JP2022514197A - 抗ｂ７－ｈ３抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｂ７Ｈ３（Ｂ７－Ｈ３）分子の細胞外領域に結合する抗体およびその免疫反応性フラグメント、ならびに使用、特に癌治療におけるその使用に関する。本発明は特に、癌性細胞に対する免疫系の活性化を増強することができる、ヒト化抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、Ｂ７Ｈ３（Ｂ７－Ｈ３）分子の細胞外領域に結合する抗体およびその免疫反応性フラグメント、ならびにその使用、特に癌治療におけるその使用に関する。本発明は特に、癌性細胞を含む病変組織に対する免疫系の活性化を増強することができる、ヒト化抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。

Ｂ７ホモロジー３タンパク質（Ｂ７－Ｈ３）（ＣＤ２７６およびＢ７ＲＰ－２とも呼ばれ、本明細書では「Ｂ７－Ｈ３」または「Ｂ７Ｈ３」と呼ばれる）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通糖タンパク質である。現在まで、Ｂ７スーパーファミリーの７つのメンバー、すなわち、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４が発見されている（非特許文献１）。

ヒトＢ７－Ｈ３には、推定シグナルペプチド、Ｖ様およびＣ様Ｉｇドメイン、膜貫通領域および細胞質領域が含まれている。二種のヒトＢ７－Ｈ３のアイソタイプ、すなわち、単一のＩｇＶ－ＩｇＣ様ドメインを有する２ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプ（２ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプ）と、ＩｇＶ－ＩｇＣ－ＩｇＶ－ＩｇＣ様ドメインを有する４ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプとが存在する。ヒト組織および細胞株における主なＢ７－Ｈ３アイソタイプは４ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプである（非特許文献２）。

Ｂ７－Ｈ３は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）などを含む多くの免疫細胞で構成的に発現していないが、その発現は誘導可能であり、例えば、ＩＦＮ－γとＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインによって誘導することができる（非特許文献３）。Ｂ７－Ｈ３転写物は、結腸、心臓、肝臓、胎盤、前立腺、小腸、精巣、子宮、および骨芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞及び非リンパ系の他の細胞を含む、様々なヒト組織でも発現している（非特許文献４）。ただし、正常組織でのタンパク質発現は通常、低レベルに維持されている。

Ｂ７－Ｈ３はまた、前立腺癌、淡明細胞型腎細胞癌、神経膠腫、黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、膵臓癌、胃癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、卵巣癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎臓癌、肝細胞癌、腎臓癌、頭頸部癌、下咽頭扁平上皮癌、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、乳癌、子宮内膜癌、および尿路上皮細胞癌を含むさまざまなヒト癌において発現する。

Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する抗体および他の分子は記載されている（特許文献１～１２参照）。

米国特許第７，５２７，９６９号 米国特許第７，３６８，５５４号 米国特許第７，３５８，３５４号 米国特許第７，２７９，５６７号 国際公開第ＷＯ２００８／１１６２１９号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００６／０１６２７６号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００４／０９３８９４号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００４／００１３８１号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００２／３２３７５号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００２／１０１８７号パンフレット 国際公開第ＷＯ２００１／０９４４１３号パンフレット 欧州特許第ＥＰ１２９２６１９Ｂ号公報

Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．，（２００５）、「Ｔｈｅ Ｂ７ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ－Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｌｉｇａｎｄｓ，」 Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ. ６：２２３．１－２２３．７ Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２（４）：２３５２－９（２００４） Ｓｈａｒｐｅ，Ａ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．，（２００２）「Ｔｈｅ Ｂ７－ＣＤ２８ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ,」 Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２：１ １６－１２６ Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．３：９８９－９３（２０１１）

これらすべての抗体と分子が存在するにもかかわらず、癌細胞に結合し、癌細胞に対する免疫応答を促進または媒介することができ、従ってこれらの癌の診断および治療に使用できる、改良された抗体または分子が必要である。

本明細書で提供される抗体およびその免疫反応性フラグメントは、細胞（例えば、癌細胞）上に発現するＢ７Ｈ３（Ｂ７－Ｈ３）分子に高い親和性で結合し、癌細胞に対する効果的な免疫応答を促進する。本明細書で提供される抗体およびその免疫反応性フラグメントは、免疫系の活性化を増強することができ、これによって、Ｂ７－Ｈ３分子の発現および／または活性に関連する病的状態を標的とするための重要な治療および診断剤を提供する。したがって、本発明は、Ｂ７－Ｈ３結合に関連する方法、組成物、キットおよび製品を提供する。

一態様において、本発明は、重鎖（ＨＣ）可変領域配列および軽鎖（ＬＣ）可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗体がＢ７－Ｈ３の細胞外領域に結合し、ＳＰＲ分析によって確認された結合親和性が約１．５ｎＭまたは１．５ｎＭよりも優れており、例えば、ＳＰＲ分析によって確認された結果、１．０～１．４ｎＭ、０．５～１．０ｎＭ、０．１～０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭまたはそれよりも優れている。

一部の実施形態では、本発明は項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、その中で
（ａ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）またはＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
（ｂ）前記ＬＣが、ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）またはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
（ｃ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３配列を含み、前記ＬＣがＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
（ｄ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ３配列を含み、前記ＬＣがＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ３配列を含む。

一部の実施形態では、前記ＨＣが、ＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲ（配列番号２）またはＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴ（配列番号８）を含むＣＤＲ２配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記ＨＣが、ＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨ（配列番号１）またはＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号７）を含むＣＤＲ１配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記ＬＣが、ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）またはＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号１１）を含むＣＤＲ２配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記ＬＣが、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号４）またはＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ１配列をさらに含む。一部の実施形態では、前記ＨＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＨＣ ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲ（配列番号２）を含むＨＣ ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）を含むＨＣ ＣＤＲ３を含み；および／または
前記ＬＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号４）を含むＬＣ ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣ ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む。

一部の実施形態では、前記ＨＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号７）を含むＨＣ ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴ（配列番号８）を含むＨＣ ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＨＣ ＣＤＲ３を含み；および／または
前記ＬＣが、
（ａ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１０）を含むＬＣ ＣＤＲ１；および／または
（ｂ）アミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号１１）を含むＬＣ ＣＤＲ２；および／または
（ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む。

一部の実施形態では、前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトアクセプターフレームワーク（Ａｃｃｅｐｔｏｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）をさらに含む。一部の実施形態では、前記ヒトアクセプターフレームワークは、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する。一部の実施形態では、前記ヒトアクセプターフレームワークは、ＶＬのκＩフレームワークシーケンスのサブグループと、ＶＨのＩＩＩフレームワークシーケンスのサブグループとを含む。一般的に言えば、前記配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、Ｖｏｌｕｍｅ １－３に記載のようなサブグループである。一部の実施形態では、ＶＬの場合、前記サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（同上）に記載のようなサブグループκＩである。一部の実施形態では、ＶＨの場合、前記サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（同上）に記載のようなサブグループＩＩＩである。

一部の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトコンセンサスフレームワークを含む。一部の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列変化、例えば、１～１５、１～１０、２～９、３～８、４～７、または５～６のアミノ酸変化を有する、ヒトコンセンサスフレームワークを含む。

一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはＨＣ可変領域配列を含み、前記ＨＣ可変領域配列は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１３、１６および１７のいずれか１つと８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントはＬＣ可変領域配列を含み、前記ＬＣ可変領域配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号１４、１５、１８および１９のいずれか１つと８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記ＨＣ可変領域配列は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣ可変領域配列は配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記ＨＣ可変領域配列は配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣ可変領域配列は配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである。一部の実施形態では、前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、結合するＢ７－Ｈ３分子の生物学的活性を阻害または低減するブロッキング抗体（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）またはアンタゴニスト抗体（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。好ましくは、前記ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、Ｂ７－Ｈ３分子の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および第二の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性分子を提供する。一部の実施形態では、前記第二の抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞の表面に発現する腫瘍抗原に特異的に結合し、前記腫瘍抗原は、Ａ３３；ＡＤＡＭ－９；ＡＬＣＡＭ；ＢＡＧＥ；β－カテニン；ＣＡ１２５；カルボキシペプチダーゼＭ；ＣＤ１０３；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２５；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３６；ＣＤ４０／ＣＤ１５４；ＣＤ４５；ＣＤ４６；ＣＤ５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ；ＣＤＫ４；ＣＥＡ；ＣＴＬＡ４；サイトケラチン８；ＥＧＦ－Ｒ；ＥｐｈＡ２；ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＧＡＧＥ－１；ＧＡＧＥ－２；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ヒトパピローマウイルス－Ｅ６；ヒトパピローマウイルス－Ｅ７；ＪＡＭ－３；ＫＩＤ３；ＫＩＤ３１；ＫＳＡ（１７－１Ａ）；ＬＵＣＡ－２；ＭＡＧＥ－１；ＭＡＧＥ－３；ＭＡＲＴ；ＭＵＣ－１；ＭＵＭ－１；Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ；オンコスタチンＭ；ｐｌ５；ＰＩＰＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＲＯＲ１；ＴＮＦ－β受容体；ＴＮＦ－α受容体；ＴＮＦ－γ受容体；トランスフェリン受容体；およびＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ポリペプチドを提供する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントのＨＣ可変領域および／またはＬＣ可変領域を含む、ポリペプチドを提供する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、治療薬に連結された免疫複合体を提供する。一部の実施形態では、前記治療薬が細胞毒素または放射性同位体である。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、二重特異性分子、ポリペプチドまたは免疫複合体、および薬学上許容される担体を含む、組成物を提供する。一部の実施形態では、前記組成物は抗癌薬剤をさらに含む。一部の実施形態では、前記薬剤が、抗体、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、毒素または免疫療法剤である。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、二重特異性分子、ポリペプチド、免疫複合体、または組成物、および、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、二重特異性分子、ポリペプチド、免疫複合体、または組成物の使用に関する必要な情報を備えるプロトコル（パッケージインサート）を含む、癌を治療するための製品またはキットを提供する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する必要な情報を備えるプロトコル（パッケージインサート）を含む、癌を診断するための製品またはキットを提供する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントのＨＣ可変領域および／またはＬＣ可変領域をコードする、単離された核酸、前記核酸を含む発現ベクター、または前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。

