JP2025503080A - キメラポリペプチド - Google Patents

Abstract

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質であって、タンパク質が、第２のポリペプチドに連結された第１のポリペプチドを含み、Ａ）第１のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなり、Ｂ）第２のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、第２のポリペプチドが、ａ）好ましくは、切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）の配列の一部分又は全部を含まず、かつ／あるいはｂ）Ａｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応するアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む、キメラ又は融合タンパク質。
【選択図】なし

Description

本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するのに有用であるキメラポリペプチド、それを含む組成物、並びにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ関連の状態及び疾患の予防及び治療のためのそれらの使用に関する。

関連出願
本出願は、豪国仮出願第２０２２／９００１０２号からの優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

歯垢が歯肉（歯茎）の縁で歯の周りに蓄積したままでいると、歯肉の炎症（歯肉炎）を引き起こす。慢性歯肉炎により、歯周ポケットの基部に歯周病原体Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）が発生し、慢性感染症及び重度の疾患の発症をもたらす可能性がある。この重度形態の歯周病は歯周炎と呼ばれ、感染を排除する免疫系によるアプローチで歯の喪失をもたらす可能性がある。

慢性歯周炎は、歯の支持組織の炎症性疾患であり、歯槽骨の吸収及び最終的な歯の喪失をもたらす。この疾患は、全ての社会で主要な公衆衛生上の問題であり、成人人口の最大３０％が罹患しており、成人人口の１２～１５％が重度形態に罹患していると推定されている。

成人の３人に１人は中等度から重度の歯周炎を有している。疫学調査から、歯周炎は、心臓血管疾患、ある特定のがん、早産、関節リウマチ、及び認知症を含む炎症性疾患のリスクの増加に関連している。より最近の研究では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる慢性感染症を認知症及び関節リウマチと関連付けている。例えば、一研究では、アルツハイマー病（ＡＤ）脳試料の９６％が、Ｐ．ｇｉｎｉｇｖａｌｉｓの存在を示した。別の研究は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを有するマウスの慢性経口感染がヒトにおけるＡＤに関連する脳プラークをもたらし、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓプロテアーゼがアミロイド前駆体及びタウタンパク質を切断して、ＡＤに関連するプラーク及びタングル（ｔａｎｇｌｅ）を形成することができることを示す。

ＬＰＳ、線毛、血球凝集素、溶血素、及び細胞外加水分解酵素（特に、Ａｒｇ－Ｘ及びＬｙｓ－Ｘ特異的プロテイナーゼ）、別名「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン（ｇｉｎｇｉｐａｉｎ）」を含む、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの病原性に寄与するいくつかの病原性因子が報告されている。

公衆衛生問題の大きさは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対する強力な保護応答を提供するワクチン及びそれを提供する手段が必要とされるようである。

１つの問題は、選択する病原性因子が過多であるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対する強力な保護応答を得る方法が不明であることであった。

現在、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の発生率及び／若しくは重症度を予防若しくは低減する際の使用のため、又は対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染及び疾患を治療するための商業的に承認されたワクチンは存在しない。

したがって、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓワクチンの設計及び製造のための代替の、かつ／又は改善されたアプローチ、及びＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから産生される代替の、かつ／又は改善されたワクチンが必要である。

本明細書における任意の従来技術への言及は、この従来技術が任意の法域における共通の一般的な知識の一部を形成すること、又はこの従来技術が当業者によって理解され、関連するとみなされ、かつ／若しくは他の従来技術と組み合わされることが合理的に予想され得ることを、認めるか、又は示唆するものではない。

本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質を提供し、そのタンパク質が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、
Ａ）第１のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなり、
Ｂ）第２のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
第２のポリペプチドが、１つ以上の付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）の配列を含み、好ましくは、ＡＢＭが、ＤＵＦ２４３６ドメインと、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインの切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）との間のＡＢＭの一部又は全てに対応し、
好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＭＢ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
より好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、配列番号１４若しくは２０（ＡＢＭ１）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＢＭ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
最も好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１６又は配列番号１８又は配列番号１９又は配列番号２３若しくは２６、２７、２８、４３、４４、若しくは４５のうちのいずれかに記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
第２のポリペプチドが、
ａ）切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）若しくはその一部分の配列、好ましくは、配列番号１２若しくは１３に記載の配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を有するＣＡＤの配列を含まず、かつ／あるいは
ｂ）Ａｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応する、好ましくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む。

好ましくは、キメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる１つ以上の更なるポリペプチドを含む。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位を含むか、又はそれらからなる１つ以上の更なるポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端、第１のポリペプチドのＣ末端、第２のポリペプチドのＮ末端、又は第２のポリペプチドのＣ末端に位置し得る。ある特定の実施形態では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなる少なくとも２つの更なるポリペプチドが存在し得る。そのような実施形態では、２つの更なるポリペプチドは、第２のポリペプチドのＮ末端、第２のポリペプチドのＣ末端、又は第２のポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に位置し得る。

１つ以上の更なるポリペプチドは、キメラ若しくは融合タンパク質の第１若しくは第２のポリペプチドに、好ましくは５０アミノ酸以下のリンカーを介して連結され得るか、又は第１若しくは第２のポリペプチドに直接に連結され得る。

任意の実施形態では、第１のポリペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

１つ以上の更なるポリペプチドは、好ましくは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

任意の実施形態では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又はアミノ酸配列が同一である。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異種ジンジパインの活性部位に（例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの異なる株のジンジパインに）由来し得る。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異なるジンジパインに由来するアミノ酸配列を有し得る（例えば、ポリペプチドのうちの１つは、Ｋｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、Ｒｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有するか、又は代替的にポリペプチドのうちの１つは、ＲｇｐＡ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、ＲｇｐＢ由来の活性部位のアミノ酸配列を有する）。

第１の態様では、本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質を提供し、そのタンパク質が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、
Ａ）第１のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を含むか、又はそれからなり、
Ｂ）第２のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
第２のポリペプチドが、１つ以上の付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）の配列を含み、好ましくは、ＡＢＭが、ＤＵＦ２４３６ドメインと、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインの切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）との間のＡＢＭの一部又は全てに対応し、
好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＢＭ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含み、
より好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、配列番号１４若しくは２０（ＡＢＭ１）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＢＭ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含み、
最も好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１６又は配列番号１８又は配列番号１９又は配列番号２３若しくは２６、２７、２８、４３、４４、若しくは４５のうちのいずれかに記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含み、
第２のポリペプチドが、
ａ）切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）、好ましくは、配列番号１２若しくは１３に記載の配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列を有するＣＡＤの配列を含まず、
任意選択で、キメラ又は融合タンパク質が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる１つ以上の更なるポリペプチドを含む。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位を含むか、又はそれらからなる１つ以上の更なるポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端、第１のポリペプチドのＣ末端、第２のポリペプチドのＣ末端の第２のポリペプチドのＮ末端に位置し得る。１つ以上の更なるポリペプチドは、キメラ若しくは融合タンパク質の第１若しくは第２のポリペプチドに、好ましくは５０アミノ酸以下のリンカーを介して連結され得るか、又は第１若しくは第２のポリペプチドに直接に連結され得る。

任意の実施形態では、第１のポリペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

１つ以上の更なるポリペプチドは、好ましくは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

本発明の第１の態様の任意の実施形態では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又はアミノ酸配列が同一である。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異種ジンジパインの活性部位に（例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの異なる株のジンジパインに）由来し得る。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異なるジンジパインに由来するアミノ酸配列を有し得る（例えば、ポリペプチドのうちの１つは、Ｋｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、Ｒｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有するか、又は代替的にポリペプチドのうちの１つは、ＲｇｐＡ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、ＲｇｐＢ由来の活性部位のアミノ酸配列を有する）。

本発明の第１の態様の特に好ましい実施形態では、キメラ又は融合タンパク質は、４１若しくは４２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列を含むか、又はそれらからなる。

第２の態様では、本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質を提供し、そのタンパク質が、第２のポリペプチドに連結された第１のポリペプチドを含み、
Ａ）第１のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなり、
Ｂ）第２のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
第２のポリペプチドが、１つ以上の付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）の配列を含み、好ましくは、ＡＢＭが、ＤＵＦ２４３６ドメインと、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインの切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）との間のＡＢＭの一部又は全てに対応し、
好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＢＭ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
より好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１（ＡＢＭ２）、配列番号１４若しくは２０（ＡＢＭ１）、及び／又は配列番号１７若しくは２２（ＡＢＭ３）に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
最も好ましくは、１つ以上のＡＢＭが、配列番号１６、又は配列番号１８、１９、若しくは２３、又は配列番号２６、２７、２８のうちのいずれかに記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含み、
第２のポリペプチドが、
ａ）切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）又はその一部分、好ましくは、配列番号１２若しくは１３に記載の配列又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を有するＣＡＤの配列を含まず、かつ
ｂ）Ａｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応する、好ましくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む。

本明細書で使用される場合、ＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応するアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％同一の配列は、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの長さの少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である配列を指す。

好ましい実施形態では、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４に記載の配列であるか、又はそれに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列である。

最も好ましくは、第２のポリペプチドは、配列番号２６、２７、若しくは２８に記載の配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含むか、又はそれらからなる。

好ましくは、キメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を含むか、又はそれらからなる１つ以上の更なるポリペプチドを含む。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位を含むか、又はそれらからなる１つ以上の更なるポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端、第１のポリペプチドのＣ末端、第２のポリペプチドのＣ末端の第２のポリペプチドのＮ末端に位置し得る。１つ以上の更なるポリペプチドは、キメラ若しくは融合タンパク質の第１若しくは第２のポリペプチドに、好ましくは５０アミノ酸以下のリンカーを介して連結され得るか、又は第１のポリペプチドに直接に連結され得る。

任意の実施形態では、第１のポリペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

１つ以上の更なるポリペプチドは、好ましくは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

任意の実施形態では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、若しくはそれからなるか、又はアミノ酸配列が同一である。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異種ジンジパインの活性部位に（例えば、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの異なる株のジンジパインに）由来し得る。第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、異なるジンジパインに由来するアミノ酸配列を有し得る（例えば、ポリペプチドのうちの１つは、Ｋｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、Ｒｇｐ由来の活性部位のアミノ酸配列を有するか、又は代替的にポリペプチドのうちの１つは、ＲｇｐＡ由来の活性部位のアミノ酸配列を有し、他のポリペプチドは、ＲｇｐＢ由来の活性部位のアミノ酸配列を有する）。

本発明の第２の態様の特に好ましい実施形態では、キメラ又は融合タンパク質は、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列を含むか、又はそれらからなる。

本発明の任意の態様の任意の実施形態では、キメラ又は融合タンパク質は、本明細書に定義される第１及び第２のポリペプチドの配列からなるか、又はそれらから本質的になる。したがって、キメラ又は融合タンパク質は、天然に存在するジンジパインポリタンパク質配列におけるそれらのドメインの構成とは異なるドメインの配置又は構成を含むことが理解されるであろう。換言すれば、第１及び第２のポリペプチド及びそれにおけるドメインは、天然に存在するジンジパインポリタンパク質と異なる空間構成を有する。

本発明の任意の態様の任意の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは連結されている。第１及び第２のポリペプチドは、直接、リンカーを介して、又は１００アミノ酸以下、好ましくは５０アミノ酸以下のポリペプチド配列を介して連結され得る。好ましくは、第１及び第２のポリペプチドは、直接連結されているか、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸以下によって連結されている。最も好ましくは、第１及び第２のポリペプチドは、直接結合されている。

本発明の任意の態様の任意の実施形態では、第１のポリペプチドのＣ末端残基は、直接、リンカーを介して、又は５０アミノ酸以下のポリペプチド配列を介して、第２のポリペプチドのＮ末端残基に連結され得る。代替的には、第１のポリペプチドのＮ末端残基は、直接、リンカーを介して、又は５０アミノ酸以下のポリペプチド配列を介して、第２のポリペプチドのＣ末端残基に連結され得る。

本発明の任意の態様では、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインに由来するＤＵＦ２４３６ドメイン（存在する場合）及びＡＢＭドメインは、直接連結され得るか、又はリンカーを介して若しくはポリペプチド配列を介して接続され得る。好ましくは、ＤＵＦ２４３６及びＡＢＭドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸を含む短いリンカー配列を介して連結されている。特に好ましい実施形態では、ＤＵＦドメイン及びＡＢＭドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５アミノ酸以下の短いリンカー配列を介して連結されている。

好ましい実施形態では、ＤＵＦ２４３６及びＡＢＭドメイン（それぞれ、配列番号２４又は２５及び１８の代表的なアミノ酸配列を有するは、アミノ酸配列ＥＶＥＤＤＳＰを有するペプチド配列を介して連結され得る。

任意の実施形態では、更なるポリペプチドは、第１及び第２のポリペプチドを含むキメラ又は融合タンパク質に直接又はリンカーを介して接続され得る。更なるポリペプチドが、第２のポリペプチドを介して融合タンパク質のＣ末端領域に接続されている実施形態では、好ましくは、第２のポリペプチドのＣ末端は、更なるポリペプチドのＮ末端に直接接続されている。（例えば、付着因子ドメインのＣ末端は、好ましくは、活性部位アミノ酸配列のＮ末端に直接接続されている）。

本発明の任意の態様の任意の実施形態では、リンカー領域は、１５アミノ酸以下、好ましくは２アミノ酸超のアミノ酸配列である。溶解性に最小限の影響を及ぼすものを含む、タンパク質構築物における使用のための好適なリンカーは、当該技術分野で既知である。有用なリンカーとしては、当該技術分野で周知であり、様々な順序で組み合わされたグリシン及びセリン単位を含む、グリシン－セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーが挙げられる。例として、（ＧＳ）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎが挙げられるが、これらに限定されず、ｎは少なくとも１の整数、典型的には１～約１０、例えば１～約８、１～約６、又は１～約５の整数である。他の有用なリンカーとしては、ＤＳＳＧ、ＤＳＳＧＡＳ、ＫＬＤＳＳＧ、又は本明細書に記載の他のものが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカー領域は、天然ジンジジパイン（ｇｉｎｇｉｇｉｐａｉｎ）タンパク質配列に由来し得る。

本発明はまた、本明細書に定義されるキメラ又は融合タンパク質をコードする核酸も提供する。

好ましくは、核酸は、本明細書の表１に定義されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ以上をコードするヌクレオチド配列を有する。

任意の実施形態では、そのような核酸は、核酸がプロモーターに作動可能に連結されている発現構築物に含まれる。そのような発現構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、又はウイルスベクターにあり得る。

本発明はまた、本明細書に記載の核酸又は核酸ベクターを含む細胞を提供する。本発明の細胞の例としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞が挙げられる。好ましくは、細胞は、単離されているか、実質的に精製されているか、又は組換えられている。

本発明はまた、任意選択で薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載のキメラ又は融合タンパク質を含む組成物を提供する。

組成物はまた、キメラ又は融合タンパク質に対する免疫応答を増強するためのアジュバントを含み得る。

したがって、本発明は、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのワクチン又は免疫刺激組成物であって、組成物が、
ｉ）本明細書に記載のキメラ又は融合タンパク質の形態の免疫原と、
ｉｉ）対象における免疫原に対する免疫応答を増強するためのアジュバントと、を含む、ワクチン又は免疫刺激組成物を更に提供する。

好ましくは、本発明の組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物に提供される唯一の免疫原は、本明細書に記載のキメラ又は融合タンパク質である。

本発明はまた、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するための方法であって、方法が、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与することを含む、方法を提供する。

本発明はまた、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する体液性免疫応答を誘導する方法であって、方法が、対象に、本明細書で定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与することを含む、方法を提供する。

好ましくは、誘導される免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答からＴｈ２免疫応答への切り替えを含む。

任意の実施形態では、本明細書に記載のキメラ若しくは融合タンパク質（又はそれらを含むワクチン若しくは他の組成物）の投与によって誘発される免疫応答は、好ましくは、抗原特異的であることが理解されるであろう。したがって、好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法並びに組成物及びキメラタンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン抗原に対する免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するためのものである。

任意の実施形態では、本発明の組成物、キメラタンパク質、及び方法は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する対象の免疫応答（例えば、防御免疫応答）を強化するためのものであり得る。

本発明はまた、対象に、本明細書で定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与することを含む、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化する方法を提供する。

任意の実施形態では、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、又はそれらを含む組成物若しくはワクチンを受けたか、若しくは投与された対象は、タンパク質、組成物、又はワクチンを受けていない対象と比較して、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる感染に対する保護レベル、又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の１つ以上の症状の重症度の増加を有する。

なお更に、本発明は、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療する方法であって、方法が、それを必要とする対象に、本明細書で定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与し、それによって、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療することを含む、方法を提供する。

