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CN102803292A - 蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法 - Google Patents

蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法 Download PDF

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CN102803292A
CN102803292A CN2010800273865A CN201080027386A CN102803292A CN 102803292 A CN102803292 A CN 102803292A CN 2010800273865 A CN2010800273865 A CN 2010800273865A CN 201080027386 A CN201080027386 A CN 201080027386A CN 102803292 A CN102803292 A CN 102803292A
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S·罗
D·L·鲁布尔
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Abstract

本发明涉及用于控制蛋白质的糖基化的新方法和由此产生的蛋白质。本发明的示例性方法包括通过在糖基化抑制剂存在的情况下培养表达所述蛋白质的宿主细胞来产生包含降低的糖基化水平的蛋白质，例如，所述蛋白质在糖基化位点包含较少聚糖或较少糖。在本发明的示例性方法中，降低的糖基化水平改变所述蛋白质的生物学特征，例如，改变了所述蛋白质与其靶配体的结合。

Description

蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年4月20日提交的美国临时专利申请第61/170,897号的优先权，其整体援引加入本文。
发明背景
本发明涉及用于控制蛋白质糖基化的方法及其相关组合物和方法。本发明进一步涉及减少糖蛋白的糖基化和/或聚糖位点占据率(occupancy)从而影响它们的生物学特征和/或功能的方法。本发明还涉及利用本发明的方法以控制糖基化而制备的组合物及其用途。
蛋白质和多肽已成为越来越重要的治疗剂。在大多数情况下，这些蛋白质和多肽在细胞培养中产生，来自被改造和/或选择以产生异常高水平的所关注的特定蛋白质或多肽的细胞。细胞培养条件的控制和优化对于成功的蛋白质和多肽的商业化生产是极为重要的。
许多在细胞培养中产生的蛋白质和多肽为糖蛋白，其含有包括寡糖链在内的共价连接的糖结构。这些寡糖链在内质网和高尔基体中通过N-键或O-键连接至蛋白质。寡糖链可以包含糖蛋白质量的显著部分。寡糖链被认为在糖蛋白的功能中起着关键作用，包括促进糖蛋白的正确折叠，介导蛋白-蛋白相互作用，赋予稳定性，赋予有利的药效和/或药物动力学特性，抑制蛋白质水解消化，将糖蛋白靶向适当的分泌途径以及将糖蛋白靶向特定器官或多个器官。
一般，在内质网腔中将N-连接寡糖链添加至新生的易位蛋白(参见Alberts et al.，1994，In：Molecular Biology of the Cell，其援引加入本文)。寡糖被添加至在靶共有序列Asn-X-Ser/Thr内含有的天冬酰胺残基的侧链上的氨基，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。通常在内质网中通过的特异性糖苷酶修剪初始寡糖链，导致由2个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖残基组成的短的分枝核心寡糖。
在内质网中的初始加工之后，糖蛋白通过小泡穿梭至高尔基体，在这里寡糖链进行进一步加工，然后分泌至细胞表面。可以通过添加几个甘露糖残基来修饰修剪的N-连接寡糖链，导致高甘露糖寡糖。可选地，可以将一个或多个单糖单位的N-乙酰葡糖胺添加至核心甘露糖亚基以形成复杂寡糖(complex oligosaccharide)。可以将半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺亚基，并且可以将唾液酸亚基添加至半乳糖亚基，导致以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基终止的链。此外，可以将岩藻糖残基添加至核心寡糖的N-乙酰葡糖胺残基。通过特异性糖基转移酶催化这些添加中的每一种。
除了通过N-连接糖基化途径修饰糖蛋白，当它们在高尔基体中加工时还可以通过将O-连接寡糖链添加至特定丝氨酸或苏氨酸残基来修饰糖蛋白。一次添加一个O-连接寡糖残基，并且通过特异性酶催化每个残基的添加。与N-连接糖基化相比，O-连接糖基化的共有氨基酸序列较少明确定义。
据证实，蛋白质特别是免疫球蛋白的糖基化对其生物学功能具有显著影响。例如，对于免疫球蛋白，已证实糖基化影响效应子功能、结构稳定性和抗体产生细胞的分泌率(Leatherbarrow et al.，1985，Mol.Immunol.22：407)。负责这些特性的糖基一般连接至抗体的恒定(C)区。例如，IgG激活补体依赖性细胞溶解的经典途径的完全能力需要在CH2结构域中的天冬酰胺297处的IgG的糖基化(Tao and Morrison，1989，J.Immunol.143：2595)。在CH3结构域中的天冬酰胺402处的IgM的糖基化是抗体的正确装配和细胞溶解活性所必需的(Muraoka and Shulman，1989，J.Immunol.142：695)。去除诸如IgA抗体的CH1和CH3结构域中的位置162和419的糖基化位点导致胞内降解和抑制至少90％的分泌(Taylor and Wall，1988，Mol.Cell.Biol.8：4197)。
还观察到在包含抗原结合位点的可变(V)区中的免疫球蛋白的糖基化。Sox和Hood(1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66：975)报道约20％的人抗体在V区中是糖基化的。据信V结构域的糖基化是由V区序列中N-连接糖基化信号Asn-Xaa-Ser/Thr的偶然出现所引起的，并且本领域不认为其在免疫球蛋白功能中发挥重要作用。
最近，已证实α-(1-6)葡聚糖特异性小鼠抗体的抗原结合位点中在重链的CDR2处的糖基化增加其对葡聚糖的亲和力(Wallick et al.，1988，J.Exp.Med.168：1099；and Wright et al.，1991，EMBO J.10：2717)。还已证实去除抗CD33抗体的抗原结合位点内的糖基化位点的突变，更具体地，抗体M195的V结构域的框架区内的N-连接糖基化位点的去除增强抗体与抗原结合(Co等人的美国专利第6,350,861号)。然而，未去除存在于抗体的Fc部分中的N-连接糖基化位点，并且优选将其糖基化以维持分子的效应子功能。
此外，已将糖酵解抑制物质加入细胞培养基以减少代谢废物乳酸的积累，从而增加细胞活力和抗体的蛋白质生产。参见，例如，国际专利申请第PCT/US2007/083473号，其现在公开为2008年5月8日的WO2008/055260(将糖酵解抑制化合物加入细胞培养物会减少乳酸浓度并增加生长分化因子8(GDF-8)特异性抗体的产生)。虽然糖酵解抑制还可以影响蛋白质糖基化的水平，但是未评价甚至讨论抑制剂对蛋白质糖基化的影响。而且，细胞培养所产生的抗GDF-8抗体在抗原结合位点中不包含任何潜在的糖基化位点(参见WO 2008/055260第49页第170段，引用Veldman等，美国专利公开第2004/0142382号，描述抗GDF-8抗体Myo22、Myo28和Myo29)。因此，即使假设在重链恒定结构域的抗GDF-8抗体的糖基化在所公开的培养条件下被影响，无法评价抗原结合位点的改变的糖基化的影响，因为看来所产生的抗体在抗原结合区(例如，V结构域)缺少潜在的糖基化位点。
蛋白治疗剂的主要问题是对配体或抗原的降低的亲和力或低亲和力。丧失或降低的亲和力是高度不期望的，并且需要将更多的治疗性蛋白质注射入患者，成本更高并且副作用的风险更大。甚至更严重地，亲和力降低的蛋白质可能具有降低的生物学功能，如补体溶解、抗体依赖性细胞毒性和病毒中和。此外，与企图抑制其相互作用的内源性配体或结合伙伴相比减少的抗原或结合伙伴与治疗性蛋白质之间的竞争使得所述蛋白质可能具有降低的拮抗物功能。例如，在部分人源化抗体HUVHCAMP中亲和力的丧失可以导致其丧失所有介导补体溶解的能力(参见，Riechmann et al.，1988，Nature，332，323-327，表1)。
此外，考虑到蛋白质构象的不可预测性，甚至单个氨基酸的突变，特别是在蛋白质的抗原结合位点或配体结合位点的单个氨基酸的突变可以对潜在的治疗性蛋白质的生物学活性具有剧烈影响。
因此，本领域需要治疗性蛋白质，其具有改变的对配体的亲和力，或者在抗体的情况下，其具有改变的对抗原的亲和力，特别是对抗原或配体的增加的亲和力和/或增加的特异性，以及期望的潜在的由天然存在的恒定区糖基化所赋予的较低的免疫原性和提高的效应子功能。可选地，需要治疗性蛋白质，特别是包含免疫球蛋白恒定区的抗体或Fc融合蛋白，或者其部分，其具有提高的对抗原或配体的结合亲和力和/或特异性，但是存在于抗体重链恒定区中的糖基化位点的糖基化所介导的效应子功能下降或者没有效应子功能。还需要抑制或去除治疗性蛋白质的抗原或配体结合位点的糖基化，而不需要将任何突变引入所述抗原或配体结合位点的氨基酸序列。因此，本领域需要增加效力以及减少免疫球蛋白和其他治疗重要性蛋白质所需的剂量的方法，并且需要通过这样的方法所产生的治疗性蛋白质，本发明满足这些需要而不要求将任何突变引入抗体的抗原结合位点或治疗性蛋白质的配体结合位点。
尽管存在治疗性糖蛋白的重要性和细胞培养方法的进步，对于在可以控制配体结合位点的糖基化的条件下产生这样的蛋白质而不要求将氨基酸突变引入这样重要的蛋白质部分的新方法仍有未满足的需要。本发明满足这种需要。
发明概述
本发明包括用于降低蛋白质的糖基化水平的方法。所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平。
在一方面，所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中。
在另一方面，所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度。
在另一方面，所述糖基化位点选自O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点。
在另一方面，所述糖基化位点为N-连接糖基化位点，并且进一步地，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。
在另一方面，所述糖基化抑制剂为选自以下抑制剂中的至少一种：衣霉素、衣霉素(tunicaymycin)同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素(duimycin)、1-脱氧甘露糖野尻霉素(1-deoxymannonojirimycin)、脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖类似物、甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆甾醇、羟基胆甾醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(m-Chlorocarbonyl-cyanide phenylhydrazone，CCCP)、密实菌素、多萜长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖(dolichyl-phosphoryl-2-deoxyglucose)、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤(hygoxanthine)、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇(bromoconduritol)、环己烯四醇环氧化物(conduritol epoxide)、环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯(glycosylmethyl-p-nitrophenyltriazene)、β-羟基正缬氨酸、苏型β-氟代天冬酰胺、D-(+)-葡糖酸δ-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-(二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和氟乙酸酯。
在另一方面，所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖。
在另一方面，所述糖基化抑制量的范围为约0.5g/L-3g/L。
在另一方面，所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0.05g/L-10g/L的量。
在另一方面，所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在另一方面，所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、NS0/1、Sp2/0、人细胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5和FS4。
在另一方面，所述宿主细胞为CHO细胞。
在另一方面，所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点。
本发明涵盖根据用于降低蛋白质的糖基化水平的方法所产生的蛋白质，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平，其中所述糖基化位点为配体结合位点或抗原结合位点，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度，其中所述糖基化位点选自O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点，其中所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖，所述糖基化抑制量的范围为约0.5g/L-3g/L，所述方法包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0.05g/L-10g/L的量，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
在一方面，所述哺乳动物细胞为CHO细胞，并且天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)。
在另一方面，所述蛋白质为抗体或其抗原结合部分，并且进一步地，其中所述抗体为抗人IgE抗体。
在另一方面，所述抗体为人抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在另一方面，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的抗体相比，所述抗体包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点选自重链相对于SEQ ID NO：8的氨基酸序列的天冬酰胺73(N73)处的糖基化位点和天冬酰胺301(N301)处的糖基化位点。
在另一方面，所述抗体包含未被占据的在天冬酰胺73处的N-连接糖基化位点。
在另一方面，所述蛋白质包含晚期糖基化终产物受体(RAGE)的配体结合位点(LBS)，所述配体结合位点包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
在另一方面，所述蛋白质为RAGE融合蛋白，其包含没有信号序列的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述信号序列包含氨基酸残基1至氨基酸残基23号，其中所述融合蛋白缺少末端赖氨酸残基(Lys438)。
在另一方面，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点为选自在2号氨基酸残基(N2)处的天冬酰胺、在58号氨基酸残基(N58)处的天冬酰胺和在288号氨基酸残基(N288)处的天冬酰胺的至少一个位点，全部相对于没有信号序列(氨基酸1至23)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
在一方面，所述蛋白质包含至少两个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
在另一方面，所述蛋白质包含三个N-连接糖基化位点，其中至少一个未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
在另一方面，与在不存在所述抑制剂的情况下产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与抗原的结合。
在另一方面，与在不存在所述抑制剂的情况下产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与RAGE配体的结合。
在一方面，所述方法还包括从范围为约34℃-39℃的温度至范围为约28℃-33℃的温度的温度转换。
在另一方面，所述方法包括从范围为约34℃-37℃的温度至范围为约30.5℃-31.5℃的温度的温度转换。
本发明涉及一种药物组合物，其包含根据用于降低蛋白质的糖基化水平的方法所产生的蛋白质，其中所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平，其中所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点处的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点处的糖基化的程度，其中所述糖基化位点为包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸的N-连接糖基化位点，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖，其中所述糖基化抑制量的范围为约0.5g/L-3g/L，并且所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0.05g/L-10g/L的量，并且其中所述宿主细胞为CHO细胞。
在另一方面，所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一种糖基化位点。
本发明涉及包含一定量的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO：3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配体结合位点和至少一个可以被糖基化的氨基酸残基，其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的CH2结构域或部分CH2结构域以及免疫球蛋白的CH3结构域，并且其中所述免疫球蛋白多肽的N端残基连接至所述RAGE多肽的C端残基；并且其中所述融合蛋白的量的至少0.5％是非糖基化的(aglycosylated)。
在一方面，所述融合蛋白的总量的至少30％是非糖基化的。
在另一方面，完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。
在另一方面，所述融合蛋白包含至少三个可以糖基化的氨基酸残基，其中糖基化的第一潜在位点是所述RAGE配体结合位点的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点是所述RAGE多肽的氨基酸残基，而糖基化的第三潜在位点是所述免疫球蛋白多肽的氨基酸残基。
本发明涉及一种组合物，其包含一种蛋白质，所述蛋白质包含至少一个潜在的糖基化位点，其中完全糖基化的蛋白质的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白质的量，并且还包含药学可接受的载体。
在一方面，所述蛋白质包含两个潜在的糖基化位点，并且其中完全糖基化的蛋白质的量少于包含一个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的加和量和包含两个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的量。
下文描述了本发明的可选实施方案，如采用各种培养条件、糖蛋白以及涉及不同糖基化抑制剂的实施方案。
附图说明
当结合附图阅读时会较好地理解上文的发明概述以及下文的发明详述。为了说明本发明的目的，图中示出了目前优选的实施方案。然而，应当理解本发明不限于示出的具体安排和工具。
图中：
图1为示出sRAGE-Ig融合蛋白的构建的图。示出了晚期糖基化终产物受体(RAGE)与它的三个胞外结构域(V、C1和C2)、跨膜结构域和推测负责RAGE信号传递的胞内结构域。术语“可溶性RAGE”和“sRAGE”所涵盖的可溶性或分泌形式的RAGE显示为缺少跨膜和胞内结构域。sRAGE可以作为诱饵受体，并且在图中其显示为仅RAGE胞外结构域。示出了全长人重链IgG1分子，显示可变结合结构域(VH)与第一恒定结构域CH1一起形成抗体结合片段(Fab)，其通过柔性铰链区连接至IgG1分子的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3)。该图还示出了通过将人RAGE的V和C1结构域连接至IgG1分子的CH2和CH3结构域来构建的有或没有(示出)免疫球蛋白铰链区的sRAGE-Ig融合蛋白。
图2，包括图2A和2B，示出了本发明的sRAGE-Ig融合蛋白的氨基酸和核酸序列。图2A示出了本发明的sRAGE-Ig融合蛋白的氨基酸序列(SEQID NO：1)。sRAGE-Ig蛋白序列包含461个氨基酸，其包括23个氨基酸的信号肽/前导序列，在某些情况下可以为22个氨基酸，在表达期间被切割以产生438个氨基酸的成熟蛋白(或者在N端赖氨酸被剪掉时为437个氨基酸)。为了这个实例的目的，氨基酸残基的编号不包括23个氨基酸的前导序列，从而sRAGE-Ig融合蛋白序列具有在氨基酸1(Q1)处的谷氨酰胺，其可以环化以形成在氨基酸1处的焦谷氨酸(pE)(pE1)。人RAGE序列来源于GenBank登录号NM_001136。在位置N2、N58和N288处的三个下划线的天冬酰胺(N)表示N-连接糖基化的潜在位点。RAGE的V结构域跨越1号氨基酸残基至氨基酸残基E109。RAGE的C1结构域与V结构域的C端序列重叠约10个氨基酸，并且跨越约氨基酸G99至E220。从氨基酸残基195至氨基酸残基198的下划线的氨基酸RALR表示弗林蛋白酶切割的共有序列。在sRAGE的C2结构域的N端的约8个氨基酸残基(PEGGAVAP)与C1结构域的C端序列重叠，从而C1/C2连接处跨越约氨基酸L212至P228。IgG1 Fc的CH2和CH3结构域显示为涵盖约P229至K438，其中末端赖氨酸(K)未被剪掉。在示出的实施方案中，所述融合蛋白不包含完整的人IgG1铰链结构域。在另一实施方案中，所述融合蛋白可以包含铰链或其任何部分，包括其中铰链如果存在时可以被修饰，以便例如改变与未修饰的铰链区相关的任何效应子功能。图2B示出了编码包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的sRAGE-Ig融合蛋白的核酸序列(SEQ ID NO：2)。以粗体突出的编码序列1-753编码RAGE N端蛋白序列，而序列754-1386编码无铰链区的人IgG Fc(γ1)蛋白序列。
图3为sRAGE-Ig融合蛋白的SDS-PAGE分析的图，其证实用PNGaseF和弗林蛋白酶消化的效果。通过mabselect纯化在摇瓶培养中生长的细胞中表达的sRAGE-Ig融合蛋白，并且用PNGaseF或弗林蛋白酶进行消化，然后在还原4-12％梯度Bis-Tris凝胶上分析。每条泳道含有2.7μg的蛋白质。以Kd表示的分子量在左侧示出。泳道1和6含有未处理的融合蛋白。泳道2含有单独与PNGaseF消化缓冲液孵育的融合蛋白。泳道3含有用PNGaseF消化的融合蛋白。泳道4含有单独与弗林蛋白酶消化缓冲液孵育的融合蛋白。泳道5含有用弗林蛋白酶消化的融合蛋白。FLM＝全长单体。
图4示出了通过尺寸排阻层析(SEC)分析sRAGE-Ig融合蛋白的结果。在流动相(350mM柠檬酸盐，pH 6.0)中将纯化的sRAGE-Ig融合蛋白稀释至3mg/mL，并且通过尺寸排阻层析(SEC)分析，利用SuperdexTM 20010/300GL柱、环境温度、0.75mL/分钟流速、20μL注射体积和40分钟运行时间，在280nm监测。SEC使得能够用左上角的插图所示出的峰结果相对定量同源二聚体、异源二聚体、Fc二聚体和高分子量类型(species)。
图5示出了反相-HPLC的结果，其示出了sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位点占据谱。叠加的层析谱为sRAGE-Ig融合蛋白(S1)和分级样品(S1F1、S1F2和S1F3)的FLM。级分S1F3的浓度非常低，因此其未被包括在随后的ELISA结合测定中。右上角的插图示出了每种聚糖的大约含量，为每个样品/级分的百分率。
图6为示出图5所示的峰S1F1和S1F2通过质谱分析法的峰性质确认的图。质谱数据鉴定峰S1F1为3-聚糖类型，而S1F2为2-聚糖类型。
图7为示出从sRAGE-Ig融合释放的N-连接聚糖的正相HPLC分析与层析谱上所示的峰的鉴定图。各种类型的相对丰度如表1所示。
图8为示出sRAGE-Ig的胰蛋白酶消化的反相分离结果的图。插图示出了N-连接胰蛋白酶消化肽段洗脱的区域。
图9示出了含有共有N-连接糖基化位点的胰蛋白酶消化肽段的鉴定与理论单一同位素分子量。该图示出了来自用胰蛋白酶消化的sRAGE-Ig融合蛋白的三种预测的胰蛋白酶消化糖肽的氨基酸序列，并且示出了每种胰蛋白酶消化物(digest)的理论单一同位素分子量。所述胰蛋白酶消化糖肽如下：具有约638.36Da质量的T1pE(pENITAR)；具有约2241.22Da分子量的T10(VLPNGSLFLPAVGIQDEGIFR)；以及具有约1188.50Da分子量的T31(EEQYNSTYR)。
图10为示出反相-HPLC的图，其示出了在存在衣霉素的情况下表达的sRAGE-Ig融合蛋白的聚糖位点占据谱。叠加的层析谱为来自衣霉素处理的细胞的sRAGE-Ig融合蛋白(S2)和三个级分样品(S2F1、S2F1和S2F3)。右上角的插图示出了每个样品或其级分中每种聚糖的相对百分率。
图11为示出图10所示的峰S2F1、S2F2和S2F3通过质谱分析法的峰鉴定的确认图。质谱数据鉴定峰S2F1为3-聚糖类型，S2F2为2-聚糖类型，而S2F3为0-聚糖类型。
图12为示出典型存在于免疫球蛋白重链恒定区中的示例性二触角糖形的图。根据本发明，“G0”指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的二触角结构，“G1”指具有一个Gal而无NeuAc的二触角结构，并且“G2”指具有两个末端Gal而无NeuAc的二触角结构。
图13，包括图13A至13D，示出了抗IgE抗体5.948.1的重链和轻链的序列。图13A示出了mAb 5.948.1重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。可变结构域以小写字母显示，而恒定结构域以大写字母显示。互补决定区(CDR)有下划线，并且重链可变区中在框架3的天冬酰胺73处的潜在N-连接糖基化位点以大写字母显示(“NTS”)。在重链恒定结构域中的N-连接糖基化位点(“NST”)Asn301有下划线。图13B示出了编码mAb 5.948.1的重链的核酸序列(SEQ ID NO：9)。图13C示出了mAb 5.948.1轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。可变结构域以小写字母显示，而恒定结构域以大写字母显示。互补决定区(CDR)有下划线。图13D示出了编码mAb 5.948.1的轻链的核酸序列(SEQ ID NO：11)。
图14为示出抗体5.948.1的重链的4种可能的聚糖位点占据变体的图。从左至右，该图示出了在Asn73或Asn301不包含聚糖的0-聚糖占据变体；仅在Asn301包含一个聚糖的1-聚糖占据变体；仅在Asn73包含一个聚糖的1-聚糖占据变体；以及在Asn73和Asn301均包含聚糖的完全占据的2-聚糖占据位点变体。
