JP2023532944A - 水中油型エマルジョンアジュバントの低温濾過 - Google Patents

Abstract

本開示は、低温でエマルジョンを濾過する方法に関する。具体的には、ワクチン製造のためのエマルジョンアジュバントの低温濾過が論議される。上記エマルジョンは、３種のコア成分： 油；水性構成要素；および界面活性剤を含み得、水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを通って濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度における水中油型エマルジョンの濾過と比較して増大される工程、を包含する方法によって生成され得る。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年６月３０日出願の米国仮特許出願第６３，０４５，９４９号（その内容全体は、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権の利益を主張する。

分野
本発明は、ワクチンのための水中油型エマルジョンを製造するという分野にある。本開示は、低温において水中油型エマルジョンを濾過する方法に関する。さらに、ワクチン製造のための低温での水中油型エマルジョンの濾過が考察される。

背景
抗原に対する免疫応答を増大させる薬剤または免疫学的薬剤は、ワクチン製造にとって重要である（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。アジュバントとして利用され得る水中油型エマルジョンは、免疫応答を増強する薬剤の１つのこのような例である（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。ワクチン製剤におけるこれらのアジュバントの使用は、ワクチン製剤中のアジュバントがワクチン有効性を増強し、促進し、そして長期化することから有利である（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４； Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８）。アジュバントはまた、それらが、パンデミック勃発の間により迅速にかつより広く応答を誘発することから、用量を節約するとして記載されている（Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８）。水中油型エマルジョンおよびリポソームアジュバントは、例えば、全世界のワクチン需要を満たすためにコスト効果的な機序として全世界でワクチン製造業者によって購入されている（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。

エマルジョンは、以前に、熱力学的に不安定として記載されている（Ｒａｐｏｓｏら （２０１３） Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ １－１３）。潜在的な安定化剤としては、多官能性賦形剤（例えば、界面活性剤、補助乳化剤（ｃｏ－ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、ポリマー、生体分子、およびコロイド性粒子が挙げられる（Ｒａｐｏｓｏら （２０１３） Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ １－１３； Ｔａｍｉｌｖａｎａｎら （２０１０） Ｊ． Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ １（１）：１１－２９）。

１つのこのような水中油型アジュバントは、「ＭＦ５９」^{（登録商標）}として公知である（ＷＯ９０／１４８３７； Ｐｏｄｄａ ＆ Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ （２００３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：１９７－２０３； Ｐｏｄｄａ （２００１） Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２６７３－２６８０）。ＭＦ５９^{（登録商標）}は、スクアレン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０としても公知）、およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５としても公知）のサブミクロン水中油型エマルジョンである。それはまた、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液を含み得る（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ （編． Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５ （ＩＳＢＮ ０－３０６－４４８６７－Ｘ； Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅシリーズの第４２巻）． ＩＳＢＮ： １－５９２５９－０８３－７． 編． Ｏ’Ｈａｇａｎ； Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （編．Ｌｅｖｉｎｅら）． 第３版， ２００４． ＩＳＢＮ ０－８２４７－４０７１－８）。エマルジョンの容積組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０および約０．５％ Ｓｐａｎ（登録商標） ８５であり得る（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ （編． Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５ （ＩＳＢＮ ０－３０６－４４８６７－Ｘ； Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ シリーズの第４２巻）． ＩＳＢＮ： １－５９２５９－０８３－７． 編． Ｏ’Ｈａｇａｎ； Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ (編． Ｌｅｖｉｎｅら）． 第３版， ２００４． ＩＳＢＮ ０－８２４７－４０７１－８）。

ＭＦ５９^{（登録商標）}は、スクアレン相中にＳｐａｎ（登録商標） ８５および水性相中にＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０を分散させ、続いて、高速混合して、粗エマルジョンを形成することによって商業スケールで製造される（Ｏ’Ｈａｇａｎ （２００７） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６（５）：６９９－７１０）。次いで、この粗エマルジョンを、マイクロフルイダイザーを反復して通過させて、均質な油滴サイズを有するエマルジョンを生成する（Ｏ’Ｈａｇａｎ（２００７） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６（５）：６９９－７１０）。次いで、その微小流動化されたエマルジョンは、大きな油滴を除去するために０．２２μｍ膜を経て濾過され、得られるエマルジョンの平均液滴サイズは、４℃において少なくとも３年間にわたって変化しないままである（Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （編． Ｌｅｖｉｎｅら）． 第３版， ２００４． ＩＳＢＮ ０－８２４７－４０７１－８）。次いで、最終的なエマルジョンのスクアレン含有量が測定される（ＥＰ－Ｂ－２０２９１７０）。

代表的な濾過適用において膜を通過する水中油型エマルジョンのスループットは、多くの要因（膜構造、アジュバント懸濁物の粘性、アジュバント粒度、アジュバント粒子濃度、およびフィルター材料の抵抗が挙げられる）によって影響を及ぼされ得る（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。フィルターの全体的なスループットは、フラックスおよび耐久力によって決定される（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。フラックスは、駆動力（例えば、入り口の圧力）、流動特性（粘性）および膜構造（例えば、孔サイズ、非対称性）によって決定される（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。低減されたフラックスは、処理時間に顕著に影響を及ぼし得る（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。耐久力は、膜構造によって、およびプロセスの流れの特性（例えば、アジュバント粒子負荷）によって決められる（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。非対称性の膜および増大した圧力はともに、以前から、膜耐久力の増強と関連付けられている（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。

粘性に関しては、懸濁物は、代表的には、高温におけるほど粘性は少ないが、全ての温度において、粘性は水より高い（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。より粘性の溶液のフラックスは、水性溶液のものより高い（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。

膜の詰まりは、エマルジョンの濾過の間に考慮するに値する別の要因である。流れは、代表的には、膜の粒子詰まりおよびアジュバントの粒子特徴が原因で、濾過開始後に急速に減少する（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。従って、膜の孔の妨害は、フィルター耐久力における重要な要因であり、流束減衰の主な機序である（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。より小さな粒子の流れは、以前に、膜耐久力の増大に関連付けられた（Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４）。

細菌のような外来の汚染物質の保持は、エマルジョンの膜濾過の間の別の重要な考慮事項である。多数の要因が、アジュバントと細菌、膜との間の相互作用；膜の詰まり；アジュバント表面張力；膜の特性；温度；および操作圧力を含め、細菌保持に影響を及ぼすことが関連付けられた（Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８）。エマルジョンでの細菌の被覆は、膜の孔の妨害および低いアジュバント表面張力を有するとして、それほど強くない保持と関連している（Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８）。温度の上昇は、保持の増大と関連付けられた（Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８）。
エマルジョンの膜濾過と関連付けられた多くの問題を巧みに回避するために使用される、先行技術において開示される機序のうちの１つは、濾過する前にエマルジョンを加熱することを含む（Ｔａｍｉｌｖａｎａｎら （２０１０） Ｊ． Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ １（１）：１１－２９）。エマルジョン温度の上昇は、濾過の増強と関連付けられたが、エマルジョンの完全性およびワクチンにおけるそれらのその後の性能を顕著に損ない得る。
水中油型エマルジョン（例えば、ＭＦ５９^{（登録商標）}）の調製は、代表的には、バイオバーデン低減濾過、濾過滅菌、粒度濾過などのような多数のレベルの濾過を含む。製造の文脈において、これらの濾過工程は、大量のフィルター膜を利用する。このことに鑑みると、濾過方法およびシステムにおける改善が必要とされる。

国際公開第９０／１４８３７号 欧州特許第２０２９１７０号

Ｒｏｇｅｒｓら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ １：１－４ Ｏｎｒａｅｄｔら （２０１０） ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｉｓｓｕｅ ８ Ｒａｐｏｓｏら （２０１３） Ｐｈａｒｍ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ １－１３） Ｔａｍｉｌｖａｎａｎら （２０１０） Ｊ． Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ １（１）：１１－２９ Ｐｏｄｄａ ＆ Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ （２００３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：１９７－２０３ Ｐｏｄｄａ （２００１） Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２６７３－２６８０ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ （編． Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ） Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５ （ＩＳＢＮ ０－３０６－４４８６７－Ｘ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅシリーズの第４２巻）． ＩＳＢＮ： １－５９２５９－０８３－７ 編． Ｏ’Ｈａｇａｎ； Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （編．Ｌｅｖｉｎｅら）．第３版， ２００４． ＩＳＢＮ ０－８２４７－４０７１－８ Ｏ’Ｈａｇａｎ （２００７） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ６（５）：６９９－７１０ Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ （編． Ｌｅｖｉｎｅら）． 第３版， ２００４． ＩＳＢＮ ０－８２４７－４０７１－８）

要旨
本開示は、低温において膜濾過に供されたエマルジョンアジュバントを提供する。

本開示はまた、低温においてエマルジョンアジュバントを濾過する方法を提供する。

図面の説明
図１は、ＳＨＦ膜の５℃、３０℃、および４０℃の温度におけるスループットを示す。

図２は、ＳＨＣ膜の５℃、３０℃、および４０℃におけるスループットを示す。

図３は、ＥＣＶ膜の５℃および４０℃におけるスループットを示す。

詳細な説明
本明細書で示される本開示の多くの改変および他の実施形態は、これらの開示が関連する当業者に、前出の説明および関連付けられた図面の中に示される教示の利益を有することを想起させる。従って、本開示が、開示される特定の実施形態に限定されるべきではないこと、ならびに改変および他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されることは、理解されるべきである。特定の用語が本明細書で使用されるが、それらは、包括的かつ説明の意味で使用されるに過ぎず、限定する目的で使用されるのではない。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）、「１つの、ある（ａｎ）、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明らかに示さなければ、複数形をも含むことが意図される。さらに、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う（ｗｉｔｈ）」またはこれらのバリエーションは、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される程度まで、このような用語は、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同じように包括的であることが意図される。