本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる感染に関連する症状の重症度を低減するか、又は最小限に抑えるための方法であって、それを必要とする個体に、本明細書に定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与することを含み、症状が、腫れた（ｓｗｏｌｌｅｎ）又は腫れた（ｐｕｆｆｙ）歯茎、出血しやすい歯茎、後退した歯茎、歯周りの歯周ポケット、歯の支持組織（歯周靭帯、セメント質、及び／又は歯槽骨）の喪失、歯茎と歯との間の膿、並びに歯肉炎からなる群から選択される、方法を提供する。

本発明はまた、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ関連疾患を治療するための方法であって、方法が、それを必要とする個体に、本明細書で定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ関連疾患は、歯周病を含む。

本発明は、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物の投与を含む治療方法はまた、抗菌化合物、抗炎症剤のうちの１つ以上の投与を含み得ることを提供する。

本発明はまた、
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答（好ましくは、防御免疫応答）を誘導するか、
●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化するか、
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療するか、
●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の１つ以上の症状の重症度を最小限に抑えるか、若しくは低減するか、又は
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ関連疾患を治療する際の使用のための医薬品の製造における、本明細書で定義されるキメラ又は融合タンパク質の使用を提供する。

本発明はまた、
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答（好ましくは、防御免疫応答）を誘導するか、
●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化するか、
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療するか、
●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の１つ以上の症状の重症度を最小限に抑えるか、若しくは低減するか、又は
●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ関連疾患を治療する際の使用のための、本明細書で定義されるキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン又は免疫刺激組成物を提供する。

本発明による使用のための任意の方法、使用、又はタンパク質、組成物、若しくはワクチンでは、対象は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに感染しているか、又は感染するリスクがある任意の対象であり得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに感染しているか、又は感染するリスクがあるペットなどの獣医学的対象であり得る。

本発明はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を得るための方法であって、方法が、非ヒト動物に、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与し、それによって、動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成することを含む、方法を提供する。好ましくは、本方法は、抗体を動物から（例えば、動物の血液から抽出する）、又はその卵から（動物が鳥類種、好ましくはニワトリである場合）単離することを更に含む。

本発明はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を含む抗体調製物であって、抗体調製物が、非ヒト動物に、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与し、それによって、動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成すること、及び動物又はその卵から抗体を単離することによって得られる、抗体調製物を提供する。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を排除若しくは低減するために治療的に、又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の重症度を予防又は低減するために予防的に、使用され得る。

本発明はまた、本明細書で定義されるキメラ又は融合タンパク質を含む組成物を含むキットであって、任意選択で、キットが、１つ以上のサイトカイン及び／又はアジュバントを密封された容器中に含む、キットも提供する。

好ましくは、キットは、組成物が個体を免疫化するために使用されることを示すラベル又は添付文書を含み、任意選択で、ラベル又は添付文書は、使用説明書を含む。

本明細書全体にわたって、別途文脈が要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語句は、記載されたステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を包含するが、任意の他のステップ若しくは要素又はステップ若しくは要素の群を除外しないことを意味することが理解されるであろう。したがって、「含む」などの用語の使用は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素が任意選択であり、存在しても存在しなくてもよいことを示す。「からなる」とは、「からなる」という句に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という句は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在していなくてもよいことを示す。「から本質的になる」とは、句の後に列挙された任意の要素を含み、列挙された要素について本開示で特定された活性又は作用を妨げないか、又はそれに寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という句は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素（例えば、ポリペプチド配列のＮ末端又はＣ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２０個超の追加のアミノ酸残基）が任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を与えるかどうかに応じて、存在してもしなくてもよいことを示す。

本発明の更なる態様及び前述の段落に記載の態様の更なる実施形態は、例として与えられ、添付の図面を参照した以下の説明から明らかになるであろう。

Ａ．マウス歯周炎モデル－治療用ワクチン接種。Ｂ．本発明のキメラ又は融合タンパク質を生成するための、Ｋｇｐジンジパインポリタンパク質及びそれに由来する構成要素のドメイン構造を示す概略図。 （上記の通り。） Ａ．Ｋ１ドメインの有するか、又は有しない、全長又は切断されたＤＵＦドメインのいずれかを含有する組換えバリアントを発現するＥ ｃｏｌｉ画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ。低温及び低ＩＰＴＧ条件を使用した。全長ＤＵＦは、溶解性に重要である。全長Ｋ１は、溶解性に悪影響を及ぼす。Ｂ．ＤＴＴの非存在の存在下でのキメラ構造ＫＤＡ及びＫＤＡＫ１のネイティブＰＡＧＥ。ＫＤＡへのＫ１ドメインの付加は、溶解性を低減させる。 骨損失研究。統計分析－一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ＤｕｎｎｅｔのＴ３。＃は対照負荷群とは有意に異なる。 熱殺傷されたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ全細胞に対する抗原の抗体アイソタイプ応答（個々の血清）。ナイーブ＝対照非負荷。Ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ＝Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓでの対照負荷。キメラ＝ＫＤｃＡＫ１ｎ抗原。Ａｍｏｘ＝アモキシシリン。 骨損失研究の統計分析－一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ＤｕｎｎｅｔのＴ３。＃ｐ＜０．０１、＃＃ｐ＜０．０５（Ｔ検定）は、対照負荷群とは有意に異なる。 骨損失研究。Ｓ＝可溶性画分、尿素＝精製に使用された尿素、ＡＣ＝親和性カラム精製、ＩＢ＝封入体、バッチ＝バッチ精製方法。統計分析：一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ＤｕｎｎｅｔのＴ３。＃ｐ＜０．０１は、対照負荷群とは有意に異なる。 様々な融合タンパク質構築物を用いた動物の免疫化後の骨損失研究研究。統計分析：一元配置ＡＮＯＶＡ及び事後ＤｕｎｎｅｔのＴ３ 対照負荷群とは有意に異なる＃ｐ＜０．０５＃＃ｐ＜０．０１＃＃＃ｐ＜０．００１＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。

配列情報

本明細書に開示及び定義された本発明は、テキスト又は図面から言及されるか、又は明らかな個々の特徴の２つ以上の選択的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの種々の組み合わせの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。

本発明のある特定の実施形態について詳細に言及する。本発明は実施形態と併せて説明されるが、本発明をそれらの実施形態に限定する意図ではないことが理解されるであろう。逆に、本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変物、及び同等物を網羅することが意図される。

当業者は、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載のものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、決して、説明される方法及び材料に限定されない。本明細書に開示及び定義された本発明は、テキスト又は図面から言及されるか、又は明らかな個々の特徴の２つ以上の選択的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの種々の組み合わせの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。

本明細書で参照される特許及び刊行物の全ては、それらの全体が参照により組み込まれる。

本明細書を解釈する目的で、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆もまた同様である。

本発明に至る作業において、本発明者らは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導する際の使用のための様々なキメラ又は融合タンパク質、及びワクチン候補としての使用のためのそのようなキメラの大規模な産生のための方法を調査した。

本発明者らは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインの構成要素に由来するキメラ又は融合タンパク質の大規模な製造及び産生に関連する様々な問題を特定した。第一に、従来技術に記載のキメラ又は融合タンパク質は、可溶性タンパク質として、十分に多い量で産生することが困難である。より具体的には、従来技術のキメラタンパク質は、典型的には、Ｅ．ｃｏｌｉの封入体内で産生されるため、下流の臨床製品開発のために大量の可溶性タンパク質を産生することが困難である。

Ｅ．ｃｏｌｉで産生された場合の溶解性の低減はまた、製造の時間及び規模、並びに一度可溶化され、封入体から再折り畳まれたタンパク質の安定性の低下にも実質的に寄与する。

したがって、本発明は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導する際の使用のためのキメラ又は融合タンパク質の改善された設計、並びにそれを含む方法及び使用に関する。

任意の実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、従来技術に記載のキメラ又は融合タンパク質と比較して、改善された溶解性及び／又は安定性を有する。改善された溶解性及び／又は安定性は、臨床環境における使用のための融合タンパク質の大規模な産生に関して大きな利点を提供する。

代替の実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、従来技術のキメラ又は融合タンパク質と比較して、凝集する傾向の低減を有する。凝集は、治療用／予防用タンパク質の大規模な製造及び産生を妨げ得る。その結果、本発明のキメラタンパク質の凝集の傾向の低減は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導する際の使用のための従来技術のキメラタンパク質よりも大きな改善をもたらす。

なお更に、任意の実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、従来技術のキメラ又は融合タンパク質と比較して増加した免疫原性を有する。

したがって、本発明者らは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質を得るための様々な新しいアプローチを特定しており、これにより、従来技術よりも１つ以上の利点を有するキメラ又は融合タンパク質がもたらされる。

本発明者らは、本明細書に記載のように、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質を生成するための新しいアプローチのうちの１つ以上が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するための好適な免疫原性組成物の製造の容易さの増加、貯蔵寿命の改善、及び／又は免疫原性の改善を含む利点をもたらし得ると考えている。

ジンジパイン
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの病原性は、とりわけ、システインプロテイナーゼ（ジンジパイン）、線毛、ヘム結合タンパク質、及び外膜輸送タンパク質を含む多数の表面関連病原性因子に起因する。特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの細胞外Ａｒｇ及びＬｙｓ特異的プロテイナーゼ「ジンジパイン」（ＲｇｐＡ／Ｂ及びＫｇｐ）は、コロニー形成、宿主組織への浸透、免疫応答の調節不全、生体異常、及び疾患に重要である主要な病原性因子として関与している。

ジンジパイン、特にＬｙｓ特異的プロテイナーゼＫｇｐは、マウス歯周炎モデルにおいて歯槽骨吸収を誘導するためにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにとって不可欠である。ジンジパインはまた、重度の歯周炎の部位の歯肉組織において、歯肉下プラークの近位で高濃度で、及び歯肉組織のより深い遠位の部位でより低濃度で見出されている。Ｌｙｓ特異的及びＡｒｇ特異的プロテイナーゼは、インビトロで様々な宿主タンパク質、例えば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、及びラミニンを分解することが示されている。血漿宿主防御及び調節プロテイナーゼ阻害剤α－トリプシン、α２－マクログロブリン、抗キモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、及びアンチプラスミンもまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来のＬｙｓ－及びＡｒｇ－プロテイナーゼによって分解される。これは、慢性歯周炎の発症においてＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが果たす重要な役割を説明するための説得力のある機構の開発に至った。

ＲｇｐＡ、ＲｇｐＢ、及びＫｇｐ遺伝子は全て、約２２アミノ酸長のＮ末端シグナルペプチド、約２００アミノ酸長の異常に長いプロペプチド、及び約４８０アミノ酸の触媒ドメインをコードする。触媒ドメインのＣ末端は、付着因子結合ドメイン（ＡＢＭ、又は５つの異なる配列が記載されている）、「未知の機能のドメイン」（未知の機能の保存されたＰｆａｍドメインとして定義されるＤＵＦ２４３６と称される、ＩＰＲ０１８８３２）、及びＣ末端付着因子ドメイン又は切断された付着因子ドメイン（又はＣＡＤ）から構成される大きな血球凝集素付着因子（ＨＡ）ドメインである。ＡＢＭ、ＤＵＦ、及びＣＡＤの特定の配置は、ＫｇｐとＲｇｐＡ／Ｂとの間で変化する。

Ｋｇｐポリタンパク質におけるドメインの構造を図１Ｂに示す。例えば、Ｋｇｐは、（Ｎ末端からＣ末端へ）触媒ドメイン、第１のＡＢＭ（ＡＢＭ１）、ＤＵＦ２４３６、ＡＢＭ２、ＡＢＭ１、ＡＢＭ３を含むドメイン、２つのＣＡＤドメイン（Ｋ１及びＫ２と称される）、ＡＢＭ２及びＡＢＭ１を含む更なるドメイン、更なるＣＡＤドメイン（Ｋ３と称される）、ＡＢＭ２、並びにＣ末端ドメインを含む。

本明細書で使用される場合、ＡＢＭ１、２、及び３への言及は、概して、図１Ｂに示されるように、ＫｇｐのＤＵＦ２４３６の直前のＣ末端の配列におけるＡＢＭ２、ＡＢＭ１、及びＡＢＭ３の順序で見出されるＡＢＭを指すと理解されるであろう。

ＲｇｐＢ及びＲｇｐＡの触媒ドメインは、高度な配列相同性を共有する。しかしながら、ＲｇｐＢは、ＨＡドメインを欠き、外膜上に単量体形態で位置する。ＨＡドメインのうちのいくつかは、Ｃ末端付着因子ドメイン又は切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）として代替的に記載されており、いくつかは、ＤＵＦ（「未知の機能のドメイン」）２４３６ドメイン（未知の機能の保存されたＰｆａｍドメイン、ＩＰＲ０１８８３２）である。

ＲｇｐＡ及びＫｇｐ前駆体タンパク質は、非共有結合で会合したままの複数のドメインに切断され、大きな外膜タンパク質複合体を形成する。したがって、インビボでは、Ａｒｇ及びＬｙｓ特異的プロテイナーゼは、非共有結合で会合したプロテイナーゼ及び付着因子の細胞関連複合体に見出される。そのような複合体の１つは、ＲｇｐＡ－Ｋｇｐプロテイナーゼ－付着因子複合体（以前はＰｒｔＲ－ＰｒｔＫプロテイナーゼ－付着因子複合体と称されていた）と指定されている。複合体は、４５ｋＤａのＡｒｇ特異的カルシウム安定化システインプロテイナーゼ及び７つの配列関連付着因子ドメインから構成されている、

本明細書で使用される場合、Ｌｙｓ－ジンジパイン触媒ドメインはまた、ＫＡＳドメイン又はＰＡＳドメインとも称され得る。本明細書で使用される場合、Ａｒｇ－ジンジパイン触媒ドメインはまた、ＲＡＳドメイン又はＰＡＳドメインとも称され得る。典型的には、Ｌｙｓ－ジンジパイン又はＡｒｇ－ジンジパインの触媒ドメインは、タンパク質のＮ末端約４８０アミノ酸領域に位置する。触媒ドメイン内の活性部位は、典型的には、アミノ酸残基４２６～４４６（ＲｇｐＡの場合）及び４３２～４５３（Ｋｇｐの場合）に位置する。触媒ドメイン内に見出される例示的な活性部位ペプチドは、配列番号１～１１として表１に記載されている

本明細書で使用される場合、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインは、典型的には、触媒ドメイン又は活性部位ドメインのＣ末端であるＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの領域を指すと理解されるであろう。付着因子ドメイン（ＨＡドメインとも称される）は、典型的には、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ）ドメイン（特に、ＤＵＦ２４３６ 未知の機能の保存されたＰｆａｍドメイン、ＩＰＲ０１８８３２）、並びにいくつかの付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）ドメイン及び切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）を含む。

第１のポリペプチド
本発明のキメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－Ｘ又はＬｙｓ－Ｘプロテイナーゼ（それぞれ、本明細書においてＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインとも称される）の活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなる第１のポリペプチドを含む。

任意の実施形態では、第１のポリペプチドは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

免疫原性の改善
好ましくは、キメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる１つ以上の更なるポリペプチドを含む。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位を含むか、又はそれらからなる１つ以上の更なるポリペプチドは、第１のポリペプチドのＮ末端、第１のポリペプチドのＣ末端、第２のポリペプチドのＮ末端、又は第２のポリペプチドのＣ末端に位置し得る。１つ以上の更なるポリペプチドは、キメラ若しくは融合タンパク質の第１若しくは第２のポリペプチドに、好ましくは５０アミノ酸以下のリンカーを介して連結され得るか、又は第１のポリペプチドに直接に連結され得る。

１つ以上の更なるポリペプチドは、好ましくは、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる：配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列。

任意の実施形態では、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第１のポリペプチド及び更なるポリペプチドは、同一のアミノ酸配列、又は互いに少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である配列を含むか、又はそれからなる。

好ましい実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる２つ以下、又は３つ以下、又は４つ以下のポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる５つ未満、より好ましくは４つ未満、最も好ましくは３つ未満のポリペプチドを有する。

第２のポリペプチド
本発明のキメラ又は融合タンパク質は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇＸ又はＬｙｓ－Ｘプロテイナーゼの付着因子ドメインのアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる第２のポリペプチドを含む。

第２のポリペプチドは、典型的には、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇＸ又はＬｙｓ－Ｘプロテイナーゼの付着因子ドメイン（Ｋｇｐ及びＲｇｐＡなど）において認識されるドメイン／モチーフである付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）のうちの１つ以上に対応する少なくとも配列を含むことが理解されるであろう。

Ｋｇｐ及びＲｇｐＡについて定義されている５つのＡＢＭが存在する（ＡＢＭ１～５）。これらのＡＢＭの例示的な配列を表１に記載する。

典型的には、第２のポリペプチドは、２つ以上のＡＢＭを含み、好ましくは、第２のポリペプチドは、少なくともＡＢＭ１及びＡＢＭ２、又はＡＢＭ１若しくはＡＢＭ２の各々に対して少なくとも８０％同一の配列を含む。第２のポリペプチドはまた、ＡＢＭ３の配列又はそれに対して少なくとも８０％同一の配列を含み得る。