图15为示出抗体5.948的聚糖谱的图。重链被解析为3个峰，显示2-聚糖和1-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示完全糖基化的2-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约98％，而1-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约2％。
图16为示出单克隆抗体5.948.1(mAb 5.948.1)与用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5.948.1抗体的样品和利用SDS和BME变性的样品一起的聚糖谱的图。如先前所见到的(图15，见上文)，天然5.948.1抗体的重链解析为3个主峰，显示2-聚糖和1-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。天然去糖基化的5.948.1抗体的重链显示出主要含有1-聚糖类型与一些0-聚糖类型的谱。变性去糖基化的5.948.1抗体的重链显示出主要含有0-聚糖类型的谱。
图17为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的抗体5.948.1的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(样品7；S7)。重链被解析为3个峰，显示2-聚糖和1-聚糖变体。未检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示完全糖基化的2-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约98％，而1-聚糖占据重链包含在对照培养条件下产生的总重链的约2％。
图18为示出在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的抗体5.948.1的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(样品11；S11)。重链被解析为3个峰，显示2-聚糖和1-聚糖。很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。
图19为谱叠加的图，其比较在对照条件下(在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的mAb 5.948.1的聚糖谱和在糖基化控制条件下(即，在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下)产生的mAb 5.948.1的聚糖谱，其中在第14天从每种培养物采集样品(分别为S7和S11)。重链被解析为4个峰，显示2-聚糖、1-聚糖和0-聚糖变体。仅在S11中很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示与其中1-聚糖变体主要由Fc变体组成的对照样品(S7)相比，在2-脱氧-D-葡萄糖样品(S11)中1-聚糖Fab变体重链相对于1-聚糖Fc变体大大增加。
图20，包括图20A和20B，为详细的谱比较图，其比较在存在和不存在糖基化抑制剂的情况下产生的抗体5.948.1的聚糖谱。图20A为示出在对照条件下(在糖基化抑制剂不存在的情况下)产生的mAb 5.948.1的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(S7)。图20B为示出在存在2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的mAb 5.948.1的聚糖谱的图，其中在第14天从培养物采集样品(S11)。图20A和图20B的比较显示仅在S11中很容易检测到0-聚糖占据变体。可以将1-聚糖占据峰进一步解析以鉴定在Fc区中糖基化的变体(更普遍)和在抗体重链的Fab区中糖基化的变体。数据显示与其中1-聚糖变体主要由Fc变体组成的对照样品(S7；图20A)相比，在2-脱氧-D-葡萄糖样品(S11；图20B)中1-聚糖Fab变体重链相对于1-聚糖Fc变体大大增加。
图21为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下)产生的mAb 5.948.1在该方法的时间进程中的聚糖谱的图。该图示出了3条曲线，显示在培养的第7天(S5)、第12天(S6)和第14天(S7)采集的样品的聚糖谱。数据显示与在Fab位点(Asn73)糖基化的1-聚糖重链的量相比，在该蛋白质的Fc区(Asn301)糖基化的1-聚糖重链的相对量随时间增加。数据还证实在任何时间采集的任何样品中未检测到0-聚糖重链。
图22为示出在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的mAb 5.948.1在该方法的时间进程中的聚糖谱的图。该图示出了3条曲线，显示在培养的第7天(S9)、第12天(S10)和第14天(S11)采集的样品的聚糖谱。数据显示与2-聚糖重链蛋白的量相比，1-聚糖重链蛋白的相对量随时间增加。此外，数据显示与在Fc位点(Asn301)糖基化的1-聚糖重链的量相比，在该蛋白质的Fab区(Asn73)糖基化的1-聚糖重链蛋白随时间增加。这与在对照样品中观察到的相反，对照样品中在培养期间Fc 1-聚糖相对于Fab 1-聚糖增加。数据还证实在糖基化抑制条件下0-聚糖重链的产生随时间增加。
图23为示出在对照条件下(即，在不存在糖基化抑制剂的情况下)产生的天然抗体5.948.1(mAb 5.948.1)与等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5.948.1抗体样品和利用SDS和BME变性的样品一起的聚糖谱的图，其中在培养的第14天采集样品(S7)。如先前所见到的，天然5.948.1抗体的重链解析为3个主峰，显示2-聚糖和1-聚糖变体。在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖不存在的情况下，未检测到这个样品的0-聚糖占据变体。
图24为示出与等量的用乙二醇-N-聚糖酶去糖基化的5.948.1抗体样品(—●—)和利用SDS和BME变性的样品(---)相比的在存在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的情况下产生的天然抗体5.948.1(mAb 5.948.1)(实线)的聚糖谱的图，其中在培养的第14天采集样品(S7)。天然5.948.1抗体的重链解析为4个峰，显示2-聚糖、1-聚糖和0-聚糖变体。很容易检测到这个样品的0-聚糖占据变体，并且进一步证实了在糖基化抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖存在的情况下0-聚糖重链的产生。
发明详述
除非本文另有定义，用于本发明的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。一般，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交所用的命名及其技术是本领域众所周知和常用的。
除非另有说明，一般根据本领域众所周知的方法并如本说明书所引用和讨论的各种普遍和更具体的参考文献所述进行本发明的方法和技术。这类参考文献包括，例如，Sambrook and Russell，2001，In：Molecular Cloning，A Laboratory Approach，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel et al.，2002，In：Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；和Harlow and Lane，1990，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，其援引加入本文。如本领域通常所完成的或如本文所述，根据制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术。本文所述的分析化学、有机合成化学、细胞和分子生物学、免疫学以及医药化学所用的命名及其实验室方法和技术是本领域众所周知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
定义
如本文所用，在这个部分中以下术语中的每个具有与其相关的意思。
在本文中冠词“一个(a)”和“一个(an)”用于指一个或超过一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。例如，“一个元素”表示一个元素或超过一个元素。
如本文所用，20个常规氨基酸及其缩写按照常规用法。参见Immunology--A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其援引加入本文。
如本文所用，通过其全名、其相应的三字母代码或其相应的单字母代码来表示氨基酸，如下表所示：
Figure BPA00001481727800151
Figure BPA00001481727800161
“保守性氨基酸取代”是这样的取代，其中氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基团的另一氨基酸残基取代。一般来说，保守性氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。在两个或两个以上氨基酸序列互相的不同之处在于保守性取代的情况下，可以将序列相同性百分比或相似性程度上调以校正该取代的保守性。进行这种调整的方法为本领域技术人员众所周知。参见，例如，Pearson，1994，Methods Mol.Biol.243：307-31)。
具有化学特性相似的侧链的氨基酸组的实例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含有硫的侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可选地，保守性置换是在Gonnet et al.，1992，Science 256：1443-1445(其援引加入本文)所公开的PAM250log-似然矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”置换是在PAM250log-似然矩阵中具有非负值的任何变化。
优选的氨基酸取代为这样的取代：(1)减少对蛋白质水解的敏感性，(2)减少对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，以及(4)赋予或修饰这样的类似物的其他物理化学和功能特性。包含取代、缺失、和/或插入的类似物可以包括具有除特定肽序列之外的序列的各种突变蛋白质。例如，可以在特定序列中(优选在形成分子间接触的结构域之外的多肽的部分中，例如，在CDR之外)产生单个或多个氨基酸取代(优选保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代应当基本上不改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应当倾向于打开存在于亲本序列中的螺旋，或者破坏表征亲本序列的其他类型的二级结构)。本领域公知的多肽二级和三级结构的实例如Proteins，Structures and Molecular Principles(Creighton，Ed.，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze，eds.，Garland Publishing，New York，N.Y.(1991))；和Thornton et al.，1991，Nature 354：105)所述，各自援引加入本文。
通常利用序列分析软件测量多肽的序列相似性。蛋白质分析软件利用相似性的测量来匹配相似序列，所述相似性测量归因于各种取代、缺失和其他修饰，包括保守性氨基酸取代。例如，Genetics Computer Group(可从Genetics Computer Group，Inc.获得的GCG)，也被称为Wisconsin Package，是超过130个程序的集成软件包，用于访问、分析和操作核苷酸和蛋白质序列。GCG含有诸如“Gap”和“Bestfit”的程序，其可以用于用缺省参数确定密切相关的多肽之间或者野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列相似性、同源性和/或序列相同性，所述密切相关的多肽如来自生物的不同物种的同源蛋白质。参见，例如，GCG版本6.1、版本7.0、版本9.1和版本10.0。
还可以利用GCG中的程序FASTA比较多肽序列，利用缺省或推荐参数。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列相同性百分比(Pearson，1990，Methods Enzymol.183：63-98；Pearson，2000，Methods Mol.Biol.132：185-219)。当本发明的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选算法为计算机程序BLAST，特别是blastp或tblastn，利用缺省参数。参见，例如，Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul et al.，1997，NucleicAcids Res.25：3389-402；其援引加入本文。
本文使用常规表示法描述多肽序列：多肽序列的左端为氨基端；多肽序列的右端为羧基端。
完整“抗体”包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。一般参见，Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.，1989，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.)(为了所有目的其整体援引加入本文)。每条重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可以将VH和VL区进一步细分为高变区，其被称为互补决定区(CDR)，散布在更保守的、被称为框架区(FR)的区域中。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。按照Kabat，1987and 1991，In：Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)或Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia et al.，1989，Nature 342：878-883的界定将氨基酸分配至每个结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。在轻链和重链内，通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接可变区和恒定区，而重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。一般参见，Fundamental Immunology Ch.7(Paul，W.，ed.，2nd ed.Raven Press，N.Y.(1989))。
本文所用的术语“配体结合位点”指与另一分子特异性结合的多肽或蛋白质的部分，或者其片段，所述另一分子也被称为结合伙伴或关联配体(cognate ligand)。优选地，配体结合位点(“LBS”)可以但不必须包含至少一个聚糖位点(在本文中也被称为“潜在的糖基化位点”)，所述聚糖位点可以但不必须被糖部分占据。配体结合位点的实例为RAGE的配体结合位点，其在2号氨基酸残基天冬酰胺(Asn2或N2)处包含聚糖位点，并且在N58处还包含第二聚糖位点，其中LBS与RAGE配体特异性结合，所述RAGE配体包括但不限于淀粉状蛋白β(Aβ)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、S100、羧甲基赖氨酸(CML)、两性蛋白和CD11b/CD18。
在本文中可互换使用的术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合至抗原(例如，IgE)的能力。据证实抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合位点”之内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过在铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Wardet al.，1989，Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由不同基因编码，但是可以利用重组方法通过合成接头将它们连接，所述合成接头使它们能够作为单个蛋白链，其中VL和VH配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；参见，例如，Bird et al.，1988，Science 242：423-426；和Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。这样的单链抗体也涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”之内。诸如双抗体(diabody)的其他形式的单链抗体也涵盖在内。双抗体为二价、双特异性抗体，其中在单个多肽链上表达VH和VL结构域，但是利用接头，所述接头太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对，从而强迫所述结构域与另一条链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak et al.，1994，Structure 2：1121-1123)。
此外，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的部分，所述免疫粘附分子是通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价连接来形成的。这类免疫粘附分子的实例包括用链霉亲和素核心区产生四聚体scFv分子(Kipriyanov et al.，1995，Human Antibodies andHybridomas 6：93-101)以及用半胱氨酸残基、标记物肽和C端多聚组氨酸标签产生二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov et al.，1994，Mol.Immunol.31：1047-1058)。其他实例包括其中将来自一个抗体的一个或多个CDR共价或非共价并入分子以使其成为特异性结合至诸如IgE的所关注的抗原的免疫粘附素。在这样的实施方案中，CDR可以作为较大的多肽链的部分并入，可以共价连接至另一多肽链，或者可以非共价并入。可以利用常规技术从整个抗体制备诸如Fab和F(ab′)2片段的抗体部分，例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整个抗体。此外，如本文所述，可以利用标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。
当在本文中提到关于本发明的“抗体”时，应当理解还可以使用其抗原结合部分。抗原结合部分与完整抗体竞争特异性结合。一般参见，Paul.W.，ed.，1989，In：Fundamental Immunology，Ch.7(2nd ed.，Raven Press，N.Y.)(为了所有目的其整体援引加入本文)。可以通过重组DNA技术或者通过完整抗体的酶促或化学切割来产生抗原结合部分。在一些实施方案中，“抗原结合部分”包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、dAb以及互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体和多肽，所述多肽至少含有抗体的部分，其足以赋予该多肽特异性抗原结合。在具有一个或多个结合位点的实施方案中，所述结合位点可以互相相同或者可以不同。
本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”或“全人抗体”包括具有可变区的抗体，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系(germline)免疫球蛋白序列。而且，如果所述抗体含有恒定区，该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体或其抗原结合部分可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不包括这样的抗体，其中来源于诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列被移植至人框架序列。
术语“人单克隆抗体”或“全人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。在一实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括获得自诸如转基因小鼠的转基因非人动物的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，其中将所述B细胞融合至永生化细胞。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，如(a)从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体(transchromosomal)的动物(例如，小鼠)或由此制备的杂交瘤(下文进一步描述)分离的抗体；(b)从转化以表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离；(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体具有可变区，在所述可变区中框架和CDR区均来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，可以使这类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但是可以在体内人抗体种系库(repertoire)内不天然存在。
如本文所用，“同种型”或“种类”指重链恒定区基因所编码的抗体种类(例如，IgM或IgG)。虽然抗体的恒定结构域不涉及结合至抗原，但是其表现出各种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，可以将给定人抗体或免疫球蛋白分至五大类免疫球蛋白中的一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。不同种类的免疫球蛋白的结构和三维构型为众所周知。在各种人免疫球蛋白种类中，已知仅人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM激活补体。已知人IgG1和IgG3在人中介导ADCC。
如本文所用，“亚类”指重链恒定区基因的同种型内的进一步划分，例如，IgG同种型内的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，NK细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞等)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的这类细胞毒性细胞一般表达Fc受体(FcR)。介导ADCC的初级细胞(NK细胞)表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、FcγRIII和/或FcγRIV。在造血细胞上表达的FcR如Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)所总结。为了评价分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号所述。对这类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地或额外地，可以在体内评价所关注的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如Clynes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95：652-656(1998)所公开的动物模型。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合至抗体的Fc区的受体，其中Fc区包含重链的铰链区以及CH2和CH3结构域。例如，FcR可以是天然序列人FcR。FcR可以是结合IgG抗体的受体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcγRIV亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两个受体具有相似的氨基酸序列，不同之处主要在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见，Daeron，1997，Annu.Rev.Immunol.15：203-234)。在Ravetchand Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.9：457-92；Capel et al.，1994，Immunomethods 4：25-34；和de Haas et al.，1995，J.Lab.Clin.Med.126：330-341中综述了FcR。在本文中术语“FcR”涵盖其他FcR，包括那些在未来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.，1976，Immunol.117：587)和Kim et al.，1994，J.Immunol.24：249)。免疫球蛋白Fc片段上的主要FcR结合位点位于CH1和CH2之间的铰链区中。这个铰链区与各种白细胞上的FcR1-3相互作用，并且触发这些细胞攻击靶标。(Wines et al.，2000，J.Immunol.164：5313-5318)。铰链区包括但不限于美国专利第6,165,476号所述的序列。
术语“能够诱导抗体依赖性细胞毒性”指通过本领域技术人员已知的测定法所测量的物质(诸如抗体)的引起ADCC的能力。这种活性的特征一般在于Fc区与各种FcR的结合。不受任何特定机制的限制，本领域技术人员会认识到抗体引起ADCC的能力可以例如，依靠其亚类(如IgG1或IgG3)，通过引入Fc区的突变，或者依靠对抗体的Fc区中的糖型的修饰。这样的修饰如美国专利公开第2007/0092521号所述。
术语“人抗体衍生物”指人抗体的任何修饰形式，例如，抗体与另一物质或抗体的缀合物。
术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中来源于诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列已被移植至人框架序列。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用，短语“特异性结合”表示化合物，例如蛋白质、核酸、抗体等，其识别并结合特定分子，但是基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，抗体或肽抑制剂，其识别并结合样品中的关联(cognate)配体(例如，与其关联抗原IgE结合的抗IgE抗体)，但是基本上不识别或结合该样品中的其他分子。因此，在指定的测定条件下，特定的结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)优选结合至特定靶分子，例如IgE，并且不以显著量结合至测试样品中存在的其他组分。各种测定形式可以用于选择特异性结合所关注的分子的抗体。例如，在可以用于鉴定与IgE特异性反应的抗体的许多测定中有固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcore、FACS和蛋白质印迹分析。典型地，特异性或选择性反应会是背景信号或噪声的至少2倍，并且更典型地是背景的超过10倍，甚至更具体地，当平衡解离常数(KD)为≤1μM，优选≤100nM并且最优选≤10nM时，认为抗体“特异性结合”抗原。
