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JP2021040636A - ガングリオシドｇｄ２に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

ガングリオシドｇｄ２に対するヒトモノクローナル抗体 Download PDF

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Abstract

【課題】望ましくない免疫効果を低下させ、抗ＧＤ２抗体の望ましい抗腫瘍効果を増強すること。【解決手段】本発明によると、ＧＤ２に結合する抗体またはその機能性断片を作製するための組成物が提供される。組成物は、本明細書で提供される相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。一態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片もまたコードし得る。別の態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される抗体またはその機能性断片のＶＨドメインをコードする核酸配列も含み得る。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年６月４日に出願された米国出願第６２／００７，８７４号の利益を主張し、当該出願はその全体が本明細書に参考として援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１５年５月２９日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、１２９６７−０３４−２２８＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが６９，２３８バイトである。
本発明は、一般に、ジシアロガングリオシドＧＤ２を対象とする抗体に関する。より詳細には、本出願は、ヒト抗ＧＤ２抗体をコードするポリヌクレオチドおよび対応するコードされる抗体またはその断片、ならびに診断または治療目的のためのそのような抗体の使用に関する。ＧＤ２は、腫瘍選択的な発現パターンのために、腫瘍特異的治療、例えば抗体治療にとって魅力的である。現在、マウス抗ＧＤ２抗体、ヒト−マウスキメラ抗ＧＤ２抗体などのいくつかの抗ＧＤ２抗体が開発されている。しかし、これらの抗体は、望ましくない免疫効果をなおも有する。従って、望ましくない免疫効果を低下させ、抗ＧＤ２抗体の望ましい抗腫瘍効果を増強することがいまだ必要とされている。本出願は、この必要性を満たし、関連する利点を提供する、ＧＤ２に対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開示している。
本発明によると、ＧＤ２に結合する抗体またはその機能性断片を作製するための組成物が本明細書で提供される。組成物は、本明細書で提供される相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。一態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片もまたコードし得る。別の態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される、抗体またはその機能性断片のＶＨドメインをコードする核酸配列も含み得る。
本発明の別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体またはその機能性断片をコードし得る。一態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片もまたコードし得る。別の態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で提供される、抗体またはその機能性断片のＶＬドメインをコードする核酸配列も含み得る。
本発明の組成物は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片も含む。一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３領域を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３領域を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、本明細書で提供されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方を含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ、本明細書で提供されるクローン単離体のＶＨドメインおよびＶＬドメインそれぞれのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される抗体または機能性断片が診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とコンジュゲートしまたは組換えによって融合したコンジュゲートを提供する。本発明の一部の態様では、腫瘍形成を検出および／または診断するための方法において使用することができる検出可能な薬剤を含む本発明のコンジュゲートを主題とする。そのような方法は、それを必要とする対象にコンジュゲートの有効量を投与するステップを含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の１種または複数種の抗体または機能性断片および薬学的に許容される担体を有する医薬組成物を提供する。一部の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与することによって疾患を治療または予防するための方法も提供する。さらに別の態様では、本発明は、第２の治療剤を本発明の抗体または機能性断片と同時にまたは順次投与することを提供する。
図１は、クローン１Ｂ７の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図２は、クローン１Ｂ７の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図３は、クローン２Ｈ１２の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号５のヌクレオチド配列と配列番号６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図４は、クローン２Ｈ１２の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号７のヌクレオチド配列と配列番号８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図５は、クローン１Ｇ２の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号９のヌクレオチド配列と配列番号１０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図６は、クローン１Ｇ２の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１１のヌクレオチド配列と配列番号１２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図７は、クローン１Ｅ９の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１３のヌクレオチド配列と配列番号１４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図８は、クローン１Ｅ９の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１５のヌクレオチド配列と配列番号１６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図９は、クローン１Ｈ３の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１７のヌクレオチド配列と配列番号１８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１０は、クローン１Ｈ３の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号１９のヌクレオチド配列と配列番号２０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１１は、クローン２Ｆ５の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号２１のヌクレオチド配列と配列番号２２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１２は、クローン２Ｆ５の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号２３のヌクレオチド配列と配列番号２４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１３は、クローン２Ｆ７の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号２５のヌクレオチド配列と配列番号２６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１４は、クローン２Ｆ７の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号２７のヌクレオチド配列と配列番号２８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１５は、クローン２Ｅ１２の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号２９のヌクレオチド配列と配列番号３０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１６は、クローン２Ｅ１２の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３１のヌクレオチド配列と配列番号３２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１７は、クローン３１Ｆ９の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３３のヌクレオチド配列と配列番号３４のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１８は、クローン３１Ｆ９Ｖ２の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３５のヌクレオチド配列と配列番号３６のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図１９は、クローン３１Ｆ９の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３７のヌクレオチド配列と配列番号３８のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図２０は、クローン３２Ｅ２の可変重（ＶＨ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号３９のヌクレオチド配列と配列番号４０のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３）も特定されている。
図２１は、クローン３２Ｅ２の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を示す図である。図の上部は、配列番号４１のヌクレオチド配列と配列番号４２のアミノ酸配列のアラインメントを示す。３つの相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３）も特定されている。
図２２は、コンセンサス配列（配列番号４３）が下に列挙された、ヒト抗ＧＤ２モノクローナル抗体１Ｂ７（配列番号２）、２Ｈ１２（配列番号６）、１Ｇ２（配列番号１０）、１Ｅ９（配列番号１４）、１Ｈ３（配列番号１８）、２Ｆ５（配列番号２２）、２Ｆ７（配列番号２６）、２Ｅ１２（配列番号３０）、３１Ｆ９（配列番号３４）、３１Ｆ９Ｖ２（配列番号３６）、および３２Ｅ２（配列番号４０）のＶＨ領域のアラインメントを示す図である。
図２３は、コンセンサス配列（配列番号４４）が下に列挙された、ヒト抗ＧＤ２モノクローナル抗体１Ｂ７（配列番号４）、２Ｈ１２（配列番号８）、１Ｇ２（配列番号１２）、１Ｅ９（配列番号１６）、１Ｈ３（配列番号２０）、２Ｆ５（配列番号２４）、２Ｆ７（配列番号２８）、２Ｅ１２（配列番号３２）、３１Ｆ９（配列番号３８）、および３２Ｅ２（配列番号４２）のＶＬ領域のアラインメントを示す図である。
図２４は、ヒト抗ＧＤ２モノクローナル抗体１Ｂ７、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２、１Ｇ２、２Ｆ７、３２Ｅ２および２Ｈ１２の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を示す図である。ＡＤＣＣ活性を、工学的に作製されたＪｕｒｋｅｔ細胞をエフェクター細胞として使用してＰｒｏｍｅｇａのレポーターアッセイによって測定した。標的細胞は、ＳａＯＳ２、Ｈ５２４、Ｈｓ５７８Ｔ、ＴＣ７１、およびＬａｎ１−ｌｕｃを含めた様々な腫瘍細胞である。
図２５は、Ｈ５２４細胞へのヒト抗ＧＤ２モノクローナル抗体の内部移行を示す図である。Ｈ５２４細胞を、サポリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧであるＨｕｍ−ＺＡＰと複合体を形成した１Ｂ７、３１Ｆ９、または３１Ｆ９Ｖ２の存在下で成長させた。値を測定し、Ｆａｂ−ＺＡＰの非存在下での１００％成長に対して正規化した。
図２６は、Ｌａｎ１−ｌｕｃ細胞へのヒト抗ＧＤ２モノクローナル抗体の内部移行を示す図である。Ｌａｎ１−ｌｕｃ細胞を、サポリンとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧであるＨｕｍ−ＺＡＰと複合体を形成した１Ｂ７、１Ｇ２、２Ｈ１２、２Ｆ７、３１Ｆ９または３２Ｅ２の存在下で成長させた。値を測定し、Ｆａｂ−ＺＡＰの非存在下での１００％成長に対して正規化した。
図２７は、フローサイトメトリーによってｐＨ感受性レポーターを用いて測定した、Ｈ５２４（ＳＣＬＣ）腫瘍細胞への抗ガングリオシド抗体の内部移行の動態を示す図である。エンドソームの低ｐＨ環境へと抗体が内部移行した細胞は、フローサイトメトリーによって測定される蛍光を示す。
図２８は、フローサイトメトリーによってｐＨ感受性レポーターを用いて測定した、ＴＣ−７１（肉腫）腫瘍細胞への抗ガングリオシド抗体の内部移行の動態を示す図である。エンドソームの低ｐＨ環境へと抗体が内部移行した細胞は、フローサイトメトリーによって測定される蛍光を示す。
図２９は、ヒトＳａＯＳ２（骨肉腫）異種移植片を植え付け、抗ＧＤ２抗体または対照で処置したＳＣＩＤマウスの生存を示す図である。
図３０は、抗ＧＤ２抗体または対照で処置したＳＣＩＤマウスにおけるヒトＴＣ−７１（肉腫）異種移植腫瘍の成長を示す図である。
腫瘍細胞表面上で発現されたガングリオシドは、がん免疫療法のための標的であり得る。本明細書で提供される組成物は、少なくとも一部において、例えば、米国特許第６，９３６，２５３号；米国特許第７，００１，６０１号、および米国特許第６，９１６，４７６号に記載されるような、ＫＬＨとコンジュゲートしたＧＤ２Ｌ、ＧＤ３ＬおよびＧＭ２抗原を含むＭａｂＶａｘワクチン（ＭａｂＶａｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて免疫化した個体の血液リンパ球から生成されたヒト抗体の同定および特徴付けに基づく。ＧＤ２に対する親和性が高い抗体が少なくとも１１種同定され（１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２、および３２Ｅ２）、これらを組換え抗体として発現させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてさらに特徴付けた。試験した８種の抗体のうち、６種（１Ｂ７、２Ｈ１２、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９Ｖ２、および３２Ｅ２）は、少なくとも１種のがん細胞系統において補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて効力があった。試験した６種全ての抗体が、異なる程度までではあるが、５種の異なるがん細胞系統を用いた抗体依存性細胞傷害アッセイにおいて有意な活性を示す。試験した２種の抗体（１Ｂ７および３１Ｆ９）はまた、生存モデルおよび皮下腫瘍モデルの両方において、ｉｎ ｖｉｖｏで有意な抗腫瘍活性を示した。本明細書で提供される本発明の技術移転の妥当性は２倍である。第１に、ＧＤ２−ＫＬＨコンジュゲートワクチンは、がん患者において抗ＧＤ２ ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答を引き出すことができ、抗体産生細胞は、患者血液試料から回収できる。第２に、臨床試験において生成した最も強力な抗体を保存し、標的がん集団に対する、治療薬として、または治療薬の生成において最終的に使用することができる。本明細書で提供される抗体の親和性が高いこと、およびそれらのエフェクター機能が高いことにより、この技術移転の潜在性が支持される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特異的な分子抗原に結合することができ、２つの同一のポリペプチド鎖の対で構成され、各対が１つの重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）と１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分が約１００〜約１３０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分が定常領域を含む、ポリペプチドの免疫グロブリンクラスの範囲に入るＢ細胞のポリペプチド産物を意味するものとする（Borrebaeck（編）（１９９５年）Antibody Engineering、第２
版、Oxford University Press.；Kuby（１９９７年）Immunology、第３版、W.H. Freeman and Company、New Yorkを参照されたい）。本発明に関しては、本発明の抗体が結合し得る特異的な分子抗原として、標的ＧＤ２が挙げられる。
「ヒト」という用語は、抗体またはその機能性断片に関して使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するヒト可変領域および／またはヒト定常領域またはその一部を有する抗体またはその機能性断片を指す。そのようなヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列は、Kabatら（１９９１年）Sequences of Proteins of Immunological
Interest、第５版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. ９１〜３２４２により記載されている。ヒト抗体は、本発明に関しては
、ＧＤ２に結合し、かつ、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞性バリアントである核酸配列によりコードされる抗体を含み得る。ヒト抗体を作製する典型的な方法が実施例Ｉに提示されているが、当業者に周知の任意の方法を使用することができる。
「モノクローナル抗体」という用語は、単一細胞クローンもしくはハイブリドーマまたは単一細胞に由来する細胞の集団の産物である抗体を指す。モノクローナル抗体とは、単一分子免疫グロブリン種が産生されるように組換え方法によって重鎖および軽鎖をコードする免疫グロブリン遺伝子から作製される抗体も指すものとする。モノクローナル抗体調製物内の抗体のアミノ酸配列は実質的に均一であり、そのような調製物内の抗体の結合活性は実質的に同じ抗原結合活性を示す。対照的に、ポリクローナル抗体は、集団内の異なるＢ細胞から得られる、特異的な抗原に結合する免疫グロブリン分子の組合せである。ポリクローナル抗体の各免疫グロブリンは、同じ抗原の異なるエピトープに結合し得る。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の作製方法は当技術分野で周知である（HarlowおよびLane.、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９年）およびBorrebaeck（編）、Antibody Engineering: A
Practical Guide、W.H. Freeman and Co.、Publishers、New York、１０３〜１２０頁（１９９１年））。
本明細書で使用される場合、「機能性断片」という用語は、抗体に関して使用される場合、その断片が由来する抗体としての結合活性の一部または全部を保持する重鎖または軽鎖ポリペプチドを含む抗体の一部を指すものとする。そのような機能性断片としては、例えば、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディおよびミニボディを挙げることができる。他の機能性断片としては、例えば、そのような機能性断片が結合活性を保持する限りは、重鎖または軽鎖ポリペプチド、可変領域ポリペプチドまたはＣＤＲポリペプチドまたはその一部を挙げることができる。そのような抗体の結合性断片は、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（１９８９年）；Myers（編）、Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference、New York：VCH Publisher, Inc.；Hustonら、Cell Biophysics、２２巻：１８９〜２２４頁（１９９３年）；PluckthunおよびSkerra、Meth. Enzymol.、１７８巻：４９７〜５１５頁（１９８９年）な
らびにDay、E.D.、Advanced Immunochemistry、第２版、Wiley-Liss, Inc.、New York、NY（１９９０年）に見いだすことができる。
「重鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、アミノ末端部分が約１２０〜１３０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約５０〜７０ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称される５種の別個の型のうちの１種であり得る。別個の重鎖は、サイズが異なり、α、δおよびγはおよそ４５０アミノ酸を含有し、μおよびεはおよそ５５０アミノ酸を含有する。これらの別個の型の重鎖を軽鎖と組み合わせると、ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含め、５つの周知のクラスの抗体、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが生じる。重鎖はヒト重鎖であり得る。
「軽鎖」という用語は、抗体に関して使用される場合、アミノ末端部分が約１００〜約１１０またはそれ超のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖を指す。軽鎖のおおよその長さは２１１〜２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）またはラムダ（λ）と称される２種の別個の型が存在する。軽鎖アミノ酸配列は当技術分野で周知である。軽鎖はヒト軽鎖であり得る。
「可変ドメイン」または「可変領域」という用語は、一般に軽鎖または重鎖のアミノ末端に位置し、長さが重鎖では約１２０〜１３０アミノ酸、軽鎖では約１００〜１１０アミノ酸であり、特定の抗体それぞれの、その特定の抗原に対する結合および特異性に使用される、抗体の軽鎖または重鎖の一部を指す。可変ドメインは異なる抗体の間で配列が広範囲にわたって異なる。配列の変動性はＣＤＲに集中し、可変ドメイン内の変動性の低い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。軽鎖および重鎖のＣＤＲは、抗体と抗原の相互作用に主に関与する。本明細書で使用されるアミノ酸の位置の番号付けは、Kabatら
（１９９１年）Sequences of proteins of immunological interest.（U.S. Department of Health and Human Services、Washington、D.C.）、第５版にある通りＥ
Ｕ Ｉｎｄｅｘに従う。可変領域はヒト可変領域であり得る。
ＣＤＲとは、免疫グロブリン（Ｉｇまたは抗体）ＶＨ β−シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｈ１、Ｈ２またはＨ３）のうちの１つ、または抗体ＶＬ β−シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域（Ｌ１、Ｌ２またはＬ３）のうちの１つを指す。したがって、ＣＤＲとは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。ＣＤＲ領域は当業者には周知であり、例えば、Kabatにより、抗体可変（Ｖ）ドメイン内の最も超可変性の領域であると定義されてい
る（Kabatら、J. Biol. Chem. ２５２巻：６６０９〜６６１６頁（１９７７年）；Kabat、Adv. Prot. Chem. ３２巻：１〜７５頁（１９７８年））。またＣＤＲ領域配列は、Chothiaにより、保存されたβ−シートフレームワークの一部ではなく、したがって、
異なるコンフォメーションに適合させることができる残基であると構造的に定義されている（ChothiaおよびLesk、J. Mol. Biol. １９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。どちらの用語法も当技術分野において十分に認識されている。標準的な抗体可変ドメイン内のＣＤＲの位置は、多数の構造を比較することによって決定されている（Al-Lazikaniら、J. Mol. Biol. ２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；Moreaら、Methods ２０巻：２６７〜２７９頁（２０００年））。超可変領域内の残基の数は異なる抗体では変動するので、標準的な可変ドメイン番号付けスキームでは慣習的に、標準的な位置と比較して追加的な残基には残基数の隣にａ、ｂ、ｃなどの番号が付される（Al-Lazikaniら、上記（１９９７年））。そのような命名法も同様に当業者に周知である。
