JP2023079446A - 観察装置および観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる観察装置を提供する。【解決手段】観察装置１Ａは、光源１０、ビームスプリッタ２１、ミラー２２、ミラー２３、シリンドリカルレンズ２４、レンズ２５、シリンドリカルレンズ２６、ビームスプリッタ２７、レンズ２８、周波数シフタ３０、撮像部４０および解析部５０を備える。解析部５０は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データに基づいて、物体光の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成し、これらの複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物Ｓの３次元複素微分干渉画像を生成する。解析部５０は、３次元複素微分干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を求める。【選択図】図１

Description

本発明は、観察装置および観察方法に関するものである。

特許文献１に記載された観察装置は、光源から出力された光を分岐して物体光および参照光とし、移動している観察対象物を経た物体光と、光周波数をヘテロダイン周波数だけシフトさせた参照光とを合波して、物体光と参照光とをヘテロダイン干渉させる。そして、この観察装置は、カメラの撮像面に到達した干渉光の強度画像の時系列データに基づいて、撮像面における物体光の複素振幅画像の時系列データを取得することができる。この観察装置は、移動している観察対象物を非染色・非侵襲でイメージングすることができ、例えば、フローサイトメータで移動している細胞を観察するのに用いられ得る。

国際公開第２０１３／０６５７９６号

特許文献１に記載された観察装置は、観察対象物として単一細胞の観察に適用され得るものの、スフェロイドやオルガノイドと呼ばれる３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。何故なら、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像に多重散乱光の影響が大きく現れるからである。

光の散乱とは、光が対象物と相互作用することによって光の進行方向が変えられる現象をいう。特に対象物の屈折率の空間的な不均一さが増大すると、光は対象物を通過する間に対象物と多数回相互作用するようになる。このように対象物と多数回相互作用した光は多重散乱光と呼ばれる。これに対して、対象物と一回のみ相互作用した光は単一散乱光と呼ばれる。多重散乱光は、スペックルの増大および単一散乱-多重散乱比（Single-scattering to Multi-scattering Ratio、ＳＭＲ）の悪化の原因となり、測定の障壁となることが知られている。

スペックルは、光が時間的かつ空間的にコヒーレントである場合に、多重散乱光の干渉によって空間的に強度または位相の大きな変化が引き起こされることにより生じる。スペックル発生を抑制するには、時間的または空間的にインコヒーレントである光を出力する光源を用いればよい。例えば、位相差顕微鏡などの通常の明視野顕微鏡は、ハロゲンランプや発光ダイオードなどの空間的かつ時間的にインコヒーレントな光源を用いることで、スペックルのない画像を取得している。

ＳＭＲの悪化は、単一散乱光よりも多重散乱光が支配的になって、単一散乱光が多重散乱光の中に埋もれてしまうことにより生じる。観察対象物が大きくなって観察深度が深いほど、単一散乱光の成分は指数関数的に減少する一方で、これと対照的に多重散乱光の成分が増大する。単一散乱光は、その散乱方向が対象物の構造と直接的な対応関係を持っていることから、対象物の構造の測定に用いやすい。一方で、多重散乱光は、対象物の構造との関係が複雑であり、対象物の構造の情報を抽出することが難しい。それ故、単一散乱光を利用したイメージング技術では、多重散乱光の中に単一散乱光が埋もれると（すなわち、ＳＭＲが悪化すると）測定が失敗することが知られている。

ＳＭＲ悪化の抑制は、単一散乱光および多重散乱光のうち単一散乱光を選択的に検出するゲーティングと呼ばれる技術により可能である。ゲーティングにより多重散乱光が抑制されるので、ＳＭＲ悪化の抑制と同時にスペックルの抑制も可能である。ゲーティングは、空間、時間および偏光などの自由度を用いて実現される。共焦点顕微鏡は、空間的ゲーティングの一例である。光コヒーレンス・トモグラフィ（Optical Coherence Tomography、ＯＣＴ）は、時間的および空間的なゲーティングの一例である。

特許文献１に記載された観察装置は、多重散乱光の影響を除去していないことから、観察対象物で生じる多重散乱光が多い場合に、取得される画像においてスペックルが増大し、また、ＳＭＲが悪化する。それ故、特許文献１に記載された観察装置は、多重散乱光の発生が少ない単一細胞の観察に適用され得るものの、多重散乱光の発生が多い３次元細胞組織などの多重散乱体の観察には適用が困難である。

本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる観察装置および観察方法を提供することを目的とする。

本発明の第１態様の観察装置は、(1) 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し物体光を照射し、観察対象物を経た物体光と参照光とを合波して出力する干渉光学系と、(2) 干渉光学系の分岐から合波までの間の物体光または参照光の光路上に設けられ、物体光および参照光それぞれの光周波数をヘテロダイン周波数だけ互いに異ならせる周波数シフタと、(3) 干渉光学系から出力された物体光および参照光を受光する撮像面を有し、撮像面における物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、干渉強度画像の時系列データを出力する撮像部と、(4) 干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析部と、を備える。干渉光学系は、観察対象物に対し物体光を照射する際に、観察対象物において第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に物体光を集光照射する照射光学系と、観察対象物を経た物体光を撮像面に導く際に、第１方向については観察対象物と撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、第２方向については観察対象物と撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、を含み、物体光および参照光を互いに同軸として撮像面へ入射させる。解析部は、干渉強度画像の時系列データに基づいて、照射光学系による観察対象物への物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて観察対象物の３次元位相画像を生成する。

本発明の第２態様の観察装置は、(1) 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し物体光を照射し、観察対象物を経た物体光と参照光とを合波して出力する干渉光学系と、(2) 干渉光学系から出力された物体光および参照光を受光する撮像面を有し、撮像面における物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、干渉強度画像の時系列データを出力する撮像部と、(3) 干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析部と、を備える。干渉光学系は、観察対象物に対し物体光を照射する際に、観察対象物において第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に物体光を集光照射する照射光学系と、観察対象物を経た物体光を撮像面に導く際に、第１方向については観察対象物と撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、第２方向については観察対象物と撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、を含み、物体光および参照光を互いに異なる方向から撮像面へ入射させる。解析部は、干渉強度画像の時系列データに基づいて、照射光学系による観察対象物への物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて観察対象物の３次元位相画像を生成する。

本発明の第１態様または第２態様の一側面において、解析部は、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部により生成された複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、を備える。

本発明の第１態様または第２態様の他の一側面において、解析部は、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部により生成された複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、を備える。

本発明の第１態様または第２態様の更に他の一側面において、解析部は、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、(d) 第２複素振幅画像生成部による処理の前、途中または後において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する位相共役演算部と、(e) 複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部または位相共役演算部により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、(f) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、を備える。２次元位相画像生成部は、位相共役演算部による演算を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、位相共役演算部による演算を行って求められた複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、複数の位置のうち、撮像部に対し相対的に近い位置については主として第１位相画像に基づいて２次元位相画像を生成し、撮像部に対し相対的に遠い位置については主として第２位相画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

本発明の第１態様または第２態様の一側面において、解析部は、３次元位相画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部を更に備える。

本発明の第１態様または第２態様の更に他の一側面において、解析部は、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、(f) ３次元位相画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部と、(g) 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像および３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第３複素振幅画像生成部と、を備える。解析部は、第１複素振幅画像生成部により生成した複素振幅画像に基づいて、第２複素振幅画像生成部、２次元位相画像生成部、３次元位相画像生成部、屈折率分布算出部および第３複素振幅画像生成部それぞれの処理を順に行う。

本発明の一側面において、２次元位相画像生成部は、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。

本発明の第１態様の観察方法は、(1) 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し物体光を照射し、観察対象物を経た物体光と参照光とを合波して出力する干渉光学系により、物体光と参照光とを干渉させる干渉ステップと、(2) 干渉光学系の分岐から合波までの間の物体光または参照光の光路上に設けられた周波数シフタにより、物体光および参照光それぞれの光周波数をヘテロダイン周波数だけ互いに異ならせる変調ステップと、(3) 干渉光学系から出力された物体光および参照光を受光する撮像面を有する撮像部により、撮像面における物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、干渉強度画像の時系列データを出力する撮像ステップと、(4) 干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析ステップと、を備える。干渉光学系は、観察対象物に対し物体光を照射する際に、観察対象物において第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に物体光を集光照射する照射光学系と、観察対象物を経た物体光を撮像面に導く際に、第１方向については観察対象物と撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、第２方向については観察対象物と撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、を含み、物体光および参照光を互いに同軸として撮像面へ入射させる。解析ステップでは、干渉強度画像の時系列データに基づいて、照射光学系による観察対象物への物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて観察対象物の３次元位相画像を生成する。

本発明の第２態様の観察方法は、(1) 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し物体光を照射し、観察対象物を経た物体光と参照光とを合波して出力する干渉光学系により、物体光と参照光とを干渉させる干渉ステップと、(2) 干渉光学系から出力された物体光および参照光を受光する撮像面を有する撮像部により、撮像面における物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、干渉強度画像の時系列データを出力する撮像ステップと、(3) 干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析ステップと、を備える。干渉光学系は、観察対象物に対し物体光を照射する際に、観察対象物において第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に物体光を集光照射する照射光学系と、観察対象物を経た物体光を撮像面に導く際に、第１方向については観察対象物と撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、第２方向については観察対象物と撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、を含み、物体光および参照光を互いに異なる方向から撮像面へ入射させる。解析ステップは、干渉強度画像の時系列データに基づいて、照射光学系による観察対象物への物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて観察対象物の３次元位相画像を生成する。

本発明の第１態様または第２態様の一側面において、解析ステップは、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップにより生成された複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、を備える。

本発明の第１態様または第２態様の他の一側面において、解析ステップは、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップにより生成された複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、を備える。

