DE3751923T2

DE3751923T2 - Verfahren zur Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen

Info

Publication number: DE3751923T2
Application number: DE3751923T
Authority: DE
Inventors: Joan Ellen Brooks; Kimberly Anne Howard
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1986-06-06
Filing date: 1987-06-05
Publication date: 1997-04-03
Anticipated expiration: 2007-06-06
Also published as: ATE113653T1; DE3751730T2; DE3750708D1; EP0248678A3; JP2647847B2; EP0248678B1; AU607141B2; JPS6387982A; EP0248678A2; EP0618295B1; CN87104039A; DE3751923D1; US5320957A; US5137823A; EP0618295A1; EP0618296B1; DE3750708T2; DE3751730D1; EP0618296A1; AU7389287A

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der europäischen Anmeldung Nr. 87305005.8 (EP-A-0 248 678).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Klonierung von Restriktions-Modifikationssystemen, die dadurch erzeugten Klone und Verfahren zur Herstellung von Restriktions- und/oder Modifikationsenzymen aus den Klonen. Diese Erfindung betrifft ebenfalls Klone für die DdeI- und BamHI- Restriktionsendonukleasen und Modifikationsmethylasen und entsprechende Verfahren zur Herstellung dieser Klone und Enzyme.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, welche natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen. Diese Eigenschaft ermöglicht DNA-Molekülen, eindeutig identifiziert und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert zu werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als unentbehrliche Werkzeuge in der modernen genetischen Forschung erwie sen. Sie sind die biochemischen "Scheren" mittels welcher Gentechnologie und -analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken durch ein Erkennen und Binden an bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls. Wenn sie gebunden sind, spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Sequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonukleasen haben Affinitäten für unterschiedliche Erkennungssequenzen. Fast einhundert unterschiedliche Restriktionsendonukleasen wur den unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die bis heute untersucht wurden.
Bakterien neigen dazu, meistens nur eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Spezies zu besitzen. Die Endonukleasen werden typischerweise nach den Bakterien benannt, von denen sie abgeleitet sind. So synthetisiert die Spezies Haemophilus aegyptius beispielsweise 3 unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, die Hae I, Hae II und Hae III genannt werden. Jene Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Escherichia coli RY13 synthetisiert andererseits nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
In der Natur spielen Restriktionsendonukleasen eine schützende Rolle für das Wohlergehen der Bakterienzelle. Sie ermöglichen Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle, wie Viren und Plasmide, zu widerstehen, welche sie sonst zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen eine Resistenz, indem sie die Längen der infizierenden DNA-Moleküle abtasten und diese jedesmal spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Das Aufbrechen, welches stattfindet, macht viele der infizierenden Gene unbrauchbar und macht die DNA empfänglich für einen weiteren Abbau durch unspezifische Endonukleasen.
Ein zweiter Bestandteil der bakteriellen Schutzsysteme sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind zu den Restriktionsendonukleasen komplementär und sie stellen das Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien befähigt werden, ihre eigene DNA zu identifizieren und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, jedoch anstatt die DNA zu zertrennen, modifizieren sie chemisch das eine oder andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Addition einer Methylgruppe. Nach dieser Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist aufgrund ihrer Modifikations-Methylase immer vollständig modifiziert, und sie ist daher völlig unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist lediglich nicht modifizierte und daher identifizierbar fremde DNA, welche empfindlich für eine Erkennung und einen Angriff der Restriktionsendonuklease ist.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich waren. Der Schlüssel zur Isolierung von Restriktionsendonukleaseklonen ist es, ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zu entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer "Bibliothe ken", d.h. Klonpopulationen, die durch "Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, zu identifizieren, wenn sie mit so niedrigen Häufigkeiten wie 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;³ auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die seltenen erwünschten Klone überleben.
Restriktions-Modifikationssysteme vom Typ II werden mit wachsender Geschwindigkeit kloniert. Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als ein Mittel zum selektiven Isolieren von Restriktionsendonukleaseklonen (PstI Walder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 1503-1507 (1981), HhaII Mann et al. Gene 3: 97-112 (1981)). Da das Vorliegen von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diesen ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche klonierte Restriktions-Modifikationsgene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, welche einem Phagen ausgesetzt waren. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses Verfahren nur einen begrenzten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer hinreichende Phagenresistenz zeigen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen. Ein anderer Klonierungsansatz umfaßt ein Übertragen von Systemen, welche anfänglich als plasmid-getragen charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (EcoRV, Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 129: 3659-3676, 1984; PaeR7, Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406, 1983, Theriault und Roy, 1982; Pvu II, Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509, 1985). Schließlich wird eine wachsende Anzahl an Systemen nun durch Selektion auf ein aktives Methylasegen kloniert (BsuRI, Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421, 1986; TaqI); da die zwei Gene häufig eng verbunden sind, werden beide Gene gleichzeitig kloniert. Die Methylaseselektion ergibt jedoch nicht immer ein vollständiges Restriktionssystem (BspRI, Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225, 1980; MspI, Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241, 1983). Sogar Versuche, größere Bereiche, welche zu dem Methylasegen benachbart sind, zu klonieren, können dabei fehlschlagen, ein aktives Endonukleasegen zu produzieren.
In manchen Systemen kann das Klonierungsproblem in dem Versuch liegen, das Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen, welcher nicht angemessen durch Methylierung geschützt ist. Wenn das Methylasegen und Endonukleasegen auf einem gemeinsamen DNA-Fragment eingeführt werden, muß das erstere Genprodukt den Wirt modifizieren, bevor das letztere Genprodukt das Wirtsgenom spaltet.
Ein anderes Hindernis beim Klonieren dieser Systeme in E. coli wurde im Verlauf des Klonierens unterschiedlicher Methylasen entdeckt. Viele E. coli-Stämme (einschließlich jener, welche normalerweise beim Klonieren verwendet werden), haben Systeme, welche das Einführen von DNA, die eine heterologe Cytosinmethylierung enthält, in die Zellen blokkieren (Raleigh und Wilson, zur Veröffentlichung eingereicht). Daher ist es ebenfalls erforderlich, sorgfältig abzuwägen, welchen E. coli-Stamm (welche E. coli-Stämme) man für das Klonieren verwendet.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen, nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Verfahren zu entwickeln, um Bakterienstämme zu erhalten, welche diese Enzyme im Überschuß synthetisieren. Derartige Stämme würden nützlich sein, weil sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden, wie auch das Mittel zur Herstellung in kommerziell nützlichen Mengen zur verfügung stellen würden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Ansatz zur Herstellung von Restriktionsenzymen, die nicht von Plasmidgenen codiert werden, und/oder ihren entsprechenden Modifikationsenzymen zur Verfügung gestellt, indem Gene, welche diese codieren, kloniert werden und dafür gesorgt wird, daß die Gene mit erhöhten Niveaus exprimiert werden. Insbesondere werden ein neues Verfahren zum Klonieren dieser Enzyme, die so hergestellten Klone, sowie Verfahren zum Herstellen der Enzyme selbst zur Verfügung gestellt, was umfaßt: Klonieren und Exprimieren des Methylasegens in einem geeigneten Wirt, um den Wirt angemessen durch Methylierung zu schützen, und in einem zweiten Schritt Lokalisieren, Klonieren und Einführen des Endonukleasegens aus der chromosomalen DNA auf einem Vektor, welcher die Endonuklease bezogen auf das Methylasegen auf einem niedrigeren Niveau exprimiert, in den Wirt, der den Methylaseklon enthält.
Die Anwendung dieses Verfahrens auf die DdeI- und BamHI- Restriktions- und Modifikationsgene von Desulfovibrio desulfuricans bzw. Bacillus amyloliquefaciens ist im Detail beschrieben, zusammen mit den resultierenden Klonen, welche die Basis für ein neues und nützliches Verfahren zum Reinigen der DdeI- und BamHI-Restriktions- und Modifikationsenzymen bilden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 stellt die Tn5-Kartierung des methylasetragenden Plasmids pDde3.0a und die Konstruktion von pDdeM1.6, des Klons, welcher hohe Niveaus an DdeI-Methylase exprimiert, dar.
Figur 2 stellt die Ergebnisse eines in vivo-Schutzassays für M.DdeI-Klone dar.
Figur 3 zeigt, daß M.DdeI eine Methylase vom Cytosintyp ist.
Figur 4 stellt eine Southern Blot-Analyse und Restriktionskarte von DdeI-Klonen dar. Fig. 4A stellt einen Southern Blot unter Verwendung eines 3,0 kb HindIII-Inserts aus pDdeM3.0a, um genomische DNA-Verdaus zu sondieren, dar. Fig. 4B stellt die Restriktionskarte des D. desulfuricans- Genoms in dem Bereich, welcher das DdeI-Systemn und Plasmidderivate enthält, dar.
Figur 5 stellt eine Kartierung des methylasetragenden Plasmids für BamHI dar.
Figur 6 stellt eine Kartierung des endonukleasetragenden Klons pDH2 für BamHI dar.
Figur 7 stellt das Bam-Chromosom von Bacillus amyloliquefaciens dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Ansatz zum Klonieren von Restriktions-Modifikationssystemen unter Verwendung eines Zweischrittverfahrens und Ernten der dadurch produzierten Restriktionsenzyme zur Verfügung. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache aus, daß Klone und Wirte, die Klone enthalten, welche Modifikationsgene enthalten, ihre eigene DNA innerhalb der Erkennungssequenz des entsprechenden Restriktionsgens methylieren, wenn solche Sequenzen in dem Klon oder Wirt vorliegen. Solche Klone werden daher resistent gegenüber einem in vitro-Verdau durch die entsprechende Restriktionsendonuklease sein. Daraus folgt, daß die Einführung des Restriktionsendonukleasegens in Wirte, welche diese Klone enthalten, zu dem selektiven Überleben der methylasegeschützten Wirte führen wird.
In dem ersten Schritt wird das Methylasegen, welches dem gewünschten Restriktionsgen entspricht, kloniert und vorzugsweise ein Derivat konstruiert, welches hohe Methylaseniveaus exprimiert. In dem zweiten Schritt wird das Restriktionsgen dann in einen Wirt kloniert, welcher das Methylasegen enthält, und auf Endonukleaseaktivität hin gescreent. Die Expression des Endonukleasegens tritt in Wirten auf, welche durch das entsprechende Methylasegen hinreichend geschützt wurden.
Während man nicht durch eine Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, daß frühere Klonierungssysteme, welche das Einführen des Methylasegens und Endonukleasegens auf einem gemeinsamen DNA-Fragment in einen Wirt mit sich bringen, aufgrund von ungenügender Methylierung des Klons und seines Wirtes, was dann erlaubt, daß die entsprechende Endonukle ase das Wirtsgenom spaltet, häufig darin fehlgehen, ein aktives Endonukleasegen zu erzeugen. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden derartige Probleme überwunden indem das Methylasegen zuerst eingeführt und exprimiert oder verstärkt exprimiert wird und dann das Endonukleasegen auf einem Vektor kloniert wird, welcher die Endonuklease bezüglich der Methylase bei niedrigeren Niveaus exprimiert.
Die Verfahren&sub1; welche hierin beschrieben werden, durch welche Restriktionsgene vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, schließen die folgenden Schritte ein:

