JP2541674B2 - ２種類の生物親和性パ―トナ―の特異的結合反応によつて試料液を分析検査するための試験キヤリヤ― - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試料中および試験キヤリヤーの試薬中にそ
れぞれ含有された２種類の生物親和性結合パートナーの
特異的結合反応によつて試料液を分析検査するための試
験キヤリヤーに関する。該試験キャリヤーは次の構造を
有する： 前記の２種類の結合パートナーのうち第一の結合パート
ナーが試料中に含有されており； 基礎層上に大体において並置された数個の毛管活性試験
ゾーンを有し、これらのゾーンが液体接触していて、基
礎層に対して平行に延びる液体輸送区間を形成し、同区
間に沿って毛管作用によって駆動される液体が出発ゾー
ンから流れ； この液体輸送区間が順次に、試験キャリヤーに試料を供
給するための試料供給ゾーン、１種類の生物親和性結合
パートナーの標識複合体を含有する複合体ゾーン及び検
出ゾーンを包含しておりかつ 第一結合パートナーと、第二結合パートナーを含有する
試薬系との間で、所望の分析にとって特異的な標識物を
形成する反応が進行しかつ前記特異的標識物が検出ゾー
ンで検出される。

従来の技術 疾病の診断の際に定性的および定量的分析測定のため
に、極最近では所謂キヤリヤー結合試験を次第に使用す
るようになつている。このような試験の場合には、試薬
は、試料と接触される固体試験キヤリヤーの相応の層中
に埋込まれている。試料は大部分が血液または尿のよう
な体液である。しかしまた先行する試験段階によつて得
られた液体も重要である。

試験キヤリヤーは多数の異つた形態で知られている。
本発明は、通常吸収性層材料、すなわち紙、不織布また
は多孔性プラスチツク層材料から成る毛管活性試験ゾー
ンが、液体が基礎層に平行に液体区間に沿つて流動する
ように並列的に基礎層上に配置されている構造の試験キ
ヤリヤーに関する。従つてこの試験キヤリヤーを“縦輸
送装置を有する試験キヤリヤー”と称することもでき
る。

このような試験キヤリヤーの構造は、特に、２種の生
物親和性パートナーの特異的結合反応に基く分析法にと
つて有利である。西独国特許第3445816号および米国特
許第4,361,537号明細書には、例が記載されている。こ
の意味における特異的結合反応は、特に抗原またはハプ
テンと抗体との間の免疫的相互作用である。しかしま
た、レクチン−糖のような他の特異的生物親和性相互作
用または作用物質−受容体相互作用も使用することがで
きる。以下には、一般性を制限することなく例として免
疫学的相互作用を挙げることにする。

文献、例えば前記引用特許明細書に記載されている極
めて異つた試験原理を使用することができる。

免疫的試験操作の第１群は、液体輸送区間の前部ゾー
ンの一つが、第一結合パートナー（目標分析物Analyt）
を可溶の標識された形で含有することによつて優れてい
る。液体輸送区間のさらなる延長上に配置された試験ゾ
ーンはキヤリヤーに固定された第二結合パートナーを含
有する。試料からの目標分析物と試験からの標識された
目標分析物が第二結合パートナーの結合位置に対して競
合する。このような試験は従つて競合試験と称する。

公知の免疫学的試験操作の第２群の場合には、液体輸
送区間の前部ゾーンの一つは、第二結合パートナーを可
溶な標識された形で含有する。第一結合パートナーとの
特異的結合反応によつて可動性の標識複合体が形成され
る。

他の試験経過では、キヤリヤーに固定された形のもう
一種の結合パートナーも存在していてよく、同パートナ
ーは第一または第二結合パートナーの、複合体の形成に
よつて飽和されなかつた結合位置と特異的に結合するこ
とができる。これによつて少なくとも３種の結合パート
ナーのサンドイツチができる。従つてサンドイツチ試験
についても論議する。

所謂免疫酵素測定法（IEMA）原理の場合には、試験経
過はキヤリヤーに固定された形で目標分析物を含有す
る。これによつて第二結合パートナーの複合化されなか
つた部分が固定される。複合体のみが可動性であつて、
検出されうる。