本発明の第１態様または第２態様の更に他の一側面において、解析ステップは、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、(d) 第２複素振幅画像生成ステップによる処理の前、途中または後において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する位相共役演算ステップと、(e) 複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップまたは位相共役演算ステップにより生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、(f) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、を備える。２次元位相画像生成ステップは、位相共役演算ステップによる演算を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、位相共役演算ステップによる演算を行って求められた複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、複数の位置のうち、撮像部に対し相対的に近い位置については主として第１位相画像に基づいて２次元位相画像を生成し、撮像部に対し相対的に遠い位置については主として第２位相画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

本発明の第１態様または第２態様の一側面において、解析ステップは、３次元位相画像に基づいて観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップを更に備える。

本発明の第１態様または第２態様の更に他の一側面において、解析ステップは、(a) 撮像部から干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、(b) 干渉強度画像の時系列データに基づいて複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、(c) 複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った撮像部からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、(d) 複数の位置それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、(e) 複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、(f) ３次元位相画像に基づいて第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップと、(g) 複数の光照射方向それぞれについて、第１位置の複素振幅画像および３次元屈折率分布に基づいて第２位置の複素振幅画像を生成する第３複素振幅画像生成ステップと、を備える。解析ステップは、第１複素振幅画像生成ステップにより生成した複素振幅画像に基づいて、第２複素振幅画像生成ステップ、２次元位相画像生成ステップ、３次元位相画像生成ステップ、屈折率分布算出ステップおよび第３複素振幅画像生成ステップそれぞれの処理を順に行う。

本発明の一側面において、２次元位相画像生成ステップでは、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて２次元位相画像を生成するのが好適である。

本発明のプログラムは、上記の本発明の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのものである。本発明の記録媒体は、上記の本発明のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能なものである。

本発明によれば、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる。

図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。 図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。 図３は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成におけるレンズ２５、シリンドリカルレンズ２６およびレンズ２８を含む結像光学系を説明する図である。図３（ａ）はｙ方向に見た図であり、図３（ｂ）はｘ方向に見た図である。 図４は、観察装置１Ａ（図１）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。図４（ａ）は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を示す。図４（ｂ）は、或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ或る第２方向位置ｙ_０での時刻ｔを変数とするデータＩ（ｋ_ｘ0，ｙ_０，ｔ）を示す。 図５は、観察装置１Ａ（図１）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。図５（ａ）は、Ｉ（ｋ_ｘ0，ｙ_０，ｔ）のフーリエ変換の結果を示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）のフーリエ変換の結果の一部を切り出して平行移動させた結果を示す。図５（ｃ）は、図５（ｂ）の結果をフーリエ変換した結果を示す。 図６は、観察装置１Ｂ（図２）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。図６（ａ）は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を示す。図６（ｂ）は、或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ或る時刻ｔ_０での第２方向位置ｙを変数とするデータＩ（ｋ_ｘ0，ｙ，ｔ_０）を示す。 図７は、観察装置１Ｂ（図２）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。図７（ａ）は、Ｉ（ｋ_ｘ0，ｙ，ｔ_０）のフーリエ変換の結果を示す。図７（ｂ）は、図７（ａ）のフーリエ変換の結果の一部を切り出して平行移動させた結果を示す。図７（ｃ）は、図７（ｂ）の結果をフーリエ変換した結果を示す。 図８（ａ），（ｂ）は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成における観察対象物Ｓから出力される物体光について説明する図である。 図９（ａ），（ｂ）は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成における観察対象物Ｓから出力される物体光について説明する図である。 図１０は、解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明するフローチャートである。 図１１は、第１実施形態の観察方法のフローチャートである。 図１２は、カーネル関数ｇを説明する図である。 図１３は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第１態様のフローチャートである。 図１４は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第２態様のフローチャートである。 図１５は、カーネル関数を説明する図である。 図１６は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第３態様のフローチャートである。 図１７は、観察装置１Ｃの構成を示す図である。 図１８は、観察装置１Ｄの構成を示す図である。 図１９は、屈折率分布測定方法Ｂのフローチャートである。 図２０は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。 図２１は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。 図２２は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。 図２３は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。 図２４は、３次元位相画像生成ステップＳ６６および屈折率分布算出ステップＳ６７の各処理の順序および画像を説明する図である。 図２５は、位相共役演算の概要について説明する図であり、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光および出力光を示す図である。 図２６は、位相共役演算の概要について説明する図であり、光照射および撮像の関係を逆転させた場合の入力光および出力光を示す図である。 図２７は、位相共役演算ステップＳ６４における画像分割、位相共役演算および画像結合を説明する図である。 図２８は、観察装置１Ｅの構成を示す図である。 図２９は、観察装置１Ｆの構成を示す図である。 図３０は、屈折率分布測定方法Ｃのフローチャートである。 図３１は、屈折率分布測定方法Ｃのフローチャートである。 図３２は、観察対象物を含む領域と第１～第Ｊのブロックとの関係を説明する図である。 図３３は、第１～第Ｊのブロックにおける処理の手順を説明する図である。 図３４は、ＢＰＭの処理内容を説明する図である。 図３５は、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７のフローチャートである。

以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

（第１実施形態）
第１実施形態の装置の構成として、観察装置１Ａおよび観察装置１Ｂについて説明する。図１は、観察装置１Ａの構成を示す図である。この観察装置１Ａは、光源１０、ビームスプリッタ２１、ミラー２２、ミラー２３、シリンドリカルレンズ２４、レンズ２５、シリンドリカルレンズ２６、ビームスプリッタ２７、レンズ２８、周波数シフタ３０、撮像部４０および解析部５０を備える。

観察装置１Ａは、シリンドリカルレンズ２４とレンズ２５との間を第１方向に沿って移動している観察対象物Ｓを観察するものである。例えば、観察対象物Ｓは、フローサイトメータにおいて流路に沿って流れる細胞である。この図には、説明の便宜の為にｘｙｚ直交座標系が示されている。観察対象物Ｓの移動方向（図中の矢印の方向）をｘ方向（第１方向）とする。シリンドリカルレンズ２４およびレンズ２５の光軸の方向をｚ方向とする。ｘ方向およびｚ方向の双方に直交する方向をｙ方向（第２方向）とする。

光源１０は、空間的・時間的にコヒーレントな光を出力するものであり、好適にはレーザ光源である。ビームスプリッタ２１は、光源１０と光学的に接続されており、光源１０から出力された光を物体光と参照光とに分岐する。ビームスプリッタ２１は、物体光をミラー２３へ出力し、参照光を周波数シフタ３０へ出力する。

周波数シフタ３０は、ビームスプリッタ２１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ２１から到達した参照光を入力する。周波数シフタ３０は、この参照光の光周波数をヘテロダイン周波数だけシフトさせて、当該シフト後の参照光を出力する。ミラー２２は、周波数シフタ３０と光学的に接続されており、周波数シフタ３０から到達した参照光をビームスプリッタ２７へ反射させる。

ミラー２３は、ビームスプリッタ２１と光学的に接続されており、ビームスプリッタ２１から到達した物体光をシリンドリカルレンズ２４へ反射させる。シリンドリカルレンズ２４は、ミラー２３と光学的に接続されており、ミラー２３から到達した物体光を観察対象物Ｓに対し照射する照射光学系である。シリンドリカルレンズ２４は、観察対象物Ｓにおいてｙ方向（第２方向）に延在するライン状の領域に物体光を集光照射する。観察対象物Ｓに照射される光の波数ベクトルのｘ成分ｋ_ｘの値は或る一定範囲にあり、ｙ成分ｋ_ｙの値は或る一定値である。

シリンドリカルレンズ２４により観察対象物Ｓに照射されて観察対象物Ｓを経た物体光は、結像光学系を構成するレンズ２５、シリンドリカルレンズ２６およびレンズ２８を順に経て、撮像部４０の撮像面に到達する。

ビームスプリッタ２７は、シリンドリカルレンズ２６とレンズ２８との間に設けられている。ビームスプリッタ２７は、シリンドリカルレンズ２６から到達した物体光を入力するとともに、ミラー２２から到達した参照光を入力して、これら物体光と参照光とを合波して出力する。このとき、ビームスプリッタ２７は、物体光および参照光を互いに同軸として出力する。

光源１０から撮像部４０に到るまでの光学系は、干渉光学系を構成しており、観察対象物Ｓを経た物体光と参照光と干渉させる（干渉ステップ）。周波数シフタ３０は、物体光および参照光それぞれの光周波数をヘテロダイン周波数だけ互いに異ならせるものである（変調ステップ）。周波数シフタ３０は例えば音響光学素子を用いて構成され得る。周波数シフタ３０は、参照光の光路上に設けられてもよいし、物体光の光路上に設けられてもよい。

撮像部４０は、干渉光学系から出力された物体光および参照光を受光する撮像面を有し、撮像面における物体光と参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、その撮像により得られた干渉強度画像の時系列データを解析部５０へ出力する（撮像ステップ）。

解析部５０は、撮像部４０と電気的に接続されており、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを入力して所要の解析を行う（解析ステップ）。解析部５０は、干渉強度画像の時系列データに基づいて、物体光の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成し、これらの複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物Ｓの３次元複素微分干渉画像を生成する。さらに、解析部５０は、３次元複素微分干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を求める。解析部５０の詳細については後述する。

図２は、観察装置１Ｂの構成を示す図である。この観察装置１Ｂ（図２）は、観察装置１Ａ（図１）の構成と比較すると、周波数シフタ３０を備えていない点で相違し、物体光および参照光が互いに異なる方向から撮像部４０の撮像面へ入射する点で相違する。この相違に応じて、解析部５０の処理内容の一部が相違する。