A. Klonieren des Methylasegens

1. Die DNA der Bakterienspezies, welche kloniert werden soll, wird gereinigt. Es wurde kürzlich herausgefunden, daß Viren ebenfalls Restriktions-Modifikationssysteme enthalten und demzufolge ebenfalls als ein Ausgangsmaterial verwendet werden können.
2. Die DNA wird teilweise oder vollständig mit einer passenden Restriktionsendonuklease verdaut.
3. Die sich ergebenden Fragmente werden in einem Klonierungsvektor, wie beispielsweise pBR322, pUC 8, 9, 18 oder 19 oder pBR328 oder ein Derivat davon, welches z.B. Linker enthält, ligiert und die Mischung wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise E. coli-Zellen zu transformieren.
4. Die DNA/Zell-Mischung wird auf antibiotischen Medien, welche für transformierte Zellen selektiv sind, plat tiert. Nach einer Inkubation werden die transformierten Zellkolonien vereinigt, suspendiert und bis zur Sättigung kultiviert, um eine primäre Zellbibliothek zu bilden.
5. Die rekombinanten Plasmide werden toto aus der primären Zellbibliothek gereinigt, um eine primäre Plasmidbibliothek herzustellen.
6. Die Plasmidbibliothek wird dann vollständig in vitro mit dem Restriktionsenzym verdaut, dessen entsprechendes Methylasegen gesucht wird. Exonuklease und/oder Phosphatase können ebenfalls zu dem Verdau zugegeben werden, um die Zerstörung von Nicht-Methylaseklonen zu verstärken.
7. Die verdaute DNA wird in E. coli transformiert und transformierte Kolonien werden wiederum erhalten, indem auf antibiotischen Platten plattiert wird. Einige dieser Kolonien - sekundäre Zell-Individuen - können ausgewählt werden und ihre DNA kann auf das Vorliegen des Methylasegens hin analysiert werden. Die verbleibenden Kolonien können zusammengeschabt werden, um eine sekundäre Zellbibliothek zu bilden, aus welcher anschließend eine sekundäre Plasmidbibliothek hergestellt werden kann.
8. Die sekundäre Plasmidbibliothek kann erneut mit Restriktionsendonuklease verdaut werden (mit oder ohne Exonuklease oder Phosphatase), um die Selektion zu wiederholen, was zu der Gewinnung von tertiären Zellindividuen, tertiären Zellbibliotheken und tertiären Plasmidbibliotheken führt.
9. Jede Runde eines Restriktionsendonukleaseverdaus bewirkt die selektive Zerstörung von Nicht-Methylaseklonen und führt zu einer Erhöhung der relativen Häufigkeit der erwünschten methylasetragenden Klone.
10. Überlebende Kolonien aus der sekundären und tertiären Population werden ausgewählt und auf das Vorliegen des Methylasegens hin analysiert.
11. Ein Methylase-Screenen kann durch vier einfache Tests durchgeführt werden:
(a) Das rekombinante Plasmid-DNA-Molekül des Klons kann gereinigt werden und in vitro der ausgewählten Restriktionsendonuklease ausgesetzt werden, um zu bestätigen, daß es gegenüber einem Verdau resistent ist. Vorausgesetzt, daß der Plasmidvektor mehrere Stellen für jene Endonuklease trägt, zeigt eine Resistenz eher eine Modifikation als einen mutationsbedingten Verlust der Stelle an.
(b) Das rekombinante Plasmid kann mit dem Enzym verdaut werden, welches anfänglich benutzt wurde, um die bakterielle Donor-DNA zu fragmentieren. Die Fragmente, die in dem Klon vorliegen, sollten faßbar sein, hinreichend groß sein, um ein Methylasegen zu codieren (d.h. über 500 Basenpaare), und, was am wichtigsten ist, einer Reihe von unabhängig gebildeten Klonen gemeinsam sein: dasselbe Fragment oder dieselben Fragmente sollten bei sämtlichen Klonen vorliegen.
(c) Die gesamte chromosomale DNA des Klons oder eine zweite Plasmid-DNA, welche in die Zelle eingeführt wurde, oder DNA aus Phagen, welche auf der Zelle gewachsen sind, kann gereinigt werden und der selektiven Restriktionsendonuklease ausgesetzt werden. Wenn der Klon das Methylasegen trägt, sollte das bakterielle Chromosom, die Plasmid- oder Phagen-DNA teilweise oder vollständig methyliert sein und es sollte gefunden werden, daß sie resistent gegenüber dem Verdau ist.
(d) Der Zellextrakt aus dem Klon kann hergestellt werden und in vitro auf Methylaseaktivität hin getestet werden. (Methylase-Schutz und radioaktive Markierung.) Eine spezifische Methylaseaktivität wird oft gefunden.
12. Das Methylasegen wird als entweder eine Cytosin- oder Adeninmethylase charakterisiert, um den geeigneten Wirt zum Klonieren des entsprechenden Endonukleasegens zu bestimmen. Alternativ kann eine Reihe von Wirten verwendet werden, um das Methylasegen zu klonieren und dann seine Methylierungsspezifität zu bestimmen.

B. Klonieren des Endonukleasegens

1. Da die Endonuklease- und Methylasegene häufig eng verknüpft sind, wird der Bereich, welcher das Methylasegen auf dem Genom umgibt, kartiert, d.h. durch Southern Blots unter Verwendung des Klons, der das Methylasegen enthält, als einer Sonde und einer Sonde für das Endonukleasegen, welche aus homogenem Protein konstruiert wurde. Jegliche Inkonsistenz in der Karte zwischen dem Methylaseklon und dem bakteriellen Chromosom kann signalisieren, wo eine DNA-Neuanordnung aufgetreten ist und kann in der Tat den Ort des Endonukleasegens anzeigen.
2. Unter Verwendung der Restriktionskarte wird die DNA der bakteriellen Spezies wiederum mit einem passenden Restriktionsenzym verdaut. Fragmente eines geeigneten Größenbereiches, welche mit den Sonden hybridisieren, werden gereinigt un& in einen Klonierungsvektor ligiert, welcher die Endonuklease bezüglich der Methylase bei niedrigeren Niveaus exprimiert. Geeignete Vektoren sind vorzugsweise jene, welche mit dem Klonierungsvektor, der das Methylasegen enthält, kompatibel sind. Diese Mischung wird dann verwendet, um die Wirtszelle zu transformieren, welche das Methylaseplasmid trägt. Obwohl dies nicht bevorzugt ist, kann das Endonukleasegen in den Klonierungsvektor, welcher das Methylasegen enthält, eingeführt werden, vorausgesetzt, daß die Expression des Endonukleasegens niedrig ist oder stark durch einen Promotor kontrolliert wird. Die Mischung wird verwendet, um die Wirtszelle mit oder ohne Methylaseplasmid zu transformieren. In jedem Fall wird die DNA/Zellmischung auf antibiotischen Medien plattiert, welche selektiv für transformierte Zellen sind.
3. Ein Restriktionsendonuklease-Screenen kann auf drei Wegen durchgeführt werden:
(a) Der Zellextrakt aus dem Klon kann hergestellt werden und in vitro auf seine Fähigkeit hin getestet werden, empfindliche DNA zu verdauen. Es sollte Restriktionsendonukleaseaktivität gefunden werden.
(b) Die Zellen selbst können in vivo auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, einer Phageninfektion zu widerstehen. Resistenz gegenüber einer Phageninfektion zeigt das Vorliegen eines Restriktions-Modifikationssystems an.
(c) Transformantenkolonien können durch Hybridisierung auf das Vorliegen von Sequenzen getestet werden, welche komplementär zu jener der Oligonukleotidsonde sind, welche zu dem Endonukleasegen und/oder Bereichen, die zu der Sonde des Methylasegens benachbart aber nicht darin eingeschlossen sind, hergestellt wurde.
Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte Weise zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß im Stand der Technik bekannten Techniken variieren kann.
Klone, welche die Restriktions- und Modifikationsgene von DdeI und BamHI enthalten, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt. Die Quelle für die DNA, welche die obigen Gene enthielt, war Desulfovibrio desulfuricans (DdeI) (NCIB 83120) und Bacillus amyloliquefaciens BamHI. (Eine Probe wurde bei der American Type Culture Collection hinterlegt - ATCC 53495.)
Ein wichtiger Faktor, welcher das erfolgreiche Klonieren von Restriktions- und Modifikationsgenen beeinflußt, ist der E. coli-Stamm, welcher als der Wirt verwendet wird. Viele Bakterien, einschließlich E. coli, haben Restriktions-Modifikationssysteme. Das häufigste System in E. coli ist das wirtsspezifische Determinanten- oder "Hsd"-System, aber andere Systeme, insbeson dere Pl und die EcoR-Reihen kommen ebenfalls vor (Roberts, R.J., Nucl. Acids Res. 12S: R167-204 (1984)). Diese Systeme stören eine Klonierung, weil sie die Zerstörung der eintretenden DNA während der Transformation bewirken, was zu niedrigen Zahlen an Transformanten und nicht-repräsentativen Bibliotheken führt. Im allgemeinen ist daher beim Durchführen der vorliegenden Erfindung die bevorzugte E. coli eine, in welcher die Restriktionssysteme durch Mutation oder Verlust inaktiviert wurden. Bevorzugte Stämme, in welchen diese Systeme inaktiviert wurden oder abwesend sind und welche für allgemeine Klonierungszwecke verwendet werden können, schließen ein: HB101 (hsdR&supmin;M&supmin;) ATCC 33694, RRl (hsdR&supmin;M&supmin;) ATCC 31343, K802 (hsdR&supmin;M&spplus;) ATCC 33526, K803 (hsdR&supmin;M&supmin;) ATCC 27065 und MM294 (hsdR&supmin;M&spplus;) ATCC 33625 und ER1467 (hsdR&supmin;M&supmin;), wovon eine Probe bei der American Type Culture Collection ATCC 53496 hinterlegt wurde.
Unter besonderer Berücksichtigung des Klonierens fremder Restriktions- und/oder Modifikationsgene in E. coli gibt es ein weiteres System, welches ein erfolgreiches Klonieren stört. Das System ist unklar und wird als das "Rgl"-System bezeichnet (Revel, H.R., Bacteriodhaae T4, S. 156-165 American Society of Microbiology (1983) und Revel et al., Annual Review of Genetics 4: 177-192 (1970)). Insbesondere spaltet das E. coli-Rgl-System DNA-Moleküle, welche methylierte Cytosinreste tragen, und zerstört demzufolge gerade die selbst-methylierten Plasmidklone, welche isoliert werden sollen. Es wurde kürzlich gezeigt, daß das Rgl-System durch einen Locus kontrolliert wird, welcher mit "mcrB" (modifizierte Cytosin-Restriktion, Raleigh und Wilson, supra) bezeichnet wurde. Um derartige Methylasegene zu klonieren ist es daher bevorzugt, E. coli-Wirte zu verwenden, welche sowohl im Hinblick auf das Hsd(allgemeine)- System als auch das Rgl(spezifische)-System defekt sind. Eine neue Serie von Klonierungsstämmen wurde durch Inaktivieren des "mcrB"-Locus mit Tn10-Insertionen konstruiert. Ein solcher Stamm, der vorzugsweise verwendet wird, wenn das Methylasegen ein Klon des Cytosintyps ist, ist ER1467, welcher ein Derivatstamm von JC1552 ist (Bachman, Bacteriol. Rev. 36: 525, 1972), der eine Tn10-Insertion in mcrB enthält. Jedoch sind nicht alle klonierten Methylasegene empfindlich. Insbesondere jene, welche Adeninreste methylieren, erscheinen gänzlich unbeeinflußt durch das Rgl-System zu sein, im Gegensatz zu solchen, welche Cytosinreste methylieren.
Während man nicht an eine Theorie gebunden sein möchte, wird angenommen, daß das Rgl-System aus zwei Bestandteilen aufgebaut ist, welche mit "Rgl A" und "Rgl B" bezeichnet werden. Es scheint, daß Rgl B viele Cytosinmethylase enthaltende DNAS spaltet, wogegen von Rgl A gegenwärtig bekannt ist, daß es nur einen spezifischen Klon (Hpa II) spaltet.
Beim Auswählen eines Wirtes zum Klonieren der Restriktions- und/oder Modifikationsgene aus einem nicht charakterisierten Restriktions-Modifikationssystem oder einem, von dem bekannt ist, daß es an Cytosinen methyliert, ist ein bevorzugter Wirt ein E. coli-Stamm, welcher eine Dreifachmutante ist, d.h. einer, dem die Hsd-, Rgl A- und Rgl B-Systeme fehlen. Solche Stämme schließen K802 ein. Ein bevorzugter Wirt für DdeI ist ER1467, welcher hstR&supmin;M&supmin; und rglA&spplus;B ist. Wenn andererseits bekannt ist, daß das Modifikationssystem ein System vom Adeninmethylase-Typ ist, kann die Rgl-Aktivität des Wirts ignoriert werden. Obwohl Rgl Adeninmethylasen nicht stört, scheint es, daß andere noch schwach charakterisierte Systeme in E. coli mit Adenin-Methylierung arbeiten können. Die Wahl des Wirtes hängt demzufolge von dem Charakter des Modifikationsgens ab, welches kloniert werden soll. Tabelle I faßt die Eignung unterschiedlicher E. coli-Stämme zum Klonieren von unterschiedlichen Modif ikationsgenen zusammen. TABELLE I
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um zusätzlich Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit bevorzugt praktiziert wird. Man wird verstehen, daß diese Beispiele zur Veranschaulichung dienen und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als darauf beschränkt betrachtet werden soll.