すべての免疫学的測定法にとつて共通な点は、就中、
両結合パートナーの間の特異的結合反応を包含する検出
反応が、所望の分析にとつて特異な標識物を生じること
である。これは、競合試験の場合には結合されたまたは
遊離された目標分析物である。サンドイツチ試験の場合
にはこれは結合されたサンドイツチ複合体である。また
IEMA試験の場合には可動的に遊離された複合体である。

種々の公知免疫学的試験原理の詳細な説明は、関連文
献から知ることができるのでここでは省略する。本発明
は、特異的な試験経過に関係なく有利に適用可能である
が、特にIEMA原理に従つて作業する試験キヤリヤーに向
けられている。

また種々の免疫学的測定方法は、使用された標識に関
しても相違している。本発明は、特に酵素標識を用いる
酵素免疫試験に向けられている。標識酵素は通常標識酵
素の基質の呈色反応によつて検出される。同基質は、試
験操作に応じて検出ゾーン中にすでに存在していてもよ
いしまたは検出ゾーンに供給されてもよい。本発明は原
則的には、例えば有色物質または放射性元素が標識用に
使用される方式の非酵素的方法にも適用することができ
る。

発明の構成 本発明は、冒頭記載の構造を有する試験キャリヤーに
おいて、捕捉試薬として作用する、第一結合パートナー
にとって特異的な第三結合パートナーが、比較的高い濃
度で存在する第一結合パートナーの分析的検出のために
使用される液体輸送区間において複合体ゾーン内に又は
試料供給ゾーンと複合体ゾーンとの間に施されており、 この第三結合パートナーが第一結合パートナーの一部を
結合し、それによって特異的標識物を形成する反応から
除くような大きさの使用量で、この過程が可能であるよ
うに液体輸送区間の一つのゾーンに配置されていること
を特徴としている。

免疫学的測定は極めて高い感度によつて優れている。
これは低濃度の目標分析物の場合には利点であるが、す
でに従来から、免疫学的測定の利点を高濃度の目標分析
物の場合にも使用するという努力はあつた。この場合に
は大きな感度が難点であつた。もちろん、試料を手動に
より適宜希釈することは可能である。しかしこの操作
は、訓練された実験用員によつてのみ行なわれうる、時
間のかかる操作段階を要求する。そのために試験法に対
する費用のかかる干渉によつて同試験法の感度を下げる
試みが行われた。例えば試験において目標分析物に対す
る親和性の減少された結合パートナーを使用するか、ま
たは標識結合パートナーと標識酵素との間の化学量論を
行つた。

ところで本発明は、試験キヤリヤー上に目標分析物に
とつて特異的な捕捉試薬を施すことによつて、費用のか
かる前記公知方法と比較して意外に簡素な方法を提案し
ている。これによつて、前に接続された別個の希釈段階
を要することなしに、試験キヤリヤー上で目標分析物の
濃度の希釈が達成される。本発明による試験キヤリヤー
は10^-8mol/lを越える濃度、特に10^-7mol/lを越える濃度
にとつて有利である。

本発明の試験キャリヤーにおけえる出発ゾーンは、室
温で水に不溶の結合剤を含有する非膨潤性不織布から製
造される。

この点で本発明はまた、従来公知の技術で行なわれた
手段と根本的に異なる。つまり、西独国特許第3445816
号明細書およびヨーロツパ特許第52328号明細書には、
特に、その膨潤性のために極めて高い吸水量を有する親
水性材料から成るスポンジ状プラスチツクまたは層が適
当であると述べられているからである。これによつて、
出発ゾーンが試料液中に浸漬される時十分に同液を吸収
し、試料液中への浸漬後にそれ以上の同液体がもはや供
給されなくても、試験キヤリヤーの全液体輸送区間を試
料液で満たすことができる。

意外にも、本発明の範囲では、その自重の割には小さ
い液体吸収量を有するが、試験キヤリヤー上に十分に完
全に吸収される比較的疎水性の材料を用いると、極めて
優れた結果が得られることが判明した。

前記特性は、量的に液体保留率と表現されうる。この
液体保留率は、本発明の範囲内では、面積25cm²の試料
を、同試料よりも著しく大きくかつ飽和まで十分に湿潤
されるスポンジクロス上に置くことによつて特定するこ
とができる。スポンジから取出した水量を秤量して測定
する。該湿潤試料を、直径158mmの円形フイルタ（西独
国、Dassel在Schleicher ＆ Schll社製2668/8型）上
に置き、２分後に除去する。円形フイルタによつて吸収
された水量をまた秤量して測定する。保留率は、該試料
中に残留する水量／初めに吸収された水量の割合（％）
として特定される。この意味において、試料液に関して
25％以下の液体保留率を有する材料が有利である。