図３は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成におけるレンズ２５、シリンドリカルレンズ２６およびレンズ２８を含む結像光学系を説明する図である。図３（ａ）はｙ方向に見た図であり、図３（ｂ）はｘ方向に見た図である。ｘ方向については、レンズ２５の瞳面と撮像部４０の撮像面とは互いに共役の位置関係にあり、すなわち、観察対象物Ｓと撮像部４０の撮像面とは互いにフーリエ変換の位置関係にある。ｙ方向については、観察対象物Ｓと撮像部４０の撮像面とは互いに共役の位置関係にある。

観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの解析部５０は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データに基づいて所要の演算を行う。解析部５０は、コンピュータであってよい。解析部５０は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６、表示部５７および記憶部５８を備える。

干渉強度画像取得部５１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。干渉強度画像取得部５１は、ＣＰＵを含み、また、撮像部４０から出力される干渉強度画像のデータを入力する入力ポートを有する。

第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６は、干渉強度画像の時系列データに基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部５７は、処理すべき画像、処理途中の画像および処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部５８は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭおよびＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５、屈折率分布算出部５６および記憶部５８は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。

記憶部５８は、干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置の製造時または出荷時に記憶部５８に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部５８に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部５８に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。

干渉強度画像取得部５１、第１複素振幅画像生成部５２、第２複素振幅画像生成部５３、２次元位相画像生成部５４、３次元位相画像生成部５５および屈折率分布算出部５６それぞれの処理の詳細については後述する。

観察装置１Ａ（図１）は、周波数シフタ３０を設けることで、時間変調による干渉強度画像を取得するものである。これに対して、観察装置１Ｂ（図２）は、物体光および参照光を互いに異なる方向から撮像部４０の撮像面へ入射させることで、空間変調による干渉強度画像を取得するものである。観察装置１Ａ（図１）と観察装置Ｂ（図２）とは、このような光学系の相違に応じて、解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理が相違する。

図４および図５は、観察装置１Ａ（図１）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データ（図４（ａ））は、光照射方向ｋ_ｘと第２方向位置ｙとからなる平面上の各時刻ｔでの干渉強度画像であり、下記（１）式のＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）で表される。ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）は物体光の複素振幅であり、ｕ_refは参照光の複素振幅である。或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ或る第２方向位置ｙ_０での時刻ｔを変数とするデータＩ（ｋ_ｘ0，ｙ_０，ｔ）（図４（ｂ））をｔについてフーリエ変換すると、その光照射方向ｋ_ｘ0・第２方向位置ｙ_０での周波数スペクトルＩ（ｋ_ｘ0，ｙ_０，ｆ）（図５（ａ））が得られる。ｆは周波数である。

この周波数スペクトルには、ヘテロダイン周波数だけ離間した３つのピークが現れる。３つのピークのうち、中央のピークは（１）式最右辺の第１項および第２項によるものであり、左右の２つのピークは（１）式最右辺の第３項または第４項によるものである。この周波数スペクトルにおける左右の２つのピークのうち何れか一方のピークの周辺（図５（ａ）において破線の矩形で囲った範囲）を切り出し、そのピーク周波数が０となるように平行移動させる（図５（ｂ））。そして、これを周波数ｆについてフーリエ変換すると、或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ第２方向位置ｙ_０での物体光の複素振幅ｕ（ｋ_ｘ0，ｙ_０，ｔ）が得られる。全ての光照射方向ｋ_ｘおよび第２方向位置ｙについて同様の処理を行うことで、物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）が得られる。

図６および図７は、観察装置１Ｂ（図２）の解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２の処理内容について説明する図である。撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データ（図６（ａ））は、光照射方向ｋ_ｘと第２方向位置ｙとからなる平面上の各時刻ｔでの干渉強度画像であり、上記（１）式のＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）で表される。或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ或る時刻ｔ_０での第２方向位置ｙを変数とするデータＩ（ｋ_ｘ0，ｙ，ｔ_０）（図６（ｂ））をｙについてフーリエ変換すると、その光照射方向ｋ_ｘ0・時刻ｔ_０での空間波数スペクトルＩ（ｋ_ｘ0，ｋ_ｙ，ｔ_０）（図７（ａ））が得られる。ｋ_ｙはｙ方向の空間波数である。

この空間波数スペクトルには、撮像部４０の撮像面に入射する物体光と参照光との角度に応じた波数差だけ離間した３つのピークが現れる。３つのピークのうち、中央のピークは（１）式最右辺の第１項および第２項によるものであり、左右の２つのピークは（１）式最右辺の第３項または第４項によるものである。この空間波数スペクトルにおける左右の２つのピークのうち何れか一方のピークの周辺（図７（ａ）において破線の矩形で囲った範囲）を切り出し、そのピーク周波数が０となるように平行移動させる（図７（ｂ））。そして、これを空間波数ｋ_ｙについてフーリエ変換すると、或る光照射方向ｋ_ｘ0且つ或る時刻ｔ_０での物体光の複素振幅ｕ（ｋ_ｘ0，ｙ，ｔ_０）が得られる。全ての光照射方向ｋ_ｘおよび時刻ｔについて同様の処理を行うことで、物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）が得られる。

以上のようにして、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）の何れの構成においても、解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、撮像部４０の撮像面に到達した物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を得ることができる。更に、次のようにして、解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２は、物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する。

図８および図９は、観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成における観察対象物Ｓから出力される物体光について説明する図である。

仮に、観察対象物が静止していて、観察対象物が波数ベクトルｋ_ｄで表される単一の空間的波数を有するものであり、その観察対象物への入射波が波数ベクトルｋ_inで表される単一の波数を有する平面波であるとする。このとき、観察対象物から出力される物体光の波数ベクトルｋ_outは、下記（２）式のとおり、ベクトルｋ_ｄとベクトルｋ_inとの和で表される。

仮に、観察対象物が一定の速度ベクトルＶで移動していて、観察対象物が波数ベクトルｋ_ｄで表される単一の空間的波数を有するものであり、その観察対象物への入射波が波数ベクトルｋ_inで表される単一の波数を有する平面波であるとする。このとき、観察対象物から出力される物体光の波数ベクトルｋ_outは、上記（２）式のとおり、ベクトルｋ_ｄとベクトルｋ_inとの和で表される。また、観察対象物から出力される物体光にはドップラーシフトが生じ、そのドップラー周波数ωは、下記（３）式のとおり、ベクトルｋ_ｄとベクトルＶとの内積で表される。すなわち、図８（ａ）に示されるように、ドップラー周波数ωを横軸とし、出力される物体光の波数ベクトルｋ_outの大きさを縦軸とした平面において、観察対象物から出力される物体光のωおよびｋ_outは１点で表されることになる。

仮に、観察対象物が一定の速度ベクトルＶで移動していて、観察対象物が様々な空間的波数を有するものであり、その観察対象物への入射波が波数ベクトルｋ_inで表される単一の波数を有する平面波であるとする。このとき、観察対象物から出力される物体光の波数ベクトルｋ_outは上記（２）式で表され、ドップラー周波数ωは上記（３）式で表される。しかし、観察対象物が様々な空間的波数ｋ_ｄを有することから、図８（ｂ）に示されるように、ドップラー周波数ωを横軸とし、出力される物体光の波数ベクトルｋ_outの大きさを縦軸とした平面において、観察対象物から出力される物体光のωおよびｋ_outは１本の直線上である。

観察対象物が一定の速度ベクトルＶで移動していて、観察対象物が様々な空間的波数を有するものであり、その観察対象物への入射波が様々な波数ベクトルを有するものであるとする。このとき、観察対象物が様々な空間的波数ｋ_ｄを有し、かつ、入射波が様々な波数ベクトルｋ_inを有することから、図９（ａ）に示されるように、ドップラー周波数ωを横軸とし、出力される物体光の波数ベクトルｋ_outの大きさを縦軸とした平面において、観察対象物から出力される物体光のωおよびｋ_outは平行四辺形の領域内にある。

観察装置１Ａ（図１）および観察装置Ｂ（図２）それぞれの構成において観察対象物Ｓから出力される物体光のωおよびｋ_outは、図９（ａ）に示されるようにω-ｋ_out平面において平行四辺形の領域内にある。この図９（ａ）中に示されるｋ_out ^max，ｋ_out ^min，ｋ_in ^max，ｋ_in ^min は、観察対象物の前または後の光学系のＮＡにより決まる値である。図９（ａ）中に示される斜めの破線（この図では３本が示されている。）上ではｋ_inが一定である。上記（３）式の関係を用いることで、図９（ａ）のω-ｋ_out平面から、図９（ｂ）のｋ_in-ｋ_out平面へ変換することができる。解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２は、これを利用して、物体光の複素振幅画像ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する。

すなわち、図１０に示されるように、第１複素振幅画像生成部５２は、ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）をｔについてフーリエ変換して、Ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ω）を求める。続いて、上記（３）式の関係を用いて、Ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ω）からＵ（ｋ_ｘ，ｙ，ｋ_in）へ変換する。ここで、ｋ_outはｋ_ｘである。更に続いて、Ｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｋ_in）をｋ_ｘについてフーリエ変換して、ｕ（ｘ，ｙ，ｋ_in）を求める。

このようにして、解析部５０の第１複素振幅画像生成部５２は、撮像部４０から出力された干渉強度画像の時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、撮像部４０の撮像面に到達した物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を得ることができ、更に、この物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向ｋ_inそれぞれの複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ）を生成することができる。

図１１は、第１実施形態の観察方法のフローチャートである。この観察方法は、観察装置１Ａおよび観察装置１Ｂの何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５および屈折率分布算出ステップＳ６を備える。

干渉強度画像取得ステップＳ１の処理は干渉強度画像取得部５１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ２の処理は第１複素振幅画像生成部５２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ３の処理は第２複素振幅画像生成部５３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ４の処理は２次元位相画像生成部５４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ５の処理は３次元位相画像生成部５５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６の処理は屈折率分布算出部５６により行われる。

干渉強度画像取得ステップＳ１において、干渉強度画像取得部５１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。第１複素振幅画像生成ステップＳ２において、第１複素振幅画像生成部５２は、前述したとおり、干渉強度画像取得部５１により取得された時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、撮像部４０の撮像面に到達した物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を求め、更に、この物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向ｋ_inそれぞれの複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ）を生成する。