用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、制限のない連結動詞である。これらの動詞（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」）のうちの１またはこれより多くの任意の形態または時制は、同様に制限がない。例えば、１またはこれより多くの工程を「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、それらの１またはこれより多くの工程のみを有することに限定されず、他の列挙されていない工程をも網羅する。同様に、１またはこれより多くの特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の組成物は、それらの１またはこれより多くの特徴のみを有することに限定されず、他の列挙されていない特徴をも網羅する。本明細書中のある特定の実施形態に関して本明細書で提供される任意のおよび全ての例、または例示的な文言（例えば、「のような、例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示をよりよく例証することが意図されるに過ぎず、別段特許請求される本開示の範囲に対して限定を課すものではない。

水中油型エマルジョンアジュバント
本発明の方法は、水中油型エマルジョンの製造のために使用される。これらのエマルジョンは、３種のコア成分： 油；水性構成要素；および界面活性剤を含む。

水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンにおけるアジュバントとしての使用に適していることが見出されている。種々のこのようなエマルジョンは公知であり、それらは代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）でありかつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、直径が概して５μｍ未満であり、サブミクロン直径すら有していてもよく、これらの小さなサイズは、安定なエマルジョンを提供するためにマイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、それらが濾過滅菌に供され得ることから好ましい。

油は、動物（例えば、魚類）または植物性の供給源に由来し得る。エマルジョンは、薬学的用途が意図されることから、油は、代表的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物性油の供給源としては、堅果、種子および穀物が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油（最も一般に利用可能である）は、堅果の油の例である。ホホバ油が使用され得る（例えば、ホホバの実から得られる）。種子の油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油などが挙げられる。穀物のグループにおいて、コーン油は最も容易に入手できるものであるが、他の穀物（例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなど）の油が使用されてもよい。グリセロールおよび１，２－プロパンジオールの６～１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子の油の中には天然に存在しないが、堅果および種子の油から出発して、適切な物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳に由来する脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。純粋な油を動物供給源から得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段のための手順は、当該分野で周知である。多くの分枝鎖の油が、５個の炭素のイソプレンユニットから生化学的に合成され、一般にテルペノイドといわれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサヘキサエンとして公知の分枝状の不飽和テルペノイドを含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）は、油の別の例である。本発明の油は、例えば、スクアレンおよび少なくとも１種のさらなる油を含む油の混合物（または組み合わせ）を含み得る。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。

他の有用な油は、トコフェロール、特に、スクアレンとの組み合わせにおけるトコフェロールである。エマルジョンの油相が、トコフェロールを含む場合、αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロールまたはζトコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α－トコフェロールが好ましい。Ｄ－α－トコフェロールおよびＤＬ－α－トコフェロールはともに、使用され得る。好ましいα－トコフェロールは、ＤＬ－α－トコフェロールである。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば、異なる塩および／または異性体をとり得る。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。このトコフェロールの塩が使用されることになる場合、好ましい塩は、コハク酸塩である。スクアレンおよびαトコフェロール（例えば、ＤＬ－α－トコフェロール）を含む油の組み合わせが使用され得る。

水性構成要素は、淡水（例えば、注射用水）であり得るか、またはさらなる構成要素（例えば、溶質）を含み得る。例えば、それは、緩衝液を形成する塩を含み得る（例えば、クエン酸塩またはリン酸塩（例えば、ナトリウム塩））。代表的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、代表的には、５～２０ｍＭ 範囲に含まれる。

界面活性剤は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得るが、その場合、範囲１～１０の中にあるＨＬＢは、一般に、その界面活性剤が、水の中より油の中で可溶性であり、範囲１０～２０の中にあるＨＬＢは、油の中より水の中で可溶性であることを意味する。エマルジョンは、好ましくは、少なくとも１０（例えば、少なくとも１５）、または好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する少なくとも１種の界面活性剤を含む。

本発明は、以下が挙げられるが、これらに限定されない界面活性剤とともに使用され得る： ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎｓといわれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭの商品名の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、直線状のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、反復エトキシ（オキシ－１，２－エタンジイル）基の数が変化し得、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質（例えば、ホスファジチルコリン（レシチン））；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングロコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０））；ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮ（登録商標）として公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）およびソルビタンモノラウレート。エマルジョンの中に含めるために好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ（登録商標） ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。

界面活性剤の混合物は、エマルジョンの中に含められ得る（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０／Ｓｐａｎ（登録商標） ８５混合物、またはＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０／Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００混合物）。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）およびオクトキシノール（例えば、ｔ－オクチルフェノキシ－ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００））の組み合わせもまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０～２０の範囲にあるＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、ＨＬＢ １５．０を有する）および１～１０の範囲にあるＨＬＢ値を有する界面活性剤（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標） ８５、ＨＬＢ １．８を有する）を含み得る。

界面活性剤の適切な量（重量％）は、以下である： ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０） ０．０１～１％、特に、約０．１％； オクチル－またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの中の他の洗剤） ０．００１～０．１％、特に、０．００５～０．０２％； ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９） ０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％および特に０．１～１％または約０．５％。

油および界面活性剤の選択が何であろうと、界面活性剤は、乳化に必要とされる量の過剰で含まれ、その結果、遊離界面活性剤は、水性相の中に留まる。最終的なエマルジョンにおける遊離界面活性剤は、種々のアッセイによって検出され得る。例えば、スクロース勾配遠心分離法は、エマルジョン液滴を水性相から分離するために使用され得、次いで、その水性相が分析され得る。遠心分離は、上記２相を分離するために使用され得る。上記油滴は合体して、表面へと浮上し、その後、水性相の界面活性剤含有量は、例えば、ＨＰＬＣまたは任意の他の適切な分析技術を使用して決定され得る。

本開示に従う特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０、およびＳｐａｎ（登録商標） ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの容積組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ（登録商標） ８５であり得る。重量に関しては、これらの比は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ（登録商標） ８５になる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」^{（登録商標）}として公知である。ＭＦ５９^{（登録商標）} エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、上記水中油型エマルジョンアジュバントは、９．７５ｍｇ スクアレンを有する水中スクアレン型エマルジョンアジュバントである。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。それはまた、Ｓｐａｎ（登録商標） ８５（例えば、１％において）および／またはレシチンを含み得る。これらのエマルジョンは、２～１０％ スクアレン、２～１０％ トコフェロールおよび０．３～３％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１である。なぜならこれは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０は、約５：２の容積比を示し得る。１つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ（登録商標） ８０を溶解して、２％ 溶液を与え、次いで、この溶液のうちの９０ｍＬと（５ｇのＤＬ－α－トコフェロールおよび５ｍＬ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、その混合物を微小流動化することによって作製され得る。その得られるエマルジョンは、例えば、１００ｎｍ～２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ－ＭＰＬを含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）およびトコフェロール（例えば、α－トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍＬ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１００μｇ／ｍＬ α－トコフェロールスクシネート）においてこれら３種の構成要素を含み得、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの構成要素の任意の寄与を含むべきである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ－ＭＰＬを含み得る。上記水性相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアラン、ポリソルベート８０およびｐｏｌｏｘａｍｅｒ ４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中に製剤化され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ－１」アジュバント（０．０５～１％ Ｔｈｒ－ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）中でスレオニルＭＤＰとともに使用されている。それは、「ＡＦ」アジュバント（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）におけるように、Ｔｈｒ－ＭＤＰなしでも使用され得る。
・０．５～５０％の油、０．１～１０％のリン脂質、および０．０５～５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。好ましいリン脂質構成要素は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
・代謝可能でない油（例えば、ライトミネラルオイル）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０またはＳｐａｎ（登録商標） ８０）のサブミクロンの水中油型エマルジョン。添加剤が含められ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することによって生成されるサポニン－親油性結合体（例えば、ＧＰＩ－０１００））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が、らせん状ミセルとして会合されるエマルジョン。

エマルジョンの形成
エマルジョン構成要素は、エマルジョンを形成するために混合され得る。

エマルジョンにおける油滴は、５０００ｎｍもしくはこれ未満、例えば、４０００ｎｍもしくはこれ未満、３０００ｎｍもしくはこれ未満、２０００ｎｍもしくはこれ未満、１２００ｎｍもしくはこれ未満、１０００ｎｍもしくはこれ未満の平均サイズ、例えば、８００～１２００ｎｍの間または３００ｎｍ～８００ｎｍの間の平均サイズを有し得る。

サイズ＞１．２μｍを有するエマルジョン中の油滴の数は、５×１０^１１／ｍｌもしくはこれ未満、例えば、５×１０^１０／ｍｌもしくはこれ未満、または５×１０^９／ｍｌもしくはこれ未満であり得る。

エマルジョンの平均油滴サイズは、ホモジナイザー中で第１のエマルジョンの構成要素を混合することによって達成され得る。ホモジナイザーは、垂直および／または水平様式で稼動し得る。商業的状況における便宜のために、インラインホモジナイザーが好ましい。

商業スケールの製造のために、上記ホモジナイザーは、理想的には、少なくとも３００Ｌ／時間、例えば、≧４００Ｌ／時間、≧５００Ｌ／時間、≧６００Ｌ／時間、≧７００Ｌ／時間、≧８００Ｌ／時間、≧９００Ｌ／時間、≧１０００Ｌ／時間、≧２０００Ｌ／時間、≧５０００Ｌ／時間、またはさらには≧１００００Ｌ／時間の流速を有するべきである。適切な高耐久力ホモジナイザーは、市販されている。

好ましいホモジナイザーは、３×１０^５～１×１０^６ ｓ^－１の間、例えば、３×１０^５～７×１０^５ ｓ^－１の間、４×１０^５～６×１０^５ ｓ^－１の間、例えば、約５×１０^５ ｓ^－１の剪断速度を提供する。