BEISPIEL I

Klonieren der DdeI-Restriktions-Modifikationsgene

A. Klonieren des Methylasepens und Charakterisierung seiner Aktivität

1. DNA-Reinigung:

D. desulfuricans-DNA wurde durch das folgende Verfahren gereinigt: 5 Gramm an gefrorenen Zellen wurden in 20 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, plus 6,0 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0 wurden zugegeben. Die Suspension wurde zwei Stunden lang auf Eis gelassen. Anschließend wurden 24 ml Lysepuffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) plus 5 ml 10% SDS zugegeben und gemischt, und man ließ die Zellen lysieren. Ein gleiches Volumen an Phenol (äquilibriert mit 100 mM Tris, pH 8,0) wurde hinzugegeben und die Lösung durch Schütteln emulgiert. Dann wurden 70 ml an Chloroform zugegeben und für 10 Minuten geschüttelt. Die Mischung wurde dann bei 10K für 30 Minuten in einer Beckman-Zentrifuge zentrifugiert; die obere wäßrige Schicht, welche die DNA enthielt, wurde in eine frische Flasche überführt und zwei weitere Male mit Phenol/Chloroform reextrahiert.
Die wäßrige Schicht wurde dann über 24 Stunden gegen vier Wechsel 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 dialysiert. Die dialysierte DNA-Lösung wurde mit 0,1 Volumen RNAse (10 mg/ml) 1 Stunde lang bei 37ºC behandelt. 5 M NaCl-Lösung wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M NaCl zugegeben, und die Lösung wurde mit zwei Volumina an Ethanol überschichtet. Die DNA wurde mit einem Glasstab aufgewickelt, einmal mit 70% Ethanol gewaschen und dann in 15 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 aufgelöst. Die DNA wurde gefroren bei -20ºC gelagert. Aus 5 Gramm Zellen wurden 1,5 mg gereinigte DNA erhalten.

2. Vollständiger Verdau:

Die D. desulfuricans-Bibliothek wurde hergestellt, indem 10 µg gereinigter D. desulfuricans-DNA mit 15 Einheiten HindIII in HindIII-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;; 50 mM NaCl; 10 mM β-Mercaptoethanol) in einer 100 µl-Reaktion 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert wurden.

3. Ligation

4 µg der verdauten DNA wurden mit 2 µg mit HindIII gespaltenem und dephosphoryliertem pBR322 (New England Biolabs) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl, welches 50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 MM ATP enthielt, mit 1000 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligation setzte sich bei 16ºC über 4 Stunden fort. Die Probe wurde dann mit Chloroform behandelt und verwendet, um 200 µl eisgekühlte kompetente RRl-Zellen (in 50 mM CaCl&sub2;) zu transformieren. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 42 ºC einem "Hitzeschock" unterworfen; in 5 ml Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und bei 37ºC bis zur Sättigung kultiviert.
4. Die transformierten Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (4K, 10 Minuten, Beckman-Zentrifuge), in 250 µl L- Nährlösung resuspendiert und auf L-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin plattiert, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Eine gemischte Population von ungefähr 10&sup5; Transformanten wurde mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;- Puffer von den Platten gewaschen.
5. Diese Mischung wurde verwendet, um 500 ml LB, welches 100 µg/ml Ampicillin enthielt, zu inokulieren und wurde über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt und die Zellen dann wieder geerntet (4K, 5 Minuten). Die Zellen wurden in 10 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 4ºC gehalten; dann wurden 12 ml Lysepuffer zugegeben und die Zellsuspension wurde sanft gemischt. Nach der Lyse wurde das Lysat bei 15K für eine Stunde zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Mull dekantiert. Festes Cäsiumchlorid (0,93 g/ml) und Ethidiumbromid bis zu einer Konzentration von 100 µg/ml wurden zugegeben. Die Röhrchen wurden gefüllt, ausgeglichen und in einem Becknian Ti7O- Rotor (head) in einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 44.000 UpM für 48 Stunden bei 17ºC zentrifugiert. Die Ethidium-gefärbten DNA-Banden wurden mittels einer Spritze extrahiert und die DNA wurde in Ethanol bei Tiefkühlung präzipitiert. Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren bei 12 K für 20 Minuten gesammelt. Nach dem Resuspendieren in 1 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurde die DNA einmal Phenol-extrahiert, einmal Chloroform-extrahiert und dann in 2 Volumina Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 100 µl 10 ITLM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA-Puffer resupendiert.

6. DdeI-Spaltung:

µg des primären Plasmidpools wurden mit 80 Einheiten an DdeI-Endonuklease für 1 Stunde in 10 mM Tris, pH 7,5, 10 ITTM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, 100 mM NaCl in einer 100 µl-Reaktion verdaut.

7. Transformation:

10 µl der Reaktionsmischung wurden verwendet, um 200 µl an RRl-Zellen wie oben beschrieben zu transformieren. Nach der 2-minütigen Wärmebehandlung wurde die Transformationsmischung sofort auf L-Agar plus 100 µg/ml Ampicillin plattiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert. Ein Vergleich von DdeI-behandelten und unbehandelten rekombinanten Plasmiden ergab eine 10³-Selektion. Die Kolonien wurden in 10 ml L-Nährlösung, welche Ampicillin enthielt, inokuliert, um eine Minikultur herzustellen, und wurden auf LB und Ampicillinplatten ausgestrichen.

8. Miniprep-Verfahren:

Jede Kultur wurde wie folgt verarbeitet: die 10 ml-Übernachtkultur wurde bei 6K UpM 5 Minuten lang pelletiert und in 1 ml 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtempe ratur wurden 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS-Lösung zugegeben; die Röhrchen wurden gemischt und 5 Minuten lang bei 4ºC abgestellt. 1,5 ml an 3 M Natriumacetat, pH 4,8, wurden hinzugegeben, gemischt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Mischung wurde bei 15K UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3,0 ml Isopronanol enthielt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen für 10 Minuten bei 15K UpM zentrifugiert. Das Pellet wurde bei Raumtemperatur luftgetrocknet und in 0,85 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8, resuspendiert. 75 µl 5 M NaCl wurden hinzugegeben und die DNA wurde wieder bei Raumtemperatur mit Isopropanol gefällt. Nach dem Zentrifugieren für 1 Minute in einer Eppendorfzentrifuge wurde das Pellet luftgetrocknet und in 50 µl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, welche 20 µg/ml RNase enthielten, resuspendiert.

