuß an Hind III verdaut
und einer Elektrophorese auf einem Gel unterworfen, welches
hergestellt wurde mit 1% Agarose, 0,5 µg/ml Ethidiumbromid.
Das 3,0 kb-Fragment, welches das Dde I-Methylasegen
enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und durch
Auspressen durch eine Kanüle mit einem Durchmesser von 21,5 (21.5
gauge needle) zerkleinert, in Tris-Acetatpuffer suspendiert
und einer Ultrazentrifugation bei 290.000 x g in einem Typ
SW 50.1 Rotor (Beckman) für 35 Minuten bei 4ºC ausgesetzt.
Der Überstand wurde auf 0,4 M NaCl gebracht und die DNA
wurde mit Isopropanol präzipitiert. Die DNA wurde
resuspendiert, zweimal phenolextrahiert, ethanolpräzipitiert und in
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 1 µg dieses
Fragmentes wurde durch Kombinieren von 100 pmol alpha³²P-
dATP (New England Biolabs 800 Ci/mmol) mit 6 µl des
Fragmentes (1µg) 1 µl 10x Nick-Translationspuffer (0,5 M Tris,
pH 7,2, 0,1 M MgSO&sub4;, 1 mM DTT, 500 µg/ml BSA), 1 µl dGTP (1
mM), dTTP (1 mM), dCTP (1 mM) Mischung, 1 µl E. coli-DNA-
Polymerase I (New England Biolabs), und 1 µl DNAse I
(Sigma) Verdünnung (3 µl einer 3 mg/ml Stammlösung in 10 ml
H&sub2;O verdünnt) nicktranslatiert. Nach Inkubation für 2
Stunden bei 15ºC wurden 50 µl 20 mM EDTA und 200 µl 10 mM Tris,
pH 8,0, 1 mM EDTA zugegeben. Dieses wurde einmal
phenolextrahiert, einmal chloroformextrahiert und dann wurden 6
µg denaturierter Lachsspermien-DNA zugegeben. Das Volumen
wurde mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA auf 1 ml erhöht.
Nach zehnminütigem Kochen war das nicktranslatierte
Fragment fertig, um auf das Nitrocellulosefilter gegeben zu
werden.
-
Bevor man die nicktranslatierte Sonde hybridisierte, wurde
das Nitrocellulosefilter in Vorhybridisierungsmischung: 3
ml 50x Denhardt's Stammlösung (5 g Ficoll, 5 g
Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA, H&sub2;O auf 500 ml), 4,5 ml 20x SSPE-
Stammlösung (174 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; H&sub2;O, 7,4 g EDTA;
der pH wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt, H&sub2;O auf 1
Liter), 0,3 ml 10% SDS, 3 ml 50% Dextransulfat, 4,2 ml H&sub2;O,
für vier Stunden bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
-
Um zu hybridisieren, wurde die nicktranslatierte Sonde zu
dem vorhybridisierten Filter zugegeben (die
Vorhybridisierungsmischung einschließend) und über Nacht bei 65ºC
inkubiert. Das hybridisierte Filter wurde zweimal in 2x SSPE
(100 ml) bei Raumtemperatur für 5 Minuten und zweimal in 2x
SSPE plus 0,5% SDS bei 55ºC für 30 Minuten gewaschen. Das
Filter wurde dann luftgetrocknet und einem Röntgenfilm
ausgesetzt.