例えば、Kabat（超可変）またはChothia（構造的）による命名のいずれかに従って定義されるＣＤＲは、以下の表１に記載されている。
Figure 2021040636
１つまたは複数のＣＤＲを共有結合または非共有結合のいずれかにより分子に組み入れて、イムノアドヘシンを作出することもできる。イムノアドヘシンは、ＣＤＲ（複数可）をより大きなポリペプチド鎖の一部として組み入れることもでき、ＣＤＲ（複数可）を別のポリペプチド鎖と共有結合により連結することもでき、ＣＤＲ（複数可）を非共有結合により組み入れることもできる。ＣＤＲにより、イムノアドヘシンが特定の目的の抗原に結合することが可能になる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドに関して使用される場合、参照されている分子が天然で見いだされる少なくとも１つの成分を含まないことを意味するものとする。この用語は、その天然の環境で見いだされる他の成分の一部または全部から取り出された抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドを包含する。抗体の天然の環境の成分としては、例えば、赤血球、白血球、血小板、血漿、タンパク質、核酸、塩および栄養素が挙げられる。抗体機能性断片またはポリヌクレオチドの天然の環境の成分としては、例えば、脂質膜、細胞小器官、タンパク質、核酸、塩および栄養素が挙げられる。本発明の抗体、抗体機能性断片またはポリヌクレオチドはまた、それが単離されたまたは組換えによって作製された細胞のこれらの成分または任意の他の成分の全てを含まないまたは実質的にまで含まないものであり得る。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラスを指す。所与の抗体または機能性断片の重鎖により、その抗体または機能性断片のクラス、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥが決定される。各クラスはκまたはλ軽鎖のいずれかを有し得る。「サブクラス」という用語は、サブクラスを識別する重鎖のアミノ酸配列の軽微な差異を指す。ヒトでは、ＩｇＡのサブクラスが２つ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２）存在し、ＩｇＧのサブクラスが４つ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）存在する。そのようなクラスおよびサブクラスは当業者には周知である。
「結合する（ｂｉｎｄｓ）」または「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、複合体が形成される、分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、および／またはファンデルワールス相互作用を含めた、非共有結合性の相互作用であってよい。複合体は、共有結合性または非共有結合性の結合、相互作用または力によって一緒に保持される２つまたはそれ超の分子の結合も含み得る。抗体またはその機能性断片の結合は、例えば、実施例Ｉで提示される方法である酵素結合免疫吸着アッセイ、または当業者に周知のいくつかの方法の任意の１つを使用して検出することができる。
抗体または機能性断片上の単一の抗原結合性部位とＧＤ２などの標的分子の単一のエピトープの間の非共有結合性の相互作用全体の強度は、そのエピトープに対する抗体または機能性断片の親和性である。抗体またはその機能性断片と一価の抗原の会合（ｋ１）と解離（ｋ−１）の比（ｋ１／ｋ−１）が会合定数Ｋであり、これが親和性の尺度である。Ｋの値は、抗体または機能性断片と抗原の異なる複合体で変動し、ｋ１およびｋ−１の両方に依存する。本発明の抗体または機能性断片についての会合定数Ｋは、本明細書で提供される任意の方法または当業者に周知の任意の他の方法を使用して決定することができる。
１つの結合性部位における親和性が必ずしも抗体または機能性断片と抗原の間の相互作用の真の強度を反映するとは限らない。複合体の抗原が、例えば、多価ＧＤ２など、多数の結合性部位を含有する抗体と接触する多数の反復抗原性決定因子を含有するものである場合、１つの部位における抗体または機能性断片と抗原の相互作用により、第２の部位における反応の確率が上昇する。そのような多価抗体と抗原の間の多数の相互作用の強度は結合活性と称される。抗体または機能性断片の結合活性は、その結合能に関して、その個々の結合性部位の親和性よりも良好な尺度であり得る。例えば、ＩｇＧよりも低い親和性を有する可能性があるが、その多価性によって生じるＩｇＭの高結合活性により抗原に有効に結合することが可能になる五量体ＩｇＭ抗体に関して時に見いだされる通り、高結合活性によって低親和性が補償され得る。
抗体またはその機能性断片の特異性とは、個々の抗体またはその機能性断片の、１つの抗原とのみ反応する能力を指す。抗体または機能性断片は、抗原または抗原の異性体型の一次、二次または三次構造の差異を区別することができるものであれば、特異的であるとみなすことができる。抗体は、結合エピトープが他の抗原上に存在する場合、交差反応性であり得る。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体の、任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの配列は４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合にはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）で構成される。したがって、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチドのアルファベット表示である。ポリヌクレオチドは、遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または必要がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが分かっているまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドおよび核酸は、天然に存在しないポリヌクレオチドおよび核酸を対象とすることが理解される。天然に存在しないポリヌクレオチドおよび核酸としては、これらに限定されないが、ｃＤＮＡおよび化学的に合成された分子を挙げることができる。
ポリヌクレオチドに関して使用される「コードする」という用語またはその文法上の等価物は、そのネイティブな状態の、または当業者に周知の方法によって操作した場合に、転写されてｍＲＮＡを生じ得、次いでそれがポリペプチドおよび／またはその断片に翻訳されるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖は、そのようなポリヌクレオチドの相補物であり、それからコード配列を推定することができる。
「治療剤」という句は、ＧＤ２の発現に関連する疾患および／またはそれに関連する症状の治療、管理または好転に使用することができる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、治療剤とは、本発明の抗体または機能性断片を指す。他の実施形態では、治療剤とは、本発明の抗体または機能性断片以外の薬剤を指す。治療剤は、ＧＤ２の発現に関連する疾患および／またはそれに関連する１つもしくは複数の症状を治療する、管理するまたは好転させるために有用であることが周知である、または、そのために使用されていたもしくは現在使用されている薬剤であってよい。
「診断剤」という句は、疾患の診断に役立つ、対象に投与される物質を指す。そのような物質は、疾患を引き起こすプロセスの局在化を明らかにするため、正確に示すため、および／または定義するために使用することができる。ある特定の実施形態では、診断剤は、対象に投与した場合または対象由来の試料と接触させた場合に、がんまたは腫瘍形成の診断に役立つ、本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートした物質を含む。
「検出可能な薬剤」という句は、試料または対象における本発明の抗体または機能性断片などの所望の分子の存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）または存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ）を確認するために使用することができる物質を指す。検出可能な薬剤は、可視化することができる物質または他のやり方で決定および／もしくは測定すること（例えば、定量化によって）ができる物質であってよい。
「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、塗布または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、薬剤の生物学的利用能、投与経路などを含めたいくつかの変数に左右される。
「治療有効量」という句は、本明細書で使用される場合、所与の疾患および／またはそれに関連する症状の重症度および／または持続時間を低下および／または好転させるのに十分な、治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体もしくは機能性断片または本明細書で提供される任意の他の治療剤）の量を指す。治療剤の治療有効量は、所与の疾患の進行（ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ）または進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）を低下もしくは好転させるため、所与の疾患の再発、発生もしくは発症を低下もしくは好転させるため、および／または、別の療法（例えば、本明細書で提供される抗体または機能性断片を投与すること以外の療法）の予防もしくは治療効果を改善もしくは増強するために必要な量であり得る。
ＧＤ２ガングリオシド、ガングリオシドＧＤ２、およびガングリオシドＧ２としても公知の化合物ＧＤ２は、分子式Ｃ７４Ｈ１３４Ｎ４Ｏ３２およびモル質量１５９１．８６ｇ／ｍｏｌを有するジシアロガングリオシドである。ガングリオシドは、ほとんどの細胞膜の外表面上に見いだされる酸性スフィンゴ糖脂質である。これらは、高い抗原密度、修飾の欠如、多くの腫瘍における相対的均一性およびサイトカインによる上方調節の可能性のために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の標的であり得る。多くの腫瘍が異常な糖脂質組成および構造を有する。ＧＤ２は、神経外胚葉または上皮起源のもの、事実上全てのメラノーマ、ならびに骨肉腫および軟部組織肉腫由来の腫瘍試料のおよそ５０％を含む、広いスペクトルのヒト腫瘍において見いだされている。
一部の実施形態では、本発明は、抗体重鎖または軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗体重鎖または軽鎖またはその機能性断片は図１〜２１に示されているまたは表２に列挙されている相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つまたは複数を有する。ＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載の通りＧＤ２に特異的に結合することができる。ＧＤ２への特異的な結合は、本明細書で提供される抗体のいずれかに関して実施例Ｉで提示される特異性、親和性および／または結合活性を含み得る。一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２の任意の１つの補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性および／または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を含み得る。抗体またはその機能性断片の特異性、親和性および／または結合活性を評価するための方法は当技術分野で周知であり、例示的な方法は本明細書で提供される。
一部の実施形態では、本発明の抗体またはその機能性断片は、６つ未満のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体またはその機能性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む。特定の実施形態では、抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、および／またはＶＬ ＣＤＲ３からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＣＤＲを含む。
一部の実施形態では、本発明は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
他の実施形態では、本発明は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１の残基７６〜９９；配列番号５の残基７６〜９９；配列番号９の残基７６〜９９；配列番号１３の残基７６〜９９；配列番号１７の残基７６〜９９；配列番号２１の残基７６〜９９；配列番号２５の残基７６〜９９；配列番号２９の残基７６〜９９；配列番号３３の残基７６〜９９；配列番号３５の残基７６〜９９；配列番号３９の残基７６〜９９からなる群から選択される核酸配列によってコードされ；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１の残基１５１〜１７４；配列番号５の残基１５１〜１７４；配列番号９の残基１５１〜１７４；配列番号１３の残基１５１〜１７４；配列番号１７の残基１５１〜１７４；配列番号２１の残基１５１〜１７４；配列番号２５の残基１５１〜１７４；配列番号２９の残基１５１〜１７４；配列番号３３の残基１５１〜１７４；配列番号３５の残基１５１〜１７４；配列番号３９の残基１５１〜１７４からなる群から選択される核酸配列によってコードされ；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１の残基２８９〜３２７；配列番号５の残基２８９〜３２７；配列番号９の残基２８９〜３２４；配列番号１３の残基２８９〜３２４；配列番号１７の残基２８９〜３２４；配列番号２１の残基２８９〜３２４；配列番号２５の残基２８９〜３２７；配列番号２９の残基２８９〜３２７；配列番号３３の残基２８９〜３３０；配列番号３５の残基２８９〜３３０；配列番号３９の残基２８９〜３２４からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、クローン単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
他の実施形態では、本発明は、配列番号１の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２７；配列番号５の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２７；配列番号９の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２４；配列番号１３の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２４；配列番号１７の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２４；配列番号２１の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２４；配列番号２５の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２７；配列番号２９の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２７；配列番号３３の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３３０；配列番号３５の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３３０；配列番号３９の残基７６〜９９、残基１５１〜１７４、および残基２８９〜３２４からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、可変重（ＶＨ）鎖ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＨドメインアミノ酸配列が、配列番号１；配列番号５；配列番号９；配列番号１３；配列番号１７；配列番号２１；配列番号２５；配列番号２９；配列番号３３；配列番号３５；および配列番号３９からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号３の残基７９〜１１１；配列番号７の残基７９〜１１１；配列番号１１の残基７９〜１１４；配列番号１５の残基７９〜１１４；配列番号１９の残基７９〜１１４；配列番号２３の残基７９〜１１４；配列番号２７の残基７９〜１１１；配列番号３１の残基７９〜１１１；配列番号３７の残基７９〜９６；および配列番号４１の残基７９〜１１４からなる群から選択される核酸配列によってコードされ；ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号３の残基１６３〜１７１；配列番号７の１６３〜１７１；配列番号１１の１６６〜１７４；配列番号１５の１６６〜１７４；配列番号１９の１６６〜１７４；配列番号２３の１６６〜１７４；配列番号２７の１６３〜１７１；配列番号３１の１６３〜１７１；配列番号３７の１４８〜１５６；および配列番号４１の１６６〜１７４からなる群から選択される核酸配列によってコードされ；ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号３の残基２８０〜３０６；配列番号７の残基２８０〜３０６；配列番号１１の残基２８３〜３０９；配列番号１５の残基２８３〜３０９；配列番号１９の残基２８３〜３０９；配列番号２３の残基２８３〜３０９；配列番号２７の残基２８０〜３０６；配列番号３１の残基２８０〜３０６；配列番号３７の残基２６５〜２９１；配列番号４１の残基２８３〜３０９からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、クローン単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽（ＶＬ）鎖ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
他の実施形態では、本発明は、配列番号３の残基７９〜１１１、残基１６３〜１７１、および残基２８０〜３０６；配列番号７の残基７９〜１１１、残基１６３〜１７１、および残基２８０〜３０６；配列番号１１の残基７９〜１１４、残基１６６〜１７４、および残基２８３〜３０９；配列番号１５の残基７９〜１１４、残基１６６〜１７４、および残基２８３〜３０９；配列番号１９の残基７９〜１１４、残基１６６〜１７４、および残基２８３〜３０９；配列番号２３の残基７９〜１１４、残基１６６〜１７４、および残基２８３〜３０９；配列番号２７の残基７９〜１１１、残基１６３〜１７１、および残基２８０〜３０６；配列番号３１の残基７９〜１１１、残基１６３〜１７１、および残基２８０〜３０６；配列番号３７の残基７９〜９６、残基１４８〜１５６、および残基２６５〜２９１；配列番号４１の残基７９〜１１４、残基１６６〜１７４、および残基２８３〜３０９からなる群から選択される核酸配列によってコードされるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、ＶＬドメインアミノ酸配列が、配列番号３；配列番号７；配列番号１１；配列番号１５；配列番号１９；配列番号２３；配列番号２７；配列番号３１；配列番号３７；および配列番号４１からなる群から選択される核酸配列によってコードされる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片を提供する。一部の態様では、抗体またはその機能性断片は、図１〜２１に示されているまたは表２に列挙されているＣＤＲのうちの１つまたは複数を有する。ＣＤＲのうちの１つまたは複数、特にＣＤＲ３を含む抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載の通りＧＤ２に特異的に結合することができる。ＧＤ２への特異的な結合は、本明細書で提供される抗体のいずれかに関して実施例Ｉに記載される特異性および親和性を含み得る。一部の態様では、本発明の抗体またはその機能性断片は、本明細書に記載のクローン単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２のうちのいずれか１つのＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性を含み得る。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片を提供する。従って、一部の態様では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の他の態様では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の態様では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の他の態様では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインが、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；ＶＬが、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、抗体またはその機能性断片を提供する。
一部の他の実施形態では、本発明は、ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ、配列番号２および配列番号４；配列番号６および配列番号８；配列番号１０および配列番号１２；配列番号１４および配列番号１６；配列番号１８および配列番号２０；配列番号２２および配列番号２４；配列番号２６および配列番号２８；配列番号３０および配列番号３２；配列番号３４および配列番号３８；配列番号３６および配列番号３８；ならびに配列番号４０および配列番号４２からなる群からのアミノ酸配列を含む、抗体またはその機能性断片を提供する。
Figure 2021040636
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドのバリアントを提供する。バリアントは、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、例えば、これらに限定されないが、メチル化されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを含む。さらに、バリアントポリヌクレオチドは、非ヌクレオチド成分が間に入ったポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドに対する修飾は、当業者に周知の方法を使用してポリヌクレオチドの集合前または後に加えることができる。例えば、ポリヌクレオチドは、重合後に酵素的または化学的技法のいずれかを使用して標識成分とコンジュゲートすることによって修飾することができる（例えば、GottfriedおよびWeinhold、２０１１年、Biochem. Soc. Trans.、３９巻（２号）：５２３〜６２８頁；Paredesら、２０１１年、Methods、５４巻（２
号）：２５１〜２５９頁に記載の通り）。
当技術分野で周知の任意の方法によってポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２および３２Ｅ２の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は既知であるので（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２を参照されたい）、抗体およびこれらの抗体の修飾型をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが分かっているヌクレオチドコドンを、当該抗体をコードする核酸が生成するように集合させる。そのような抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成したオリゴヌクレオチドから集合させることができ（例えば、Kutmeierら、１９９４年、BioTechniques １７巻：２４２頁に記載の通り）、これは
、簡単に述べると、抗体、断片、またはそのバリアントをコードする配列の重複オリゴヌクレオチド含有部分を合成し、これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションを行い、次いで、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅することを伴う。
本発明の抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドは、単離体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２の可変重鎖ドメインおよび／または可変軽鎖ドメインの核酸配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、および４１）を使用して生成することができる。抗体または機能性断片をコードする核酸は、化学的に合成することもでき、適切な供給源（例えば、抗体またはその機能性断片を発現させるために選択されたハイブリドーマ細胞などの抗体またはその機能性断片を発現する細胞から単離したｃＤＮＡ）から、配列の３’および５’末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または特定の核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって得ることもできる。次いで、ＰＣＲによって生成した増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