第２複素振幅画像生成ステップＳ３において、第２複素振幅画像生成部５３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部５２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。基準位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，０）の２次元フーリエ変換をＵ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ，０）とすると、ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）、および、この複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）の２次元フーリエ変換Ｕ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ，ｄ）は、下記式で表される。ｉは虚数単位であり、ｋ_０は観察対象物中における光の波数である。

２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細については後述する。

なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、２次元位相画像生成ステップＳ４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ４において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部５８が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる点で好ましい。

３次元位相画像生成ステップＳ５において、３次元位相画像生成部５５は、２次元位相画像生成部５４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙおよび該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。

屈折率分布算出ステップＳ６において、屈折率分布算出部５６は、３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。観察対象物の屈折率分布をｎ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、電気感受率分布をｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とし、背景の媒質の屈折率をｎ_ｍとすると、両者の間には下記（６）式の関係がある。３次元位相画像生成部５５により生成された３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（７）式のとおり、カーネル関数ｇ（ｘ，ｙ，ｚ）と電気感受率分布ｆ（ｘ，ｙ，ｚ）とのコンボリューションで表される。したがって、観察対象物の３次元屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、３次元位相画像Φ（ｘ，ｙ，ｚ）に基づいてデコンボリューションにより求めることができる。

なお、カーネル関数ｇは、波動方程式の解に対応するグリーン関数に基づくものである。図１２は、カーネル関数ｇを説明する図である。この図において、カーネル関数ｇの値が最も大きい中心位置が原点であり、縦方向がｚ軸であり、横方向がｚ軸に垂直な方向である。

次に、第１実施形態の観察方法における２次元位相画像生成ステップＳ４の詳細について説明する。２次元位相画像生成ステップＳ４において、２次元位相画像生成部５４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部５３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。２次元位相画像生成ステップＳ４は、以下に説明する３つの態様が可能である。

図１３は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第１態様のフローチャートである。この第１態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ１１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ１２において、この複素振幅総和画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

ステップＳ１１の処理は、ＣＡＳＳ（Collective Accumulation of SingleScattering）技術によるものである。或る光照射方向に沿って対象物に照射されて該対象物を経た光のうち、対象物と一回のみ相互作用した単一散乱光の空間周波数分布は光照射方向に応じてシフトしているのに対して、対象物と複数回相互作用した多重散乱光の空間周波数分布は光照射方向によってランダムに変化する。ＣＡＳＳ技術は、このような単一散乱光および多重散乱光それぞれの空間周波数分布の光照射方向依存性の相違を利用する。

すなわち、ステップＳ１１では、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正する（つまり、空間周波数領域において複素振幅画像の空間周波数分布を光照射方向に応じて平行移動する）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分の空間周波数分布を光照射方向に依存しない形状および配置とし、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分の空間周波数分布をランダムな形状および配置とする。そして、ステップＳ１１では、これら補正後の複数の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成する（つまり、合成開口処理をする）ことにより、複素振幅画像のうちの単一散乱光成分をコヒーレントに足し合わせ、その一方で、複素振幅画像のうちの多重散乱光成分を互いに相殺させる。

したがって、ステップＳ１１で生成される複素振幅総和画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されＳＭＲが改善されたものとなる。

図１４は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第２態様のフローチャートである。この第２態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

ｚ＝ｄの位置の複素振幅画像をｕ（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２１で生成される複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は下記（８）式で表される。δｘおよびδｙのうち少なくとも一方は非０である。δｘ≠０，δｙ＝０であれば、ｘ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ＝０，δｙ≠０であれば、ｙ方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。δｘ≠０，δｙ≠０であれば、ｘ方向およびｙ方向の何れとも異なる方向をシアー方向とする複素微分干渉画像ｑが得られる。なお、複素微分干渉画像ｑ（ｘ，ｙ，ｄ）は、複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ，ｄ）を下記（９）式のように変換した後に（８）式で求めてもよい。

複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像ｑの総和をｑ_sum（ｘ，ｙ，ｄ）とすると、ステップＳ２２で生成される位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）は、ｑ_sum（ｘ，ｙ，ｄ）の位相として下記（１０）式で表される。ステップＳ２３では、この位相微分画像φ（ｘ，ｙ，ｚ）を積分またはデコンボリューションすることにより、２次元位相画像を生成することができる。

なお、ステップＳ２１において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ２１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ２２において、複数のシアー方向それぞれについて、複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ２３において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

ステップＳ２２で複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて生成される位相微分画像は、多重散乱光の影響が低減されたものとなる。そして、最終的に屈折率分布算出ステップＳ６で得られる３次元屈折率分布も、多重散乱光の影響が低減されて、スペックルが抑制されたものとなる。また、ステップＳ２１において複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成する場合には、ステップＳ２３で得られる２次元位相画像にライン状のノイズが現れるのを抑制することができる。

ここでは、ステップＳ２３において位相微分画像を積分またはデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ２３を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６７のデコンボリューションにおいて、ステップＳ２３のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネル（図１５）を用いることにより、ステップＳ２２で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。図１５に示されるカーネルは、図１２に示したカーネルとステップＳ２３のデコンボリューションで用いるカーネルとを畳み込み積分することにより得られる。

図１６は、２次元位相画像生成ステップＳ４の第３態様のフローチャートである。この第３態様では、２次元位相画像生成ステップＳ４は、複数の位置それぞれについて、ステップＳ３１において、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分し、複数のバッチそれぞれについて、該バッチに含まれる複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後、これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

第３態様のステップＳ３１の処理は、複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を複数のバッチに区分した上で、複数のバッチそれぞれについて第１態様のステップＳ１１の処理を行うことに相当する。第３態様のステップＳ３２，Ｓ３３の処理は、複数のバッチそれぞれについて第２態様のステップＳ２１，Ｓ２２の処理を行うことに相当する。第３態様のステップＳ３４の処理は、第２態様のステップＳ２３の処理を行うことに相当する。

なお、ステップＳ３２において、複素振幅画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複素微分干渉画像を生成してもよい。この場合、２次元位相画像生成ステップＳ４は、ステップＳ３２において、複数のバッチそれぞれの複素振幅総和画像に基づいて該画像上の互いに異なる複数のシアー方向それぞれについて複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、ステップＳ３３において、複数のシアー方向それぞれについて、複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像の総和に基づいて位相微分画像を生成し、ステップＳ３４において、複数のシアー方向それぞれの位相微分画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

第３態様におけるスペックルの抑制は、第１態様および第２態様と同程度である。第３態様におけるＳＭＲの改善は、第１態様と第２態様との中間の程度である。

ここでも、ステップＳ３４において位相微分画像を積分またはデコンボリューションすることにより２次元位相画像を生成する場合を説明した。しかし、位相微分画像を２次元位相画像として扱うこともできる。この場合、ステップＳ３４を行うことなく、屈折率分布算出ステップＳ６のデコンボリューションにおいて、ステップＳ３４のデコンボリューションで用いたカーネルを含むカーネルを用いることにより、ステップＳ３３で生成された位相微分画像（２次元位相画像）から観察対象物の３次元屈折率分布を求めることができる。

本実施形態によれば、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる。

（第２実施形態）
第２実施形態の装置の構成として、観察装置１Ｃおよび観察装置１Ｄについて説明する。図１７に示される観察装置１Ｃは、図１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１０から撮像部４０に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。図１８に示される観察装置１Ｄは、図２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１０から撮像部４０に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部６０を備える点で相違する。

解析部６０は、撮像部４０と電気的に接続されており、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを入力する。解析部６０は、干渉強度画像の時系列データに基づいて、物体光の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成し、これらの複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物Ｓの３次元複素微分干渉画像を生成する。さらに、解析部６０は、３次元複素微分干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を求める。解析部６０は、コンピュータであってよい。解析部６０は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７、表示部６８および記憶部６９を備える。

干渉強度画像取得部６１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。干渉強度画像取得部６１は、ＣＰＵを含み、また、撮像部４０から出力される干渉強度画像のデータを入力する入力ポートを有する。

第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６および屈折率分布算出部６７は、干渉強度画像の時系列データに基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部６８は、処理すべき画像、処理途中の画像および処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部６９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭおよびＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６、屈折率分布算出部６７および記憶部６９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。

記憶部６９は、干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６および屈折率分布算出部６７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ａの製造時または出荷時に記憶部６９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部６９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部６９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。

干渉強度画像取得部６１、第１複素振幅画像生成部６２、第２複素振幅画像生成部６３、位相共役演算部６４、２次元位相画像生成部６５、３次元位相画像生成部６６および屈折率分布算出部６７それぞれの処理の詳細については後述する。

図１９は、第２実施形態の観察方法のフローチャートである。この観察方法は、観察装置１Ｃおよび観察装置１Ｄの何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４、２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６および屈折率分布算出ステップＳ６７を備える。

干渉強度画像取得ステップＳ６１の処理は干渉強度画像取得部６１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ６２の処理は第１複素振幅画像生成部６２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理は第２複素振幅画像生成部６３により行われる。位相共役演算ステップＳ６４の処理は位相共役演算部６４により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ６５の処理は２次元位相画像生成部６５により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ６６の処理は３次元位相画像生成部６６により行われる。屈折率分布算出ステップＳ６７の処理は屈折率分布算出部６７により行われる。

干渉強度画像取得ステップＳ６１において、干渉強度画像取得部６１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。第１複素振幅画像生成ステップＳ６２において、第１複素振幅画像生成部６２は、干渉強度画像取得部６１により取得された時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、撮像部４０の撮像面に到達した物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を求め、更に、この物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向ｋ_inそれぞれの複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ）を生成する。

第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、第２複素振幅画像生成部６３は、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成部６２により生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。