如本文所用，术语“kon”指特定抗体-抗原或受体-配体相互作用的结合速率(on-rate)或结合速率(association rate)，而如本文所用，术语“koff”指特定抗体-抗原/受体-配体相互作用的解离速率(off-rate)或解离速率(dissociation rate)。如本文所用，术语“KD”指解离常数，其获得自koff与kon的比值(即，koff/kon)，并且表示为摩尔浓度(M)。可以利用本领域已建立的方法测定抗体或其它结合伙伴的KD值。用于测定KD的一种方法是通过利用表面等离子共振，通常利用生物传感器系统，如Biacore
Figure BPA00001481727800231
系统。
本文所用的术语“嵌合抗体”表示包含来自两个或两个以上不同抗体的区域的抗体。在某些实施方案中，“嵌合抗体”包含来源于一个物种的可变区序列和来源于另一个物种的恒定区序列，如一种抗体，其中可变区序列来源于小鼠抗体，而恒定区序列来源于人抗体。在一实施方案中，CDR中的一个或多个来源于小鼠抗人IgE抗体。在另一实施方案中，所有CDR均来源于小鼠抗人IgE抗体。在另一实施方案中，将来自不止一种小鼠抗人IgE抗体的CDR在嵌合人抗体中组合。例如，嵌合抗体可以包含来自第一小鼠抗IgE抗体的轻链的CDR1、来自第二小鼠抗人IgE抗体的轻链的CDR2以及CDR3，并且CDR3来自第三小鼠抗人IgE抗体的轻链，而且来自重链的CDR可以来源于一种或多种其他抗IgE抗体。此外，框架区可以来源于相同小鼠抗人IgE抗体中的一种或者来源于一种或多种不同小鼠。
此外，如本文前面所讨论的，嵌合抗体包括这样的抗体，其包含来源于不止一个物种的种系序列的部分。
本发明的糖部分会参考用于描述寡糖的常用命名法来描述。使用这种命名法的糖化学的综述在Hubbard and Ivatt(1981)Ann.Rev.Biochem.50：555-583中找到。这种命名法包括，例如，Man，其代表甘露糖；GicNAc，其代表2-N-乙酰葡糖胺；Gal，其代表半乳糖；Fuc，为岩藻糖；以及Glc，其代表葡萄糖。唾液酸通过简化符号描述如下：NeuNAc为5-N-乙酰神经氨酸，而NeuNGc为5-羟乙酰神经氨酸(IUB-IUPAC Joint Commission onBiochemical Nomenclature，1982，J.Biol.Chem.257：3347-3351；(1982)J.Biol.Chem.257：3352)。
本发明的糖结构出现在作为N-连接寡糖表达的蛋白质上。“N-连接糖基化”指糖部分通过GlcNAc连接至多肽链中的天冬酰胺残基。N-连接糖全部含有共同的Man 1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构。因此，在所述核心结构中，R代表产生的糖蛋白的天冬酰胺残基。所产生的蛋白质的序列会含有天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸(Asn-Xaa-Ser/Thr)。相比之下，“O-连接”糖的特征在于共同核心结构，其为连接至苏氨酸或丝氨酸的羟基的GalNAc，但是不需要共有序列。N-连接糖中最重要的是“复杂”N-连接糖，，如本文所述的“二触角”结构。
技术人员会认识到糖蛋白免疫球蛋白G(IgG)与含有0个、1个或2个半乳糖残基的三种类型的复杂二触角结构相关(Wormland et al.，1997，Biochemistry 36：1370-1380)，通常分别称为G0、G1和G2。关于IgG类的人抗体分子，每种具有连接在Asn 297的酰胺侧链的N-连接寡糖，Asn 297位于Fc区的CH2结构域的内表面的β-4转角(Beale and Feinstein，1976，Q.Rev.Biophys.9：253-259；Jefferis et al.，1995，Immunol.Letts.44：111-117)。连接在IgG CH2结构域的Asn 297的寡糖部分是复杂二触角类型的，其具有经鉴定的多聚己糖核心结构和可变的外部糖残基(参见Jefferis et al.，1997，supra；Wyss and Wagner，1996，Current Opinions in Biotech.7：409-416)。核心结构(GIcNAc2Man3GIcNAc)为典型的二触角寡糖，并且可以如以下示意图所代表：
Figure BPA00001481727800241
因为每个核心结构可以具有二等分的N-乙酰葡糖胺，核心岩藻糖以及半乳糖或唾液酸外部糖，所以可以占据Asn 297位点的结构独特的寡糖总计有36种(Jefferis and Lund，见上文)。还应当认识到在特定CH2结构域内，由于连接在两条链的Fc结构域内的任一Asn 297残基处的不同寡糖链，在Asn 297处的糖基化可以是不对称的。例如，虽然在单个抗体分泌细胞内合成的重链在其氨基酸序列中可以是同质的，但是其一般是差异糖基化的，导致大量结构独特的Ig糖形。
在IgG的CH2结构域中发现的复杂寡糖结构的主要类型如国际专利公开第WO 99/22764号第7页所示。
根据本发明，G0指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的二触角结构，G1指具有一个Gal而无NeuAc的二触角结构，并且G2指具有两个末端Gal而无NeuAc的二触角结构。参见，例如，示出G0、G1、G-1和G2的示例性结构的图12。
“糖形”指包含各种糖单位的连接的复杂寡糖结构。这类结构如Essentials of Glycobiology Varki et al.，eds.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY(1999)所述，其还提供了标准糖生物学命名法的综述。这类糖形包括但不限于G2、G1、G0、G-1和G-2(参见，例如，国际专利公开第WO98/58964号和第WO 99/22764号)。
术语“聚糖位点占据”或“聚糖占据”包括，蛋白质中的潜在N-联或O-联糖基化位点可以包含共价连接的糖部分(即，聚糖位点被占据)或者没有包含共价连接的糖部分(即，聚糖位点未被占据)。当多肽上有至少两个潜在的糖基化位点时，0个(0-聚糖位点占据)、1个(1-聚糖位点占据)或2个(2-聚糖位点占据)可以被糖部分占据。
“糖基化模式”定义为共价连接至蛋白质(例如，糖形)以及位点的糖单位的模式，通过所述位点糖形共价连接至蛋白质的肽骨架，更具体地共价连接至免疫球蛋白。
通过不同细胞系或在转基因动物中表达的蛋白质，包括抗体，相互比较可能会具有不同聚糖位点占据、糖形和/或糖基化模式。然而，本文所提供的核酸分子编码的所有糖蛋白，或者包含本文所提供的氨基酸序列的所有糖蛋白，包括抗体在内，均为本发明的部分，无论该糖蛋白的糖基化、聚糖占据或糖形模式。
本文所用的术语“糖基化抑制剂”或“糖基化抑制化合物”指物质或化合物，其中在所述物质或化合物存在的情况下产生的多肽或蛋白质包含至少一个未糖基化的(unglycosylated)位点，或者在相同位点比在其他方面相同的条件下但是在不存在所述物质或化合物的情况下通过其他方面相同的细胞产生的其他方面相同的多肽或蛋白质少包含至少一个糖部分。糖基化抑制剂包括但不限于衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖和甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆甾醇、羟基胆甾醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、密实菌素、多萜长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇、环己烯四醇环氧化物和环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯、β-羟基正缬氨酸、苏型β-氟代天冬酰胺、D-(+)-葡糖酸δ-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-(二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯、和/或氟乙酸酯。根据本发明的方法和组合物，本领域普通技术人员会很容易识别或者能够确定可以使用的糖基化抑制物质，不用过多实验。
本文所用的术语“糖基化抑制量”表示物质或化合物的量，其中与不存在在该物质或化合物的情况下产生的其他方面相同的多肽或蛋白质相比，在存在该物质或化合物的情况下产生的多肽或蛋白质在糖基化方面包含可检测的减少。即，与在其他方面相同的条件下但是在不存在所述物质或化合物的情况下通过细胞产生的其他方面相同的多肽或蛋白质相比，所述多肽或蛋白质多包含至少一个未糖基化的位点(未被占据的聚糖位点)，或者在相同的潜在糖基化位点少包含至少一个糖部分。
本文可互换使用的“减少的糖基化”、“较少糖基化”或“抑制的糖基化”包括，与在其他方面相同的条件下但是在不存在糖基化抑制物质或化合物的情况下通过细胞产生的其他方面相同的多肽或蛋白质相比，多肽或蛋白质多包含至少一个未糖基化的(即，非糖基化的)位点，即没有连接的糖部分的完全未被占据的聚糖位点，或者在相同的潜在糖基化位点少包含至少一个糖部分。
如本文所用，术语“有效量”表示这样的量，当给细胞施用时，与在其他方面相同的条件下在不存在所述物质或化合物的情况下通过其他方面相同的细胞产生的其他方面相同的多肽或蛋白质的糖基化相比，其在通过细胞产生的所关注的多肽或蛋白质的糖基化中介导可检测的减少。可以通过本领域众所周知的许多方法评价多肽或蛋白质的糖基化，包括，例如，本文所公开的这类方法。
技术人员应当理解本文所施用的化合物或组合物的有效量会变化，并且基于许多因素可以很容易确定，如细胞类型、多肽或蛋白质中潜在的糖基化位点的数目、所用的细胞培养条件等。
如本文所用，关于抗体或配体：受体结合对，术语“竞争”表示第一抗体或其抗原结合部分或者受体蛋白与第二抗体或其抗原结合部分或者所述受体蛋白的关联配体竞争，其中与在第二抗体不存在的情况下第一抗体的结合相比，在第二抗体存在的情况下第一抗体与其关联表位的结合可检测地减少。替代情况可以存在但不是必需的，其中在第一抗体存在的情况下第二抗体与其表位的结合也可检测地减少。即，第一抗体可以抑制第二抗体结合至其表位，而第二抗体不抑制第一抗体结合至其相应的表位。然而，当每个抗体可检测地抑制其他抗体与其同源表位或配体的结合时，无论相同、较多或较少程度，均认为所述抗体互相“交叉竞争”它们各自表位的结合。例如，交叉竞争的抗体可以结合至本发明的抗体结合的表位或表位的部分。本发明包括竞争和交叉竞争的抗体。无论这样的竞争或交叉竞争通过任何机制发生(例如，空间位阻、构象变化或者结合至常见表位或其部分等)，基于本文所提供的教导，技术人员应当理解这类竞争和/或交叉竞争的抗体包括在本文内，并且可以有利于本文所公开的方法。
本文所用的术语“指导材料”包括出版物、记录、图或任何其他表达介质，其可以用于传达试剂盒中的本发明的方法、化合物、组合和/或组合物对于影响、缓解或治疗本文所列举的各种疾病或病症或者对于使用本文所公开的新方法的用途。任选地或可选地，指导性材料可以描述在细胞、组织或哺乳动物中产生治疗性蛋白质和/或缓解疾病或病症的一种或多种方法，包括如本文其他地方所公开的使用本发明的蛋白质。
例如，试剂盒的指导材料可以附在含有本发明的化合物和/或组合物的容器上，或者与含有所述化合物和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可以与本发明的容器分开运送，接受者配合使用指导材料和化合物。
除非另有说明，术语“患者”或“对象”可互换使用，并且指哺乳动物，如人患者和非人灵长类；以及兽医学对象，如兔、大鼠和小鼠；以及其他动物。优选地，患者指人。
本文使用常规表示法描述多肽序列：多肽序列的左端为氨基端；多肽序列的右端为羧基端。
如本文所用，短语“特异性结合”表示化合物，例如蛋白质、核酸、抗体等，其识别并结合特定分子，但是基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，抗体或肽受体，其识别和结合样品中的关联配体或结合伙伴(例如，与其同源抗原IgE结合的抗IgE抗体，或者晚期糖基化终产物受体(RAGE)与其配体中的一种，如淀粉状蛋白β肽或S100)，但是基本上不识别或结合该样品中的其他分子。因此，在指定的测定条件下，特异性结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分，或者受体或其配体结合部分)优选结合至特定靶分子，并且不以显著量结合测试样品中存在的其他组分。各种测定形式可以用于选择特异性结合所关注的分子的抗体或肽。例如，在可以用于鉴定与抗原特异性反应的抗体，或者与关联配体或结合伙伴特异性结合的受体或其配体结合部分的许多测定中有固相ELISA免疫测定、免疫沉淀、BIAcoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、FACS、OctetTM(FortéBio，Inc.，Menlo Park，CA)和蛋白质印迹分析。典型地，特异性或选择性反应会是背景信号或噪声的至少2倍，并且更典型地是背景的超过10倍，甚至更具体地，当平衡解离常数(KD)为≤1μM，优选≤100nM并且最优选≤10nM时，认为抗体“特异性结合”抗原。
如本文所用，“基本上纯”表示目标物质(species)为存在的优势物质(即，在摩尔的基础上，在组合物中其比任何其他单一物质更丰富)，并且优选地，基本上纯化的部分是这样的组合物，其中所述目标物质(例如，糖蛋白，包括抗体或受体)包含存在的所有大分子物质的至少约50％(在摩尔的基础上)。一般，基本上纯的组合物会包含组合物中存在的所有大分子物质的超过约80％，更优选地超过约85％、90％、95％和99％。最优选地，将所述目标物质纯化至基本上同质性(通过常规检测方法在组合物中不可以检测到污染物)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。
如本文所用，“治疗”表示减少患者经历疾病的症状(即，肿瘤生长和/或转移，或者免疫细胞的数量和/或活性所介导的其他效应等)的频率。该术语包括施用本发明的化合物或物质以防止或延迟疾病的症状、并发症或生化指标的发生，缓解症状，或者阻滞或抑制疾病、疾病状况或病症的进一步发展。治疗可以是在疾病表现之后症状的预防性(防止或延迟疾病的发生，或者阻止其临床或亚临床症状的表现)或治疗性抑制或缓解。
“组合治疗”包括作为特定治疗方案的部分施用第一治疗剂和另一治疗剂，旨在从这些治疗剂的共同作用提供有益效应，所述治疗方案任选包括维护阶段。组合的有益效应包括但不限于治疗剂的组合所导致的药物动力学或药效共同作用。通常在规定的时间(通常为分钟、小时、天或周，取决于所选的组合)内进行这些治疗剂的组合施用。“组合治疗”一般不包括作为独立的单一治疗方案的部分施用两种或两种以上的这些治疗剂，所述独立的单一治疗方案偶然或任意导致本发明的组合。
“组合治疗”包括以顺序方式施用这些治疗剂，即，其中在不同时间施用每种治疗剂；以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂或至少两种治疗剂。任何适当的途径可以影响每种治疗剂的顺序或基本上同时施用，所述途径包括但不限于口服途径，静脉内途径，肌肉内、皮下途径以及通过粘膜组织直接吸收。可以通过相同途径或通过不同途径施用治疗剂。例如，可以口服施用第一治疗剂(例如，化疗剂)，并且可以静脉内施用第二物质(例如，抗体或其他糖蛋白)。此外，可以通过静脉内注射施用所选组合的第一治疗剂，然而可以口服施用所述组合的其他治疗剂。可选地，例如，可以通过静脉内或皮下注射施用两种治疗剂。
在本说明书中，除非另有说明，术语“顺序”表示特征在于有规律的顺序或次序，例如，如果施用方案包括施用治疗性蛋白质(例如，抗体、糖蛋白等)和化疗剂，顺序施用方案可以包括在施用化疗剂之前、同时、基本上同时或之后施用治疗性蛋白质，但是会以有规律的顺序或次序施用两种物质。除非另有说明，术语“分开”表示把一个与另一个分开。除非另有说明，术语“同时”表示在相同时间发生或完成，即在相同时间施用本发明的化合物。术语“基本上同时”表示互相在几分钟之内(例如，互相在10分钟之内)施用化合物，并且包括组合施用以及连续施用，但是如果施用是连续的，其在时间上仅间隔短时期(例如，医生分别施用两种化合物所花费的时间)。如本文所用，并行施用和基本上同时施用可互换使用。顺序施用指在时间上分开施用治疗性蛋白质和化疗剂。
“组合治疗”还可以包括进一步组合其他生物活性成分(例如但不限于第二和不同治疗性蛋白质、疫苗等)和非药物治疗(例如但不限于外科手术或放射治疗)来施用如上所述的治疗剂。当组合治疗进一步包括放射治疗时，可以在任何合适的时间进行放射治疗，只要获得来自治疗剂和放射治疗的组合的共同作用的有益效应。例如，在适当情况下，当在时间上从治疗剂的施用去除放射治疗，可能几天或甚至几周时，仍然获得有益效应。
本文所用的术语“分批培养”指培养细胞的方法，其中在培养过程的开始提供在培养细胞中最终会使用的所有组分，包括培养基以及细胞本身。通常在某些点终止分批培养，收获培养基中的细胞和/或组分并任选地纯化。
“生物反应器”包括有利于细胞培养物的生长的任何容器。生物反应器可以是任何大小，只要其有利于细胞的培养。一般来说，生物反应器至少为1升，并且可以为10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多、或者之间的任何容积。在培养期间任选控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。生物反应器可以由适合在本发明的培养条件下容纳悬浮在培养基中的细胞培养物的任何材料组成，包括玻璃、塑料或金属。本文所用的术语“生产生物反应器”指在所关注的多肽或蛋白质的生产中使用的最终生物反应器。生产生物反应器的容积典型为至少500升，并且可以为1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多、或者之间的任何容积。本领域普通技术人员会知道并且能够选择用于实施本发明的合适的生物反应器。
本文所用的术语“细胞密度”表示在给定体积的培养基中存在的细胞的数量。
如本文所用，“细胞活力”指培养中的细胞在给定的培养条件或实验变量下存活的能力。本文所用的该术语还指在特定时间相对于该时间培养物中活和死细胞的总量的活细胞的部分。
本文所用的术语“培养基(medium)”、“细胞培养基”和“培养基(culturemedium)”指含有滋养生长细胞的营养物的溶液。在某些实施方案中，培养基有利于使哺乳动物细胞生长。一般而言，培养基提供细胞最低生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和痕量元素。培养基还可以含有使生长和/或存活提高至最低水平之上的的补充组分，其包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯、钙，镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、和/或葡萄糖或其他能源。在某些实施方案中，将培养基有利地配制为对细胞存活和增殖最优的pH和盐浓度。在某些实施方案中，培养基为在细胞培养开始之后加入的补料培养基。在某些实施方案中，细胞培养基是起始营养物溶液和在细胞培养开始之后加入的任何补料培养基的混合物。
本文所用的术语“复合培养基”指含有至少一种性质或数量未知或不受控制的组分的培养基。
本文所用的术语“培养物”和“细胞培养物”指在适合细胞群体的存活和/或生长的条件下悬浮在培养基(在本文其他地方定义)中的细胞群体。本领域普通技术人员会清楚，本文所用的这些术语还指包含细胞群体和培养基的组合，所述群体悬浮在所述培养基中。在某些实施方案中，细胞培养物为哺乳动物细胞培养物。
本文所用的术语“确定成分培养基”指培养基，其中该培养基的组分已知并受控制。
本文所用的术语“补料分批培养”包括培养细胞的方法，其中在培养过程开始之后在一个时间或多个时间向培养物提供额外的组分。所提供的组分通常包含在培养过程中耗尽的细胞的营养补充物。额外地或可选地，额外的组分可以包括补充组分(在本文其他地方定义)。在某些实施方案，可以在补料培养基中提供额外的组分。通常在某些点终止补料分批培养，收获培养基中的细胞和/或组分并任选地纯化。
本文所用的术语“改良的补料分批”或“混合模式培养方法”包括培养细胞的方法，其在接种物阶段和/或最终生物反应器生产阶段期间使用灌注和/或分批和/或补料分批方法的组合。讨论了示例性改良的补料分批方法，但不限于美国专利申请公开第US 2009/0042253号(2009年2月12日公开)中的方法，其整体援引加入本文。
本文所用的“补料培养基”指在细胞培养开始之后加入的含有滋养生长哺乳动物细胞的营养物的溶液。补料培养基可以含有与初始细胞培养基所提供的相同的组分。可选地，除了初始细胞培养基所提供的组分之外，补料培养基可以含有一种或多种额外的组分。额外地或可选地，补料培养基可以缺少初始细胞培养基所提供的一种或多种组分。在某些实施方案中，以与初始细胞培养基所提供的这些组分的浓度或水平相同或相似的浓度或水平提供补料培养基的一种或多种组分。在某些实施方案中，以与初始细胞培养基所提供的这些组分的浓度或水平不同的浓度或水平提供补料培养基的一种或多种组分。在某些实施方案中，补料培养基含有补充组分。
本文所用的术语“补充组分”涵盖使生长和/或存活提高至最低水平之上的的组分，其包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、和/或葡萄糖或其他能源。在某些实施方案中，将补充组分加入初始细胞培养物。在某些实施方案中，在细胞培养开始之后加入补充组分。
本文所用的术语“片段”指多肽，并且定义为给定多肽的任何离散部分，其对于该多肽是独特的或者是该多肽的特征。本文所用的该术语还指给定多肽的任何离散部分，其至少保留了全长多肽的活性的部分。在某些实施方案中，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少10％。在某些实施方案中，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施方案中，保留的活性的部分为全长多肽的活性的至少95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，保留的活性的部分为全长多肽的活性的100％或更多。可选地或额外地，本文所用的该术语还指给定多肽的任何部分，其包括在全长多肽中发现的至少一个确定的序列元件。在某些实施方案中，所述序列元件跨越全长多肽的至少约4-5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多个氨基酸。
本文所用的术语“基因”指任何核苷酸序列、DNA或RNA，其至少某些部分编码离散终产物，一般为多肽但不限于多肽。任选地，该术语不仅指编码多肽或其它离散终产物的编码序列，而且还可以包括编码序列之前和/或之后的调节表达的基础水平的区域(参见下文“遗传控制元件”的定义)以及单独的编码片段(“外显子”)之间的间插序列(“内含子”)。
本文所用的术语“遗传控制元件”指调节其可操作地连接的基因的产物的表达的任何序列元件。遗传控制元件可以通过增加或减少基因产物的表达水平来发挥功能，并且可以位于编码序列之前、内部或之后。遗传控制元件可以在基因表达的任何阶段发挥作用，例如，调控转录的起始、延伸或终止，mRNA剪接，mRNA编辑，mRNA稳定性，细胞内mRNA定位，翻译的起始、延伸或终止，或者基因表达的任何其他阶段。遗传控制元件可以单独或互相组合发挥功能。
本文所用的术语“宿主细胞”指根据本发明在培养中生长以产生所关注的蛋白质或多肽的细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。
本文所用的术语“杂交瘤”包括永生化细胞与抗体产生细胞融合所获得的细胞或细胞的后代。所得的杂交瘤为产生抗体的永生化细胞。用于产生杂交瘤的个体细胞可以来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、山羊和人。该术语还包括三源杂交瘤细胞系，其当异源杂交骨髓瘤融合(人细胞和小鼠骨髓瘤细胞系之间融合的产物)的后代随后与浆细胞融合时获得。此外，该术语包括任何产生抗体的永生化杂交细胞系，例如，四源杂交瘤(quadroma)(参见，例如，Milstein et al.，1983，Nature537：3053)。
本文所用的术语“多肽”指通过肽键连接在一起的氨基酸的顺序链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域普通技术人员会理解该术语不限于长的链，并且可以指包含通过肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员已知的，可以加工和/或修饰多肽。例如，多肽可以被糖基化。根据本发明表达的多肽可以是治疗性多肽。治疗性多肽是对身体的部位具有生物学效应的多肽，所述多肽对所述身体的部位发挥作用或通过中间体远程发挥作用。治疗性多肽的实例在下文中更详细地讨论。
本文所用的术语“蛋白质”指作为离散单位发挥功能的一种或多种多肽。如果单个多肽为离散功能单位，并且不需要与其他多肽永久性或暂时物理关联以形成离散功能单位，那么术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散功能单位由互相物理关联的多个多肽组成，本文所用的术语“蛋白质”指物理偶联并作为离散单位一起发挥功能的多个多肽。根据本发明表达的蛋白质可以是蛋白质治疗剂。蛋白质治疗剂是对身体的部位具有生物学效应的蛋白质，所述蛋白质对所述身体的部位发挥作用或通过中间体远程发挥作用。蛋白质治疗剂的实例在下文中更详细地讨论。
本文所用的“重组表达多肽”和“重组多肽”指从宿主细胞表达的多肽，所述宿主细胞被操作以表达该多肽。在某些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，这种操作可以包含一种或多种遗传修饰。例如，可以通过引入编码待表达的多肽的一种或多种异源基因来遗传修饰宿主细胞。异源重组表达多肽可以与宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似。异源重组表达多肽也可以与宿主细胞无关，例如与宿主细胞中正常表达的多肽异源。在某些实施方案中，异源重组表达多肽是嵌合的。例如，多肽的部分可以含有与宿主细胞中正常表达的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分含有与宿主细胞无关的氨基酸序列。额外地或可选地，多肽可以含有来自两种或两种以上不同多肽的氨基酸序列，所述两种或两种以上不同多肽均在宿主细胞中正常表达。此外，多肽可以含有来自与宿主细胞无关的两种或两种以上多肽的氨基酸序列。在某些实施方案中，通过一种或多种内源基因的激活或上调来遗传修饰宿主细胞。
本文所用的术语“滴度”表示在给定量的培养基体积中细胞培养物所产生的重组表达多肽或蛋白质的总量。滴度通常以毫克或微克多肽或蛋白质每毫升培养基的单位表示。
控制糖基化的方法
本发明提供了用于通过细胞培养生产糖基化的蛋白质和/或糖基化的多肽的改进的方法和培养基配方，其中所述蛋白质或多肽包含减少的糖基化。在某些实施方案中，本发明提供了减少细胞培养物中蛋白质的糖基化的方法。
以前的工作已证实代谢废物乳酸对细胞生长、活力和/或蛋白质生产或质量是有害的。以前的工作还已证实可以通过在培养期间维持低葡萄糖水平以减少糖酵解来保持细胞培养物中的低乳酸水平(Cruz et al.，1999，Biotechnology and Bioengineering 66：104-113)。然而，因为对于蛋白质或多肽的大规模生产，葡萄糖水平的持续监测和调整是不实际的，所以以前的工作已证实将糖酵解抑制物质加入细胞培养基可以减少糖酵解以改进蛋白质生产(国际专利申请第PCT/US2007/083473号，公开为2008年5月8日的WO 2008/055260)。更具体地，据证实糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的添加降低细胞培养基中的乳酸水平，并且在某些浓度下，其还增加通过细胞的所关注的蛋白质的生产。
本发明提供了用于通过细胞培养生产包含减少的糖基化的糖蛋白和/或多肽的改进的方法和培养基配方，所述细胞培养不需要持续监测和调整培养物的葡萄糖水平。本发明提供了用于生产包含减少的糖基化的糖蛋白或多肽的改进的方法和培养基配方，其中所述糖蛋白或多肽在配体结合位点或抗原结合位点中包含潜在的糖基化位点。在某些实施方案中，包含减少的糖基化的糖蛋白或多肽证实了改善的生物学特征，包括但不限于改善的与关联配体或结合伙伴的结合(例如，增加的特异性和/或亲合力(avidity))。在某些实施方案中，细胞培养为分批或补料分批培养。