9. Methylasegen-Klone:

Die Plasmid-Minipreps wurden nachfolgend analysiert, indem sie zunächst mit DdeI herausgefordert und dann durch HindIII-Verdau analysiert wurden. Unter den Überlebenden waren zwei Typen resistent gegen eine Spaltung durch DdeI- Endonuklease. Diese trugen ein 3,0 kb-HindIII-Fragment in entgegengesetzten Orientierungen, relativ zu pBR322. Es wurde anschließend gezeigt, daß diese Plasmide das DdeI- Modifikationsmethylasegen trugen. Die beiden Plasmide wurden mit pDdeM3.0a und pDdeM3.0b bezeichnet, indem das Standardverfahren der Nomenklatur verwendet wurde, welches in Gingeras und Brooks, PNAS (USA) 80: 402 (1985) beschrieben ist. Rohextrakte dieser Klone (siehe Abschnitt B-5, infra) zeigten keinerlei DdeI-Endonukleaseaktivität.
Die Position des Methylasegens innerhalb des 3,0 kb- HindIII-Fragmentes wurde durch eine Reihe von Tn5-Mutageneseexperimenten bestimmt (Fig. 1A) (Berg, D.E. (1977) in DNA Insertions Elements, Plasmids. and Episomes, Bukhari, A.I., Shapiro, J.A. und Adhya, S.L. Herausg., Seiten 205-212, Cold Spring Harbor Laboratories, New York). HB101 (reca)-Zellen, welche das Methylaseplasmid pDdeM3.0a oder pDdeM3.0b trugen, wurden über Nacht bei 30ºC in L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin plus 0,2% Maltose kultiviert. Die gesättigten Kulturen wurden in 5 ml LB plus Ampicillin plus Maltose 1:100 verdünnt und zu einer Zelldichte von etwa 10&sup9; Zellen/ml kultiviert. 1 ml dieser Zellen wurde mit dem Tn5-tragenden Bakteriophagen (lambda 467::Tn5 von N. Kleckner via E. Raleigh) bei einer m.o.i.=0,1 gemischt. Die Mischung wurde bei 30ºC für 2 Stunden inkubiert. 0,2 ml-Aliquots wurden auf LB-Platten, welche 50 µg/ml Kanamycin, 100 µg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Die Platten wurden bei 30ºC 48 Stunden lang inkubiert.
Die Kolonien wurden mit 5 ml 25 mM Tris, pH 6,0, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose von den Platten gewaschen und Minipreps wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (siehe Abschnitt 8, Miniprep-Verfahren).
Die Minipreps wurden verwendet, um 200 µl eisgekühlte kompetente HB101-Zellen (in 50 mM CaCl&sub2;) zu transformieren. Die Zellen wurden für 2 Minuten bei 42ºC einem "Hitzeschock" unterworfen, dann in 1 ml L-Nährlösung verdünnt und für 1 Stunde inkubiert. Die Zellen wurden auf L-Nährlösung plus 50 µg/ml Kanamycin, 100 µg/ml Ampicillin plattiert.
Die Transformanten wurden auf das Vorliegen von Tn5-enthaltenden Plasmiden hin gescreent, indem Minipreps der Plasmid-DNA mit HindIII verdaut wurden. Plasmide mit Tn5 wurden auf DdeI-Methylaseaktivität hin getestet, indem die Minipreps mit DdeI-Endonuklease herausgefordert wurden.
Wie in Fig. 1A gezeigt, führten lediglich Tn5-Insertionen zwischen ClaI- und HindIII-Stellen zu dem Verlust der DdeI- Methylaseaktivität, was nahelegte, daß das Gen in dem Bereich zwischen diesen Stellen enthalten war. Indem eine Cla I-Deletion von pDdeM3.0a hergestellt wurde, wurde ein Subklon, welcher mit pDdeM1.6 bezeichnet wurde, erzeugt, der Methylaseaktivität beibehält, was bestätigt, daß das Methylasegen vollständig innerhalb dieses 1,6 kb-Bereiches liegt (Fig. 1B).
Die Methylaseaktivität der drei M.DdeI-Klone wurde verglichen, indem ein in vivo-Schutzassay und ein in vitro ³H- Methyleinbautest wie folgt verwendet wurden:

a. In vitro ³H-Methyleinbautest (Gingeras und Brooks, supra):

Um auf Methylierung zu testen, wurden drei Mischungen hergestellt:
1. 10x Methylierungspuffer: 1 M NaCl, 0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1 M EDTA und 50 mm β-Mercaptoethanol.
2. Methylierungsreaktionsmischung: Das Substrat pBR322, linearisiert mit EcoRI, wurde wie folgt hergestellt: pBR322 wurde mit 20-fachem Überschuß an EcoRI in 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; bei einer Konzentration von 20 µg/ml inkubiert. Nach dem Inkubieren für 1 Stunde bei 37ºC wurde das linearisierte Plasmid phenolextrahiert, ethanolpräzipitiert und das Pellet luftgetrocknet. Die DNA wurde in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml linearisiertem Plasmid resuspendiert. Die Methylierungsreaktionsmischung enthielt 1 µg (= 1 µl) an linearisiertem pBR322 plus 2,5 µl lox Methylierungspuffer, 0,5 µl ³H-S-Adenosylmethionin und H&sub2;O auf 20 µl.
3. Zellextrakte wurden wie folgt hergestellt:
Eine 5 ml-Kultur des zu testenden Klons wurde über Nacht in L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin bei 37ºC kultiviert. Nach der Sättigung wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 5 K UpM für 10 Minuten pelletiert. Die Pellets wurden in 500 µl Beschallungspuffer (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM 13- Mercaptoethanol) resuspendiert. Zu dieser Mischung wurden 25 µl Lysozym (10 mg/ml) und 50 µl EDTA (100 mM) zugegeben. Die Proben wurden eingefroren und dann auf Eis aufgetaut. Diese wurden unter Verwendung eines einzelnen 10 Sekunden- Stoßes beschallt. Nach dem Zugeben von 5 µl 1 M MgCl&sub2; wurden die Proben in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten zentrifugiert.
Um die Zellextrakte zu testen, wurden 5 µl des Extraktes zu den 20 µl der Methylierungsreaktionsmischung zugegeben und für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die gesamte 25 µl-Reaktion wurde dann auf 3 mm-Papier, abgegrenzt in 2,54 cm (1 Inch)-Quadrate, pipettiert. Das Papier wurde luftgetrocknet, dann zweimal mit 10% T.C.A. (150 ml), dann zweimal mit 200 ml Isopropanol gewaschen. Das Papier wurde wiederum luftgetrocknet und dann in ein Röhrchen gegeben und mit Szintillationsflüssigkeit (Omniflour, NEN) bedeckt. Um den Methylierungsgrad zu bestimmen, wurden die Proben auf ³H- Methyleinbau hin gezählt.

b. In vivo-Lambda-Schutzassay

Die Methylase-enthaltenden Plasmide pDdeM3.0a, pDdeM3.0b und pDdeM1.6 wurden durch das zuvor beschriebene Transformationsverfahren in den Stamm ER1467 transformiert. Diese Klone wurden in L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin bis zur Sättigung kultiviert. Nach Inokulierung 1:100 in 10 ml L-Nährlösung plus Ampicillin wurden die Zellen zum mittleren logarithmischen Stadium kultiviert, dann durch Zentrifugation bei 5K UpM für 5 Minuten pelletiert. Die Zellpellets wurden in 1 ml des folgenden Phagenpuffers: 10 mM Tris, pH 7,4, 5 mM MgCl&sub2;, 0,2 M NaCl, 0,1% Gel resuspen diert. 100 µl Lambda-Phagen (1011 Phagen/ml) wurden dann hinzugefügt, gemischt und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde durch Zugeben von 9 ml Phagenpuffer verdünnt, dann wiederum bei 5 K UpM für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 ml L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin resuspendiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert.
Die Phagen-DNA wurde auf die folgende Weise hergestellt. Die lysierten Zellen wurden in ein Zentrifugenröhrchen überführt und 3 Tropfen Chloroform wurden hinzugegeben. Die Proben wurden verwirbelt und dann bei 10 K UpM 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der Überstand wurde phenolextrahiert, indem ein gleiches Volumen an Phenol zugegeben wurde, verwirbelt und bei 5 K UpM für 5 Minuten zentrifugiert wurde. Die wäßrige Schicht wurde dann chloroformextrahiert, verwirbelt und erneut zentrifugiert. Die oberste Schicht wurde in ein frisches Röhrchen überführt, zu welchem 2 Volumina Ethanol hinzugegeben wurden, um die DNA zu präzipitieren. Nach Zentrifugieren bei 10 K UpM für 20 Minuten wurde das Pellet luftgetrocknet und in 1 ml 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 20 µg/ml RNase resuspendiert.
Um die Phagen-DNA auf Modifikation zu testen, haben wir 20 bis 40 µl der Phagen-DNA mit dem folgenden gemischt: 5 µl 10 DdeI-Puffer (1 M NaCl, 100 mM Tris, pH 7,5 und 100 mM MgCl&sub2;) und 1,5 µl DdeI-Endonuklease (10.000 Einheiten/ml) in einem Reaktionsvolumen von 50 µl. Die gesamte Probe wurde durch Gelelektrophorese analysiert, wie in Fig. 2 gezeigt ist.
Sowohl in vitro- als auch in vivo-Tests ergaben eine Abstufung der Methylaseaktivität, wobei pDdeM3.0b die niedrigste Aktivität und pDdeMl.6 die höchste aufwies; lediglich pDdeM1.6 hat hinreichend Aktivität, um Lambda-Phagen in vivo vollständig zu schützen. Die in vitro-Teste stimmten mit diesen Ergebnissen überein. pDdeM1.6 wurde daher in späteren Versuchen verwendet, um das Endonukleasegen zu klonieren (siehe unten).
Es ist möglich, auf dem folgenden Weg zu zeigen, daß M.DdeI eher eine Cytosin- als eine Adeninmethylase ist: Lambda-DNA enthält überlappende Sau3a- (GATC) und Dde I- (CTNAG) Stellen bei Position 2532: 5'-GATCTCAG-3' Suggs, S.V., Wallace, R.B., Hirose, T., Kawashima, E.H. und Itakura, K. (1981) PNAS (USA) 78, 6613-6617, Sanger, F., Coulson, A.R., Hong GF., Hill, D.F. und Petersen, G.B. (1982) J. Moh Biol. 162, 729-773.
Die Spaltung von Lambda-DNA mit Sau3a führt zu 165 bp- und 487 bp-Fragmenten aus diesem Bereich. Ein 5,0 kb-MluI-Fragment enthält die überlappenden Sau3a- und DdeI-Stellen. Dieses Fragment wurde isoliert, so daß die relevanten Sau3a-Fragmente besser sichtbar gemacht werden konnten. Wir haben dieses Lambda-Fragment mit M.DdeI behandelt und dann mit Sau3a herausgefordert. Wenn M.DdeI eine Adeninmethylase wäre, würde die Modifikation an dem zweiten Adenin innerhalb dieser Sequenz auftreten, außerhalb der Sau3a-Erkennungsstelle. Die Sau3a-Spaltung würde daher zu den normalen 165 bp- und 487 bp-Fragmenten führen. Wenn jedoch M.DdeI eine Cytosinmethylase ist, würde eine Modifikation an dem Cytosin innerhalb der Sau3a-Erkennungssequenz auftreten. Eine Hemi-Methylierung innerhalb der Sau3a-Stelle blockiert die Sau3a-Spaltung; lediglich Einzelstrang-Nicking tritt auf (Streek, R.E. (1980) Gene 12, 267). Eine Sau3a-Behandlung würde dann zu dem Erscheinen eines neuen 652 bp-Fragmentes führen. Wie in Fig. 3 gezeigt, erscheint die neue Bande tatsächlich, ein Anzeichen, daß M.DdeI eine Cytosin-Methylase ist.
Die Erkenntnis, daß M.DdeI eine Cytosin-Methylase ist, half, das folgende Phänomen zu erklären. Der Klon, welcher die meiste Methylase produziert, der pDdeM1.6 trägt, war in unserem Klonierungsstamm RRl merklich weniger lebensfähig als pDdeM3.0b-Konstrukte. Wenn eine Kultur aus RRl, welche pDdeM1.6 trug, die stationäre Phase erreichte, hatte sie lediglich 6% der Anzahl an lebensfähigen Zellen, wie eine Parallelkultur aus RRl allein (Tabelle II). Es wurde kürzlich gezeigt, daß gewisse E. coli-Stämme Systeme haben, welche die Einführung von DNA, die eine Cytosin-Methylierung enthält, blockieren (Raleigh et al., im Druck); der Locus, welcher für diese Aktivität verantwortlich ist, wurde mit "mcrB" bezeichnet (modifizierte Cytosin-Restriktion). In RRl ist dieser Locus von E. coli B abgeleitet und ist von unterschiedlicher Spezifität und sichtlich schwächerer Aktivität (Raleigh et al., supra, Revel, H.R. (1967), Virology 31, 688-701). Eine neue Reihe von Klonierungsstämmen wurde durch Inaktivieren des mcrB-Locus mit Tn10-Insertionen konstruiert. Wir haben unsere Methylaseklone in einen dieser Stämme, ER1467, eingeführt: ein Vergleich von pDdeM3.0a, pDdeM3.0b, pDdeM1.6 und ER1467 allein zeigt eine vollständige Widerherstellung der Lebensfähigkeit; es gab einen vernachlässigbaren Unterschied in der Anzahl der koloniebildenden Einheiten (c.f.u.) bei Sättigung, Tabelle II. Daher wurde eine weitere Klonierung. und Charakterisierung des DdeI-Systems in ER1467 durchgeführt. TABELLE II: LEBENSFÄHIGKEIT VON METHYLASEKLONEN IN RRl GEGEN ER1467
¹ Lebensfähigkeit ist definiert als das Verhältnis von c.f.u./ml des Teststammes zu den c.f.u./ml des Wirts (RRl oder ER1467)allein bei Sättigung.