本発明の一部の態様では、単離された抗体またはその機能性断片はモノクローナル抗体である。本発明の一部の態様では、本明細書で提供される単離された抗体またはその機能性断片はＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプである。本発明のさらなる態様では、抗体またはその機能断片は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体である。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその機能性断片を作製する方法を提供する。本発明の方法は、本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するステップ、宿主細胞を、本発明の抗体または機能性断片のコードされる重鎖および／または軽鎖を産生させる条件下、それに十分な期間にわたって培養するステップ、ならびに抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖を精製するステップを含み得る。他の実施形態では、本発明は、本発明の抗体または機能性断片をコードするポリヌクレオチドを有する組換え細胞を提供する。一部の態様では、抗体またはその機能性断片は、１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２と名付けた抗体の可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインを有する。
ＧＤ２抗原に結合する本発明の抗体またはその機能性断片の組換え発現は、本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含み得る。本発明の抗体またはその機能性断片（重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインを含有することが好ましいが、必ずしもそうでなくてよい）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体または機能性断片を産生させるためのベクターを、当技術分野で周知の技法を使用して組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載されている。
当業者に周知の方法を使用して、抗体またはその機能性断片のコード配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ技法、合成法、およびｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えが挙げられる。したがって、本発明は、プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第ＷＯ８６／０５８０７およびＷＯ８９／０１０３６号；ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖全体と軽鎖全体の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをそのようなベクターにクローニングすることができる。
発現ベクターを従来の技法によって宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来の技法によって培養して本発明の抗体またはその機能性断片を産生させる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結した、本発明の抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現に関する一部の実施形態では、以下に詳述されている通り、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖を両方コードするベクターを宿主細胞において同時発現させることができる。
本発明の抗体またはその機能性断片を発現させるために、種々の宿主−発現ベクター系を利用することができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。そのような宿主−発現系は、目的のコード配列を産生させ、その後、精製することができるビヒクルを意味するが、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトすると、ｉｎ ｓｉｔｕで本発明の抗体分子を発現し得る細胞も意味する。これらとしては、これらに限定されないが、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）などの微生物；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、もしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、および３Ｔ３細胞）が挙げられる。一部の態様では、特に組換え抗体全体を発現させるための、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉなどの細菌細胞、または真核細胞を、組換え抗体または機能性断片を発現させるために使用する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せて、抗体の有効な発現系である（Foeckingら、１９８６年、Gene ４５巻：１０１頁；およびCockettら、１９９０年、Bio/Technology ８巻：２頁）。一
部の実施形態では、本発明の抗体またはその断片をＣＨＯ細胞において産生させる。一実施形態では、ＧＤ２に結合する本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列の発現を構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって調節する。
細菌系では、発現させる抗体分子の意図された使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するためにそのような抗体を大量に産生させる場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、これらに限定されないが、抗体コード配列を個別にｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションすることができ、したがって融合タンパク質を産生させるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、１９８３年、EMBO １２巻：１７９１頁）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye、１９８５年、Nucleic Acids Res. １３巻：３１０１〜
３１０９頁；Van Heeke & Schuster、１９８９年、J. Biol. Chem. ２４巻：５５
０３〜５５０９頁）などが挙げられる。外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるためにｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着および結合させ、その後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含み、したがって、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができるように設計されている。
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用する。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。抗体または機能性断片のコード配列を個別にウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）への挿入により、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じる（例えば、Logan & Shenk、１９８４年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
８１巻：３５５〜３５９頁を参照されたい）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルを使用することもできる。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、挿入断片全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と同相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然でも合成でも種々の起源のものであってよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強することができる（例えば、Bittnerら、１９８７年、Methods in Enzymol. １５３巻：５１〜５４４頁を参照されたい）。
さらに、挿入配列の発現を調節する、または遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、抗体または機能性断片の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的な機構を有する。発現させる外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために適切な細胞系統または宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、これらに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞およびＴ４７Ｄ細胞、ＮＳ０（内因的にはいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないマウス骨髄腫細胞系統）細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられる。
長期間にわたり、組換えタンパク質の高収率の産生、安定発現が好ましい。例えば、本発明の抗体または機能性断片を安定に発現する細胞系統を工学的に作製することができる。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、工学的に作製した細胞を栄養強化培地で１〜２日間成長させることができ、次いで選択培地に切り換える。組換えプラスミド内の選択マーカーにより選択に対する耐性が付与され、細胞がそれらの染色体内にプラスミドを安定に組み込み、成長して巣を形成させることが可能になり、今度はそれをクローニングし、拡大増殖させて細胞系統にすることができる。この方法を有利に使用して、抗体分子を発現する細胞系統を工学的に作製することができる。
これらに限定されないが、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら、１９７７年、Cell １１巻：２２３頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalska & Szybalski、１９９２年、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA ４８巻：２０２頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ
遺伝子（Lowyら、１９８０年、Cell ２２巻：８〜１７頁）を含めた、いくつかの選択系を使用することができる。また、代謝拮抗薬耐性を以下の遺伝子に対する選択の基礎として使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、１９８０年、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. ７７巻（６号）：３５６７〜７
０頁；O'Hareら、１９８１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８巻：１５２７頁）；グルタミン酸およびアンモニアが使用されるグルタミンの生合成に関与する酵素であるグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）（Bebbingtonら、１９９２年、Biuotechnology １０巻：１６９頁）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg、
１９８１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８巻：２０７２頁）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（WuおよびWu、１９９１年、Biotherapy ３巻：８７〜９５頁；Tolstoshev、１９９３年、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. ３２巻：５７３〜５９６頁；Mulligan、１９９３年、Science ２６０巻：９２６〜９３２頁
；ならびにMorganおよびAnderson、１９９３年、Ann. Rev. Biochem. ６２巻：１９１〜２１７頁；１９９３年５月、TIB TECH １１巻（５号）：１５５〜２１５頁）；およ
びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、１９８４年、Gene
３０巻：１４７頁）。所望の組換えクローンを選択するために、組換えＤＮＡ技術の技術分野で周知の方法を常套的に適用することができ、そのような方法は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ausubelら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY（１９９３年）；Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY（１９９０年）；ならびにDracopoliら（編）、Current Protocols in Human Genetics、１２章および１３章、John Wiley & Sons、NY（１９９４年）；Colberre-Garapinら、１９８１年、J. Mol. Biol. １５０巻：１頁に記載されている。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇させることができる（総説については、BebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells、DNA cloning、３巻（Academic Press、New York、１９８７年）を参照されたい）。抗体または
その機能性断片を発現させるベクター系内のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルが上昇すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子に関連するので、抗体の産生も増加する（Crouseら、１９８３年、Mol. Cell. Biol. ３巻：２５７頁）。
宿主細胞に、本発明の２種の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターを同時トランスフェクトすることができる。２種のベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする同一の選択マーカーを含有してよい。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現させることができる単一のベクターを使用することができる。そのような状況では、毒性の遊離重鎖が過剰になるのを回避するために、軽鎖を重鎖の前に置くことができる（Proudfoot、１９８６年、Nature ３２２巻：５
２頁；およびKohler、１９８０年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７７巻：２１９７〜２１９９頁）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
さらに、本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で周知の技法を使用したコドン最適化に供して、所望の宿主細胞における本発明の抗体または機能性断片の最適化された発現を実現することができる。例えば、コドン最適化の１つの方法では、ネイティブなコドンを参照遺伝子セット由来の最も頻度の高いコドンで置換し、各アミノ酸についてのコドン翻訳の速度が高くなるように設計する。本発明の抗体または機能性断片の重鎖および／または軽鎖に適用することができる、所望のタンパク質を発現させるためのコドン最適化されたポリヌクレオチドを生成するための追加的な例示的な方法は、Kanayaら、Gene、２３８巻：１４３〜１５５頁（１９９９年）、Wangら、Mol. Biol. Evol.、１８巻（５号）：７９２〜８００頁（２００１年）、米国特許第５，７９５，７３７号、米国特許公開第２００８／００７６１６１号およびＷＯ２００８／０００６３２に記載されている。
本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、それを、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、特に特異的な抗原に対してはプロテインＡクロマトグラフィーの後にアフィニティクロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的な溶解性によって、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準の技法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体または機能性断片は、精製を容易にするために、本明細書で提供されるまたはそうでなければ当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。例えば、本発明の抗体または機能性断片は、市販されている、とりわけ、ポリ−ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、ＦＬＡＧタグ、赤血球凝集素タグ（ＨＡタグ）またはｍｙｃ−タグを組換えによって付加することおよび当業者に周知の精製方法を利用することによって精製することができる。
一部の実施形態では、本発明の抗体機能性断片は、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）であってよい。抗体およびその機能性断片に関して、種々の形態、変更および修飾が当技術分野で周知である。本発明のＧＤ２特異的抗体断片は、そのような種々の抗体の形態、変更および修飾のいずれかを含み得る。当技術分野で公知のそのような種々の形態および用語の例は以下に記載されている。
Ｆａｂ断片とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片を指し、Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であり、Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなり、Ｆｖ断片は、抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなり、ｄＡｂ断片（Wardら、Nature ３４１巻：５４４〜５４６頁、（１９８９年））は、ＶＨドメインからなる。
抗体は１つまたは複数の結合性部位を有し得る。２つ以上の結合性部位が存在する場合、結合性部位は互いと同一であってもよく、異なってもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは２つの同一の結合性部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合性部位を有するが、「二特異性」または「二機能性」抗体は２つの異なる結合性部位を有する。
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）とは、ＶＬ領域とＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）によってつながって連続的なポリペプチド鎖を形成した抗体を指し、リンカーは、タンパク質鎖が折りたたまれ、一価の抗原結合性部位が形成されるのが可能になるのに十分に長いものである（例えば、Birdら、Science ２４２巻：４２３〜２６頁（１９
８８年）およびHustonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：５８７９〜８３頁（１９８８年）を参照されたい）。ダイアボディとは、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体を指し、各ポリペプチド鎖は、リンカーによってつながったＶＨドメインとＶＬドメインを含み、リンカーは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成が可能になるには短すぎ、したがって各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対形成するのを可能にするものである（例えば、Holligerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０巻：６４４４〜４８頁（１９９３年）、およびPoljakら、Structure ２巻：１１２１〜２
３頁（１９９４年）を参照されたい）。ダイアボディの２つのポリペプチド鎖が同一である場合には、それらの対形成によって生じるダイアボディは２つの同一の抗原結合性部位を有するものになる。異なる配列を有するポリペプチド鎖を使用して、２つの異なる抗原結合性部位を有するダイアボディを作出することができる。同様に、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）およびテトラボディは、それぞれポリペプチド鎖を３つおよび４つ含み、同じであっても異なってもよい抗原結合性部位をそれぞれ３つおよび４つ形成する抗体である。
本発明は、ＧＤ２に結合する、１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２および３２Ｅ２の誘導体である抗体またはその機能性断片も提供する。本発明の抗体またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入するために、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発を含めた、当業者に周知の標準の技法を使用することができる。一部の態様では、誘導体は、元の分子と比較して２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、本発明は、修飾された形態の天然に存在するアミノ酸、保存的置換、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸類似体および模倣物を有する抗体またはその機能性断片が本明細書で定義されている機能活性を保持する限りは、そのような抗体または機能性断片を提供する。一実施形態では、誘導体は、１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基においてなされた保存的アミノ酸置換を有する。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、飽和変異誘発などによってコード配列の全部または一部を通してランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされる抗体またはその機能性断片を発現させることができ、抗体または機能性断片の活性を決定することができる。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の抗体または機能性断片内に含有されるＦｃ断片のフコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化が改変された抗体またはその機能性断片を提供する。Peippら、Blood、１１２巻（６号）：２３９０〜２３９９頁（２００８年）において論じられている通り、そのようなＦｃ断片の改変により、Ｆｃ受容体媒介性活性がもたらされ得る。例えば、Ｆｃ Ｎ−グリカン由来のコアフコース残基を欠く糖鎖工学により作製された治療用抗体は、フコシル化対応物と比較して低濃度で強力なＡＤＣＣを示し、また、有効性がはるかに高い。Shieldsら、J. Biol. Chem.、２７７
巻（３０号）：２６７３３〜４０頁（２００２年）；Okazakiら、J Mol Biol.、３３６巻：１２３９〜１２４９頁（２００４年）；Natsumeら、J. Immunol. Methods.、３０
６巻：９３〜１０３頁（２００５年）。抗体のフコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化をその機能性断片に関して改変するための方法は当技術分野で周知である。例えば、脱フコシル化手法は、Yamane-Ohnukiら、MAbs.、１巻（３号）：２３０〜２３６頁（２００９年）に記載の通り、３つの方法体系（１）非哺乳動物細胞のＮ−グリコシル化経路の「ヒト化」非フコシル化経路への変換；（２）哺乳動物細胞のＮ−グリカンフコシル化経路の不活化および（３）非フコシル化Ｎ−糖タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける化学合成またはＮ−グリカンから非フコシル化形態への酵素による改変に群分けすることができる。これらの方法の任意の１つまたは当技術分野において周知の任意の他の方法を使用して、フコシル化、ガラクトシル化および／またはシアリル化が改変された抗体またはその機能性断片を作製することができることが理解される。