一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを上記宿主細胞において発現させることと、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを前記宿主細胞から単離することとを含む、方法を提供する。

一態様において、本発明は、有効量の上記の本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、二重特異性分子、ポリペプチド、免疫複合体、組成物、製品、またはキットを、癌疾患に罹患している患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記癌は、黒色腫、結腸直腸腺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、および淡明細胞型腎細胞癌からなる群より選ばれる。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを、被験者からのサンプルと接触させることを含む、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性を検出または定量するための方法を提供する。一部の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能な物質で標識される。一部の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、放射性標識、蛍光標識、または酵素標識されている。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用してＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性を検出または定量することを含む、被験者における癌のリスクを予測するための方法を提供する。

一態様において、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを使用してＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性を検出または定量することを含む、Ｂ７－Ｈ３の発現レベルまたは活性の増加を示す癌の治療における薬剤の有効性をモニタリングするための方法を提供する。

図１Ａは、本発明の、ヒトＢ７Ｈ３、マウスＢ７Ｈ３、およびカニクイザルＢ７Ｈ３タンパク質に結合するヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体のＥＬＩＳＡ分析実験の結果を示す図である。 図１Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析の実験結果を示す図である。解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数のデータは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して得られた。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋａに対するｋｄの比率から計算された。 図２は、細胞株表面に安定して発現するＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－２ＩｇおよびＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－４Ｉｇに対するヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の細胞表面結合親和性を示す図である。 図３は、刺激されたヒトＰＢＭＣ上で発現するＢ７Ｈ３に対するヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の結合親和性を示す図である。 図４は、ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体によってインビトロで誘導されたＡＤＣＣを示す図である。その結果は、ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体が用量依存的にＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを媒介できることを示している。 図５は、抗Ｂ７Ｈ３抗体が、Ｂ７Ｈ３によるＴ細胞活性化への阻害をブロックしたことを示す図である。その結果は、抗Ｂ７Ｈ３抗体が抗ＣＤ３によって刺激されたＴ細胞活性化に対するＢ７Ｈ３の阻害効果を逆転させたことを示している。 図６は、Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫同系モデルを示す図である。その結果は、抗Ｂ７Ｈ３抗体がインビボ研究で黒色腫腫瘍の増殖を減少させることができることを示している。 図７は、ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＳＷ６２０ヒト結腸直腸腺癌異種移植モデルを示す図である。その結果は、抗Ｂ７Ｈ３抗体が異種移植モデルにおけるヒト結腸直腸腺癌の増殖を減少させることができることを示している。

本発明は本明細書において、Ｂ７－Ｈ３タンパク質、特にヒトＢ７－Ｈ３タンパク質またはポリペプチドに結合する抗体およびそのフラグメントを提供する。本発明はまた、例えば癌細胞に抵抗するように免疫系の活性化を増強するための前記抗体およびそのフラグメントの使用に係る。本発明はさらに、抗Ｂ７－Ｈ３抗体、抗Ｂ７－Ｈ３抗体をコードするポリヌクレオチド、および抗Ｂ７－Ｈ３抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞を調製するための方法を提供する。

１．定義
本開示は、本明細書に記載の態様に限られるものではなく、その自身は勿論変化することができることを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の態様を説明するためにのみ使用され、限定することを意図しないことも理解されたい。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、その技術が属する分野の通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用されるすべての技術および特許公開は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に明記しない限り、当業者は、本技術分野の技術的範囲内の組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｄｓ．（２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｌａｎｅ ｅｄｓ．（１９９９） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ （Ｓｈｅｐｈｅｒｄ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，２０００） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＵＳＡ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．を参照できる。

本明細書で使用されるように、「Ｂ７－Ｈ３」は、共刺激分子のＢ７／ＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞応答の補助調節因子として機能する。Ｂ７－Ｈ３は、Ｂ７ファミリーの他のメンバーと２０％～２７％のアミノ酸同一性を共有するＩ型膜貫通タンパク質である。マウスＢ７－Ｈ３は、単一の細胞外可変免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖ－ＩｇＣドメインとシグネチャー細胞内ドメイン（２Ｉｇ Ｂ７－Ｈ３）で構成されているが、ヒトＢ７－Ｈ３は、ほぼ一致したＩｇＶ－ＩｇＣドメインのタンデム重複を含む、いわゆる４Ｉｇ Ｂ７－Ｈ３という別のアイソタイプを有する。Ｂ７Ｈ３（２Ｉｇ）について、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２５２４０．２を参照でき、Ｂ７Ｈ３（４Ｉｇ）について、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０２４７３６．１を参照できる。（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：８０３８１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５ＺＰＲ３ http://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇоｖ/ 最終アクセス日：２０１４年１０月２０日）。

本発明で使用されているように、用語の「抗体」は、「免疫グロブリン」とも呼ばれ、天然抗体の構造的特徴を有する抗体、および天然抗体とは異なる構造的特徴を有するがＢ７Ｈ３分子（Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２７６およびＢ７ＲＰ－２）に対して結合特異性を示す抗体様分子を包含する。用語の抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を包含することを意図している。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。

用語の「重鎖」（「ＨＣ」）、「軽鎖」（「ＬＣ」）、「軽鎖可変領域」（「ＶＬ」）、「重鎖可変領域」（「ＶＨ」）、「フレームワーク」（「ＦＲ」）とは、天然に存在する免疫グロブリンのドメイン、および合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体）の対応するドメインを指す。天然に存在する免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本の構造単位は、２つの軽鎖と２つの重鎖を持つ四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、主に抗原認識を担当する。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域として定義され、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。したがって、天然に存在するＩｇＧ分子の軽鎖の構造はＮ－ＶＬ－ＣＬ－Ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はＮ－ＶＨ－ＣＨ１－Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ（Ｈはヒンジ領域）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）（抗原と接触する残基を含む）と非ＣＤＲセグメント（構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定するフレームワークセグメントと呼ばれる）で構成される。したがって、前記ＶＬとＶＨドメインの構造は、Ｎ－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４－Ｃという構造を有する。

天然抗体では、可変性は抗体の可変領域において不均一に分布しており、軽鎖と重鎖可変領域において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖と軽鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲで接続された４つのＦＲ領域が含まれている。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって密接に連結されており、別の鎖からのＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位の形成を促進する［Ｋａｂａｔ, Ｅ.Ａ. ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９８７）参照］。定常領域は、抗体と抗原との結合に直接に関与しないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。

本明細書で使用されているように、用語の抗体の「抗原結合フラグメント」（または「抗体フラグメント」と略称する）とは、抗原（例えば、ヒトＢ７Ｈ３などのようなＢ７Ｈ３分子（Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ２７６およびＢ７ＲＰ－２））に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。前記抗体フラグメントは、完全な抗体の一部のみを含み、その部分は好ましくは、完全な抗体に存在する場合に当該部分に通常に関連する少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべての機能を保持する。抗体フラグメントの実例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二重特異性抗体（ダイアボディｄｉａｂоｄｙ）；線状抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントからなる多重特異性抗体が含まれる。

抗体をパパインで消化することにより、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントが生成され、それぞれが単一の抗原結合部位と残りのＦｃフラグメントを有し、その名前は、容易に結晶化する能力を反映している。「Ｆａｂ」フラグメントはさらに、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。「Ｆａｂ’」フラグメントのＦａｂフラグメントとの違いは、抗体のヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む、いくつかの残基が重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に追加されたことである。「Ｆａｂ’－ＳＨ」はＦａｂ’で定常ドメインのシステイン残基に遊離のチオール基があることを示す。「Ｆ（ａｂ’）」フラグメントは、ペプシン消化生成物「Ｆ（ａｂ’）２」のヒンジシステインのジスルフィド結合の切断によって生成される。

「Ｆｄ」フラグメントは、ＶＨとＣＨ１ドメインで構成される。「ｄＡｂ」フラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）はＶＨドメインで構成される。単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）と２つ以上の単離されたＣＤＲとの組み合わせは、合成リンカーによって結合されていてもよい。

「Ｆｖ」フラグメントは、抗体の一本アームのＶＬドメインとＶＨドメインで構成される。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合されていることにより１つの単鎖ポリペプチド鎖になる、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域で構成される。

用語の「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、これらのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ－ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。リンカーを使用することにより（同一鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるため）、前記ドメインは他の鎖の相補ドメインとペアリングせざるを得ず、２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；および、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９０：６４４４－４８（１９９３）にはより完全に記載されている。

これらの抗体のフラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して、例えば、組換えＤＮＡ技術によって、または完全な免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって得られる。

本明細書で使用されているように、用語の「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同な抗体の群から得られた抗体のことであり、すなわち、可能な変異体抗体（例えば、自然に存在する変異またはモノクローナル抗体の製造過程において発生する変異を含み、このような変異体は一般に微量で存在する）を除き、該群を構成する各抗体は同一であり、および／または同じエピトープに結合する。

本明細書で使用されているように、用語の「キメラ抗体」とは、組換えＤＮＡ技術を使用して、ある種からのモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えば、マウスのＦｃ定常領域）を別の種の抗体のＦｃ定常領域（例えば、ヒトＦｃ定常領域）に置き換える抗体を指す。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，欧州特許出願１７３，４９４を参照できる。

本明細書で使用されているように、用語の「ヒト化抗体」とは、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラット、ウサギ、または合成）免疫グロブリンからの１つまたは複数のＣＤＲを含む抗体を指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一態様では、すべてのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンのドナー免疫グロブリンに由来する。そのため、可能なＣＤＲ以外に、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と基本的に同じである。ヒト化抗体は、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許番号５，５８５，０８９を参照できる）。

「アクセプターヒトフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークを指す。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、またはアミノ酸配列変化を含み得る。一部の実施形態では、アミノ酸変化の数は、１～１０、２～９、３～８、４～７、または５～６である。

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的にみられるアミノ酸残基を表すフレームワークのことである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、前記配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ （１９９１）、第１～３巻のサブグループのようなものである。一部の実施形態では、ＶＬについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（同上）によって記載されているサブグループκIである。一部の実施形態では、ＶＨについて、前記サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（同上）によって記載されているサブグループＩＩＩである。

本明細書で使用されているように、用語の「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本技術のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ランダムまたは部位特異的インビトロ変異誘発、またはインビボ体細胞の変異によって導入される変異）。しかしながら、本明細書で使用されている用語の「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種の生殖系列（例えば、ウサギ）に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。したがって、本明細書で使用されているように、用語の「ヒト抗体」とは、タンパク質の実質的にすべての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、ＶＬ、ＶＨ）が、わずかな配列変化または変異のみを伴って、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体を指す。したがって、ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体とは異なる。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物または原核生物または真核生物細胞によって産生され得ることが指摘されたい。

本明細書で使用されているように、「二重特異性抗体」または「二重特異性抗原結合抗体」もしくは「二機能性抗体」は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。本発明について言えば、「二重特異性抗体」は、Ｂ７Ｈ３と別の抗原、例えば、腫瘍細胞に発現する腫瘍抗原、に特異的に結合する。

「複合体」は、細胞毒性剤を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低下させる抗体である。好ましいブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。

本明細書で使用されているように、「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的または細胞性材料を指す。例えば、組換えＤＮＡ技術によって生成された場合は、細胞性材料、ウイルス材料、または培地を実質的に含まない核酸またはペプチド、或いは化学的に合成された場合は化学物質を実質的に含まない前駆体または他の化学物質である。また、「単離された核酸」とは、フラグメントとして自然に存在せず、自然状態では見出されない核酸フラグメントを含むことを意味する。「単離された」という用語は本明細書においてまた、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指し、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。

本明細書で使用されているように、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用される「相同性」または「同一性」のパーセンテージは、２つ以上の配列またはサブ配列が同じであるか、または指定されたパーセンテージを有する同じのヌクレオチドまたはアミノ酸残基のことを指し、例えば、指定された領域で（例えば、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列）、少なくとも８０％の同一性を有し、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有する。相同性は、各配列における位置を比較することによって確定でき、比較の目的でその位置をアラインメントすることができる。比較された配列の中の一つの位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占められている場合、当該分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、マッチングした数または配列によって共有される相同位置の数の関数である。本分野で知られているソフトウェアプログラムをアラインメントに使用して相同性パーセンテージまたは配列の同一性を確定することができる。好ましくは、デフォルトのパラメータをアラインメントのために使用する。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇоｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにある。

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。別途説明する場合を除き、本明細書で使用されている「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。親和性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびＥＬＩＳＡを含む、本分野で知られている通常の方法によって測定することができる。

パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に、比率ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）として計算される平衡解離定数（ＫＤ）で表すことができる。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ，（１９９９） Ｊ． ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５－８８１を参照できる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に抗原に速く結合し、より長く結合したままになる傾向がある。本発明の一実施形態では、「解離速度（ｋ_ｄ）」は、表面プラズモン共鳴測定を使用して測定される。本発明によれば、「オン速度」または「会合した速度」或いは「会合速度（ｋ_ａ）」もしくは「ｋ_оｎ」は、同じ表面プラズモン共鳴技術を使用して確定することができ、会合および解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア）を使用して計算する。

本明細書で使用されているように、用語の「ＥＣ５０」は、インビトロまたはインビボアッセイの中で、Ｂ７Ｈ３に結合する、および／または応答を誘導する抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度を指し、それは最大結合または応答の５０％であり、すなわち、最大結合または応答とベースラインとの中間である。

用語の「癌」、「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ」、および「腫瘍（ｔｕｍｏｒ）」は、本発明において置き換えて使用することができ、細胞の異常で制御されずに成長して引き起こされる新生物または腫瘍を指し、その異常で制御されない成長は、宿主生物を致病する。一部の実施形態では、癌とは、限局性のままである良性腫瘍を指す。他の実施形態では、癌は、隣接する身体構造に侵入して破壊し、離れた部位までに広がった悪性腫瘍を指す。一部の実施形態では、癌は特異的癌抗原に関連する。

本明細書で使用されているように、被験者の疾患を「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」することまたはその「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、検出可能か検出不可能かを問わず、１つまたは複数の症状の軽減または改善、病状（疾患を含む）の範囲の縮小、病状（疾患を含む）の安定した（すなわち、悪化しない）状態、病状（疾患を含む）の遅延または減速、病状（疾患を含む）の進行、改善または緩和、状態、および寛解（部分的または全体的）を含むが、これらの１つまたは複数に限られていない、有益なまたは望ましい結果を得るための方法を指す。

「薬学上許容される担体」とは、有効成分と一緒に医薬製剤を構成する担体のことである。薬学上許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤を含むが、これらに限られていない。

用語の「プロトコル・パッケージインサート」は、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指すために使用される。一般に、適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および／または警告などの、治療用製品の使用に関する情報はプロトコル・パッケージインサートにある。

本発明は、特定の実施形態について、特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。例えば、本明細書および特許請求の範囲で使用される「含む」という用語は、その他の要素またはステップを除外するものではない。単数名詞を言及する時に不定冠詞または定冠詞が使用され、例えば、「一（ａ）」または「１つ（ａｎ）」、「この（ｔｈｅ）」は、特に説明しない限り、該名詞の複数形をも含む。

２．抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびその調製方法
本発明は、単離された抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメント、抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を包含する。

本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、好ましくはモノクローナルである。本明細書で提供される抗Ｂ７－Ｈ３抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントも本発明の範囲に含まれる。これらの抗体フラグメントは、酵素消化などの従来の手段によって生成することも、または、組換え技術によって生成することもできる。抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびそのフラグメントは、癌の診断および治療を含む、診断および治療の目的に使用することができる。

モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体群から得られる。つまり、天然に存在し得る突然変異が少量存在できることを除いて、当該群を構成する個々の抗体は同じである。したがって、修飾語の「モノクローナル」は、抗体が異なる抗体の混合物ではないことを特徴としていることを示す。本発明のモノクローナル抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、ハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ法（米国特許番号４，８１６，５６７）を使用して製造することができる。

ハイブリドーマ法では、Ｂ７－Ｈ３分子全体または前記分子の一部（例えば、Ｂ７－Ｈ３の細胞外領域を含むポリペプチド）とアジュバントと共によって、マウスまたはハムスターなどの他の適切な宿主動物を免疫する。Ｂ７－Ｈ３分子またはＢ７－Ｈ３分子の細胞外領域を含むポリペプチドは、本分野で公知の方法を使用して調製することができる。一実施形態では、Ｂ７－Ｈ３の細胞外領域（ＥＣＤ）を含むポリペプチドを使用して動物を免疫し、前記細胞外領域は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分に融合される。一実施形態では、Ｂ７－Ｈ３－ＩｇＧ１融合タンパク質を使用して動物を免疫する。二週間後、動物はブーストされる。７～１４日後、動物から血液を採取し、血清の抗Ｂ７－Ｈ３力価を測定する。力価が安定するまで動物をブーストする。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫することができる。そして、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を使用して、リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９～１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。

このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含む適切な培地に播種して培養される。好ましい骨髄腫細胞は効果的に融合され、選択された抗体産生細胞によって安定した高レベルで抗体を産生することをサポートし、培地（ＨＡＴ培地など）に感受性のある骨髄腫細胞である。その中で、好ましい骨髄腫細胞株は、ＳＰ－２またはＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞などのネズミ科骨髄腫細胞株である。（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １３３：３００１ （１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１～６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生への、ヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株の使用も記載している。

ハイブリドーマ細胞を培養する培地は、Ｂ７－Ｈ３に対してモノクローナル抗体を産生する能力が測定される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）あるいは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって確定される。

そして、本分野における従来の方法によってモノクローナル抗体の結合親和性を確定することができる。必要な特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈手順でサブクローニングし、標準的な方法で培養クローニングすることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９～１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。

この目的に適した培地は、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、腹水腫瘍として動物体内で増殖する可能性がある。従来の免疫グロブリン精製手順により、サブクローニングによって分泌されたモノクローナル抗体は、培地、腹水または血清から適切に分離される。

本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、コンビナトリアル・ライブラリーを使用して、所望の１つまたは複数の活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングすることによって作製することができる。一般に、合成抗体クローンは、抗体可変領域（Ｆｖ）の異なるフラグメントをディスプレイするファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。前記Ｆｖフラグメントは、ファージコートタンパク質に融合する。このファージライブラリーは、目的の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選択（Ｐａｎ）される。

クローンが発現したＦｖフラグメントは目的抗原に結合することができ、抗原に吸着するため、これによってライブラリーの非結合クローンから分離される。そして、結合したクローンは抗原から溶出され、抗原の吸着／溶出の追加サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、以下の方法によって得ることができる。すなわち、適切な抗原スクリーニングプログラムを設計し、目的ファージクローンを選択し、次いで、目的ファージクローンからのＦｖ配列およびＫａｂａｔらがＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、Ｖｏｌｕｍｅ １－３に記載した適切な定常領域（Ｆｃ）配列を使用して完全長の抗Ｂ７－Ｈ３抗体クローンを構築する。

ＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々クローニングされ、ファージライブラリーでランダムに組換えられ、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４３３－４５５（１９９４）に記載されているように、その中の抗原結合クローンを探すことができる。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、免疫化せずに広範囲の非自己および自己抗原に対する単一の供給源のヒト抗体を提供するようにナイーブ（ｎａｉｖｅ）レパートリーをクローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．ＭｏＩ Ｂｉｏｌ，２２７：３８１－３８８（１９９２）に記載されているように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードしてインビトロで再配列することによって作製できる。