本发明的某些组合物包括细胞培养基，所述细胞培养基包含糖基化抑制物质。在某些实施方案中，这样的糖基化抑制物质包括衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖和甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆甾醇、羟基胆甾醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、密实菌素、多萜长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇、环己烯四醇环氧化物和环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯、β-羟基正缬氨酸、苏型β-氟代天冬酰胺、D-(+)-葡糖酸δ-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-(二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和/或氟乙酸酯。经过本文所提供的教导，技术人员会理解本领域已知许多有用的潜在的糖基化抑制剂，其抑制N-连接、O-连接或两种糖基化，并且可以测定其在本发明的新方法中的用途。参见，例如，Elbein，1985，Methods in Enzymol.98：135-154；Elbein，1987，Ann.Rev.Biochem.56：497-534。
根据某些实施方案，通过细胞培养产生的重组蛋白的糖基化水平(例如，蛋白质或肽上被占据的聚糖位点的数目，在该位点的糖形的大小和/或复杂度等)低于在其他方面相同的情况下在缺少这样的糖酵解抑制物质的其他方面相同的培养基中产生的蛋白质的糖基化水平。根据某些实施方案，培养物的糖基化水平低于在其他方面相同的条件下在缺少这样的糖基化抑制物质的其他方面相同的培养基中产生的糖基化水平。
下文详细讨论了本发明的其他实施方案。然而，本领域普通技术人员会理解这些实施方案的各种修改在所附的权利要求的范围之内。权利要求及其等同物界定了本发明的范围，其不受限于或者不应当受限于某些实施方案的这种描述。
细胞
可以按照本发明利用能容许细胞培养以及蛋白质或多肽表达的任何宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物。可用作表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域众所周知，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，其包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK、人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)和人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)。可以按照本发明使用的哺乳动物细胞的其他非限制性实例包括人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞(Grahamet al.，1977，J.Gen Virol.36：59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.23：243-251)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather et al.，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；人肝癌系(Hep G2)；以及许多骨髓瘤细胞系，包括但不限于BALB/c小鼠骨髓瘤系(NS0/1，ECACC No：85110503)、NS0细胞和Sp2/0细胞。
此外，可以按照本发明利用任何数量的可商购和不可商购的表达多肽或蛋白质的杂交瘤细胞系。本领域技术人员会理解杂交瘤细胞系可以具有不同的营养需求和/或为了最优生长以及多肽或蛋白质表达可以需要不同培养条件，并且能够根据需要修改条件。
本发明包括本领域已知或本文所公开的用于生产所关注的蛋白质的任何真核表达系统，如在昆虫细胞系统、酵母表达系统或哺乳动物细胞系统中表达，例如但不限于CHO细胞。即，其中所产生的蛋白质是以其他方式糖基化的并且在期望减少糖基化(N-连接和/或O-连接)的情况下，任何细胞培养系统可以用于本发明的新方法。
在某些实施方案中，使用酵母表达系统，并且利用糖基化抑制剂的糖基化控制减少或消除N-连接、O-连接或两种类型的糖基化。这特别有用，因为酵母系统可以介导不需要的N-连接糖基化，并且更特别地介导不需要的O-连接糖基化。因此，本文所公开的新方法提供了用于在酵母中产生具有降低的N-连接和/或O-连接糖基化水平的蛋白质的有用方法。从而所产生的较少糖基化或非糖基化的蛋白质可以表现出有用特征，例如但不限于，较少异质性、改善的分批/批结果的更标准化的特性、改善的结合特征等。
可以使用的其他细胞系为昆虫细胞系，如Sf9细胞。植物宿主细胞包括，例如，烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(E.coli)和链霉菌(Streptomyces species)。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。
编码所关注蛋白质的核酸分子，包含这些核酸分子的表达载体可以用于合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞的转染。可以通过任何已知的用于将多核苷酸引入宿主细胞的方法进行转化。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法为本领域众所周知，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包入脂质体以及将DNA直接显微注射入核。此外，可以通过病毒载体将核酸分子引入哺乳动物细胞。转化植物细胞的方法为本领域众所周知，包括，例如，农杆菌介导的转化、基因枪(biolistic)转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域众所周知的。
还可以利用DNA基因枪将表达载体递送至表达系统，其中将质粒沉淀在微观颗粒上，优选金，并且将该颗粒推入靶细胞或表达系统。DNA基因枪技术为本领域众所周知，并且诸如“基因枪(gene gun)”的装置可商购，用于将微粒递送入细胞(例如，Helios Gene Gun，Bio-Rad Labs.，Hercules，CA)和皮肤(PMED Device，PowderMed Ltd.，Oxford，UK)。
可以利用许多已知的技术提高来自生产细胞系的蛋白质表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)和原生质编码(plasma-encoded)的新霉素抗性系统是用于在某些条件下提高表达的常用方法。
如上所述，在许多情况下会选择或改造细胞以产生高水平的所关注的蛋白质或多肽。通常，例如通过引入编码所关注的蛋白质或多肽的基因和/或通过引入控制元件来操作细胞以产生高水平的蛋白质，所述控制元件调控编码所关注的多肽或蛋白质的基因(无论内源的或引入的)的表达。
某些多肽可以对细胞生长、细胞活力或者细胞的某种其他特征具有有害效应，以某种方式最终限制所关注的多肽或蛋白质的生产。即使在被改造以表达特定多肽的一种特定类型的细胞群体中，在细胞群体内也可以存在变异性，从而某些个别的细胞会更好地生长和/或产生更多所关注的多肽。在某些实施方案，实践者凭经验选择在所选的用于培养细胞的特定条件下健壮生长的细胞系。在某些实施方案中，基于细胞生长、最终细胞密度、细胞活力百分比、表达多肽的滴度或这些的任何组合或者实践者认为重要的任何其他条件，选择被改造以表达特定多肽的个别的细胞用于大规模生产。
培养细胞
本发明可以与适合表达多肽的任何细胞培养方法或系统使用。例如，可以使细胞在分批或补料分批培养中生长，其中在多肽的足量表达之后终止培养，然后收获表达的多肽并任选地纯化。可选地，可以使细胞在灌注培养中生长，其中不终止培养，并且定期或持续将新的营养物和其他组分加入培养物，培养期间定期或持续收获表达的多肽。在其他实施方案中，使细胞在改良的补料分批方法中生长，如美国专利申请公开第US2009/0042253号所述的方法。
可以使细胞在实践者所选的任何方便的容积中生长。例如，可以使细胞在容积范围为几毫升至几升的小规模反应容器中生长。可选地，可以使细胞在大规模商业生物反应器中生长，所述生物反应器的容积范围为约最少1升至10、100、250、500、1,000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多、或者之间的任何容积。
主要基于细胞培养物保持存活、产生高水平的多肽的温度范围，最小化代谢废物的产生或积累的温度，和/或这些的任何组合或者实践者认为重要的其他因素选择细胞培养的温度。作为一个非限制性实例，CHO细胞在约37℃下生长良好，并且产生高水平的蛋白质或多肽。一般，大多数哺乳动物细胞在约25℃-42℃的范围内生长良好和/或可以产生高水平的蛋白质或多肽，不过本公开所教的方法不限于这些温度。某些哺乳动物细胞在约35℃-40℃的范围内生长良好和/或可以产生高水平的蛋白质或多肽。在某些实施方案中，在细胞培养过程中在一段或更多时间使细胞培养物在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃的温度下生长。本领域普通技术人员能够根据细胞的需要和实践者的生产要求选择生长细胞的合适温度或多个温度。
此外，在培养过程中可以使培养物进行一次或多次温度转换。当转换培养物的温度时，温度转换可以是相对渐进的。例如，可以花费几个小时或几天以完成温度变化。可选地，温度变化可以是相对突然的。在培养过程中温度可以稳步上升或下降。可选地，在培养过程中温度可以在不同时间以离散量上升或下降。随后的温度或温度范围可以低于或高于初始或之前的温度或温度范围。本领域普通技术人员会理解这些实施方案涵盖多个离散温度转换。例如，可以将温度转换一次(至较高或较低的温度或温度范围)，将细胞维持在这个温度或温度范围一定时间，然后可以将温度再次转换至新的温度或温度范围，其可以高于或低于之前的温度或温度范围。在每次离散转换之后培养物的温度可以是恒定的，或者可以维持在一定的温度范围内。
与初始温度或温度范围一样，主要基于细胞培养物保持存活的温度、产生高水平的多肽或蛋白质的范围、最小化代谢废物的产生或积累的范围、和/或这些的任何组合或者实践者认为重要的其他因素选择温度转换之后细胞培养物的温度或温度范围。一般，大多数哺乳动物细胞在约25℃-42℃的范围内保持存活并产生高水平的蛋白质或多肽，不过本公开所教的方法不限于这些温度。在某些实施方案中，哺乳动物细胞在约25℃-35℃的范围内保持存活并产生高水平的蛋白质或多肽。在某些实施方案中，温度转换之后在一段或更多时间使细胞培养物在20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃的温度下生长。本领域普通技术人员能够根据细胞的特殊需要和实践者的特殊生产要求选择温度转换之后生长细胞的合适温度或温度范围。可以使细胞生长任何时间量，取决于实践者的需要和细胞本身的需求。本领域普通技术人员能够基于所用细胞系的特征、待生产的蛋白质或多肽的特征、培养基中其他组分存在或不存在或者对他或她的实验和/或其他需要可取的任何其他因素选择将培养物转换至较低温度的确切时间点。
在某些实施方案中，使细胞培养物在范围为约32℃至约42℃的温度下生长，并且将温度转换为约25℃至约31℃；更优选地，使细胞培养物在范围为约33℃至约37℃的温度下生长，并且将温度转换为约28℃至约31℃；更优选地，使细胞培养物在范围为约34℃至37℃的温度下生长，并且将温度转换为约29℃至约31℃；更优选地，使细胞培养物在约34℃的温度下生长，并且将温度转换为约31℃。
在某些实施方案中，如实践者的需要所确定的，一旦表达的多肽达到最够高的滴度，终止分批和补料分批反应。作为非限制性实例，当多肽滴度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000mg/L或更高时可以终止细胞培养。本领域普通技术人员能够选择可以收获分批和/或补料分批培养物的一个或多个合适滴度。额外地或可选地，如实践者的需要所确定的，一旦细胞达到足够高的密度，终止分批和补料分批反应。例如，一旦细胞达到最大活细胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％，可以终止培养。
在某些实施方案中，终止分批和/或补料分批细胞培养以防止不期望的代谢废物的产生或积累，如乳酸和铵。在某些实施方案中，在乳酸在培养物中积累至不期望的水平之前终止细胞培养。作为非限制性实例，可以在乳酸达到8、7、6、5、4、3、2或1g/L之前终止细胞培养。
在某些实施方案中，如实践者的需要所确定的，一旦细胞密度达到足够高的水平，终止分批和补料分批反应。例如，一旦细胞密度达到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12×106个细胞/mL或更多，可以终止细胞培养。在某些实施方案中，在细胞密度达到1×106个细胞/mL之前终止分批和补料分批反应。
在某些情况下，在随后的生产阶段中向细胞培养物补充已被细胞耗尽或代谢的营养物或其他培养基组分可以是有益的或必需的。作为非限制性实例，向细胞培养物补充激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、或者葡萄糖或其他能源可以是有益的和必需的。可以将这些补充组分一次全部加入细胞培养物，或者可以通过一系列的添加将它们提供给细胞培养物。
本领域普通技术人员能够制定特异性细胞培养条件以优化细胞培养物的某些特征，包括但不限于所关注的蛋白质的糖基化程度、细胞生长速率、细胞活力、细胞培养物的最终细胞密度、诸如乳酸和铵的有害代谢副产物的终浓度、表达的多肽的最终滴度或这些的任何组合或者实践者认为重要的其他条件。
培养基组合物
按照本发明可以使用多种生长培养基中的任意生长培养基。在某些实施方案中，使细胞在多种化学成分确知培养基中的任意培养基中生长，其中培养基的组分已知并受控制。在某些实施方案中，使细胞在多种复杂培养基中的任意培养基中生长，其中不是所有培养基的组分已知和/或受控制。
在过去几十年中，已广泛开发和公开了用于细胞培养的化学成分确知的生长培养基，包括用于哺乳动物细胞培养的化学成分确知的生长培养基。确定成分培养基的所有组分已良好表征，因此确定成分培养基不含有复杂的添加剂，如血清或水解产物。早期培养基配方是开发来允许细胞生长和维持活力，较少或不关心蛋白质生产。最近，已开发为了支持产生重组蛋白和/或多肽的高产细胞培养物的表达目的的培养基配方。
确定成分培养基通常由水中的已知浓度的大约50种化学实体组成。大部分确定成分培养基还含有一种或多种良好表征的蛋白质，如胰岛素、IGF-1、转铁蛋白或BSA，但是其他不需要蛋白质成分，并且因此被称为无蛋白质确定成分培养基。确定成分培养基的化学组分一般落入五大类：氨基酸、维生素、无机盐、痕量元素和难于整齐分类的其它类。
所有培养基，确定成分或复合培养基，均包括用于生长细胞的能源。通常，所述能源为葡萄糖，具有化学式C6H12O6的简单单糖。传统培养基配方含有相对高水平的葡萄糖，所述传统培养基配方包括可商购的培养基，如Ham′s F10(Sigma)、最小必需培养基([MEM]，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和达尔伯克改良伊格尔培养基([DMEM]，Sigma)。传统上认为需要丰富的葡萄糖，因为它是细胞的主要代谢能源。然而，葡萄糖的快速消耗导致增加的糖基化。因为如本文所证实的，减少的糖基化可以为糖蛋白提供改善的生物学功能和特征，所以可以期望在细胞培养中降低和/或控制葡萄糖的水平。相应地，本发明包括减少和/或控制细胞培养基中葡萄糖的量。在一实施方案中，将葡萄糖浓度维持在约100μg/L至约10g/L的范围中，更优选地，约500μg/L至约10g/L，更优选地，约500μg/L至约5g/L，甚至更优选地，约500μg/L至约3g/L，甚至更优选地，约1g/L至约3g/L，更优选地，约1g/L至约2g/L，并且更优选地，0.05g/L至0.5g/L。最优选地，将葡萄糖浓度维持在约1.5g/L。
本发明包括这样的发现，某些细胞培养方法和培养基配方最小化甚至完全抑制糖蛋白的糖基化。衣霉素为抗生素，其为抑制糖基转移酶的糖基化抑制剂，所述糖基转移酶从尿苷二磷酸(UDP)-GlcNAc转移磷酸-N-乙酰葡糖胺(P-GlcNAc)以形成多萜醇磷酸(Dol-P)-GlcNAc。2-脱氧-D-葡萄糖是葡萄糖的结构类似物，其中用氢部分代替在糖的2′位置的羟基。因此，不希望被任何具体理论束缚，看来在利用任一抑制剂的减少的蛋白质的糖基化导致具有较低糖基化水平的糖蛋白中，糖基化抑制的机制是不重要的。更令人惊讶地，不管在细胞培养中用于抑制糖基化的糖基化抑制剂，减少包含位于配体结合位点内的糖基化位点的蛋白质的糖基化介导提高的该蛋白质与同源配体的结合。
本公开证实含有糖基化抑制物质的培养基配方当用于在细胞培养中生长细胞时导致糖蛋白的糖基化减少，所述糖基化抑制物质包括但不限于2-脱氧-D-葡萄糖和衣霉素。此外，本文所提供的公开令人惊讶地证实当糖基化位点位于糖蛋白的配体结合位点或抗体的抗原结合位点内时，与包含较高水平的糖基化并且在其他方面相同的细胞培养条件下在不存在糖基化抑制物质的情况下产生的相同糖蛋白相比，减少在该位点的糖基化介导改善的糖蛋白的生物学功能(例如，改善的配体或抗原结合)。不希望被任何具体理论束缚，可能通过在细胞培养基中提供这样的糖基化抑制物质，减少了糖基化，从而影响结合位点结合其关联配体的能力，因此增加蛋白质的结合亲和力或特异性。
此外，本文所提供的公开令人惊讶地证实当糖基化位点位于抗体的抗原结合位点内时，本文所公开的新方法可以在位于抗原结合位点内的糖基化位点和位于该抗体重链恒定区中的糖基化位点均降低该抗体的糖基化水平。而且，与包含较高水平的糖基化并且在其他方面相同的细胞培养条件下在不存在糖基化抑制物质的情况下产生的相同抗体相比，减少在介导的位点的糖基化可以改善抗体的生物学功能(例如，改善抗原结合)。
因此，本发明提供了用于影响包括抗体在内的糖蛋白的糖基化水平和/或结合特征而不改变该糖蛋白的氨基酸序列的新方法。
在某些实施方案中，待按照本发明使用的糖基化抑制物质包括2-脱氧-D-葡萄糖。在某些实施方案中，以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多克/升的浓度提供2-脱氧-D-葡萄糖。在某些实施方案中，细胞培养物中2-脱氧-D-葡萄糖比葡萄糖的比例为1/50、1/45、1/40、1/39、1/38、1/37、1/36、1/35、1/34、1/33、1/32、1/31、1/30、1/29、1/28、1/27、1/26、1/25、1/24、1/23、1/22、1/21、1/20、1/19、1/18、1/17、1/16、1/15、1/14、1/13、1/12、1/11、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3、1/2、1/1或者比这些更高或更低的任何比例。本领域普通技术人员会理解可以利用分批培养、补料分批培养、灌注培养和/或改良的补料分批培养实现上述细胞培养基中2-脱氧-D-葡萄糖的浓度和比例。
本发明还包括培养基配方，其中葡萄糖的浓度是有限的。在某些实施方案中，将葡萄糖的浓度维持在约100μg/L至约10g/L的范围内，更优选地，约100μg/L至约5g/L，甚至更优选地，约100μg/L至约3g/L，更优选地，约100ug/L至约1.5g/L，更优选地，约100ug/L至1g/L，并且最优选地，约50ug/L至0.5g/L。
本公开教导，对于减少所关注的蛋白质的糖基化从而向该蛋白质提供包括改善的与关联配体的结合在内的改善的生物学特征，几个因素可以是重要的。这样的因素包括但不限于将糖基化抑制剂加入细胞培养物、培养物中葡萄糖的水平、培养物的温度和用于培养细胞的培养基，其中所述培养物的温度包括但不限于使细胞培养物进行温度转换。
特定细胞系可以产生不同的糖基化水平和/或在糖基化位点存在的糖形。无论如何，在任何给定细胞培养物中利用本文所述的发明方法和培养基组合物会导致与在其他方面相同的条件下在不存在糖基化抑制剂的情况下产生的蛋白质的糖基化水平相比较低的糖蛋白的总体糖基化。
当必需或期望时，本文所公开的发明培养基配方可以任选地补充激素和/或其他生长因子、特定离子(如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质、蛋白质水解产物、或者葡萄糖或其他能源。在本发明的某些实施方案中，向培养基补充化学诱导物(inductant)可以是有益的，如六亚甲基-双(乙酰胺)(″HMBA″)和/或丁酸钠(″NaB″)。这些任选存在的补充物可以在培养开始时添加，或者可以稍后添加以补充耗尽的营养物或为了其他原因。本领域普通技术人员会知道可以包括在本发明的培养基配方中的任何期望或必需补充物，并且能够基于他或她的实验和/或其他需要选择添加哪些特定补充物。
多肽
可以按照本文所公开的方法和组合物生产在宿主细胞中可表达的包含潜在的糖基化位点的任何多肽。甚至更优选地，所述多肽在该多肽的配体结合位点中包含潜在的糖基化位点，所述配体结合位点例如但不限于抗体的抗原结合位点、受体的配体结合位点等。
可以从宿主细胞的内源基因，或者从引入宿主细胞的异源基因表达所述多肽。所述多肽可以是天然存在的多肽，或者可选地，可以具有已被改造或选择的序列。可以从自然中单独存在的多肽片段装配待生产的多肽。额外地或可选地，被改造的多肽可以包括一个或多个不是天然存在的片段。
可以根据本文所提供的新方法生产的示例性糖蛋白为本领域众所周知，并且包括但不限于2004年4月9日提交、2004年11月18日公开为WO 2004/099231的国际专利公开第PCT/US2004/011494号所提供的广泛列表(参见，例如，图28A至28CC)。
本发明的实践者会选择他们所关注的多肽，并且会知道其精确的氨基酸序列。任何待按照本发明表达的给定蛋白质会具有其自身的特定特征，可以通过培养的细胞影响糖基化水平，并且可以比在相同培养条件下生长的另一多肽或蛋白质更低的水平表达。本领域普通技术人员能够适当修改本文所述的发明培养基和方法以控制任何给定的表达多肽或蛋白质的糖基化水平。
在某些实施方案中，所述多肽包含潜在的糖基化位点。即，技术人员会理解所述多肽包含显示该蛋白质可以被细胞糖基化的特征，所述特征包括某些氨基酸序列。在某些实施方案中，潜在的糖基化位点为包含丝氨酸或苏氨酸的O-连接糖基化位点。参见Peter-Katalinic，2005，Methods inEnzymol.405：139-171。在其他实施方案中，所述多肽包含至少一个N-连接糖基化位点。参见Medzihradszky，2005，Methods in Enzymol.405：116-138。本领域技术人员会理解细胞将某些氨基酸序列识别为糖基化信号，从而将聚糖连接在某些天冬酰胺残基。在某些实施方案中，N-连接糖基化位点包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸(N-X-S)或天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在某些实施方案，N-连接糖基化位点包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括但不限于天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)。用于鉴定潜在的和实际的蛋白质糖基化位点的方法是本领域已知的，并且包括但不限于在URLhttp://www.expasy.ch/tools/的瑞士生物信息研究所(Swiss Institute ofBioinformatics)的蛋白质分析专家系统(Expert Protein Analysis System)蛋白质组学服务器可免费获得的翻译后修饰预测软件。这些不同程序包括但不限于DictyOGlyc(盘基网柄菌属(Dictyostelium)中GlcNAc O-糖基化位点的预测；在http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/可免费获得)；NetCGlyc(哺乳动物蛋白质中C-甘露糖化位点的预测；在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/可免费获得)；NetOGlyc(哺乳动物蛋白质中O-GalNAc、粘蛋白型糖基化位点的预测；在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/可免费获得)；NetGlycate(人蛋白质中赖氨酸的ε氨基的糖化的预测；在http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/可免费获得)；OGPET(真核(非原生动物)蛋白质中O-GalNAc、粘蛋白型糖基化位点的预测；在http://ogpet.utep.edu/OGPET/可免费获得)；以及YinOYang(真核蛋白质序列中O-beta-GlcNAc连接位点的预测，在http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/可免费获得)。在某些实施方案中，蛋白质可以包含O-连接和N-连接糖基化位点，并且这类蛋白质为本领域众所周知或者技术人员可以很容易鉴定。
通常在令人关注或有用的生物学或化学活性的基础上选择可以期望按照本发明表达的多肽。在某些实施方案中，采用本发明的方法和/或组合物表达蛋白质治疗剂或多肽治疗剂。例如，可以采用本发明表达任何药学或商业相关受体、抗体、酶、激素、调控因子、抗原、结合剂等。可以根据本发明生产的多肽和蛋白质的以下列表仅为自然中的示例，并不是限制性叙述。本领域普通技术人员会理解任何多肽或蛋白质可以按照本发明表达，并且能够基于他或她的特定需要选择待生产的特定多肽。
受体
已证实作为药学和/或商业药剂有效并且可以期望根据本发明的教导来生产的一类多肽包括受体。考虑到受体的生物学重要性和它们作为潜在的治疗剂的重要性，按照本发明的方法和组合物生产这些分子特别令人关注。受体通常为跨膜糖蛋白，其通过识别胞外信号配体来发挥功能。除了配体识别结构域之外，受体通常具有蛋白激酶结构域。当结合配体时这个蛋白激酶结构域通过磷酸化靶胞内分子来启动信号途径，导致细胞内发育或代谢变化。
在某些实施方案中，按照本发明的系统和方法表达晚期糖基化终产物受体(RAGE)。其中，可以表达的示例性RAGE蛋白提供于：2005年8月3日提交的国际专利申请第PCT/US2005/027694号，现在公开为2006年2月16日的WO 2006/017643；2005年8月3日提交的国际专利申请第PCT/US2005/027705号，现在公开为2006年2月16日的WO 2006/017647；2007年1月23日提交的国际专利申请第PCT/US2007/001686号，现在公开为2007年8月23日的WO 2007/094926；2007年4月25日提交的国际专利申请第PCT/US2007/010125号，现在公开为2007年11月15日的WO2007/130302；以及2008年2月11日提交的国际专利申请第PCT/US2008/001786号，现在公开为2008年8月21日的WO 2008/100670(每个整体援引加入本文)。在一实施方案中，RAGE配体结合位点包括全长人RAGE的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)(包括信号序列在内)的约氨基酸24(Gln24；Q24)至52号氨基酸残基(Lys52；K52)。在其他实施方案中，配体结合位点包含RAGE V-结构域，全长人RAGE的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)(包括信号序列在内)的从约氨基酸24(Gln24；Q24)至116号氨基酸残基(Arg116；R116)。人RAGE的全长氨基酸序列如下文所示，信号序列以小写字母表示，并且两个潜在的N-连接糖基化位点有下划线：
全长人RAGE(SEO ID NO：3)
编码人RAGE的氨基酸1-251的核酸序列(SEQ ID NO：4)如下：
Figure BPA00001481727800472
通常，前22或23个氨基酸(以小写字母表示)包含信号序列，并且在哺乳动物细胞表达的成熟RAGE中不存在。此外，当前23个氨基酸包含信号序列并且成熟RAGE在位置1包含谷氨酰胺氨基酸残基(Q)时，该谷氨酰胺(Q)通常环化为焦谷氨酸(示为“pE”)，从而人RAGE的配体结合位点包含以下序列：
在某些实施方案中，RAGE多肽包含RAGE的V样结构域，所述V样结构域包含以下氨基酸序列：
Figure BPA00001481727800482
通过本文所提供的公开，本领域技术人员会理解人RAGE的配体结合位点可以包含任何长度的氨基酸，范围从SEQ ID NO：14的序列至SEQ IDNO：16的氨基酸序列。在每个实例中，RAGE的配体结合位点包含至少一个N-连接糖基化位点，其位于SEQ ID No：13和16的序列的Asn3和59(其中信号序列长度为22个氨基酸)，或者位于SEQ ID NO：14、15、17和18的Asn2和/或Asn58(其中信号序列长度为23个氨基酸)。