第２実施形態の観察方法における干渉強度画像取得ステップＳ６１、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２および第２複素振幅画像生成ステップＳ６３は、それぞれ、第１実施形態の観察方法における干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２および第２複素振幅画像生成ステップＳ３と同様の処理を行う。

位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われてもよい（後述）。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から複数段階を経て或るｚ位置の複素振幅画像を生成する場合には、その複数段階のうちの或る段階と次の段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われてもよい（後述）。位相共役演算ステップＳ６４において、位相共役演算部６４は、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する。

なお、位相共役演算は、位相共役法（phase conjugate method）に基づく複素振幅画像に対する演算であり、対象物における光照射と光出力との関係を表すトランスミッション行列を計算し、その逆行列計算と座標変換と含む演算である。位相共役法は、位相共役（phase conjugation）、時間反転法（time reversal method）、時間反転（time reversal）、デジタル位相共役（digital phase conjugation）、デジタル位相共役法（digital phase conjugate method）等と呼ばれる場合もある。詳細については後述する。

２次元位相画像生成ステップＳ６５において、２次元位相画像生成部６５は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部６３または位相共役演算部６４により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。

２次元位相画像生成ステップＳ６５において、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行って求められた複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、複数の位置のうち、撮像部に対し相対的に近い位置については主として第１位相画像に基づいて２次元位相画像を生成し、撮像部に対し相対的に遠い位置については主として第２位相画像に基づいて２次元位相画像を生成する。

なお、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて複数の位置それぞれの複素振幅画像を全て生成した後に、位相共役演算部６４以降の処理を行ってもよい。また、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において複数の光照射方向それぞれについて或る１つのｚ方向位置の複素振幅画像を生成し、該位置の２次元位相画像を２次元位相画像生成ステップＳ６５において生成する処理を単位として、ｚ方向位置を走査しながら当該単位処理を繰り返し行ってもよい。後者の場合には、記憶部６９が記憶しておくべき画像データの容量を小さくすることができる点で好ましい。

３次元位相画像生成ステップＳ６６において、３次元位相画像生成部６６は、２次元位相画像生成部６５により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙおよび該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。

屈折率分布算出ステップＳ６７において、屈折率分布算出部６７は、３次元位相画像生成部６６により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布を求める。

第２実施形態の観察方法における２次元位相画像生成ステップＳ６５、３次元位相画像生成ステップＳ６６および屈折率分布算出ステップＳ６７は、それぞれ、第１実施形態の観察方法における２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５および屈折率分布算出ステップＳ６と同様の処理を行う。

図２０は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。この図は、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行わない態様を示す。この態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（４）式および（５）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ_１，ｚ_２，ｚ_３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。

図２１～図２３は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３、位相共役演算ステップＳ６４および２次元位相画像生成ステップＳ６５の各処理の順序および画像を説明する図である。これらの図は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前、途中または後で位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う態様を示す。

図２１に示される第１態様は、図１９のフローチャートに対応するものである。この第１態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の後に行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（４）式および（５）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ_１，ｚ_２，ｚ_３）それぞれの複素振幅画像が生成される。

第１態様では、続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の位置それぞれについて、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、位相共役演算ステップＳ６４で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。

図２２に示される第２態様では、位相共役演算ステップＳ６４は、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の処理の前に行われる。位相共役演算ステップＳ６４において、複数の光照射方向それぞれについて、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。

第２態様では、続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（４）式および（５）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ_１，ｚ_２，ｚ_３）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。

図２３に示される第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３が基準位置の複素振幅画像から２つの段階を経て複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する場合に、その２つの段階のうちの第１段階と第２段階との間において位相共役演算ステップＳ６４が行われる。

第３態様では、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第１段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（４）式および（５）式の自由伝搬の式により、第１複素振幅画像生成ステップＳ６２で生成された基準位置（ｚ＝０）の複素振幅画像に基づいて、複数のｚ方向位置（この図ではｚ＝ｚ_１，ｚ_３，ｚ_５）それぞれの複素振幅画像が生成される。続いて、位相共役演算ステップＳ６４において、複数の照射方向それぞれの複素振幅画像に対して位相共役演算が行われて、観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の照射方向それぞれの複素振幅画像が生成される。

第３態様では、更に続いて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３の第２段階において、複数の光照射方向それぞれについて、上記（４）式および（５）式の自由伝搬の式により、位相共役演算ステップＳ６４で生成されたｚ方向位置（ｚ＝ｚ_１，ｚ_３，ｚ_５）の複素振幅画像に基づいて、ｚ方向位置（ｚ＝ｚ_２，ｚ_４，ｚ_６）それぞれの複素振幅画像が生成される。そして、２次元位相画像生成ステップＳ６５において、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ６３で生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、複素微分干渉画像が生成され、さらに位相微分画像が生成される。

これらの第１態様、第２態様および第３態様の間では、位相共役演算ステップＳ６４における複素振幅画像に対する位相共役演算の回数が異なる。位相共役演算ステップＳ６４の全体の処理時間は、第１態様より第３態様の方が短く、第２態様では更に短い。

図２４は、３次元位相画像生成ステップＳ６６および屈折率分布算出ステップＳ６７の各処理の順序および画像を説明する図である。３次元位相画像生成ステップＳ６６において、２次元位相画像生成ステップＳ６５で生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて３次元位相画像が生成される。このとき、撮像部に対し相対的に近い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図２０の態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。一方、撮像部に対し相対的に遠い位置については、位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成された２次元位相画像（図２１～図２３の何れかの態様で生成された２次元位相画像）が主として採用される。続いて、屈折率分布算出ステップＳ６７において、３次元位相画像生成ステップＳ６６で生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより観察対象物の３次元屈折率分布が求められる。

ｚ方向の各位置の２次元位相画像の生成は、次のような３つの態様がある。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行う前の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図２０の態様で生成される位相画像）を第１位相画像φ_１とする。位相共役演算ステップＳ６４の処理を行った後の複素振幅画像に基づいて生成される位相画像（図２１～図２３の何れかの態様で生成される位相画像）を第２位相画像φ_２とする。光伝搬経路に沿った撮像部からの距離を表す変数ｚに対する微係数が０以下である重み関数αを用いる。重み関数の値は０以上１以下である。

第１態様では、重み関数αは、ｚが閾値ｚ_th以下である範囲において正値（例えば１）であり、それ以外の範囲において値が０であるとする。すなわち、２次元位相画像は下記（１１）式で表される。

第２態様では、重み関数αは、ｚ方向の少なくとも一部範囲において連続的に値が変化するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（１２）式で表される。

第３態様では、重み関数αは、光軸（ｚ方向）に直交する面における位置（ｘ，ｙ）に応じた値を有するものとする。すなわち、２次元位相画像は下記（１３）式で表される。

次に、図２５および図２６を用いて、位相共役演算ステップＳ６４による位相共役演算の内容について説明する。

図２５は、撮像部により干渉強度画像を撮像するときの入力光Ｕ_in（ｋ_in）および出力光ｕ_out（ｒ_out）を示す図である。Ｕ_in（ｋ_in）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋ_inの複素振幅を表す。ｕ_out（ｒ_out）は、観察対象物から出力される光の位置ｒ_outの複素振幅を表す。Ｕ_in（ｋ_in）とｕ_out（ｒ_out）との間の関係は、下記（１４）式で表される。列ベクトルＵ_inの第ｎ要素Ｕ_in（ｋ_in ⁿ）は、波数ｋ_in ⁿの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕ_outの第ｎ要素ｕ_out（ｒ_out ⁿ）は、位置ｒ_out ⁿで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）は、Ｕ_in（ｋ_in）とｕ_out（ｒ_out）との間の線形な関係を表すものであって、トランスミッション行列と呼ばれる。このようなトランスミッション行列により、観察対象物における光の散乱過程を表すことができる。行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）の第ｎ１行第ｎ２列の要素Ｔ_n1,n2は、波数ｋ_in ⁿ²で振幅１の平面波が入力されたときに位置ｒ_out ⁿ¹で観測される光の複素振幅を表す。

図２６は、光照射および撮像の関係を逆転させた場合の入力光Ｕ_out（ｋ_out）および出力光ｕ_in（ｒ_in）を示す図である。この場合、Ｕ_out（ｋ_out）は、観察対象物へ照射される光の波数ｋ_outの複素振幅を表す。ｕ_in（ｒ_in）は、観察対象物から出力される光の位置ｒ_inの複素振幅を表す。Ｕ_out（ｋ_out）とｕ_in（ｒ_in）との間の関係は、下記（１５）式で表される。列ベクトルＵ_outの第ｎ要素Ｕ_out（ｋ_out ⁿ）は、波数ｋ_out ⁿの平面波の複素振幅を表す。列ベクトルｕ_inの第ｎ要素ｕ_in（ｒ_in ⁿ）は、位置ｒ_in ⁿで観測される光の複素振幅を表す。Ｎ行Ｎ列の行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）は、Ｕ_out（ｋ_out）とｕ_in（ｒ_in）との間の線形な関係を表すものであって、光照射および撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列である。

Ｕ_in（ｋ_in）は、下記（１６）式のようにｕ_in（ｒ_in）のフーリエ変換で表される。Ｕ_out（ｋ_out）は、下記（１７）式のようにｕ_out（ｒ_out）のフーリエ変換で表される。（１４）式～（１７）式を用いると、光照射および撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）は、逆フーリエ変換を表す行列とトランスミッション行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）を用いて下記（１８）式で表される。

位相共役演算ステップＳ６４では、まず、複素振幅画像に基づいて、撮像部により干渉強度画像を撮像したときのトランスミッション行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）を求める。次に、このトランスミッション行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）および上記（１８）式に基づいて、光照射および撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）を求める。そして、このトランスミッション行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）に基づいて、光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求める。