B. KLONIEREN DES ENDONUKLEASEGENS

Da Endonuklease- und Methylasegene häufig eng verknüpft sind, erschien es sinnvoll zu erwarten, daß das R.DdeI-Gen in einem Bereich angrenzend an das Methylasegen liegen würde. Der Bereich auf dem D. desulfuricans-Genom um das Methylasegen herum wurde durch Southernblot-Analyse kartiert, indem das 3,0 kb-HindIII-Fragment aus pDdeM3.0a als eine Sonde verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Fig. 4A gezeigt.
Eine Oligonukleotid-Sonde, die spezifisch für das 5'-Ende des Endonukleasegens war, wurde synthetisiert.

Schritt 1: Reinigen der DdeI-Endonuklease zur Homogenität: DdeI-Endonuklease-Reinigung

Die 23 Gramm gefrorenes Pellet aus D.desulfuricans wurden auf Eis aufgetaut und in 120 ml Beschallungspuffer (10 mM KPO&sub4;, pH 6,9, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA), 50 mM NaCl resuspendiert. Sämtliche Schritte, die unten beschrieben sind, wurden bei 4ºC durchgeführt. Lysozym wurde bis zu einer Endkonzentration von 300 µg/ml zugegeben und Zellen wurden durch Beschallung aufgebrochen. Das Zellysat wurde bei 10.000 x g für 45 Minuten zentrifugiert.
Die 120 ml Überstand wurden auf eine 2,5 x 15 cm Phosphocellulose P11-Säule (Whatman) gegeben, welche mit Beschallungspuffer, 150 mM NaCl äquilibriert war. Das Enzym wurde mit einem linearen 700 ml-Gradienten von 150 mM bis 1 M NaCl eluiert. Die Endonuklease eluiert ungefähr bei 0,5 M NaCl. Die Peakfraktionen wurden gesammelt und gegen Beschallungspuffer, 50 mM NaCl, dialysiert.
Der 170 ml-Enzympool von der Phosphocellulosesäule wurde auf eine 1,5 x 15 cm Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia) gegeben, welche mit Beschallungspuffer, 25 mM NaCl, äquilibriert war. Ein 340 ml-Gradient von 25 mM bis 1 M NaCl wurde verwendet, und das Enzym eluierte bei ungefähr 0,5 M NaCl. Fraktionen mit Endonukleaseaktivität wurden gepoolt und gegen HPLC-Puffer (20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM β- Mercaptoethanol), 50 mM KCl, dialysiert.
Der 10 ml-Enzym-Pool wurde durch eine Mono-Q-Säule (Pharmacia) und eine Polyanionen-SI-Säule (Pharmacia) geschickt und dann auf einer 1 x 8 cm Mono-S-Säule (Pharmacia) bei 50 mM KCl absorbiert. Ein linearer 53 ml- Gradient wurde von 50 mM bis 1 M KCl entwickelt. Die Endonuklease eluierte als ein einzelner Peak bei ungefähr 0,2 M KCl.
Es wurde ein Waters Associates Flüssig-Chromotograph verwendet, um die Probe zur Proteinsequenzierung auf die folgende Weise herzustellen. DdeI-Endonukleaseproben (15 µg) wurden einer Chromatographie auf einer Vyadac C4 214TP54 (5 µm, 4,6 x 300 mm) 300 Angström Poren-Umkehrphasensäule unterzogen und mit einem linearen Gradienten aus 5% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure über 25 Minuten bei einer Flußrate von 1 ml/min mit Messung bei 214 nm entwickelt. Einzelne Peaks wurden manuell gesammelt und lyophilisiert.

Schritt 2: Protein-Sequenzierung und Synthese der Endonuklease-Sonde

Der sequentielle Proteinabbau wurde mit einem Applied Biosystems Modell 470A Gasphasen-Sequenzierer, Strickler, J.E., Hunkapiller, MW. und Wilson, K.S. (1984) Analytical Biochemistry 140, 553-566, durchgeführt. Die ersten 19 Phenylthiohydantome wurden durch Hochleistungsflüssigchromatographie auf einer IBM Cyano (µm, 4,5 x 250 mm) Säule mit leichten Gradientmodifikationen zu jenen, welche zuvor beschrieben wurden, eindeutig identifiziert, Hunkapiller, M.W. und Hood, L.E. (1983) in Methods in Enzymology, Hirs, C.H.W. und Timasheff, S.N. Herausg., Bd 91, Seiten 486-493, Academic Press, New York.
Die Proteinsequenz wurde verwendet, um eine DNA-sequenz mit minimaler Degeneriertheit abzuleiten. Dieses Tetradecamer wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesekits (New England Biolabs) synthesisiert und durch Chromatographie auf einer Water Associates C8 (10 µm, 0,5 x 10 cm) Radial Pak-Säule gereinigt.
Die ersten 19 Aminosäuren der Endonuklease sind Met-Lys- Ala-Ala-Thr-Asp-Gln-Glu-Leu-Arg-Lys-Leu-Ile-Val-Leu-Tyr- Asn-Asn-Val. Unter Verwendung der fünf unterstrichenen Aminosäuren wurde eine gemischte Tetradekamersonde mit der Sequenz: 5'-ATG-AAR-GCN-GCN-AC-3' (R, Nukleotid A oder G; N, Nukleotid A,G,C oder T) hergestellt. Southern Blots der Genom-DNA-Verdaus wurden mit der Sonde hybridisiert. Die Endonukleasesonde hybridisiert nicht mit dem 3,0 kb- HindIII-Fragment, von welchem bekannt ist, daß es das Methylasegen enthält.