根据某些实施方案，晚期糖基化终产物受体包括可溶性RAGE(sRAGE)。即，sRAGE不包含RAGE的跨膜和胞质结构域。参见Neeper etal.，1992，J.Biol.Chem.267：14998-15004；Park et al.，1998，Nature Med.4：1025-1031。在某些实施方案中，RAGE包括可溶性RAGE-Ig融合蛋白，例如，RAGE-Fc，其包含部分RAGE，所述部分RAGE包含与部分免疫球蛋白(“Ig”)共价连接的配体结合位点。在某些实施方案中，sRAGE融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc(其中Fc通常包含例如IgG的铰链区、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，sRAGE-Ig包含人Ig的铰链部分，其中铰链结构域跨越从第一重链恒定结构域(CH1)的末端至第二重链恒定结构域(CH2)的开端的氨基酸序列。参见，例如，Strom&Zhen的美国专利第6,165,476号(在衔接第4列的底部至第5列的顶部的表示出了人和小鼠免疫球蛋白的铰链结构域的氨基酸序列)。在某些实施方案中，包含铰链区的人sRAGE-Ig融合蛋白涵盖2003年8月18日提交、现在公开为2004年2月16日的WO 2004/016229的国际专利申请第PCT/US2003/025996号所述的如图3A所示的人sRAGE-Fc。在其他实施方案中，sRAGE-Ig融合蛋白包含通过6个氨基酸的接头(即，IEGRMD)与人IgG恒定结构域(人IgG1的氨基酸Pro100至Lys330)融合的人RAGE胞外结构域(SEQ ID NO：3的氨基酸残基1号至344号)。参见产品编号1145-RG，R&D Systems，Minneapolis，MN。此外，包含铰链区的sRAGE-Fc融合涵盖如WO 2004/016229图1B所述的小鼠sRAGE-Fc，以及可以从R&D Systems(Minneapolis，MN)商购的分别如产品编号1179-RG、1616-RG所述的小鼠和大鼠sRAGE-Fc融合蛋白。在其他实施方案中，RAGE融合蛋白包含与人Ig结构域融合的小鼠RAGE的可溶性结构域。在其他实施方案中，RAGE融合蛋白包含与来自人IgG4免疫球蛋白的恒定重链结构域融合的人RAGE的sRAGE部分。参见，例如，提交的国际专利公开第PCT/US2008/066956号(如第12页第055段表2所示，示出了包含人IgG4的Fc区的人sRAGE-Fc融合蛋白的氨基酸序列；如第13页第0059段表4所示，示出了包含7个氨基酸的接头序列GSGSGSG的sRAGE-Fc IgG4融合蛋白的氨基酸序列，所述接头连接sRAGE部分与人IgG4Fc部分；如第15页第0063段表6所示，示出了包含连接至人IgG4的Fc区的人sRAGE的氨基酸序列的sRAGE-Fc融合蛋白的氨基酸序列，其在推测的人RAGE的弗林蛋白酶切割位点或附近还包含两个点突变；以及如第17页第0067段表8所示，示出了包含7个氨基酸的接头序列GSGSGSG的sRAGE-Fc IgG4融合蛋白的氨基酸序列，所述接头连接sRAGE与人IgG4Fc部分，所述sRAGE-Fc IgG4融合蛋白在推测的人RAGE的弗林蛋白酶切割位点或附近还包含两个点突变)。
在某些实施方案中，sRAGE-Ig包含缺少铰链部分的免疫球蛋白部分，其中CH2的第一个氨基酸不存在，并且其中用RAGE结构域内接头序列或者与其至少70、75、80、85、90、95、97、98或99％相同的序列代替铰链区。
在某些实施方案中，RAGE-Ig融合蛋白包含与缺少铰链区的部分Ig融合的RAGE的胞外部分。在一实施方案中，将包含RAGE的V-结构域的人RAGE的胞外部分与部分人IgG1融合，所述部分人IgG1包含人IgG1的部分CH2结构域和整个CH3结构域并缺少铰链区。参见，例如，WO2006/017643和WO 2006/017647(整体援引加入本文，并且如图4所示，提供了包含3个结构域的sRAGE-Ig融合蛋白)。在另一实施方案中，RAGE-Ig融合蛋白包含4个结构域，RAGE V-结构域、RAGE C1结构域、部分人IgG1CH2结构域和人IgG1的整个CH3结构域，以及铰链区。参见，例如，WO2006/017643和WO 2006/017647图5；以及WO 2008/100470(图4B和4D提供了3个结构域的sRAGE-Fc融合蛋白，并且如图4A和4C所示，提供了4个结构域的sRAGE-Ig融合蛋白)(每个整体加入本文)全部缺少铰链区。此外，在某些实施方案中，sRAGE融合蛋白包括这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含在羧基端与6-组氨酸标签融合的犬RAGE的胞外结构域，即可溶性结构域(产品编号4750-RG，R&D Systems，Minneapolis，MN)。
本文举例说明了某些RAGE融合蛋白。然而，本发明不限于这些或任何其他RAGE多肽，而是包括任何包含配体结合位点的RAGE蛋白或其片段，或者与其至少70、75、80、85、90、95、97、98或99％相同的序列，其中优选地，所述配体结合位点包含潜在的糖基化位点。
在某些实施方案中，RAGE-融合蛋白包含RAGE的配体结合位点，所述配体结合位点分别在丙氨酸23(22个氨基酸的信号序列不在成熟肽中)或者在残基24处的谷氨酰胺(Q)或焦谷氨酸(pE)(23个氨基酸的信号序列不在成熟肽中，并且谷氨酰胺环化为pE)起始，并且分别在SEQ ID NO：3的氨基酸残基Lys30或Lys29终止。在其他实施方案中，所述融合蛋白的RAGE部分包含RAGE的V-结构域，所述V-结构域大约从氨基酸丙氨酸23(22个氨基酸的信号序列不在成熟肽中)或者在残基24处的谷氨酰胺(Q)或焦谷氨酸(23个氨基酸的信号序列不在成熟肽中，并且谷氨酰胺环化为pE)，并且在SEQ ID NO：3的氨基酸残基Arg116终止(包括前导肽)。参见WO2007/094926，例如，图1D。
在其他实施方案中，其中RAGE-Ig融合蛋白包含C端赖氨酸(K)氨基酸残基，本领域技术人员会理解所述赖氨酸残基可以被剪掉，导致缺少C端赖氨酸残基的融合蛋白。
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含一定量的如本文实施方案中任一个所述的蛋白质，其中至少0.5％的蛋白质是非糖基化的。蛋白质量的百分率涉及样品中蛋白质分子的数量，并且在适当情况下，考虑糖基化对蛋白质分子量的影响。在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质的百分率少于蛋白质总量的67％，或者少于65％，或者少于60％，或者少于55％，或者少于50％，或者少于45％。在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质量的百分率少于所有非完全糖基化形式的蛋白质量相加的百分率。例如，在蛋白质具有2个糖基化的潜在位点的情况下，完全糖基化形式(即，双糖基化)的sRAGE-Ig融合蛋白量的百分率少于以单糖基化和非糖基化形式存在的蛋白质量相加的百分率。在另一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含一定量的如本文实施方案中任一个所述的sRAGE-Ig融合蛋白，其中至少0.5％的sRAGE-Ig融合蛋白是非糖基化的。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
当在包含一定量的sRAGE-Ig融合蛋白的组合物的上下文内使用时，“sRAGE-Ig融合蛋白量”是通过用于蛋白质的典型分析检测方法可检测的量。在一实施方案中，sRAGE-Ig融合蛋白量大于0.01mg。在另一实施方案中，sRAGE-Ig融合蛋白量大于0.1mg。在另一实施方案中，sRAGE-Ig融合蛋白量大于1.0mg。
在另一实施方案中，非糖基化形式的sRAGE-Ig融合蛋白量的百分率为sRAGE-Ig融合蛋白总量的至少1％、或者至少2％、或者至少3％、或者至少4％、或者至少5％、或者至少6％、或者至少7％、至少8％、或者至少9％、或者至少10％、或者至少12％、或者至少14％、或者至少16％、或者至少18％、或者至少20％、或者至少22％、或者至少24％、或者至少26％、或者至少28％、或者至少30％。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，完全糖基化形式的sRAGE-Ig融合蛋白的百分率少于sRAGE-Ig融合蛋白总量的67％、或者少于65％、或者少于60％、或者少于55％、或者少于50％、或者少于45％。在另一实施方案中，完全糖基化形式的sRAGE-Ig融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的sRAGE-Ig融合蛋白量相加的百分率。例如，在sRAGE-Ig融合蛋白具有3个糖基化的潜在位点的情况下，完全糖基化形式(即，三糖基化)的sRAGE-Ig融合蛋白量的百分率少于以双糖基化、单糖基化和非糖基化形式存在的sRAGE-Ig融合蛋白量相加的百分率。因此，当潜在的糖基化位点的数目为n个并且n为大于或等于1的整数时，包含n个糖基化的位点的sRAGE-Ig融合蛋白量比以具有少于或等于n-1个糖基化的位点的所有形式存在的sRAGE-Ig融合蛋白的总量少。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一方面，本发明提供包含一定量的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，
a)其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO：3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配体结合位点和至少一个可以被糖基化的氨基酸残基，
b)其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的CH2结构域或部分CH2结构域和免疫球蛋白的CH3结构域，以及
c)其中所述免疫球蛋白多肽的N端残基连接至所述RAGE多肽的C端残基；以及
其中所述融合蛋白的量的至少0.5％是非糖基化的。在一实施方案中，所述融合蛋白不包括RAGE多肽的信号序列。所述信号序列可以是SEQ IDNO：4的氨基酸残基1-18、1-22或1-23。在另一实施方案中，所述RAGE多肽包含选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的序列。在另一实施方案中，所述RAGE多肽包含选自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列。在另一实施方案中，所述融合蛋白的N端序列选自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。在另一实施方案中，所述RAGE多肽包含SEQ ID NO：3的23-116、23-118、23-136、23-230、23-256、23-305、23-321、23-330或23-344的氨基酸残基。
当在包含一定量的融合蛋白的组合物的上下文内使用时，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，“融合蛋白量”是通过用于蛋白质的典型分析检测方法可检测的量。在一实施方案，所述融合蛋白量大于0.01mg。在另一实施方案，所述融合蛋白量大于0.1mg。在另一实施方案，所述融合蛋白量大于1.0mg。
在另一实施方案中，非糖基化形式的融合蛋白量的百分率为sRAGE-Ig融合蛋白总量的至少1％、或者至少2％、或者至少3％、或者至少4％、或者至少5％、或者至少6％、或者至少7％、至少8％、或者至少9％、或者至少10％、或者至少12％、或者至少14％、或者至少16％、或者至少18％、或者至少20％、或者至少22％、或者至少24％、或者至少26％、或者至少28％、或者至少30％。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于sRAGE-Ig融合蛋白总量的67％、或者少于65％、或者少于60％、或者少于55％、或者少于50％、或者少于45％。在另一实施方案中，完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非糖基化形式的融合蛋白量的百分率。例如，在融合蛋白具有3个糖基化的潜在位点的情况下，完全糖基化形式(即，三糖基化)的融合蛋白量的百分率少于双糖基化、单糖基化和非糖基化形式的融合蛋白量相加的百分率。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，所述融合蛋白包含至少2个可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，所述融合蛋白包含至少3个可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，所述融合蛋白中糖基化的潜在位点的数目为2个。在另一实施方案中，所述融合蛋白中糖基化的潜在位点的数目为3个。在另一实施方案中，RAGE配体结合位点包含可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，其中所述融合蛋白包含至少2个可以被糖基化的氨基酸残基，糖基化的第一潜在位点是RAGE配体结合位点的氨基酸残基，并且糖基化的第二潜在位点是免疫球蛋白多肽的氨基酸残基。在另一实施方案中，其中所述融合蛋白包含至少3个可以被糖基化的氨基酸残基，糖基化的第一潜在位点是RAGE配体结合位点的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点是RAGE多肽的氨基酸残基，而糖基化的第三潜在位点是免疫球蛋白多肽的氨基酸残基。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
当在包含一定量的融合蛋白的上下文内使用时，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，“免疫球蛋白多肽”包括在所述免疫球蛋白的CH2和CH3结构域的连接处的受保护的FcRn清道夫受体结合位点。所述免疫球蛋白多肽可以是来自已知重链同种型中任一种的片段或整个重链：IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。此外，所述重链(或其部分)可以来源于已知重链亚型中的任一种：IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)或这些同种型的突变或改变生物学活性的亚型。在一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽可以含有不同免疫球蛋白同种型和/或重链亚型的部分或结构域。在一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽是IgG1亚型的。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽是IgG2亚型的。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽是IgG3亚型的。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽是IgG4亚型的。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的Fc片段的一条重链片段的片段。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的重链。在另一实施方案中，所述免疫球蛋白多肽和融合蛋白不包括免疫球蛋白的铰链区。
在某些实施方案中，按照本发明的系统和方法表达肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；1991年3月20日公开的EP 417,563；和TNFR-2，1991年3月20日公开的EP 417,014，每个整体援引加入本文)形式的肿瘤坏死因子抑制剂(综述参见Naismith and Sprang，1995-96，J.Inflamm.47：1-7，整体援引加入本文)。根据某些实施方案，肿瘤坏死因子抑制剂包括可溶性TNF受体。在某些实施方案中，肿瘤坏死因子抑制剂包括可溶性TNFR-Ig。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂为TNFRI和TNFRII可溶形式。在其他实施方案中，所述TNF抑制剂包括小鼠可溶性TNFRII-Fc融合蛋白。参见，例如，WO 2004/016229图2B)。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂为可溶性TNF结合蛋白。在某些实施方案中，本发明的TNF抑制剂为TNFR-Ig融合蛋白，例如，TNFR-Fc或依那西普。如本文所用，“依那西普”指TNFR-Fc，其为p75TNF-α受体的胞外部分的两个分子的二聚体，每个分子由人IgG1的235个氨基酸的Fc部分组成。
在某些实施方案中，待按照本发明生产的受体为受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括对各种功能和多种细胞类型至关重要的受体(参见，例如，Yarden and Ullrich，1988，Ann.Rev.Biochem.57：433-478；Ullrich andSchlessinger，1990，Cell 61：243-254，援引加入本文)。RTK的非限制性实例包括肿瘤坏死因子α和β受体(TNFR-1；1991年3月20日公开的EP 417,563；和TNFR-2，1991年3月20日公开的EP 417,014；综述参见上文Naismith andSprang，援引加入本文)、成纤维细胞生长因子(FGF)受体家族成员、表皮生长因子受体(EGF)家族成员、血小板衍生生长因子(PDGF)受体、具有免疫球蛋白和EGF同源结构域的酪氨酸激酶-I(TIE-1)和TIE-2受体(Sato et al.，1995，Nature 376：70-74，援引并入本文)以及c-Met受体，据提示其中一些直接或间接促进血管发生(Mustonen and Alitalo，1995，J.Cell Biol.129：895-898)。RTK的其他非限制性实例包括胎肝激酶1(FLK-1)(有时被称为含激酶插入域受体(KDR)(Terman et al.，1991，Oncogene 6：1677-83)或血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2))、fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1)(DeVries et al.1992，Science 255；989-991；Shibuya et al.，1990，Oncogene5：519-524，)、有时被称为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR-1)，神经毡蛋白-1、内皮因子(endoglin)、内皮唾液酸蛋白以及Ax1。本领域普通技术人员会知道可以按照本发明的某些方法和组合物表达的其他受体。
在某些实施方案中，待按照本发明生产的受体为G蛋白偶联受体(GPCR)。GPCR是药物作用和开发的主要靶标，已导致目前已知药物的一半以上(Drews，1996，Nature Biotechnology，14：1516)，并且GPCR代表治疗性干预的最重要的靶标，30％的临床处方药拮抗或对抗GPCR(Milligan，G.and Rees，S.，TIPS，20：118-124，1999)。因为这些受体作为治疗靶标具有已建立的、证实的历史，所以按照本发明生产GPCR也是特别令人关注的。
谷氨酸受体形成了一组在神经传递中很重要的GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神经递质，并且据信在神经元塑性、认知、记忆、学习以及诸如癫痫、中风和神经退行性变的一些神经病症中具有重要作用(Watson，S，andS.Arkinstall，In：The G-Protein Linked Receptor Facts Book，Academic Press，San Diego Calif.，pp.130-132，1994)。血管活性肠肽(VIP)家族是一组相关多肽，其作用也通过GPCR介导。该家族的主要成员为VIP本身、促胰液素和生长激素释放因子(GRF)。VIP具有广泛的生理作用，包括平滑肌的松弛、各种组织中分泌的刺激或抑制、各种免疫细胞活性的调节以及CNS中的各种兴奋和抑制活性。促胰液素在胰和肠中刺激酶和离子的分泌，并且还在脑中少量存在。
抗体
抗体是具有特异性结合特定抗原的能力的蛋白质。考虑到目前作为药学或其他商业药剂使用或研究的大量抗体，按照本发明的方法和组合物生产抗体特别令人关注。
可以按照本发明使用可以在宿主细胞中表达的任何抗体。更优选地，所述抗体在该抗体的抗原结合位点中或附近包含潜在的糖基化位点。在一实施方案中，所述抗体在可变结构域中包含糖基化位点。在另一实施方案中，所述糖基化位点可以位于CDR或FR中，甚至更优选地，所述糖基化位点的位点占据影响所述抗体与其抗原的结合。
在某些实施方案中，待表达的抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，所述单克隆抗体为嵌合抗体。如本领域所知道的，嵌合抗体含有来源于一种以上生物体的氨基酸片段。嵌合抗体分子可以包括，例如，来自小鼠、大鼠或其他物种的抗体的抗原结合结构域，以及人恒定区。已描述了各种用于制备嵌合抗体的方法。参见例如，Morrison et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851；Takeda et al.，1985，Nature 314：452；Cabilly et al.，美国专利第4,816,567号；Boss等人，美国专利第4,816,397号；Tanaguchi等人，欧洲专利公开EP171496；欧洲专利公开0173494，英国专利GB 2177096B，每个整体援引加入本文。
在某些实施方案中，所述单克隆抗体为人源化抗体。人源化抗体为嵌合抗体，其中大部分氨基酸残基来源于人抗体，因此当递送至人对象时最小化任何可能的免疫反应。在人源化抗体中，用来自非人物种的赋予期望的抗原特异性或亲和力的残基代替高变区中的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体具有与人抗体至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％相同或更高的氨基酸序列。在某些实施方案中，通过引入保守性取代、共有序列取代、种系取代和/或回复突变来优化人源化抗体。这类改变的免疫球蛋白分子可以通过本领域已知的任何若干技术来制备，(例如，Teng et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：7308-7312；Kozboret al.，1983，Immunology Today 4：7279；Olsson et al.，1982，Meth.Enzymol.92：3-16)，并且可以根据PCT公开WO92/06193或EP 0239400的教导来制备，每个整体援引加入本文)。
在某些情况下，本公开的抗体为人单克隆抗体。可以利用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生这样的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别被称为的HuMAbMouse
Figure BPA00001481727800571
和KM Mouse的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb Mouse
Figure BPA00001481727800573
(Medarex，Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使内源性μ和κ链基因座失活的定向突变(参见例如，Lonberg，et al.，1994，Nature 368：856-859)。因此，该小鼠表现出减少的小鼠IgM或κ表达，并且对免疫应答，引入的人重链和轻链转基因进行类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(上文Lonberg et al.，1994；在Lonberg，1994，Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101中综述；Lonberg and Huszar，1995，Intern.Rev.Immunol.13：65-93，Harding and Lonberg，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546)。进一步参见，Taylor et al.，1992，Nucleic Acids Research20：6287-6295；Chen et al.，1993，International Immunol.5：647-656；Tuaillon etal.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi et al.，1993，NatureGenetics 4：117-123；Chen et al.，1993，EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.，1994，J.Immunol.152：2912-2920；Taylor et al.，1994，InternationalImmunology 6：579-591；和Fishwild et al.，1996，Nature Biotechnology 14：845-851；全部为Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；Surani等人的美国专利第5,545,807号；全部为Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开第WO01/14424号。
在另一种情况下，可以利用在转基因和转染色体(transchomosome)上携带人免疫球蛋白序列的小鼠产生本公开的人抗体，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。在Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中详细描述了本文中被称为“KM miceTM”的这类小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可选转基因动物系统在本领域中可获得，并且可以用于产生本公开的抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的可选转基因系统；例如，Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963描述了这样的小鼠。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可选转染色体动物系统在本领域中可获得，并且可以用于产生本公开的抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称为“TC小鼠”；这样的小鼠如Tomizuka et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727所述。而且，在本领域中已描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa et al.，2002，Nature Biotechnology 20：889-894)，并且其可以用于产生本公开的抗体。
还可以利用SCID小鼠制备本公开的人单克隆抗体，其中人免疫细胞已重建入SCID小鼠，从而当免疫时可以产生人抗体应答。例如，Wilson等人的美国专利第5,476,996号和第5,698,767号描述了这样的小鼠。
还可以利用筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本公开的人单克隆抗体。在本领域中建立了用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利第5,427,908号和第5,580,717号；McCafferty等人的美国专利第5,969,108号和第6,172,197号；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