ナイーブライブラリー（天然または合成）から生成された抗体は中程度の親和性を持つことができるが、二次ライブラリーを構築してそれらから再選択することにより、親和性の成熟をインビトロでシミュレーションすることもできる。例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ＭｏＬ Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９－８９６（１９９２）の方法、またはＧｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９：３５７６－３５８０（１９９２）の方法において、エラーが発生しやすいポリメラーゼ（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１－１５（１９８９）で報告されている）を使用してインビトロで突然変異をランダムに導入することができる。また、親和性の成熟は、選択した単一のＦｖクローン内に、１つまたは複数のＣＤＲをランダムに変異させ（例えば、ＰＣＲと、目的のＣＤＲにまたがるランダム配列を持つプライマーを使用する）、親和性のより高いクローンをスクリーニングすることで実行できる。別の効果的な方法は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１０：７７９－７８３（１９９２）に記載されているように、ファージディスプレイによって選択されたＶＨまたはＶＬドメインを、免疫されていないドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと再結合し、数ラウンドの鎖再編成でより高い親和性をスクリーニングすることである。

Ｂ７－Ｈ３について、親和性がわずかに異なる場合でも、異なる親和性のファージ抗体から選択することも可能である。しかし、選択された抗体のランダムな突然変異（例えば、上記の親和性成熟技術のいくつかで実行されるようなもの）は、多くの突然変異体を産生するかもしれず、それらのほとんどは抗原に結合し、いくつかはより高い親和性を持っている。すべての高親和性変異体を保持するために、ファージを過剰のビオチン化Ｂ７－Ｈ３とインキュベーションすることができるが、ビオチン化Ｂ７－Ｈ３のモル濃度は、Ｂ７－Ｈ３に対する目標モル親和性定数よりも低くなる。そして、高親和性結合ファージは、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズによって捕捉することができる。このような「平衡捕捉（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｃａｐｔｕｒｅ）」により、抗体の結合親和性に基づいて抗体を選択でき、その感度により、親和性の低い大量に過剰するファージから、親和性の２倍と高い変異体クローンを単離することができる。

抗Ｂ７－Ｈ３クローンは、活性のパフォーマンスに基づいて選択できる。一実施形態では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３受容体とそのリガンドとの間の結合を遮断する抗Ｂ７－Ｈ３抗体を提供する。本明細書に記載の特性を有する本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、任意の便利な方法によって、所望の特性について抗Ｂ７－Ｈ３ハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって得ることができる。例えば、所望の抗体が、Ｂ７－Ｈ３受容体とＢ７－Ｈ３リガンドとの結合を遮断するまたは遮断しない抗Ｂ７－Ｈ３モノクローナル抗体である場合、競合結合ＥＬＩＳＡなどの結合競合アッセイで候補抗体をテストすることができる。その中で、プレートのウェルをＢ７－Ｈ３でコーティングし、過剰なＢ７－Ｈ３受容体を含む抗体の溶液を、コーティングされたプレートに広げ、結合した抗体を酵素反応によって検出する。例えば、結合した抗体を、ＨＲＰ結合抗Ｉｇ抗体またはビオチン化抗Ｉｇ抗体と接触させ、ＨＲＰ呈色反応を行う（例えば、ストレプトアビジン－ＨＲＰおよび／または過酸化水素を使用してプレートを呈色させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４９０ｎｍで分光光度法いよりＨＲＰ呈色反応を検出する）。

３．単離されたポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明のハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、ハイブリドーマまたはファージＤＮＡテンプレートから目的の重鎖および軽鎖コーディング領域を特異的に増幅するように設計されている、オリゴヌクレオチドプライマー）を使用して容易に単離およびシーケンシングすることができる。いったん単離されると、前記ＤＮＡは発現ベクターに入れられ、組換え宿主細胞において所望のモノクローナル抗体の合成を得るように宿主細胞（例えば、大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンを産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトされる。

本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、全長または部分長の重鎖および／または軽鎖をコードするクローンを形成するように、重鎖および／または軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（同上）から得ることができる）と結合することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的に使用でき、そのような定常領域は、任意のヒトまたは動物種から取得できることを理解されたい。Ｆｖクローンは、ある動物（ヒトなど）種の可変ドメインＤＮＡに由来し、別の動物種の定常領域ＤＮＡと融合して「ハイブリッド」を形成する。本明細書で使用される「キメラ」および「ハイブリッド」抗体の定義には、全長重鎖および／または軽鎖のコード配列が含まれる。好ましい一実施形態では、ヒト可変ＤＮＡに由来するＦｖクローンは、ヒト定常領域ＤＮＡと融合して、すべてのヒトの全長または部分長の重鎖および／または軽鎖のコード配列を形成する。

本発明のハイブリドーマに由来する抗Ｂ７－Ｈ３抗体をコードするＤＮＡはまた修飾されることができ、例えば、ハイブリドーマクローンに由来する相同マウス配列をヒト重鎖と軽鎖定常ドメインのコード配列で置き換える（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載の方法など）。ハイブリドーマまたはＦｖクローンに由来する抗体またはフラグメントをコードするＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドの全部または一部のコード配列を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによってさらに修飾されることができる。このようにして、本発明のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローンに由来する抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。

本発明の抗体を組換えにより産生するために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に分離およびシーケンシングすることができる。多くの種類のベクターが利用可能である。ベクターの選択は、使用する宿主細胞に一部依存する。一般に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（通常は哺乳動物）に由来するものである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含む任意のアイソタイプの定常領域をこの目的に使用でき、このような定常領域は、任意のヒトまたは動物種から取得できることを理解されたい。

４．複合体およびその調製方法
本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントと、１つまたは複数の他の分子（毒素、例えば、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、ドラスタチン（ｄｏｌａｓｔａｔｉｎｓ）、オーロスタチン（ａｕｒｏｓｔａｔｉｎｓ）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）およびＣＣ１０６５）との複合体または免疫複合体も本明細書で考慮される。

一部の実施形態では、前記複合体は、１つまたは複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートされた本発明の抗体（全長またはフラグメント（断片））を含む。メイタンシノイドは、チューブリンの重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）はもともと東アフリカの低木メイテヌスセレート（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔｅ）から単離された（米国特許番号３，８９６，１１１）。その後、特定の微生物も、メイタンシノールやＣ－３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを生成することは発見された（米国特許番号４，１５１，０４２）。

メイタンシノイドを含む免疫複合体、その調製方法およびその治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０、５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されており、その開示内容は参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

抗体とメイタンシノイドの複合体は、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸エステル（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体など、さまざまな二機能性タンパク質カップリング剤を使用して作成できる。

一部の実施形態では、前記免疫複合体は、ドラスタチンまたはドロスタチンペプチド類似体および誘導体、ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓにコンジュゲートする本発明の抗体を含む（米国特許第５６３５４８３；５７８０５８８）。

一般に、ペプチドベースの薬物部分は、２つ以上のアミノ酸および／またはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することによって調製することができる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学分野で公知の液相合成法によって調製することができる。ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ／ドラスタチンの薬物部分は、ＵＳ５６３５４８３；ＵＳ５７８０５８８のような方法で調製することができる。また、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１（７）：７７８－７８４をも参照できる。

本発明はさらに、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはデオキシリボヌクレアーゼなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間に形成される免疫複合体を考慮した。

腫瘍を選択的に破壊するために、前記抗体は高レベル放射性原子を含むことができる。放射性結合抗体の生成には、様々な放射性同位元素を使用することができる。放射性または他の標識は、既知の方法で複合体に組み込むことができる。例えば、ペプチドは、生合成され得るか、または、例えば、水素の代わりにフッ素－９を含む、適切なアミノ酸前駆体を使用して化学的アミノ酸合成によって合成され得る。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９８９）にはその他の方法は詳しく説明されている。

５．抗体フラグメントおよびその調製方法
本発明は抗体フラグメントを包含する。特定の状況では、抗体全体の代わりに抗体フラグメントを使用することに利点がある。フラグメントのサイズが小さいと、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスが促進できる。

抗体フラグメントの生成のために様々な技術が開発されてきた。従来は、これらのフラグメントは、完全な抗体のタンパク質加水分解消化を介して得られる（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）；およびＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかし、今は、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって直接生成できる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントは、大腸菌で発現および分泌され得るため、これらのフラグメントはが大量に容易に生成できる。抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収し、化学的カップリングによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。別の方法によれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。米国特許５，８６９，０４６号には、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは記載されている。抗体フラグメントを産生するための他の技術は、熟練した技術員には明らかであろう。

他の実施形態では、選択された抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖとｓＦｖは、完全な結合部位を持つが、定常領域をもたない唯一の種である。そのため、それらは、インビボ使用中の非特異的結合を低減するのに適している。ｓＦｖのアミノ末端またはカルボキシル末端でエフェクタータンパク質の融合を生成するように、ｓＦｖ融合タンパク質を構築することができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、編集者Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、同上を参照されたい。前記抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許ＵＳ５，６４１，８７０号に記載されているように、「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であってもよい。

６．ヒト化抗体およびヒト抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法は本分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は通常「インポート」残基と呼ばれ、一般に「インポート」された可変ドメインから取得される。基本的に、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒらの方法に従って実行でき（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４－１５３６）、ヒト抗体の対応する配列を超可変領域配列に置き換える。したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に小さい部分は、非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられる。実際には、ヒト化抗体は通常、いくつかの超可変領域残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似部位からの残基によって置き換えられている抗体である。ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖）の選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に拠れば、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対して、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列をスクリーニングする。そして、げっ歯類の配列に最も近接したヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワークとする（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．， （１９８７） Ｊ． ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１）。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークを使用する。

さらに重要なのは、抗体が抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することである。この目標を達成するために、ある方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的なヒト化生成物を分析するプロセスを通して調製される。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配座構造を説明および表示するコンピュータープログラムは利用可能である。これらの表示内容を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割を分析すること、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。このようにして、受容体およびインポート配列からＦＲ残基を選択して結合し、これによって、Ｂ７－Ｈ３に対する親和性の増加などの所望の抗体特徴を取得できる。