また、第２のポリペプチドにおけるＡＢＭペプチドの配置は、天然に存在する付着因子ドメインに見られるＡＢＭペプチドの配置に対応する必要はないことが理解されるであろう。例えば、ＡＢＭペプチドは、配列（Ｎ末端からＣ末端へ）ＡＢＭ１、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３などで第２のポリペプチドに配置され得る。代替的には、ＡＢＭペプチドは、Ｋｇｐの付着因子ドメイン１に存在するように、ＡＢＭ２、ＡＢＭ１、及びＡＢＭ３などの天然に存在する付着因子ドメインにおける配置を反映するように配置され得る。

なお更に、第２のポリペプチドにおけるＡＢＭは、隣接して配置され得るか、又は５０アミノ酸以下のアミノ酸配列によって互いに分離され得る。当業者であれば、本発明のキメラ又は融合タンパク質の設計において、ＡＢＭ間の間隔は重要ではないことを理解するであろう。

任意の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。

任意の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。

任意の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１８若しくは２３に記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。

任意の実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号２６、２７若しくは２８、若しくは４３、４４、若しくは４５に記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の配列を含む。

本発明者らは、キメラ又は融合タンパク質における使用のために天然に存在するジンジパインに見られる様々なドメインを単純に選択することを含む従来技術の方法が、典型的には、組換え系において低発現であり、不溶性タンパク質として発現する傾向を有するタンパク質（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの封入体において）の生成をもたらすことを立証した。

本明細書の実施例を参照すると、本発明者らは、配列番号１３に記載の配列（すなわち、ＣＡＤドメインの切断された形態）が、Ｋｇｐポリタンパク質がどのようにタンパク質分解的に処理され、細胞表面上に組み立てられるかを表すことを認識した。したがって、そのような配列の包含は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答の誘導に重要であると考えられた。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、この配列が存在する場合、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された場合の組換えタンパク質の溶解性の低下及び封入体の形成に寄与したことを見出した。

発明者らは、融合タンパク質にＣＡＤの完全な配列を含めることによって、この問題を修正しようとした。驚くべきことに、これは溶解性を改善せず、実際にはより低い溶解性に寄与した。

したがって、本発明者らは、１つ以上の切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）又はその一部分に対応する配列の包含は、提案されているジンジパイン配列に由来するキメラタンパク質及びワクチン組成物の溶解性の低減に寄与することを見出した。

したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、第２のポリペプチドは、配列番号１３に記載の配列、又はそれに対して少なくとも８０％同一の配列を含まない。

代替的には、第２のポリペプチドは、配列番号１２に記載の配列、若しくはそれに対して少なくとも８０％同一の配列又はそれらの一部分を含まない。

本発明者らはまた、本発明のキメラ又は融合タンパク質がＤＵＦ２４３６ドメインの一部分のみ（すなわち、Ｎ末端が切断されたＤＵＦ２４３６ドメイン）を含む場合、本発明のキメラ又は融合タンパク質の溶解性が低下することを見出した。

本明細書の実施例を参照すると、本発明者らは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓワクチン設計に対する従来技術のアプローチには、Ｎ末端が切断された形態のＤＵＦ２４３６ドメインが含まれることを認識した。切断されたＤＵＦ２４３６ドメインは、Ｋｇｐポリタンパク質がどのようにタンパク質分解的に処理され、細胞表面上に組み立てられるかを表すが、本発明者らは、ＤＵＦ２４３６ドメインの全長の配列（すなわち、ＤＵＦ２４３６ドメインのＮ末端部分を含む）を提供することが、可溶性組換えタンパク質の産生を実質的に改善することを見出した。

したがって、好ましい実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質における第２のポリペプチドは、ＤＵＦ２４３６ドメインの残基１～３７を含み、好ましくは、キメラタンパク質は、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応するアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む。

本明細書で使用される場合、ＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応するアミノ酸配列、又はそれに対して少なくとも８０％同一の配列は、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの長さの少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である配列を指す。

好ましくは、ＤＵＦ２４３６ドメインは、配列番号２４に記載の配列、又はそれに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列を含む。

第１及び第２のポリペプチドの連結
本発明のキメラ又は融合タンパク質では、第１のポリペプチドのＣ末端残基は、第２のポリペプチドのＮ末端残基（付着因子ドメインポリペプチドに対応する）に共有結合されてもよく、又は第１のペプチドのＮ末端残基は、第２のポリペプチドのＣ末端残基（付着因子ドメインポリペプチドに対応する）に共有結合されてもよい。この配置では、第１のペプチド及び付着因子ドメインポリペプチドは、「直接連結されている」又は「隣接している」と言われる。

他の実施形態では、キメラ又は融合タンパク質は、第１のペプチドを付着因子ドメインポリペプチドに連結するためのリンカーを含む。リンカーは、アミノ酸及び非アミノ酸リンカーの両方を含む、ペプチドをポリペプチドに接続することができる任意のリンカーであり得る。

好ましくは、リンカーは、非免疫原性である。典型的には、リンカーは、アミノ酸から構成され、したがって、ペプチドリンカーと称され得る。

リンカーは、通常、最大２０アミノ酸の長さを有するペプチドであるが、より長くてもよい。「に連結された」又は「に融合された」という用語は、２つの部分の間に形成された共有結合、例えば、ペプチド結合を指す。したがって、本発明の文脈において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２アミノ酸以上の長さを有し得る。例えば、本明細書に提供されるキメラ又は融合タンパク質は、第２のポリペプチドのＮ末端と第１のポリペプチドのＣ末端との間のような、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパイン活性ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる第１のポリペプチドと、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓジンジパインの付着因子ドメインに対応する第２のポリペプチドとの間にリンカーを含み得る。そのようなリンカーは、融合タンパク質の異なるポリペプチドが独立して折り畳まれ、予想どおりに作用する可能性を高めることができるという利点を有する。好適なリンカーは、最大５０アミノ酸長であり得るが、２０アミノ酸未満、１５アミノ酸未満、又は５アミノ酸未満が好ましい。リンカーは、第１のペプチド及び付着因子ドメインポリペプチドを、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓトリプシン様酵素において通常観察されるよりもより近い空間配置にするように機能し得る。代替的には、それは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド（付着因子ドメインポリペプチドに対応する）に間隔を空け得る。

溶解性に最小限の影響を及ぼすものを含む、タンパク質構築物における使用のための好適なリンカーは、当該技術分野で既知である。リンカーは、当業者に既知の任意のリンカーであり得、柔軟性リンカー（グリシン及びセリン残基の反復を含むものなど）、剛性リンカー（グルタミン酸及びリジン残基、隣接するアラニンの反復を含むものなど）、及び／又は切断可能なリンカー（プロテアーゼ切断による感受性である配列など）であり得る。そのようなリンカーの例は、当業者に既知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５：１３５７－１３６９に記載されている。

有用なリンカーとしては、当該技術分野で周知であり、様々な順序で組み合わされたグリシン及びセリン単位を含む、グリシン－セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーが挙げられる。例として、（ＧＳ）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎが挙げられるが、これらに限定されず、ｎは少なくとも１の整数、典型的には１～約１０、例えば１～約８、１～約６、又は１～約５の整数である。

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、様々な長さ及び組み合わせのアミノ酸グリシン及びセリンを含み得る。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＳ）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＳ）、又はＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）及びそれらのバリエーション又は反復を含み得る。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（６アミノ酸長のリンカー）又はそれ以上を含み得る。リンカーは、異なる長さのグリシン及びセリン残基（ＧＳ）の一連の反復、すなわち、（ＧＳ）ｎであり、ｎは、１～１５以上の任意の数であり得る。例えば、リンカーは、（ＧＳ）３（すなわち、ＧＳＧＳＧＳ）又はより長い（ＧＳ）１１又はそれ以上であり得る。ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上を含む任意の数であり得ることが理解されるであろう。そのような長さのリンカーを有する融合タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。同様に、リンカーは、セリン残基によって分離された一連の反復のグリシン残基であり得る。例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（すなわち、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）３を含み得る。）及びそのバリエーションである。

一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（６アミノ酸長のリンカー）又はそれ以上を含み得る。リンカーは、異なる長さのグリシン及びセリン残基（ＧＳ）の一連の反復、すなわち、（ＧＳ）ｎであり、ｎは、１～１５以上の任意の数であり得る。例えば、リンカーは、（ＧＳ）３（すなわち、ＧＳＧＳＧＳ）又はより長い（ＧＳ）１１又はそれ以上であり得る。ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１以上を含む任意の数であり得ることが理解されるであろう。

他の有用なリンカーとしては、ＤＳＳＧ、ＤＳＳＧＡＳ、ＫＬＤＳＳＧ、及びそれらのバリエーションが挙げられる。他の好適なリンカーの例は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６５：１３５７－１３６９に記載されている。

キメラ又は融合タンパク質及び組換えタンパク質
本発明のキメラ又は融合タンパク質は、多くの従来の技術のうちのいずれかによって調製され得るが、典型的には、ポリペプチドは、組換え技術を使用して作製される。

組換えポリペプチドの場合、所望のペプチドをコードするＤＮＡ断片を、周知の分子遺伝子技術を使用して適切なベクターにサブクローニングすることができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９を参照されたい）。断片は、インビトロで転写され得、続いて、ポリペプチドが翻訳され得る。市販のキットもまた用いられ得る（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．などによって製造されたものなど）。ポリメラーゼ連鎖反応は、任意選択で、核酸の操作において用いられ得る。

「断片」は、本明細書に記載のアッセイを使用して決定され得る、ポリペプチドと実質的に同様の機能的活性又は実質的に同じ生物学的機能若しくは活性を保持する本発明のポリペプチドの一部分である。

ポリペプチド配列、すなわち、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」又は「同一性パーセント（％）」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、配列同一性の一部分として任意の保存的置換を考慮しない、本発明の特定のポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。本明細書における、列挙される配列に対する「少なくともｘ％の配列同一性」を有するバリアントへの言及は、バリアントが、列挙される配列に対して少なくともｘ％同一であることを意味する。

本発明の様々な態様及び実施形態では、定義されたポリペプチドは、参照配列に対して少なくとも８０％の相同性又はそれ以上を有するバリアントを参照することによって記載される。相同性パーセンテージ（％）は、概して、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、配列同一性の一部分として任意の保存的置換を考慮しない、本発明の特定のポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される、本明細書で定義される本発明のポリペプチドを指す。

アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは、多くの場合互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換のうち、グリシン及びアラニンが互いに置換するために使用され（それらが比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシン、及びイソロイシンが互いに置換するために使用される（それらが疎水性であるより大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。多くの場合、互いに置換され得る他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びにシステイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。

この性質の置換は、多くの場合「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と称される。

アミノ酸の欠失又は挿入はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓタンパク質の天然配列に対して行われ得る。したがって、例えば、ポリペプチドの活性に実質的な影響を及ぼさない、又は少なくともそのような活性を排除しないアミノ酸が欠失され得る。そのような欠失は、ポリペプチドの全長及び分子量を低減しながらも依然として活性を保持することができるため、特に長いポリペプチドでは有利であり得る。これにより、特定の目的に必要なポリペプチドの量が低減され得、例えば、投薬量レベルが低減され得る。

天然ポリペプチドの配列に対するアミノ酸挿入も行われ得る。これは、本発明における使用のためのポリペプチドの特性を変化させるために行われ得る（例えば、抗原性を向上させるために）。

アミノ酸の変化は、任意の好適な技術を使用して、例えば、部位特異的変異誘発又は固相合成を使用して行われ得る。

本発明の範囲内のアミノ酸置換又は挿入は、天然に存在する又は非天然のアミノ酸を使用して行われ得ることを理解されたい。天然又は合成アミノ酸が使用されるか否かにかかわらず、Ｌ－アミノ酸のみが存在することが好ましい。

当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズム（以下に記載の非限定的な例）を含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。アミノ酸配列がアラインメントされる場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ）、それとの（ｗｉｔｈ）、又はそれに対する（ａｇａｉｎｓｔ）所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセント（代替的には、所与のアミノ酸配列Ｂに対して（ｔｏ）、それと（ｗｉｔｈ）、又はそれに対して（ａｇａｉｎｓｔ）、ある特定のアミノ酸配列同一性パーセントを有するか、又は含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、以下のように計算され得る：アミノ酸配列同一性パーセント＝Ｘ／Ｙ１００、式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムの又はアルゴリズムのＡ及びＢのアラインメントによって同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性パーセントは、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性パーセントと等しくない。

同一性パーセントを計算する際、典型的には正確な一致が計数される。２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７にあるように改変されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。比較目的でギャップアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０における）を利用することができる。代替的には、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）上記を参照されたい。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）の既定パラメータが使用され得る。アラインメントは、調査によって手動で実施されてもよい。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸又はＤＮＡ配列の全体をアラインメントさせ、したがって、全アミノ酸配列の配列保存についてのデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、ベクターＮＴＩプログラムスイートのＡＬＩＧＮＸモジュール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などのいくつかの市販のＤＮＡ／アミノ酸分析ソフトウェアパッケージにおいて使用される。ＣｌｕｓｔａｌＷでのアミノ酸配列のアラインメント後、アミノ酸同一性パーセントが評価され得る。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの分析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例は、ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）又はＪａｌＶｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊａｌｖｉｅｗ．ｏｒｇ／）である。ＧＥＮＥＤＯＣ（商標）は、複数のタンパク質間のアミノ酸（又はＤＮＡ）類似性及び同一性の評価を可能にする。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、９６８５Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の一部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティ、及び４のギャップペナルティが使用され得る。

ポリペプチドは、所望により、アミノ末端及びカルボキシル末端を含む。ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、又はＤ－アミノ酸とＬ－アミノ酸との混合物を含み得る。しかしながら、アミノ酸のＤ型は、Ｄ－アミノ酸から構成されたポリペプチドがインビボでその生物学的活性をより大きく保持すると予想されるため、特に好ましい。

本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、ペプチド中の天然配列に存在するアミノ酸を、類似の立体特性を有する天然に存在する若しくは非天然のアミノ酸又はペプチド模倣物に置き換えることを指す。置換される天然アミノ酸の側鎖が極性又は疎水性のいずれかである場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体特性を有することに加えて）極性若しくは疎水性でもある天然に存在するアミノ酸、非天然のアミノ酸、又はペプチド模倣部分である必要がある。

機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換表は、当業者に周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換であると考えられ得るアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

天然に存在するアミノ酸は、典型的には、それらの特性に従って群化されるため、立体的に類似した非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換が保存的置換とみなされるという事実に留意して、天然に存在するアミノ酸による保存的置換が決定され得る。非天然アミノ酸による保存的置換を作製するために、当該技術分野で周知のアミノ酸類似体（合成アミノ酸）を使用することも可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣物は、当業者に既知の文献に十分に記載されており、非天然（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌ）又は非天然（ｕｎｎａｔｕｒａｌ）アミノ酸については、以下に更に記載される。保存的置換に影響を及ぼす場合、置換アミノ酸は、元のアミノ酸と同じ又は類似の官能基を側鎖に有する必要がある。

本明細書で使用される「非保存的置換」又は「非保存的残基」という句は、親配列に存在するアミノ酸を、異なる電気化学的特性及び／又は立体特性を有する別の天然に存在する又は非天然のアミノ酸によって置き換えることを指す。したがって、置換するアミノ酸の側鎖は、置換されている天然アミノ酸の側鎖よりも顕著に大きく（又は小さく）あり得、かつ／又は置換されているアミノ酸とは顕著に異なる電子特性を有する官能基を有し得る。この種類の非保存的置換の例には、フェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンのアラニンへの置換、イソロイシンのグリシンへの置換、又は－ＮＨ－ＣＨ［（－ＣＨ２）５－ＣＯＯＨ］－ＣＯ－のアスパラギン酸への置換が含まれる。非保存的置換は、保存的とはみなされない任意の変異を含む。

非保存的アミノ酸置換は、以下における変化から生じ得る：（ａ）置換領域におけるアミノ酸骨格の構造、（ｂ）アミノ酸の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）アミノ酸側鎖の容積。概して、タンパク質特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、以下におけるものである：（ａ）親水性残基が疎水性残基に（若しくはそれによって）置換されているか、（ｂ）プロリンが、任意の他の残基に（若しくはそれによって）置換されているか、（ｃ）かさばる側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有しない残基、例えば、グリシンに（若しくはそれによって）置換されているか、又は（ｄ）正電荷の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、若しくはヒスタジルが、負電荷残基、例えば、グルタミル若しくはアスパルチルに（若しくはそれによって）置換されている。