実施例 次に本発明を、図面に略示した実施例により詳述す
る： 第１図を、種々の可能な試験原理および試験キヤリヤ
ー上の捕捉試薬の配置を説明するために用いる。それ故
に同図は構造的詳細な点を無視し、試験ゾーン11〜16が
それらの端面で隣接してその上に並列的に配置されてい
る、基礎層２を有する試験キヤリヤー１を原理的にのみ
示す。試験ゾーンは好ましくはそれぞれ種々の吸収性材
料（紙、不織布、多孔性プラスチツク層等）から成り、
接合縁における液体接触が十分に密接な層の接合によつ
て実現される。しかしまた、層が部分的にオーバーラツ
プする（第２図参照）かまたは同一材料から成る数個の
隣接ゾーンがワンピースとして製造されていてもよい。
試験ゾーンは全体として、出発ゾーン11から目標ゾーン
16に達する液体輸送区間20を形成する。

試験キヤリヤーを使用する際には先づ、好ましくは同
キヤリヤーを適宜試料液中に浸漬することによつて出発
ゾーン11のみを同液と接触させる。次に出発ゾーンがそ
の含有液体を次第に液体輸送区間に放出する。液体はゾ
ーン11〜16で支配する毛管作用に基いて目標ゾーン16ま
でクロマトグラフイーを行なう。ここで重要なゾーンの
液体輸送特性の詳細については、第２図により後述する
ことにする。

さて第１図の場合には、出発ゾーン11に試料供給ゾー
ン12および補助試薬ゾーン13が接続している。試料供給
ゾーンの機能はさらに次下に詳述する。補助試薬は、試
料のpH値を試験条件に合わせるために、緩衝剤を含有し
ている。同試薬は所望の場合には別の補助試薬、例えば
湿潤剤等を含有していてもよい。一般には、試験条件に
応じて、図示の場合よりも多数のまたは少数のゾーンが
存在していてもよい。

個々の場合に適用される免疫学的試験原理に応じて、
相応の試薬系成分が試験キヤリヤーのゾーン中に含有さ
れている。若干の例を次に述べる。

試料中に含有された抗原Agを測定するための競合試験
の場合には、例えばゾーン14（複合体ゾーンという）が
抗原と標識酵素AgEとの複合体を可溶性の形で含有する
ことができる。ゾーン15は、キヤリヤーに固定された形
の抗体Ak1（ｆ）を第二結合パートナーとして含有す
る。

試料が流通するとAgEが溶解される。AgとAgEとがAk1
（ｆ）の結合位置をめぐつて競合する。さらに液体が目
標ゾーン16中に流入すると、ゾーン15においてAk1
（ｆ）への結合によつて固定されたAgEと、ゾーン16中
に引続き流入する遊離AgEとの分離が行なわれる。ゾー
ン15で結合されたAgE量は特異的であつて、分析に関し
て特徴的であり、例えば別の方法段階で呈色性基質を酵
素に供給し、ゾーン15での呈色を観察することによつて
そこで検出することができる。この限りにおいて試験経
過は慣用的である（例えば西独国特許第3445816号明細
書参照）。

ゾーン13には捕捉試薬としてキヤリヤーに固定された
第三結合パートナーAk2（ｆ）が存在する。同パートナ
ーは、試料抗原が抗原複合体と一緒に複合体ゾーン14中
に入る前に、同抗原の一部を固定するために役立つ。そ
れによつて抗原（一般的に言えば第一結合パートナー）
の一定部分が、標識物を形成する検出反応から除去され
る。