在某些实施方案中，本发明的抗体在该抗体的可变结构域中包含至少一个潜在的糖基化位点。在某些实施方案中，所述糖基化位点位于CDR中，而在其他实施方案中，所述糖基化位点位于FR中或者位于CDR和FR中。在其他实施方案中，所述抗体在恒定结构域中包含至少一个糖基化位点。优选地，所述抗体在重链恒定结构域中包含糖基化位点。
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含一定量的如本文实施方案中任一个所述的蛋白质，其中至少0.5％的蛋白质是非糖基化的。蛋白质量的百分率涉及样品中蛋白质分子的数量，并且在适当情况下，考虑糖基化对蛋白质分子量的影响。在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质的百分率少于蛋白质总量的98％、或者少于97％、或者少于96％、或者少于95％、或者少于94％、或者少于93％、或者少于92％、或者少于91％、或者少于90％、或者少于87％、或者少于85％、或者少于80％、或者少于75％、或者少于70％、或者少于67％、或者少于65％、或者少于60％、或者少于55％、或者少于50％、或者少于45％。在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质量的百分率少于所有非糖基化形式的蛋白质量相加的百分率。例如，在蛋白质具有2个糖基化的潜在位点的情况下，完全糖基化形式(即，两个位点均完全糖基化，存在完全糖形)的蛋白质量的百分率少于以单非糖基化(一个位点是非糖基化的)和完全非糖基化(两个位点均为非糖基化的)形式存在的蛋白质量相加的百分率，其中，“非糖基化”包括其中在位点上存在的糖形比当所述蛋白质完全糖基化时在该位点存在的完全糖形少包含至少1个、至少2个、至少3个糖部分。在另一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含一定量的如本文实施方案中任一个所述的蛋白质，其中至少0.5％的蛋白质是非糖基化的。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
当在包含一定量的蛋白质的组合物的上下文内使用时，“蛋白质量”是通过用于蛋白质的典型分析检测方法可检测的量。在一实施方案中，所述蛋白质量大于0.01mg。在另一实施方案中，所述蛋白质量大于0.1mg。在另一实施方案中，所述蛋白质量大于1.0mg。
在另一实施方案中，非糖基化形式的蛋白质量的百分率为蛋白质总量的至少1％、或者至少2％、或者至少3％、或者至少4％、或者至少5％、或者至少6％、或者至少7％、至少8％、或者至少9％、或者至少10％、或者至少12％、或者至少14％、或者至少16％、或者至少18％、或者至少20％、或者至少22％、或者至少24％、或者至少26％、或者至少28％、或者至少30％。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质的百分率少于蛋白质总量的95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、以及少于67％、或者少于65％、或者少于60％、或者少于55％、或者少于50％、或者少于45％。在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质量的百分率少于所有非糖基化形式的蛋白质量相加的百分率。例如，在蛋白质具有3个糖基化的潜在位点的情况下，完全糖基化形式(即，3个位点完全糖基化)的蛋白质量的百分率少于以双糖基化(2个位点完全糖基化)、单糖基化(1个位点完全糖基化)和非糖基化(全部3个位点非糖基化)形式存在的蛋白质量相加的百分率。因此，当潜在的糖基化位点的数目为n个并且n为大于或等于1的整数时，包含n个糖基化的位点的蛋白质量比以具有少于或等于n-1个糖基化的位点的所有形式存在的蛋白质总量少。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一方面，本发明涵盖包含蛋白质的组合物，其中所述蛋白质为包含多肽链的抗体，所述多肽链包含两个潜在的糖基化位点，其中完全糖基化形式(即，两个位点均被占据，并且在每个位点存在完全糖形)的抗体量少于所有非完全糖基化形式的抗体相加的量。如技术人员所理解的，典型的抗体通常包含两条重链和两条轻链。当重链包含两个糖基化位点(如图14图解所示抗体，在可变结构域中包含一个糖基化位点并且在恒定结构域中包含一个糖基化位点)时，或者当重链和轻链各自包含一个糖基化位点时，或者当每条轻链包含两个糖基化位点时，完全糖基化的抗体可以包含4个糖基化位点。因此，在典型抗体的情况下，所述抗体可以包含4个糖基化的潜在位点，每条重链上两个，或者每条重链和轻链上一个，或者轻链上两个，并且本发明包括一种组合物，其中完全糖基化形式(即，4个位点完全糖基化)的抗体量的百分率少于以单非糖基化(一条链中的一个位点和其他链上的两个是完全糖基化的)、双非糖基化(一条链中的两个位点或者每条链上的一个位点是完全糖基化的)、三非糖基化(仅一条链中的一个位点是完全糖基化的)和完全非糖基化(全部4个位点是非糖基化的)形式存在的抗体量相加的百分率。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的或不完全糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一方面，本发明提供包含一定量的蛋白质的组合物，所述蛋白质包括抗体，其中所述蛋白质的量的至少0.5％是非糖基化的。
当在一定量的包括抗体在内的蛋白质的上下文内使用时，“蛋白质量”是通过用于蛋白质的典型分析检测方法可检测的量。在一实施方案中，所述蛋白质量大于0.01mg。在另一实施方案中，所述蛋白质量大于0.1mg。在另一实施方案中，所述蛋白质量大于1.0mg。
在另一实施方案中，非糖基化形式的蛋白质量的百分率为蛋白质总量的至少1％、或者至少2％、或者至少3％、或者至少4％、或者至少5％、或者至少6％、或者至少7％、至少8％、或者至少9％、或者至少10％、或者至少12％、或者至少14％、或者至少16％、或者至少18％、或者至少20％、或者至少22％、或者至少24％、或者至少26％、或者至少28％、或者至少30％。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，完全糖基化形式的蛋白质量的百分率少于组合物中蛋白质总量的97％、少于96％、少于95％、少于94％、少于93％、少于92％、少于91％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于67％、或者少于65％、或者少于60％、或者少于55％、或者少于50％、或者少于45％。在另一实施方案中，样品中完全糖基化形式的蛋白质量的百分率少于所有非完全糖基化形式的蛋白质量的百分率。例如，在蛋白质具有3个糖基化的潜在位点的情况下，样品中完全糖基化形式(即，三糖基化)的蛋白质量的百分率少于双、单和非糖基化形式的蛋白质量相加的百分率。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。
在另一实施方案中，所述蛋白质包含至少两个可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，所述蛋白质包含至少三个可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，所述蛋白质中糖基化的潜在位点的数目为2个。在另一实施方案中，所述蛋白质中糖基化的潜在位点的数目为3个。在另一实施方案中，所述蛋白质包含配体结合位点，所述配体结合位点包含可以被糖基化的氨基酸残基。在另一实施方案中，其中所述蛋白质包含至少两个可以被糖基化的氨基酸残基，糖基化的第一潜在位点是配体结合位点的氨基酸残基，并且糖基化的第二潜在位点是所述蛋白质的非配体结合位点中的氨基酸残基。在另一实施方案中，其中所述蛋白质包含至少三个可以被糖基化的氨基酸残基，糖基化的第一潜在位点是配体结合位点中的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点也是所述蛋白质的配体结合位点中的氨基酸残基，而糖基化的第三潜在位点是不在所述蛋白质的配体结合位点中的氨基酸残基。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，位点可以认为是非糖基化的，其中连接至该位点的糖残基的数目为3个或更少，或者2个或更少，或者1个或更少。在本段的任何实施方案的进一步实施方案中，蛋白质涵盖抗体的多肽链，并且配体结合位点包括抗体的抗原结合位点。
作为一个非限制性实例，可以根据本教导生产的抗体为抗人IgE抗体。在哮喘和其他IgE介导的疾病的治疗中，抗IgE抗体是特别有前途的潜在治疗途径，所述IgE介导的疾病例如但不限于过敏性鼻炎和食物过敏。
抗IgE抗体是潜在的有前途的哮喘治疗途径，因为一旦IgE抗体结合抗原，其可以阻止IgE与FcεRI结合，从而阻止FcεRI受体的交联。阻止结合至FcεRI受体的IgE抗体的交联抑制潜在的过敏反应中组胺释放的触发。因此，有利于治疗例如哮喘的抗IgE抗体理想地结合IgE并抑制其与FcεRI受体相互作用，但是不结合已结合至所述受体的IgE，从而保证该抗体不可以交联所述受体并触发过敏反应(称为“非过敏性抗体”)。
在本发明中可采用的抗体的实例和生产它们的方法如2008年4月1日提交、2008年10月16日公开为WO 2008/123999的国际申请第PCT/US2008/004286号所述，其援引加入本文。在本文提供关于这个抗体的氨基酸序列的信息的同时，其他信息可以在WO 2008/123999中找到；这些申请中示出的序列援引加入本文。
这些抗体用于治疗各种IgE介导的疾病的某些用途如WO 2008/123999所讨论，其整体援引加入本文，所述IgE介导的疾病包括但不限于哮喘、过敏性鼻炎和食物过敏。
在某些实施方案中，抗IgE抗体或其抗原结合部分包含潜在的糖基化位点。所述糖基化位点可以在抗体或其抗原结合部分的CDR中，在FR中，或者在CDR和FR中。
在某些实施方案中，如通过其在细胞结合测定中减少IgE结合的能力所测量的，针对人IgE的抗IgE抗体或其部分具有0.5μg/mL或更少的IC50，所述细胞结合测定利用人FcεR1转染的RBL-2H3细胞系。
在另一实施方案中，如通过其抑制人FcεR1转染的RBL-2H3细胞系的IgE介导的脱粒的能力所测量的，抗IgE抗体或其部分具有0.5μg/mL或更少的IC50，其中将RBL-2H3(FcεR1)细胞与抗IgE抗体和人IgE培养48小时，洗涤以去除抗IgE:IgE复合物，留下结合至FcεR1的IgE，然后用交联结合的IgE的多克隆抗IgE抗体刺激，导致IgE介导的脱粒。在另一实施方案中，所述IC50少于0.2μg/mL、少于0.1μg/mL、少于0.08μg/mL或少于0.02μg/mL。
在另一实施方案，针对人IgE的抗体或其抗原结合部分不交联受体结合的IgE，并且不刺激RBL-2H3(FcεR1)细胞的IgE依赖性脱粒，所述RBL-2H3(FcεR1)细胞与人IgE培养48小时，然后洗涤以去除未结合的IgE。本发明的针对人IgE的抗体或其抗原结合部分对分离的RBL-2H3(FcεR1)没有激动剂活性
在某些实施方案中，针对人IgE的抗体或其抗原结合部分不交联受体结合的IgE，并且不刺激与人IgE培养过夜的人血嗜碱性粒细胞的IgE依赖性脱粒。本发明的针对人IgE的抗体或其抗原结合部分对分离的人血嗜碱性粒细胞没有激动剂活性。
在其他实施方案中，相对于人IgA、IgGI和lgG3，针对人IgE的抗体或其抗原结合部分高度选择IgE。
在某些实施方案中，如通过表面等离子共振(BIAcore)所测量的，所述抗体或其抗原结合部分结合至全长人IgE，具有15nM或更少的亲和力常数K0。
在某些实施方案中，非过敏性抗IgE抗体是如WO 2008/123999所公开的mAb 5.948.1。5.948.1抗体在重链可变结构域的氨基酸残基73号处包含潜在的N-连接糖基化位点。更具体地，所述糖基化位点位于可变结构域的第三框架区(FR3)中。
在某些实施方案中，抗IgE抗体或其部分在抗原结合结构域中包含潜在的糖基化位点。在某些实施方案中，所述抗体在可变结构域CDR或FR中包含潜在的糖基化位点。
在另一实施方案中，抗IgE抗体或其部分如抗体5.948.1结合至人IgE的相同表位。
在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：8具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少98％、更优选至少99％序列相同性的重链可变结构域氨基酸序列，以及与SEQ IDNO：10具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、甚至更优选至少98％、更优选至少99％序列相同性的轻链可变结构域氨基酸序列。在另一实施方案中，所述抗体或其抗原结合部分包含与SEQ ID NO：8相同的重链可变结构域氨基酸序列和与SEQ ID NO：10相同的轻链可变结构域氨基酸序列。
在某些实施方案，所述抗体或其抗原结合部分包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：8的CDR，并且还包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含SEQ ID NO：10的CDR。
在某些实施方案，所述抗体或其抗原结合部分包含如Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号所公开的抗CD33抗体M195(每个整体援引加入本文)。M195在该抗体的抗原结合部分内包含糖基化位点；更具体地，M195在重链可变结构域的第三框架区内包含N-连接糖基化位点。即，在小鼠亲本抗体的人源化过程中，糖基化位点被引入重链可变结构域的FR3。通过诱变去除糖基化位点增加抗体与CD33的结合。虽然已知约20％的抗体在可变结构域内包含糖基化位点，但是相信抗体的抗原结合片段中的糖基化对抗原结合没有影响。参见Sox&Hood，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 66：975。事实上，据报道在CDR2的糖基化实际上增加抗体与其抗原α-(1，6)-葡聚糖的结合(Wallick et al.，1988，J.Exp.Med.168：1099；Wright et al.，1991，EMBO J.10：2717)。因此，一旦采用本文所提供的公开，技术人员会理解应当评价所关注的抗体中潜在的糖基化位点的存在。可以利用本领域众所周知的各种方法进行这种评价，所述方法包括但不限于本文所提供的方法，如氨基酸序列分析和/或可以鉴定蛋白质中糖基化的存在的层析技术。
一旦已确定抗体在可变结构域或抗原结合部分中包含潜在的糖基化位点，本领域技术人员会理解本发明包括根据本文所提供的新方法降低所述抗体的糖基化水平，其不需要改变所述抗体的氨基酸序列。经过本文所提供的教导的技术人员会进一步理解本文所提供的新方法允许降低抗体的糖基化水平而不改变可变区的氨基酸序列。此外，本领域技术人员会理解改变抗体可变结构域中的即使单个氨基酸可以对抗原结合具有戏剧性的有害影响。因此，本文所提供的新方法使得能够减少抗体的糖基化，这可以改善所述抗体的结合特征，但是不改变可变结构域的氨基酸序列。
在某些实施方案中，与其他方面相同但是完全糖基化的蛋白质结合至相同配体或抗原相比，减少或消除蛋白质的糖基化分别增加所述蛋白质结合至受体或抗体的至少一个配体或抗原。
在其他实施方案中，即使与其他方面相同但是较多或完全糖基化的蛋白质相比，对较少糖基化的蛋白质的生物学活性可能没有影响，技术人员会理解非糖基化的蛋白质的生产可以提供重要的制造优势。即，特别地但不限于，包含至少两个聚糖的蛋白质的生产和/或当聚糖占据水平和/或在每个位点存在的糖形可能难以控制时，新方法提供了用于生产受控制的聚糖的有用方法以满足规范(例如，无糖基化)和/或减少批和/或分批失败。因此，一旦经过本文所提供的教导，技术人员会理解本发明提供了新方法以提高糖蛋白的细胞培养制造过程的稳健性，即使减少糖基化的/非糖基化的蛋白质的生物学活性未获得可检测的差异。
在另一实施方案中，包含较低水平的糖基化的本发明的蛋白质可以有利于x射线晶体学研究和胰蛋白酶消化研究(参见，例如，Chaplin et al.，1991，GBH Monographs 15(Protein)：279-282)。
可选地或额外地，当本发明的蛋白质包含免疫球蛋白结构域时，例如，所述蛋白质为抗体或包含部分Ig(例如，Fc部分)的融合蛋白，组合氨基酸修饰与一种或多种改变所述蛋白质的生物学特征的进一步的氨基酸修饰可以是有利的。
除了在框架区或CDR区内产生的修饰，或者可选地，可以改造本公开的糖蛋白以包括Fc区内的修饰，典型地以便改变所述抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本公开的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接至所述抗体)或者修饰以改变其糖基化，再次以便改变所述抗体的一种或多种功能特性。这些方面的每个在下文中进一步详细描述。Fc区中残基的编号为Kabat的EU索引的编号。
在一种情况下，修饰CH1的铰链区，从而改变铰链区中半胱氨酸的数目，例如，增加或减少。这种方法在Bodmer等人的美国专利第5,677,425号中进一步描述。例如，改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以促进轻链和重链的装配或者以提高或降低所述抗体的稳定性。
在另一种情况下，对抗体的Fc铰链区进行突变以减少所述抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，从而相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合，所述抗体具有受损的葡萄球菌(Staphylococcyl)A蛋白(SpA)结合。这种方法在Ward等人的美国专利第6,165,745号中进一步详细描述。
在另一种情况下，修饰所述抗体以增加其生物半衰期。各种方法是可行的。例如，如Ward的美国专利第6,277,375号所述，可以引入以下突变的一种或多种：T252L、T254S、T256F。可选地，为了增加生物半衰期，如Presta等人的美国专利第5,869,046号和第6,121,022号所述，可以在CH1或CL区内改变所述抗体以含有补救受体结合表位，所述补救受体结合表位来自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环。
在另一种情况下，通过用不同氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变所述抗体的效应子功能。例如，可以用不同氨基酸残基代替选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸，从而所述抗体具有改变的对效应子配体的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力被改变的效应子配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1组分。这种方法在Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中进一步详细描述。
在另一种情况下，可以用不同氨基酸残基代替选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸，从而所述抗体具有改变的C1q结合和/或减少或破坏的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法在Idusogie等人的美国专利第6,194,551号中进一步详细描述。
在另一实例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，以便从而改变所述抗体固定补体的能力。这种方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在另一实例中，修饰Fc区以增加所述抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加所述抗体对Fcγ受体的亲和力，这通过修饰在以下位置的一个或多个氨基酸：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这种方法在Presta的PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，人IgG1上对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已被定位，并且已描述具有提高的结合的变体(参见Shields et al.，2001 J.Biol.Chem.276：6591-6604)。据证实在位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变提高对FcγRIII的结合。此外，据证实以下组合突变体提高FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。例如，本文所述的22B5/DLE抗体使用IgG同种型的IgG1亚类，但是已通过位点定向诱变并入以下突变(与野生型IgG1亚类相比)：S247D；A338L；以及I340E。相似地，如下文更详细地描述，已将这样的S247D、A338L和I340E突变引入24C7、1D9和2D2单克隆抗体。如实施例进一步描述的，这样的突变可以增加所述抗体对Fcγ受体的亲和力，并且因此增加其效应子功能。因此，本发明涵盖一种抗体，所述抗体在Fc区中包含至少一个突变，并且具有可检测的比其他方面相同的不包含所述突变的抗体更大的ADCC反应。
在某些实施方案中，上文所述的单克隆、嵌合、单链或人源化抗体可以含有在自然中的任何物种中的任何抗体中不天然存在的氨基酸残基。例如，可以利用这些外源残基以赋予单克隆、嵌合、单链或人源化抗体新的或修饰的特异性、亲和力或效应子功能。
凝血因子(Clotting Factor)
据证实凝血因子作为药学和/或商业药剂是有效的。考虑到重组凝血因子在诸如血友病的疾病的治疗中的重要性，按照本发明的方法和组合物优化重组产生的凝血因子的表达特别令人关注。可以按照本发明生产的凝血因子的一个非限制性实例为凝血因子IX(因子IX，或“FIX”)。FIX为单链糖蛋白，其缺乏会导致血友病B，一种其中患者的血液不能凝固的病症。因此，任何导致出血的小伤口都是潜在的威胁生命的事件。
FIX具有多个糖基化位点，包括N-连接和O-连接糖。在细胞培养中通过中国仓鼠卵巢(″CHO″)细胞产生的FIX在丝氨酸61的寡糖链中表现出一些变异性。当给人或动物施用时，这些不同糖形和其他潜在的糖形可以具有不同的诱导凝固的能力和/或在血液中可以具有不同稳定性，导致较少有效的凝固。
与血友病B在临床上难以区分的血友病A是由另一糖蛋白人凝血因子VIII的缺陷所引起的，人凝血因子VIII作为单链酶原合成，然后加工为双链活性形式。也可以采用本发明控制或改变凝血因子VIII的糖基化模式以调节其凝固活性。可以按照本发明生产并控制或改变其糖基化模式的其他糖蛋白凝血因子包括，例如但不限于组织因子和血管假性血友病因子。
酶
据证实作为药学和/或商业药剂有效并且可以期望根据本发明的教导生产的另一类多肽包括酶。考虑到重组酶在疾病治疗以及其他商业和药学用途中的重要性，按照本发明生产酶特别令人关注。
作为一个非限制性实例，葡糖脑苷脂酶(GCR)的缺乏导致被称为戈谢病的疾病状况，其由某些细胞的溶酶体中葡糖脑苷脂酶的积累所引起。患有戈谢病的对象表现出一系列的症状，包括脾大、肝肿大、骨骼病症、血小板减少和贫血。Friedman和Hayes证实在一级氨基酸序列中含有单个取代的重组GCR(rGCR)表现出改变的糖基化模式，特别是与天然存在的GCR相比岩藻糖和N-乙酰基葡糖胺残基增加(参见美国专利第5,549,892号，整体援引加入本文)。因此，考虑按照本发明的方法生产GCR。本领域普通技术人员会知道可以按照本发明的方法生产的其他期望的酶。
生长因子和其他信号分子
据证实作为药学和/或商业药剂有效并且可以期望根据本发明的教导生产的另一类多肽包括生长因子和其他信号分子。考虑到生长因子和其他信号分子的生物学重要性以及它们作为潜在的治疗剂的重要性，按照本发明的方法和组合物生产这些分子特别令人关注。生长因子一般为细胞分泌的糖蛋白，并且结合和激活其他细胞上的受体，引发受体细胞中的代谢或发育变化。
哺乳动物生长因子和其他信号分子的非限制性实例包括细胞因子；表皮生长因子(EGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)，如aFGF和bFGF；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(TL)，例如，IL-1至IL-10；肿瘤坏死因子(TNF)α和β；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，如C蛋白；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，如尿激酶或者人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶，造血生长因子；脑啡肽酶；RANTES(调节激活正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；苗勒抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子，如NGF-β。本领域普通技术人员会知道可以按照本发明表达的其他生长因子或信号分子。
将用于表达多肽的核酸引入宿主细胞
在某些实施方案中，引入细胞的核酸分子编码期望根据本发明表达的多肽。在某些实施方案中，核酸分子可以编码诱导细胞表达期望多肽的基因产物。例如，引入的遗传物质可以编码激活内源或异源多肽的转录的转录因子。可选地或额外地，引入的核酸分子可以增加细胞所表达的多肽的翻译或稳定性。
所述核酸可以是编码蛋白质的任何核酸，所述蛋白质包含至少一个潜在的糖基化位点，N-连接或O-连接。在其他实施方案中，所述核酸编码包含至少一个N-连接和一个O-连接潜在的糖基化位点的蛋白质。对于特定蛋白质可以已知潜在的糖基化位点的存在，或者可以基于本领域众所周知的因素预测潜在的糖基化位点的存在，所述因素包括但不限于所述蛋白质的氨基酸序列中典型的糖基化位点的存在，许多可免费获得的用于预测糖基化位点的计算机软件程序等。在其他实施方案中，已知所述蛋白质被糖基化，这样的蛋白质包括但不限于抗体和大量糖蛋白，例如WO 2004/099231所示的糖蛋白。优选地，已知糖基化位点在与所述蛋白质的生物学功能相关或参与所述蛋白质的生物学功能的部分蛋白质内，例如但不限于介导所述蛋白质与另一蛋白质相互作用的位点。甚至更优选地，已知所述蛋白质的糖基化影响该蛋白质的生物学功能。然而，可以利用本文所提供的新方法生产任何包含潜在的糖基化位点的蛋白质，并且可以评价对所关注的功能的任何影响，例如，与另一蛋白质相互作用。即，可以比较根据本发明的方法在存在糖基化抑制剂的情况下产生的蛋白质的所关注的功能与在其他方面相同的条件下但是在不存在糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的蛋白质的该功能，从而评价糖基化是否影响所关注的功能。当糖基化影响蛋白质的所关注的功能时，所述蛋白质是待根据本发明的方法生产的候选。因此，可以通过本发明的新方法生产所关注的任何治疗性蛋白质，其中糖基化影响、介导所述蛋白质的治疗性功能或与之相关。
编码所关注的蛋白质的核酸序列可以通过本领域众所周知的方法获得，并且许多核酸序列可从许多数据库很容易获得。在某些实施方案中，所述序列为本领域已知。参见，例如，人RAGE序列可从GenBank获得(登录号NM_001136)，并且各种RAGE-Ig融合蛋白的序列在本领域中可获得，所关注的许多其他蛋白质的序列也是如此，包括抗体。在其他实施方案中，当编码所关注的蛋白质的核酸序列未知时，可以利用本领域众所周知的标准方法获得序列。在某些实施方案中，核酸序列可以但不必须密码子优化以增加本发明的方法所用的宿主细胞中蛋白质的表达。用于密码子优化以增加所关注的核酸的宿主细胞表达的技术为本领域众所周知，并且包括但不限于Angov等人(2008，PloS ONE 3：e2189[在www.plosone.org可获得])和Hatfield&Roth(2007，Biotechnol.Ann.Rev.13：27-42)所述的技术，而且蛋白质表达优化服务还可从例如CODA Genomics，Inc.(Laguna Hills，CA)和GENEART AG(Regensburg，Germany)商购。