複数の光照射方向それぞれについて撮像部により干渉強度画像を撮像するときの第ｎの光照射方向の入力光のベクトルＵ_in ⁿ（ｋ_in）は、下記（１９）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この入力光Ｕ_in ⁿ（ｋ_in）に対して、出力光ｕ_out ⁿ（ｒ_out）は、下記（２０）式で表される。この（２０）式は、第ｎの光照射方向の際に得られた複素振幅に対応する。

この（１９）式および上記（１４）式から、下記（２１）式が得られる。そして、複数の光照射方向それぞれについて同様に求めると、下記（２２）式が得られる。このようにして、トランスミッション行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）を求めることができる。さらに、この（２２）式および上記（１８）式から、光照射および撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）を求めることができる。

光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向のうちの第ｎの光照射方向の入力光Ｕ_out ⁿ（ｋ_out）は、下記（２３）式で表され、第ｎ要素の値のみが１であって、他の要素の値が０である。この式から、この入力光Ｕ_out ⁿ（ｋ_out）に対する出力光ｕ_in ⁿ（ｒ_in）は、下記（２４）式で表される。この（２４）式は、光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅を表す。このようにして、光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複素振幅画像を求めることができる。

光照射および撮像の関係を逆転させた場合のトランスミッション行列Ｓ（ｒ_in，ｋ_out）を求める際に、上記（１８）式に示されるとおり、トランスミッション行列Ｔ（ｒ_out，ｋ_in）の逆行列を計算する必要がある。したがって、トランスミッション行列Ｔは、行要素の数と列要素の数とが互いに等しい正方行列であることが必要である。すなわち、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元（matrix dimension）と、複素振幅画像の画素数とは、互いに等しいことが必要である。

両者を互いに等しくするには、干渉強度画像取得ステップＳ６１の際の観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数に一致させるか、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いるかすればよい。しかし、一般には、撮像部により得られる画像の画素数は例えば１０２４×１０２４であることから、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元を画素数と同じにすることは容易ない。また、撮像部により得られた画像のうち一部範囲の画像のみを爾後の処理に用いることは、解像度の低下につながるので、好ましくない。

そこで、図２７に示されるように、位相共役演算ステップＳ６４において、観察対象物に対する光照射側波数空間における行列の次元と同じ画素数を各々有する複数の部分画像に複素振幅画像を分割し、これら複数の部分画像それぞれに対して位相共役演算を行い、その後に複数の部分画像を結合するのが好適である。このとき、複数の部分画像のうち何れか２以上の部分画像が共通の領域を有していてもよい。

本実施形態においても、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる。

（第３実施形態）
第３実施形態の装置の構成として、観察装置１Ｅおよび観察装置１Ｆについて説明する。図２８に示される観察装置１Ｅは、図１に示された観察装置１Ａの構成と比較すると、光源１０から撮像部４０に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。図２９に示される観察装置１Ｆは、図２に示された観察装置１Ｂの構成と比較すると、光源１０から撮像部４０に到るまでの光学系については共通であるが、解析部５０に替えて解析部７０を備える点で相違する。

解析部７０は、撮像部４０と電気的に接続されており、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを入力する。解析部７０は、干渉強度画像の時系列データに基づいて、物体光の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成し、これらの複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて、観察対象物Ｓの３次元複素微分干渉画像を生成する。さらに、解析部７０は、３次元複素微分干渉画像に基づいて観察対象物Ｓの３次元屈折率分布を求める。解析部７０は、コンピュータであってよい。解析部７０は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７、表示部７８および記憶部７９を備える。

干渉強度画像取得部７１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。干渉強度画像取得部７１は、ＣＰＵを含み、また、撮像部４０から出力される干渉強度画像のデータを入力する入力ポートを有する。

第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６および第３複素振幅画像生成部７７は、干渉強度画像の時系列データに基づいて処理を行うものであり、ＣＰＵ、ＧＰＵ、ＤＳＰまたはＦＰＧＡ等の処理装置を含む。表示部７８は、処理すべき画像、処理途中の画像および処理後の画像などを表示するものであり、例えば液晶ディスプレイを含む。記憶部７９は、各種の画像のデータを記憶するものであり、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＡＭおよびＲＯＭ等を含む。第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６、第３複素振幅画像生成部７７および記憶部７９は、クラウドコンピューティングによって構成されてもよい。

記憶部７９は、干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５、屈折率分布算出部７６および第３複素振幅画像生成部７７に各処理を実行させるためのプログラムをも記憶する。このプログラムは、観察装置１Ａの製造時または出荷時に記憶部７９に記憶されていてもよいし、出荷後に通信回線を経由して取得されたものが記憶部７９に記憶されてもよいし、コンピュータ読み取り可能な記録媒体２に記録されていたものが記憶部７９に記憶されてもよい。記録媒体２は、フレキシブルディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、ＤＶＤ-ＲＯＭ、ＢＤ-ＲＯＭ、ＵＳＢメモリなど任意である。

干渉強度画像取得部７１、第１複素振幅画像生成部７２、第２複素振幅画像生成部７３、２次元位相画像生成部７４、３次元位相画像生成部７５および屈折率分布算出部７６および第３複素振幅画像生成部７７それぞれの処理の詳細については後述する。

図３０および図３１は、第３実施形態の観察方法のフローチャートである。図３１は、図３０のフローチャートの一部を示す。この観察方法は、観察装置１Ｅおよび観察装置１Ｆの何れを用いた場合においても可能なものである。この観察方法は、干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７を備える。

干渉強度画像取得ステップＳ７１の処理は干渉強度画像取得部７１により行われる。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の処理は第１複素振幅画像生成部７２により行われる。第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理は第２複素振幅画像生成部７３により行われる。２次元位相画像生成ステップＳ７４の処理は２次元位相画像生成部７４により行われる。３次元位相画像生成ステップＳ７５の処理は３次元位相画像生成部７５により行われる。屈折率分布算出ステップＳ７６の処理は屈折率分布算出部７６により行われる。第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理は第３複素振幅画像生成部７７により行われる。

干渉強度画像取得ステップＳ７１において、干渉強度画像取得部７１は、撮像部４０から出力される干渉強度画像の時系列データを取得する。第１複素振幅画像生成ステップＳ７２において、第１複素振幅画像生成部７２は、干渉強度画像取得部７１により取得された時系列データＩ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、撮像部４０の撮像面に到達した物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）を求め、更に、この物体光の複素振幅画像の時系列データｕ（ｋ_ｘ，ｙ，ｔ）に基づいて、複数の光照射方向ｋ_inそれぞれの複素振幅画像ｕ（ｘ，ｙ）を生成する。

第２複素振幅画像生成ステップＳ７３において、第２複素振幅画像生成部７３は、複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った撮像部４０からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する。

２次元位相画像生成ステップＳ７４において、２次元位相画像生成部７４は、複数の位置それぞれについて、第２複素振幅画像生成部７３により生成された複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像に基づいて２次元位相画像を生成する。ここで生成される２次元位相画像は、フォーカスを合わせたｚ方向位置を中心とする位相画像に相当する。

３次元位相画像生成ステップＳ７５において、３次元位相画像生成部７５は、２次元位相画像生成部７４により生成された複数の位置それぞれの２次元位相画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成する。ここで生成される３次元位相画像は、２次元位相画像中での位置ｘ，ｙおよび該２次元位相画像の位置ｚを変数とする画像である。

屈折率分布算出ステップＳ７６において、屈折率分布算出部７６は、３次元位相画像生成部７５により生成された３次元位相画像に基づいて、デコンボリューションにより、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。

第３実施形態の観察方法における干渉強度画像取得ステップＳ７１、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５および屈折率分布算出ステップＳ７６は、それぞれ、第１実施形態の観察方法における干渉強度画像取得ステップＳ１、第１複素振幅画像生成ステップＳ２、第２複素振幅画像生成ステップＳ３、２次元位相画像生成ステップＳ４、３次元位相画像生成ステップＳ５および屈折率分布算出ステップＳ６と略同様の処理を行う。

第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第３複素振幅画像生成部７７は、複数の光照射方向それぞれについて、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３で用いた第１位置の複素振幅画像、および、屈折率分布算出ステップＳ７６で算出した第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。

第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５および屈折率分布算出ステップＳ７６を含むステップＳ８３では、光伝搬経路に沿った撮像部４０からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の観察対象物の３次元屈折率分布を求める。ステップＳ８３および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理は繰り返し行われる。このことについて、図３０～図３３を用いて説明する。

図３２は、観察対象物を含む領域と第１～第Ｊのブロックとの関係を説明する図である。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に第１～第Ｊのブロックに区分する。この図では、Ｊ＝３としている。第１～第Ｊのブロックのうちの第ｊブロックは、ｚ＝ｚ_ｊ－１からｚ＝ｚ_ｊまでの領域である。各第ｊブロックにおいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ_ｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ_ｊの位置（遠端）を第２位置とする。

図３３は、第１～第Ｊのブロックにおける処理の手順を説明する図である。この図に示されるように、各第ｊブロックについて、ステップＳ８３で、第１位置の複素振幅画像に基づいて、第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像および２次元位相画像を生成し、第１位置から第２位置までの間の３次元位相画像を生成し更に３次元屈折率分布を求める。各第ｊブロックについて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で、第１位置の複素振幅画像、および、ステップＳ８３で算出した３次元屈折率分布に基づいて、第２位置の複素振幅画像を生成する。

第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で生成された第(ｊ＋１)ブロックの第２位置の複素振幅画像は、次の第ｊブロックの第１位置の複素振幅画像として用いられて、第ｊブロックについてステップＳ８３および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。第１～第Ｊのブロックそれぞれについて３次元屈折率分布が得られたら、これらを結合することで観察対象物の全体の３次元屈折率分布が得られる。

図３０および図３１に示されるように、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２の後のステップＳ８１においてｊ＝０とされ、続くステップＳ８２においてｊの値が１増されてｊ＝１とされて、第１ブロックについてステップＳ８３および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の各処理が行われる。すなわち、撮像部に対し最も近い第１ブロックについては、第１複素振幅画像生成ステップＳ７２で生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ_０の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ_１の位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。