トランスジェニック動物（マウスなど）は、内因性免疫グロブリンを生成することなく、免疫後にヒト抗体のレパートリー全体を生成できる。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体の産生を完全に阻害することは記載されている。このような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入すると、抗原チャレンジ後にヒト抗体が生成される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｌ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：３３（１９９３）を参照できる。

遺伝子シャッフリング（Ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）はまた、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体からのヒト抗体の取得にも使用でき、この場合、前記ヒト抗体は、最初の非ヒト抗体と類似した親和性と特異性を有する。この方法（「エピトープインプリンティング」とも呼ばれる）によって、上記のファージディスプレイ技術によって得られた非ヒト抗体フラグメントの重鎖または軽鎖可変領域は、レパートリーからのヒトＶドメイン遺伝子で置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラ体群を作成する。抗原による選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂを単離することができ、ヒト鎖は、最初のファージディスプレイクローンの対応する非ヒト鎖が除去されたときに破壊された抗原結合部位を回復し、つまり、エピトープはヒト鎖パートナーの選択を制御（インプリント）する。このプロセスを繰り返して残りの非ヒト鎖を置き換えると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ ＷＯ ９３／０６２１３参照）。ＣＤＲ移植による従来の非ヒト抗体のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト由来のＦＲまたはＣＤＲ残基のない完全なヒト抗体を提供する。

７．二重特異性抗体およびその調製方法
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体であり、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。現在の状況では、結合特異性の１つはＢ７－Ｈ３に対するものであり、もう１つは他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、抗Ｂ７－Ｈ３タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体は、細胞毒性剤を抗Ｂ７－Ｈ３を発現する細胞に局在化させるためにも使用できる。これらの抗体は、Ｂ７－Ｈ３結合アームと細胞毒性剤に結合するアームを持っている。

二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。二重特異性抗体を作製するための方法は本分野で既知である。通常、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの共発現に基づいており、２つの重鎖は異なる特異性を持っている。免疫グロブリン重鎖と軽鎖のランダムな組み合わせにより、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、おそらく１０の異なる抗体分子の混合物を生成し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を持っている。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーステップによって完成するが、これは非常に面倒であり、収率も低い。別のより好ましい方法によって、所望の結合特異性（抗体－抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。融合物は好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインに融合され、このドメインは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。好ましくは、少なくとも１つの融合物に第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有し、前記ＣＨ１は、軽鎖結合に必要な部位を含む。免疫グロブリン重鎖融合物および（必要な場合）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクションする。最高の収率を提供するために異なる比率の３つのポリペプチド鎖を構築体において使用する場合、それは、実施形態において３つのポリペプチドフラグメントの相互比率を調節するために大きな柔軟性を提供する。ただし、少なくとも２つのポリペプチド鎖が等しい比率で発現されて高収率が得られる場合、または比率に特に意味がない場合は、２つまたはすべて３つのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入できる。

この方法の好ましい実施形態では、前記二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、もう一方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペア（第２の結合特異性を提供する）とからなる。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、便利な分離方法が提供されたため、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二重特異性化合物の分離に寄与することは発見された。この方法はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体の生成の詳細について、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。

８．薬剤成分
所望の純度を有する抗体を、選択されてもよい生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０００））と混合して、本発明の抗体を含む治療剤を調製し、水溶液、凍結乾燥または他の乾燥製剤の形で保管する。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度下において被験者に対して毒性がなく、緩衝剤（リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジンおよびその他の有機酸など）；酸化防止剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；防腐剤；低分子量（１０個くらいより少ない残基を有する）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性重合体（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなど）；単糖、二糖およびその他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ；ショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールなどの糖類）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体；および／または非イオン界面活性剤（ＴＷＥＥＮ^ＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^ＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む。

本文の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する化合物を含んでもよい。このような分子は、予定の目的に有効な量で組み合わせに存在することに適している。

コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおいて、前記活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製された、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルのようなマイクロカプセルに封入されてもよい。

徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、本発明の免疫グロブリンを含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。

９．抗Ｂ７－Ｈ３抗体の診断および治療の使用
一つの局面では、本明細書に開示された抗体とＢ７－Ｈ３の特異的結合に基づいて、本発明の抗体を使用して、尿、血漿、細胞溶解物、および生検サンプルなどの生理学的サンプル中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドを検出および定量することができる。したがって、本明細書に開示された抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、例えば、癌の進行および／または所与の治療レジメンの有効性を確定するように、組織内のＢ７－Ｈ３レベルを診断において監視するために使用されることができる。当業者が知っているように、本明細書に開示されたＢ７－Ｈ３抗体は、検出を促進するために検出可能な材料とカップリングすることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示された抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントは、検出を促進するために固体支持体に結合される。

もう一つの局面では、本明細書に開示された抗体とＢ７－Ｈ３の特異的結合に基づいて、本発明の抗体は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降による単離、フローサイトメトリーによる細胞の分析または選別、および免疫組織化学、細胞学分析、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降法による固定した組織サンプルまたは細胞塗抹標本サンプル内のＢ７－Ｈ３ポリペプチドの検出に使用することができる。

特定の実施形態では、検出、定量、または分析されるＢ７－Ｈ３分子は、ヒトＢ７－Ｈ３タンパク質またはそのフラグメントである。特定の実施形態では、Ｂ７－Ｈ３タンパク質またはそのフラグメントを溶液（溶解溶液または破砕された細胞を含むサブセル画分の溶液など）に置き、またはＢ７－Ｈ３陽性細胞の表面に存在させ、或いはＢ７－Ｈ３および他の細胞成分を含む複合物に含有させる。

本開示の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現レベルを検出するために使用することができる。Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドを検出するためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、および免疫蛍光（ＩＨＣなど）を含む。また、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドを検出するためのインビボ技術は、標識された抗Ｂ７－Ｈ３抗体を被験者に導入することを含む。ほんの一例として、放射性マーカーで抗体を標識することができ、被験者における放射性マーカーの存在および位置は、標準的なイメージング技術によって検出できる。

タンパク質遺伝子の発現を検出するために使用できる、抗体に基づいた、他の方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイを含む。適切な抗体アッセイ標識は本分野で知られており、酵素標識（グルコースオキシダーゼなど）および放射性同位体または他の放射性試薬、ならびに蛍光標識（フルオレセインおよびローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）など）、およびビオチンを含む。

本明細書に開示されたＢ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントは、任意の種類の生物学的サンプルの診断試薬として使用することができる。一つの局面において、本明細書に開示されたＢ７－Ｈ３抗体は、ヒトの生物学的サンプルの診断試薬として使用することができる。Ｂ７－Ｈ３抗体は、様々な標準アッセイ形式のＢ７－Ｈ３ポリペプチドを検出するために使用できる。このような形式は、免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、フローサイトメトリー、ＩＨＣ、およびイムノメトリックアッセイを含む。

本発明はまた、被験者がＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加に関連する医学的疾患または病状に罹患するリスクがあるかどうかを確定する（例えば、前癌細胞の検出）ための、抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびそのフラグメントの予後（または予測）における使用を提供する。したがって、本明細書に開示された抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびそのフラグメントは、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加を特徴とする、またはＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加に関連する医学的疾患または病状（例えば、癌）の発症前に個体を予防的に治療するように、予後または予測の目的で使用することができる。

本開示のもう一つの局面において、被験者におけるＢ７－Ｈ３の発現を確定するための方法が提供され、これによって、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加を特徴とする、またはＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加に関連する医学的疾患または病状（例えば、癌）の治療または予防化合物をスクリーニングする。

特定の実施形態では、上記の医学的疾患または病状は、前癌状態または癌であり、前記医学的疾患または病状は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加を特徴とし、またはＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現または活性の増加に関連する。特定の実施形態では、癌に罹患している、または癌のリスクのある被験者を予後アッセイによって同定することができる。そのため、本開示は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現レベルの増加に関連する疾患または病状（例えば、癌）を同定するための方法を提供し、ここで、テストサンプルは被験者から取得され、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドを検出でき、対照サンプルと比較してＢ７－Ｈ３ポリペプチドのレベルが増加すると、被験者がＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現レベルの増加に関連する疾患または病状（例えば、癌）に罹患している、またはその疾患または病状（例えば、癌）に罹患するリスクがあることを予測できる。

もう一つの局面において、本開示は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現の増加に関連する疾患または病状（例えば、癌）に対する治療薬で被験者を効果的に治療できるかどうかを確定するための方法を提供し、ここで、生物学的サンプルは被験者から取得され、Ｂ７－Ｈ３抗体を使用してＢ７－Ｈ３ポリペプチドを検出する。被験者から取得された生物学的サンプル中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドの発現レベルを確定し、それを、無病の被験者から取得された生物学的サンプルで見られたＢ７－Ｈ３発現レベルと比較する。健康な被験者から取得されたサンプルと比べ、疾患または病状を有すると疑われる被験者から取得されたサンプル中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドレベルの上昇は、テストされる被験者におけるＢ７－Ｈ３関連の疾患または病状（例えば、癌）を示す。

一つの局面において、本開示は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチド発現に対する薬剤の治療効果をモニタリングするための方法を提供する。このようなアッセイは、薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用できる。例えば、癌と診断された患者など、Ｂ７－Ｈ３発現の上昇を示す被験者の臨床試験でＢ７－Ｈ３ポリペプチドレベルの低下における薬剤の有効性をモニタリングすることができる。Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現に影響を与える薬剤は、薬剤を投与しその反応を観察することで同定できる。このように、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの発現パターンは、薬剤に対する被験者の生理学的反応を示すマーカーとして使用できる。

上記は、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体およびそのフラグメントを使用した例示的なアッセイに過ぎない。現在または後に開発される抗体またはそのフラグメントを使用してＢ７－Ｈ３を測定するための他の方法も本発明の範囲に含まれる。