挿入、欠失、及び／又は置換などによる、変異体ポリペプチドを産生するための天然アミノ酸配列の改変は、当業者に既知の様々な手段によって行われ得る。例えば、部位特異的変異は、修飾部位を含む合成オリゴヌクレオチドを発現ベクターにライゲーションすることによって導入され得る。代替的には、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４２：１３３（１９８６）、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３７：７３（１９８５）、Ｃｒａｉｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２－１９（Ｊａｎｕａｒｙ １９９５）、並びに米国特許第４，５１８，５８４号及び同第４，７３７，４６２号に開示されているものなど、オリゴヌクレオチド誘導部位特異的変異誘発手順が使用され得る。変異を導入するための好ましい手段は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）である。

任意の適切な発現ベクター（例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．：１９８５）に記載のもの）及び対応する好適な宿主は、組換えポリペプチドの産生に用いられ得る。発現宿主には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属内の細菌種、バキュロウイルス系を含む哺乳動物又は昆虫細胞系（例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）による記載のもの）、及びＣＯＳ－７、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＢＨＫ細胞株などの確立された細胞株が含まれるがこれらに限定されない。当業者は、発現宿主の選択が、産生されるポリペプチドの種類に派生する効果を有することを認識している。例えば、酵母細胞又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞）で産生されるポリペプチドのグリコシル化は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞で産生されるポリペプチドのグリコシル化とは異なる。

代替的に、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の標準的なペプチド合成技術を使用して合成され得る（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：１９８４）に要約される）。具体的には、ポリペプチドは、固相合成の手順を使用して合成され得る（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－５４（１９６３）、Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：７０５－７３９（１９８７）、及び米国特許第５，４２４，３９８号を参照されたい）。必要に応じて、これは、自動ペプチド合成器を使用して行われ得る。ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔ－ＢＯＣ）又は９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸ブロッキング基の除去及びポリペプチドの樹脂からの分離は、例えば、低温での酸処理によって達成され得る。次いで、ポリペプチド含有混合物を、例えば、ジメチルエーテルで抽出して非ペプチド性有機化合物を除去することができ、合成されたポリペプチドを（例えば、約２５％ｗ／ｖの酢酸で）樹脂粉末から抽出することができる。ポリペプチドの合成後、任意の不完全なポリペプチド又は遊離アミノ酸を排除するために、更なる精製（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して）を任意選択で行うことができる。アミノ酸及び／又はＨＰＬＣ分析は、その同一性を検証するために、合成されたポリペプチドに対して行われ得る。本発明による他の用途については、本明細書に記載の方法又は他の遺伝子手段などによってより大きな融合タンパク質の一部分として、又は当業者に既知であり、本明細書に記載の物理的又は化学的コンジュゲーションなどを介したより大きなコンジュゲートの一部分として、ポリペプチドを産生することが好ましい場合がある。

本発明の任意の実施形態では、本発明のキメラ又は融合タンパク質は、組換え発現系での発現を促進するため、及び／又はタンパク質の精製を促進するために、追加のアミノ酸残基を含み得る。したがって、本明細書に定義されるタンパク質は、Ｎ末端領域に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸などの追加のアミノ酸を含み得る。典型的には、追加のアミノ酸は、組換え発現系における発現を促進するためのＮ末端メチオニンを含むが、典型的には、そのようなＮ末端残基は、タンパク質の翻訳後に切断されることが理解されるであろう。ある特定の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸は、少なくともメチオニン及びアラニン残基を含む。

更に、本発明によるキメラ又は融合タンパク質は、好ましくは精製を容易にするために、Ｎ末端又はＣ末端領域に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸などの追加のアミノ酸を含み得る。そのようなアミノ酸残基は、タンパク質における精製タグ（ヒスチジンタグなど）の包含を促進し得ることが理解されるであろう。そのような残基は、タンパク質のタグ付けされていないバージョンが産生される場合には含まれなくてもよい。

本発明のポリペプチドはまた、精製を容易にするために、又はポリペプチドのインビボ半減期を増加させるために、又は当該技術分野で既知の方法を使用するイムノアッセイにおける使用のために、別の部分にコンジュゲート又は融合させることによって修飾され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって修飾され得る。

核酸
本発明のキメラ又は融合タンパク質又はポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸分子もまた、本発明の範囲内である。核酸は、例えば、本発明のポリペプチドを作製する際、及び治療薬として有用である。それらは、培養物中又はインビボで細胞に投与され得、細胞からの本発明のポリペプチドの分泌を指向又は促進する分泌シグナルを含み得る。また、本発明の核酸を含有する、又は含む発現ベクター及び宿主細胞もまた、本発明の範囲内である（以下に更に記載される）。本発明の核酸は、「単離された」と称され得るが、定義上、本発明のポリペプチドは、野生型ポリペプチドではなく、したがって、天然に存在する核酸によってコードされないであろう。したがって、本発明のポリペプチド及び核酸は、「精製された」、「実質的に精製された」、「単離された」、「組換え」、又は「合成された」ものであり得るが、天然に存在する物質と区別されるために必ずしもそのようなものである必要はない。

「単離された」核酸分子は、それが通常、核酸の天然源で関連する少なくとも１つの混入物質の核酸分子から特定及び分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然界に見出される形態又は状況以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞に存在する核酸分子と区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常、Ｋｇｐを発現する細胞に含有された核酸分子を含み、例えば、核酸分子は、天然の細胞のものとは異なる染色体位置にある。

「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はその類似体の、任意の長さの重合形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離された形態又は精製された形態で提供され得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のために、そのような核酸配列には、ウイルス、原核生物、又は真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、更には合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終止配列は、コード配列の３’側に位置し得る。

本発明のポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）に例として記載のように、当該技術分野で周知の方法に従って合成され得る。

本発明のポリヌクレオチド分子は、挿入された配列に作動可能に連結された制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、したがって、標的対象における本発明のポリペプチドのインビボでの発現を可能にする。これらの発現カセットは、次いで、典型的には、核酸免疫化の試薬としての使用に好適なベクター（例えば、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供される。そのような発現カセットは、宿主対象に直接投与され得る。代替的には、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが宿主対象に投与され得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを使用して調製及び／又は投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を運び、本発明のポリペプチドの発現を可能にすることができる任意のベクターであり得る。

したがって、本発明は、そのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、任意選択で、本明細書に定義される異なるポリペプチドをコードする１つ以上の更なるポリヌクレオチド配列とを含む、炎症性疾患又は状態の予防又は治療における使用のためのベクターを提供する。

更に、本発明の組成物及び産物は、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの混合物を含み得ることが理解されるであろう。したがって、本発明は、ポリペプチドのうちのいずれか１つの代わりに、該ポリペプチドを発現することができるポリヌクレオチドである、本明細書に定義される組成物又は産物を提供する。

発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築され、例えば、本発明のペプチドの発現を可能にするために、プラスミドＤＮＡ、並びに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、並びに例えば、必要である場合があり、正しい方向に配置されるポリアデニル化シグナルなどの他の要素の使用を伴い得る。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。この点に関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照する。

したがって、本発明のポリペプチドは、そのようなベクターを細胞に送達し、ベクターからの転写が起こることを可能にすることによって提供され得る。好ましくは、本発明の、又はベクターにおける本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に作動可能に連結されており、すなわち、ベクターは発現ベクターである。

「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成要素がそれらの通常の機能を実施するように構成されている要素の配置を指す。したがって、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターなどの所与の調節配列は、適切な酵素が存在する場合にその配列の発現を達成することができる。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写される配列は、プロモーター配列と核酸配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。

当該技術分野では多くの発現系が記載されており、その各々は典型的には、発現制御配列に作動可能に連結された目的の遺伝子又はヌクレオチド配列を含有するベクターからなる。これらの制御配列は、転写プロモーター配列並びに転写開始及び終止配列を含む。本発明のベクターは、例えば、複製起点、任意選択で該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、及び任意選択でプロモーターの調節因子を有するプラスミド、ウイルス又はファージベクターであり得る。「プラスミド」は、染色体外遺伝子要素の形態のベクターである。ベクターは、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子、又は真菌ベクターについては耐性遺伝子を含有し得る。ベクターは、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの産生のためにインビトロで使用されてもよく、又は宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞をトランスフェクション又は形質転換するために使用されてもよい。ベクターはまた、例えば、ポリペプチドのインビボ発現を可能にするために、インビボで使用されるように適合され得る。

「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び調節するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘導される）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などによって抑制される）、及び構成的プロモーターを含み得る。「プロモーター」又は「制御要素」という用語は、完全長プロモーター領域及びこれらの領域の機能的（例えば、転写又は翻訳を制御する）セグメントを含むことが意図される。

本発明によるポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、シグナルペプチド配列を更に含み得る。シグナルペプチド配列は、概して、シグナルペプチドが発現され、プロモーターとの作動可能な連結でも配列をコードすることによってコードされるポリペプチドの分泌を促進するように、プロモーターとの作動可能な連結で挿入される。

典型的には、シグナルペプチド配列は、１０～３０アミノ酸、例えば、１５～２０アミノ酸のペプチドをコードする。多くの場合、アミノ酸は、主に疎水性である。典型的な状況では、シグナルペプチドは、シグナルペプチドを有する成長ポリペプチド鎖を、発現細胞の小胞体に標的とする。シグナルペプチドは小胞体内で切り離され、ゴルジ体を介したポリペプチドの分泌を可能にする。

免疫原性及びワクチン組成物
本発明は更に、本明細書に定義されるキメラ又は融合タンパク質を含む組成物、並びにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の治療又は予防における免疫原性又はワクチン組成物におけるそのようなキメラ又は融合タンパク質の使用を提供する。

本明細書で使用される「ワクチン組成物」という用語は、疾患に対して生物を保護又は治療するために、組成物内の抗原（免疫原）に対する免疫応答を誘発するために使用される組成物として定義される。

本明細書で使用される場合、「免疫刺激組成物」、「ワクチン組成物」、及び「免疫原性組成物」という用語は、概して、互換的に使用され得る。

本発明の免疫刺激組成物又はワクチンは、治療的又は予防的活性成分としての本発明の１つ以上のペプチドに加えて、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、アジュバント、ビヒクル、緩衝液、又は安定剤を好適に含み得る。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノール、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、任意の適切な経路、例えば、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内、又は脳脊髄液への注射を含む）、経口（頬若しくは舌下を含む）、鼻、局所（頬、舌下、若しくは経皮を含む）、膣、又は直腸経路による投与に適合され得る。そのような組成物は、薬学の分野で既知の任意の方法によって、例えば、ペプチドを無菌条件下で担体又は賦形剤と混合することによって調製され得る。典型的には、ワクチン組成物は、皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内経路によって、典型的には注射による投与に適合される。代替的には、ワクチン組成物は、経口又は経鼻投与に適合され得る。

非経口投与に適合した免疫刺激組成物又はワクチン組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を対象レシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液であり得る。注射可能な溶液に使用され得る賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が含まれる。組成物は、単位用量又は複数回用量容器、例えば、密封されたアンプル及びバイアル中で提供され得、使用の直前に、運ばれる滅菌液体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））状態で保存され得る。即席の注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。

経口投与に適合した免疫刺激又はワクチン組成物は、カプセル又は錠剤又はロゼンジなどの別個の単位として、粉末又は顆粒として、溶液、シロップ又は懸濁液として（水性若しくは非水性液体中、又は食用泡若しくはホイップとして、又はエマルジョンとして）提供され得る。

錠剤又は硬質ゼラチンカプセルに好適な賦形剤としては、ラクトース、トウモロコシデンプン又はその誘導体、ステアリン酸又はその塩が挙げられる。軟質ゼラチンカプセルとの使用に適した賦形剤としては、例えば、植物油、ワックス、脂肪、半固体又は液体ポリオールなどが挙げられる。

溶液及びシロップの調製のために、使用することができる賦形剤には、例えば、水、ポリオール、及び糖が含まれる。懸濁液の調製のために、油（例えば、植物油）を使用して、水中油型又は油中水型の懸濁液を提供し得る。

担体が固体である鼻投与に適合された免疫刺激又はワクチン組成物は、鼻からの吸引の様式、すなわち、鼻の近くに保持される粉末の容器から鼻腔を通って急速に吸入することによって投与される、例えば、２０～５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗い粉末を含む。担体が、経鼻スプレー又は経鼻液滴としての投与のための液体である好適な組成物は、活性成分の水性又は油性溶液を含み得る。

吸入による投与に適合された組成物には、様々な種類の定量加圧エアロゾル、ネブライザー、又は吸入器によって生成され得る微粒子ダスト又はミストが含まれる。

経皮投与に適合された免疫刺激又はワクチン組成物は、長期間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触し続けることを意図した別個のパッチとして提供され得る。例えば、活性成分は、概してＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３（６）：３１８（１９８６）に記載されているように、イオン泳動によってパッチから送達され得る。

局所投与に適合された組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液（例えば、口腔洗浄液）ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又は油として製剤化され得る。眼又は他の外部組織、例えば、口及び皮膚の感染症の場合、組成物は、局所軟膏又はクリームとして適用され得る。軟膏中に製剤化される場合、活性成分は、パラフィン性又は水混和性の軟膏基剤のいずれかとともに用いられ得る。代替的には、活性成分は、水中油型クリーム基材又は油中水型基材を有するクリーム中に製剤化され得る。眼への局所投与に適合された医薬組成物は、点眼剤を含み得、活性成分は、好適な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁される。口における局所投与に適合された医薬組成物は、トローチ剤、ペースト剤、又は口腔洗浄液を含み得る。

免疫刺激又はワクチン組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、付臭剤、塩（本発明の物質自体は、薬学的に許容される塩の形態で提供され得る）、緩衝液、コーティング剤、又は抗酸化剤を含有し得る。

本発明のワクチン組成物はまた、本明細書に定義されるキメラ又は融合タンパク質に加えて、１つ以上の他の予防的又は治療的に活性な薬剤を含有し得る。

本発明のワクチン組成物における使用のためのキメラ又は融合タンパク質は、凍結乾燥されていてもよく、されていなくてもよい。

本発明のワクチン組成物はまた、本明細書に定義されるペプチドに加えて、薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。ワクチン組成物の免疫原性を増強するために、アジュバントが添加される。

ワクチン組成物に含まれるのに好適なアジュバントは、当該技術分野において既知であり、不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）を有するフロイントアジュバント、ミョウバン（水酸化アルミニウム）、ミョウバン＋Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ、典型的には、ウイルスタンパク質を含有するＱｕｉｌ Ａのマトリックス）、ＱＳ－２１、Ｄｅｔｏｘ－ＰＣ、ＭＰＬ－ＳＥ、ＭｏＧＭ－ＣＳＦ、ＴｉｔｅｒＭａｘ－Ｇ、ＣＲＬ－１００５、ＧＥＲＢＵ、ＴＥＲａｍｉｄｅ、ＰＳＣ９７Ｂ、Ａｄｊｕｍｅｒ、ＰＧ－０２６、ＧＳＫ－Ｉ、ＧｃＭＡＦ、Ｂ－アレチン、ＭＰＣ－０２６、Ａｄｊｕｖａｘ、ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ、及びＭＦ５９が含まれる。

本発明のワクチン組成物はまた、１つ以上の共刺激分子を含むか、又はそれとともに投与され得る。

本発明のワクチン組成物の投薬量は、治療などされる個体の年齢及び状態などに応じて、広い範囲で変化することができ、医師が最終的に使用される適切な投薬量を決定する。

この投薬量は、必要に応じて頻繁に反復され得る。例えば、ワクチンの初回用量が投与され、次いでブースーが後日投与され得る。

哺乳動物、特にヒトへの投与の場合、活性剤の１日投薬量は、１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約１０μｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ体重であることが予想される。いずれにせよ、医師が、個体の年齢、体重、性別、及び応答を含む要因に依存する個体に最も好適な実際の投薬量を決定する。上記投薬量は、平均症例の例示である。もちろん、より高い投薬量又はより低い投薬量が必要とされる事例がある可能性があり、そのような事例は、本発明の範囲内にある。

本発明のワクチン組成物は、筋肉内、静脈内を介して、吸入によって、腹腔内又は経口経路、又は脳脊髄液への注射によってなど本明細書に記載の任意の好都合な経路によって投与され得る。

本発明のワクチン組成物は、単位剤形で提供され得、概して密封された容器で提供され、キットの一部として提供され得る。そのようなキットは、通常（必ずしもそうとは限らないが）使用説明書を含む。複数の該単位剤形を含み得る。

したがって、更に別の態様では、本発明は、密封された容器に本発明のワクチン組成物並びに１つ以上のサイトカイン及び／又はアジュバントを含むキットオブパーツを提供する。

主題のキメラ又は融合タンパク質を使用して対象を免疫化するための方法
本発明は、感染を治療若しくは予防するか、又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる感染の可能性を最小限に抑えることが必要な個体において、それを行うための方法及び組成物を提供し、その方法は、本発明の融合又はキメラタンパク質を投与することを含む。