Southern-Hybridisierungen:

1. Verwendung des nicktranslatierten Fragmentes

1-2 µg der genomischen DNA wurden mit 20-fachem Überschuß der folgenden Endonukleasen: Pst I, Sal I, Bgl II, Bcl I, Hind III, EcoRI, BamHI unter den empfohlenen Bedingungen (New England Biolabs) verdaut. Die Verdaus wurden einer Agarosegelelektrophorese unterworfen und die verdaute DNA wurde nach dem Verfahren von Southern (Southern, E.M. (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517) auf Nitrocellulosepapier übertragen.
Diese Nitrocellulosefilter wurden mit dem 3,0 kb-HindIII- Fragment aus pDdeM3.0a hybridisiert. Dieses Fragment wurde durch das Verfahren der Gelreinigung wie folgt hergestellt:
pDdeM3.0a wurde mit 20-fachem Überschuß an Hind III verdaut und einer Elektrophorese auf einem Gel unterworfen, welches mit 1% Agarose, 0,5 µg/ml Ethidiumbromid hergestellt wurde. Das 3,0 kb-Fragment, welches das DdeI-Methylasegen enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und durch Auspressen durch eine Kanüle mit einem Durchmesser von 21,5 (21.5 gauge needle) zerkleinert, in Tris-Acetatpuffer suspendiert und einer Ultrazentrifugation bei 290.000 x g in einem Rotor vom Typ SW 50.1 (Beckman) für 35 Minuten bei 4ºC unterworfen. Der Überstand wurde auf 0,4 M NaCl gebracht und die DNA wurde mit Isopropanol präzipitiert. Die DNA wurde resuspendiert, zweimal phenolextrahiert, ethanolpräzipitiert und in 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. 1 µg dieses Fragmentes wurde durch Kombinieren von 100 pmol alpha³²P-dATP (New England Biolabs 800 Ci/mmol) mit 6 µl des Fragmentes (1 µg), 1 µl 10x Nick-Translationspuffer (0,5 M Tris, pH 7,2, 0,1 M MgSO&sub4;, 1 mM DTT, 500 µ g/ml BSA), 1 µl dGTP (1 mM), dTTP (1 mM), dCTP (1 mM) Mischung, 1 µl E. coli-DNA-Polymerase 1 (New England Biolabs) und 1 µl DNAse 1 (Sigma)-Verdünnung (3 µl einer 3 mg/ml-Stammlösung in 10 ml H&sub2;O verdünnt) nicktranslatiert. Nach Inkubation für 2 Stunden bei 15ºC wurden 50 µl 20 mM EDTA und 200 µl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA zugegeben. Dieses wurde einmal phenolextrahiert, einmal chloroformextrahiert und dann wurden 6 µg denaturierter Lachsspermien-DNA zugegeben. Das Volumen wurde mit 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA auf 1 ml erhöht. Nach 10-minütigem Kochen war das nicktranslatierte Fragment fertig, um auf das Nitrocellulosefilter gegeben zu werden.
Bevor man die nicktranslatierte Sonde hybridisierte wurde das Nitrocellulosefilter in Vorhybridisierungsmischung: 3 ml 50x Denhardt's stammlösung (5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g BSA, H&sub2;O auf 500 ml), 4,5 ml 20x SSPE- Stammlösung (174 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; H&sub2;O, 7,4 g EDTA; der pH wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt, H&sub2;O auf 1 Liter), 0,3 ml 10% SDS, 3 ml 50% Dextransulfat, 4,2 ml H&sub2;O, für vier Stunden bei Raumtemperatur vorhybridisiert.
Um zu hybridisieren, wurde die nicktranslatierte Sonde zu dem vorhybridisierten Filter zugegeben (einschließlich der Vorhybridisierungsmischung) und über Nacht bei 65ºC inkubiert. Das hybridisierte Filter wurde zweimal in 2x SSPE (100 ml) bei Raumtemperatur für 5 Minuten und zweimal in 2x SSPE plus 0,5% SDS bei 55ºC für 30 Minuten gewaschen. Das Filter wurde dann luftgetrocknet und einem Röntgenf ilm ausgesetzt.

2. Verwendung der Oligonukleotidsonde.

1-2 µg genomische DNA oder 0,5-1 µg Plasmid-DNA wurden verdaut, einer Gelelektrophorese unterworfen und wie zuvor beschrieben auf Nitrocellulose übertragen. Diese Filter wurden auf die folgende Weise mit der Oligonukleotidsonde hybridisiert. 2 µl der Sonde (25-50 µg/ml) plus 2,5 µl 10x Puffer (0,5 M Tris, pH 7,6, 0,1 M MgCl&sub2;&sub1; 50 mM DTT, 1 mM Spermidin, 1 mM EDTA) 15 µl H&sub2;O, 5 µl gamma-³²P-ATP (New England Nuclear, 3000 Ci/mmol) und 0,5 µl Polynukleotidkinase (New England Biolabs oder Boehringer Mannheim) wurden gemischt und bei 37ºC 30 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde dann für 10 Minuten auf 65ºC erwärmt. 1 ml mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA wurde zu der markierten Sonde hinzugefügt. Dieses wurde zu dem vorhybridisierten Nitrocellulosefilter (wie oben beschrieben) zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Das hybridisierte Filter wurde zweimal mit 2x SSPE (200 ml) bei Raumtemperatur für 5 Minuten und zweimal in 2x SSPE plus 0,5% SDS bei 30ºC für 30 Minuten gewaschen. Das Filter wurde dann luftgetrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Die Southern Blots wurden verwendet, um die Restriktionskarte zu erzeugen, welche in Fig. 4B dargestellt ist. Zwei Enzymverdaus ergaben Fragmente, welche mit beiden Sonden hybridisierten und welche groß genug waren, um für die Methylase und/oder die Endonuklease zu codieren. Beide Sonden hybridisieren mit einem einzelnen PstI-Fragment, wie in Bahn (a), Fig. 4A, gezeigt ist, woraus sich schließen läßt, daß sowohl das Endonuklease- als auch das Methylasegen auf diesem 4,8 kb-Stück der DNA lokalisiert sind. Zusätzlich hybridisieren beide Sonden mit einem 5,3 kb-BamHI-Fragment, wie in Bahn (g), Fig. 4A gezeigt ist. Dieses Fragment schließt einen Teil des Methylasegens ein und ist groß genug, um das gesamte Endonukleasegen zu codieren.
Die Endonuklease- und Methylasegene wurden getrennt auf kompatiblen Plasmiden eingeführt. 2,3 kb-BamHI-Fragmente der D. desulfuricans-DNA wurden in pACYC184 (Chang und Cohen, J. Bacteriol, 134: 1131 (1978)) wie folgt kloniert: 50 µg der D. desulfuricans-DNA wurden mit BamHI geschnitten und einer Elektrophorese unterworfen. Fragmente in dem geeigneten Größenbereich wurden wie zuvor beschrieben gel gereinigt; ungefähr 100 ng DNA wurden gewonnen und diese Menge wurde unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus Kalbsintestinum (Boehringer Man.) mit BamHI-geschnittenem und dephosphoryliertem pACYC 184 ligiert. Diese Ligationsmischung wurde verwendet, um ER1467-Zellen, welche den M.DdeI-Klon pDDEM1.6 trugen, zu transformieren. Die Transformanten wurden durch Plattieren auf L-Agar plus 100 µg/ml Ampicillin, 30 µg/ml Chloramphenicol selektiert. Die Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert.

5. Restriktionsendonuklease-Screenen:

Fünfzig Transformanten wurden zufällig mit sterilen Zahnstochern in Mikrotitervertiefungen (Nunc) übertragen, welche jeweils 100 µl L-Nährlösung plus 100 µg/ml Ampicillin, 30 µg/ml Chloramphenicol enthielten. Nach Inkubieren bei 37ºC für 6 Stunden, wurden die Transformanten auf sechs Platten replicaplattiert, welche L-Agar, Ampicillin, Chloramphenicol und Lambdavir.-Phagen-Verdünnungen von 10&sup4; bis 10&sup8; Phagen/Platte enthielten. Nach dem Inkubieren dieser Platten über Nacht bei 37ºC beschränkte eine einzelne Transformante die Phagen auf ein Niveau von ungefähr 10&supmin;¹. Um das Vorliegen von aktiver DdeI-Endonuklease zu bestätigen, wurde ein Rohextrakt (zuvor beschrieben) dieser Transformante hergestellt. Zu 1 µg pBR322 (= 1 µl) wurden 5 µl 10x DdeI-Puffer (100 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2; und 1 M NaCl), 43 µl H&sub2;O und 1 µl Rohextrakt zugegeben und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert und dann einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. DNA aus diesem Klon wurde hergestellt und die vorläufige Restriktionskartierung zeigte, daß dieses 2,3 kb-BamHI-Fragment mit dem BamHI- bis HindIII- Bereich von pDDEM1.6 wie in Fig. 6 gezeigt überlappte. Demzufolge ist das DdeI-System innerhalb von 2,9 kb der D. desulfuricans-DNA enthalten.