一つの局面において、本発明は、そのような治療を必要とする被験者に、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する有効量の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントを投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。本発明の抗体は、Ｂ７－Ｈ３分子を含む１つまたは複数の抗原分子の発現および／または活性に関連する、または、Ｂ７－Ｈ３分子を含む１つまたは複数の抗原分子の発現および／または活性の増加に関連する疾患、障害または病状の治療、阻害、その進行の遅延、その再発の予防／遅延、当該疾患、障害または病状の改善または予防に使用することができる。

本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントの治療における使用について、本発明の抗体の適切な用量は（単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用される場合）、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度と経過、抗体が予防または治療の目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する反応、ならびに主治医の判断によるものである。抗体は適切に患者に一回または複数回投与される。疾患のタイプおよび重症度に応じて、患者に投与される抗体の適切な用量は、任意選択で、例えば、１回または複数回で別々の投与、または連続注入で、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）である。

本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、本発明の抗体は、別の抗体、ステロイド（吸入可能、全身または皮膚ステロイドなど）、化学療法剤（化学療法剤の混合物を含む）、他の細胞毒性剤、抗血管新生剤、サイトカインおよび／または成長阻害剤と共に投与することができる。上記のような併用療法は、組み合わせ投与（２つ以上の薬剤が同じまたは別々の製剤に含まれる）および別々の投与を含む。その場合、１つまたは複数の他の薬剤の投与前、投与中および／または投与後、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントを投与することができる。組み合わせて投与される治療薬の有効量は、使用する治療薬の種類および治療される特定の患者などの要因によって決められ、そして、通常は医者または獣医によって決められる。

１０．キットおよび製品
本開示は、Ｂ７－Ｈ３の発現レベルを確定するための診断方法を提供する。一つの具体的な局面において、本開示は、Ｂ７－Ｈ３の発現レベルを確定するためのキットを提供する。前記キットは、本明細書に開示された抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメント、およびキットの使用に関する説明書、例えば、サンプルの収集、および／または検出および／または結果の分析のための説明書を含む。このキットは、生物学的サンプル（例えば、任意の体液）中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドの存在の検出に使用できる。前記体液は、例えば、喀痰、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水または血液、および体組織の生検サンプルを含むが、これらに限られていない。テストサンプルはまた、腫瘍細胞、腫瘍に隣接する正常細胞、腫瘍組織タイプに対応する正常細胞、血液細胞、末梢血リンパ球、またはそれらの組み合わせであり得る。

特定の実施形態では、前記キットは、生物学的サンプル中のＢ７－Ｈ３ポリペプチドに結合することができる、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体以外の１つまたは複数の他のＢ７－Ｈ３抗体をさらに含んでもよい。その１つまたは複数のＢ７－Ｈ３抗体は標識されてもよい。特定の実施形態では、前記キットは、例えば、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドに結合する固体支持体に付着した第１の抗体を含み、且つ、任意選択で、２）Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドまたは第１の抗体と結合して検出可能な標識にコンジュゲートする第２の異なる抗体を含む。

前記キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定剤をさらに含んでもよい。前記キットはまた、酵素や基質など、検出可能な標識を検出するために必要なコンポーネントを含んでもよい。前記キットはまた、アッセイしてテストサンプルと比較できる、１つの対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含んでもよい。前記キットの各コンポーネントは個別の容器に入れることができ、これらの容器すべてを一つのパッケージに入れることができ、そして、サンプルの収集および／または検出および／または結果の分析のための説明など、キットの使用に関する説明をプロトコルに記載することができる。

もう一つの局面において、本発明は、上記の疾患の治療、予防、および／または診断に使用される材料を含む製品を提供する。その製品は、容器と、容器上または容器に関連するラベルまたはプロトコルを含み、そのラベルまたはプロトコルには、例えば、治療される適応症、投与レジメンおよび警告の書面の説明などがある。適切な容器は例えば、ボトル、バイアル、注射器などを含む。前記容器は各種材料、例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は、本発明の抗Ｂ７－Ｈ３抗体またはそのフラグメントを含む組成物を収容し、この組成物自体、または別の組成物と組み合わせた場合、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチドの１つまたは複数の分子の発現または活性の増加を特徴とする、または１つまたは複数の分子の発現または活性の増加に関連する医学的疾患または病状（例えば、癌）の治療、予防および／または診断に効果的である。

前記製品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物を含む第１の容器；および（ｂ）別の活性成分を含む組成物を有する、第２、第３、または第４の容器を含んでもよい。また、前記製品は、薬学上許容される緩衝液（例えば、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液（Ｒｉｎｇｅｒ‘ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）およびグルコース溶液など）を含む容器をさらに含んでもよい。さらには、その他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業および使用者の角度から見ると必要とされるその他の材料、を含んでもよい。

実施例１ 抗Ｂ７Ｈ３マウス抗体の生成
Ｂ７Ｈ３ ＫＯマウス（１６～１８ｇ、６週齢）は、Ｓｕｈ ＫＷ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４（９）：８９９－９０６，２００３の記載に従って調製し、完全なフロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ６８８１）を含むヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステム）１０μｇを皮下注射により投与して免疫し、免疫を３日間隔で５回繰り返した。最後の追加免疫の３日後、注射部位に近いリンパ節を注意深く解剖した。ＰＥＧ１５００（ポリエチレングリコール１５００、Ｒｏｃｈｅ^ＴＭ、カタログ番号：７８３６４１、１０×４ｍｌを７５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ中に置いたＰＥＧ ５０％ Ｗ／Ｖ）を用いてリンパ球とＡｇ８．６５３骨髄腫細胞（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号８５０１１４２０）を融合し、ＨＡＴ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａカタログ番号：Ｈ０２６２）とＨＦＣＳ（ハイブリドーマ融合およびクローニングサプリメント（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、５０ｘ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号：１１－３６３－７３５－００１）を用いてクローニングした。ハイブリドーマ上清において、ヒトＢ７Ｈ３でトランスフェクションされたＢＡＦ３細胞でのＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによって、ヒトＢ７Ｈ３－Ｆｃに結合した抗体の産生についてスクリーニングした（実施例２と３参照）。選択されたマウス抗Ｂ７Ｈ３＃２３および＃２７は、ＣＤＲ移植および逆突然変異を使用してヒト化された。

ＣＤＲ移植による抗体のヒト化：アクセプターフレームワークが選択された。ＮＣＢＩ Ｉｇ－Ｂｌａｓｔ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/）を利用して、ヒト生殖系列データベース内で親抗体の可変領域配列を検索した。重鎖および軽鎖のＣＤＲ配列（配列番号１～１２）はそれぞれ以下に示される。重鎖および軽鎖ごとに、５つの異なるヒト受容体（すなわち、親抗体との相同性が高いヒト可変領域）を選択した。ヒト受容体のＣＤＲは、対応するマウスのものに置き換えられ、ヒト化された可変領域配列が得られた。５つのヒト化重鎖と５つのヒト化軽鎖を設計、合成し、発現ベクターに挿入した。前記ヒト化抗体を発現させた後、アフィニティーランキング試験に使用した。＃２３－ＶＨ５－ＶＬ２、＃２７－ＶＨ２－ＶＬ１、および＃２７－ＶＨ２－ＶＬ２に対して最も強い結合親和性を有する抗体を選択して逆突然変異に使用した。これらのバリアントの中で、結合および機能アッセイに基づいて、＃２３－ＶＨ５－４／ＶＬ２－３、＃２３－ＶＨ５－４／ＶＬ２－４、＃２７－ＶＨ２－１／ＶＬ２－１、＃２７－ＶＨ２－１／ＶＬ２－２、＃２７－ＶＨ２－２／ＶＬ２－１、および＃２７－ＶＨ２－２／ＶＬ２－２（配列番号１３～１９）を選択した。
＃２３－ＣＤＲ１Ｈアミノ酸配列（配列番号１）
ＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨ
＃２３－ＣＤＲ２Ｈアミノ酸配列（配列番号２）
ＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲ
＃２３－ＣＤＲ３Ｈアミノ酸配列（配列番号３）
ＳＴＡＬＡＴＤＹ
＃２３－ＣＤＲ１Ｌアミノ酸配列（配列番号４）
ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ
＃２３－ＣＤＲ２Ｌアミノ酸配列（配列番号５）
ＤＴＳＮＬＡＳ
＃２３－ＣＤＲ３Ｌアミノ酸配列（配列番号６）
ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ
＃２７－ＣＤＲ１Ｈアミノ酸配列（配列番号７）
ＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ
＃２７－ＣＤＲ２Ｈアミノ酸配列（配列番号８）
ＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴ
＃２７－ＣＤＲ３Ｈアミノ酸配列（配列番号９）
ＳＴＡＬＡＴＧＹ
＃２７－ＣＤＲ１Ｌアミノ酸配列（配列番号１０）
ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ
＃２７－ＣＤＲ２Ｌアミノ酸配列（配列番号１１）
ＤＴＳＮＬＡＳ
＃２７－ＣＤＲ３Ｌアミノ酸配列（配列番号１２）
ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ
可変重鎖ドメイン(＃２３－ＶＨ５－４)アミノ酸配列（配列番号１３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＡＳＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨＷＶＲＱＲＰＧＫＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲＫＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＫＳＴＡＬＡＴＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
可変軽鎖ドメイン(＃２３－ＶＬ２－３)アミノ酸配列（配列番号１４）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＩＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
可変軽鎖ドメイン(＃２３－ＶＬ２－４)アミノ酸配列（配列番号１５）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＩＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＴＬＴＩＳＳＭＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
可変重鎖ドメイン(＃２７－ＶＨ２－１)アミノ酸配列（配列番号１６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＡＬＡＴＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
可変重鎖ドメイン(＃２７－ＶＨ２－２)アミノ酸配列（配列番号１７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴＲＶＴＩＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＴＡＬＡＴＧＹＷＧＱＧＴＬＬＴＶＳＳ
可変軽鎖ドメイン(＃２７－ＶＬ２－１)アミノ酸配列（配列番号１８）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
可変軽鎖ドメイン(＃２７－ＶＬ２－２)アミノ酸配列（配列番号１９）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＤＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＶＴＹＹＣＱＱＷＳＳＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