一旦获得，然后将编码本发明的治疗性蛋白质的核酸引入宿主细胞。本领域已知适合将足以实现所关注的多肽的表达的核酸引入宿主细胞的方法。参见，例如，Gething et al.，1981，Nature 293：620-625；Mantei et al.，1979，Nature，281：40-46；Levinson et al.EP 117,060；和EP 117,058，每个援引加入本文。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入细胞的常用方法包括Graham andvan der Erb，1978，Virology 52：456-457的磷酸钙沉淀法或Hawley-Nelson，1993，Focus 15：73的LipofectamineTM(Gibco BRL)法。Axel在美国专利第4,399,216号中已描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的概况。对于用于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见Keown et al.，1990，Methods inEnzymology 185：527-537；Mansour et al.，1988，Nature，336：348-352；Sambrook and Russell，2001，In：Molecular Cloning，A Laboratory Approach，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY；和Ausubel et al.，2002，In：Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY。
在某些实施方案中，待引入的核酸为裸核酸分子形式。在这些实施方案的某些方面，引入细胞的核酸分子仅由编码多肽的核酸和必需的遗传控制元件组成。在这些实施方案的某些方面，编码多肽的核酸(包括必需的调控元件)包含在质粒载体内。用于在哺乳动物细胞中表达多肽的合适的载体的非限制性代表性实例包括pcDNA1；pCD，参见Okayama，et al.，1985，Mol.Cell Biol.5：1136-1142；pMClneo Poly-A；参见Thomas，et al.，1987，Cell51：503-512；杆状病毒载体，如pAC 373或pAC 610；CDM8(Seed，1987，Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman et al.，1987，EMBO J.6：187-195)。在某些实施方案中，待引入细胞的核酸分子包含在病毒载体内。例如，可以将编码多肽的核酸插入病毒基因组(或部分病毒基因组)。指导多肽表达的调控元件可以包括在插入病毒基因组的核酸内(即，连接至插入病毒基因组的基因)，或者可以由病毒基因组本身提供。
可以通过形成含有DNA和磷酸钙的沉淀物来将裸DNA引入细胞。额外地或可选地，还可以通过形成DNA与DEAE-葡聚糖的混合物并将所述混合物与细胞孵育，或者通过将细胞和DNA一起在合适的缓冲液中孵育并使细胞经历高压电脉冲(即，通过电穿孔)来将裸DNA引入细胞。在某些实施方案中，将裸DNA引入细胞是通过将DNA与含有阳离子脂质的脂质体悬浮液混合。然后将DNA/脂质体复合物与细胞孵育。还可以通过例如显微注射将裸DNA直接注射入细胞。
额外地或可选地，可以通过将DNA络合至诸如聚赖氨酸的阳离子来将裸DNA引入细胞，所述阳离子偶联至细胞表面受体的配体(参见例如Wuand Wu，1988，J.Biol.Chem.263：14621；Wilson et al.，1992，J.Biol.Chem.267：963-967；和美国专利第5,166,320号)。DNA-配体复合物结合至受体，促进通过受体介导的内吞作用的DNA的吸收。
使用病毒载体是用于将核酸序列引入细胞的常用方法，所述病毒载体含有特定核酸序列，例如编码多肽的cDNA。用病毒载体感染细胞具有优势，大部分细胞接收到核酸，这可以避免选择已接收核酸的细胞的需要。此外，病毒载体内例如病毒载体所含有的cDNA编码的分子一般在已接受病毒载体核酸的细胞中高效表达。
缺陷型逆转录病毒在为了基因治疗目的的基因转移中的用途已良好表征(综述参见Miller，A.D.，Blood 76：271，1990)。可以构建重组逆转录病毒，其具有插入逆转录病毒基因组的编码所关注的多肽的核酸。此外，可以去除部分逆转录病毒基因组以使逆转录病毒复制缺陷。然后将复制缺陷型逆转录病毒包装入病毒粒子，所述病毒粒子可以用于通过标准技术利用辅助病毒感染靶细胞。
可以操作腺病毒的基因组，从而其编码和表达所关注的蛋白质，但是其在正常裂解病毒生命周期中复制的能力被失活。参见，例如，Berkner et al.，BioTechniques 6：616，1988；Rosenfeld et al.，Science 252：431-434，1991；和Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155，1992。本领域已知来源于腺病毒毒株Ad 5型dl324或腺病毒的其他毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体。重组腺病毒的优势在于它们不需要分裂细胞作为有效的基因递送载体(vehicle)，并且可以用于感染各种细胞类型，包括气道上皮细胞(Rosenfeldet al.，1992，cited supra)、内皮细胞(Lemarchand et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6482-6486，1992)、肝细胞(Herz and Gerard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2812-2816，1993)和肌细胞(Quantin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：2581-2584，1992)。此外，引入的腺病毒DNA(和其中含有的外源DNA)并不整合入宿主细胞的基因组，而是保持游离，从而避免在引入的DNA整合入宿主基因组(例如，逆转录病毒DNA)的情况下作为插入诱变的结果可以发生的潜在问题。而且，相对于其他基因递送载体，腺病毒基因组对外源DNA的承载能力很大(达8千碱基)(Berkner et al.，cited supra；Haj-Ahmand and Graham，J.Virol 57：267，1986)。目前使用的大部分复制缺陷型腺病毒载体缺失病毒E1和E3基因的全部或部分，但是保留多达80％的腺病毒遗传物质。
腺伴随病毒(AAV)是天然存在的缺陷型病毒，其需要诸如腺病毒或疱疹病毒的另一病毒作为辅助病毒用于高效复制和生产生命周期。(综述参见Muzyczka et al.，Curr.Topics in Micro.and Immunol.158：97-129，1992)。腺伴随病毒还是可以将其DNA整合入非分裂细胞并表现出高频率的稳定整合的少数病毒中的一种(参见例如Flotte et al.，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356，1992；Samulski et al.，J.Virol.63：3822-3828，1989；和McLaughlinet al.，J.Virol.62：1963-1973，1989)。含有低至300碱基对的AAV的载体可以包装并且可以整合。外源DNA的空间限制在约4.5kb。如Tratschin等人(Mol.Cell.Biol.5：3251-3260，1985)所述的AAV载体可以用于将DNA引入细胞。利用AAV载体已将各种核酸引入不同细胞类型(参见例如Hermonat etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470，1984；Tratschin et al.，Mol.Cell.Biol.4：2072-2081，1985；Wondisford et al.，Mol.Endocrinol.2：32-39，1988；Tratschin et al，J.Virol.51：611-619，1984；和Flotte et al.，J.Biol.Chem.268：3781-3790，1993)。
在某些实施方案中，本发明包括使用哺乳动物人工染色体，利用例如人工染色体表达(ACE)技术将所关注的DNA或基因引入宿主细胞以产生表达重组蛋白的细胞系。与传统技术相比，这些哺乳动物人工染色体为细胞蛋白质生产提供优势，因为它们的高承载能力和不依赖于整合入宿主基因组的自我复制能力。以前，据证实称为ACE(人工染色体表达)的基于大卫星DNA的人工染色体可以在各种宿主细胞背景中很容易地重新产生(Csonka et al.，2000，J.Cell Sci.113：3207-3216；Hadlaczky，2001，Curr.Opin.Mol.Ther.3：125-132；Lindenbaum et al.，2004，Nucleic Acids Research 32：21；Perez et al.，2004，.Bioprocessing J.July/August 2004：61-68；Stewart et al.，2002，Gene Ther.9：719-723；Vanderbyl et al.，2005，Exp.Hematol.33：1470-14765)。
当用于将核酸分子引入细胞群体的方法导致大部分细胞的改变和细胞高效表达多肽时，可以使用改变的细胞群体而不进一步分离或亚克隆该群体内的个别细胞。即，通过该细胞群体可以有足够的多肽产生，从而不需要进一步的细胞分离，并且该群体可以立即用于接种细胞培养物用于多肽的生产。在某些实施方案中，可以期望分离和扩大来自高效产生多肽的单个细胞的同质细胞群体。
除了将编码所关注的多肽的核酸分子引入细胞，引入的核酸可以编码诱导或提高细胞内源性产生的蛋白质或多肽的表达水平的另一多肽、蛋白质或调控元件。例如，细胞能够表达特定多肽，但是不额外处理该细胞时可能失败。相似地，为了期望的目的，细胞可以表达不足量的多肽。因此，刺激所关注的多肽的表达的物质可以用于诱导或提高细胞表达该多肽。例如，引入的核酸分子可以编码转录因子，所述转录因子激活或上调所关注的多肽的转录。这样的转录因子的表达转而导致所关注的多肽的表达或更稳健的表达。相似地，引入的核酸分子可以含有一个或多个调控元件，所述调控元件从所关注的多肽的调控区探测(titrate)出一个或多个转录阻遏物。
在某些实施方案中，将指导多肽的表达的核酸稳定引入宿主细胞。在某些实施方案中，将指导多肽的表达的核酸瞬时引入宿主细胞。本领域普通技术人员能够基于他或她的实验需要选择将核酸稳定或瞬时引入细胞。
可以任选将编码所关注的多肽的基因连接至一个或多个调控遗传控制元件。在某些实施方案中，遗传控制元件指导多肽的组成型表达。在某些实施方案中，可以使用提供编码所关注的多肽的基因的诱导型表达的遗传控制元件。诱导型遗传控制元件(例如，诱导型启动子)的使用允许调节细胞中多肽的产生。在真核细胞中使用的潜在有用的诱导型遗传控制元件的非限制性实例包括激素调控元件(参见例如，Mader，S，and White，J.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5603-5607，1993)、合成配体调控元件(参见，例如Spencer，D.M.et al.，Science 262：1019-1024，1993)和电离辐射调控元件(参见例如，Manome，Y.et al.，Biochemistry 32：10607-10613，1993；Datta，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10149-10153，1992)。本领域已知的额外的细胞特异性或其它调控系统可以按照本文所述的方法和组合物使用。
在某些实施方案中，将编码多肽的核酸序列密码子优化以提高在任何特定细胞中的表达水平。用于密码子优化的方法为本领域众所周知，并且包括例如Angov等人(2008，PloS ONE 3：e2189[在www.plosone.org可获得])和Hatfield&Roth(2007，Biotechnol.Ann.Rev.13：27-42)所述的方法。此外，密码子优化服务可从例如CODA Genomics，Inc.(Laguna Hills，CA)和GENEART AG(Regensburg，Germany)商购。
在其它实施方案中，当多肽包含信号序列时，可以用通常不与所述多肽相关的信号序列代替与所述多肽天然相关的内源信号序列以提高所述多肽在培养细胞中的表达水平。即，本发明的多肽可以作为与异源肽融合的融合蛋白多肽来表达，所述异源肽优选为在成熟蛋白质或多肽的N端(例如，在人RAGE的Ala22或Glu23)具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽。所选的异源序列优选为宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列可以被原核信号序列取代，所述原核信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可以被以下序列取代，例如酵母转化酶前导序列、α-因子前导序列(包括酵母菌(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)、或者酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或者例如WO 1990/13646所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列是可用的，例如，人白介素-3信号序列(氨基酸序列MSRLPVLLLLQLLVRPAMA[SEQ ID NO：19]；由核酸序列ATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGCCATGGCT[SEQ ID NO：20]编码)、单纯疱疹gD信号。将这样的前体区的核酸符合读框地连接至编码所关注的蛋白质的核酸。
在某些实施方案中，当蛋白质包含内源信号序列时，可以将编码信号序列的核酸序列密码子优化以提高蛋白质在宿主细胞中的表达水平。
本领域普通技术人员能够按照本发明的教导选择并任选适当修改引入导致细胞表达所关注的多肽的基因的方法。
表达的多肽的分离
在某些实施方案中，期望分离和/或纯化根据本发明表达的蛋白质或多肽。在某些实施方案中，表达的多肽或蛋白质分泌入培养基，因此例如作为纯化过程中的第一步，如通过离心或过滤可以去除细胞和其他固体。
当利用重组技术时，蛋白质可以产生在胞内，在周质间隙中，或者直接分泌入培养基。如果在胞内产生抗体变体，作为第一步，例如，通过离心或超滤可以去除颗粒碎片，宿主细胞或裂解片段。Carter et al.，1992，Bio/Technology 10：163-167描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质间隙的抗体的方法。简单地说，将细胞块(paste)在乙酸钠(pH 3.5)、EBTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的情况下解冻约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。
当蛋白质分泌入培养基时，一般首先利用可商购的蛋白质浓缩滤器浓缩来自这类表达系统的上清液，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元。在任何上述步骤中可以包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白质水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
可以通过标准方法或通过用于蛋白质纯化的任何其他可用技术分离和纯化多肽或蛋白质，所述标准方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、尺寸排阻和羟基磷灰石层析)、凝胶过滤、离心、或差异溶解度、乙醇沉淀(参见，例如，Scopes，In：Protein Purification Principles and Practice，2ndEdition，Springer-Verlag，New York，1987；Higgins&Hames(eds.)，In：ProteinExpression：A Practical Approach，Oxford Univ Press，1999；和Deutscher et al.(eds.)，In：Guide to Protein Purification：Methods in Enzymology，Methods inEnzymology Series，Vol 182，Academic Press，1997，每个整体援引加入本文)。
特别是对于免疫亲和层析，可以通过使蛋白质结合至亲和柱来分离蛋白质，所述亲和柱包含针对该蛋白质并附着至固定支持物的抗体。可选地，可以通过标准重组技术将诸如流感病毒外壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶的亲和标签连接至蛋白质以允许通过合适的亲和柱很容易纯化。本领域普通技术人员会知道有利于分离表达的多肽的其他已知的亲和标签。可以在任何或所有阶段加入诸如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽或抑酶肽的蛋白酶抑制剂以减少或消除纯化过程中多肽或蛋白质的降解。当必须裂解细胞以分离和纯化表达的多肽或蛋白质时，使用蛋白酶抑制剂通常是有利的。
对于抗体或包含免疫球蛋白Fc结构域的蛋白质，可以利用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析纯化从细胞制备的蛋白质组合物，亲和层析为优选的纯化技术。A蛋白作为亲和配体的适合性取决于存在于抗体或Fc融合蛋白中的任何免疫球蛋白Fc结构域的类型和同种型。A蛋白可以用于纯化基于人IgG1、IgG2或IgG4重链的抗体(Lindmark et al.，1983，J.Immunol Meth.62：1-13)。推荐G蛋白用于所有小鼠同种型和用于人IgG3(Guss et al.，1986，EMBO J.5：1567-1575)。连接亲和配体的基质最常为琼脂糖，但是其他基质是可用的。诸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯的机械稳定的基质允许比可以用琼脂糖实现的更快的流速和更短的处理时间。当抗体变体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)有利于纯化。根据待回收的抗体变体，用于蛋白质纯化的其他技术也是可用的，如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以使包含所关注的蛋白质或抗体以及污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，利用在约2.5-4.5之间的pH的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
本领域普通技术人员会理解确切的纯化技术可以变化，取决于待纯化的多肽或蛋白质的特征、表达多肽或蛋白质的细胞的特征以及生长细胞的培养基的组合物。
药物组合物
本发明涵盖药物组合物的制备和用途，所述药物组合物包含本发明的多肽或蛋白质作为活性成分。本发明进一步涵盖药物组合物的制备和用途，所述药物组合物包含作为活性成分的本发明的多肽或蛋白质，与第二治疗剂联用，例如，化疗剂、另一抗体或蛋白质、免疫刺激剂等。这样的药物组合物可以由每种活性成分单独组成，作为适合施用个体的形式的至少一种活性成分(例如，有效剂量的治疗性蛋白质、有效剂量的治疗剂)的组合，或者所述药物组合物可以包含活性成分以及一种或多种药学可接受的载体，一种或多种额外的(活性或无活性)成分，或这些物质的一些组合。
在一实施方案中，在以丸剂/胶囊形式口服施用第二治疗剂(例如，化疗剂、第二治疗性蛋白质、第二抗体等)的同时，在水性溶液中肠胃外(例如，静脉内)施用所述蛋白质。然而，基于本文所提供的公开，技术人员会理解本发明不限于这些，或者任何其他制剂、剂量、施用途径等。相反，本发明涵盖施用蛋白质联合第二治疗剂的任何制剂或方法，包括但不限于在不同制剂中通过不同施用途径分别施用每种物质，以及在单个组合物中施用所述蛋白质和治疗剂(例如，当第二治疗剂为蛋白质时，如另一抗体、第二治疗性蛋白质等)，其中在水性组合物中静脉内施用)，等等。因此，以下讨论描述了用于实施本发明的方法的各种制剂，其包含施用任何治疗性蛋白质，与任何其他治疗性蛋白质或化合物联用，但是本发明不限于这些制剂，而是包含如一旦经过本文所提供的教导本领域技术人员可以很容易确定用于本发明的方法的任何制剂。
可以将本发明的方法中所用的治疗性蛋白质并入适合施用个体的药物组合物。通常，药物组合物包含所述蛋白质和药学可接受的载体。如本文所用，“药学可接受的载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的实例包括水、盐水、盐酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露糖醇的多元醇(polyalcohol)、山梨醇或氯化钠。药学可接受的物质，如润湿或较少量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，其可以增加所述蛋白质或其部分的保存期限和有效性。
本发明中所用的治疗性蛋白质可以是各种形式的。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如，可注射和可输液(infusible)的溶液)、分散液(dispersion)或混悬剂、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于治疗剂、预期的施用模式和治疗应用。典型优选的组合物为可注射或可输液的溶液形式，如与用于用其他抗体被动免疫人的组合物相似的组合物。优选的施用模式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一优选实施方案中，通过静脉内输液或注射施用所述蛋白质。在另一优选实施方案中，通过肌肉内或皮下注射施用所述蛋白质。
治疗组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌和稳定的。可以将所述组合物配制为适合高药物浓度的溶液、微乳状液、分散液、脂质体或其他有序结构。无菌可注射的溶液可以这样制备，根据需要，将需要量的所述蛋白质并入含有上文列举的成分的一种或组合的适当溶剂，然后过滤除菌。一般，通过将活性化合物并入无菌媒介物来制备分散液，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的成分的所需的其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射的溶液的情况下，制备的优选方法为真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的期望成分的粉末。
适合可注射用途的药物组合物通常包括无菌水溶液(其中可溶于水)或分散液以及用于临时制备无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或盐酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物应当是无菌的并且应当流动至存在轻易可注射性(syringability)的程度。有利地，某些药物制剂在制造和储存条件下是稳定的，并且必须保护以防止诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。一般，相关载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(polyol)(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂实现微生物作用的预防，例如，对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在某些情况下，在所述组合物中包括等渗剂是有用的，例如，糖、诸如甘露糖醇的多元醇、山梨醇或氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的物质带来可注射的组合物的延长吸收，例如，单硬脂酸铝和明胶。
可以通过本领域已知的各种方法施用治疗性蛋白质，所述方法包括但不限于口服、肠胃外、粘膜、吸入、体表、口腔、鼻和直肠施用。对于许多治疗应用，优选的施用途径/模式为皮下、肌肉内、静脉内或输液。如果需要，可以采用无针注射。如技术人员会理解的，施用途径和/或模式会根据期望的结果变化。
在某些实施方案中，可以与载体一起制备所述蛋白质，所述载体会保护化合物防止快速释放，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法获得了专利，或者一般为本领域技术人员已知。参见，例如，Robinson，ed.，In：Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，Marcel Dekker，Inc.，New York(1978)。
可以调整剂量方案以提供最佳期望反应。例如，可以施用单个推注，可以随着时间的推移施用几个分剂量，或者可以如治疗情况的紧急性所示按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，将肠胃外组合物配制为剂量单位形式是特别有利的。本文所用的剂量单位形式指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物个体的物理离散单位；每个单位含有计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物，与所需的药学载体联用。本发明的剂量单位形式的规范取决于并直接依赖于(a)所述蛋白质的独特特征和待实现的特定治疗或预防效果，以及(b)合成这样的用于个体中敏感性治疗的活性化合物的领域中固有的限制。
应当注意剂量值可以随待缓解的疾病状况的类型和严重程度变化，并且可以包括单个和多个剂量。应当进一步理解，对于任何特定个体，应当根据个体需要以及管理或监督施用组合物的人的专业判断随着时间的推移调整具体剂量方案，并且本文所示的剂量范围仅为示范，而不是为了限制要求保护的组合物的范围或应用。
在一实施方案中，在静脉内制剂中施用所述蛋白质，所述静脉内制剂作为无菌水性溶液，含有约1mg/ml、优选约5mg/ml、或者更优选约10mg/ml、或者更优选约15mg/ml、或者甚至更优选约20mg/ml的蛋白质与乙酸钠、聚山梨酯80和氯化钠，pH为约5-6。优选地，所述静脉内制剂为无菌水性溶液，含有5或10mg/ml的蛋白质与20mM乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨酯80和140mM氯化钠，pH 5.5。此外，在许多其他化合物中，包含蛋白质的溶液可以包含组氨酸、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇、EDTA、甲硫氨酸及其任何组合，以及相关领域已知的许多其他化合物。
在一实施方案中，通过静脉内推注施用部分剂量，并且剩余的通过蛋白质制剂的输液。例如，可以作为推注施用所述蛋白质的0.01mg/kg的静脉内注射，并且可以通过静脉内注射施用剩余的预定蛋白质量。例如，可以在一个半小时至两小时至五小时的时期内施用预定量的所述蛋白质。
关于第二治疗剂，当所述治疗剂为例如小分子时，其可以生理可接受的酯或盐的形式存在于药物组合物中，例如与本领域众所周知的生理可接受的阳离子或阴离子联用。
可以通过药学领域已知或今后开发的任何方法制备本文所述的药物组合物的制剂。一般，这样的制备方法包括以下步骤，使活性成分联合载体或者一种或多种其他辅助成分，然后，如果必需或期望，将产物成形或包装入期望的单个或多个剂量单位。
可以适合口服、直肠、阴道、肠胃外、体表、肺、鼻内、口腔、眼或另一施用途径的制剂制备、包装或出售在本发明的方法中有用的药物组合物。其他预期的制剂包括喷射的纳米颗粒、脂质体制品、含有活性成分的重新包封的红细胞和基于免疫的制剂。
可以散装、作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量制备、包装或出售本发明的药物组合物。如本文所用，“单位剂量”为离散量的药物组合物，其包含预定量的活性成分。活性成分的量一般等于会施用个体的活性成分的剂量或这样的剂量的合适的分数，例如，这样的剂量的1/2或1/3。
本发明的药物组合物中的活性成分的相对量、药学可接受的载体和任何额外的成分会变化，这取决于治疗的个体的性质、大小和状况，并且进一步取决于施用所述组合物的途径。例如，所述组合物可以包含0.1％和100％(w/w)之间的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种额外的药学活性治疗剂。特别考虑的额外的治疗剂包括止吐药、止泻药、化疗剂、细胞因子等。
可以利用常规技术制备本发明的药物组合物的控释或缓释制剂。