いくつかの実施形態において、エマルジョン構成要素は、何度も均質化され得る（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回またはより多くの回数）。容器およびホモジナイザーの長い繋がりの必要性を回避するために、エマルジョン構成要素は、循環され得る。特に、エマルジョンは、第１のエマルジョン構成要素を、ホモジナイザーを複数回（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、１００回などの回数）経て循環させることによって形成され得る。しかし、余りに多くのサイクルは、再合体を生じ得ることから望ましくない場合もある（Ｊａｆａｒｉら （２００８） Ｆｏｏｄ Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ ２２：１１９１－１２０２）。従って、油滴のサイズは、ホモジナイザー循環が、所望の液滴サイズに達していることおよび／または再合体が起こっていないことをチェックするために使用される場合にモニターされ得る。

ホモジナイザーを通る循環は、エマルジョンにおける油滴の平均サイズを低減し得ることから有利である。循環はまた、第１のエマルジョンのサイズ＞１．２μｍを有する油滴の数を低減し得ることから有利である。第１のエマルジョンにおける平均液滴サイズおよび＞１．２μｍの液滴の数のこれらの低減は、下流プロセスにおいて利点を提供し得る。特に、ホモジナイザーを通るエマルジョン構成要素の循環は、改善された微小流動化プロセスをもたらし得、これは、それ自体、改善された濾過性能を提供し得る。改善された濾過性能は、濾過の間の内容物の喪失、例えば、水中油型エマルジョンがＭＦ５９^{（登録商標）}である場合にはスクアレン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０およびＳｐａｎ（登録商標） ８５の喪失を少なくし得る。

本発明の方法は、大規模で使用され得る。従って、１つの方法は、容積が１リットルより大きい、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどである第１のエマルジョンを調製することを含み得る。

微小流動化
その形成の後に、エマルジョンは、その平均油滴サイズを低減するために、および／または＞１．２μｍのサイズを有する油滴の数を低減するために、微小流動化され得る。

微小流動化機器は、幾何額的に固定されたチャネルを経て高圧かつ高速で、投入される構成要素の流れを進ませることによって平均油滴サイズを低減する。相互作用チャンバへと入るときの圧力（「第１の圧力」ともいわれる）は、構成要素がマイクロフルイダイザーへと供給される間の時間のうちの少なくとも８５％、例えば、エマルジョンがマイクロフルイダイザーへと供給される間の時間のうちの少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％にわたって、実質的に一定（すなわち、±１５％；例えば、±１０％、±５％、±２％）であり得る。

微小流動化装置は、代表的には、少なくとも１つの増圧ポンプ（ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ ｐｕｍｐ）（好ましくは、２つのポンプであり、これらは同期化されていてもよい）および相互作用チャンバを含む。上記増圧ポンプ（これは、理想的には、電気油圧式駆動される）は、高圧（すなわち、第１の圧力）を提供して、エマルジョンを、相互作用チャンバの中へとこれを経て押し進める。増圧ポンプの同期性質は、上記で考察されるエマルジョンの実質的に一定の圧力を提供するために使用され得る。このことは、エマルジョン液滴が全て、微小流動化の間の剪断力の実質的に同じレベルに曝されることを意味する。

エマルジョンにおける平均油滴サイズおよびサイズ＞１．２μｍを有する油滴の数の低減は、改善された濾過性能を提供し得る。改善された濾過性能は、例えば、濾過の間の内容物の喪失、例えば、エマルジョンがＭＦ５９^{（登録商標）}である場合にはスクアレン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０およびＳｐａｎ（登録商標） ８５の喪失を少なくし得る。

好ましい微小流動化装置は、１７０バール～２７５０バール（およそ２５００ｐｓｉ～４００００ｐｓｉ）の間の圧力で、例えば、約３４５バール、約６９０バール、約１３８０バール、約２０７０バールなどで稼動する。

好ましい微小流動化装置は、１×１０^６ ｓ^－１超、例えば、≧２．５×１０^６ ｓ^－１、≧５×１０^６ ｓ^－１、≧１０^７ ｓ^－１などの剪断速度を提供する相互作用チャンバを有する。

微小流動化装置は、平行して使用される多数の相互作用チャンバ（例えば、２個、３個、４個、５個またはより多く）を含み得るが、１個の相互作用チャンバを含むことは、より有用である。

微小流動化の結果は、油滴の平均サイズが５００ｎｍもしくはこれより小さい水中油型エマルジョンであり得る。この平均サイズは、エマルジョンの濾過滅菌を容易にすることから、特に有用である。油滴の数で少なくとも８０％が、５００ｎｍもしくはこれより小さい、例えば、４００ｎｍもしくはこれより小さい、３００ｎｍもしくはこれより小さい、２００ｎｍもしくはこれより小さい、または１６５ｎｍもしくはこれより小さい平均サイズを有するエマルジョンは、特に有用である。さらに、サイズ＞１．２μｍを有するエマルジョンにおける油滴の数は、５×１０^１０／ｍｌもしくはこれより少ない、例えば、５×１０^９／ｍｌもしくはこれより少ない、５×１０^８／ｍｌもしくはこれより少ない、または２×１０^８／ｍｌもしくはこれより少ない。

微小流動化装置におけるエマルジョン容器は、不活性ガス、例えば、０．５バールまでの窒素下で保持され得る。これは、エマルジョン構成要素が酸化することを防止する。このことは、エマルジョン構成要素のうちの１つがスクアレンである場合に特に有利である。これは、エマルジョンの安定性の増大をもたらす。

本発明の方法は、大規模で使用され得る。従って、１つの方法は、１リットルより大きい、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの容積を微小流動化することを含み得る。

濾過
微小流動化の後に、上記エマルジョンは濾過される。濾過は、均質化および微小流動化手順から残存している任意の大きな油滴を除去する。全体的な数としては小さいが、これらの油滴は、容積としては大きい可能性があり、凝集の核形成部位（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）として作用し得、貯蔵の間にエマルジョン分解をもたらす。さらに、濾過は、フィルター滅菌を達成し得る。

製造プロセスにおける水中油型エマルジョンの濾過は、濾過工程の１または多数のレベルおよび／またはタイプの工程を含み得る。これらのうちのいくつかは、バイオバーデンを低減するための濾過、濾過滅菌、粒度濾過などを含み得る。従って、種々の実施形態において、本開示は、エマルジョンの、好ましくは水中油型エマルジョンの濾過を改善するための方法を記載する。１またはこれより多くの好ましい局面において、本開示によって具現化される濾過のタイプとしては、バイオバーデン低減濾過、滅菌濾過、および粒度濾過が挙げられるが、これらに限定されない。

濾過に適した特定の濾過膜は、エマルジョンの流体特性および必要とされる濾過の程度に依存する。フィルターの特性は、微小流動化されるエマルジョンの濾過のその適切性に影響を及ぼし得る。例えば、フィルターの孔サイズおよび表面特性は、重要であり、特に、スクアレンベースのエマルジョンを濾過する場合には重要であり得る。

本発明とともに使用される膜の孔サイズは、不要な液滴を保持しながら、所望の液滴の通過を許容するべきである。例えば、それは、＜２００ｎｍの液滴の通過を許容しながら、≧１μｍのサイズを有する液滴を保持するべきである。０．２μｍまたは０．２２μｍのフィルターが理想的であり、これはまた、濾過を達成し得る。

上記エマルジョンは、例えば、０．４５μｍフィルターを経て予備濾過され得る。予備濾過および濾過は、大きい方の孔を有する第１の膜および小さい方の孔を有する第２の膜を含む公知の二重層フィルターの使用によって１工程で達成され得る。二重層フィルターは、本発明で特に有用である。第１の層は、理想的には、＞０．３μｍ（例えば、０．３～２μｍの間または０．３～１μｍの間、または０．４～０．８μｍの間、または０．５～０．７μｍの間）の孔サイズを有する。第１の層における≦０．７５μｍの孔サイズが好ましい。従って、第１の層は、例えば、０．６μｍまたは０．４５μｍの孔サイズを有し得る。第２の層は、理想的には、第１の層の孔サイズの７５％未満（および理想的には、半分より小さい）（例えば、第１の層の孔サイズの２５～７０％の間または２５～４９％の間、例えば、３０～４５％の間、例えば、第１の層の孔サイズの１／３または４／９）の孔サイズを有する。従って、第２の層は、孔サイズ＜０．３μｍを有し得る（例えば、０．１５～０．２８μｍの間または０．１８～０．２４μｍの間、例えば、０．２μｍまたは０．２２μｍの孔サイズの第２の層）。１つの例では、大きい方の孔を有する第１の膜層は、０．４５μｍフィルターを提供する一方で、小さい方の孔を有する第２の膜層は、０．２２μｍフィルターを提供する。

上記濾過膜および／または上記予備濾過膜は、非対称性であり得る。非対称性の膜は、膜の一方の側面から他方の側面へと孔のサイズが変動する（例えば、出口の側面より入り口の側面の方が孔のサイズが大きい）膜である。非対称性の膜の一方の側面は、「粗孔化表面（ｃｏａｒｓｅ ｐｏｒｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）」といわれ得る一方で、上記非対称性の膜の他方の側面は、「細孔化表面（ｆｉｎｅ ｐｏｒｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ）」と言われ得る。二重層フィルターでは、一方または（理想的には）両方の層が、非対称性であり得る。

上記濾過膜は、多孔性または同質性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）であり得る。同質性の膜は通常、１０～２００μｍの範囲に及ぶ密なフィルムである。多孔性の膜は、多孔性の構造を有する。１つの実施形態において、上記濾過膜は多孔性である。二重層フィルターでは、両方の層が多孔性であってもよいし、両方の層が同質性であってもよいし、一方が多孔性で一方が同質性の層であってもよい。好ましい二重層フィルターは、両方の層が多孔性であるフィルターである。