BEISPIEL II

Klonieren der BamHI-Restriktions-Modifikationsgene

A. Klonieren des BamHI-Methylasegens und Charakterisierung seiner Aktivität

1. Um die DNA aus Bacillus amyloliquefaciens H herzustellen, wurden 5 g an frisch gewachsener Zellpaste in etwas an 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, plus 6,0 ml 10 mg/ml Lysozym (in 0,25 M Tris, pH 8,0) wurden hinzugefügt. Die Suspension wurde 2 Stunden lang auf Eis belassen. Anschließend wurden 24 ml Lysepuffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 8,0, 67 mM EDTA) plus 5 ml 10% SDS hinzugefügt und gemischt und man ließ die Zellen lysieren. Ein gleiches Volumen Phenol (äquilibriert mit 100 mM Tris, pH 8) wurde hinzugefügt und die Lösung durch Schütteln emulgiert. 70 ml Chloroform wurden dann hinzugefügt und für 10 Minuten geschüttelt. Die Mischung wurde dann bei 10 K für 30 Minuten in einer Beckman-Zentrifuge zentrifugiert; die obere wäßrige Schicht, welche die DNA enthielt, wurde in eine frische Flasche überführt und mit Phenol-Chloroform zweimal mehr reextrahiert.
Die obere Schicht wurde dann gegen 4 x 1 Liter TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) für > 24 Stunden dialysiert. Nach der Dialyse wurde die DNA für 1 Stunde bei 37ºC mit 0,1 Volumen RNAse (10 µg/ml) behandelt. 5 M NaCl-Lösung wurde hinzugefügt zu einer Endkonzentration von 0,4 M NaCl, wobei zwei Volumina Ethanol darauf geschichtet wurden. Die DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt; 1x mit 70% EDTA gewaschen und wiederum in 15 ml TE aufgelöst und bei -20ºC zur Lagerung eingefroren. Endkonzentration an DNA = 100 µg/ml.
2. Teilweiser Verdau: 2 ml Bam-DNA (100 µg/ml) wurden zu Röhrchen hinzugefügt; [200 µg/Röhrchen] in HindIII-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol). Das HindIII-Enzym wurde in einer Reihe von 2x-Verdünnungen zu den Röhrchen hinzugefügt; d.h. 40 Einheiten in Röhrchen 1, 20 Einheiten in 2, usw. Verdaus wurden bei 37ºC für eine Stunde durchgeführt; das Enzym wurde durch Hitze abgetötet, indem die Reaktion für 15 Minuten bei 72ºC inkubiert wurde. 810 µg von jedem Verdau wurden entfernt und durch Gelelektrophorese analysiert. Die Proben, welche eine teilweise Spaltung zeigten, wurden gemischt und verwendet:
3. Ligation: 4 µg Bam-DNA, welche mit HindIII verdaut war, wurde mit 2 µg mit alkalischer Phospatase behandeltem pBR322 (New England Biolabs) in einem Reaktionsvolumen von 100 µl, welches 50 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP enthielt, mit 1000 Einheiten T4-DNA-Ligase (N.E. Biolabs) ligiert; die Ligation wurde für 4 Stunden bei 16ºC fortgesetzt. Die Probe wurde dann chloroformbehandelt und in 10 Aliquots aufgeteilt; jedes wurde verwendet, um 200 µl eisgekühlte kompetente RRl-Zellen (in 50 mM CaCl&sub2;) zu transformieren. Die Zellen wurden für zwei Minuten bei 42ºC einem "Hitzeschock" unterworfen, in 5 ml Luria-Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und bei 37ºC bis zur Sättigung kultiviert.
4. Die transformierten Zellen wurden durch Zentrifugation (4 K, 10 Minuten) geerntet, in 250 µl L-Nährlösung resuspendiert und auf L-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin plattiert, und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die Transformanten wurden mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgCl&sub2; von den Platten abgewaschen.
5. Diese Mischung wurde verwendet, um 500 ml L-Nährlösung, welche 100 µg/ml Ampicillin enthielt, zu inokulieren. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt und die Zellen wurden dann wieder geerntet (4 K, 5 Minuten). Die Zellen wurden in 10 ml 25% Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 bei Raumtemperatur, 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8 und 3 ml 10 mg/ml Lysozym in (H&sub2;O) resuspendiert. Die Lösung wurde für 1 Stunde bei 40ºC gehalten; dann wurden 12 ml Lysepuffer hinzugefügt und die Zellsuspension sanft gemischt. Nach der Lyse wurde das Lysat bei 15 K für 1 Stunde zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Mull dekantiert. Festes CsCl (0,93 g/ml) und Ethidiumbromid zu einer Konzentration von 100 µg/ml wurden hinzugefügt. Die Röhrchen wurden gefüllt, ausgeglichen und in einem Beckman Ti70-Rotor (head) in einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 44.000 UpM für 48 Stunden bei 17ºC zentrifugiert. Die ethidiumgefärbten DNA-Banden wurden mittels einer Spritze gesammelt. Das Plasmid wurde durch Hinzufügen von zwei Volumina Ethanol und Tiefkühlen präzipitiert; die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren bei 12.000 UpM für 20 Minuten gesammelt. Die DNA wurde nach Resuspension in 1 ml TE-Puffer lx phenolextrahiert; 1x chloroformextrahiert und dann in zwei Volumina Ethanol präzipitiert, getrocknet und in 100 µl TE-Puffer resuspendiert.
6. Bam-Herausforderung: Der primäre Plasmidpool (ungefähr 100 µg DNA in 100 µl) wurde in 5 x 100 µl-Aliquot-Reaktionen verdaut, welche 20 µg der Plasmid-DNA in 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl; 10 mM 13-Mercaptoethanol enthielten. 100 Einheiten an BamHI (N.E. Biolabs) wurden zu dem ersten Röhrchen hinzugefügt; 50 u zu dem zweiten, usw. und die Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert.
7. Transformation: 10 µl aus jeder Reaktion wurden verwendet, um 100 µl RRl-Zellen wie oben beschrieben zu transformieren. Die Transformationsmischung wurde sofort nach einer 2-minütigen Wärmebehandlung plattiert und auf L-Agar plus Ampicillin über Nacht bei 37ºC inkubiert.
In späteren Experimenten wurde herausgefunden, daß eine Behandlung der Restriktionsreaktionen mit der Zugabe von 2,5 Einheiten Exonuklease III (N.E. Biolabs) oder mit 10 Einheiten alkalischer Phosphatase (Boehringer) die Selektion um 10³ oder 10&sup4; erhöhte. Ungefähr 200 Kolonien wurden von den Platten mit der niedrigsten Anzahl an Überlebenden gesammelt.
8. Jede Kolonie wurde in 10 ml L-Nährlösung plus Ampicillin inokuliert und ebenfalls auf einer LB plus Ampicillin- Masterpiatte ausgestrichen.
Jede Kultur wurde verwendet, um wie folgt "Miniprep"-DNA herzustellen: die 10 ml-Kultur wurde geerntet (6 K für 5 Minuten] und in 1 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8 mit 1 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS-Lösung hinzugegeben; das Röhrchen wurde gemischt und für 5 Minuten auf 4ºC gestellt. 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, wurden hinzugegeben, gemischt und für 5 Minuten auf Eis inkubiert. Die Mischung wurde bei 15 K für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand dekantiert und zu 3,0 ml Isopropanol hinzugegeben. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen bei 15 K für 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde getrocknet und in 0,85 ml TE resuspendiert, 75 µl 5 M NaCl wurden hinzugegeben und die DNA wurde einmal mehr bei Raumtemperatur präzipitiert. Nach 1-minütiger Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge wurde das DNA-Pellet getrocknet und in 50 µl TE, pH 8,0, welche 20 µg/ml RNAse enthielten, resuspendiert.
Einzelne Plasmidpräparationen wurden dann auf ihre Hind III-Fragmentkomponenten und ihre Widerstandsfähigkeit gegenuber BamHI-Endonuklease hin untersucht.
Vier einzelne Kolonien wurden gefunden, die gegen BamHI resistent waren und mehrere HindIII-Fragmente enthielten. Eine weitere Analyse wurde an jeder der vier durchgeführt. Eine kleine Menge (10 ml) der Zellkultur jedes Klons wurde kultiviert und die gesamte chromosomale DNA präpariert (siehe Abschnitt 1). Von diesen enthielt einer Wirts-DNA, welche gegenüber einer BamHI-Spaltung resistent war, und wurde für weitere Experimente verwendet.

9. Methylasetests:

In vitro- und in vivo-Tests von BamHI-Extrakten wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das für den in vitro-Test verwendete Substrat ligierte BamHI-Linker (dpCGGATCCG) (N.E. Biolabs) waren, welche wie folgt hergestellt wurden:
Eine O.D.-Einheit an BamHI-Linkern wurde in einer 100 µl- Reaktion, welche zusammen mit 1000 Einheiten T4-DNA-Ligase (N.E. Biolabs) 50 mM Tris, pH 8; 20 mM DTT, 2 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2;, 50 g/ml Rinderserumalbumin (Pentax) enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Die Reaktion wurde dann Minuten lang zum Inaktivieren auf 70ºC erwärmt. 0,005 OD-Einheiten an Linker wurden zu jeder Methylasereaktion hinzugefügt; die Reaktion wurde mit [³H]-S-Adenosylmethionin durchgeführt.
In vivo-Tests: wurden unter Verwendung von Lambda-Phagen durchgeführt, wie in Beispiel I beschrieben ist.
Der Methylaseklon wurde ebenfalls auf Endonukleaseaktivität hin getestet [Endonucleasetests der rohextrakte wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1 µg pBR322, das mit 10 Einheiten PstI-Endonuklease (N.E. Biolabs) linearisiert worden war, als ein Substrat verwendet wurde). Es wurde keine Aktivität nachgewiesen.

B. Klonieren des Endonukleasegens:

1. Kartieren des Methylaseplasmids:

Die Reihenfolge der HindIII-Fragmente wurde durch eine Reihe von Doppelverdaus mit Restriktionsendonuklease, welche gemäß den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt wurden, festgestellt [siehe Fig. 5].
Darüber hinaus wurde die Oligonukleotidsonde, welche nach der Sequenz hergestellt wurde, die aus homogener BamHI- Endonuklease abgeleitet wurde [analog der Dde-Sonde - siehe Beispiel I], verwendet, um die HindIII-Fragmente auf die folgende Weise anzuordnen:
150 µl Reaktion, welche 15 µg des Bam-Methylaseplasmids in 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, enthielten, wurden gemischt und in 9 Röhrchen gegeben, wobei das erste 30 µl enthielt. 2 Einheiten HindIII-Endonuklease [N.E. Biolabs] wurden zu dem ersten Röhrchen hinzugefügt und eine Hälfte des Volumens wurde in das zweite übertragen usw., so daß man eine Reihenverdünnung erhält. Nach 1 Stunde wurden die Reaktionen (inkubiert bei 37ºC) beendet und die Verdaus wurden einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel unterworfen. Das der Elektrophorese unterworfene Material wurde dann wie in Beispiel I beschrieben auf ein Nitrocellulosefilter übertragen und dieses wurde verwendet, um mit der Oligonukleotidsonde zu hybridisieren, welche durch Behandlung mit gamma³²P-ATP [New England Nuclear] und T4- Polynukleotidkinase [N.E. Biolabs] wie in Beispiel I beschrieben radioaktiv gemacht wurde. Dieses führte zum Auffinden eines 2,2 kb-Fragmentes, welches an die Sonde hybridisierte.

2. Kartieren und Subklonieren des Methylasegens.

Das Plasmid, welches das Methylasegen enthielt (pDH1 genannt), wurde durch CaCl&sub2;-Behandlung in HB101-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde durch CsCl-Gradienten gereinigt, wie detailliert in Abschnitt 5 beschrieben ist.
a) HB101-Zellen, welche pdhl enthielten, wurden durch Lambda 467::Tn5 infiziert, um somit die Methylasefunktion durch Transposonmutagenese zu kartieren. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in Beispiel I angegeben.
b) Das Methylasegen schien auf einem 2,2 kb-HindIII-Fragment lokalisiert zu sein. 100 µg pDH1-DNA wurden vollständig mit Hind III verdaut und dann aüf einµm präparativen 0,7% Agarosegel laufengelassen. Das 2,2 kb-Fragment wurde mit langwelligem UV sichtbar gemacht, mit einem Skalpell ausgeschnitten und in einem analytischem Elektroelutionsgerät, IBI-Modell UEA, gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers elektroeluiert. Das Fragment wurde in 2 Volumina Ethanol präzipitiert, in 300 µl TE resuspendiert, phenolextrahiert, chloroformextrahiert und wieder mit Ethanol plus 0,2 M LiCl präzipitiert. Das DNA-Fragment wurde dann in 100 µl TE resuspendiert und bei -20ºC eingefroren.
c) 2 µg dieses Fragmentes wurden mit 0,1 µg pBR322- HindIII (mit alkalischer Phosphatase behandelt) oder 0,1 µg pUC19-Hind III, welches mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde, ligiert und die Ligation wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ligationsmischung (siehe Abschnitt A-3 für Einzelheiten der Ligation) wurde 1x chloroformextrahiert und dann verwendet, um kompetente HB101- Zellen zu transformieren. Transformanten wurden "minipräpariert" und die Plasmide auf Methylaseaktivität hin getestet (Abschnitt A-9). Konstrukte, welche das 2,2 kb-Fragment sowohl in pBR322 als auch in pUC19 enthielten, waren Bam- Methylaseproduzenten. Diese Plasmide wurden mit pDH2 bzw. pDH3 bezeichnet.
d) PDH2 wurde durch Standardmittel kartiert und die Endonukleasesonde wurde ebenfalls auf dem Fragment kartiert [Fig. 6]. Eine passende XmnI-Stelle wurde ungefähr 450 bp stromaufwärts von einer HindIII-Stelle lokalisiert, nahe der Stelle wo die Oligonukleotidsonde hybridisierte.
10 µg gereinigtes 2,2 kb-Fragment wurden extensiv mit XmnI- Endonuklease verdaut und die Reaktionsmischung wurde phenolextrahiert, chloroformextrahiert, ethanolpräzipitiert und resuspendiert. 5 µg dieser DNA wurden mit 0,5 µg pUC8, welcher mit Hind III und Sma I doppelverdaut worden war, ligiert. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um kompetente K802-Zellen zu transformieren. Einzelne Transformanten wurden "minipräpariert", um ihre Plasmidstruktur anzuschauen, und die Klone wurden ebenfalls auf Bam-Methylaseaktivität hin getestet (in vivo). Einer wurde gefunden, welcher das 1,75 kb-HindIII-Xmn-Fragment und Methylaseaktivität aufwies (andere, welche das 0,45 kb-Fragment aufwiesen, wurden als Endonukleasesonden aufbewahrt - sie hatten keine Bam-Methylaseaktivität). Dieses verkürzte Konstrukt, welches noch Bam-Methylase-positiv war, wurde mit pDH5 bezeichnet.