上述のように、抗体Ak1（ｆ）およびAk2（ｆ）はそれ
ぞれ同一抗原と特異的に結合できなければならない。好
ましくは同一抗体を使用してもよい。

免疫酵素測定法試験原理（IEMA）に従つて動作する、
試料中に含有された抗原Agを測定するための試験キヤリ
ヤーの場合には、複合体ゾーン14は、抗原に特異的に結
合する抗体と標識酵素AkE（第二結合パートナー）との
可溶性複合体を含有する。ゾーン15はキヤリヤーに固定
された形の抗原（Ag（ｆ）、別の結合パートナー）を含
有する。試料が流通すると、AkEが溶解され、Agと共に
複合体Ag−AkEを形成する。未結合AkEはゾーン15でAg
（ｆ）に結合され、他方Ag−AkE複合体は遊離してい
る。液体をさらにゾーン16中に輸送すると、結合された
AkEと、分析に関して特徴的な、複合化されそれ故に遊
離されているAg−AkEとが分離される。後者はゾーン16
で検出されうるが、有利にはゾーン16には標識酵素の呈
色性基質が存在している。この試験過程も公知である。

競合的試験の場合には、検出は好ましくはゾーン15
で、つまり固定された第二結合パートナーを有するゾー
ンで行なわれるけれども、免疫酵素測定法試験の場合に
は、固定ゾーン15に続くゾーン16が検出ゾーンとして用
いられる。

免疫酵素測定法試験は、極めて高い感度および簡素な
操作によつて優れている。本発明の範囲内では、意外に
も、この原理に従つて動作する試験キヤリヤーが、直接
的検出のために比較的多量に計量された目標分析物（0.
1μm01/lよりも大きい濃度）に関しても、操作容易性に
関する利点を失うことなく有効に使用されうることが判
明した。

さらに捕捉試薬も施されているが、このものは前記の
競合的試験原理の場合と同様に試験キヤリヤーのゾーン
13、つまり複合体ゾーンの前に置かれたゾーンの１つの
中に溶けているかまたはキヤリヤーに固定された形で含
有されていてもよい。

極めて好ましくは、捕捉試薬が可溶性の形で複合体と
一緒に同一ゾーン（例の場合にはゾーン14）に存在して
いる、という他の態様もある。この場合には、捕捉試薬
として使用される抗体は、複合体の場合に使用される抗
体と同じ作用特異性を有しなければならない。従つて、
同一のモノクロナール抗体、場合によつてはまた極めて
狭いエピトープスペクトルを有するポリクロナール抗体
が好適である。

この態様の場合には、酵素標識を有しない捕捉試薬が
複合体と共に目標分析物の特異な結合位置を求めて競合
する。これによつて、大体において百分率の“希釈度”
が得られる。つまり検出反応の捕捉試薬によつて除去さ
れる目標分析物の分量が、捕捉試薬／複合体の割合に近
似的に相応する。

捕捉試薬を遊離の形で施す手段は、同試薬が複合体と
同じゾーンに配置されている場合に限定されない。それ
どころか本発明は、この手段の十分なる一般性におい
て、該補捉試薬が、同試薬にとつて適当な、検出ゾーン
の前に置かれた、液体輸送区間のゾーン中に可溶性の形
で含有されている形式の試験キヤリヤーも包含する。

捕捉試薬の量は、特定の必要条件に適合している。理
論的には、この量は試料中の目標分析物の被検出最少量
（検出限界）よりも小さくなければならない、という前
提がある。しかし実際には、種々の要因が問題になる。
このような要因には、使用された抗体の親和定数、特異
的な複合体構造および液体が捕捉試薬を含有するゾーン
を通つて流れる速度が挙げられる。また、試料抗原の捕
捉試薬への結合がどの程度まで完全であるか、というこ
とも重要である。理論的考察によると、この場合測定結
果の著しい狂いを危惧しなければならないような大きい
不正確さが存在することを恐れなければならないであろ
う。しかし実際には意外にも、高濃度のパラメータの免
疫学的測定が良好な精度をもつて可能であるように、捕
捉試薬の量を経験的に決めることができることが判つ
た。

捕捉試薬を有する試験ゾーンを形成する吸収性層材料
を、好ましくは、同試薬が分析測定の所望の検出限界に
ほぼ相応するモル濃度で含有されている含浸溶液で含浸
する。含浸溶液中の捕捉試薬の濃度は少なくとも、所望
の検出限界の半分の大きさでなければならない。濃度は
絶対数で少なくとも10^-8mol/l、好ましくは少なくとも1
0^-7mol/lである。

試料は、必ずしも出発ゾーン11に供給しなくてもよ
い。むしろ特別な試料供給ゾーン12が設けられていても
よい。これは、特に付加的な試料の希釈を達成しよう場
合に有利である。この場合には、試料を過少量で試料供
給ゾーン12に供給する。ここで、“過少量で”とは、供
給した容量が試料供給ゾーンの吸収容量よりも小さいこ
とを意味する。次に出発ゾーンを溶離剤（有利には水ま
たは緩衝溶液）に接触させる。