１つの実施形態において、上記エマルジョンは、非対称性の親水性多孔性膜を経て予備濾過され、次いで、上記予備濾過膜より小さな孔を有する別の非対称性の親水性多孔性膜を経て濾過される。これは、二重層フィルターを使用し得る。

上記フィルター膜は、無菌であることを担保するために、使用前にオートクレーブにかけられ得る。

濾過膜は、代表的には、ＰＴＦＥ（ポリ－テトラ－フルオロ－エチレン）、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）、ナイロン（ポリアミド）、ＰＰ（ポリプロピレン）、セルロース（セルロースエステルを含む）、ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）、ニトロセルロースなどのようなポリマー支持材料から作製される。これらは、種々の特性を有し、ある支持体は、本質的に疎水性であり（例えば、ＰＴＦＥ）、他の支持体は、本質的に親水性である（例えば、酢酸セルロース）。しかし、これらの本質的な特性は、膜表面を処理することによって改変され得る。例えば、それらを他の材料（例えば、他のポリマー、グラファイト、シリコーンなど）で処理して、膜表面をコーティングすることによって、親水性にしたかまたは疎水性にした膜を調製することは公知である（ＷＯ９０／０４６０９）。二重層フィルターでは、上記２つの膜は、異なる材料から、または（理想的には）同じ材料から作製され得る。

本発明とともに使用するための理想的なフィルターは、疎水性（ポリスルホン）表面よりむしろ親水性表面を有する（Ｂａｕｄｎｅｒら （２００９） Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ． ２６（６）：１４７７－８５； Ｄｕｐｕｉｓら （１９９９） Ｖａｃｃｉｎｅ １８：４３４－９； Ｄｕｐｕｉｓら （２００１） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：２９１０－８； Ｂｕｒｋｅら （１９９４） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７０：１１１０－９）。親水性表面を有するフィルターは、親水性材料から、または疎水性材料を親水性にすることによって形成され得、本発明とともに使用するために好ましいフィルターは、親水性ポリエーテルスルホン膜である。いくつかの異なる方法が、疎水性ＰＥＳ膜を親水性ＰＥＳ膜へと変換することが公知である。これは、よくあるとすれば、上記膜を親水性ポリマーでコーティングすることによって達成された。親水性ポリマーを、上記ＰＥＳへと永久的に付着させることを提供するために、親水性コーティング層が通常、架橋反応またはグラフト化のいずれかに供される。官能化可能な鎖の末端を有する疎水性ポリマーの表面特性を改変するためのプロセスは、上記ポリマーとリンカー部分の溶液とを接触させて、共有結合を形成する工程、および次いで、上記反応した疎水性ポリマーと改変薬剤の溶液とを接触させる工程を包含する（ＷＯ９０／０４６０９）。直接的な膜コーティングによってＰＥＳ膜を親水性にする方法であって、アルコールで予め濡らし、次いで、親水性モノマー、多官能性モノマー（架橋剤）および重合開始剤を含む水性溶液中に浸す工程を含む方法が、さらに使用される（米国特許第４，６１８，５３３号）。上記モノマーおよび架橋剤は、次いで、膜表面上に架橋された親水性ポリマーのコーティングを形成するために、熱で開始またはＵＶで開始される重合を使用して重合される（米国特許第４，６１８，５３３号）。類似の方法は、親水性ポリマー（ポリアルキレンオキシド）および少なくとも１種の多官能性モノマー（架橋剤）の水性溶液中にＰＥＳ膜を浸し、次いで、モノマーを重合して、非抽出性親水性コーティングを提供することによって、ＰＥＳ膜をコーティングする工程を包含する（米国特許第６，１９３，０７７号；米国特許第６，４９５，０５０号）。次いで、そのＰＥＳ膜は、ＰＥＳ膜が低温ヘリウムプラズマ処理、続いて、親水性モノマー、Ｎ－ビニル－２－ピロリジン（ＮＶＰ）を膜表面へとグラフト化することに供されるグラフト化反応によって親水性にされ得る（Ｃｈｅｎら （１９９９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ７２：１６９９－１７１１）。

コーティングに依拠しない方法では、ＰＥＳは、溶媒中に溶解され得、可溶性の親水性添加剤ブレンドされ、次いで、そのブレンドされた溶液は、親水性膜を、例えば、沈殿させることによってもしくは共重合を開始することによってキャストするために使用される（米国特許第４，９４３，３７４号；米国特許第６，０７１，４０６号；米国特許第４，７０５，７５３号；米国特許第５，１７８，７６５号；米国特許第６，４９５，０４３号；米国特許第６，０３９，８７２号；米国特許第５，２７７，８１２号）。例えば、ＰＥＳ、ＰＶＰ、ポリエチレンイミン、および脂肪族ジグリシジルエーテルのブレンドのポリマー溶液を作製し、その溶液の薄いフィルムを形成し、そのフィルムを膜として沈殿させて形成される、低い膜抽出性を有し、超純水耐性の迅速な回復を可能にし、架橋された相互侵入ポリマーネットワーク構造（ｉｎｔｅｒ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する親水性電荷改変膜を調製する方法が、使用され得る（米国特許第５，２７７，８１２； 米国特許第５，５３１，８９３号）。

ハイブリッドアプローチが使用され得る。このアプローチでは、親水性添加剤が膜形成の間に存在し、コーティングとして後に添加される（米国特許第４，９６４，９９０号）。

ＰＥＳ膜を親水性にすることはまた、低温ＣＯ_２－プラズマでの処理によるＰＥＳ膜の親水性改変を含む、低温プラズマでの処理によって達成され得る（Ｗａｖｈａｌ ＆ Ｆｉｓｈｅｒ （２００２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｔ Ｂ： Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｈｙｓｉｃｓ ４０：２４７３－８８）。

ＰＥＳ膜を親水性にすることは、酸化によっても達成され得る（ＷＯ２００６／０４４４６３）。この方法は、疎水性ＰＥＳ膜を、低い表面張力を有する液体の中で予め濡らし、その濡らしたＰＥＳ膜を、酸化剤の水性溶液に曝し、次いで加熱することを含む（ＷＯ２００６／０４４４６３）。

相反転がまた、使用され得る（Ｅｓｐｉｎｏｚａ－Ｇｏｍｅｚら （２００３） Ｒｅｖｉｓｔａ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｄａｄ Ｑｕｉｍｉｃａ ｄｅ Ｍｅｘｉｃｏ ４７：５３－５７）。

理想的な親水性ＰＥＳ膜は、ＰＶＰ（親水性）でＰＥＳ（疎水性）を処理することによって得られ得る。ＰＶＰの代わりにＰＥＧ（親水性）で処理すると、親水性にされたＰＥＳ膜が与えられることが見出された。このＰＥＳ膜は、（特に、スクアレン含有エマルジョンを使用する場合に）容易に詰まり、不都合なことには、オートクレーブの間にホルムアルデヒドを放出する。

好ましい二重層フィルターは、第１の親水性ＰＥＳ膜および第２の親水性ＰＥＳ膜を有する。

公知の親水性膜としては、Ｂｉｏａｓｓｕｒｅ（Ｃｕｎｏ製）；ＥｖｅｒＬＵＸ^ＴＭ ポリエーテルスルホン；ＳＴｙＬＵＸ^ＴＭ ポリエーテルスルホン（ともにＭｅｉｓｓｎｅｒ製）；Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ、Ｍｉｌｌｅｘ ＨＰ、Ｍｉｌｌｉｐａｋ ６０、Ｍｉｌｌｉｐａｋ ２００およびＤｕｒａｐｏｒｅ ＣＶＧＬ０１ＴＰ３膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）；Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ^ＴＭ ＥＸ ＥＤＦ膜、Ｓｕｐｏｒ^ＴＭ ＥＡＶ；Ｓｕｐｏｒ^ＴＭ ＥＢＶ、Ｓｕｐｏｒ^ＴＭ ＥＣＶ、Ｓｕｐｏｒ^ＴＭ ＥＫＶ（全てＰａｌｌ製）；Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ^ＴＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製）；Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈの親水性ＰＥＳ膜；およびＷｏｌｆｔｅｃｈｎｉｋのＷＦＰＥＳ ＰＥＳ膜が挙げられる。

濾過の間に、上記エマルジョンは、成功裡の濾過滅菌を促進するために、４０℃もしくはこれより低い、例えば、３０℃もしくはこれより低い、例えば、２０℃もしくはこれより低い、例えば、１０℃もしくはこれより低い、例えば、２～８℃もしくはこれより低い、例えば、５℃もしくはこれより低い温度において維持され得る。エマルジョンによっては、これらが４０℃より高い温度で存在する場合に、滅菌フィルターを通過しなくてもよい。

濾過工程を、第２のエマルジョンの生成の２４時間以内に、例えば、１８時間以内に、１２時間以内に、６時間以内に、２時間以内に、３０分以内に行うことは有利である。なぜならこの時間の後に、フィルターを詰まらせずに滅菌フィルターを経て第２のエマルジョンを通過させられない可能性もあるからである（Ｌｉｄｇａｔｅら （１９９２） Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９（７）：８６０－８６３）。

本発明の方法は、大規模で使用され得る。従って、１つの方法は、１リットルより大きい、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの容積を濾過することを含み得る。