e) Kartieren des Endonukleasegens auf dem Bam-Chromosom.

Gereinigte Bacillus amyloliquefaciens-DNA wurde mit einer Reihe von Restriktionsendonukleasen unter Standardbedingungen verdaut und die Verdaus wurden auf 0,5%igen Agarosegelen laufengelassen. Die DNA wurde auf Nitrocellulosefilter übertragen, wie in Einzelheiten in Beispiel I ausgeführt ist. Die Southern Blot-Transfers wurden dann parallel zu der kinasierten Bam-Oligonukleotidsonde [Sequenz: 5'TCC(T)TTC(T)TCG(TCA)ACC(T)TCCAT3'] und nick-translatiertem gereinigtem 2,2 kb-Fragment [Nick-Translationsverfahren, beschrieben in Beispiel I] hybridisiert.
Obwohl die Oligosondenhybridisierung und Waschungen mit weniger Stringenz durchgeführt wurden und daher mehr unspezifische Hybridisierung auftrat, war es klar, daß beide Anteile an denselben Bereich des Bam-Chromosoms hybridisierten (Fig. 7). Insbesondere hybridisierten beide Sonden an ein 4,5 kb-HindIII-Fragment auf dem Bam-Chromosom.

3. Auffinden des Endonukleasegens

100 µg gereinigte Bam-DNA wurden vollständig mit 200 Einheiten HindIII-Endonuklease verdaut. Die DNA wurde auf einem präparativen 0,5% Agarosegel laufengelassen, ausgeschnitten und wie oben beschrieben elektroeluiert.
10 µg der gereinigten 4,5 kb-Fragmente wurden mit 1 µg pACYC 184-Vektor, welcher mit Hind III verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Die Ligationsmischung wurde nach Chloroformbehandlung von 100 µl auf 300 µl verdünnt. 100 µl wurden verwendet, um kompetente K802-Zellen, welche zuvor mit pDH5 transformiert wurden, zu transformieren.
Transformanten, welche AmpRcamR waren, wurden selektiert. 350 von diesen wurden durch Zahnstocher in sterile Mikrotiterplatten {Nunc] überführt, welche 100 1 L-Nährlösung + Amp + Cam (Chloramphenicol; 30 µg/ml Endkonzentration) enthielten, und wurden über Nacht bei 37º0 kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Kolonien unter Verwendung einer mehrzinkigen Inokulierungsvorrichtung auf LB + Amp + Cam- Platten gestempelt und diese wurden über Nacht bei 37º0 inkubiert; 50 Kolonien/Platte.
Testen auf Endonukleaseaktivität: Zu jeder der 7 Masterplatten wurden 5 ml Beschallungspuffer (100 mM Tris, pH 8; mM Mercaptoethanol) hinzugefügt und die Kolonien wurden von der Oberfläche der Platte abgewaschen. Die Zellsuspension wurde für 10 Minuten bei 5 K zentrifugiert, um die Zellen zu ernten und sie wurden in 0,5 ml Beschallungspuffer resuspendiert. Die Zellen wurden mit der Mikrospitze für 15 Sekunden beschallt, nachdem sie mit 25 µl Lysozym (10 mg/ml) und 50 µl 0,1 M EDTA, pH 7,0, behandelt wurden, und wurden eingefroren und aufgetaut. Die Zelltrümmer wurden nach Zugabe von 10 µl 1 M MgC1&sub2; durch Niedriggeschwindigkeitszentrifugation (5 Minuten in Eppendorf) aus der beschallten Lösung (sonicate) entfernt. 1 µl jedes gepoolten Extraktes wurde verwendet, um 1 µg pBR322-DNA, welche durch die Zugabe von 10 µl PstI zu der Reaktionsmischung (10 mM Tris, pH8, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) linearisiert wurde, zu verdauen. Nach Auflösung der Verdaus auf Agarosegelen wurde etwas Erfolgversprechendes auf Platte Nr. 5 gesehen. Daher wurden Zellen aus jeder Kolonie in 5 ml LB + Amp + Cam inokuliert und über Nacht kultiviert, jede einzeln geerntet und auf BamHI-Endonukleaseaktivität hin getestet.
Darüber hinaus wurden die Kolonien auf Phagenrestriktion hin geprüft [siehe Beispiel 1]. Eine Kolonie wurde gefunden, welche Bam-Endonukleaseaktivität aufwies.

Claims

1. Verfahren zum Klonieren eines nicht-plasmidgetragenen Restriktions-Modifikationssystems, welches umfaßt:

(a) Einführen eines Modifikationsgens, welches dem zu klonierenden Restriktions-Modifikationssystem entspricht, in einen Klonierungsvektor und Exprimieren des Gens in einer geeigneten Wirtszelle, wobei die Expression des Modifikationsgens auf einem Niveau ist, das ausreichend hoch ist, um die Wirtszell-DNA vor einem Abbau durch die Restriktionsendonuklease des Restriktions-Modifikationssystems zu schützen; und

(b) nachfolgend Lokalisieren und Einführen eines Restriktionsgens aus der chromosomalen DNA, welches dem zu klonierenden Restriktions-Modifikationssystem entspricht, in die Wirtszelle, welche das exprimierte Modifikationsgen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Einführung des Modifikationsgens in den Klonierungsvektor und die Expression davon in einer geeigneten Wirtszelle die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Reinigen von DNA aus einer Quelle, welche das zu klonierende Restriktions-Modifikationssystem enthält;

(b) wenigstens teilweises Verdauen der gereinigten DNA, um DNA-Fragmente zu bilden;

(c) Ligieren des Fragmentes in den Klonierungsvektor;

(d) Transformieren der Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (c), um eine Bibliothek zu bilden;

(e) Screenen der Bibliothek auf Klone, welche das Modifikationsgen enthalten; und

(f) Kultivieren der Wirtszellen, welche die Klone aus Schritt (e) enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Quelle der DNA ausgewählt wird aus Bakterien oder Viren, die das Restriktions-Modifikationssystem enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Klonierungsvektor ein Plasmid oder ein virales DNA-Molekül ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Plasmid pBR322, pUC8, pUC9, pUC18 oder puclg ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Einführung des Restriktionsgens in die Wirtszelle ein Einführen des Restriktionsgens in ein zweites Plasmid, das mit dem Plasmid, welches das Modifikationsgen enthält, kompatibel ist, und ein Transformieren der Wirtszelle mit dem zweiten Plasmid umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Einführung des Restriktionsgens in die Wirtszelle ein Einführen des Restriktionsgens in das Plasmid, welches das Modifikationsgen enthält, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle ausgewählt wird aus der Gruppe von ER1467, K802, HB101, RRl, K803 und MM294.

9. Klon, welcher gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 erzeugt wurde, wobei der Klon in der Abwesenheit des früher exprimierten Modifikationsgens für eine DNA- Spaltung durch die Restriktionsendonuklease des Restriktions-Modifikationssystems empfänglich ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Restriktionsenzyms aus einem nicht-plasmidgetragenen Restriktions-Modifikationssystem, welches die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Reinigen von DNA aus einer Quelle, welche ein zu klonierendes Restriktions-Modifikationssystem enthält;

(c) Ligieren der Fragmente in einen Klonierungsvektor;

(d) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem Klonierungsvektor aus Schritt (c), um eine Bibliothek zu bilden;

(e) Screenen der Bibliothek auf Klone, welche ein Modifikationsgen enthalten, das dem Restriktions-Modifikationssystem entspricht;

(f) Exprimieren des Modifikationsgens auf einem Niveau, das ausreichend hoch ist, um die Wirtszell-DNA vor einem Abbau durch das zu erzeugende Restriktionsenzym zu schützen;

(g) nachfolgend Lokalisieren und Einführen eines Restriktionsgens aus der chromosomalen DNA, welches dem Restriktions-Modifikationssystem entspricht, in die Wirtszelle, welche das exprimierte Modifikationsgen enthält;

(h) Kultivieren der Wirtszellen aus Schritt (g); und

(i) Gewinnen des Restriktionsenzyms aus der Kultur.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Quelle der DNA ausgewählt wird aus Bakterien oder Viren, die das Restriktions-Modifikationssystem enthalten.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Klonierungsvektor ein Plasmid oder ein virales DNA-Molekül ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Plasmid pBR322, pUC8, pUC9, pUC18 oder pUC19 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Einführung des Restriktionsgens in die Wirtszelle ein Einführen des Restriktionsgens in ein zweites Plasmid, das mit dem Plasmid, welches das Modifikationsgen enthält, kompatibel ist, und ein Transformieren der Wirtszelle mit dem zweiten Plasmid umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Einführung des Restriktionsgens in die Wirtszelle ein Einführen des Restriktionsgens in das Plasmid, welches das Modifikationsgen enthält, umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle ausgewählt wird aus der Gruppe von ER1467, K802, HB101, RRl, K803 und MM294.