これによって希釈が達成されうることが判明した。希
釈の度合いは、試料供給ゾーンにピペツトで供給した容
量および出発ゾーンの吸収容量によつて影響されうる。
この操作法の著しい利点は、任意の時点で試料を供給し
かつ乾燥させうることである。溶離および分析は、爾後
の時点で初めて行なわれる。これによつて一連の試験片
テストが集積されうる。

試料供給ゾーンの希釈作用にとつては、分析を妨害す
る試料の増量がクロマトグラフイー用液体の前部で起ら
ないことが重要である。それ故に、試料供給ゾーンにと
つて有利には、その特有の性質により前記条件を満足さ
せる材料を選択する。このためには次の作用原理が必要
である： ａ）供給された目標分析物が固相に弱く結合し、溶離剤
によつて遅延的に溶離されるように該物質を選択する。

ｂ）試料供給ゾーンの材料が、渦流および／または非層
流によつて試料と溶離剤との混合が達成されるような構
造を有している。

第２図は、比較的多量に計量されたパラメーターの測
定を免疫酵素測定法試験原理を用いて極めて容易に可能
にする試験キヤリヤーを示す。該キヤリヤーは、比較的
多量に利用されうる試料液、特に尿の中のこのようなパ
ラメーターを測定するのに好適である。

基礎層２上には、出発ゾーン21、補助試薬ゾーン23、
複合体ゾーン24および固定ゾーン25が大体において並列
的に配置されている。固定ゾーン25の端部25aと基礎層
との間に呈色ゾーン26が存在する。さらに、固定層25の
端部25aは、硬質プラスチツク材料から製造された保持
層28によつて呈色層26に対して押圧されている。保持層
は溶融接着剤片27で基礎層２に取付けられている。

図面においては、ゾーンの縁における液体接触を改善
するために、層21〜25がそれぞれ隣接の層に少し重なつ
ているのが認められる。しかし液体輸送は、大体におい
て試験キャリヤーの長手方向において、従つてゾーンが
それから製造されている層材料の表面に平行に、液体輸
送区間30に沿つて行なわれる。

試験キヤリヤーは、使用する場合、出発ゾーン21のみ
が湿潤される場合には、試料液中に浸漬する。つまり出
発ゾーン21のみが試料液と接触する。したがつて出発ゾ
ーン21は、同ゾーンが液体を自然にかつ完全に吸収しか
つさらに先へ良好に案内し乃至放出するような性質でな
ければならない。ここに存在する種類の試験片にとつて
は、試験キヤリヤーの実際の動作領域を形成する、出発
ゾーン21の後に置かれたすべてのゾーンに十分にかつ再
現可能に液体が供給されるのが重要である。これは成
程、試験キヤリヤーを試料を含む容器中に放置し、その
結果大きな液体供給源に恒常的に接触することによつて
達成することはできる。しかしこれは操作を困難にす
る。従つて、試験片を試料液から再び取出した後、出発
ゾーン21が数秒内に十分な液体量を吸収し、試験要件に
より再び放出するのが望ましい。

本例の出発ゾーンは、ヨーロツパ特許出願第52328号
による従来の前記提案とは反対に、水不溶性結合剤を含
有する非膨潤性不織布から成る。

非膨潤性繊維材料としては、不織布の含分が少なくと
も50％でなければならない完全合成繊維が極めて好まし
い。特にポリアミドおよびポリエステルならびにこれら
の混合物が有利であつた。

繊維を固定するための結合剤としては、有利にはポリ
ビニルアルコールを使用することができる。この結合剤
は、特に、不織布を製造する際大形容器で実際の不織布
とポリビニルアルコール繊維とを混合するようにして使
用する。次にこれらの繊維を、不織布製造時の常法によ
り、乾燥ロール上に引き上げる。約90℃〜150℃の乾燥
温度でポリビニルアルコール繊維が溶解し、不織布の残
りの成分上に、この不織布に強度を付与する被覆を形成
する。好ましくは、1.26〜1.30g/cm³の比重を有する高
分子の完全ケン化ポリビニルアルコールを使用する。