１またはこれより多くの局面において、本明細書で記載される場合、低減されたバイオバーデンに適した膜は、本明細書で記載される方法で使用され得る。これらの膜としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｇｕａｒｄ、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＡＶ、Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ ＤＢＬ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄなどが挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる局面において、本明細書で記載される場合、濾過滅菌煮適した膜は、本明細書で記載される方法で使用され得る。これらの膜としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＦ、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＢＶ、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＣＶ、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＫＶ、Ｐａｌｌ Ｅｍｆｌｏｎ ＩＩ、Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ、Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＥＤＦ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＸＬＧ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ Ｐｌａｔｉｎｕｍなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。

さらなる局面において、本明細書で記載される場合、粒度濾過に適した膜は、本明細書で記載される方法で使用され得る。これらの膜としては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｇｕａｒｄ、Ｐａｌｌ Ｓｕｐｏｒ ＥＡＶ、Ｐａｌｌ Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ ＩＩ ＤＢＬ、Ｐａｌｌ ＨＤＣ、Ｐａｌｌ Ｐｏｓｉｄｙｎｅ、Ｐａｌｌ ＰｒｅＦｌｏｗ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。

最終的なエマルジョン
微小流動化および濾過の結果は、油滴の平均サイズが２２０ｎｍ未満、例えば、１５５±２０ｎｍ、１５５±１０ｎｍまたは１５５±５ｎｍであり得る、およびサイズ＞１．２μｍを有する油滴の数が５×１０^８／ｍｌもしくはこれ未満、例えば、５×１０^７／ｍｌもしくはこれ未満、５×１０^６／ｍｌもしくはこれ未満、２×１０^６／ｍｌもしくはこれ未満、または５×１０^５／ｍｌもしくはこれ未満であり得る水中油型エマルジョンである。

本明細書で記載されるエマルジョンの平均油滴サイズは、概して５０ｎｍ以上である。

本発明の方法は、大規模で使用され得る。従って、１つの方法は、１リットルより大きい、例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなどの容積で最終的なエマルジョンを調製することを含み得る。

上記水中油型エマルジョンがいったん形成された後、それは、滅菌ガラスボトルへと移され得る。そのガラスボトルは、サイズが５Ｌ、８Ｌ、または１０Ｌであり得る。あるいは、上記水中油型エマルジョンは、滅菌可撓性バッグ（フレックスバッグ）へと移され得る。上記フレックスバッグは、サイズが５０Ｌ、１００Ｌまたは２５０Ｌなどであり得る。さらに、上記フレックスバッグは、このフレックスバッグをシステムへと接続するために、１またはこれより多くの滅菌コネクターと嵌められ得る。フレックスバッグと滅菌コネクターとを使用すると、ガラスボトルと比較して有利である。なぜならフレックスバッグはガラスボトルより大きく、それは、１つのバッチで製造されたエマルジョン全てを貯蔵するためにフレックスバッグを取り替える必要がない場合もあるからである。これは、エマルジョンの製造のために滅菌閉鎖系を提供し得、これは、最終的なエマルジョンに存在する不純物の機会を低減し得る。これは、最終的なエマルジョンが製薬目的で使用される場合、例えば、最終的なエマルジョンがＭＦ５９^{（登録商標）} アジュバントである場合、特に重要であり得る。

最終的なエマルジョンにおける油の好ましい量（容積％）は、２～２０％の間、例えば、約１０％である。約５％または約１０％というスクアレン含有量が特に有用である。３０～５０ｍｇ／ｍｌの間のスクアレン含有量（ｗ／ｖ）が有用である（例えば、３５～４５ｍｇ／ｍｌ、３６～４２ｍｇ／ｍｌ、３８～４０ｍｇ／ｍｌの間など）。

最終的なエマルジョンにおける界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である： ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０） ０．０２～２％、特に約０．５％または約１％； ソルビタンエステル（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標） ８５） ０．０２～２％、特に約０．５％または約１％； オクチル－またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００） ０．００１～０．１％、特に０．００５または０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９） ０．１～２０％、好ましくは０．１～１０％および特に０．１～１％または約０．５％。４～６ｍｇ／ｍｌの間のポリソルベート８０含有量（ｗ／ｖ）が有用である（例えば、４．１～５．３ｍｇ／ｍｌの間）。４～６ｍｇ／ｍｌ野間だのソルビタントリオレエート含有量（ｗ／ｖ）が有用である（例えば、４．１～５．３ｍｇ／ｍｌの間）。

上記プロセスは、以下の水中油型エマルジョンのうちのいずれかを調製するために特に有用である：
・スクアレン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０）、およびソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）を含むエマルジョン。上記エマルジョンの容積組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ ソルビタントリオレエートであり得る。重量に関しては、これらの量は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ ソルビタントリオレエートになる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」^{（登録商標）}として公知である。ＭＦ５９^{（登録商標）} エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
・スクアレン、α－トコフェロール（理想的にはＤＬ－α－トコフェロール）、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、（重量で）２～１０％ スクアレン、２～１０％ α－トコフェロールおよび０．３～３％ ポリソルベート８０（例えば、４．３％ スクアレン、４．７％ α－トコフェロール、１．９％ ポリソルベート８０）を有し得る。スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１（例えば、０．９０）である。なぜならこれは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比、または約１１：５の重量において存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にポリソルベート８０を溶解して２％ 溶液を与え、次いで、この溶液のうちの９０ｍｌと（５ｇのＤＬ－α－トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、その混合物を微小流動化することによって作製され得る。その得られたエマルジョンは、例えば、１００～２５０ｎｍの間の、好ましくは約１８０ｎｍのサイズを有するサブミクロン油滴を有し得る。
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３－Ｏ－デアセチル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄ－ＭＰＬ」）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアレン、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）およびトコフェロール（例えば、α－トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１００μｇ／ｍｌ α－トコフェロールスクシネート）においてこれら３種の構成要素を含み得、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの構成要素の任意の寄与を含むべきである。上記エマルジョンはまた、３ｄ－ＭＰＬを含み得る。上記エマルジョンはまた、サポニン（例えば、ＱＳ２１）を含み得る。上記水性相は、リン酸緩衝液を含み得る。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンセトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはマンニドエステル（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ（登録商標） ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは熱可逆的である、および／または少なくとも９０％の、２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴（容積で）を有する（米国特許公開第２００７／００１４８０５号）。上記エマルジョンはまた、以下のうちの１またはこれより多くのものを含み得る： アルジトール；凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）；および／またはアルキルポリグリコシド。それはまた、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、その化学構造が糖環を含まないもの）を含み得る（ＷＯ２００７／０８０３０８）。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

これらのエマルジョンの組成（上記ではパーセンテージの表現で表される）は、希釈または濃縮によって（例えば、２もしくは３のような整数で、または２／３もしくは３／４のような分数で）改変され得、ここでそれらの比は、同じままである。例えば、２倍濃縮のＭＦ５９^{（登録商標）}が、約１０％ スクアレン、約１％ ポリソルベート８０および約１％ ソルビタントリオレエートを有する。濃縮形態は、エマルジョンの所望斧最終濃度を与えるために（例えば、抗原溶液で）希釈され得る。

本発明のエマルジョンは、理想的には、２℃～８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には直射光を避けて保管されるべきである。特に、本発明のスクアレン含有エマルジョンおよびワクチンは、スクアレンの光化学的分解を回避するために保護されるべきである。本発明のエマルジョンが貯蔵される場合、これは、好ましくは不活性雰囲気（例えば、Ｎ_２またはアルゴン）中にある。

ワクチン
水中油型エマルジョンアジュバントを単独で患者に投与する（例えば、患者に別個に投与した抗原に関してアジュバント効果を提供する）ことは可能であるが、アジュバントと抗原とを投与前に混合して、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を形成することの方が、より通常のことである。エマルジョンおよび抗原の混合は、準備なしに、使用時に、起こり得るか、またはワクチン製造の間に、充填する前に起こり得る。本発明の方法は、両方の状況で適用され得る。

従って、本発明の方法は、上記エマルジョンと抗原構成要素とを混合するさらなるプロセス工程を包含し得る。代替として、上記方法は、上記アジュバントをキットへと、キット構成要素として抗原構成要素と一緒にパッケージングするさらなる工程を包含し得る。

従って、全体として、本発明は、混合ワクチンを調製する場合にまたは混合する準備のできた抗原およびアジュバントを含むキットを調製する場合に、使用され得る。混合を製造の間に行う場合、混合されるバルク抗原およびエマルジョンの容積は、代表的には、１リットルより大きい（例えば、≧５リットル、≧１０リットル、≧２０リットル、≧５０リットル、≧１００リットル、≧２５０リットルなど）。混合を使用時に行う場合、混合される容積は、代表的には、１ミリリットルより小さい（例えば、≦０．６ｍｌ、≦０．５ｍｌ、≦０．４ｍｌ、≦０．３ｍｌ、≦０．２ｍｌなど）。両方の場合に、エマルジョンおよび抗原溶液の実質的に等しい溶液が混合される（すなわち、実質的に１：１（例えば、１．１：１～１：１．１の間、好ましくは１．０５：１～１：１．０５の間、およびより好ましくは１．０２５：１～１：１．０２５の間））ことが、通常である。しかし、いくつかの実施形態において、過剰のエマルジョンおよび過剰の抗原が使用されてもよい（ＷＯ２００７／０５２１５５）。過剰容積の１つの構成要素が使用される場合、その過剰は概して、少なくとも１．５：１、例えば、≧２：１、≧２．５：１、≧３：１、≧４：１、≧５：１などである。

抗原およびアジュバントが別個の構成要素としてキット内で提示される場合、それらは、キット内で互いから物理的に分離しており、この分離は、種々の方法で達成され得る。例えば、上記構成要素は、別個の容器（例えば、バイアル）中にあり得る。次いで、２本のバイアルの内容物は、必要とされる場合、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、それを他方のバイアルへと添加することによって、または両方のバイアルの内容物を別個に取り出し、それらを第３の容器中で混合することによって、混合され得る。