第ｊブロック（ここでは、ｊは２以上Ｊ未満）については、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第(ｊ－１)ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ_ｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ_ｊの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理が順に行われる。その後、ステップＳ８２に戻る。

撮像部に対し最も遠い最終段ブロックである第Ｊブロックについては、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７で第(Ｊ－１)ブロックについて生成した複素振幅画像に基づいて、撮像部に対し最も近いｚ＝ｚ_Ｊ－１の位置（近端）を第１位置とし、撮像部に対し最も遠いｚ＝ｚ_Ｊの位置（遠端）を第２位置として、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）の処理が行われる。

第Ｊブロックについては、ステップＳ８３の後のステップＳ８４において、最終段ブロックであると判断されて、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７に進むことなく終了すればよい。なお、第Ｊブロックについては、３次元位相画像生成ステップＳ７５の後において、最終段ブロックであると判断されて、屈折率分布算出ステップＳ７６に進むことなく終了してもよく、この場合には、観察対象物の全体の３次元位相画像が得られる。

なお、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて観察対象物を含む領域を順に２個のブロックに区分してもよく、その場合には、上述した第１ブロックについての処理および最終段の第Ｊブロックについての処理を行えばよい。また、観察対象物を含む領域を複数のブロックに区分しなくてもよく、その場合には、ステップＳ８３（第２複素振幅画像生成ステップＳ７３、２次元位相画像生成ステップＳ７４、３次元位相画像生成ステップＳ７５、屈折率分布算出ステップＳ７６）および第３複素振幅画像生成ステップＳ７７それぞれの処理を順に１回のみ行ってもよい。

次に、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の詳細について説明する。観察対象物に光を照射して干渉強度画像を取得する際に、各第ｊブロックにおいて、第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）の光波面は、第ｊブロックの内部を伝搬して第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）に到達し更に撮像部まで伝搬する。そこで、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部を逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）の光波面を求める。すなわち、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、複数の光照射方向それぞれについて、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）の複素振幅画像および第ｊブロックの屈折率分布に基づいて、第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）の複素振幅画像を生成する。この処理に際して、媒質の屈折率分布を考慮して光波面の伝搬を数値計算する手法が用いられる。このような不均一媒質伝搬の数値計算手法として、ＢＰＭ（Beam Propagation Method）およびＳＳＮＰ（Split-Step Non-Paraxial）等が知られている。以下では、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７においてＢＰＭを用いた処理について説明する。

図３４は、ＢＰＭの処理内容を説明する図である。この図は、任意の第ｊブロックを示している。この図に示されるように、光伝搬経路（ｚ方向）に沿った撮像部からの距離に基づいて第ｊブロックをＭ個（この図では７個）のスライス（第１～第Ｍのスライス）に区分する。各スライスの厚みは波長程度である。

各スライスの厚みは一定であってもよい。ここでは、各スライスの厚みを一定値のΔｚとする。第ｊブロックの第１～第Ｍのスライスのうちの第ｍスライスは、位置（ｚ_ｊ－１＋(ｍ－１)Δｚ）から位置（ｚ_ｊ－１＋ｍΔｚ）までである。第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）から第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）へ向かって順に、第１～第Ｍのスライスにおいて順次に、屈折率分布に応じた位相変化を与えて光波面をΔｚだけ逆伝搬させる。

なお、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理における各スライスの厚みΔｚは、第２複素振幅画像生成ステップＳ７３の処理で第１位置から第２位置までの間の複数のｚ方向位置それぞれの複素振幅画像を生成する際の位置間隔と、異なっていてもよいし、一致していてもよい。

位置ｚにある厚みΔｚのスライスを逆伝搬する際に光波面に与えられる位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）は、下記（２５）式で表される。この（２５）式中のｋ_ｖは真空中での光の波数である。δｎ（ｘ，ｙ，ｚ）は、位置ｚにおける観察対象物の屈折率分布ｎ（ｘ，ｙ，ｚ）と背景（媒質）の屈折率ｎ_ｂとの差分であり、下記（２６）式で表される。また、cosθは下記（２７）式で表される。

第ｍスライスの位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１＋(ｍ－１)Δｚ）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、第ｍスライスの内部を光が逆伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）は、下記（２８）式で表される。この（２８）式中のＰ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ；Δｚ）は、下記（２９）式で表される。（２８）式は、光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との積をフーリエ変換し、このフーリエ変換の結果とＰ（ｋ_ｘ，ｋ_ｙ；Δｚ）との積を逆フーリエ変換することで、厚みΔｚのスライスを伝搬した後の位置（ｚ＋Δｚ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求めることを表している。Ｐ_Δｚは、Δｚの光伝搬の演算を行う関数である。

第ｊブロックの各スライスにおける光波面の伝搬は、下記（３０）式～（３２）式で表される。すなわち、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）における光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ－１）とすると、第ｊブロックの第１スライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ－１＋Δｚ）は、下記（３０）式で表される。第ｊブロックの第(ｍ－１)スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ－１＋(ｍ－１)Δｚ）とすると、第ｊブロックの第ｍスライスを伝搬した後の光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ－１＋ｍΔｚ）は、下記（３１）式で表される。第ｊブロックの第(Ｍ－１)スライスを伝搬した後の光の複素振幅をｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ－１＋(Ｍ－１)Δｚ）とすると、第ｊブロックの第Ｍスライスを伝搬した後の第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）における光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ_ｊ）は、下記（３２）式で表される。

このようにして、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７において、第ｊブロックの屈折率分布を考慮した数値計算により、第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）の光波面を第ｊブロックの内部をスライス毎に順次に逆伝搬させることで、第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）の光波面を求めることができる。

図３５は、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７のフローチャートである。ステップＳ４１において、位置ｚを、第ｊブロックの第１位置（ｚ＝ｚ_ｊ－１）に初期化する。ステップＳ４２において、位置ｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ）と位相変化ｏ（ｘ，ｙ，ｚ）との相互作用を求める。ステップＳ４３において、その相互作用後の光の波面を距離Δｚだけ伝搬させて、位置ｚ＋Δｚにおける光の複素振幅ｕ（ｘ，ｙ，ｚ＋Δｚ）を求める。ステップＳ４４において、Δｚを加算したｚを新たなｚとする。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）に未だ到達していないと判断されれば、ステップＳ４２に戻って、ステップＳ４２～Ｓ４４を繰り返す。ステップＳ４４において、位置ｚが第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）に到達したと判断されれば、第３複素振幅画像生成ステップＳ７７の処理を終了する。終了時に取得された光の複素振幅が第ｊブロックの第２位置（ｚ＝ｚ_ｊ）における複素振幅となる。

本実施形態においても、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても、多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができる。

なお、自己干渉を用いる観察装置および観察方法でもよい。この場合、観察装置は、干渉光学系を備える必要はない。

本実施形態の観察装置または観察方法は、移動している観察対象物が多重散乱体である場合であっても多重散乱光の影響を低減して観察対象物を観察することができ、例えばフローサイトメータに適用することができる。フローサイトメータにおいて流路に沿って流れる観察対象物がスフェロイドやオルガノイドなどの３次元細胞組織であっても、多重散乱光の影響を低減して３次元細胞組織を観察することができる。

フローサイトメータにおいて本実施形態の観察装置と３次元培養体アナライザとを組み合わせて用いれば、流路に沿って流れる個々の３次元細胞組織について、観察装置により３次元屈折率分布を求め、この３次元屈折率分布に基づいて３次元培養体アナライザにより種別を判定することができる。これにより、種類毎の３次元細胞組織の個数や割合を求めることができる。また、分岐流路を設ければ種類毎に３次元細胞組織を流す方向を別にすることで、３次元組織の分取・選別等が行える。

さらに、旋回培養（フローサイトメータのような流路に沿って細胞を流しながら３次元培養体を形成）を行う場合には、本実施形態の観察装置または観察方法を用いることで、３次元培養体が次第に形成されていく様子を観察することができる。

１Ａ～１Ｆ…観察装置、１０…光源、２１…ビームスプリッタ、２２，２３…ミラー、２４…シリンドリカルレンズ、２５…レンズ、２６…シリンドリカルレンズ、２７…ビームスプリッタ、２８…レンズ、３０…周波数シフタ、４０…撮像部、５０…解析部、５１…干渉強度画像取得部、５２…第１複素振幅画像生成部、５３…第２複素振幅画像生成部、５４…２次元位相画像生成部、５５…３次元位相画像生成部、５６…屈折率分布算出部、５７…表示部、５８…記憶部、６０…解析部、６１…干渉強度画像取得部、６２…第１複素振幅画像生成部、６３…第２複素振幅画像生成部、６４…位相共役演算部、６５…２次元位相画像生成部、６６…３次元位相画像生成部、６７…屈折率分布算出部、６８…表示部、６９…記憶部、７０…解析部、７１…干渉強度画像取得部、７２…第１複素振幅画像生成部、７３…第２複素振幅画像生成部、７４…２次元位相画像生成部、７５…３次元位相画像生成部、７６…屈折率分布算出部、７７…第３複素振幅画像生成部、７８…表示部、７９…記憶部。

Claims (18)