極めて好ましいポリエステル繊維は、約1.17g/cm³の
比重、６〜12mmの切断長さおよび1.7〜3.3dtexの繊度を
有する。

ポリアミド繊維を使用する場合には、同繊維は好まし
くは約1.14〜1.15g/cm³の比重、４〜6mmの切断長さおよ
び2.2dtexの繊度を有する。

該不織布は、付加的成分としてリンター（木綿植物の
原綿から得られた繊維であつて、化学的に溶解されかつ
漂白される）を含有していてもよい。

他のゾーンは、第１図で免疫酵素測定法試験の場合に
ついて記載したのと同じ試薬を含有する：補助試薬ゾー
ン23は緩衝剤および場合により他の補助試薬を含有し、
複合体ゾーン24は目標分析物に特異的に結合することの
できる（第二）結合パートナーの酵素複合体を含有し、
固定ゾーン25は固相に結合された目標分析物（つまり目
標分析物同族体）を含有し、呈色ゾーン26は標識酵素の
呈色基質を含有する。

抗原を測定する場合には、複合体ゾーン24では相応の
抗体の複合体を使用し、固定ゾーン25では同一の抗原ま
たは層24の抗体と結合することのできる抗原を使用す
る。抗体を測定しようとする場合には、当業者にとつて
周知のように、それぞれ抗原を抗体と交換しなければな
らない。

同様に第１図と一致する場合には、捕捉試薬が施され
ており、同試薬は好ましくは溶解しており、層24におけ
る酵素的に複合されたパートナーと同一である。

試験過程は第１図による試験キヤリヤーの免疫酵素測
定法と同様であつて、ここで再び詳述する必要はない。

また第２図による試験キヤリヤーの作用にとつては、
種々のゾーンを形成する層材料の液体輸送特性も極めて
重要である。

最適試験過程にとつて、分析にとつて特異的な標識物
が呈色ゾーン26でその全面に亘つて十分に均質であつ
て、その結果均質な呈色が行なわれることが必要であ
る。従つて、免疫酵素測定法試験の場合には、分析にと
つて特徴的な、呈色ゾーン26におけるAg−AkE複合体の
均質な分配を達成することが要求される。

この意味では、本発明の範囲において、複合体ゾーン
およびその直後に続くゾーンが製造されている材料がそ
れらの吸収性に関して互いに調整されていて、複合体ゾ
ーンの材料がその直後に続くゾーンの材料よりも迅速に
液体を輸送するようになつている場合が有利であること
が判明した。

図示した例の場合には、これは複合体ゾーン24および
一般の場合には必ずしも固定ゾーンでなくてもよい、そ
の直後に続くゾーン25に関している。２つのゾーンは同
一液体流の中に存在しているので、両ゾーンが充填され
ると、これらのゾーンは定常状態で単位時間当り同一液
量を輸送しなければならない。それにも拘らず、複合体
ゾーンがその直後に続くゾーンよりも薄く、そのために
より小さい流動断面を有しているので、その流速はより
小さい。

この手段は複合体の均質化を要求する。複合体は、複
合体ゾーン24における溶液条件および液体輸送条件に依
存して、同ゾーンで入つて来る液体によつて程度の差こ
そあれ鋭い前部濃度の意味で溶解される。これは液体ク
ロマトグラフイーの場合の吸収性層の普通の挙動に相当
する。ここで議論された手段の目的は、それから生じる
濃度差を調整することである。先づ複合体ゾーンが比較
的迅速に充填されるが、複合体はまだ僅かしか溶けな
い。次に、続行する液体輸送は、次に続くゾーンの液体
輸送特性に従つて比較的緩慢に行なわれる。この緩慢な
流動の間に複合体はすでにゾーン24で比較的均質に溶解
する。さらに緩慢な流動はゾーン25内の平衡作用ももた
らす。

免疫酵素測定法試験の場合には、前記のように、複合
体ゾーンの後に固定ゾーンが存在し、一般の場合には両
ゾーンの間に別のゾーンが存在していてもよい。ところ
で本発明の好ましい手段は、固定ゾーンが複合体ゾーン
よりも大きい流動断面を有することを意図する。

公知の免疫学的試験の場合には、主として、固定層よ
りも薄い厚さを有する細孔性プラスチツク材料（膜）を
使用する、それというのもこのような材料がキヤリヤー
に固定された免疫学的試薬の高い保持密度を許し、液体
が同材料中を緩慢に流れるからである。これによつて複
合体層からの未結合複合体の信頼できる固定が達成され
る。これは測定精度にとつて極めて重要である。