別の取り合わせにおいて、上記キットの構成要素のうちの一方は、シリンジ中にあり、他方は、容器（例えば、バイアル）中にある。上記シリンジは、その内容物を混合用のバイアルへと挿入するために（例えば、針とともに）使用され得、次いで、その混合物は、シリンジの中へと引き抜かれ得る。次いで、上記シリンジの混合した内容物は、患者へと、代表的には、新しい滅菌針を経て投与され得る。シリンジ中に一方の構成要素をパッケージすると、患者に投与するための別個のシリンジを使用する必要性が排除される。

別の好ましい取り合わせでは、上記２つのキット構成要素が、一緒に、しかし同じシリンジの中に別個に保持される（例えば、デュアルチャンバシリンジ（ＷＯ２００５／０８９８３７；米国特許第６，６９２，４６８号； ＷＯ００／０７６４７； ＷＯ９９／１７８２０； 米国特許第５，９７１，９５３号； 米国特許第４，０６０，０８２号； ＥＰ－Ａ－０５２０６１８； ＷＯ９８／０１１７４）。上記シリンジが作動される場合（例えば、患者への投与中に）、その２つのチャンバの内容物は、混合される。この取り合わせは、使用時の別個の混合工程の必要性を回避する。

種々のキット構成要素の内容物は、概して全てが液体形態にある。いくつかの取り合わせにおいて、構成要素（代表的には、エマルジョン構成要素よりむしろ抗原構成要素）は、乾燥形態に（例えば、凍結乾燥形態）あり、他方の構成要素は、液体形態にある。その２つの構成要素は、乾燥した構成要素を再活性化し、患者に投与するための液体組成物を与えるために、混合され得る。凍結乾燥された構成要素は、代表的には、シリンジよりむしろバイアル内に配置される。乾燥された構成要素は、安定化剤（例えば、ラクトース、スクロースまたはマンニトール）、およびこれらの混合物（例えば、ラクトース／スクロース混合物、スクロース／マンニトール混合物など）を含み得る。１つの考えられる取り合わせは、プレフィルドシリンジ中で液体エマルジョン構成要素およびバイアル中で凍結乾燥された抗原構成要素を使用する。

ワクチンが、エマルジョンおよび抗原に加えて構成要素を含む場合、これらのさらなる構成要素は、１つまたは２つのキット構成要素の中に含まれてもよいし、第３のキット構成要素の一部であってもよい。

本発明の混合ワクチンにまたは個々のキット構成要素に適切な容器としては、バイアルおよび使い捨てシリンジが挙げられる。これらの容器は、滅菌されているべきである。

組成物／構成要素がバイアル中に配置される場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック材料から作製される。バイアルは、好ましくは組成物をそこに添加する前に滅菌される。ラテックス感受性の患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有の栓で密封され、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。１つの実施形態において、バイアルは、ブチルゴム栓を有する。上記バイアルは、ワクチン／構成要素の単一用量を含んでいてもよいし、１より多くの用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。１つの実施形態において、バイアルは、１０×０．２５ｍｌ用量のエマルジョンを含む。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される。

バイアルは、プレフィルドシリンジがキャップ（例えば、ルアーロック）へと挿入され得、そのシリンジの内容物がバイアルへと排出され得（例えば、凍結乾燥された材料をその中で再構成するために）、そのバイアルの内容物がシリンジの中へと戻され得るように適合されたキャップを有し得る。上記バイアルからシリンジを除去した後、次いで、針が取り付けられ得、その組成物が患者に投与され得る。上記キャップは、そのキャップにアクセスし得る前にシールまたはカバーが除去されなければならないように、好ましくはシールまたはカバーの内側に位置する。

組成物／構成要素がシリンジへとパッケージングされる場合、そのシリンジは通常、これに取り付けられた針を有しないが、別個の針が、アセンブルおよび使用のためにそのシリンジとともに供給され得る。セーフティーニードルが好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が代表的である。シリンジは、記録管理を容易にするために、ロット番号、インフルエンザシーズンおよび内容物の使用期限が印字され得るピールオフラベルとともに提供され得る。シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、プランジャーが、吸引している間に偶発的に外れないようにストッパーを有する。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、ワクチンの単一用量を含む。上記シリンジは、針を取り付ける前に先端を密封する先端キャップを概して有し、その先端キャップは、好ましくはブチルゴムから作製される。上記シリンジおよび針が別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムの覆いとともに嵌められる。

上記エマルジョンは、バイアルまたはシリンジへとパッケージングする前に、緩衝液で希釈され得る。代表的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。希釈は、アジュバントの相対的割合を保持しながら、「強度が半分」のアジュバントを提供するために、例えば、アジュバントの構成要素の濃縮を低減し得る。

容器は、半用量容積を示すように、例えば、小児への送達を容易にするように、印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ 用量を構成するシリンジは、０．２５ｍｌ 容積を示す印を有し得る。

ガラス容器（例えば、シリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製される容器を使用することが好ましい。

種々の抗原が、水中油型エマルジョンとともに使用され得る（ウイルス抗原（例えば、ウイルス表面タンパク質）；細菌抗原（例えば、タンパク質および／またはサッカリド抗原）；真菌抗原；寄生生物抗原；および腫瘍抗原が挙げられるが、これらに限定されない）。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタイン・バーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンのために特に有用である。例えば：
・インフルエンザウイルス抗原． これらは、生ウイルスまたは不活性化ウイルスの形態をとり得る。不活性化ウイルスが使用される場合、ワクチンは、ビリオン全体、スプリットビリオン、または精製表面抗原（ヘマグルチニンを含み、通常は、ノイラミニダーゼも含む）を含み得る。インフルエンザ抗原はまた、ビロソームの形態において提示され得る。上記抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５および／またはＨ１６から選択される任意のヘマグルチニンサブタイプを有し得る。ワクチンは、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む１つまたはこれより多くの（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはこれより多くの）インフルエンザウイルス株に由来する抗原を含み得る（例えば、一価Ａ／Ｈ５Ｎ１もしくはＡ／Ｈ１Ｎ１ワクチン、または三価Ａ／Ｈ１Ｎ１ ＋ Ａ／Ｈ３Ｎ２ ＋ Ｂワクチン）。上記インフルエンザウイルスは、再集合株（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ）であってもよく、逆遺伝学技術によって得られていてもよい（Ｈｏｆｆｍａｎｎら （２００２） Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：３１６５－３１７０； Ｓｕｂｂａｒａｏら （２００３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３０５：１９２－２００； Ｌｉｕら （２００３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４：５８０－５９０； Ｏｚａｋｉら （２００４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８：１８５１－１８５７； Ｗｅｂｂｙら （２００４） Ｌａｎｃｅｔ ３６３：１０９９－１１０３）。従って、上記ウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つまたはこれより多くのＲＮＡセグメントを含み得る（代表的には、Ａ／ＰＲ／８／３４からの６セグメントであり、ＨＡおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する（すなわち、６：２再集合））。上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（例えば、胚形成鶏卵）または細胞培養のいずれかで増殖され得る。細胞培養が使用される場合、細胞基質は、代表的には、哺乳動物細胞株（例えば、ＭＤＣＫ； ＣＨＯ； ２９３Ｔ； ＢＨＫ； Ｖｅｒｏ； ＭＲＣ－５； ＰＥＲ．Ｃ６； ＷＩ－３８；など）である。インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる： Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞（ＷＯ９７／３７０００； Ｂｒａｎｄｓら （１９９９） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ９８：９３－１００； Ｈａｌｐｅｒｉｎら （２００２） Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：１２４０－７； Ｔｒｅｅら （２００１） Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３４４４－５０）；アフリカミドリザル腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞（Ｉｓｔｎｅｒら （１９９８） Ｖａｃｃｉｎｅ １６：９６０－８； Ｋｉｓｔｎｅｒら （１９９９） Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ ９８：１０１－１１０； Ｂｒｕｈｌら （２０００） Ｖａｃｃｉｎｅ １９：１１４９－５８）；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｐａｕら （２００１） Ｖａｃｃｉｎｅ １９：２７１６－２１）。ウイルスが哺乳動物細胞株で増殖される場合、組成物は、有利なことには、卵タンパク質（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによって、アレルゲン性を低減する。ワクチンの単位用量は、代表的には、ヘマグルチニン（ＨＡ）含有量を参照して標準化され、代表的には、ＳＲＩＤによって測定される。既存のワクチンは、代表的には、約１５μｇのＨＡ／株を含むが、より低用量が、特にアジュバントを使用する場合には、使用され得る。分割用量（fｒａｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ）（例えば、’Ａ（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、’ＡおよびＶｓが使用されている（ＷＯ０１／２２９９２； Ｈｅｂｅら （２００４） Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １０３（１－２）：１６３－７１）。より高用量も同様である（例えば、３×または９×用量（Ｔｒｅａｎｏｒら （１９９６） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７３：１４６７－７０； Ｋｅｉｔｅｌら （１９９６） Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３：５０７－１０）。従って、ワクチンは、インフルエンザ株あたり０．１～１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは０．１～５０μｇの間、例えば、０．１～２０μｇ、０．１～１５μｇ、０．１～１０μｇ、０．１～７．５μｇ、０．５～５μｇなどを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などを含む。
・ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を含む）。その抗原は、代表的には、エンベロープ抗原である。
・Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原． この抗原は、好ましくは、組換えＤＮＡ法によって、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母における発現後に得られる。天然ウイルスＨＢｓＡｇとは異なり、組換え酵母発現抗原は、グリコシル化されていない。それは、リン脂質を含む脂質マトリクスを含め、実質的に球形の粒子（平均直径 約２０ｎｍ）の形態にあり得る。天然ＨＢｓＡｇ粒子とは異なり、酵母発現粒子は、ホスファチジルイノシトールを含み得る。ＨＢｓＡｇは、サブタイプａｙｗｌ、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、ａｙｒ、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒｑ－およびａｄｒｑ＋のうちのいずれかに由来し得る。
・鉤虫， 特にイヌにおいて認められるとおり（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｎｕｍ）。この抗原は、組換えＡｃ－ＭＴＰ－１（アスタシン様メタロプロテアーゼ）および／またはアスパラギン酸ヘモグロビナーゼ（Ａｃ－ＡＰＲ－１）であり得、これは、バキュロウイルス／昆虫細胞系において分泌タンパク質として発現され得る（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら （２００６） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７４：９６１－７； Ｌｏｕｋａｓら （２００５） ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ２（１０）： ｅ２９５）。
・単純ヘルペスウイルス抗原（ＨＳＶ）． 本発明とともに使用するための好ましいＨＳＶ抗原は、膜糖タンパク質ｇＤである。ＨＳＶ－２株に由来するｇＤ（「ｇＤ２」抗原）を使用することは好ましい。組成物は、Ｃ末端膜アンカー^領域が欠失されているｇＤの形態、例えば、天然のタンパク質のアミノ酸１～３０６を含み、Ｃ末端においてアスパラギンおよびグルタミンの付加を伴う短縮型ｇＤ）を使用し得る（ＥＰ－Ａ－０１３９４１７）。タンパク質のこの形態は、成熟した２８３アミノ酸タンパク質を生じるように切断されるシグナルペプチドを含む。アンカーの欠失は、上記タンパク質が可溶性形態で調製されることを可能にする。
・ヒトパピローマウイルス抗原（ＨＰＶ）． 本発明とともに使用するための好ましいＨＰＶ抗原は、ＬＩキャプシドタンパク質であり、これは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として公知の構造を形成するためにアセンブルされ得る。上記ＶＬＰは、酵母細胞における（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける）または昆虫細胞における（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ細胞（例えば、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）における、もしくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞における）ＬＩの組換え発現によって生成され得る。酵母細胞に関しては、プラスミドベクターが、ＬＩ遺伝子を運び得る；昆虫細胞に関しては、バキュロウイルスベクターが、ＬＩ遺伝子を運び得る。より好ましくは、組成物は、ＨＰＶ－１６およびＨＰＶ－１８株の両方に由来するＬＩ ＶＬＰを含む。この二価組み合わせは、非常に有効であることが示されている（Ｈａｒｐｅｒら （２００４） Ｌａｎｃｅｔ ３６４（９４４７）：１７５７－６５）。ＨＰＶ－１６およびＨＰＶ－１８株に加えて、ＨＰＶ－６およびＨＰＶ－１１株に由来するＬＩ ＶＬＰを含めることも、可能である。発がん性ＨＰＶ株の使用はまた、可能である。ワクチンは、１つのＨＰＶ株につき２０～６０μｇ／ｍｌ野間だ（例えば、約４０μｇ／ｍｌ）のＬＩを含み得る。
・炭疽抗原． 炭疽は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓによって引き起こされる。適切なＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原としては、Ａ構成要素（致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ））が挙げられ、これらはともに、防御抗原（ＰＡ）として公知の共通のＢ構成要素を共有し得る（Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ （２００１） ３９：８５－１００； Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉら （１９９８） Ｖａｃｃｉｎｅ １６：８８０－８８４； Ｓｔｅｐａｎｏｖら （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４ΑΛ５５Α６０）。上記抗原は、必要に応じて無毒化され得る（Ｊ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｃｌｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ （２００１） ３９：８５－１００； Ｄｅｍｉｃｈｅｌｉら （１９９８） Ｖａｃｃｉｎｅ １６：８８０－８８４； Ｓｔｅｐａｎｏｖら （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４ΑΛ５５Α６０）。
・Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原． 種々のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原が公知である。適切な抗原としては、莢膜サッカリド（例えば、５型および／または８型株に由来する）およびタンパク質（例えば、ＩｓｄＢ、Ｈｌａなど）が挙げられる。莢膜サッカリド抗原は、理想的には、キャリアタンパク質に結合体化される。
・Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原． 種々のＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が公知である。適切な抗原としては、莢膜サッカリド（例えば、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および／または２３Ｆのうちの１種またはこれより多くのものに由来する）およびタンパク質（例えば、ニューモライシン、無毒化ニューモライシン、ポリヒスチジントライアドタンパク質Ｄ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒｉａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）（ＰｈｔＤ）などが）が挙げられる。莢膜サッカリド抗原は、理想的には、キャリアタンパク質に結合体化される。
・がん抗原． 種々の腫瘍特異的抗原が公知である。本発明は、肺がん、黒色腫、乳がん、前立腺がんなどに対する免疫治療的応答を誘発する抗原とともに使用され得る。