本発明は、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する体液性免疫応答を誘導するための方法及び組成物を更に提供する。体液性応答は、保護／治療を必要とする個体において、保護／治療的抗Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗体を直接得る目的のためであり得る。代替的には、体液性応答は、したがって抗体が抗体での治療／保護を必要とする個体に直接投与され得るように、したがって対象（又はその卵）から単離される抗体を生成する目的のためであり得る。

したがって、本発明は、個体におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓでの感染を予防し、感染の可能性を最小限に抑え、かつ／又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の重症度及び期間を低減するための方法及び組成物を含む。

本発明はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を得るための方法であって、方法が、非ヒト動物に、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与し、それによって、動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成することを含む、方法を提供する。好ましくは、本方法は、抗体を動物から（例えば、動物の血液から）、又は動物の卵から（例えば、ニワトリからＩｇＹ抗体を生成する場合）単離することを更に含む。

本発明はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を含む抗体調製物であって、抗体調製物が、非ヒト動物に、本発明のキメラ若しくは融合タンパク質、組成物、ワクチン、又は免疫刺激組成物を投与し、それによって、動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成すること、及び動物又はその卵から抗体を単離することによって得られる、抗体調製物を提供する。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を排除若しくは低減するために治療的に、又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の重症度を予防又は低減するために予防的に、使用され得る。更なる実施形態では、抗体は、診断用試薬又は分析用試薬として使用され得る。

本明細書で使用される場合、対象の「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患若しくは状態、疾患若しくは状態の症状、又は疾患若しくは状態のリスク（若しくは感受性）を遅延させるか、減速させるか、安定化させるか、癒すか、治癒するか、緩和するか、軽減するか、変更するか、改善するか（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、悪化を減少させるか、改善するか（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善するか（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、又は影響を与えることを目的とした、対象への本発明の組成物の適用若しくは投与（又は対象由来の細胞若しくは組織への本発明の化合物の適用若しくは投与）を含む。「治療する」という用語は、減退；寛解；悪化率の減少；疾患の重症度の減少；症状の安定化、軽減、又は傷害、病理学若しくは状態を対象にとってより忍容性のあるものにすること；悪化若しくは衰弱の速度を減速させること；悪化の最終的なポイントを衰弱させないようにすること；あるいは対象の身体的又は精神的健康を改善することなどの客観的又は主観的パラメータを含む、損傷、病理学、又は状態の治療又は改善の成功の任意の指標を指す。

本明細書で使用される場合、「予防すること」又は「予防」は、疾患又は障害を獲得するリスク（又はそれの受けやすさ）の可能性の少なくとも低減を指すことを意図している（すなわち、疾患に曝露し得るか、又はその素因を有するが、疾患の症状をまだ経験していない、又は呈していない対象において、疾患の臨床症状のうちの少なくとも１つを発症させないようにする）。そのような対象を特定するための生物学的及び生理学的パラメータは、本明細書で提供され、医師によっても周知である。

本発明のワクチン組成物は、それを最も必要としていると思われる対象に、例えば、ヒト患者の文脈で、小児又は高齢者又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに曝露するリスクがある個体に投与され得る。本発明のワクチン組成物はまた、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに感染している疑いがあるか、又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに感染していると診断された対象に投与され得る。

本発明の組成物及び方法は、ヒト及び／又は獣医学の両方における使用、診断薬の生成、又は他の治療試薬の生成に等しく拡張される。

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、例えば、哺乳動物を含む任意の動物を意味するものとする。例示的な対象として、ヒト及び非ヒト霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、対象は、ヒトであり得る。更なる例では、対象は、獣医学的対象、例えば、ペット（ネコ、イヌ、モルモットなど）であり得る。本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、互換的に使用され得る。

当業者は、本明細書に記載のキメラ若しくは融合タンパク質又は組成物による成功裏のワクチン接種／免疫化を決定するための方法に精通しているであろう。例えば、当業者は、免疫化後に生成された抗体を定量するための方法、及び／又は免疫化後に誘導された体液性（Ｔｈ２）応答の程度を定量するための方法に精通しているであろう。

キット
別の実施形態では、本発明の１つ以上のタンパク質、ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、及び／又は上記の免疫原性組成物を含むキット又は製品が提供される。

更に別の態様では、本発明は、本発明のワクチン組成物と、対象に別個に、続けて、又は同時投与するための１つ以上のアジュバントとを含むキットオブパーツを提供する。

他の実施形態では、上記の治療的又は予防的適用における使用のためのキットが提供され、そのキットは、
－本発明のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又は免疫原性組成物を保持する容器と、
－使用説明書を有するラベル又は添付文書と、を含む。

任意の実施形態では、このキットは、対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘発するための１つ以上の更なる活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）又は活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）を含有し得る。

キット又は「製品」は、容器、及び容器上又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ブリスターパックなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態を治療するのに有効である治療組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。ラベル又は添付文書は、選択した状態を治療するために治療用組成物が使用されることを示す。一実施形態では、ラベル又は添付文書は、使用説明書を含み、治療組成物又は予防組成物を使用して、本明細書に記載の炎症性疾患又は状態を治療し得ることを示す。

キットは、（ａ）治療用又は予防用組成物と、（ｂ）その中に含有される第２の活性成分を有する第２の容器と、を含み得る。本発明のこの実施形態におけるキットは、組成物を示す添付文書を更に含み得、他の活性成分は、本明細書に記載の炎症性疾患又は状態に起因する障害を治療するか、又は合併症を予防するために使用され得る。代替的に、又は追加的に、キットは、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（又は第３の）容器を更に含み得る。これには、商業及び使用者の観点から、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む望ましい他の材料が更に含まれ得る。

任意の実施形態では、治療用組成物は、治療用、予防用、又は免疫原性組成物を保持するための容器を含む、使い捨て又は再利用可能なデバイスの形態で提供され得る。一実施形態では、デバイスは、注射器、自動注射器、又はナノパッチである。デバイスは、０．１～２ｍＬの治療用又は免疫原性組成物を保持し得る。治療用又は予防用組成物は、使用の準備ができている状態、又は更なる構成要素の混合、溶解、若しくは再懸濁、又は添加を必要とする状態でデバイス内に提供され得る。

本明細書に開示及び定義された本発明は、テキスト又は図面から言及されるか、又は明らかな個々の特徴の２つ以上の選択的な組み合わせの全てに及ぶことが理解されるであろう。これらの種々の組み合わせの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは、決して、本発明の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される原理の多くの変形及び修正を容易に考案することができる。

以下の実施例は、本発明のキメラ又は融合タンパク質に関連する一連のインビトロ及びインビボ研究について説明する。実施例１は、実施例２及び３に記載の研究で使用された材料及び方法を説明する。実施例２は、インビトロ研究の結果を説明し、実施例３は、インビボ研究の結果を説明する。

実施例１：材料及び方法
１．１インビトロ研究のための材料及び方法
組換えタンパク質の発現
組換えタンパク質（すなわち、本明細書に記載の種々のキメラ又は融合タンパク質）は、本質的に以下のとおり、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）での誘導によって、ｐＥＴ２８ベクター（又は１つのベクターからのｒＡＢＭ１＋ｒＡＢＭ２共発現のためのｐＤＵＥＴ－１）から発現された。

キメラ及び融合タンパク質（活性部位及び付着因子ドメインを含む）の種々のキメラ及び構成要素をコードする核酸は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０ゲノムＤＮＡ鋳型及び特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標準のＰＣＲ又は重複拡張（「ＳＯＥｉｎｇ」）ＰＣＲを介したＤＮＡスプライシングによって生成された。ＰＣＲ断片又はＳＯＥｎ ＰＣＲ断片を精製し、クローニングベクターｐＧＥＭＴｅａｓｙ又はｐＢＨＡにライゲーションし、化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉ α－Ｇｏｌｄ細胞（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に形質転換した。

「ＤＳＳＧ」アミノ酸リンカー領域を含有するか又はリンカーなしのいずれかの単一の追加のＫＡＳ（すなわち、活性部位）残基をコードするＤＮＡ配列を、本質的に以下のように、組換えキメラ及びＫｇｐ付着因子ドメインに一度に１つずつ順次付加した：制限酵素部位を、制限酵素に特異的なヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって、キメラ及び付着因子バリアントマザークローンにおけるＤＮＡ挿入断片の末端に導入した。対応する制限配列を有する個々のＫＡＳ配列をコードする合成ＤＮＡ断片を、マザークローンからのＤＮＡ構築物の挿入末端にライゲーションし、組換えクローンを精製した。続いて、第２又は第３の追加のＫＡＳを添加した場合、更なる制限配列をこれらのクローニングされた挿入物の末端に導入し、異なる制限部位を有するＫＡＳ配列をコードする追加のＤＮＡ断片を一度に１つずつライゲーションした。単一、二重、又は四重の線形ＫＡＳコード配列を有するマザークローン構築物を特異的制限消化に供し、次いで亜断片をライゲーションを介して交換して、多数のバリアント（表１に例示されるものを含む）を産生することができた。

ＡＢＭ１及びＡＢＭ２内の残基を、製造業者の指示に従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して変異させた。

クローニングベクターｐＧＥＭＴｅａｓｙ及びｐＢＨ１における全ての挿入物の完全性を、ＤＮＡ配列決定（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）によって確認した。変異は、挿入物全体のＤＮＡ配列決定によって更に検証された。次いで、検証された構築物を選択された酵素での制限消化に供し、挿入物をＥ．ｃｏｌｉ α－ｓｅｌｅｃｔ化学的有能の細胞における関連するｐＥＴ発現ベクターにクローニングし、続いてＥ．ｃｏｌｉ発現宿主、ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＰＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にクローニングした。

組換えタンパク質の溶解性に影響を与えるキメラの特徴の調査、小規模
単一コロニー形質転換体を使用して、オービタルシェーカーで、３７℃で一晩、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスに接種した。次いで、この接種物を使用して、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２ｍｌのＬＢを接種した（１：１００）。ＯＤ６００＝０．６～１．０の細胞培養物を、３７℃で２時間、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞培養物を遠心分離し、ペレットを２５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、ＣＰＸ７５０超音波処理器（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を使用して短時間超音波処理し、遠心分離した。

全溶解物、可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析して、組換えタンパク質の溶解性を評価した。これらの初期パイロット発現条件下で不溶性のままであるか、又は低い溶解性を示した組換えタンパク質を、より低い温度（１６℃～３０℃）及びより低いＩＰＴＧ（０．０１～０．５ｍＭ）を有する様々な条件下で発現させて、溶解性の増強ための最適な条件を確認した。全ての組換えタンパク質誘導を、最適な条件下で規模を拡大（２０～２００ｍｌ）して、中－大規模で溶解性を試験した。培養物（２００ｍＬ）を、様々な温度（例えば、３０℃で５時間又は１６℃で１６時間）でＩＰＴＧ誘導に供した。

細胞を採取し、溶解緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ、１×プロテイナーゼ阻害剤カクテル、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）中に再懸濁した。細胞再懸濁液を４℃で１時間インキュベーションし、次いで、清澄化された溶解物を遠心分離（８，０００ｇ、３０分、４℃）して、上清（可溶性）及びペレット（不溶性）画分を採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びネイティブ－ＰＡＧＥによって分析した。

組換えタンパク質のゲル内ＨＩＳ染色
ＳＤＳ ＰＡＧＥに供した組換えタンパク質を、製造業者の指示に従ってＩｎｖｉｓｉｏｎ Ｉｎ Ｇｅｌ Ｈｉｓ Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して染色した。この染色は、Ｈｉｓタグ付きタンパク質に非常に特異的である。この手順は、全ての候補がＣ末端Ｈｉｓタグを含有するため、組換えタンパク質のＮ末端分解を特定するために使用された。

動物モデルにおける研究のためのキメラの大規模な精製
各組換えタンパク質の精製条件については、以下のセクションに詳述する。

タンパク質発現及び細胞溶解
動物モデルのワクチン候補としての使用のために特定された全ての組換えタンパク質を、前述のように、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において、組換えＣ末端Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として、又は「タグなし」タンパク質として発現させた。細胞を、ＬＢ培地、ＴＢ培地、又は５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した改変Ｍ９最小培地中で３７℃で増殖させた。ＯＤ６００＝０．８～１．０の培養物を、３７℃又は３４℃で２～４時間、２５℃で１２時間、又は１６℃で１６～２０時間、０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。４℃で、８０００ｇでの遠心分離によって採取した後、細胞を、別段の指示がない限り、溶解緩衝液［０．３５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、ＴＢＳ１５０（５０ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５中の４０μｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅＩ］＋１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤（完全ＵＬＴＲＡ 錠、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で１．５時間氷上で溶解した。細胞溶解物を、４℃で２３，５００ｇで４０分間遠心分離することによって清澄化した。

翻訳された配列ＭＡから始まる、表１に示される全ての組換えタンパク質上の開始Ｍｅｔ残基（ａａ１）は、最後から２番目の残基が小さい残基である場合、メチオニンを切断するＥ．ｃｏｌｉ Ｎ末端メチオニン処理酵素によってインビボで除去される。これは、ＫＤＡＫ及びＫＤＡＫバリアント組換えタンパク質の質量分析によって確認された。

非変性条件下での可溶性画分からのＨｉｓタグ付きタンパク質の精製
１．Ｎｉ－親和性クロマトグラフィー
細胞溶解物を４℃で、２０，０００ｇで遠心分離することによって清澄化し、細胞破片を除去した。０．２２μｍフィルターを通して濾過した後、溶解物を、ローディング緩衝液ＴＢＳ３００（５０ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）＋１０ｍＭのイミダゾール及び１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００中のＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ－親和性カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを、ローディング緩衝液、次いでＴＢＳ３００中の２０ｍＭのイミダゾールで十分に洗浄した。結合されたタンパク質を、吸光度を２８０ｎｍで監視しながら、ＴＢＳ３００中の２０～３５０ｍＭのイミダゾールの勾配で溶出した。ピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで分析した。溶出された標的タンパク質を、タンパク質サイズに応じて３ｋＤａ又は１０ｋＤａの分子量カットオフを有するＡｍｉｃｏｎフィルターユニットを使用して濃縮した。得られたタンパク質溶液を、更なる精製のために－７０℃で保存した。

２．陰イオン交換クロマトグラフィー
全ての候補タンパク質の等電点（ｐＩ）は、オンライン分析ＰｒｏｔＰａｒａｍツール－ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を使用して酸性範囲にあると予測されたため、必要に応じて更に精製するために陰イオン交換クロマトグラフィーを適用した。簡潔に述べると、Ｎｉ－親和性精製からの濃縮タンパク質を緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に希釈してイオン強度を低減させ、次いで、緩衝液Ａ中の陰イオン交換ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。タンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度を監視しながら、Ｔｒｉｓ緩衝液中で２０～４００ｍＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。ピーク画分中の標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証し、適切な分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎフィルターユニットを使用して濃縮した。タンパク質溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー又は透析を使用して、更なる精製又は緩衝液交換のために－７０℃で保存した。

３．サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィーを、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００又はＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で４℃で実施した。Ｎｉ親和性精製又は陰イオン交換クロマトグラフィーの更なるステップからのタンパク質を適切なカラムにロードし、２８０ｎｍでの吸光度を監視しながら、ＴＢＳ１５０又はＴＢＳ１００（５０ｍＭのＴｒｉｓ・Ｃｌ中１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の緩衝液中で溶出した。ピーク画分中の標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証した。二量体などの単一のオリゴマー種の単離のために、第２又は更なるラウンドのサイズ排除精製を実施した。最良のタンパク質純度を含有する画分をプールし、濃縮した。タンパク質ホモ多量体の混合物を調製するために、標的タンパク質画分を単純にプールして濃縮した。タンパク質同一性は、必要に応じて、液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化分光法（ＬＣ－ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して無傷のタンパク質モル質量を決定することによって、又は液体クロマトグラフィーＯｒｂｉｔｒａｐタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して配列分析によって確認した。タンパク質濃度を、動物モデル実験に提出する前に、計算された減衰係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を決定することによって定量した。