1. 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し前記物体光を照射し、前記観察対象物を経た前記物体光と前記参照光とを合波して出力する干渉光学系と、
   前記干渉光学系の分岐から合波までの間の前記物体光または前記参照光の光路上に設けられ、前記物体光および前記参照光それぞれの光周波数をヘテロダイン周波数だけ互いに異ならせる周波数シフタと、
   前記干渉光学系から出力された前記物体光および前記参照光を受光する撮像面を有し、前記撮像面における前記物体光と前記参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、前記干渉強度画像の時系列データを出力する撮像部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析部と、
   を備え、
   前記干渉光学系は、
   前記観察対象物に対し前記物体光を照射する際に、前記観察対象物において前記第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に前記物体光を集光照射する照射光学系と、
   前記観察対象物を経た前記物体光を前記撮像面に導く際に、前記第１方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、前記第２方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、
   を含み、
   前記物体光および前記参照光を互いに同軸として前記撮像面へ入射させ、
   前記解析部は、前記干渉強度画像の時系列データに基づいて、前記照射光学系による前記観察対象物への前記物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元位相画像を生成する、
   観察装置。
2. 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し前記物体光を照射し、前記観察対象物を経た前記物体光と前記参照光とを合波して出力する干渉光学系と、
   前記干渉光学系から出力された前記物体光および前記参照光を受光する撮像面を有し、前記撮像面における前記物体光と前記参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、前記干渉強度画像の時系列データを出力する撮像部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析部と、
   を備え、
   前記干渉光学系は、
   前記観察対象物に対し前記物体光を照射する際に、前記観察対象物において前記第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に前記物体光を集光照射する照射光学系と、
   前記観察対象物を経た前記物体光を前記撮像面に導く際に、前記第１方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、前記第２方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、
   を含み、
   前記物体光および前記参照光を互いに異なる方向から前記撮像面へ入射させ、
   前記解析部は、前記干渉強度画像の時系列データに基づいて、前記照射光学系による前記観察対象物への前記物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元位相画像を生成する、
   観察装置。
3. 前記解析部は、
   前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成部により生成された前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、
   を備える、
   請求項１または２に記載の観察装置。
4. 前記解析部は、
   前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成部により生成された前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、
   を備える、
   請求項１または２に記載の観察装置。
5. 前記解析部は、
   前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
   前記第２複素振幅画像生成部による処理の前、途中または後において、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、前記観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する位相共役演算部と、
   前記複数の位置それぞれについて、前記第２複素振幅画像生成部または前記位相共役演算部により生成された前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、
   を備え、
   前記２次元位相画像生成部は、前記位相共役演算部による演算を行う前の前記複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、前記位相共役演算部による演算を行って求められた前記複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、前記複数の位置のうち、前記撮像部に対し相対的に近い位置については主として前記第１位相画像に基づいて前記２次元位相画像を生成し、前記撮像部に対し相対的に遠い位置については主として前記第２位相画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
   請求項１または２に記載の観察装置。
6. 前記解析部は、前記３次元位相画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部を更に備える、
   請求項３～５の何れか１項に記載の観察装置。
7. 前記解析部は、
   前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得部と、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った前記撮像部からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて前記第１位置から第２位置までの間の複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成部と、
   前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて前記第１位置から前記第２位置までの間の３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成部と、
   前記３次元位相画像に基づいて前記第１位置から前記第２位置までの間の前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出部と、
   前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１位置の前記複素振幅画像および前記３次元屈折率分布に基づいて前記第２位置の複素振幅画像を生成する第３複素振幅画像生成部と、
   を備え、
   前記第１複素振幅画像生成部により生成した前記複素振幅画像に基づいて、前記第２複素振幅画像生成部、前記２次元位相画像生成部、前記３次元位相画像生成部、前記屈折率分布算出部および前記第３複素振幅画像生成部それぞれの処理を順に行う、
   請求項１または２に記載の観察装置。
8. 前記２次元位相画像生成部は、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像の総和に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
   請求項３～７のいずれか一項に記載の観察装置。
9. 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し前記物体光を照射し、前記観察対象物を経た前記物体光と前記参照光とを合波して出力する干渉光学系により、前記物体光と前記参照光とを干渉させる干渉ステップと、
   前記干渉光学系の分岐から合波までの間の前記物体光または前記参照光の光路上に設けられた周波数シフタにより、前記物体光および前記参照光それぞれの光周波数をヘテロダイン周波数だけ互いに異ならせる変調ステップと、
   前記干渉光学系から出力された前記物体光および前記参照光を受光する撮像面を有する撮像部により、前記撮像面における前記物体光と前記参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、前記干渉強度画像の時系列データを出力する撮像ステップと、
   前記干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析ステップと、
   を備え、
   前記干渉光学系は、
   前記観察対象物に対し前記物体光を照射する際に、前記観察対象物において前記第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に前記物体光を集光照射する照射光学系と、
   前記観察対象物を経た前記物体光を前記撮像面に導く際に、前記第１方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、前記第２方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、
   を含み、
   前記物体光および前記参照光を互いに同軸として前記撮像面へ入射させ、
   前記解析ステップでは、前記干渉強度画像の時系列データに基づいて、前記照射光学系による前記観察対象物への前記物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元位相画像を生成する、
   観察方法。
10. 光源から出力された光を物体光と参照光とに分岐し、第１方向に沿って移動している観察対象物に対し前記物体光を照射し、前記観察対象物を経た前記物体光と前記参照光とを合波して出力する干渉光学系により、前記物体光と前記参照光とを干渉させる干渉ステップと、
    前記干渉光学系から出力された前記物体光および前記参照光を受光する撮像面を有する撮像部により、前記撮像面における前記物体光と前記参照光との干渉による干渉強度画像を撮像して、前記干渉強度画像の時系列データを出力する撮像ステップと、
    前記干渉強度画像の時系列データに基づいて解析を行う解析ステップと、
    を備え、
    前記干渉光学系は、
    前記観察対象物に対し前記物体光を照射する際に、前記観察対象物において前記第１方向に対し垂直な第２方向に延在するライン状の領域に前記物体光を集光照射する照射光学系と、
    前記観察対象物を経た前記物体光を前記撮像面に導く際に、前記第１方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いにフーリエ変換の位置関係とし、前記第２方向については前記観察対象物と前記撮像面とを互いに共役の位置関係とする結像光学系と、
    を含み、
    前記物体光および前記参照光を互いに異なる方向から前記撮像面へ入射させ、
    前記解析ステップでは、前記干渉強度画像の時系列データに基づいて、前記照射光学系による前記観察対象物への前記物体光の集光照射の際の複数の光照射方向および複数の位置それぞれの複素微分干渉画像を生成し、これらの複素微分干渉画像に基づいて前記観察対象物の３次元位相画像を生成する、
    観察方法。
11. 前記解析ステップは、
    前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成ステップにより生成された前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、
    を備える、
    請求項９または１０に記載の観察方法。
12. 前記解析ステップは、
    前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１複素振幅画像生成ステップにより生成された前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像を複数のバッチに区分し、前記複数のバッチそれぞれについて該バッチに含まれる前記複素振幅画像の位相を光照射方向に基づいて補正した後これら補正後の複素振幅画像の総和を表す複素振幅総和画像を生成し、前記複数のバッチそれぞれの前記複素振幅総和画像に基づいて前記複数のバッチそれぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数のバッチそれぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、
    を備える、
    請求項９または１０に記載の観察方法。
13. 前記解析ステップは、
    前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記複素振幅画像に基づいて複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、
    前記第２複素振幅画像生成ステップによる処理の前、途中または後において、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に対して位相共役演算を行って、前記観察対象物に対する光照射および撮像の関係を逆転させた場合の複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する位相共役演算ステップと、
    前記複数の位置それぞれについて、前記第２複素振幅画像生成ステップまたは前記位相共役演算ステップにより生成された前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、
    を備え、
    前記２次元位相画像生成ステップは、前記位相共役演算ステップによる演算を行う前の前記複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第１位相画像とし、前記位相共役演算ステップによる演算を行って求められた前記複素振幅画像に基づいて生成される位相画像を第２位相画像としたとき、前記複数の位置のうち、前記撮像部に対し相対的に近い位置については主として前記第１位相画像に基づいて前記２次元位相画像を生成し、前記撮像部に対し相対的に遠い位置については主として前記第２位相画像に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項９または１０に記載の観察方法。
14. 前記解析ステップは、前記３次元位相画像に基づいて前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップを更に備える、
    請求項１１～１３の何れか１項に記載の観察方法。
15. 前記解析ステップは、
    前記撮像部から前記干渉強度画像の時系列データを取得する干渉強度画像取得ステップと、
    前記干渉強度画像の時系列データに基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素振幅画像を生成する第１複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、光伝搬経路に沿った前記撮像部からの距離に関し第１位置の複素振幅画像に基づいて前記第１位置から第２位置までの間の複数の位置それぞれの複素振幅画像を生成する第２複素振幅画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれについて、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素振幅画像に基づいて前記複数の光照射方向それぞれの複素微分干渉画像を生成し、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像に基づいて２次元位相画像を生成する２次元位相画像生成ステップと、
    前記複数の位置それぞれの前記２次元位相画像に基づいて前記第１位置から前記第２位置までの間の３次元位相画像を生成する３次元位相画像生成ステップと、
    前記３次元位相画像に基づいて前記第１位置から前記第２位置までの間の前記観察対象物の３次元屈折率分布を求める屈折率分布算出ステップと、
    前記複数の光照射方向それぞれについて、前記第１位置の前記複素振幅画像および前記３次元屈折率分布に基づいて前記第２位置の複素振幅画像を生成する第３複素振幅画像生成ステップと、
    を備え、
    前記第１複素振幅画像生成ステップにより生成した前記複素振幅画像に基づいて、前記第２複素振幅画像生成ステップ、前記２次元位相画像生成ステップ、前記３次元位相画像生成ステップ、前記屈折率分布算出ステップおよび前記第３複素振幅画像生成ステップそれぞれの処理を順に行う、
    請求項９または１０に記載の観察方法。
16. 前記２次元位相画像生成ステップでは、前記複数の光照射方向それぞれの前記複素微分干渉画像の総和に基づいて前記２次元位相画像を生成する、
    請求項１１～１５の何れか１項に記載の観察方法。
17. 請求項９～１６の何れか１項に記載の観察方法の各ステップをコンピュータに実行させるためのプログラム。
18. 請求項１７に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。

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