抗原の溶液は、通常、エマルジョンと混合される（例えば、１：１容積比で）。この混合は、充填する前に、ワクチン製造業者によって行われるか、または医療従事者によって使用時に行われるかのいずれかであり得る。

薬学的組成物
抗原の溶液は、通常、エマルジョンと混合される（例えば、１：１容積比で）。この混合は、充填する前に、ワクチン製造業者によって行われるか、または医療従事者によって使用時に行われるかのいずれかであり得る。

本発明の方法を使用して作製される組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、エマルジョンおよび選択肢的な抗原に加えて、構成要素を含み得る。

上記組成物は、保存剤（例えば、チメロサールまたは２－フェノキシエタノール）を含み得る。しかし、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）であるべきであることが好ましい（例えば、チメロサール非含有（Ｂａｎｚｈｏｆｆ （２０００） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ７１：９１－９６； ＷＯ０２／０９７０７２）。水銀を含まないワクチンおよび構成要素が、より好ましい。

組成物のｐＨは、概して５．０～８．１の間、より代表的には、６．０～８．０の間、例えば、６．５～７．５の間である。本発明のプロセスは、従って、パッケージングの前に、ワクチンのｐＨを調節する工程を含み得る。

上記組成物は、好ましくは無菌である。上記組成物は、好ましくは発熱物質がない（例えば、 １用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシンユニット（標準尺度））、および好ましくは１用量あたり＜０．１ ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくはグルテン非含有である。

上記組成物は、１回の免疫のための物質を含んでいてもよいし、多数回の免疫のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の取り合わせにおいては好ましい。

ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、小児には半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が投与され得る。

処置方法およびワクチンの投与
ワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、小児には半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が投与され得る。

本発明は、本発明の方法を使用して調製されるキットおよび組成物を提供する。本発明の方法に従って調製された組成物は、ヒト患者への投与のために適しており、本発明は、患者において免疫応答を惹起する方法であって、上記方法は、上記患者にこのような組成物を投与する工程を包含する方法を提供する。

本発明はまた、医薬として使用のためのこれらキットおよび組成物を提供する。

本発明はまた、患者において免疫応答を惹起するための医薬の製造における（ｉ）抗原の水性調製物；および（ｉｉ）本発明に従って調製された水中油型エマルジョンの使用を提供する。

これらの方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答を含む。

上記組成物は、種々の方法で投与され得る。最も好ましい免疫経路は、（例えば、腕または脚への）筋肉内注射によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内（Ｇｒｅｅｎｂａｕｍら （２００４） Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：２５６６－７７； Ｚｕｒｂｒｉｇｇｅｎら （２００３） Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２：２９５－３０４； Ｐｉａｓｃｉｋ （２００３） Ｊ Ａｍ Ｐｈａｒｍ Ａｓｓｏｃ （Ｗａｓｈ ＤＣ）． ４３：７２８－３０）、経口（Ｍａｎｎら （２００４） Ｖａｃｃｉｎｅ ２２：２４２５－９）， ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ （Ｈａｌｐｅｒｉｎら （１９７９） Ａｍ Ｊ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ６９：１２４７－５０； Ｈｅｒｂｅｒｔら （１９７９） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １４０：２３４－８）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（Ｃｈｅｎら （２００３） Ｖａｃｃｉｎｅ ２１：２８３０－６）などが挙げられる。

本発明に従って調製されたワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。患者は、１歳齢未満、１～５歳齢、５～１５歳齢、１５～５５歳齢、または少なくとも５５歳齢であり得る。上記患者は、高齢者（例えば、≧５０歳齢、好ましくは≧６５歳齢）、若年者（例えば、＜５歳齢）、入院患者、医療従事者、軍隊（ａｒｍｅｄ ｓｅｒｖｉｃｅ）および軍人、妊婦、慢性病の、免疫不全の患者、および海外旅行する人々であり得る。上記ワクチンは、これらのグループにとってのみ適しているわけではないが、より一般に、集団において使用され得る。

本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家への同じ医療相談または通院の間に）患者に投与され得る。

中間プロセス
本発明はまた、水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、上記方法は、第１のエマルジョンを微小流動化して、第２のエマルジョンを形成する工程、および次いで、上記第２のエマルジョンを濾過する工程を包含する方法を提供する。上記第１のエマルジョン、上記の特性を有する。

本発明はまた、水中油型エマルジョンの製造のための方法であって、上記方法は、第２のエマルジョン、すなわち、微小流動化されたエマルジョンの濾過を包含する方法を提供する。上記微小流動化されたエマルジョンは、上記の特性を有する。

本発明はまた、ワクチンの製造のための方法であって、上記方法は、エマルジョンと抗原とを合わせる工程であって、ここで上記エマルジョンは、上記の特性を有する工程を包含する方法を提供する。

具体的実施形態
本開示のある特定の好ましい実施形態は、以下の段落においてまとめられる。このリストは例示であって、本開示によって提供される実施形態の全てを網羅するものではない。