ＧＤ２に結合する本発明の抗体またはその機能性断片は、抗体を、特に化学合成によってまたは組換え発現技法によって合成するための当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。本発明の実施には、別段の指定のない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当技術分野の技術の範囲内の関連する分野の従来の技法を使用する。これらの技法は、本明細書において引用されている参考文献に記載されており、文献において十分に説明されている。例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Maniatisら（１９８２年）Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrookら（１９８９年）、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrookら（２００１年）Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons（
１９８７年および１年毎の更新）；Current Protocols in Immunology、John Wiley
& Sons（１９８７年および１年毎の更新）Gait（編）（１９８４年）Oligonucleotide
Synthesis: A Practical Approach、IRL Press；Eckstein（編）（１９９１年）Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach、IRL Press；Birrenら（
編）（１９９９年）Genome Analysis: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor
Laboratory Press；Borrebaeck（編）（１９９５年）Antibody Engineering l、第
２版、Oxford University Press；Lo（編）（２００６年）Antibody Engineering: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)；２４８巻、Humana Press, Incを参照されたい。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマおよび組換え技術、またはこれらの組合せの使用を含めた当技術分野で公知の多種多様な技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるHarlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、（Cold
Spring Harbor Laboratory Press、第２版、１９８８年）；Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas ５６３〜６８１頁（Elsevier、N.Y.、１９８１年）において教示されているものを含めたハイブリドーマ技法を使用して作製することができる。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術によって作製された抗体に限定されない。モノクローナル抗体を作製する他の例示的な方法は当技術分野で公知である。モノクローナル抗体を作製する追加的な例示的な方法は、本明細書の実施例Ｉにおいて提示されている。
ＧＤ２に結合する抗体機能性断片は、当業者に周知の任意の技法によって生成することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するため）などの酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解性の切断によって作製することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、重鎖の可変領域、軽鎖定常領域およびＣＨ１ドメインを含有する。
本発明の抗体機能性断片は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。例えば、ファージディスプレイ法では、本明細書で提供されるＣＤＲを１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ有する重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域などの機能性抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に提示させる。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に組み直し、ファージミドベクターにクローニングする。ベクターをＥ．ｃｏｌｉに電気穿孔により導入し、Ｅ．ｃｏｌｉにヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含めた繊維状ファージであり、通常、ＶＨおよびＶＬドメインをファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかと、組換えによって融合する。ＧＤ２などの特定の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージを、抗原を用いて、例えば、標識した抗原または固体表面もしくはビーズに結合させたもしくは捕捉した抗原を使用して選択または同定することができる。本発明の抗体機能性断片を作出するために使用することができるファージディスプレイ法の例としては、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brinkmanら、１９９５年、J. Immunol. Methods、１８２巻：
４１〜５０頁; Amesら、１９９５年、J. Immunol. Methods、１８４巻：１７７〜１８６頁；Kettleboroughら、１９９４年、Eur. J. Immunol．、２４巻：９５２〜９５８頁；Persicら、１９９７年、Gene、１８７巻：９〜１８頁; Burtonら、１９９４年、Advances in Immunology、５７巻：１９１〜２８０頁；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０
１１３４号；国際公開第ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１ １２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、およびＷＯ９７／１３８４４号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号に開示されているものが挙げられる。
上記の参考文献に記載の通り、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、それを使用して、ヒト抗体を含めた全抗体または任意の他の所望の抗原結合性断片を生成し、例えば、本明細書に記載の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主において発現させることができる。
Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって作製するための技法も、そのそれぞれの全体が参照により組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号；Mullinaxら、１９９２年、BioTechniques １２巻（６号）：８６４〜８６９頁；Sawaiら、１９９５年、AJRI ３４巻：２６〜３４頁；およびBetterら、１９８８年、Science
２４０巻：１０４１〜１０４３頁に開示されているものなどの当技術分野で公知の方法を使用して利用することができる。
全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者に周知のクローニング技法を利用して、ＰＣＲ増幅されたＶＨドメインをＶＨ定常領域、例えば、ヒトガンマ１定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインをＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬドメインを必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングすることもできる。次いで、当業者に周知の技法を使用して重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系統に同時トランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一過性の細胞系統を生成する。
一部の実施形態では、本発明の抗体または機能性断片を１つまたは複数の診断剤、検出可能な薬剤または治療剤または任意の他の所望の分子とコンジュゲートする（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合する。コンジュゲートしたまたは組換えによって融合した抗体または機能性断片は、特定の療法の有効性の決定などの、臨床試験の手順の一部として、ＧＤ２の発現に関連する疾患、例えば、がんまたは腫瘍形成などの発症、発生、進行および／または重症度をモニタリングまたは診断するために有用であり得る。
一部の態様では、本発明の抗体またはその機能性断片を検出可能な薬剤とコンジュゲートする。検出および診断は、例えば、本発明の抗体または機能性断片と、これらに限定されないが、放射性材料、例えば、これらに限定されないが、ジルコニウム（８９Ｚｒ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ、１１Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５Ｏ、１３Ｎ、６４Ｃｕ、９４ｍＴｃ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｓｎなど；および種々の陽電子放出断層撮影法を使用する陽電子放出性金属、種々の酵素、例えば、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなど；補欠分子族、例えば、これらに限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなど；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocynate）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなど；発光材料、例えば、これに限定されないが、ルミノールなど；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなど、ならびに非放射性常磁性金属イオンを含めた、検出可能な物質をカップリングすることによって実現することができる。
本発明は、１つまたは複数の治療剤とコンジュゲートした（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合した本発明の抗体または機能性断片の治療的使用をさらに包含する。この場合、例えば、抗体は、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、または放射活性金属イオン、例えば、アルファ−エミッターなどの治療剤とコンジュゲートするまたは組換えによって融合することができる。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に対して有害である任意の薬剤を含む。治療剤は、化学療法薬、例えば、これらに限定されないが、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシンおよびダウノルビシン（以前はダウノマイシン））など；タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソテレ）；代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルおよびデカルバジン）；またはアルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣ
ＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）およびシスプラチン）；抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））；アウリスタチン分子（例えば、アウリスタチンＰＨＥ、ブリオスタチン１、ソラスタチン（ｓｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））；ホルモン（例えば、グルココルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、およびエストロゲン）；ヌクレオシド類似体（例えばゲムシタビン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（例えば、エトポシドおよびトポテカン）、キナーゼ阻害剤（例えば、グリベックまたはメシル酸イマチニブとしても公知の化合物ＳＴ１５７１）；細胞傷害剤（例えば、マイタンシン、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド（glucorticoid）、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体またはホモログ、ならびに米国特許第６，２４５，７５９号、同第６，３９９，６３３号、同第６，３８３，７９０号、同第６，３３５，１５６号、同第６，２７１，２４２号、同第６，２４２，１９６号、同第６，２１８，４１０号、同第６，２１８，３７２号、同第６，０５７，３００号、同第６，０３４，０５３号、同第５，９８５，８７７号、同第５，９５８，７６９号、同第５，９２５，３７６号、同第５，９２２，８４４号、同第５，９１１，９９５号、同第５，８７２，２２３号、同第５，８６３，９０４号、同第５，８４０，７４５号、同第５，７２８，８６８号、同第５，６４８，２３９号、同第５，５８７，４５９号に開示されている化合物）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｒ１１５７７７、ＢＭＳ−２１４６６２、および、例えば、米国特許第６，４５８，９３５号、同第６，４５１，８１２号、同第６，４４０，９７４号、同第６，４３６，９６０号、同第６，４３２，９５９号、同第６，４２０，３８７号、同第６，４１４，１４５号、同第６，４１０，５４１号、同第６，４１０，５３９号、同第６，４０３，５８１号、同第６，３９９，６１５号、同第６，３８７，９０５号、同第６，３７２，７４７号、同第６，３６９，０３４号、同第６，３６２，１８８号、同第６，３４２，７６５号、同第６，３４２，４８７号、同第６，３００，５０１号、同第６，２６８，３６３号、同第６，２６５，４２２号、同第６，２４８，７５６号、同第６，２３９，１４０号、同第６，２３２，３３８号、同第６，２２８，８６５号、同第６，２２８，８５６号、同第６，２２５，３２２号、同第６，２１８，４０６号、同第６，２１１，１９３号、同第６，１８７，７８６号、同第６，１６９，０９６号、同第６，１５９，９８４号、同第６，１４３，７６６号、同第６，１３３，３０３号、同第６，１２７，３６６号、同第６，１２４，４６５号、同第６，１２４，２９５号、同第６，１０３，７２３号、同第６，０９３，７３７号、同第６，０９０，９４８号、同第６，０８０，８７０号、同第６，０７７，８５３号、同第６，０７１，９３５号、同第６，０６６，７３８号、同第６，０６３，９３０号、同第６，０５４，４６６号、同第６，０５１，５８２号、同第６，０５１，５７４号、および同第６，０４０，３０５号によって開示されているもの）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、ＳＮ−３８、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、ＧＧ−２１１（ＧＩ１４７２１１）、ＤＸ−８９５１ｆ、ＩＳＴ−６２２、ルビテカン（ｒｕｂｉｔｅｃａｎ）、ピラゾロアクリジン、ＸＲ−５０００、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、ＵＣＥ６、ＵＣＥ１０２２、ＴＡＮ−１５１８Ａ、ＴＡＮ １５１８Ｂ、ＫＴ６００６、ＫＴ６５２８、ＥＤ−１１０、ＮＢ−５０６、ＥＤ−１１０、ＮＢ−５０６、ファガロニン（ｆａｇａｒｏｎｉｎｅ）、コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）、ベータ−ラパコンおよびレベッカマイシン（ｒｅｂｅｃｃａｍｙｃｉｎ））；ＤＮＡ副溝結合物質（例えば、Ｈｏｅｓｃｈｔ色素３３３４２およびＨｏｅｃｈｓｔ色素３３２５８）；アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、リン酸フルダラビンおよび２−クロロデオキシアデノシン）；またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和化合物、クラスレート、もしくはプロドラッグであってよい。治療剤は、例えば、これらに限定されないが、セツキシマブ、ベバシズマブ、ハーセプチン（heceptin）、リツキシマブ）などの免疫療法薬であってよい。
さらに、本発明の抗体または機能性断片は、例えば、放射活性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉなどのなどのアルファ−エミッターなど、または、これらに限定されないが、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含めた放射性金属イオンのコンジュゲートに有用な大環状キレート化剤；または、大環状キレート化剤、例えば、リンカー分子によって抗体または機能性断片に付着させることができる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）などの治療剤とコンジュゲートすることができる。そのようなリンカー分子は一般に当技術分野で公知であり、Denardoら、１９９８年、Clin Cancer Res. ４巻（１０号）：２４８３
〜９０頁；Petersonら、１９９９年、Bioconjug. Chem.１０巻（４号）：５５３〜７頁
；およびZimmermanら、１９９９年、Nucl. Med. Biol. ２６巻（８号）：９４３〜５
０頁に記載されている。
さらに、本発明の抗体または機能性断片は、所与の生物学的応答を改変する治療剤とコンジュゲートする（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合することができる。したがって、治療剤は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるべきでない。例えば、治療剤は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素およびジフテリア毒素）；腫瘍壊死因子、γ−インターフェロン、α−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス作用物質（例えば、ＴＮＦ−γ、ＡＩＭ Ｉ、ＡＩＭ ＩＩ、ＦａｓリガンドおよびＶＥＧＦ）、抗血管新生作用物質（例えば、アンジオスタチン、エンドスタチンおよび組織因子などの凝固経路の成分）などのタンパク質；生物学的反応修飾物質（例えば、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−２３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、および顆粒球コロニー刺激因子などのサイトカイン）；増殖因子（例えば、成長ホルモン）、または凝固作用物質（例えば、カルシウム、ビタミンＫ、組織因子、例えば、これらに限定されないが、ハーゲマン因子（第ＸＩＩ因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、凝固タンパク質−第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第Ｖ因子、第ＸＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘ因子、リン脂質、およびフィブリン単量体など）を挙げることができる。
本発明は、異種タンパク質またはポリペプチドと組換えによって融合または化学的にコンジュゲートして（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）融合タンパク質を生成する本発明の抗体または機能性断片を包含する。一部の態様では、そのようなポリペプチドの長さは約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０または約１００アミノ酸であってよい。一部の態様では、本発明は、本発明の抗体の機能性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメインまたはＶＬ ＣＤＲ）および異種タンパク質またはポリペプチドを有する融合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗体または機能性断片と融合させる異種タンパク質またはポリペプチドは、抗体または機能性断片を、ＧＤ２を発現する細胞などの特定の細胞型にターゲティングするために有用である。
本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とコンジュゲートした（共有結合または非共有結合によるコンジュゲーション）または組換えによって融合した本明細書で提供される本発明のいずれかの抗体または機能性断片を含む。一実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２抗体と、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、１Ｅ９、１Ｈ３、２Ｆ５、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２または３２Ｅ２抗体の機能性断片と、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号２、６、１０、１４、１８、２２、２６、３０、３４、３６、または４０に示されているＶＨ ＣＤＲの任意の１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。別の実施形態では、コンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２、３８、または４２に示されているＶＬ ＣＤＲの任意の１つのアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＶＬ ＣＤＲと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
一部の態様では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＶＨドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含み、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される。
一部の他の態様では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＶＨドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
さらに他の態様では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＶＬドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含み、ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される。
他の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＶＬドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
一部の他の態様では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含む。
一部の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含み、ＶＨドメインは、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；ＶＬドメインは、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
一部の他の実施形態では、本発明のコンジュゲートしたタンパク質または融合タンパク質は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインと、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とを含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、それぞれ、配列番号２および配列番号４；配列番号６および配列番号８；配列番号１０および配列番号１２；配列番号１４および配列番号１６；配列番号１８および配列番号２０；配列番号２２および配列番号２４；配列番号２６および配列番号２８；配列番号３０および配列番号３２；配列番号３４および配列番号３８；配列番号３６および配列番号３８；ならびに配列番号４０および配列番号４２からなる群からのアミノ酸配列を有する。
診断剤、検出可能な薬剤または治療剤（ポリペプチドを含む）と抗体を融合またはコンジュゲートするための方法は周知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs
In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld
ら（編）、２４３〜５６頁（Alan R. Liss, Inc.、１９８５年）；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（第２版）、Robinson
ら（編）、６２３〜５３頁（Marcel Dekker, Inc.、１９８７年）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）
、４７５〜５０６頁（１９８５年）；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」
、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら（編）
、３０３〜１６頁（Academic Press、１９８５年）、Thorpeら、１９８２年、Immunol.