さて前記の公知法とは異なり、本発明の範囲では好ま
しくは、比較的ルーズなキヤリヤー材料、例えば紙、織
布または（特に好ましくは）不織布を基材として製造さ
れている固定層を使用する。この層材料は比較的厚いの
で、該固定ゾーンは複合体ゾーンよりも大きい流動断面
を有している。これによつてこの場合にも免疫試薬を極
めて多量に保持することができ、該固定層の製造は膜の
場合よりも著しく少ない費用ですむ。複合体および固定
層の前記の調整によつて同時に、過剰な複合体の完全な
結合にとつて有利な、固定層における比較的緩慢な流動
が得られる。

また第２図の試験キヤリヤーの場合には、呈色ゾーン
が固定ゾーンの一部と平行に延びかつ固定ゾーンと平面
的に液体接触していることによつて、層26における呈色
の均質性も促進される。同時に呈色ゾーンは、液体が固
定ゾーン25から極めて遅延的に呈色ゾーン26中に入る、
つまり呈色反応の開始前に固定ゾーン25が大体において
完全に充填されているようにゾーン26の基質が遅延的に
溶解する、ように有利に形成されている。この点に関し
ては、西独国特許出願第P3826056.5号および同第P38260
57.3号を参照されたい。

例１ 出発ゾーン11,21にとつて好適な材料の吸水性および
水放出性： ヨーロツパ特許出願第52328号記載の膨潤性スポンジ
材料を、本発明による次の３種の材料と比較した。

ａ）ポリアミドとポリエステルとから成る混合不織布： 上記材料を大形容器でクラロン（Kuralon）〔ポリビ
ニルアルコール、西独国Ｍnchengladbach在Rohtex−T
extil社製〕と一緒にポリアミド：ポリエステル：クラ
ロンの割合＝30:20:2.6で混合し、公知法で加工して基
本重量160g/m²および厚さ1.0mmを有する不織布を製造す
る。

ｂ）純粋ポリエステル不織布： ポリエステルとクラロンとを10:1の割合で大形容器で
混合し、基本重量166g/m²および厚さ1.0mmの不織布に加
工する。

ｃ）リンターを含むポリエステル不織布： ポリエステル、リンターおよびクラロンを50:25:7.5
の重量割合で大形容器中で混合し、基本重量250g/m²お
よび厚さ1.4mmを有する不織布に加工する。

これらの不織布の保留性能を次表に示す： 上表によれば、従来技術のスポンジ材料の場合の吸水
量が最も高い。水放出量についても同じことがいえる。
しかし試験キヤリヤーの動作にとつて極めて重要なの
は、保留率、つまり特定の限定された実験条件下でそれ
ぞれの試験ゾーン中に残留する液体のパーセントであ
る。本例からは、本発明による３種のすべて不織布の場
合の保留率が従来技術の出発ゾーン材料の場合よりも著
しく優れていることが判る。

例２ 尿中のアルブミンを測定するための、特に微量蛋白尿
を検出するための試験キヤリヤー： 第２図による試験キヤリヤーを次のように製造する。

出発ゾーン11: ポリエステル不織布（西独国Hatzfeld在Binzer社）。
これはクラロン10％で補強された純粋ポリエステル不織
布である。厚さ1.0〜1.2mm、吸収容量＝1800ml/m²。

緩衝剤ゾーン23: 厚さ0.7mmおよび吸収容量480ml/m²を有する不織布材
料SL4207KA〔西独国Euskirchen在Kalff社製；ポリエス
テル90％、ビスコースステープルフアイバー10％および
アクリレート少量から成る〕に次の溶液を含浸し、次に
含浸材料を乾燥させる： 燐酸ナトリウム（pH7.8）200mM ウシ血清アルブミン１％ 複合体ゾーン24: ガラス繊維100重量部から成り、クラロン10重量部で
補強した、厚さ0.2mmおよび吸収容量200ml/m²のガラス
繊維不織布に次の溶液を含浸し次に含浸材料を乾燥させ
る： 燐酸ナトリウム（pH7.4）70mM、 トレハロース１％、 ウシ血清アルブミン0.5％、 β−ガラクトシダーゼおよび目標分析物特異性抗体（Ig
G）から成る複合体6kU/l、 捕捉試薬としての未標識の目標分析物特異性抗体（Ig
G）70mg/l。