実施例２ ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の親和性の分析
ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の結合親和性をテストするために、ＥＬＩＳＡ分析を実施した。０．５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中のヒトＢ７Ｈ３、マウスＢ７Ｈ３、およびカニクイザルＢ７Ｈ３（２ｕｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中）をＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ、４４９８２４）にコーティングし、４℃で一晩インキュベーションした。コーティングされたプレートをスキムミルク（５％、ＰＢＳＴ中）で１時間ブロックした。ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体を希釈してプレートに加え、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含む、１×ＰＢＳ）で３回洗浄し、結合していない抗体を除去した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｅａｓｙｂｉｏ、ＢＥ０１２２、ＰＢＳ中１：５０００）を添加して１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０を含む、１×ＰＢＳ）で３回洗浄し、結合していない抗体を除去した。ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００－４２０１－５６）（５０μｌ／ウェル）を加えて呈色させ、２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４（５０ｕｌ／ウェル）で停止させた。４５０ｎｍおよび５７０ｎＭで光学密度を測定した。図１Ａおよび表１に示すように、抗体は高い親和性で、ヒト、マウス、およびカニクイザルＢ７Ｈ３タンパク質に結合した。カニクイザルＢ７Ｈ３へのｍＡｂの結合能力は、ヒトＢ７－Ｈ３タンパク質への結合能力と類似している。

また、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析によって上記ｍＡｂの親和性をさらに分析した。ＳＰＲは、負の誘電率材料と正の誘電率材料の間の界面に入射光によって励起された伝導電子の共振振動である。抗体をＦｃ捕捉法によってセンサーチップに固定させた。ヒトＢ７－Ｈ３細胞外領域（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０２５２４０．２）を分析物として使用した。解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数のデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して取得した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｄとｋａの比率から計算された。図１Ｂおよび表２に示すように、すべてのヒト化抗Ｂ７－Ｈ３ ｍＡｂは、高い親和性（＜１．５ｎＭ）でヒトＢ７－Ｈ３細胞外領域に結合した。

実施例３ Ｂ７Ｈ３安定細胞株に結合したヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体
細胞表面での抗Ｂ７Ｈ３抗体の結合親和性を評価するために、異なるＢ７Ｈ３アイソフォームの２つの安定した細胞株（Ｂ７Ｈ３０２ＩｇおよびＢ７Ｈ３０４Ｉｇ）をＢａＦ３細胞株上に構築した。ヒトＢ７Ｈ３０２Ｉｇと４Ｉｇの完全長ＤＮＡは完全に合成されている。ＤＮＡ配列を消化し、ｐｃＤＮＡ３．４に連接して完全長プラスミドを個別に構築した。完全長プラスミドをＢａＦ３細胞にトランスフェクションするようにエレクトロポレーションを実施した。Ｇ４１８（Ａｍｅｒｅｓｃｏ、Ｅ８５９－１Ｇ、濃度を１ｍｇ／ｍｌに最適化した）によって陽性クローンをスクリーニングし、フローサイトメトリーによってＢ７Ｈ３の発現を検出した。

ＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－２ＩｇおよびＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－４Ｉｇを用いて、同じ方法で細胞表面結合親和性をテストした。細胞をＰＢＳで洗浄し、５×１０＾５細胞／ウェルの細胞密度でそれらを９６ウェルＵ底プレートに分注した。生／死染色について、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ(R)Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ３４９５７）を細胞に適用し（ＰＢＳ中１：１０００、１００ｕｌ／ウェル）、４℃で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ含有、１００ｕｌ／ウェル）を各ウェルに加えて染色を停止させた。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上澄を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体をＦＡＣＳ緩衝液で対応する濃度に希釈し、各ウェルに加えた（１００ｕｌ／ウェル）。細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)５９４標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－５８５－０８８）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：５００）を加え、結合した抗体を標識した。細胞を４℃で３０分間インキュベーションした後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞をフローサイトメトリーで分析し、結果を図２に示す。データは、抗体が高い親和性で、細胞上に発現したＢ７Ｈ３に結合したことを示している。例えば、＃２７ｍＡｂの結合ＥＣ５０は１ｎＭ未満である。ｍＡｂがプレート上のヒトＢ７－Ｈ３細胞外領域タンパク質に結合するだけではなく、細胞表面に発現するヒトＢ７－Ｈ３分子にも効果的に結合することは、データによって実証された。

実施例４ 刺激されたＰＢＭＣへのヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の結合アッセイ
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）には、刺激下で細胞表面のＢ７Ｈ３発現をアップレギュレーションする単球が含まれている。この実施例は、単球に対するヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体の結合親和性を評価するためのものである。ヒトのバフィーコートをＰＢＳで希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ、１７－１４４０－０２）の２倍の量にした。希釈したバフィーコートをＦｉｃｏｌｌの上に軽く広げ、２５００ｒｐｍ、２０℃で４０分間、ブレーキをかけずに遠心分離した。ＰＢＭＣ層をＦｉｃｏｌｌとその透明な上澄の間から注意深く取り除いた。ＰＢＭＣの５倍量のＰＢＳを加え、１２００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離した。上澄を捨て、ＰＢＳで再度洗浄した。血小板を除去するために、９００ｒｐｍ、２０℃で８分間遠心分離した。ＰＢＭＣを培地（１０％ＦＢＳと１％ＰＳを含むＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁し、カウントして９６ウェルプレート（５×１０＾５細胞／ウェル）に分注し、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。２４時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。生／死染色について、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ(R)Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ３４９５７）を細胞に適用し（ＰＢＳ中１：１０００、１００ｕｌ／ウェル）、４℃で１０分間インキュベーションした。ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％ＦＢＳ含有、１００ｕｌ／ウェル）を各ウェルに加えて染色を停止させた。遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）して上澄を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体をＦＡＣＳ緩衝液で対応する濃度に希釈し、各ウェルに加えた（１００ｕｌ／ウェル）。細胞を４℃で３０分間インキュベーションし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)５９４標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９－５８５－０８８）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：５００）を加え、結合した抗体を標識した。細胞を４℃で３０分間インキュベーションした後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞をフローサイトメトリーでテストした。その結果を図３に示す。データは、抗体が高い親和性で、ヒトＰＢＭＣから得られた初代細胞に発現したＢ７Ｈ３に結合したことを示している。すなわち、＃２７由来のｍＡｂの結合ＥＣ５０は１ｎＭ未満であり、＃２３由来のｍＡｂの結合ＥＣ５０は３ｎＭ未満である。ヒト化ｍＡｂが、生理学的構造を有するＢ７－Ｈ３分子に効果的に結合できることは、データによって実証された。これは、治療用抗体の開発に不可欠である。前記ｍＡｂは、抗体薬物の結合特性の要件を満たしている。

実施例５ ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体はインビトロでＡＤＣＣを誘導すること
ＩｇＧ１アイソタイプを持つヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体は、エフェクター細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。安定した細胞株であるＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－４Ｉｇは標的細胞として使用され、ヒトＰＢＭＣはエフェクター細胞として使用された。光を避けて、ＢａＦ３／Ｂ７Ｈ３－４Ｉｇ細胞（５×１０＾７細胞／ｍｌ、ＰＢＳ中）を３７℃の水浴中でＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ、２１８８８、５ｎＭ）で１０分間標識した。完全培地を細胞に少なくとも５倍量に加え、氷上で５分間すばやくインキュベーションした。遠心分離して上澄を除去した。完全培地に再懸濁した細胞を９６ウェルＵ底プレートに分注した（４０００細胞／ウェル、１００ｕｌ／ウェル）。ヒト化抗Ｂ７Ｈ３抗体を対応する濃度に希釈し、標識された細胞に添加した。ＰＢＭＣエフェクター細胞をＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）の比率２５：１で各ウェルに添加した。細胞をＣＯ_２インキュベーター内で３７℃、４時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。死細胞を、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ^ＴＭ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、６５－０８６４－１８、ＰＢＳ中１：１０００）で陽性に染色した。ＰＢＭＣエフェクター細胞を抗ＣＤ４５マーカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４０３２）で標識した。ＡＤＣＣのパーセンテージは、ＣＦＳＥ陽性細胞における死細胞の割合に等しい。抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）は、ＣＦＳＥ陽性細胞における抗ＣＤ４５陽性細胞の割合に等しい。図４に示すように、ヒト化抗Ｂ７－Ｈ３抗体は、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを用量依存的に媒介することができる。データは、ｍＡｂが癌細胞を殺すための治療薬（枯渇性抗体薬）として開発できることを示した。また、高度に発現したＢ７Ｈ３分子を有する標的細胞（癌細胞を含む）に化学物質を持ち込む能力があるため、抗体－薬物複合体として開発することができる。それらの癌は、前立腺癌、乳癌、結腸癌、肺癌、胃癌、淡明細胞型腎細胞癌を含むが、これらに限られていない（Ｌｏｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１２）。