封入体からのＨｉｓタグ付きタンパク質の精製
１．酸化条件下
細胞の溶解後（可溶性画分からの精製について記載されているように）、不溶性ペレットをＴＢＳ１５０で２回洗浄した。封入体として発現されたタンパク質を、ＴＢＳ３００又は２０ｍＭのＮａＰｉ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４（ＰＢＳ５００）中で１時間、ローリングプラットホームで、室温で８Ｍの尿素で可溶化した。タンパク質抽出物を２０，０００ｇで遠心分離し、０．２２μｍフィルターユニットを通して濾過し、次いで、緩衝液ＴＢＳＵ（ＴＢＳ３００中の８Ｍの尿素＋２０ｍＭのイミダゾール）又はＰＢＳＵ（８Ｍの尿素、２０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ７．８、５００ｍＭのＮａＣｌ＋２０ｍＭのイミダゾール）を含有する尿素中のＨｉｓＴｒａｐ親和性カラムにロードした。カラムを同じ８Ｍの尿素緩衝液で十分に洗浄した。ｐＨ６．５のＰＢＳＵでの更なる洗浄を、ＰＢＳＵ中のロードされたタンパク質を有するカラムに適用した。尿素の除去のために、標的タンパク質を、ＰＢＳＵ中の２０～５００ｍＭのイミダゾールの勾配で溶出した。緩いＮｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した場合、尿素抽出物をＰＢＳＵ中で穏やかに攪拌しながら２時間樹脂と混合した。ＰＢＳＵ（ｐＨ７．８、次いでｐＨ６．５）での十分な洗浄後、結合したタンパク質を、同じ緩衝液中の５００ｍＭのイミダゾールで樹脂から溶出させた。溶出されたタンパク質を、分子量カットオフが３．５ｋＤａの透析チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で、６Ｍ、４Ｍ、次いで２Ｍの尿素リン酸緩衝液中に段階的に透析した。２Ｍの尿素緩衝液中のタンパク質を更に生理食塩水のみに透析し、動物モデル実験に提出する前に４℃で維持したか、又はそうでなければ、更なる透析なしに２Ｍの尿素緩衝液中で提出した。

２．還元条件下
タンパク質を、５ｍＭのＴＣＥＰの存在下で６Ｍの尿素緩衝液を用いて封入体から抽出し、同じ緩衝液中のＨｉｓＴｒａｐカラムにロードした。カラムを２ＭのＴＣＥＰを含有する４Ｍの尿素緩衝液で洗浄した後、標的タンパク質を、２ＭのＴＣＥＰの存在下で、４から０Ｍへの尿素の濃度勾配を減少させながらカラムで再折り畳みを行った。次いで、タンパク質を、ＴＢＳ３００＋２ｍＭのＴＣＥＰ中、２０～３５０ｍＭのへイミダゾールの濃度勾配を増加させながら溶出した。次いで、溶出されたタンパク質を、非変性条件下で可溶性画分からタンパク質二量体又は多量体を精製するためのセクションに記載のものと同じ方法で、還元緩衝液（ＴＢＳ１５０中の２ｍＭのＴＣＥＰ）中のサイズ排除クロマトグラフィーのために濃縮した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びネイティブＰＡＧＥ、質量分析及び定量を用いて分析した後、試料を還元緩衝液中で－７０℃で保存するか、又は動物モデル実験のために提出した。

酸化及び変性条件下での可溶性画分からのＨｉｓタグ付きタンパク質の精製
細胞溶解物を２０，０００ｇで遠心分離することによって清澄化して、残渣及び不溶性物質を除去し、次いで、溶解物を、室温で１時間攪拌しながら、尿素溶液をＰＢＳ５００中８Ｍの最終濃度まで添加することによって直ちに変性させた。次いで、得られた溶解物を室温で２０，０００ｇで４０分間遠心分離した。標的タンパク質を、ＨｉｓＴｒａｐ Ｎｉ－親和性カラム又は緩いＮｉ－ＮＴＡ樹脂を使用して、上記の酸化条件下での封入体からの精製のセクションに記載のものと同じアプローチで精製した。生理食塩水中で精製された抗原を４℃で保存した後、動物モデル実験に提出した。

可溶性画分からのタグのない候補の精製
陰イオン交換クロマトグラフィー これは、タグのないタンパク質を精製するための最初のクロマトグラフィー工程である。Ｈｉｓタグ付きの対応物と同様に、タグのない候補のｐＩも、オンライン分析ＰｒｏｔＰａｒａｍツール－ＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）を使用して酸性範囲内にあると予測された。したがって、陰イオン交換クロマトグラフィーを適用し、２ラウンドを行った。第１のラウンドでは、清澄化された細胞溶解物を０．２２μｍフィルターディスクを通して濾過し、緩衝液ＡＡ（０．０５×プロテアーゼ阻害剤カクテルで補充された２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５）中の陰イオン交換ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。１０カラム体積の緩衝液ＡＡでの洗浄後、結合したタンパク質を０～１００％の緩衝液ＢＡのＮａＣｌ勾配（２０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ６．５中の１ＭのＮａＣｌ）で溶出し、２８０ｎｍでの吸光度を監視した。ピーク画分中の標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証した。第２のラウンドでは、陰イオン交換ステップの第１のラウンドからの最良の画分をプールし、緩衝液ＡＡで６倍に希釈し、次いで同じ緩衝液中の陰イオン交換ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再ロードした。結合したタンパク質を０～５０％緩衝液ＢＡのＮａＣｌ勾配で溶出し、２８０ｎｍでの吸光度を監視した。ピーク画分中の標的タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証し、最良の画分を、１０ｋＤａの分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎフィルターユニットを使用して濃縮した。タンパク質溶液を－２０℃で保存し、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて更に精製した。

第１のラウンドのサイズ排除クロマトグラフィー サイズ排除クロマトグラフィーを室温で、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製からのタンパク質をサイズ排除カラムにロードし、２８０ｎｍでの吸光度を監視しながらＡＳの緩衝液中（０．０５×プロテアーゼ阻害剤カクテルが補充された１Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ７．０）で溶出した。ピーク画分中の標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証した。最良のタンパク質純度の画分を、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた更なる精製のためにプールした。

疎水性相互作用クロマトグラフィー 第１のラウンドのサイズ排除クロマトグラフィーからの緩衝液ＡＳ中の標的タンパク質のプールされた画分を、０．２２μｍの膜を通して濾過し、４℃で緩衝液ＡＨ（１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＮａＰｉ ｐＨ７）中で予め平衡化されたＨｉＴｒａｐフェニルＨＰカラムにロードした。結合したタンパク質を、２８０ｎｍでの吸光度を監視しながら、緩衝液ＢＨ（５０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７）中の８００ｍＭから２００ｍＭへの（ＮＨ４）２ＳＯ４のイオン強度の減少させる勾配で溶出した。ピーク画分中の標的タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで検証し、最良の画分を、第２のラウンドのサイズ排除クロマトグラフィーの次の精製又は緩衝液交換ステップのためにプールし、Ａｍｉｃｏｎフィルターユニットを使用して濃縮した。

第２のラウンドのサイズ排除クロマトグラフィー 疎水性相互作用を伴う精製工程からの濃縮された試料を、第１のラウンドのサイズ排除クロマトグラフィーで使用されたサイズ排除カラムにロードし、ＢＴＳ（２０ｍＭのＢｉｓ－Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）の緩衝液中で溶出した。ピーク画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び／又はネイティブＰＡＧＥで分析した。最高純度の画分をプールし、濃縮した。液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ－ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ）及び定量による特定後、抗原を等分し、将来の使用のために－８０℃で保存した。

タンパク質の特定及びタグのない候補の定量
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はネイティブＰＡＧＥの検証に加えて、必要に応じて、ＬＣ－ＭＳを使用した無傷なタンパク質モル質量の決定によって、又は液体クロマトグラフィーＯｒｂｉｔｒａｐタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した配列分析によって、タンパク質同一性を確認した。計算された減衰係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を決定することによってタンパク質濃度を定量した（表３）。動物モデル実験に提出する前に緩衝液交換が必要であった場合、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ除外カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。

１．２ インビボ研究のための材料及び方法
歯周炎のマウスモデルのための細菌の培養
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株、Ｗ５０（血清型Ｃ）を、Ｏｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｔｈｅ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｄｅｎｔａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａの培養コレクションから入手した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０を、ＭＫ３嫌気性ワークステーション（Ｄｏｎ Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ａｄｅｌａｉｄｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中で、５％ＣＯ_２を含有する嫌気性Ｎ_２雰囲気中で、１０％ｖ／ｖの溶解ウマ血液（３７℃）を補充したウマ血液寒天（ＨＢＡ）（２０ｇ／ＬのＨＢＡ、Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）上で増殖させた。コロニーを、５ｍｇ／Ｌのヘミン及び０．５ｍｇ／Ｌのシステインを補充した２０ｍＬの滅菌された脳心臓注入（３７ｇ／ＬのＢＨＩ、Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．、Ｈａｍｓｐｈｉｒｅ，ＵＫ）培地から構成されたスターター培地に接種し［ＭｃＫｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ５２：３４９－３５５］及び嫌気的にインキュベーションした（２４時間、３７℃）。分光光度計（モデル２９５Ｅ、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、バッチ培養物の吸光度をＯＤ６５０ｎｍで監視した。細菌細胞を、遠心分離（７，０００ｇ、２０分、４℃）によって後期指数関数的増殖中に採取した。細菌の純度は、グラム染色によって日常的に確認された［Ｓｌｏｔｓ（１９８２）．Ｉｎ：Ｈｏｓｔ－Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇｅｎｃｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｅｒｇａｎｈａｇａｎ，Ｓ．Ｅ．（ｅｄｓ）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．ｐｐ．２７－４５．］。

熱殺傷細菌の調製
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０培養物を採取し（６，５００ｇ、４℃）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４及び０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で一度洗浄し、次いで遠心分離（７，０００ｇ、２０分４℃）によってペレット化した。細菌細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、６５℃に１５分間加熱した。懸濁液を遠心分離し（７，０００ｇ、２０分４℃）、滅菌ＰＢＳ中で再懸濁し、これを１回繰り返した。２回目の洗浄後、上清を廃棄し、細胞ペレットを滅菌ＰＢＳ中に再懸濁して、２×１０^１０細胞／ｍＬの細胞密度を得、Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＳＷ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用してタンパク質濃度を決定した。

マウス歯周炎モデル
マウス歯周炎の実験を、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．’ｓ ｍｏｄｅ（１９９４）．Ａｒｃｈ Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ ３９：１０３５－１０４０）から修正し、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ－Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．により以前に記載されたように実施した（２００５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５：３９８０－３９８９）。０日目、マウス（雌ＢＡＬＢ／ｃ、６～８週齢、１０匹のマウス／群）に、２日間隔で４用量のＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０［２％ｗ／ｖのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、Ｓｉｇｍａ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を含有する２０μＬのＰＧ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ_４、及び１４．３ｍＭのメルカプトエタノール、ｐＨ７．４）に懸濁した１×１０^１０個の生存Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０細胞］からなるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを経口内接種した。接種物を嫌気的に調製し、次いで、直ちに上顎大臼歯の歯肉縁に適用した。各接種物における生菌数をフローサイトメトリーによって検証し、血液寒天上でＣＦＵ計数した。動物の群は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ５０経口接種（感染対照）、非細菌接種対照、及び免疫群からなった。治療用ワクチン接種のために、歯周炎モデル（図１）マウスに、生理食塩水／ミョウバン（アルヒドロゲル、２％の水酸化アルミニウム湿潤ゲル懸濁液、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）中の５０μｇのワクチン候補で最初に経口接種した後、１９日目に腹腔内経路を介して免疫化した。マウスは、４０日目に皮下経路を介して第２の免疫化（生理食塩水／ミョウバン中５０μｇ）を受けた。６２日目に、マウスを心臓穿刺によって出血させ、殺した。上顎を除去し、正中線と通って半分にし、１０分割して歯槽骨損失を決定した。血清を使用して、ＥＬＩＳＡを使用して抗体プロファイルを決定した。

マウス上顎における歯槽骨損失の測定
骨損失を検査するための上顎を脱イオン水中で沸騰させ（１分）、機械的に解体し、２％ｗ／ｖの水酸化カリウム中に浸漬した（１６時間、２５℃）。上顎を脱イオン水（２５℃）で２回洗浄し、乾燥させ（１時間、３７℃）、０．５％ｗ／ｖのメチレンブルー水溶液で染色した。上顎の頬側のデジタル画像は、ＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、解剖顕微鏡に取り付けられたＯｌｙｍｐｕｓ ＤＰ１２デジタルカメラで捕捉され、水平骨損失を評価した。上顎は、頬側及び舌側の大臼歯の歯尖が重ね合わされるように配置された。画像を、各画像の測定値を標準化できるように、フレーム内のマイクロメートルとともに撮像した。水平骨損失は、歯槽骨頂に垂直な水平面で発生し、頂の高さの低減をもたらす損失として定義された。各臼歯のセメント質－エナメル質接合部（ＣＥＪ）から歯槽骨頂（ＡＢＣ）までの可視面積を、ＯＬＹＳＩＡ ＢｉｏＲｅｐｏｒｔソフトウェアバージョン３．２イメージングソフトウェアを使用して測定して、ｍｍ^２での全可視ＣＥＪ－ＡＢＣ面積を得た。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失（ｍｍ^２）は、未接種（Ｎ－Ｃ）群の全可視ＣＥＪ－ＡＢＣ面積を各実験群の全可視ＣＥＪ－ＡＢＣ面積から差し引いて算出した。歯槽骨損失測定値は、ランダム及び盲検プロトコルで２回決定した。データは、平均＋／－標準偏差（ｍｍ^２）として表され、一元配置ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔｓ Ｔ３事後検定を使用して分析された。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるワクチン候補の事前スクリーニング
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対するいくつかのモノクローナル抗体を使用して、ワクチン候補を事前スクリーニングして、ワクチン構築物に存在する主要なドメイン及びエピトープが抗体にアクセス可能であるかどうかを決定し、したがって、インビボでの抗体応答の生成を可能にした。スクリーニングする抗原を、平底ポリビニルマイクロ力価プレート（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ，ＵＳ）上に、０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１６時間、４℃でコーティングした。これらの実験では、以下の抗体希釈を使用した：ヤギ抗マウス；ＩｇＧ（Ｍ８６４２）抗体の１／４０００希釈の希釈（Ｓｉｇｍａ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートブタ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｍ５４２０、Ｓｉｇｍａ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の１／４０００希釈を使用して、ＥＬＩＳＡ実験を開発した。

ＥＬＩＳＡを使用した血清中のサブクラス抗体の決定
Ｐａｔｈｉｒａｎａ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７５：１４３６－１４４２）に記載のように、平底ポリビニルマイクロ力価プレート（Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ，ＵＳ）のウェルをコーティングする（１６時間、４℃）ための０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＨＫ Ｗ５０細胞、ドメインサブユニット又はエピトープのいずれかの溶液（１μｇ／ｍＬ）を使用して、ＥＬＩＳＡを実施して、領域のサブクラスの抗体を評価した。これらの実験では、以下の抗体希釈を使用した：ヤギ抗マウス、ＩｇＧ（Ｍ８６４２）、ＩｇＧ１（Ｍ８７７０）、ＩｇＧ２ａ（Ｍ４４３４）抗体の１／４０００希釈の希釈（Ｓｉｇｍａ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートブタ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｍ５４２０、Ｓｉｇｍａ、Ｎｅｗ Ｓｏｕｔｈ Ｗａｌｅｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の１／４０００希釈を使用して、ＥＬＩＳＡ実験を開発した。エピトープＥＬＩＳＡについて、ビオチン化ペプチドを、１０μｇ／ｍＬで、予めブロックされたストレプトアビジンコーティングされた平底プレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に結合させた。血清とのインキュベーション後、ＥＬＩＳＡを、１／４０００のヤギ抗マウスＩｇＧ及び１／４０００の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートブタ抗ヤギＩｇＧ抗体とともに開発した。全ての光学密度測定は、４０５ｎｍでＷａｌｌａｃ ＶＩＣＴＯＲ３ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ計数器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行った。

実施例２：インビトロ研究の結果
組換えタンパク質の溶解性に影響を及ぼすキメラ構成要素
以前に報告された１つのキメラ（ＷＯ２０１０／０２２４６３において）は、Ｎ末端を切断されたＤＵＦ２４３６ドメイン（Ｄｃ）にコンジュゲートされたＫＡＳ（Ｋ）ペプチド、ＡＢＭ２１３（Ａ）を含む付着因子ドメイン、及びＣ末端を切断されたＣＡＤドメイン（切断されたＫ１ドメイン、Ｋ１ｎと称される）からなる。このキメラは、「ＫＤｃＡＫ１ｎ」と称され（配列番号３５）、本明細書では、本発明のキメラ及び融合タンパク質と比較して、「元のキメラ」又は「キメラ」とも称され得る。ＫＤｃＡＫ１ｎタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける封入体として産生され、可溶性が低く、安定性が低い。

Ａ１付着因子断片の切断されたＤＵＦ及びＫ１ドメインは、感染中にＫｇｐポリタンパク質がどのように天然にタンパク質分解的に処理され、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ細胞表面上で組み立てられるかを表す。したがって、切断されたＤＵＦ及びＫ１ドメインは、ジンジパインに対する免疫応答を生成するためのワクチン中の含有のための明白な候補となる。