2. Verwendung einer Oligonukleotidsonde.
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1-2 µg an Genom-DNA oder 0,5-1 µg an Plasmid-DNA wurden
verdaut, einer Gelelektrophorese unterworfen und wie zuvor
beschrieben auf Nitrocellulose übertragen. Diese Filter
wurden auf die folgende Weise mit der Oligonukleotidsonde
hybridisiert. 2 µl der Sonde (25-50 µg/ml) plus 2,5 µl 10x
Puffer (0,5 M Tris, pH 7,6, 0,1 M MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 1 mM
Spermidin, 1 mM EDTA) 15 µl H&sub2;O, 5 µl Gamma-³²P-ATP (New
England Nuclear, 3000 Ci/mmol) und 0,5 µl
Polynukleotidkinase (New England Biolabs oder Boehringer Mannheim)
wurden gemischt und bei 37ºC 30 Minuten inkubiert. Die
Mischung wurde dann für 10 Minuten auf 65ºC erwärmt. 1 ml
10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurden zu der markierten
Sonde hinzugefügt. Dieses wurde zu dem vorhybridisierten
Nitrocellulosefilter (wie oben beschrieben) zugegeben und
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
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Das hybridisierte Filter wurde zweimal mit 2x SSPE (200 ml)
bei Raumtemperatur für 5 Minuten und zweimal in 2x SSPE
plus 0,5% SDS bei 30ºC für 30 Minuten gewaschen. Das Filter
wurde dann luftgetrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
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Die Southernblots wurden verwendet, um die
Restriktionskarte, welche in Fig. 4B dargestellt ist, zu erzeugen. Zwei
Enzymverdaus ergaben Fragmente, welche mit beiden Sonden
hybridisierten und welche groß genug waren, um für die
Methylase und/oder die Endonuklease zu codieren. Beide
Sonden hybridisieren mit einem einzelnen PstI-Fragment, wie in
Spur (a), Fig. 4A, gezeigt ist, woraus sich schließen läßt,
daß sowohl das Endonuklease- als auch das Methylasegen auf
diesem 4,8 kb-Stück der DNA lokalisiert sind. Zusätzlich
hybridisieren beide Sonden mit einem 5,3 kb-BamH
I-Fragment, wie in Spur (g), Fig. 4A gezeigt ist. Dieses Fragment
schließt einen Teil des Methlasegens ein und ist groß
genug, um das gesamte Endonukleasegen zu codieren.
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Die Endonuklease- und Methylasegene wurden getrennt auf
kompatiblen Plasmiden eingeführt. 2,3 kb-BamH I Fragmente
der D. desulfuricans-DNA wurden in pACYC184 (Chang und
Cohen, J. Bacteriol, 134: 1131 (1978)) wie folgt kloniert:
50 µg der D. desulfuricans-DNA wurden mit BamH 1
geschnitten und einer Elektrophorese unterworfen. Fragmente in dem
geeigneten Größenbereich wurden wie zuvor beschrieben
gelgereinigt; ungefähr 100 ng DNA wurden erhalten und diese
Menge wurde unter Verwendung von Alkalischer Phosphatase
aus Kalbsintestinum (Boehringer Man.) in BamH
I-geschnittenen und dephosphorylierten pACYC 184 ligiert. Diese
Ligierungsmischung wurde verwendet, um ER1467-Zellen, welche den
M.Dde I-Klon pDDEM1.6 trugen, zu transformieren. Die
Transformanten wurden durch Plattieren auf L-Agar plus 100 µg/ml
Ampicillin, 30 µg/ml Chloramphenicol ausgewählt. Die
Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.
5. Restriktionsendonuklease-Screenen:
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Fünfzig Transformanten wurden zufällig mit sterilen
Zahnstochern in Mikrotitervertiefungen (Nunc) übertragen,
welche jeweils 100 µl L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin,
30 µg/ml Chloramphenicol enthielten. Nach Inkubieren bei
37ºC für sechs Stunden, wurden die Transformanten auf sechs
Platten Replica-plattiert, welche L-Agar, Ampicillin,
Chloramphenicol und Lambdavir.-Phagen-Verdünnungen von 10&sup4;
bis 10&sup8; Phagen/Platte enthielten. Nach dem Inkubieren
dieser Platten über Nacht bei 37ºC beschränkte eine einzelne
Transformante die Phagen auf ein Niveau von ungefähr 10&supmin;¹.
Um das Vorliegen von aktiver Dde I-Endonuklease zu
bestätigen, wurde ein Rohextrakt (zuvor beschrieben) dieser
Transformante hergestellt. Zu 1 µg pBR322 (= 1 µl) wurden 5 µl
10x Dde I-Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 1 M
NaCl), 43 µl H&sub2;O und 1 µl Rohextrakt zugegeben und bei 37ºC
für 30 Minuten inkubiert und dann einer
Agarosegelelektrophorese unterworfen. DNA aus diesem Klon wurde hergestellt
und die vorläufige Restriktionskartierung zeigte, daß
dieses 2,3 kb-BamH 1-Fragment mit dem BamH I bis Hind III-Teil
von pDDEM1.6, wie in Fig. 6 gezeigt, überlappte. Demzufolge
ist das Dde I-System innerhalb von 2,9 kb der D.
desulfuricans-DNA enthalten.