Rev.、６２巻：１１９〜５８頁；米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，７２３，１２５号、同第５，７８３，１８１号、同第５，９０８，６２６号、同第５，８４４，０９５号、同第５，１１２，９４６号、同第７，９８１，６９５号、同第８，０３９，２７３号、同第８，１４２，７８４号；米国特許公開第２００９／０２０２５３６号、同第２０１０／００３４８３７号、同第２０１１／０１３７０１７号、同第２０１１／０２８０８９１号、同第２０１２／０００３２４７；ＥＰ３０７，４３４；ＥＰ３６７，１６６；ＥＰ３９４，８２７；ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０６５７０、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９６／２２０２４、ＷＯ９７／３４６３１、およびＷＯ９９／０４８１３号；Ashkenaziら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：１０５３５〜
１０５３９頁、１９９１年；Trauneckerら、Nature、３３１巻：８４〜８６頁、１９８８年；Zhengら、J. Immunol.、１５４巻：５５９０〜５６００頁、１９９５年；Vilら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８９巻：１１３３７〜１１３４１頁、１９９２年；ならびにSenter、Current Opinion in Chemical Biology、１３巻：２３５〜２４４頁（
２００９年）を参照されたい。
別の態様では、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤は、還元した抗体成分のヒンジ領域においてジスルフィド結合を形成させることによって付着させることができる。あるいは、そのような薬剤は、Ｎ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの異種二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋剤を使用して抗体成分に付着させることができる。Yuら、Int. J. Cancer ５６巻：２４４号（１９９４年）。そのようなコンジュゲーションのための一般的な技法は当技術分野で周知である。例えば、Wong、CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS−LINKING（CRC Press １９９１年）；Upeslacisら、「Modification of Antibodies by Chemical Methods」、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS、Birchら（
編）、１８７〜２３０頁（Wiley-Liss, Inc. １９９５年）；Price、「Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」、MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION、ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION、Ritterら（編）
、６０〜８４頁（Cambridge University Press １９９５年）を参照されたい。
あるいは、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤は、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートすることができる。ペプチドを抗体成分と抗体炭水化物部分を介してコンジュゲートするための方法は、当業者には周知である。例えば、全てその全体が参照により組み込まれる、Shihら、Int. J. Cancer. ４１巻：８３２〜８３９頁（１９
８８年）；Shihら、Int. J. Cancer. ４６巻：１１０１〜１１０６頁（１９９０年）
；およびShihら、米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法は、酸化した炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離のアミン官能を有し、複数のペプチドを担持させた担体ポリマーと反応させることを伴う。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）連結がもたらされ、これを還元によって第二級アミンに安定化して最終的なコンジュゲートを形成することができる。
しかし、Ｆｃ領域が存在しない場合、例えば、本明細書で提供される抗体機能性断片が望ましい場合でも、診断剤、検出可能な薬剤または治療剤を付着させることが可能である。炭水化物部分を全長抗体または抗体断片の軽鎖可変領域に導入することができる。例えば、全てその全体が参照により組み込まれる、Leungら、J. Immunol.、１５４巻:５９１９頁（１９９５年）；米国特許第５，４４３，９５３号および同第６，２５４，８６８号を参照されたい。工学的に作製した炭水化物部分を使用して診断剤、検出可能な薬剤または治療剤を付着させる。
ＧＤ２に結合する本発明の抗体もしくは機能性断片とコンジュゲートしまたは組換えによって融合した治療剤は、所望の予防または治療効果（複数可）が実現されるように選択することができる。どの治療剤を本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートしまたは組換えによって融合するかを決定する際に、疾患の性質、疾患の重症度、および対象の状態を考慮することは、臨床医または他の医療関係者の技術レベルの範囲内であることが理解される。
本明細書で提供される通り検出可能に標識した、ＧＤ２に結合する本発明のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片は、診断目的で、疾患を検出、診断、またはモニタリングするために使用することができ、ここで、疾患を引き起こすまたは疾患に関連する細胞はＧＤ２を発現する。例えば、本明細書で提供される通り、例えば、これらに限定されないが、神経芽腫、骨肉腫および肉腫の他のサブセット、メラノーマ、神経膠腫、小細胞肺がん、乳がんおよび乳がん幹細胞、髄芽腫、ならびに星細胞腫などのがん細胞および腫瘍は、ＧＤ２を発現することが示されている。他の型の肉腫としては、これらに限定されないが、軟部組織肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。軟部組織肉腫としては、これらに限定されないが、胞巣状軟部肉腫（aveolar soft part sarcoma）、血管肉腫、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、神経線維肉腫、横紋筋肉腫が挙げられる。
したがって、本発明は、それを必要とする対象に本発明のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片の有効量を投与することによって対象におけるがんまたは腫瘍形成を検出するための方法を提供する。一部の態様では、検出方法は、ＧＤ２に結合する本発明の１種または複数種のコンジュゲートまたは融合抗体または機能性断片を使用して、対象の細胞または組織試料におけるＧＤ２の発現をアッセイするステップ、およびＧＤ２のレベルを対照レベル、例えば、正常組織試料（例えば、疾患を有さない対象由来のもの、または疾患が発症する前の同じ対象由来のもの）におけるレベルと比較し、それにより、アッセイされたＧＤ２のレベルがＧＤ２の対照レベルと比較して上昇していることにより、疾患が示されるステップをさらに含んでよい。そのような診断方法により、医療従事者が他の場合で可能になるよりも早く予防の尺度または侵襲性の治療を使用し、それにより、疾患の発生またはさらなる進行を予防することが可能になり得る。
本発明の抗体または機能性断片は、本明細書で提供されるまたは当業者に周知の古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中のＧＤ２抗原レベルをアッセイするためにも使用することができる（例えば、Jalkanenら、１９８５年、J. Cell. Biol. １０１巻：９７６〜９８５頁；およびJalkanenら、１９８７年、J. Cell. Biol. １０５巻：３０８７〜３０９６頁を参照されたい）。ＧＤ２を検出するために有用な他の抗体に基づく方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適切な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、それらとして、酵素標識、例えばグルコースオキシダーゼなど；放射性同位元素、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）など；発光標識、例えばルミノールなど；および蛍光標識、例えばフルオレセインおよびローダミンなど、ならびにビオチンが挙げられる。
一態様では、本発明は、ヒトにおける疾患の検出および診断を提供する。一実施形態では、診断は、ａ）ＧＤ２に結合する本発明のコンジュゲートまたは融合タンパク質の有効量を対象に投与する（例えば、非経口的に、皮下に、または腹腔内に）ステップ、ｂ）コンジュゲートまたは融合タンパク質を対象におけるＧＤ２が発現している部位に優先的に集中させるために（および、一部の態様では、結合していないコンジュゲートまたは融合タンパク質をバックグラウンドレベルまで除くために）、投与後ある時間間隔をあけるステップ、ｃ）バックグラウンドレベルを決定するステップ、およびｄ）対象におけるコンジュゲートまたは融合タンパク質を検出し、その結果、バックグラウンドレベルを上回るコンジュゲートまたは融合タンパク質が検出されることにより、対象が疾患を有することが示されるステップを含む。バックグラウンドレベルは、検出されたコンジュゲートまたは融合タンパク質の量を特定の系に関して予め決定された標準値と比較することを含めた、種々の方法によって決定することができる。
対象のサイズおよび使用する画像処理系は、診断画像を作成するために必要な画像処理部分の数量を決定し、当業者により容易に決定され得ることが理解される。例えば、ヒト対象に関して、本発明の抗体または機能性断片とコンジュゲートした放射性同位元素の場合では、注射する放射活性の数量は通常、約５〜２０ミリキュリーの９９Ｔｃに及ぶ。次いで、コンジュゲートはＧＤ２を発現する細胞の場所に優先的に蓄積する。ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍画像処理は、S.W. Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.」（Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer、１３章、S.W. BurchielおよびB.A. Rhodes編、Masson Publishing Inc.（１９８２年）に記載されている。
使用する検出可能な薬剤の種類および投与形式を含めたいくつかの変数に応じて、コンジュゲートを対象における部位に優先的に集中させるため、および結合していないコンジュゲートをバックグラウンドレベルまで除くための投与後の時間間隔は６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は５〜２０日または５〜１０日である。一実施形態では、疾患のモニタリングを、本明細書で提供される診断方法を、例えば、最初の診断の１カ月後、最初の診断の６カ月後、最初の診断の１年後、またはそれよりも後に繰り返すことによって行う。
コンジュゲートまたは融合タンパク質の存在は、対象においてｉｎ ｖｉｖｏにおけるスキャンの技術分野で公知の方法を使用して検出することができる。これらの方法は、使用する検出可能な薬剤の種類に依存する。当業者は、特定の検出可能な薬剤を検出するために適した方法を決定することができる。本発明の診断方法において使用することができる方法およびデバイスとしては、これらに限定されないが、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放出断層撮影法（position emission tomography）（ＰＥＴ）などの全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられる。一実施形態では、本発明の抗体または機能断片を放射性同位元素とコンジュゲートし、対象において放射線応答性外科用機器を使用して検出する。別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を蛍光化合物とコンジュゲートし、対象において蛍光応答性スキャン機器を使用して検出する。別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を、ジルコニウム（８９Ｚｒ）などの陽電子放出性金属または本明細書で提供されるもしくは陽電子放出断層撮影法によって検出可能であることが当技術分野において周知である任意の他の陽電子放出性金属とコンジュゲートし、対象において陽電子放出断層撮影法を使用して検出する。さらに別の実施形態では、本発明の抗体または機能断片を常磁性標識とコンジュゲートし、対象において磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して検出する。
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体または機能性断片および薬学的に許容される担体を有する医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物において使用することができる薬学的に許容される担体としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および油・水エマルションなどのエマルション、および種々の型の湿潤剤などの当技術分野で公知の標準の医薬担体のいずれかが挙げられる。これらの医薬組成物は、本発明の抗体または機能性断片を治療を必要とする対象の標的領域に送達するのに十分な液体の単位用量形態または任意の他の投薬形態で調製することができる。例えば、医薬組成物は、選択された投与形式、例えば、血管内、筋肉内、皮下、腹腔内などに適した任意の様式で調製することができる。他の任意選択の成分、例えば、医薬品グレードの安定剤、緩衝剤、防腐剤、賦形剤などは、当業者が容易に選択することができる。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮する医薬組成物の調製は当技術分野の技術レベルの範囲内である。
本明細書で提供される本発明の１つまたは複数の抗体または機能性断片を含有する医薬製剤は、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences（１９９０
年）Mack Publishing Co.、Easton、PA）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保管用
に調製することができる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において疾患を治療または予防するための方法を提供する。本発明の方法は、本明細書で提供される医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含み得る。例えば、医薬組成物は、本明細書で提供される１つまたは複数の抗体または機能性断片を含み得る。本発明の方法を使用して治療または予防することができる疾患としては、がん、腫瘍形成および／または転移が挙げられる。特に、本発明の方法は、がん細胞または腫瘍がＧＤ２を発現するがんまたは腫瘍形成を治療するために有用である。本発明の方法を使用して治療または予防することができるがんまたは腫瘍の非限定的な例としては、神経芽腫、骨肉腫および肉腫の他のサブセット、メラノーマ、神経膠腫、小細胞肺がん、乳がん、髄芽腫、ならびに星細胞腫が挙げられる。他の型の肉腫としては、これらに限定されないが、軟部組織肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。軟部組織肉腫としては、これらに限定されないが、胞巣状軟部肉腫、血管肉腫、類上皮肉腫、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、消化管間質腫瘍、脂肪肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、神経線維肉腫、横紋筋肉腫が挙げられる。乳がん幹細胞は、ＧＤ２を発現することも公知である。Battula1 VLら、Ganglioside GD2 identifies breast cancer stem cells and promotes tumorigenesis. J CLIN INVEST.１２２巻（６号）：２０６６〜２０７８頁（２０１２年）。
従って、一部の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを有し、ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される、方法を提供する。
一部の他の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ
ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを有する、方法を提供する。
さらに他の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを有する、方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有し、ＶＬ ＣＤＲ１が、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；ＶＬ ＣＤＲ２が、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、ＶＬ ＣＤＲ３が、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される、方法を提供する。
一部の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、方法を提供する。
一部の他の態様では、本発明は、それを必要とする対象において、抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体または機能性断片がＧＤ２に結合し、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを有する、方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において、ＧＤ２に結合する抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体またはその機能性断片が可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインが、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し；ＶＬドメインが、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、方法を提供する。