固定ゾーン25: 重量比50:50:3のポリエステル、木綿リンターおよび
エタヅリン（Etadurin^R）から成り、厚さ0.5mmおよび吸
収容量450ml/m²を有する混合不織布に次の溶液を含浸
し、次にこの含浸布を50℃で30分乾燥させる： 燐酸ナトリウム10mMの緩衝液（pH7.5）、 濃度200mg/l（燐酸ナトリウム緩衝液）の架橋ヒト血清
アルブミン。

上記架橋ヒト血清アルブミンは次のようにして製造し
た： ヒト血清アルブミン1.5gを、燐酸カリウム緩衝液（20
0mM、pH8.0）30ml中に仕込み、スベリン酸ジスクシニジ
ル50mg/mlジオキサンから成る溶液2.5mlを２時間以内で
加えた。架橋反応経過後に、500倍容の燐酸カルシウム
緩衝液（20mM、pH7.2）に対して透析した。650000より
も大きい分子量を有する高分子画分をズペローゼ（Supe
rose）6^R（西独国Freiburg在Pharmacia社）を用いてゲ
ル濾過によつて分離し、サツカロース6mg/mgタンパク質
を加えた後凍結乾燥する。

呈色ゾーン26: 厚さ0.1mmのポリカーボネートシート上に次の調剤で
可溶性フイルムを被覆させる： モヴイオール18/88（西独国Frankurt/M.在Hoehst社）4.
5g、 水50ml中に溶かしたオルトーニトロフエノール−β−ガ
ラクトシド0.3g。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による試験キヤリヤーのゾーン列を説明
するための原理図であり、第２図は本発明による試験キ
ヤリヤーの斜視図である： 11〜16;21〜25…試験ゾーン、２…基礎層、11,21…出発
ゾーン、14,24…複合体ゾーン、16,26…検出ゾーン、2
0,30…液体輸送区間

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロルフ・レルヒ ドイツ連邦共和国イルフエスハイム・レ ツシングシユトラーセ ４ (72)発明者 ヨアヒム・シユタインビス ドイツ連邦共和国ロルシユ・アレキサン ダーシユトラーセ 21アー (56)参考文献 特開 昭61−228354（ＪＰ，Ａ) 特公 昭63−43701（ＪＰ，Ｂ２)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２種類の生物親和性結合パートナーのうち
   第一の結合パートナーが試料中に含有されていて、第二
   の結合パートナーが試験キャリヤーの試薬系に含有され
   ており； 基礎層（２）上に大体において並置された数個の毛管活
   性試験ゾーン（11〜16,21〜25）を有し、これらのゾー
   ンが液体接触していて、毛管作用によって駆動された液
   体が出発ゾーン（11,21）から出発してそれに沿って流
   れる液体輸送区間（20,30）を形成し； この液体輸送区間が順次に、試験キャリヤーに試料を供
   給するための試料供給ゾーン（12）、１種類の生物親和
   性結合パートナーの標識複合体を含有する複合体ゾーン
   （14,24）及び検出ゾーン（16,26）を包含しておりかつ 第一結合パートナーと、第二結合パートナーを含有する
   試薬系との間で、所望の分析にとって特異的な標識物を
   形成する反応が進行しかつ前記特異的標識物が検出ゾー
   ン（16,26）で検出される 構造の前記２種類の結合パートナーの特異的結合反応に
   よって試料液を分析検査するための試験キャリヤーにお
   いて、 捕捉試薬として作用する、第一結合パートナーにとって
   特異的な第三結合パートナーが、比較的高い濃度で存在
   する第一結合パートナーの分析的検出のために使用され
   る液体輸送区間において複合体ゾーン内に又は試料供給
   ゾーンと複合体ゾーンとの間に施されており、 この第三結合パートナーが第一結合パートナーの一部を
   結合し、それによって特異的標識物を形成する反応から
   除くような大きさの使用量で、この過程が可能であるよ
   うに液体輸送区間（20,30）の一つのゾーンに配置され
   ていることを特徴とする、２種類の生物親和性パートナ
   ーの特異的結合反応によって試料液を分析検査するため
   の試験キャリヤー。