可溶性ＫＤｃＡＫ１ｎを作製するための広範な試みが行われた。増殖培地、増殖条件、ＩＰＴＧ濃度、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株、誘導温度、誘導時の細胞の増殖段階、増殖安定剤の添加、溶解緩衝液及びタンパク質保存緩衝液の広範な試験における変動を体系的に調査した。可溶性組換えタンパク質発現の増強は、低温及びＩＰＴＧ誘導下での小規模発現において観察された。小規模では、ＫＤｃＡＫ１ｎは、全組換えタンパク質発現の約３０～５０％を可溶性タンパク質として産生した。それにもかかわらず、可溶性組換え体は、１０ｍｌ超の培養物に規模を変更することができず、規模の拡大を試みると、封入体形成をもたらした。

溶解性に対するＫ１ドメインの影響
Ｋｇｐポリタンパク質の全ての完全なＤＵＦ、ＡＢＭ２１３、ＡＢＭ２１及びＤＵＦ－ＡＢＭ２１３ドメインを、高度に可溶性で安定した組換えタンパク質として発現させた。しかしながら、完全なＫ１ドメイン単独は、不溶性であり、封入体（ＩＢ）としてのみ発現した。

ＡＢＭ２１３ドメインにコンジュゲートされたＫＡＳモチーフ（すなわち、「ＫＡ」）又はＤＵＦ及びＡＢＭ２１３ドメインの両方にコンジュゲートされたＫＡＳモチーフ（すなわち、「ＫＤＡ」）の発現は、非常に可溶性の安定した組換えタンパク質を産生した。

しかしながら、図２に示すように、Ｃ末端が切断されたＫ１ドメイン（すなわち、Ｋ１ｎ断片）又は完全なＫ１ドメインの組換え体ＫＡ又はＫＤＡへの付加（ＫＡＫ１又はＫＤＡＫ１）は、溶解性の損失をもたらした。

ＫＤＡＫ１ｎ（配列番号３６）及びＫＤＡＫ１（配列番号３７）タンパク質（すなわち、Ｋドメイン、ＤＵＦ２４３６、及びＡＢＭを含む付着因子ドメイン、並びに切断された又は全長のＣＡＤドメインを含む）の両方が、ＫＤＡ（すなわち、切断された又は全長のＣＡＤを除く同じタンパク質）よりも顕著に低いレベルで、可溶性発現のためのより厳しい増殖条件を必要とする。

Ｋ１ドメイン発現の結果をまとめると、Ｋ１（ＣＡＤ）ドメインが、キメラベースの組換え体の不十分な溶解性に寄与することが明らかである。

タンパク質溶解性に対するＤＵＦドメインの影響
キメラタンパク質構築物におけるＤＵＦドメインの切断は、可溶性タンパク質発現の排除をもたらした。この結果は、余分な３８個のＮ末端残基を含有する完全なＤＵＦドメインが、組換えタンパク質の可溶性発現及び効率的な安定化を最適化するために望ましいことを示す。

したがって、伸長されたＤｃドメインを有するキメラバリアント（３８個のＮ末端残基によって伸長されたＤｃを有するキメラ）を発現する構築物を作製した。この組換え体は、ＫＤＡＫ１ｎと指定され、結果は、キメラの溶解性が完全なＤＵＦドメインで顕著に増強されることを示す。０．２～０．５ｍＭのＩＰＴＧで３０℃での大規模なＫＤＡＫ１ｎの発現は、良好な収量の可溶性組換えタンパク質の発現をもたらした。

溶解性に対するＫ１及び全長ＤＵＦドメインの影響
しかしながら、この規模でのこの可溶性タンパク質発現にもかかわらず、ＫＤＡＫ１ｎ／ＫＤＡＫ１におけるＫ１ｎ／Ｋ１の包含は、Ｋ１を含むこれらのバリアントが規模の拡大及び商業的開発にとってあまり望ましくない場合があるようなＫ１ｎ／Ｋ１を欠くＫＤＡバリアントよりも調製をより問題とするように思われる。

以下のようにまとめる：
●全長ＤＵＦドメインは、組換えバリアントの溶解性に望ましい（図２Ａ）。
●Ｋ１ドメイン（全長又は切断されてるにかかわらず）は、バリアントの凝集及び不溶性に主に関与した。
●全長ＤＵＦドメイン（すなわち、ＤＵＦｃ）の非存在下では、Ｋ１及びＫ１ｎ含有バリアントは完全に不溶であった（図２Ａ）。
●全長ＤＵＦドメインの存在下では、Ｋ１及びＫ１ｎ含有バリアントの非常に低レベルの溶解性が、非常に穏やかな誘導条件下で明らかであった。それにもかかわらず、この溶解性は非常に低く、全ての組換えタンパク質の約８０～９０％が封入体として発現されていた。
●可溶性ＫＤＡＫ１組換え体の中規模精製のネイティブＰＡＧＥゲル分析は、組換え体の無秩序な凝集を明らかにした（すなわち、ＫＤＡバリアントについては、整然とした均一なラダーではない）。ミニニッケルスピンカラムを使用したこれらのバリアントの小規模精製（低タンパク質濃度で）は、同様の凝集をもたらさなかったが、しかしながら、切断されたＤＵＦバリアントの小規模精製はまた、ネイティブＰＡＧＥ上のタンパク質の特徴的なラダーが不均一であり、無秩序な凝集を示唆することを明らかにした。
●Ｋ１及びＫ１ｎドメイン含有バリアントは、より高い濃度で、及び精製試料の凍結融解後の凝集の増加傾向を有した。Ｋ１ドメインがこの不安定性の原因であった。しかしながら、Ｋ１又はＫ１ｎを欠く全てのバリアントは、凍結融解時及びより高い濃度（例えば、約３０ｍｇ／ｍｌの濃度）で非常に安定であった。

全長又は切断されたＫ１ドメインを含有するバリアントは非常に不溶性であり、低レベルの産生された可溶性組換えタンパク質は、精製後に不安定で凝集する傾向にある。バリアントを含有する可溶性Ｋ１の効率的な規模の拡大は不可能であった。

したがって、ＤＵＦの全長への伸長及び／又はＫ１（又はＫ１ｎ）ドメインの除去、好ましくは両方は、組換えタンパク質の溶解性及び安定性にとって重要である。

活性部位（ＫＡＳ）モチーフ
追加のＫＡＳモチーフを組換えキメラバリアントに操作して、これが免疫原性に影響を及ぼすかどうかを決定した。単一のＫＡＳ又は２つの連続したＫＡＳを、それらのＮ末端又は両方の末端でバリアントに付加した。更に、各ＫＡＳモチーフ間にＤＳＳＧリンカー配列を含有する４つのＫＡＳ残基の線形配列も、選択されたバリアントのＮ末端に付加した。

組換え体の精製プロファイル及びＨｉｓゲル染色分析は、追加のＫＡＳ残基が組換えタンパク質のいくらかの不安定性及び分解を引き起こしたことを明らかにした。分解及び不安定性は、４×線形ＫＡＳバリアントで最大であり、タンパク質分解処理が追加のＫＡＳ配列内で生じていたことを示唆している。隣接するＫＡＳ配列間のＤＳＳＧリンカーのその後の除去は、安定性を改善しなかった。

したがって、これらのバリアントは連続した複数のＫＡＳ配列が線形配列で発現された場合、タンパク質分解処理を行う傾向があると結論付けた。一方又は両方の末端に単一のＫＡＳを有する可溶性バリアントは、比較的安定であり、分解しにくく、精製収量が損なわれにくかった。

大規模なタンパク質収量及び安定性
可溶性タンパク質として発現され、非変性条件下で精製されたほとんどの組換えタンパク質は、それらの最終産物の比較的高い収量を有した（＞１０ｍｇ／Ｌ培養物及び２０ｍｇ／Ｌ培養物を超える）。

これらの同じ組換えタンパク質の収量は、それらを意図的に変性させる条件（例えば、尿素）下で、封入体又は可溶性画分から精製された場合、はるかに低かった（２．１～３．６ｍｇ／Ｌ培養物）。変性タンパク質が、変性条件下でＮｉ－親和性樹脂に対して低い結合親和性を有し、最終的に非変性緩衝液中で平衡化されたときに低い溶解性を有したことに留意した。加えて、変性形態から精製されたバリアントは、タンパク質が最初に可溶性タンパク質又は不溶性形態として発現されたかどうか、予め充填されたカラムを使用して又は緩いＮｉ－ＮＴＡ樹脂を使用して精製されたかどうかにかかわらず、緩衝されていない生理食塩水中で不安定であった。これらの結果は、変性剤が必要とされない場合、それらの使用を低減又は回避することが望ましい場合があることを示唆している。

１６℃での低発現温度は、ＫＤＡＫ１（配列番号３７）などの可溶性が低いタンパク質の可溶性発現を改善するのに有効であることが証明された。それにもかかわらず、陰イオン交換精製中の低イオン強度の緩衝液中のカラム上の濃縮は、４℃の低温でさえも、カラム上の凝集又は沈殿により収量を著しく損なった。これらのタンパク質について、陰イオン交換ステップをバイパスする精製は、より高い収量をもたらし、例えば、ＫＤＡＫ１の収量は、このように産生された場合２倍になった。また、ＫＤＡＫ１ｎ（配列番号３６）は可溶性タンパク質として発現されたが、後の精製プロセスでは溶液中で安定していないように見え、収量はわずか２．３ｍｇ／Ｌ培養物であった。

Ｋ１が不溶性であり、ＫＤＡ又はＤＡへのＫ１又はＫ１ｎの付加が、大規模精製における組換えバリアントの溶解性を減少させることを考慮すると、上記のように、ドメインが保護のために必要でない場合にＫ１の除外が好ましいように、Ｋ１領域が、Ｋ１含有キメラバリアントの不安定性に関与し得る。

ゲルのＨｉｓ染色により、複数のＫＡＳ（Ｋ）残基を含有する領域内に分解があることが立証されたが、Ｎｉ－親和性クロマトグラフィーによる収量への負の影響は観察されなかった。例えば、保護抗原、ＫＫＤＡＫ１ｎＫＫ（配列番号４０）及びＫＫＤＡＫＫ（配列番号３４）は、最終産物中の予想される全長タンパク質種の９０％超が１２～２１ｍｇ／Ｌ培養物の範囲の収量を有した。

還元条件は、尿素を使用して封入体から不溶性ＫＤｃＡＫ１ｎを抽出するのに好ましいことが見出された。非還元条件下では、還元条件下よりも高い濃度の尿素が必要であった。

同じ条件下でタンパク質が発現された場合、Ｃ末端Ｈｉｓタグはタンパク質産生及び溶解性大きな影響を及ぼさないことが分かった。

タグなし候補の精製において、陰イオン交換クロマトグラフィーは標的タンパク質を濃縮したが、ほとんどのＥ．ｃｏｌｉタンパク質が４～７のｐＩ範囲で酸性であり、それらの多くが標的タンパク質に近いｐＩを有するため、このステップは、樹脂への密接な結合親和性によって標的タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ宿主のものから効率的に分離することができなかった。しかしながら、興味深いことに、１Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の緩衝液を用いた室温でのサイズ排除クロマトグラフィーは重要なステップであるようであり、Ｅ．ｃｏｌｉ．のものから標的タンパク質の非常に効率的な分離を提供した。疎水性相互作用及びサイズ排除クロマトグラフィーの第２のラウンドでの更なる精製の後、両方の主要なタグのない候補を、高い均質性で９９％の純度に精製し、これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ネイティブＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析によって証明された。

実施例３：動物研究
歯周炎のマウスモデルにおけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ骨損失の予防
１．実験１
試験された抗原：ＫＤｃＡＫ１ｎ ５０μｇ、ＫＤｃＡＫ１ｎ ０．５μｇ、ＫＤＡ ５０μｇ、ＫＤＡ ０．５μｇ、ＫＤＡＫ１ ５０μｇ、ＫＤＡＫ１ ０．５μｇ。全ての抗原は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のミョウバン上に吸収した。

ＫＤｃＡＫ１ｎ：封入体から、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂でバッチ精製した、続いて非還元条件下で２Ｍ尿素－ＰＢＳに透析した。

ＫＤＡ及びＫＤＡＫ１：可溶性画分から、Ｎｉ－親和性（予め充填されたカラム）及び勾配溶出を伴う陰イオン交換クロマトグラフィーを行い、続いて非還元条件下でＰＢＳへの透析を行った。

マウス上顎におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失
ＫＤｃＡＫ１ｎ及びＫＤＡは、動物モデルにおいて骨損失から保護した。ＫＤｃＡＫ１ｎは、試験された両方の濃度で骨損失から保護し、一方、ＫＤＡは、５０μｇでのみ保護した（図３）。

抗体応答
歯周炎モデルにおける免疫化されたマウスの血清抗体サブクラス応答を、ＥＬＩＳＡによって調査した。抗血清を使用して、吸収された抗原として、熱殺傷Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株Ｗ５０を探査した。抗体応答は、得られたＥＬＩＳＡ力価からバックグラウンドレベルの３倍を引いたものとして表され、各力価は、１０匹の個々のマウスの平均±ｓ．ｄ．を表す（図４）。ＫＤｃＡＫ１ｎ（図４では「キメラ」と称される）及びＫＤＡは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ全細胞に対して最も強力な総ＩｇＧ及びＩｇＧ１応答を誘導し、続いてＫＤＡＫ１が誘導した。試験された抗原間では、５０μｇでのＩｇＧ及びＩｇＧ１抗体応答に顕著な差はなかった。

２．実験２
試験された抗原：ＫＤｃＡＫ１ｎ ５０μｇ、ＫＤｃＡＫ１ｎ ０．５μｇ、ＫＤＡ ５０μｇ、ＫＤＡ ０．５μｇ、ＫＤＡＫ１ ５０μｇ、ＫＤＡＫ１ ０．５μｇ。全ての抗原は、生理食塩水（ｐＨ７．４）中のミョウバン上に吸収した。

抗原を、実験１と同じ方法で精製した。

マウス上顎におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失
この実験では、実験１と同じ抗原を調査したが、それらはＰＢＳではなく生理食塩水を使用してミョウバンに吸収された。骨損失の結果は、実験１及び図３（データ示さず）に反映され、ＫＤｃＡＫ１ｎ及びＫＤＡのみが保護を示し、ミョウバン調製にＰＢＳ又は生理食塩水を使用することは実験結果に影響を及ぼさなかったことを示した。

抗体応答
試験された全ての抗原は、全細胞Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する同様の総ＩｇＧ及びＩｇＧ１応答を誘導した。ＫＤＡ及びＫＤＡＫ１は、ＫＤｃＡＫ１ｎと比較してより強力なＩｇＧ２ａ応答を誘導した（示さず）。

３．実験３
試験された抗原：ＫＫＤＡ１ｎＫＫ；ＫＤＡＫ１ｎ；ＫＫＤＡＫＫ．

全ての抗原を、Ｎｉ－親和性カラム、陰イオン交換、及びゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、非還元条件下で、可溶性画分から精製した。

ミョウバン吸収
抗原を吸収するアルヒドロゲル２％の能力を、抗原をミョウバンとともに４℃で６０分間穏やかに混合しながらインキュベーションすることによって試験した。次いで、ミョウバンをペレット化し、ブラッドフォードタンパク質アッセイを抗原のミョウバン吸着前後に実施した。全ての抗原は、９１．７％～９９．３％のパーセンテージでミョウバエに結合した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルはまた、前後のミョウバン吸収前後の試料に対しても実行され、ブラッドフォードアッセイのタンパク質の決定と一致していた。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓエピトープに対するｍＡｂを有するワクチン候補の事前スクリーニング
全てのワクチン候補は、陰性対照ｍｕＢＭ４ ｍＡｂと比較して大きな滴定曲線によって見られるように、ＫＡＳ２、ＡＢＭ３、及びＥＰ１ ｍＡｂに結合することができた。ＫＫＤＡ１ｎＫＫ、ＫＤＡＫ１ｎ、及びＫＫＤＡＫＫは、ＡＢＭ２ ｍＡｂに結合せず、このｍＡｂが認識するエピトープが、これらの構築物においてアクセス可能でないことを示す（示さず）。

マウス上顎におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失
ＫＫＤＡＫ１ｎＫＫ及びＫＫＤＡＫＫは、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導骨損失から保護した（図５）。

抗体応答
歯周炎モデルにおける免疫化されたマウスの血清抗体サブクラス応答を、ＥＬＩＳＡによって調査した。抗血清を使用して、吸着された抗原として、熱殺傷Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ株Ｗ５０を探査した。試験された全ての抗原は、様々な程度のＩｇＧ応答を生成した。保護ＫＫＤＡＫ１ｎＫＫ及びＫＫＤＡＫＫは、熱殺傷Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する堅牢な総ＩｇＧ及びＩｇＧ１応答を誘導した。