一部の他の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において、ＧＤ２に結合する抗体またはその機能性断片を有する医薬組成物の治療有効量を投与することによってがんまたは腫瘍形成を治療するための方法であって、抗体またはその機能性断片が可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、それぞれ、配列番号２および配列番号４；配列番号６および配列番号８；配列番号１０および配列番号１２；配列番号１４および配列番号１６；配列番号１８および配列番号２０；配列番号２２および配列番号２４；配列番号２６および配列番号２８；配列番号３０および配列番号３２；配列番号３４および配列番号３８；配列番号３６および配列番号３８；ならびに配列番号４０および配列番号４２からなる群からのアミノ酸配列を有する、方法を提供する。
本明細書に記載されているものなどの製剤は、治療する特定の疾患に対する必要に応じて２種以上の活性化合物を含有してもよい。ある特定の実施形態では、製剤は、本発明の抗体または機能性断片と、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する１種または複数種の活性化合物とを含む。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。例えば、本発明の抗体または機能性断片は、１種または複数種の他の治療剤と組み合わせることができる。そのような併用療法は、対象に同時にまたは順次投与することができる。
したがって、一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に本明細書で提供される医薬組成物の治療有効量を投与することによって疾患を治療または予防するための方法であって、医薬組成物が本発明の抗体または機能性断片と第２の治療剤とを含む、方法を提供する。適切な第２の治療剤は、本明細書で論じられている通り当業者が容易に決定することができる。一態様では、第２の治療剤は、化学療法剤または免疫療法剤である。
本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で、本明細書で提供される本発明の抗体の１つまたは複数の治療有効量、および任意選択で１種または複数種の追加的な治療剤を含有する。そのような医薬組成物は、がんもしくは腫瘍形成などの疾患、またはその症状の１つもしくは複数の予防、治療、管理または好転において有用である。
医薬組成物は、本発明の１つまたは複数の抗体または機能性断片を含有してよい。一実施形態では、抗体または機能性断片を、非経口投与用の滅菌溶液または懸濁剤などの適切な医薬調製物に製剤化する。一実施形態では、本明細書で提供される抗体または機能性断片を、当技術分野で周知の技法および手順を使用して医薬組成物に製剤化する（例えば、Ansel（１９８５年）Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、第４版、１２６頁を参照されたい）。
本発明の抗体または機能性断片は、治療される対象に対して、望ましくない副作用がなく、治療的に有用な効果が発揮されるのに十分な治療有効量で医薬組成物中に含めることができる。治療有効濃度は、常套的な方法を使用して化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系において試験し、次いで、そこからヒトに対する投薬量を推定することによって経験的に決定することができる。医薬組成物中の抗体または機能性断片の濃度は、例えば、抗体または機能性断片の物理化学特性、投薬スケジュール、および投与量、ならびに当業者に周知の他の因子に左右される。
一実施形態では、治療有効投薬量により、約０．１ｎｇ／ｍｌから約５０〜１００μｇ／ｍｌまでの、抗体または機能性断片の血清中濃度がもたらされる。別の実施形態では、医薬組成物により、１日当たり体重１キログラム当たり抗体約０．００１ｍｇから約５００ｍｇまでの投薬量がもたらされる。医薬単位剤形（ｄｏｓａｇｅ ｕｎｉｔ ｆｏｒｍ）を、単位剤形当たり約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇまたは１ｍｇから約３０ｍｇ、１００ｍｇまたは５００ｍｇまで、一実施形態では約１０ｍｇから約５００ｍｇまでの抗体もしくは機能性断片および／または他の任意選択の基本的な成分の組合せがもたらされるように調製することができる。
本発明の抗体または機能性断片は、一度に投与することもでき、時間間隔をあけて投与するいくつかのより小さな用量に分けることもできる。治療の正確な投薬量および持続時間は、治療される疾患に応じ、公知の試験プロトコールを使用して、またはｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏにおける試験データを外挿することによって、経験的に決定することができることが理解される。濃度および投薬量値は、軽減しようとする状態の重症度によっても変動し得ることに留意すべきである。任意の特定の対象に対して、個々の必要性および組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に応じて特定の投薬レジメンを経時的に調整することができること、および本明細書に記載されている濃度範囲は単なる例示であり、特許請求された組成物の範囲または実施を制限するものではないことがさらに理解されるべきである。
本発明の抗体または機能性断片を混合または添加した際に生じる混合物は、溶液、懸濁液などであってよい。生じる混合物の形態は、意図された投与形式および選択された担体またはビヒクル中での化合物の溶解性を含めたいくつかの因子に左右される。有効濃度は、治療される疾患、障害または状態の症状を好転させるのに十分であり、経験的に決定することができる。
医薬組成物は、ヒトおよび動物に、化合物または薬学的に許容されるそれらの誘導体の適切な分量を含有する滅菌非経口用溶液または懸濁液などの単位剤形（ｕｎｉｔ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で投与するように提供される。一実施形態では、抗体または機能性断片は、単位剤形または複数剤形（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）で製剤化し投与することができる。単位剤形（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）とは、ヒトおよび動物対象に適するものであり、当技術分野で公知の通り個別に包装された物理的に別個の単位を指す。各単位用量は、所望の治療効果をもたらすのに十分な本発明の抗体または機能性断片の所定数量を、必要な医薬担体、ビヒクルまたは希釈剤を伴って含有する。単位剤形の例としては、アンプルおよびシリンジが挙げられる。単位剤形は、その分数または倍数で投与することができる。複数剤形（ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）は、単位剤形を分けて投与するように単一の容器内に包装された複数の同一の単位剤形である。複数剤形の例としては、パイントまたはガロンのバイアルまたはビンが挙げられる。したがって、複数剤形は、包装が分けられていない複数の単位用量である。
一実施形態では、本発明の１種または複数種の抗体または機能性断片は、液体医薬製剤中にある。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書で提供される抗体または機能性断片と任意選択の医薬アジュバントを、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に溶解させるか、分散させるか、または他のやり方で混合して、それにより、溶液を形成することによって調製することができる。所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のそのような薬剤も含有してよい。そのような剤形の実際の調製方法は当業者に公知である、または明らかになる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（１９９０年）Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照されたい。
本発明の医薬組成物を投与するための方法は当技術分野で周知である。医薬組成物の適切な投与経路は、熟練臨床医が容易に決定することができることが理解される。例示的な投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射または皮下注射が挙げられる。さらに、医薬組成物の製剤は、投与経路に適応するように容易に調整することができることが理解される。本発明は、本発明の医薬組成物の投与後に、本明細書で提供される１種または複数種の医薬組成物の遅延、順次および／または反復投薬を対象に施すことができることも提供する。
疾患を治療するための本発明の方法は、（１）疾患を予防すること、すなわち、疾患の素因があり得るが、まだ疾患の症状を経験しておらず、現していない対象において疾患の臨床症状が発生しないようにすること；（２）疾患を阻害すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の発生を静止もしくは低下させること；または（３）疾患を軽減すること、すなわち、疾患もしくはその臨床症状の退縮を引き起こすことを含むものとする。疾患を予防するための本発明の方法は、がんまたは腫瘍形成を示す臨床症状を未然に防ぐことを含むものとする。そのような未然に防ぐことは、例えば、対象における正常な生理的指標の維持を含む。したがって、予防は、対象を腫瘍転移の出現から保護するための対象に対する予防的処置を含み得る。
本発明の方法において使用される医薬組成物の治療有効量は、使用される医薬組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重などに応じて変動し、これらは全て、担当臨床医の技能の範囲内である。本発明の方法によって治療される対象は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを含む。
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない改変も本明細書で提供される本発明の定義の範囲内で提供されることが理解される。したがって、以下の実施例は、例示であるが本発明を限定するものではないものとする。
（実施例Ｉ）
ＧＤ２に対するヒトモノクローナル抗体は強力な抗腫瘍活性を有する
ジシアロガングリオシドＧＤ２は、神経芽腫、骨肉腫および肉腫の他のサブセット、メラノーマ、神経膠腫、小細胞肺がん、乳がん、髄芽腫、ならびに星細胞腫を含めた広いスペクトルのヒト腫瘍において見いだされている。乳がん幹細胞は、ＧＤ２を発現することも公知である。Battula VLら、Ganglioside GD2 identifies breast cancer stem
cells and promotes tumorigenesis. J Clin Invest.１２２巻（６号）：２０６６〜２０７８頁（２０１２年）。ガングリオシドは、高い抗原密度、修飾の欠如、多くの腫瘍における相対的均一性およびサイトカインによる上方調節の可能性のために、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に対する理想的な標的である。従って、本明細書に記載の通り、ＧＤ２に対する完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成した。いくつかのｍＡｂを、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳに基づいて選択し、さらに特徴付けた。試験した抗体のうち、１Ｂ７、２Ｈ１２、２Ｆ７、２Ｅ１２、および３１Ｆ９Ｖ２は、一部のがん細胞系統に対して高レベルの補体依存性細胞傷害を示し、１Ｂ７、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２、および２Ｆ７は、一部のがん細胞系統に対して高レベルの抗体依存性細胞傷害を示し、抗腫瘍活性を、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいても確認した。免疫攻撃の標的としてのＧＤ２の潜在性ならびにそれらの親和性、特異性、およびエフェクター機能に基づいて、抗ＧＤ２ｍＡｂには、がんの治療における臨床的な有用性がある。
材料、細胞、および抗体
抗原：ＧＤ２−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０８３２−ＢＰ）、ＧＭ２−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０８３５−ＢＰ）およびＧＤ３−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０８９８−ＢＰ）はＬｅｃｔｉｎｉｔｙ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）から購入した。Ｔｎ−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０１−０１０）、ｓＴｎ−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０１−０５９）、ＴＦ−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０１−０２３）およびｓＬｅＡ−ＰＡＡ−ビオチン（ｃａｔ番号０１−０４４）はＧｌｙｃｏｔｅｃｈ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。ＧＤ２−セラミド、ＧＭ２−セラミド、ＧＤ３−セラミド、フコシル−ＧＭ１−セラミドおよびＧｌｏｂｏ−Ｈ−ビオチンはＭＳＫＣＣ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から入手した。ＭＵＣ１ペプチド−ビオチン（ｃａｔ番号３５３９５１）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）から購入した。ＧＭ３−セラミド（ｃａｔ番号１５０３）はＭａｔｒｅｙａ（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、ＰＡ）から購入した。セラミド抗原はメタノール中に溶解させ、他は全て、１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳ中に再浮遊させた。
細胞系統：Ｈ５２４、Ｌａｎ１−ｌｕｃ、ＢｘＰＣ３、ＳＫ−ＭＥＬ１９、ＳＴ８８、ＬＳ１４１、ＳａＯＳ２細胞系統はＭＳＫＣＣ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）から入手した。Ｃａｐａｎ２（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−８０）、ＤＭＳ７９（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−２０４９）、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−１５２）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ７２）、ＨＴ２９、（ＨＴＢ−３８）およびＭＣＦ７（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ２２）はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＴＣ−７１（ＡＡＣ５１６）はＬｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
抗ＧＤ２ ｍＡｂ産生ハイブリドーマおよびリンパ芽球様細胞系統（ＬＣＬ）の生成：メラノーマ（melonama）の患者におけるＧＤ２−／ＧＤ３−ＫＬＨコンジュゲートワクチンを用いた治験および肉腫の患者におけるＧＤ２−／ＧＤ３−／ＧＭ２−ＫＬＨ三価ワクチンを用いた治験における患者から血液試料を得た。メラノーマ第Ｉ相治験はＭＳＫＣＣにおいて行い、肉腫治験は多施設盲検第ＩＩ相研究であった。それぞれの施設ならびにＦＤＡの認可を受けたＩＲＢプロトコールおよびＩＮＤの下で全ての試料を得た。およそ８０〜９０ｍｌの血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（ｃａｔ番号１０７７１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での勾配遠心分離を使用してＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃａｔ番号１５０２４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）によってヒトＢ細胞を単離した。Ｌ−グルタミン（ｃａｔ番号２５０３００８１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡの非必須アミノ酸（ｃａｔ番号ＮＥ−０１）、ピルビン酸ナトリウム（ｃａｔ番号ＳＰ−９０）、ビタミン（ｃａｔ番号ＭＥ−３０）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ−２０）、１０％ＦＢＳ（ｃａｔ番号ＦＢ−０１）、ならびに刺激薬とサイトカインとの混合物を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ｃａｔ番号１０−０４０−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）でＢ細胞を培養した。５〜７日後、細胞を電気融合によってＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ｃａｔ番号ＰＴＡ−８４３４、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）と融合した。ＩＬ２およびＲ８４８またはＰＳ２００６の存在下でＢ細胞にＥＢＶ（Ｂ９５−８培養物上清）を感染させることによってＬＣＬを生成した。ＧＤ２特異的ＥＬＩＳＡを使用して抗ＧＤ２産生ハイブリドーマおよびＬＣＬを同定した。