実施形態１． 膜フィルターを通る水中油型エマルジョンの濾過を改善する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度における水中油型エマルジョンの濾過と比較して増大される工程、を包含する方法。
実施形態２． 水中油型エマルジョンを調製する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度と比較して増大される工程、を包含する方法。

実施形態３． 水中油型エマルジョンを調製する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンを、１０℃を上回る温度におけるより１０℃を下回る温度においてより大きいフィルタースループットで膜フィルターを経て濾過する工程、を包含する方法。

実施形態４． 水中油型エマルジョンアジュバントを調製する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンアジュバントを、１０℃を上回る温度におけるより５℃の温度においてより大きいアジュバントスループットで膜フィルターを経て濾過する工程、を包含する方法。

実施形態５． 水中油型エマルジョンを調製する方法であって、前記方法は、油、水性構成要素、および界面活性剤を混合して、水中油型エマルジョンを形成する工程；前記混合物を微小流動化して、前記する水中油型エマルジョンの平均液滴サイズを低減する工程；ならびに前記微小流動化された水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度における水中油型エマルジョンの濾過と比較して増大される工程、を包含する方法。

概略
本発明はまた、ワクチンの製造のための方法であって、上記方法は、エマルジョンと抗原とを合わせる工程であって、ここで上記エマルジョンは、上記の特性を有する工程を包含する方法を提供する。

用語「含む、包含する」とは、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「～なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから専らなってもよいし、さらなる何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

文言「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」とは、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ）」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合には、文言「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、選択肢的であり、例えば、ｘ＋１０％を意味する。

別段具体的に述べられなければ、２種またはこれより多くの構成要素を混合する工程を包含するプロセスは、混合する任意の具体的順序を必要としない。従って、構成要素は、任意の順序で混合され得る。３種の構成要素が存在する場合、２種の構成要素が、互いと合わせられ得、次いで、その組み合わせが、第３の構成要素と合わせられ得るなど。

動物（および特にウシ）の材料が、細胞の培養において使用される場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）がない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）がない供給源から得られるべきである。全体的に、動物由来の材料の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。

特許請求の範囲における請求項の全ては、さらなる実施形態として、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

実施例
実施例１： ＭＦ５９^{（登録商標）}濾過のためのフィルター決定
Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ、Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＦ、Ｄｕｒａｐｏｒｅ ０．２２μｍ、およびＤｕｒａｐｏｒｅ ０．４５／０．２２μｍを含むいくつかのフィルターを、ＭＦ５９^{（登録商標）}濾過の間に試験して、上記水中油型エマルジョンアジュバントのサイズ分けおよび濾過滅菌の両方の間に、フィルター耐久力の増強に関する最適なフィルターを決定した。試験したフィルターの説明は、以下の表１に示される。

ＭＦ５９^{（登録商標）}の濾過Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ^２）を、種々の温度： ５℃、３０℃、および４０℃において上記のフィルターに関して測定した。全てのフィルターを分離し、４３ｐｓｉ定圧の下で流した。低圧は２２ｐｓｉであり、高圧は、５０ｐｓｉであった。

簡潔には、Ｖｍａｘ濾過のためのプロトコールは、先ず、フィルターデバイスを、上記フィルターの上流にストップ－ロック（ｓｔｏｐ－ｌｏｃｋ）を有する圧力容器に設置する工程を含んだ。次に、１０００Ｌ／ｍ^２が濾過されうるように、供給物を圧力容器に添加した。上記デバイスを通気して、適切に空気を抜き、上記容器を加圧した。

いったん濾過が開始した後、時間および容積を規則的な間隔で記録した。全ての材料が使い尽くされたか、または＞７５％ 流束減衰（ｆｌｕｘ ｄｅｃａｙ）が観察された後に、試行を終了した。

５℃で行った試験に関しては、試験材料を、低温室において維持し、次いで、持ち出して、周囲温度において直ぐに濾過した。３０℃および４０℃で行った試験に関しては、試験材料を、ウォーターバスの中で温め、次いで、持ち出して、周囲温度で直ぐに濾過した。

Ｖｍａｘ試験の結果を、以下の表２に示す。

Ｖｍａｘ試験の結果は、滅菌グレードのフィルターが、４３ｐｓｉ圧力損失（ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｄｒｏｐ）でＭＦ５９^{（登録商標）}を約３０Ｌ／ｍ^２まで濾過できたことを示す。ＳＨＦ、ＳＨＣおよびＤｕｒａｐｏｒｅフィルターは、３０℃および４０℃と比較して、５℃での改善を示した。ＳＨＦは、最高の濾過能力を有し、次はＳＨＣであった。ＳＨＦは、低温においてわずかに良好な性能を有した。ＳＨＦとＳＨＣとの間のロット間変動は、かなり低かった。上記データは、圧力を増大させると濾過能力が増大することを示唆する。例えば、ＳＨＣは、４２．９ｐｓｉから４９．９ｐｓｉへと圧力を増大させた場合に、耐久力が約１．５×改善することを示した。

結論
概して、ＭＦ５９^{（登録商標）}の濾過は、滅菌グレードフィルターの高率の詰まりおよび剪断減粘性特性を示す。Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＦは、試験した全ての滅菌グレードのフィルターに関して最も都合のよいフィルター水力学を示した。Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ Ｈｉｇｈ Ａｒｅａは、高面積デバイスは、類似の性能を有するカートリッジあたりの面積の２倍を提供することから、ＭＦ５９^{（登録商標）}の３３０Ｌバッチを処理するための最低の設備を提供した。

別個の濾過試験はまた、スループットが、以下の表３および４ならびに図１～３で示されるように、より低温において種々の膜で行った場合に有意に増大することを示した。

以下に示される表５はまた、圧力を増大させると、より低温でのスループットがさらに増強されることを示した（例えば、１０℃）。

参考文献
参照される全ての参考文献は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

Claims (31)

1. 膜フィルターを通る水中油型エマルジョンの濾過を改善する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度における水中油型エマルジョンの濾過と比較して増大される工程、を包含する方法。
2. 水中油型エマルジョンを調製する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度と比較して増大される工程、を包含する方法。
3. 前記水中油型エマルジョンを濾過する工程は、水中油型エマルジョンにおけるバイオバーデンの量を低減する、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
4. 前記水中油型エマルジョンを濾過する工程は、前記水中油型エマルジョンの濾過滅菌を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記水中油型エマルジョンを濾過する工程は、前記水中油型エマルジョンの粒度低減濾過を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記水中油型エマルジョンを、２～８℃の温度において膜フィルターを経て濾過する工程を包含する、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の方法に従って調製された、水中油型エマルジョン。
8. 前記水中油型エマルジョンは、アジュバントである、請求項７に記載の水中油型エマルジョン。
9. 前記水中油型エマルジョンは、スクアレンを含む、請求項７～８のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
10. 前記水中油型エマルジョンは、（ａ）スクアレン、ポリソルベート８０およびソルビタントリオレエート、または（ｂ）スクアレン、トコフェロールおよびポリソルベート８０を含む、サブミクロン水中油型エマルジョンを含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
11. 前記水中油型エマルジョンは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の水中油型エマルジョン。
12. 請求項１～６のいずれか１項に記載の方法に従って調製された水中油型エマルジョンを含む、ワクチン組成物。
13. 前記ワクチン組成物は、インフルエンザウイルスを特異的に標的にする、請求項１２に記載のワクチン組成物。
14. 前記水中油型エマルジョンは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項１２～１３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
15. 水中油型エマルジョンアジュバントを調製する方法であって、前記方法は、前記水中油型エマルジョンアジュバントを、１０℃を上回る温度におけるより５℃の温度における方が大きいアジュバントスループットにおいて膜フィルターを経て濾過する工程を包含する方法。
16. 請求項１５に記載の方法に従って調製された水中油型エマルジョンアジュバント。
17. 前記水中油型エマルジョンアジュバントは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項１６に記載の水中油型エマルジョンアジュバント。
18. 請求項１５に記載の方法に従って調製された水中油型エマルジョンアジュバントを含む、ワクチン組成物。
19. 前記ワクチン組成物は、インフルエンザウイルスを特異的に標的にする、請求項１８に記載のワクチン組成物。
20. 前記水中油型エマルジョンアジュバントは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項１８～１９のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
21. 水中油型エマルジョンを調製する方法であって、前記方法は、
    油、水性構成要素、および界面活性剤を混合して、前記水中油型エマルジョンを形成する工程；
    前記混合物を微小流動化して、前記水中油型エマルジョンの平均液滴サイズを低減する工程；および
    前記微小流動化された水中油型エマルジョンを、１０℃未満もしくは１０℃に等しい温度において膜フィルターを経て濾過する工程であって、ここでフィルタースループットは、１０℃より高い温度における水中油型エマルジョンの濾過と比較して増大される工程、
    を包含する方法。
22. 前記水中油型エマルジョンは、スクアレンを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記油、水性構成要素、および界面活性剤を混合する工程は、前記構成要素を均質化する工程を包含する、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法に従って調製された水中油型エマルジョン。
25. 前記水中油型エマルジョンは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項２４に記載の水中油型エマルジョン。
26. 請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法に従って調製された水中油型エマルジョンを含むワクチン組成物。
27. 前記ワクチン組成物は、インフルエンザウイルス特異的に標的にする、請求項２６に記載のワクチン組成物。
28. 前記水中油型エマルジョンは、ＭＦ５９^{（登録商標）}である、請求項２６～２７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
29. 前記水中油型エマルジョンと抗原化合物とを混合する工程をさらに包含する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記抗原化合物は、インフルエンザウイルス抗原である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記水中油型エマルジョンを、抗原化合物と一緒にキットの中へとパッケージする工程をさらに包含する、請求項２９～３０のいずれか１項に記載の方法。