実施例６ 抗Ｂ７Ｈ３抗体は、Ｂ７Ｈ３によるＴ細胞活性化の阻害を遮断すること
Ｂ７Ｈ３はＴ細胞活性化の阻害剤である。抗Ｂ７Ｈ３抗体の遮断効果を研究するために、ＰＢＭＣ機能アッセイを確立した。ＰＢＳ中の抗ＣＤ３（ＢＤ、５５５３２９、０．１２５ｕｇ／ｍｌ）およびＢ７Ｈ３－４Ｉｇ（１０ｕｇ／ｍｌ）を９６ウェルプレート（１００ｕｌ／プレート）にコーティングして４℃で一晩置いた。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、３７℃で３０分間完全培地でブロックした。抗Ｂ７Ｈ３抗体を完全培地で対応する濃度に希釈した後、コーティングされたプレートに添加した。抗体を３７℃で１時間インキュベーションし、完全培地で１回洗浄した。実施例４に記載されているように、ＰＢＭＣを新鮮なバフィーコートから単離した。完全培地に再懸濁した後、ＰＢＭＣを各ウェルに分注した（３×１０＾５細胞／ウェル、２００ｕｌ／ウェル）。細胞をＣＯ_２インキュベーターで一晩インキュベーションした。翌日、死細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ(R)Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ３４９５７）で標識した。Ｔ細胞を抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７３２２）、抗ＣＤ４（ＢＤ、５６２４０２）、および抗ＣＤ８（ＢＤ、５５７８３４）で標識し、活性化マーカーＣＤ６９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１０９２２）を抗体遮断効果の指標として標識した。細胞をフローサイトメトリーでテストした。図５に示すように、抗Ｂ７Ｈ３抗体は、抗ＣＤ３により刺激されたＴ細胞活性化に対するＢ７－Ｈ３の阻害効果を逆転した。公開されたデータは、マウスの癌モデルにおけるＢ７－Ｈ３の役割を分析し（Ｌｅｅ Ｙｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７）、Ｂ７－Ｈ３が腫瘍免疫において重要な負の調節的役割を果たしていることを示した。Ｂ７－Ｈ３の生物学的活性を遮断することにより、ｍＡｂが癌治療の治療薬として開発される可能性が高いことは、本明細書に記載のデータにより示された。

実施例７ 抗Ｂ７Ｈ３抗体の治療効果
１．Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスにおけるＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫同系モデル
Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞は、空気中５％ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で単層培養としてインビトロで維持された。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理によって１日おきに通常に継代培養された。腫瘍の発生のために、各マウスにＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞（２×１０^５、０．１ｍｌ ＰＢＳ中）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１２９ｍｍ^３に達した時に治療を開始した。マウスをランダムに４つの群、すなわち、ＰＢＳ、抗Ｂ７Ｈ３ ２７－１－５（ＰＧ－Ｄ０、３）または２７－１（ＰＧ－Ｄ５、８、１０）ｍＩｇＧ２ｂ １０ｍｇ／ｋｇ、抗Ｂ７Ｈ３ ２３０２０３ ｍＩｇＧ２ａ １０ｍｇ／ｋｇ、および２３－２－３ ｍＩｇＧ２ｂ １０ｍｇ／ｋｇに分けた。各群の治療スケジュールはいずれもＰＧ－Ｄ０、３、５、８、１０であった。図６に示すように、抗Ｂ７Ｈ３抗体は、インビボ研究で黒色腫腫瘍の増殖を抑えることができる。データは、黒色腫を含むＢ７Ｈ３を発現する癌に対する有意な治療効果を示している。
２．ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスにおけるＳＷ６２０ヒト結腸直腸腺癌異種移植モデル
ＳＷ６２０腫瘍細胞は、空気中５％ＣＯ_２の雰囲気下、３７℃で１０％ウシ胎児血清を添加した１６４０培地で単層培養としてインビトロで維持された。腫瘍細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡ処理によって１日おきに通常に継代培養された。腫瘍の発生のために、各マウスにＳＷ６２０腫瘍細胞（５×１０^６、０．１ｍｌ ＰＢＳ中）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１８８ｍｍ^３に達した時に治療を開始した。マウスをランダムに２つの群、すなわち、ＰＢＳ、および抗Ｂ７Ｈ３ ２３－２－３ ｍＩｇＧ２ａ １０ｍｇ／ｋｇに分けた。各群の治療スケジュールは週に２回、連続３週間であった。図７に示すように、抗Ｂ７Ｈ３抗体は、異種移植モデルにおいてヒト結腸直腸腺癌の増殖を抑えることができる。データは、結腸直腸腺癌を含むＢ７Ｈ３を発現する癌に対する有意な治療効果を示している。

Claims (31)

1. 重鎖（ＨＣ）可変領域配列および軽鎖（ＬＣ）可変領域配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体がＢ７－Ｈ３の細胞外領域に結合し、ＳＰＲ分析によって確認された結合親和性が約１．５ｎＭまたは１．５ｎＭよりも優れている、抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. （ａ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）またはＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
   （ｂ）前記ＬＣが、ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）またはＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
   （ｃ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３配列を含み、ＬＣがＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３配列を含み；または
   （ｄ）前記ＨＣが、ＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＣＤＲ３配列を含み、ＬＣがＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＣＤＲ３配列を含む、
   請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
3. 前記ＨＣが、ＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲ（配列番号２）またはＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴ（配列番号８）を含むＣＤＲ２配列をさらに含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
4. 前記ＨＣが、ＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨ（配列番号１）またはＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号７）を含むＣＤＲ１配列をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. 前記ＬＣが、ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）またはＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号１１）を含むＣＤＲ２配列をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. 前記ＬＣが、ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号４）またはＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ１配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 前記ＨＣが、
   （ａ）アミノ酸配列ＧＹＮＦＮＮＹＷＭＨ（配列番号１）を含むＨＣ ＣＤＲ１；および／または
   （ｂ）アミノ酸配列ＭＩＨＰＮＳＧＴＦＮＹＮＥＲＦＫＲ（配列番号２）を含むＨＣ ＣＤＲ２；および／または
   （ｃ）アミノ酸配列ＳＴＡＬＡＴＤＹ（配列番号３）を含むＨＣ ＣＤＲ３を含み；および／または
   前記ＬＣが、
   （ａ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号４）を含むＬＣ ＣＤＲ１；および／または
   （ｂ）アミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号５）を含むＬＣ ＣＤＲ２；および／または
   （ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号６）を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. 前記ＨＣが、
   （ａ）アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨ（配列番号７）を含むＨＣ ＣＤＲ１；および／または
   （ｂ）アミノ酸配列ＭＩＨＰＮＳＧＡＦＮＹＮＥＲＦＫＴ（配列番号８）を含むＨＣ ＣＤＲ２；および／または
   （ｃ）アミノ酸配列ＳＴＡＬＡＴＧＹ（配列番号９）を含むＨＣ ＣＤＲ３を含み；および／または
   前記ＬＣが、
   （ａ）アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＹ（配列番号１０）を含むＬＣ ＣＤＲ１；および／または
   （ｂ）アミノ酸配列ＤＴＳＮＬＡＳ（配列番号１１）を含むＬＣ ＣＤＲ２；および／または
   （ｃ）アミノ酸配列ＱＱＷＳＳＹＰＬＴ（配列番号１２）を含むＬＣ ＣＤＲ３を含む、
   請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
9. 前記抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
10. ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
11. 前記ＨＣ可変領域配列は、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１３、１６および１７のいずれか１つと８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
12. 前記ＬＣ可変領域配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号１４、１５、１８および１９のいずれか１つと８０％超、８５％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
13. 前記ＨＣ可変領域配列は配列番号１３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣ可変領域配列は配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
14. 前記ＨＣ可変領域配列は配列番号１６または配列番号１７のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣ可変領域配列は配列番号１８または配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
15. 前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
16. 前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦｖからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および第二の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、二重特異性分子。
18. 前記第二の抗体またはその抗原結合フラグメントは、腫瘍細胞の表面に発現する腫瘍抗原に特異的に結合し、前記腫瘍抗原は、Ａ３３；ＡＤＡＭ－９；ＡＬＣＡＭ；ＢＡＧＥ；β－カテニン；ＣＡ１２５；カルボキシペプチダーゼＭ；ＣＤ１０３；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２５；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３６；ＣＤ４０／ＣＤ１５４；ＣＤ４５；ＣＤ４６；ＣＤ５；ＣＤ５６；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ；ＣＤＫ４；ＣＥＡ；ＣＴＬＡ４；サイトケラチン８；ＥＧＦ－Ｒ；ＥｐｈＡ２；ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＧＡＧＥ－１；ＧＡＧＥ－２；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ；ヒトパピローマウイルス－Ｅ６；ヒトパピローマウイルス－Ｅ７；ＪＡＭ－３；ＫＩＤ３；ＫＩＤ３１；ＫＳＡ（１７－１Ａ）；ＬＵＣＡ－２；ＭＡＧＥ－１；ＭＡＧＥ－３；ＭＡＲＴ；ＭＵＣ－１；ＭＵＭ－１；Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ；オンコスタチンＭ；ｐｌ５；ＰＩＰＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＲＯＲ１；ＴＮＦ－β受容体；ＴＮＦ－α受容体；ＴＮＦ－γ受容体；トランスフェリン受容体；およびＶＥＧＦ受容体からなる群から選択される、請求項１７に記載の二重特異性分子。
19. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ポリペプチド。
20. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＨＣ可変領域および／またはＬＣ可変領域を含む、ポリペプチド。
21. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、治療薬に連結された免疫複合体。
22. 前記治療薬が細胞毒素または放射性同位体である、請求項２１に記載の免疫複合体。
23. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１７または１８に記載の二重特異性分子、請求項１９または２０に記載のポリペプチドまたは請求項２１または２２に記載の免疫複合体、および薬学上許容される担体を含む、組成物。
24. 抗癌剤をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
25. 前記薬剤が、抗体、化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン療法剤、毒素または免疫療法剤である、請求項２４に記載の組成物。
26. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項１７または１８に記載の二重特異性分子、請求項１９または２０に記載のポリペプチド、請求項２１または２２に記載の免疫複合体、または請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物を含む、癌を治療するための製品またはキット。
27. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、癌を診断するための製品またはキット。
28. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＨＣ可変領域および／またはＬＣ可変領域をコードする、単離された核酸。
29. 請求項２８に記載の核酸を含む発現ベクター。
30. 請求項２９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
31. 抗体またはその抗原結合フラグメントを調製するための方法であって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを請求項３０に記載の宿主細胞において発現させることと、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを前記宿主細胞から単離することとを含む、方法。

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