ＥＬＩＳＡ：ビオチン化抗原のために：５０μｌ／ウェルのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（ｃａｔ番号３１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、４μｇ／ｍｌでＥＬＩＳＡプレート（ｃａｔ番号６５５０６１、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｍｏｎｒｏｅ、ＮＣ）上にコーティングし、室温で２時間インキュベートした。プレートを、室温で２時間または４℃で一晩、１．２５％ヒト血清アルブミン（ＨｕＳＡ）（ｃａｔ番号ＨＡ２５Ｓ、Ｍｏｎｏｂｉｎｄ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＣＡ）でブロッキングした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳ（ＰＢＳ−０．０５％Ｔ）で２回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのビオチン化抗原（ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの最終濃度）またはＰＢＳを添加し、室温で３０分間または４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、１．２５％ＨｕＳＡ中に２μｇ／ｍｌで希釈した精製されたｍＡｂ １００μｌ／ウェルと一緒に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔで３回洗浄した後、１００μｌ／ウェルの二次抗体、アルカリホスファターゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ（１．２５％ＨｕＳＡ中に１：３０００希釈、それぞれ、ｃａｔ番号０７５−１００２およびｃａｔ番号０７５−１００３、ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔで４回洗浄した。１００μｌ／ウェルのｐＮＰＰ基質（ｃａｔ番号ＰＩ３４０４５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を添加し、室温で１時間インキュベートし、２５μｌ／ウェルの２Ｎ ＮａＯＨで反応を停止させた。
セラミド抗原のために：５０μｌ／ウェルのセラミド抗原（ＥｔＯＨ中５μｇ／ｍｌの最終濃度）またはＥｔＯＨを、９６ウェルプレート（ｃａｔ番号２６９６２０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）上にコーティングし、室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、室温で２時間または４℃で一晩、２．５％ＨｕＳＡでブロッキングした。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、１．２５％ＨｕＳＡ中に２μｇ／ｍｌで希釈した精製されたｍＡｂ １００μｌ／ウェルと一緒に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄し、その後上記のとおりの二次抗体を添加した。プレートをＰＢＳ−０．０２５％Ｔで３回洗浄し、その後基質を添加した。
ＦＡＣＳ：細胞を、０．２５×１０６細胞／ｍｌで２００μｌ／チューブのＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ｃａｔ番号Ａ３０５９、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中に再浮遊させた。精製されたｍＡｂを、ＩｇＧについて２ｍｇ／ｍｌまたはＩｇＭについて５ｍｇ／ｍｌでチューブに添加し、４℃で４０分間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで１回洗浄した後、２００μｌのフルオロフォアとコンジュゲートした抗体であるＡｌｅｘａ４８８−抗ヒトＩｇＧ（ｃａｔ番号Ｈ１０１２０、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）またはＡｌｅｘａ４８８−抗ヒトＩｇＭ（ｃａｔ番号Ａ２１２１５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）をチューブに添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回洗浄し、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ−９６（ＰＣＡ−９６）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用してＧｕａｖａ ＥｘｐｒｅｓｓＰｒｏソフトウェアを用いて分析した。
親和性の決定：ＢｉａＣｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の原理を使用して親和定数を決定した。特注合成したビオチン標識したＧＤ２−ポリアクリルアミド（ＧＤ２−ＰＡＡ−ビオチン）をＬｅｃｔｉｎｉｔｙ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ（Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）から入手し、ストレプトアビジンコーティングされたバイオセンサーチップ（ＳＡ；Ｃａｔ番号ＢＲ１００３９８）に製造者の説明書に従ってカップリングした。ＨＳＡ、および遊離のビオチンを含有する培養培地を用いてブロッキングした１つのフローセルを参照セルとして使用した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性物質Ｐ２０）中に希釈したいくつかの既知濃度の抗体から、ＧＤ２−ＰＡＡ−ビオチンでコーティングしたフローセルを使用して結合速度パラメータを決定した。ＢｉａＣｏｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔから提供された曲線あてはめソフトウェアを使用して、会合および解離速度を算出した。
ＣＤＣアッセイ：細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍｌのＰＢＳに１０６細胞／ｍｌ／チューブで再浮遊させ、１２．５μｌ／チューブのカルセインＡＭ（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ）（ｃａｔ番号Ｃ３１００ＭＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。標識した細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地（完全培地）（ｃａｔ番号ＦＢ−１２、Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ）で２回洗浄し、１ｍｌの完全培地に再浮遊させた。標識した細胞（５０μｌ／ウェル）を、完全培地中に希釈したｍＡｂ １００μｌ／ウェルと一緒に４℃で１５分間インキュベートした。完全培地中に希釈したヒト補体（ｃａｔ番号ＩＰＬＡ−ＣＳＥＲ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖｉ、ＭＩ）５０μｌ／ウェルをウェルに添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。ヒト補体のための適切な最終希釈を各細胞系統について事前決定した（１：５と１：１６の間）。１６００ｒｐｍで８分間の遠心分離後、上清（１００μｌ／ウェル）を、新たな蛍光９６ウェルプレート（ｃａｔ番号７６０５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に移した。各試料を３連で評価した。ＮＰ４０を添加する対照試料を最大死滅を決定するために使用し、補体単独を添加する試料はベースラインとしての機能を果たす。死滅した細胞の百分率を、相対蛍光単位によって決定し、次式に従って算出する：％死滅＝（％試料−％補体単独）／（％ＮＰ４０−％補体単独）＊１００。
抗体依存性細胞傷害アッセイ：ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（ｃａｔ番号Ｇ７０１０）をＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入し、アッセイを取扱説明書に従って実施した。簡単に述べると、エフェクター細胞（コアキットからのＪｕｒｋａｔ）およびＧＤ２抗原発現標的細胞を洗浄し、それぞれ、３×１０６細胞／ｍｌおよび０．５×１０６細胞／ｍｌで、１０％低ウシＩｇＧ血清（コアキット）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で再浮遊させた。標的細胞（１２，５００細胞／２５μｌ／ウェル）を、２５μｌ／ウェルの抗ＧＤ２ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｌの最終濃度）または培地のみ、およびエフェクター細胞（７５，０００／２５μｌ／ウェル）と一緒に３７℃で１７時間インキュベートした。１００μｌ／ウェルのＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質（コアキット）を添加し、１０分間インキュベートした。Ｓｙｎｅｒｇｙ２ルミノメーター（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）によって相対光単位（ＲＬＵ）を測定した。エフェクター細胞および培地のみのウェルはベースラインＲＬＵとしての機能を果たした。各試料を３連で試験する。
内部移行アッセイ：抗ＧＤ２抗体の内部移行を、ＧＤ２発現細胞系統、Ｈ５２４およびＬａｎ１−ｌｕｃに対するｍＡｂおよびＨｕｍ−ＺＡＰ二次コンジュゲート（ｃａｔ番号ＩＴ２２、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）複合体の細胞傷害活性を測定することによって評価した。細胞を、２連で９６ウェルプレートにプレーティングし（２，０００細胞／９０μｌ／ウェル）、一晩インキュベートした。抗ＧＤ２抗体を、Ｈｕｍ−ＺＡＰ二次コンジュゲートと一緒に、製造者の説明書に従い、室温でインキュベートした。次に、１０μｌ／ウェルのｍＡｂおよびＨｕｍ−ＺＡＰ複合体を細胞に添加し、３日間インキュベートした。ｍＡｂの最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。アッセイを３連で実施した。２５μｌのＴｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ｃａｔ番号Ｍ５６５５、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェルの可溶化溶液（２０％ＳＤＳ／５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ｃａｔ番号Ｄ４５５１、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を各ウェルに添加し、３７℃でさらに４時間インキュベートした。５７０／６９０ｎｍにおいてＯＤを測定し、培地単独を用いて得られた値をプレートバックグラウンド減算のために使用した。抗体を伴わない３つの並行した培養物を使用して試料の値を正規化した（試料／無処理平均＊１００）。
ｐＨ感受性細胞内蛍光プローブを使用する内部移行アッセイ：ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ番号１０９−００６−００６）を、製造者のプロトコールに従ってｐＨＡｂ Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ｃａｔ番号Ｇ９８４１）とコンジュゲートした。ｐＨＡｂは、細胞がそれらのリソソームに抗体を取り込むときに遭遇する酸性ｐＨでのみ蛍光を示すｐＨセンサー色素である。簡単に述べると、６μｇ／ｍｌ（２００μｌ／チューブ）の一次抗体（１Ｂ７、３１Ｆ９、５Ａ７Ｇ３または試薬対照としてｍＡｂなし）および４．５μｇ／ｍｌ（２００μｌ／チューブ）の抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２−ｐＨＡｂを、室温で２０分間インキュベートした。Ｈ５２４またはＴＣ−７１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋グルタミン＋Ｐ／Ｓ培地に１．５×１０６細胞／ｍｌで再浮遊させた。２００μｌの細胞を、一次プラス二次抗体混合物に添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、０．５ｍｌの培養培地で再浮遊させ、９６ウェル組織培養プレートに分配し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。試料を、Ｇｕａｖａ
Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｐｒｏソフトウェアを使用するフローサイトメトリー分析のために、１時間、２時間、４時間および２４時間の時点で採取して、細胞の陽性の百分率を決定した。
異種移植モデル：骨肉腫ＳａＯＳ２細胞をＡＴＣＣ（Ｃａｔ番号ＨＴＢ−８５；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（５〜８週齢）をＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から購入した。完全成長培地０．１ｍｌ中のＳａＯＳ２細胞（１×１０６）を、０日目に２８Ｇ針を伴うＢＤインスリンシリンジ（ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を使用して、群当たり１０匹の動物の尾静脈に注射した。２００μｇのｍＡｂ（１Ｂ７または３１Ｆ９）を、腫瘍細胞注射の１日後、４日後、８日後、１１日後、１４日後、２１日後および２８日後に腹腔内に注射した。生存を毎日モニタリングし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してカプラン・マイヤー生存曲線を作成した。
ユーイング肉腫ＴＣ−７１細胞をＬｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ ＧｍｂＨ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、推奨どおりに培養した。０．１ｍｌのＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
Ｍａｔｒｉｘ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中のＴＣ−７１細胞（０．１×１０６）を、０日目に、群当たり５匹のマウスで雌ＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（５〜８週齢）の右後側腹部に皮下注射した。２００μｇのｍＡｂ（１Ｂ７または３１Ｆ９）を、腫瘍細胞注射の１日後、４日後、８日後、１１日後、１４日後、２１日後および２８日後に腹腔内に注射した。対照群の動物にＰＢＳをモック注射した。１週間に２回腫瘍成長についてマウスをモニタリングし、腫瘍サイズをノギスによって測定した。長さ×幅×幅×０．５として腫瘍体積（ｍｍ３）を算出した。
全ての手順をＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる認可を受けたプロトコールの下で実施した。
免疫グロブリンｃＤＮＡクローニングおよび組換え抗体発現：ヒトｍＡｂ重鎖および軽鎖の可変領域ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって個々のハイブリドーマまたはＬＣＬ細胞系統から回収し、以前に記載されている通りＩｇＧ１もしくはＩｇＭ重鎖発現ベクター、またはＩｇＫもしくはＩｇＬ軽鎖発現ベクターにサブクローニングした。Sawada-Hirai, R.ら、Human anti-anthrax protective antigen neutralizing monoclonal antibodies derived from donors vaccinated with anthrax vaccine adsorbed. J IMMUNE BASED THER VACCINES ２巻（１号）：５頁（２００４年）。Ｉｇ重鎖または軽
鎖発現ベクターをＮｏｔ ＩおよびＳａｌ Ｉで２重消化し、次いで、両方の断片をライゲーションして二重遺伝子発現ベクターを形成した。６ウェルプレート中のＣＨＯ細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（ｃａｔ番号１１６６８０１９、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して二重遺伝子発現ベクターをトランスフェクトした。２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を、選択培地［１０％透析ＦＢＳ（ｃａｔ番号２６４０００４４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ、ｃａｔ番号Ｍ５３７９、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｃａｔ番号５８７６２Ｃ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（ｃａｔ番号ＰＳ−２０、Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔａｒｚａｎａ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ］を伴う１０ｃｍのディッシュに移した。２週間後、ＭＳＸ耐性トランスフェクタントを単離し、拡大増殖させた。ＧＤ２特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて上清中の抗体レベルを測定することによって高抗ＧＤ２抗体産生クローンを選択し、大規模ｍＡｂ産生のために拡大増殖させた。
結果
組換え抗体の生成：１１種の選択された抗体由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をＲＴ−ＰＣＲによって回収し、全長ＩｇＧもしくはＩｇＭ重鎖発現ベクター、またはＩｇＫもしくはＩｇＬ軽鎖発現ベクターにクローニングした。ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔを使用した分子配列解析（Brochetら、Nucleic Acids Res.、３６巻：Ｗ５０３〜８頁（２
００８年））により、９種の選択されたヒト抗ＧＤ２抗体が３つの異なるＶＨファミリーに由来すること、および全てカッパ軽鎖が使用されていることが明らかになった。これらのＩｇＧ抗体は、生殖細胞系列から外れた変異をそれぞれ５個、７個、８個、９個、１０個、または２０個伴う異なるＣＤＲ配列を示した（図１〜１４、図１７〜２１；表３）。ＩｇＭ抗体（２Ｅ１２）ではカッパ軽鎖も利用され、重鎖変異が３個ある（図１５〜１６；表３）。ウェーブバイオリアクターシステム中、ＣＨＯ細胞系統において組換え抗体を産生させ、ＩｇＧおよびＩｇＭに対してそれぞれプロテインＡまたはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して精製した。精製された組換え抗体は、ＥＬＩＳＡでの結合および特異性に関して元のハイブリドーマ由来の抗体の性質を保持した。
Figure 2021040636
結合特異性：抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、７種のヒト抗ＧＤ２抗体（１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、および３２Ｅ２）が、ＧＤ２−ＰＡＡコンジュゲートに対して強い反応性を示したが、ＧＤ３−ＰＡＡ、Ｇｌｏｂｏ−Ｈ、ＭＵＣ１、Ｔｎ−ＰＡＡ、ｓＴｎ−ＰＡＡ、ＴＦ−ＰＡＡ、またはＳｌｅＡ−ＰＡＡに対しては示さなかった。３種の抗体（１Ｂ７、２Ｈ１２および２Ｆ７）は、ＧＭ２−ＰＡＡコンジュゲートに対しても交差反応性を示した。同様に、これら７種の抗体はまた、ＧＤ２−セラミドコンジュゲート（ＧＤ２−ｃｅｒ）と強い反応性を実証したが、ＧＤ３−セラミドコンジュゲート（ＧＤ３−ｃｅｒ）、Ｆ−ＧＭ１−セラミドコンジュゲート（Ｆ−ＧＭ１−ｃｅｒ）、またはＧＭ３−セラミドコンジュゲート（ＧＭ３−ｃｅｒ）とは実証しなかった。