プールされた血清試料を使用して、ＥＬＩＳＡプレートに吸着されたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓドメインを探査した。ＡＢＭ２１（多量体及び二量体）及びＡＢＭ２１３（多量体及び二量体）に対する総ＩｇＧ応答は、全ての抗原によって様々な程度に生成された。ＤＵＦ２４３６に対するＩｇＧ応答は、完全なＤＵＦドメインを含有する抗原（ＫＫＤＡＫ１ｎＫＫ、ＫＤＡＫ１ｎ、及びＫＫＤＡＫＫ）においてのみ明らかであった。プールされた血清試料は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓエピトープペプチドを探査するためにも使用され、保護抗血清中に高いＫＡＳ力価の明確な傾向があったが、やはり保護と非保護の間の明確なパターンは観察されなかった。

４．実験４
試験された抗原
全ての抗原を、Ｎｉ－親和性クロマトグラフィー、続いて生理食塩水への透析を使用して、非還元条件下で精製した。

ＫＤｃＡＫ１ｎ－封入体から、尿素及び親和性カラムを使用して精製した（ＩＢ、尿素、ＡＣ）；ＫＤＡ－可溶性画分から、親和性カラム精製した（Ｓ、ＡＣ）；ＫＤＡ－可溶性画分から、尿素及び親和性カラムを使用して精製した（Ｓ、尿素、ＡＣ）；ＫＤＡ－可溶性画分から、尿素及びバッチ精製方法を使用して精製した（Ｓ、尿素、バッチ）；ＫＤＡＫ１－可溶性画分から、尿素及び親和性カラムを使用して精製した（Ｓ、尿素、ＡＣ）；ＫＤＡＫ１－封入体から、尿素及び親和性カラムを使用して精製した（ＩＢ、尿素、ＡＣ）；ＫＤＡＫ１－封入体から、尿素及びバッチ精製方法を使用した（ＩＢ、尿素、バッチ）。

Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓエピトープに対するｍＡｂを有するワクチン候補の事前スクリーニング。
全ての候補は、陰性対照ｍｕＢＭ４ ｍＡｂと比較して大きな滴定曲線によって見られるように、ＫＡＳ２、ＡＢＭ３、及びＥＰ１ ｍＡｂに結合することができた。抗原のいずれもＡＢＭ２ ｍＡｂに結合せず、このｍＡｂが認識するエピトープが、これらの構築物においてアクセス可能でないことを示す（示さず）。

マウス上顎におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失
ＫＤｃＡＫ１ｎ（ＩＢ、尿素、ＡＣ）、ＫＤＡ（Ｓ、ＡＣ）、ＫＤＡＫ１（Ｓ、尿素、ＡＣ）、ＫＤＡＫ１（ＩＢ、尿素、ＡＣ）ＫＤＡＫ１（ＩＢ、尿素、バッチ）、及びＫＤＡ（Ｓ、尿素、バッチ）は、ＫＤｃＡＫ１ｎ（ＩＢ、尿素、ＡＣ）、ＫＤＡ（Ｓ、ＡＣ）及びＫＤＡＫ１（ＩＢ、尿素、バッチ）が最良の保護を提供して、骨損失に対する顕著な保護を示した。ＫＤＡ（Ｓ、ＡＣ）で観察された有意な保護は、尿素での変性、例えば、ＫＤＡ（Ｓ、尿素、ＡＣ）で失われたことに留意されたい（図６）。

未分画の親和性精製された抗原が骨損失の保護を提供し、特に良好な保護が親和性精製された可溶性ＫＤＡで観察されたが、この保護は、変性Ｄ及びＡドメインのジスルフィド架橋を促進するであろう酸化条件下での尿素での処理で部分的に失われたことは注目に値する。重ねて、これらの結果は、尿素を避ける必要があり、可溶性の折り畳まれたドメインの調製が好ましい必要があることを示唆している。

５．実験５
試験された抗原
全ての抗原を、Ｎｉ－親和性クロマトグラフィー、続いて生理食塩水への透析を使用して、非還元条件下で精製した。試験された抗原は以下のとおりである：ＫＤｃＡＫ１ｎ－封入体から、尿素及び親和性カラムを使用して精製した（ＩＢ、尿素、ＡＣ）、ＫＤＡＫ１ｎＫ、ＫＤＡＫ、ＫＫＤＡＫＫ、ＫＫＤＡＫ１ｎＫＫ。

マウス上顎におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失
試験された全ての抗原は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導骨損失から保護した。（図７）。

実施例２及び３に提示された結果の要約及び考察
本報告書に記載の研究は、産生の容易さを促進し（溶解性及び安定性の改善に寄与する構成要素など）、並びにＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘発すること、及び／又はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ誘導歯槽骨損失を低減させることにおいて最も効果的であるするキメラワクチンの構成要素を特定するために、様々なワクチン候補の産生及び有効性を比較した。

動物歯周炎モデルにおける歯周骨損失の予防に有効であるが、従来技術のワクチンであるＫＤｃＡＫ１ｎは、Ｅ．ｃｏｌｉによって封入体として発現され、可変の溶解性及び安定性を示す。

ＫＤｃＡＫ１ｎは、Ｌｙｓ特異的ジンジパインＫｇｐの活性部位配列（ＫＡＳ又はＫ）と、Ｋｇｐポリタンパク質の処理された付着因子断片（Ａ１）との間の融合に基づいた。Ｋｇｐポリタンパク質ドメインの構造分析から、細胞表面上に見出されるＡ１付着因子断片が、ＤＵＦドメイン（Ｄ）、ＡＢＭドメイン（Ａ）、及びＫ１ドメイン（Ｋ１）の３つの別個の構造ドメインを含むことが今や明らかである。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの表面上のＫｇｐポリタンパク質を処理してプロテイナーゼ触媒ドメイン及び付着因子を放出することは、３８アミノ酸残基によるＤＵＦドメインのＮ末端切断を伴う。しかしながら、これらの余分なＮ末端３８残基を構築物に付加して、切断されたドメイン（Ｄｃ）の代わりに完全なＤＵＦドメインを産生し、非常に可溶性の組換えタンパク質（例えば、ＤＵＦ２４３６、ＫＤＡ、及びＫＫＤＡＫＫ）を産生した。

ＫＤｃＡＫ１ｎはまた、Ｋｇｐポリタンパク質の細胞表面処理に基づいて再びＣ末端が切断されたＫ１ドメイン（Ｋ１ｎ）を含み、Ａ１付着因子断片を産生する。Ｋ１ｎに欠損しているＣ末端配列を付加した完全Ｋ１ドメインは、タンパク質が依然としてＥ．ｃｏｌｉによる封入体として主に発現されていたため、溶解性の点で改善されなかった。部分的又は完全Ｋ１ドメインを有するほとんどの構築物は、いくつかの溶解性の問題を示したため、完全ＤＵＦドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉによる可溶性タンパク質としての構築物の発現に重要であり、可能であれば、キメラバリアントにＫ１ドメインを含めることを避けるべきであると結論付けた。

更に、動物実験からの歯周骨損失及びエピトープ分析データから、特に、保護抗原のいずれも、Ｋ１エピトープＡＢＭ５に結合する抗血清を生成しない場合、Ｋ１ドメインが保護に顕著に付加しない可能性があるようであった。したがって、Ｋ１（又はＫ１ｎ）ドメインの省略は、ワクチンの有効性に顕著に影響を及ぼすことなく、溶解性を改善する。

保護及び非保護血清を使用した、キメラの種々のセグメント（Ｋ、Ｄ、Ａ、及びＫ１）及び疑わしい重要なエピトープ（ＫＡＳ、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３、ＥＰ１）に対する抗体応答の検査は、いずれの明らかなパターンも提供しなかったが、保護されたそれらのキメラバリアントが、保護がいずれの１つのエピトープにも関連しない可能性があるが、歯周骨損失の完全な保護を確実にするために必要とされるエピトープの組み合わせに更に関連する可能性があるような、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ細胞全体及び既知の保護性エピトープ（ＫＡＳ、ＤＵＦ、ＡＢＭ）に対して強力な（ＩｇＧ／ＩｇＧ１）応答を示す傾向があることが明らかであった。

Claims (50)

1. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するためのキメラ又は融合タンパク質であって、前記タンパク質が、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、
   Ａ）前記第１のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれらからなり、
   Ｂ）前記第２のポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの付着因子ドメインのアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、
   前記第２のポリペプチドが、１つ以上の付着因子結合モチーフ（ＡＢＭ）の配列を含み、
   前記第２のポリペプチドが、
   ａ）切断された付着因子ドメイン（ＣＡＤ）の配列を含まず、かつ／あるいは
   ｂ）Ａｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの全長に実質的に対応するアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む、前記キメラ又は融合タンパク質。
2. 前記１つ以上のＡＢＭが、配列番号１５若しくは２１、配列番号１４若しくは２０、及び／又は配列番号１７若しくは２２に記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１に記載のキメラ又は融合タンパク質。
3. 前記１つ以上のＡＢＭが、配列番号１６又は配列番号１８、１９、若しくは２３のうちのいずれかに記載の配列、あるいはそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を含む、請求項１又は２に記載のキメラ又は融合タンパク質。
4. 前記キメラ又は融合タンパク質が、配列番号１２若しくは１３に記載のアミノ酸配列又はそれらに対して少なくとも８０％同一の配列を有するＣＡＤの配列又はその一部分を含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
5. Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの前記ＤＵＦ２４３６ドメインの前記全長に実質的に対応するアミノ酸配列が、Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインのＤＵＦ２４３６ドメインの長さの少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である配列である、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
6. Ａｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの前記ＤＵＦ２４３６ドメインの前記アミノ酸配列が、配列番号２４に記載の配列であるか、又はそれに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列である、請求項５に記載のキメラ又は融合タンパク質。
7. 前記第２のポリペプチドが、配列番号２６、２７、２８のうちのいずれか１つに記載の配列、又はそれに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
8. 前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドに連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
9. 前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドのＮ末端に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
10. 前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドに直接接続されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
11. 前記第１のポリペプチドが、リンカーを介して前記第２のポリペプチドに連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
12. 前記リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項１１に記載のキメラ又は融合タンパク質。
13. 前記ペプチドリンカーが、少なくとも２アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸を含み、好ましくは前記リンカーが、５０アミノ酸以下を含む、請求項１２に記載のキメラ又は融合タンパク質。
14. 前記ペプチドリンカーが、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である、請求項１２又は１３に記載のキメラ又は融合タンパク質。
15. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１～１１のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列を含むか、又はそれらからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
16. 前記第１のポリペプチドが、配列番号１若しくは２に記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列を含むか、又はそれらからなる、請求項１５に記載のキメラ又は融合タンパク質。
17. 前記キメラ又は融合タンパク質が、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－若しくはＬｙｓ－ジンジパインの前記活性部位のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％同一である配列を含むか、又はそれからなる１つ以上の更なるポリペプチドを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
18. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのＡｒｇ－又はＬｙｓ－ジンジパインの前記活性部位を含むか、又はそれらからなる前記１つ以上の更なるポリペプチドが、前記第１のポリペプチドのＮ末端、前記第１のポリペプチドのＣ末端、前記第２のポリペプチドのＣ末端の前記第２のポリペプチドのＮ末端に位置する、請求項１７に記載のキメラ又は融合タンパク質。
19. 前記１つ以上の更なるポリペプチドが、前記キメラ又は融合タンパク質の前記第１又は第２のポリペプチドに直接連結されている、請求項１８に記載のキメラ又は融合タンパク質。
20. 前記１つ以上の更なるポリペプチドが、ペプチドリンカーによって前記第１又は第２のポリペプチドに連結されている、請求項１９に記載のキメラ又は融合タンパク質。
21. 前記ペプチドリンカーが、少なくとも２アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸を含み、好ましくは前記リンカーが、５０アミノ酸以下を含む、請求項２０に記載のキメラ又は融合タンパク質。
22. 前記ペプチドリンカーが、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である、請求項２０又は２１に記載のキメラ又は融合タンパク質。
23. 前記１つ以上の更なるポリペプチドが、好ましくは、配列番号１～１１、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一の配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる、請求項１７～２２のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
24. 前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の更なるポリペプチドが、互いに同一であるか、又は少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一である、請求項２２に記載のキメラ又は融合タンパク質。
25. 前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の更なるポリペプチドが、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの異種ジンジパインの前記活性部位のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラ又は融合タンパク質。
26. 前記第１のポリペプチド及び前記１つ以上の更なるポリペプチドが、Ｌｙｓ－ジンジパインの前記活性部位の前記アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラ又は融合タンパク質。
27. 前記第１のポリペプチドが、Ｌｙｓ－ジンジパインの前記活性部位のアミノ酸配列を含み、前記１つ以上の更なるポリペプチドが、Ａｒｇ－ジンジパインの前記活性部位の前記アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のキメラ又は融合タンパク質。
28. 前記キメラ又は融合タンパク質が、配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、４１、若しくは４２のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列、又はそれらに対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、若しくは９９％の配列を含むか、又はそれらからなる、請求項１～２７のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
29. 前記タンパク質が、組換え発現系における発現を促進するため、かつ／又は前記タンパク質の精製を促進するために、追加のアミノ酸残基を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質。
30. 前記追加のアミノ酸が、任意選択でＮ末端メチオニン及び／又はアラニン残基を含む、Ｎ末端領域に１、２、３、４、又は５アミノ酸を含む、請求項２９に記載のキメラ又は融合タンパク質。
31. 前記追加のアミノ酸が、Ｃ末端領域に１、２、３、４、又は５アミノ酸を含む、請求項２９又は３０に記載のキメラ又は融合タンパク質。
32. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質をコードする、核酸。
33. 請求項３２に記載の核酸を含む、ベクター又は構築物。
34. 請求項３２に記載の核酸、又は請求項３３に記載のベクター若しくは構築物を含む、宿主細胞。
35. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質を含む、組成物。
36. 前記組成物が、ワクチン組成物であり、前記キメラ又は融合タンパク質に対する免疫応答を増強するための１つ以上のアジュバントを含む、請求項３５に記載の組成物。
37. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質と、任意選択で、前記キメラ又は融合タンパク質に対する免疫応答を増強するためのアジュバントと、を含む、ワクチン又は免疫刺激組成物。
38. 対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するための方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与することを含む、前記方法。
39. 対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する体液性免疫応答を誘導する方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与することを含む、前記方法。
40. 誘導される前記免疫応答が、Ｔｈ１免疫応答からＴｈ２免疫応答への切り替えを含む、請求項３９に記載の方法。
41. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化する方法であって、前記方法が、前記対象に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与することを含む、前記方法。
42. 対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療する方法であって、前記方法が、それを必要とする対象に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与することを含む、前記方法。
43. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓによる感染に関連する症状の重症度を低減するか、又は最小限に抑えるための方法であって、それを必要とする個体に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７８に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与することを含み、
    前記症状が、腫れた（ｓｗｏｌｌｅｎ）又は腫れた（ｐｕｆｆｙ）歯茎、出血しやすい歯茎、後退した歯茎、歯周りの歯周ポケット、歯の支持組織（歯周靭帯、セメント質、及び／又は歯槽骨）の喪失、歯茎と歯との間の膿、並びに歯肉炎からなる群から選択される、前記方法。
44. 前記方法が、抗菌化合物、抗炎症剤のうちの１つ以上の投与を更に含む、請求項４２又は３４に記載の方法。
45. ●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するか、
    ●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化するか、
    ●前記対象における前記Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療するか、又は
    ●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の１つ以上の症状の重症度を最小限に抑えるか、若しくは低減するための医薬の製造における、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ又は融合タンパク質の、使用。
46. ●対象におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに対する免疫応答を誘導するか、
    ●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染に対して対象を免疫化するか、
    ●前記対象における前記Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染を治療するか、又は
    ●Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ感染の１つ以上の症状の重症度を最小限に抑えるか、若しくは低減する際の使用のための、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物。
47. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を得るための方法であって、前記方法が、非ヒト動物に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与し、それによって、前記動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成することを含む、前記方法。
48. 前記方法が、前記動物又は前記動物の卵から、前記抗体を単離することを更に含む、請求項４７に記載の方法。
49. Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を含む抗体調製物であって、前記抗体調製物が、非ヒト動物に、請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質、請求項３５若しくは３６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を投与し、それによって、前記動物において、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに指向された抗体を生成すること、及び前記動物又はその卵から前記抗体を単離することによって得られる、前記抗体調製物。
50. 請求項１～３１のいずれか一項に記載のキメラ若しくは融合タンパク質を含む組成物、請求項３５若しくは２６に記載の組成物、又は請求項３７に記載のワクチン若しくは免疫刺激組成物を含むキットであって、任意選択で、前記キットが、１つ以上のサイトカイン及び／又はアジュバントを密封された容器中に含み、好ましくは、前記キットが、前記組成物が、個体を免疫化するために使用されることを示すラベル又は添付文書を含み、任意選択で、前記ラベル又は添付文書が、使用説明書を含む、前記キット。
    

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