Figure 2021040636
腫瘍細胞結合の分析：細胞表面結合は細胞傷害活性に関して極めて重要であり、したがって、抗ＧＤ２抗体１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、および３２Ｅ２についてこれを次に試験した。フローサイトメトリーにより、７種全ての抗体の、小細胞がん細胞系統Ｈ５２４、神経芽腫細胞系統Ｌａｎ１−Ｌｕｃ、乳がん細胞系統Ｈｓ５２７Ｔ、ならびに２つの肉腫細胞系統ＴＣ７１およびＳａＯＳ２への強力な結合が示された。７種の抗体のうち一部と、膵がん細胞、急性Ｔ細胞白血病細胞、メラノーマ細胞、および他の肉腫細胞を含めた他のがん細胞系統との間でも、陽性結合が検出された（表５）。
Figure 2021040636
親和性測定：ＧＤ２への結合の相対的な親和性／結合活性を、ビオチン化ＧＤ２−ＰＡＡを捕捉するためにストレプトアビジンでコーティングしたバイオセンサーチップを使用してＳＰＲによってプローブした（表６）。
Figure 2021040636
ＣＤＣ活性：１Ｂ７、２Ｈ１２、１Ｇ２、２Ｆ７、２Ｅ１２、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２、および３２Ｅ２の機能活性を評価するために、４種の異なる細胞（Ｈ５２４、Ｌａｎ１−Ｌｕｃ、Ｊｕｒｋａｔ、およびＴＣ−７１）を用い、補体の供給源としてヒト血清の存在下でそれらの細胞傷害活性を試験した。１Ｂ７は、試験した４種の細胞のうち３種において、１０μｇ／ｍＬでほぼ１００％の死滅活性を示した。２Ｈ１２、２Ｆ７、３１Ｆ９Ｖ２、および３２Ｅ２は全て、一部の細胞系統に対して有意なレベルのＣＤＣ活性を示した。ＩｇＭ抗体２Ｅ１２は、Ｈ５２４、Ｌａｎ１−ＬｕｃおよびＴＣ−７１に対して５μｇ／ｍＬでほぼ１００％の死滅活性を示し、これは、補体媒介性細胞傷害アッセイにおいてＩｇＭ抗体がより有効であることが分かっていたので、予測された。
Figure 2021040636
抗体依存性細胞傷害：ＣＤＣアッセイでは２Ｅ１２の効力が有意に大きかったが、ＩｇＧ抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の死滅に関して重要である抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有することが公知であった。６種の抗ＧＤ２ ＩｇＧ抗体（１Ｂ７、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２、１Ｇ２、２Ｆ７、および３２Ｅ２）を、５種の異なる細胞系統（ＳａＯＳ２、Ｈ５２４、Ｈｓ５７８Ｔ、ＴＣ７１）で試験した。培地のみによる処置を対照として使用した。１Ｂ７、３１Ｆ９、３１Ｆ９Ｖ２および２Ｆ７抗体を特にＴＣ７１細胞系統と共に使用して、高レベルの細胞傷害性が測定された（図２４）。１Ｇ２および３２Ｅ２も、比較的低いレベルではあるが、いくらかの活性を示した。
内部移行アッセイ：抗ＧＤ２抗体の内部移行を、ＧＤ２発現細胞系統であるＨ５２４およびＬａｎ１−ｌｕｃに対するｍＡｂおよびＨｕｍ−ＺＡＰ二次コンジュゲート複合体の細胞傷害活性を測定することによって評価した。複合体が内部移行した細胞は死滅するが、サポリンが内部移行しないことにより細胞は無傷のままになる。培地のみによる処置を対照として使用した。図２５に示されている通り、Ｈ５２４細胞は、１Ｂ７、３１Ｆ９、または３１Ｆ９Ｖ２の存在下で有効に死滅した。同様に、Ｌａｎ１−Ｌｕｃ細胞は、１Ｂ７、１Ｇ２、２Ｈ１２、２Ｆ７、３１Ｆ９、および３２Ｅ２の存在下で有効に死滅した（図２６）。
さらなる内部移行アッセイを、ＰＨ感受性蛍光タグにより内部移行の動態を直接測定するｐＨ感受性細胞内蛍光プローブを使用して実施した。図２７および２８は、Ｈ５２４（ＳＣＬＣ）細胞およびＴＣ−７１（肉腫）細胞への１Ｂ７および３１Ｆ９Ｖ２の内部移行の動態を実証している。示されている通り、有意な量の抗ＧＤ２抗体が、５Ａ７Ｇ３（抗ＧＤ３）および抗Ｆ（ａｂ’）２−ｐＨＡｂのみと比較して、Ｈ５２４（ＳＣＬＣ）腫瘍細胞およびＴＣ−７１（肉腫）腫瘍細胞の両方に内部移行した。
ｉｎ ｖｉｖｏモデル：抗ＧＤ２抗体の抗腫瘍効果を、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいても評価した。図２９は、ヒトＳａＯＳ２（骨肉腫）異種移植片を植え付けたＳＣＩＤマウスの生存を測定した生存モデルの結果を示す。図２９に実証したように、植え付けたマウスのパーセント生存は、マウスにＰＢＳのみを注射した対照群と比較して、３１Ｆ９または１Ｂ７のいずれかによって処置することによって有意に増加した。図３０は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＴＣ−７１（肉腫）異種移植腫瘍の成長を測定した皮下腫瘍モデルの結果を示す。図３０に実証したように、植え付けたマウスにおける腫瘍体積は、マウスにＰＢＳのみを注射した対照群と比較して、３１Ｆ９または１Ｂ７のいずれかによって処置することによって有意に低下した。
従って、上記のデータにより、ヒト抗ＧＤ２ ｍＡｂ処置を使用して、樹立腫瘍を抑制しまたは退縮させ、生存に対する利点をもたらす有意な潜在性が実証される。
本出願全体を通して種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、本発明が関する技術分野の現状をより詳細に説明するためにそれらの全体がこれによって参照により本出願に組み込まれる。本発明は上に提供した実施例を参照して説明されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるべきである。
例えば、本発明の実施形態において以下の項目が提供される。
（項目１）
ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
前記ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；
前記ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；
前記ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
（項目２）
前記ＶＨドメインが、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、項目１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目３）
配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む抗体重鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目４）
前記ＶＨドメインアミノ酸配列が、配列番号１；配列番号５；配列番号９；配列番号１３；配列番号１７；配列番号２１；配列番号２５；配列番号２９；配列番号３３；配列番号３５；および配列番号３９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目５）
ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；
前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、
前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。
（項目６）
前記ＶＬドメインが、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、項目５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目７）
配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む抗体軽鎖またはその機能性断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
（項目８）
前記ＶＬドメインアミノ酸配列が、配列番号３；配列番号７；配列番号１１；配列番号１５；配列番号１９；配列番号２３；配列番号２７；配列番号３１；配列番号３７；および配列番号４１からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、項目７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目９）
ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含み、
前記ＶＨ ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２の残基２６〜３３；配列番号６の残基２６〜３３；配列番号１０の残基２６〜３３；配列番号１４の残基２６〜３３；配列番号１８の残基２６〜３３；配列番号２２の残基２６〜３３；配列番号２６の残基２６〜３３；配列番号３０の残基２６〜３３；配列番号３４の残基２６〜３３；配列番号３６の残基２６〜３３；および配列番号４０の残基２６〜３３からなる群から選択され；
前記ＶＨ ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２の残基５１〜５８；配列番号６の残基５１〜５８；配列番号１０の残基５１〜５８；配列番号１４の残基５１〜５８；配列番号１８の残基５１〜５８；配列番号２２の残基５１〜５８；配列番号２６の残基５１〜５８；配列番号３０の残基５１〜５８；配列番号３４の残基５１〜５８；配列番号３６の残基５１〜５８；および配列番号４０の残基５１〜５８からなる群から選択され；
前記ＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２の残基９７〜１０９；配列番号６の残基９７〜１０９；配列番号１０の残基９７〜１０８；配列番号１４の残基９７〜１０８；配列番号１８の残基９７〜１０８；配列番号２２の残基９７〜１０８；配列番号２６の残基９７〜１０９；配列番号３０の残基９７〜１０９；配列番号３４の残基９７〜１１０；配列番号３６の残基９７〜１１０；および配列番号４０の残基９７〜１０８からなる群から選択される、
抗体またはその機能性断片。
（項目１０）
前記ＶＨドメインが、配列番号２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号１０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号１８の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２２の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８；配列番号２６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０９；配列番号３４の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；配列番号３６の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１１０；ならびに配列番号４０の残基２６〜３３、残基５１〜５８、および残基９７〜１０８からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、項目９に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１１）
ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖（ＶＨ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片。
（項目１２）
ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、
前記ＶＬ ＣＤＲ１は、配列番号４の残基２７〜３７；配列番号８の残基２７〜３７；配列番号１２の残基２７〜３８；配列番号１６の残基２７〜３８；配列番号２０の残基２７〜３８；配列番号２４の残基２７〜３８；配列番号２８の残基２７〜３７；配列番号３２の残基２７〜３７；配列番号３８の残基２７〜３２；および配列番号４２の残基２７〜３８からなる群から選択され；
前記ＶＬ ＣＤＲ２は、配列番号４の残基５５〜５７；配列番号８の残基５５〜５７；配列番号１２の残基５６〜５８；配列番号１６の残基５６〜５８；配列番号２０の残基５６〜５８；配列番号２４の残基５６〜５８；配列番号２８の残基５５〜５７；配列番号３２の残基５５〜５７；配列番号３８の残基５０〜５２；および配列番号４２の残基５６〜５８からなる群から選択され、
前記ＶＬ ＣＤＲ３は、配列番号４の残基９４〜１０２；配列番号８の残基９４〜１０２；配列番号１２の残基９５〜１０３；配列番号１６の残基９５〜１０３；配列番号２０の残基９５〜１０３；配列番号２４の残基９５〜１０３；配列番号２８の残基９４〜１０２；配列番号３２の残基９４〜１０２；配列番号３８の残基８９〜９７；および配列番号４２の残基９５〜１０３からなる群から選択される、
抗体またはその機能性断片。
（項目１３）
前記ＶＬドメインが、配列番号４の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号１２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号１６の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２０の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２４の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３；配列番号２８の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３２の残基２７〜３７、残基５５〜５７、および残基９４〜１０２；配列番号３８の残基２７〜３２、残基５０〜５２、および残基８９〜９７；ならびに配列番号４２の残基２７〜３８、残基５６〜５８、および残基９５〜１０３からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、項目１２に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１４）
ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む、抗体またはその機能性断片。
（項目１５）
ＧＤ２に結合する単離された抗体またはその機能性断片であって、可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含み、
前記ＶＨは、配列番号２；配列番号６；配列番号１０；配列番号１４；配列番号１８；配列番号２２；配列番号２６；配列番号３０；配列番号３４；配列番号３６；および配列番号４０からなる群から選択され；
前記ＶＬは、配列番号４；配列番号８；配列番号１２；配列番号１６；配列番号２０；配列番号２４；配列番号２８；配列番号３２；配列番号３８；および配列番号４２からなる群から選択される、
抗体またはその機能性断片。
（項目１６）
前記ＶＨドメインおよび前記ＶＬドメインが、それぞれ、配列番号２および配列番号４；配列番号６および配列番号８；配列番号１０および配列番号１２；配列番号１４および配列番号１６；配列番号１８および配列番号２０；配列番号２２および配列番号２４；配列番号２６および配列番号２８；配列番号３０および配列番号３２；配列番号３４および配列番号３８；配列番号３６および配列番号３８；ならびに配列番号４０および配列番号４２からなる群からのアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１７）
前記抗体がヒト抗体である、項目９から１６までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能断片。
（項目１８）
前記抗体機能性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦＶ、ダイアボディ、トリアボディ、ミニボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）からなる群から選択される、項目９から１６までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目１９）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目９から１６までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目２０）
前記抗体がＩｇＧまたはＩｇＭ同位元素である、項目９から１６までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目２１）
前記ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１サブクラスである、項目２０に記載の単離された抗体またはその機能性断片。
（項目２２）
診断剤、検出可能な薬剤または治療剤とコンジュゲートしているか、または組換えによって融合している、項目９から１６までのいずれか一項に記載の単離された抗体またはその機能性断片を含むコンジュゲート。
（項目２３）
検出可能な薬剤を含む、項目２２に記載のコンジュゲート。
（項目２４）
腫瘍の検出を必要とする対象における腫瘍を検出するための方法であって、前記対象に項目２３に記載のコンジュゲートの有効量を投与するステップを含む方法。
（項目２５）
項目９から１６までのいずれか一項に記載の抗体またはその機能性断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目２６）
疾患を治療または予防するための方法であって、疾患の治療または予防を必要とする対象に項目２５に記載の医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法。
（項目２７）
前記疾患ががんまたは腫瘍形成であり、前記がんまたは前記腫瘍の細胞がＧＤ２を発現する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記がんまたは前記腫瘍が、神経芽腫、骨肉腫および肉腫の他のサブセット、メラノーマ、神経膠腫、小細胞肺がん、乳がん、髄芽腫ならびに星細胞腫からなる群から選択される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記乳がんが、乳がん幹細胞を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
第２の治療剤を同時にまたは順次投与するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記第２の治療剤が化学療法剤または免疫療法剤である、項目３０に記載の方法。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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