可以离散固体剂量单位的形式制备、包装或出售适合口服的本发明的药物组合物的制剂，所述离散固体剂量单位包括但不限于片剂、硬胶囊或软胶囊、扁囊剂、药片或锭剂，每种均含有预定量的活性成分。适合口服的其他制剂包括但不限于粉末或颗粒制剂、水性或油性混悬剂、水性或油性溶液、或者乳剂。
如本文所用，“油性”液体是包含含碳液体分子并且表现出比水弱的极性特征的液体。
例如，可以通过压缩或成型活性成分来制备包含活性成分的片剂，任选存在一种或多种额外的成分。可以通过在合适的装置中压缩诸如粉末或颗粒制品的自由流动形式的活性成分以制备压缩的片剂，所述活性成分任选与一种或多种粘合剂(binder)、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂混合。可以通过在合适的装置中成型活性成分、药学可接受的载体和至少足以湿润混合物的液体的混合物来成型片剂。
在片剂的制造中使用的药学可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、造粒和崩解剂、粘合剂(binding agent)以及润滑剂。已知的分散剂包括但不限于马铃薯淀粉和羟乙酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的造粒和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合剂包括但不限于明胶、阿拉伯胶、预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
片剂可以是无包衣的，或者可以利用已知的方法将它们包被以实现个体胃肠道中延迟的崩解，从而提供活性成分的持续释放和吸收。例如，诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的物质可以用于包被片剂。进一步例如，可以利用美国专利号4,256,108；4,160,452；和4,265,874所述的方法包被片剂以形成渗透控释片剂。片剂可以进一步包含甜味剂、增香剂、着色剂、防腐剂或这些物质的一些组合以提供药学上美观和可口的制品。
可以利用诸如明胶的生理可降解的组合物制备包含活性成分的硬胶囊。这样的硬胶囊包含活性成分，并且可以进一步包含额外的成分，包括，例如，惰性固体稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或白陶土。
可以利用诸如明胶的生理可降解的组合物制备包含活性成分的软明胶胶囊。这样的软胶囊包含活性成分，所述活性成分可以与水或者诸如花生油、液状石蜡或橄榄油的油性介质混合。
可以液体形式或干燥产物的形式制备、包装和出售适合口服的本发明的药物组合物的液体制剂，所述干燥产物预期在使用之前与水或另一合适的媒介物重组。
可以利用常规方法制备液体混悬剂以获得水性或油性媒介物中的活性成分的混悬剂。水性媒介物包括，例如，水和等渗盐水。油性媒介物包括，例如，杏仁油；油性酯；乙醇；植物油，如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；分馏植物油；以及矿物油，如液状石蜡。液体混悬剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、分散或湿润剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲液、盐、增香剂、着色剂以及甜味剂。油性混悬剂可以进一步包含增稠剂。已知的悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆，氢化食用脂肪，海藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄芪树胶，阿拉伯树胶和纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散或湿润剂包括但不限于天然存在的磷脂，如卵磷脂；烯化氧与脂肪酸、与长链脂族醇、与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯、或者与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(分别例如，聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括但不限于甲基、乙基或正丙基对羟基苯甲酸，抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括，例如，甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知用于油性混悬剂的增稠剂包括，例如，蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。
可以与液体混悬剂基本上相同的方式制备水性或油性溶剂中的活性成分的液体溶液，主要区别在于将活性成分溶解，而不是悬浮在溶剂中。本发明的药物组合物的液体溶液可以包含所述关于液体混悬剂的组分的每种，应当理解悬浮剂不必辅助活性成分在溶剂中的溶解。水性溶剂包括，例如，水和等渗盐水。油性溶剂包括，例如，杏仁油；油性酯；乙醇；植物油，如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；分馏植物油；以及矿物油，如液状石蜡。
可以利用已知的方法制备本发明的药学制品的粉末和颗粒制剂。这样的制剂可以直接给对象施用，例如，用于形成片剂，填充胶囊，或者通过加入水性或油性媒介物制备水性或油性混悬剂或溶液。这些制剂的每种可以进一步包含一种或多种分散或湿润剂、悬浮剂和防腐剂。这些制剂中还可以包括额外的赋形剂，如填充剂以及甜味剂、增香剂或着色剂。
还可以水包油乳剂或油包水乳剂的形式制备、包装或出售本发明的药物组合物。油相可以为植物油，如橄榄油或花生油；矿物油，如液状石蜡；或者这些的组合。这类组合物可以进一步包含一种或多种乳化剂，例如天然存在的树胶，如阿拉伯树胶或黄芪树胶；天然存在的磷脂，如大豆或卵磷脂磷脂；来源于脂肪酸和己糖醇酐的组合的酯或偏酯，如脱水山梨醇单油酸酯；以及这类偏酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。这些乳剂还可以含有额外的成分，包括，例如，甜味剂或增香剂。
可以适合直肠施用的制剂来制备、包装或出售本发明的药物组合物。例如，这样的组合物可以为栓剂、滞留型灌肠剂制品以及用于直肠或结肠灌洗的溶液的形式。
可以通过组合活性成分与无刺激性的药学可接受的赋形剂来制备栓剂制剂，所述赋形剂在普通室温(即，约20℃)下为固体，并且在个体的直肠温度(即，在健康人体中约37℃)下为液体。合适的药学可接受的赋形剂包括但不限于可可脂、聚乙二醇和各种甘油酯。栓剂制剂可以进一步包含各种额外的成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
可以通过组合活性成分与药学可接受的液体载体来制备用于直肠或结肠灌洗的滞留型灌肠剂制品或溶液。如本领域众所周知的，可以利用适合个体的直肠解剖结构的递送装置施用灌肠剂制品，并且可以将灌肠剂制品包装在适合个体的直肠解剖结构的递送装置内。灌肠剂制品可以进一步包含各种额外的成分，包括但不限于抗氧化剂和防腐剂。
可以适合阴道施用的制剂来制备、包装或出售本发明的药物组合物。例如，这样的组合物可以为栓剂、诸如卫生棉塞的浸渍或包被的可插入阴道的物质、灌注液制品、或者用于阴道灌洗的凝胶或霜剂或溶液。
用化学组合物浸渍或包被物质的方法为本领域已知，并且包括但不限于将化学组合物沉积或结合至表面上的方法，在合成所述物质期间将化学组合物并入所述物质的结构的方法(即，例如用生理可降解的物质)，以及将水性或油性溶液或混悬剂吸收入吸收剂物质的方法，随后干燥或不干燥。
可以通过组合活性成分与药学可接受的液体载体来制备用于阴道灌洗的灌注液制品。如本领域众所周知的，可以利用适合个体的阴道解剖结构的递送装置施用灌注液制品，并且可以将灌注液制品包装在适合个体的阴道解剖结构的递送装置内。灌注液制品可以进一步包含各种额外的成分，包括但不限于抗氧化剂、抗生素、抗真菌剂和防腐剂。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理穿透个体的组织并通过所述组织中的裂口施用所述药物组合物。因此肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过非手术组织穿透伤口施用组合物等来施用药物组合物。具体地，肠胃外施用理解为包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内注射，以及肾透析输液技术。
适合肠胃外施用的药物组合物的制剂包含活性成分联合药学可接受的载体，如无菌水或无菌等渗盐水。可以适合推注施用或持续施用的形式制备、包装或出售这类制剂。可以单位剂型制备、包装或出售可注射的制剂，如安瓿或含有防腐剂的多剂量容器。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂以及如下文所讨论的可植入的缓释或生物可降解的制剂。这类制剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在一用于肠胃外施用的制剂的实施方案中，以干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分用于在肠胃外施用重组的组合物之前与合适的媒介物(例如，无菌无热原水)重组。
可以通过本领域已知的各种方法施用本发明的组合物。施用途径和/或模式根据期望的结果而变化。活性化合物可以与保护该化合物防止快速释放的载体制备，如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚正酯和聚乳酸。例如，Robinson，ed.，Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1978)描述了用于制备这类制剂的许多方法。优选在GMP条件下制造药物组合物。
可以无菌可注射的水性或油性混悬剂或溶液的形式制备、包装或出售药物组合物。可以根据已知的技术配制这种混悬剂或溶液，并且除了活性成分之外，可以包含额外的成分，如本文所述的分散剂、湿润剂或悬浮剂。可以利用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂制备这类无菌可注射的制剂，例如水或1，3-丁二醇。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成的甘油单酯或甘油二酯。其他有用的可肠胃外施用的制剂包括以微晶形式、在脂质体制品中或者作为生物可降解的聚合物系统的组分包含活性成分的制剂。用于缓释或植入的组合物可以包含药学可接受的聚合或疏水物质，如乳剂、离子交换树脂、难溶的聚合物或难溶的盐。
适合体表(topical)施用的制剂包括但不限于液体或半液体制品，如搽剂，洗剂，诸如霜剂、软膏剂或糊剂的水包油或油包水乳剂，以及溶液或混悬剂。例如，可体表施用的制剂可以包含约1％至约10％(w/w)活性成分，虽然活性成分的浓度可以高达溶剂中活性成分的溶解度极限。用于体表施用的制剂可以进一步包含一种或多种本文所述的额外的成分。
可以适合通过口腔肺部施用的制剂制备、包装、或出售本发明的药物组合物。这样的制剂可以包含干燥颗粒，所述干燥颗粒包含活性成分并且具有约0.5至约7纳米、优选约1至约6纳米范围内的直径。这类组合物方便为干粉的形式，用于利用包含干粉储存器的装置施用，所述装置可以引导推进剂流分散粉末，或者利用自推进溶剂/粉末配药容器施用，如包含溶解或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置。优选地，这样的粉末包含颗粒，其中至少98重量％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，并且至少95数量％的颗粒具有小于7纳米的直径。更优选地，至少95重量％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且至少90数量％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物优选包括固体精细粉末稀释剂，如糖，并且方便在单位剂型中提供。
低沸点推进剂一般包括在大气压下具有低于65℉的沸点的液体推进剂。一般推进剂可以构成组合物的50-99.9％(w/w)，并且活性成分可以构成组合物的0.1-20％(w/w)。推进剂可以进一步包含额外的成分，如液体非离子型或固体阴离子型表面活性剂或者固体稀释剂(优选具有与包含活性成分的颗粒相同数量级的粒径)。
配制用于肺部递送的本发明的药物组合物还可以溶液或混悬剂的液滴的形式提供活性成分。可以作为水性或稀释的醇溶液或混悬剂来制备、包装或出售这类制剂，其任选无菌，包含活性成分，并且可以方便地利用任何雾化或粉末化装置来施用。这类制剂可以进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于诸如糖精钠的增香剂、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或者诸如羟苯甲酯的防腐剂。通过这种施用途径提供的液滴优选具有约0.1至约200纳米范围内的平均直径。
本文所述有利于肺部递送的制剂也有利于本发明的药物组合物的鼻内递送。
适合鼻内施用的另一制剂为包含活性成分并具有约0.2-500微米的平均颗粒的粗粉末。以采用鼻烟的方式施用这样的制剂，即，通过鼻通道从靠近鼻孔的粉末的容器快速吸入。
例如，适合鼻部施用的制剂可以包含约低至0.1％(w/w)和高达100％(w/w)的活性成分，并且可以进一步包含一种或多种本文所述的额外的成分。
可以适合含服施用的制剂制备、包装或出售本发明的药物组合物。这类制剂可以是例如利用常规方法制备的片剂或锭剂形式，并且可以包含例如0.1-20％(w/w)活性成分，剩余部分包含口服可溶解或可降解的组合物以及任选存在的一种或多种本文所述的额外的成分。可选地，适合含服施用的制剂可以包含粉末或者气雾化或粉末化的溶液或混悬剂，所述粉末或者气雾化或粉末化的溶液或混悬剂包含活性成分。当分散时，这类粉末、气雾化或气雾化制剂优选具有约0.1至约200纳米范围内的平均颗粒或液滴大小，并且可以进一步包含一种或多种本文所述的额外的成分。
可以适合眼部施用的制剂制备、包装或出售本发明的药物组合物。这类制剂可以是例如滴眼液形式，包括例如水性或油性液体载体中的活性成分的0.1-1.0％(w/w)溶液或混悬剂。这类滴剂可以进一步包含缓冲剂、盐或者一种或多种本文所述的其他额外的成分。其他有用的可眼部施用的制剂包括以微晶形式或在脂质体制品中包含活性成分的制剂。
如本文所用，“额外的成分”包括但不限于一种或多种以下物质：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；增香剂；着色剂；防腐剂；生理可降解的组合物，如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散或湿润剂；乳化剂、缓和剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学可接受的聚合或疏水物质。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“额外的成分”为本领域已知，并且例如Remington′sPharmaceutical Sciences，Genaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1985)所述，其援引加入本文。
在本发明的一实施方案中，包含治疗性蛋白质的组合物包含无菌溶液，所述无菌溶液包含20mM组氨酸缓冲液、pH 5.5，84mg/ml脱水海藻糖，0.2mg/ml聚山梨酯80以及0.1mg/ml EDTA二钠水合物。在一方面，将所述蛋白质包装在具有橡胶塞和铝封的透明玻璃小瓶中。在另一方面，小瓶含有约20mg/ml的所述蛋白质与约400mg每小瓶的标称填充。
可以将本发明的治疗性蛋白质组合物施用于动物，优选人。当所述组合物包含治疗性蛋白质和第二治疗剂的组合时，每种活性成分施用的精确剂量会根据任何数量的因素变化，所述因素包括但不限于动物类型和治疗的疾病状态的类型、动物的年龄以及施用途径。
可以每天几次的频率将治疗性蛋白质施用于动物，或者可以较低频率施用治疗性蛋白质，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至更低频率，如每几个月一次或甚至每年一次或更少。施用频率对于技术人员是显而易见的，并且取决于任何数量的因素，例如但不限于治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
可以每天几次的频率将治疗性蛋白质施用于动物，或者可以较低频率施用治疗性蛋白质，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次，或者甚至更低频率，如每几个月一次或甚至每年一次或更少。施用频率对于技术人员是显而易见的，并且取决于任何数量的因素，例如但不限于治疗的疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
治疗性蛋白质和第二治疗剂(例如，第二蛋白质)可以共施用，其中它们可以分别施用，在不同日期或者一天的不同时间，以及同时或在同一天。因此共施用涵盖施用所述蛋白质和第二治疗剂的任何时间组合，从而这两种物质的施用介导对患者的治疗益处，所述治疗益处可检测地大于在不存在另一物质的情况下施用任一物质。
本发明的治疗性蛋白质和第二治疗剂的组合可以与许多其他化合物(其他抗激素治疗剂、细胞因子、化疗和/或抗病毒药等)共施用。可选地，可以在所述蛋白质-治疗剂组合之前一小时、一天、一周、一个月或甚至更早施用所述化合物，或者其任何排列。此外，可以在施用辐射、干细胞移植或者施用任何治疗剂(例如，细胞因子、化疗化合物等)之后一小时、一天、一周或甚至更晚施用所述化合物，或者其任何排列。频率和施用方案对于技术人员是显而易见的，并且取决于任何数量的因素，例如但不限于治疗的疾病的类型和严重程度、动物的年龄和健康状况、施用的化合物或多种化合物的性质、各种化合物的施用途径等。
剂量方案
可以调整剂量方案以提供最佳期望反应。例如，可以施用单个推注，可以随着时间的推移施用几个分剂量，或者可以如治疗情况的紧急性所示按比例减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，将肠胃外组合物配制为剂量单位形式是特别有利的。本文所用的剂量单位形式指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物个体的物理离散单位；每个单位含有计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物，与所需的药学载体联用。本发明的剂量单位形式的规范取决于并直接依赖于(a)治疗性蛋白质的独特特征和待实现的特定治疗或预防效果，以及(b)合成这样的用于个体中敏感性治疗的活性化合物的领域中固有的限制。
根据本发明施用的治疗性蛋白质的治疗有效量的示例性、非限制性范围为至少约1mg/kg，至少约5mg/kg，至少约10mg/kg，超过约10mg/kg，或者至少约15mg/kg，例如约1-30mg/kg，或者例如约1-25mg/kg，或者例如约1-20mg/kg，或者例如约5-20mg/kg，或者例如约10-20mg/kg，或者例如约15-20mg/kg，或者例如约15mg/kg。应当注意剂量值可以随待缓解的疾病状况的类型和严重程度变化，并且可以包括单个或多个剂量。应当进一步理解对于任何特定个体，应当根据个体需要以及管理或监督施用组合物的人的专业判断随着时间的推移调整具体剂量方案，并且本文所示的剂量范围仅为示例，而不是为了限制要求保护的组合物的范围或应用。确定施用治疗性蛋白质的适当剂量和方案在相关领域中众所周知，并且应当理解一旦提供了本文所公开的教导，技术人员会确定施用治疗性蛋白质的适当剂量和方案。
在一实施方案中，以静脉内制剂施用本发明的抗IgE抗体或其抗原结合部分，所述静脉内制剂作为无菌水性溶液，在合适的缓冲系统中含有约5-20mg/ml的抗体。
在一实施方案中，对于低剂量施用，通过静脉内推注施用部分剂量，而其余通过抗体制剂的输液。例如，可以作为推注施用0.01mg/kg静脉内注射的抗体，并且可以通过静脉内注射施用其余预定的抗体剂量。在另一实施方案中，作为单个推注施用整个低剂量。对于较高剂量，例如3mg/kg，不作为推注施用所述抗体，而是通过输液施用整个量。例如，可以在约一小时以及半小时至约五小时的时间内施用预定剂量的所述抗体。
在本发明的一实施方案中，约每3周施用治疗性蛋白质(例如，sRAGE-Fc融合蛋白质、诸如抗IgE抗体的抗体等)，更优选地，持续约四个周期，此后每3个月施用治疗性蛋白质。在这个实施方案的一方面，以约10mg/kg施用所述蛋白质。
技术人员会理解可以同时施用本发明的治疗性蛋白质与第二治疗性蛋白质或治疗剂的组合，或者可以在不同时间施用本发明的蛋白质与第二治疗性蛋白质或治疗剂。例如，在一实施方案中，作为单个注射和/或输液施用治疗性蛋白质，并且每天一次在施用所述蛋白质之前、期间或之后开始施用第二治疗剂(例如，非蛋白质化合物)。然而，本发明不限于治疗剂的任何特定剂量或施用方案。相反，施用所述抗体和治疗剂的最佳剂量、途径和方案可以由相关领域的普通技术人员利用众所周知的方法很容易确定。
例如，可以施用单个剂量或多个剂量的治疗性蛋白质。可选地，可以施用至少1个剂量，或者至少3个、6个或12个剂量。例如，可以每2周、每3周、每个月、每20天、每25天、每28天、每30天、每40天、每6周、每50天、每2个月、每70天、每80天、每3个月、每6个月或每年施用所述剂量。在一方面，每3周一次施用治疗性蛋白质，优选持续4个周期，之后每3个月施用治疗性蛋白质。此外，可以每天几次或每天一次、每周、每2周、每3周、每4周、每个月、每3个月、每6个月、每年一次或者如技术人员所确定的向患者提供治疗益处的任何其他周期施用第二治疗剂或蛋白质。
所述蛋白质的用途
本发明的治疗性蛋白质可以用作亲和纯化剂。在这个方法中，利用本领域众所周知的方法将所述蛋白质固定在固相上，如SEPHADEXTM树脂或滤纸。使固定的蛋白质与含有待纯化的结合伙伴的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持体，所述溶剂会基本上去除样品中的所有物质，除了结合至固定的蛋白质的待纯化的结合伙伴。最后，用另一合适的溶剂，如甘氨酸缓冲液洗涤支持体，这会从固定的蛋白质释放结合伙伴。
所述蛋白质还可以用于诊断测定，例如，用于检测特定细胞、组织或血清中所关注的结合伙伴的表达。为了诊断应用，通常会用可检测的部分标记本发明的蛋白质。许多标记是可用的，包括当用荧光团标记所述蛋白质时用于定量荧光变化的技术。通过化学反应化学发光底物变为电子激发的，然后可以发光，所述光可以测量(例如利用化学发光分析仪(chemiluminometer))或者将能量供给荧光受体。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利第4,737,456号)、萤光素、2，3-dihydrophthalazinediones、苹果酸脱氢酶、脲酶、诸如辣根过氧化物酶(HRPO)的过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至包括抗体或其片段在内的蛋白质的技术如O′Sullivan etal.，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use inEnzyme Immunoassay，in：Methods in Enzym.(Ed.J.Langone&H.VanVunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)所述。
有时，将所述标记与所述蛋白质间接缀合。技术人员会知道用于实现这个的各种技术。例如，可以将诸如抗体或其抗原结合部分的蛋白质与生物素缀合，并且可以将上文提到的任何三大类的标记与抗生物素蛋白质缀合，反之亦然。生物素选择性结合至抗生物素蛋白，因此所述标记可以这种间接方式与所述蛋白质缀合。可选地，为了实现所述标记与所述蛋白质的间接缀合，将所述蛋白质与小半抗原(例如，地高辛)缀合，并且将上文提到的不同类型的标记中的一种与抗半抗原抗体(例如，抗地高辛抗体)缀合。因此，可以实现所述标记与所述蛋白质的间接缀合。
在本发明的另一实施方案中，不需要标记所述蛋白质，并且可以利用结合至所述蛋白质的标记抗体检测其存在。
包括抗体在内的本发明的蛋白质可以用于任何已知的测定方法，如竞争性结合测定、直接和间接夹心测定以及免疫沉淀测定。Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158(CRC Press，Inc.1987)。
竞争性结合测定依赖于标记的标准品与测试样品竞争结合有限量的蛋白质的能力。测试样品中靶标的量与结合至所述蛋白质的标准品的量成反比。为了促进确定结合的标准品的量，一般在竞争之前或之后所述蛋白质是不溶的。结果，可以方便地从保持未结合的标准品和测试样品分离结合至所述蛋白质的标准品和测试样品。
夹心测定涉及使用两种结合蛋白，每种能够结合至待检测的蛋白质的不同结合结构域，或者在抗体的情况下，每种能够结合至待检测的蛋白质的不同表位。在夹心测定中，固定在固体支持体上的第一抗体结合待分析的测试样品，此后包括第二抗体在内的第二结合蛋白结合至测试样品，因此形成不溶的三部分的复合物。参见例如，美国专利第4,376,110号。可以用可检测的部分标记第二抗体本身(直接夹心测定)，或者可以利用可检测的部分标记的抗免疫球蛋白抗体测量第二抗体(间接夹心测定)。例如，夹心测定的一种类型为ELISA测定，在这种情况下可检测的部分为酶。
对于免疫组织化学，生物样品可以是新鲜或冷冻的，或者可以包埋在石蜡中并用诸如福尔马林的防腐剂固定。
所述蛋白质还可以用于体内诊断测定。一般，用放射性核素(如111In、99Tc、14C、131I、3H、32P或35S)标记所述蛋白质，从而可以利用免疫显像定位所述蛋白质与结合伙伴结合的组织，或者在抗体的情况下，定位所述抗体与其抗原结合的组织。例如，本发明的抗IgE抗体可以用于检测例如哮喘患者的肺中存在的IgE的量。或者本发明的RAGE融合蛋白可以用于检测患者体内存在的配体的量。
本发明的蛋白质可以在试剂盒中提供，即，包装的预定量的试剂的组合与进行诊断测定的说明书。当用酶标记所述蛋白质时，所述试剂盒可以包括所述酶需要的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。此外，可以包括其他添加剂，如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。各种试剂的相对量可以广泛变化以提供基本上优化测定灵敏度的试剂的溶液浓度。特别地，可以作为干粉提供试剂，所述干粉通常冻干，包括赋形剂，在溶解时会提供具有适当浓度的试剂溶液。
所述抗体的体内用途
预期本发明的蛋白质可以用于治疗哺乳动物。例如，在一实施方案中，为了获得临床前数据的目的，将所述蛋白质给非人哺乳动物施用。待治疗的示例性非人哺乳动物包括非人灵长类、狗、猫、啮齿类和其他哺乳动物，其中进行临床前研究。这类哺乳动物可以是建立的待用所述蛋白质治疗的疾病的动物模型，或者可以用于研究所关注的蛋白质的毒性或药物动力学。在这些实施方案的每个中，可以在哺乳动物上进行剂量递增研究。
通过任何合适的方法施用所述蛋白质，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内施用，以及如果期望局部免疫抑制治疗，病灶内施用。肠胃外输液包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，适合通过脉冲输液施用所述蛋白质，特别是递减剂量的所述蛋白质。优选通过注射施用，更优选静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂或长期的。
为了预防或治疗疾病，所述抗体或蛋白质的适当剂量取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和进程、为了预防还是治疗目的施用抗体变体、先前的治疗、患者的临床病史和对抗体变体的反应以及主治医师的决定。在某些实施方案，可以一次或在一系列的治疗中将本发明的抗人IgE抗体适当地给患者施用。相似地，在其他实施方案中，一次或在一系列的治疗中将本发明的sRAGE-Ig融合蛋白给患者施用。
根据疾病的类型和严重程度，约0.1mg/kg-150mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的蛋白质是用来给患者施用的初始候选剂量，例如，通过一次或多次单独施用，或者通过持续输液。典型的每日剂量范围可以为约1mg/kg至100mg/kg或更多，取决于上文提到的因素。根据疾病状况，对于在几天或更长时间内重复施用，持续治疗直至期望的疾病症状的抑制出现。然而，其他剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定很容易监测这种治疗的过程。抗LFA-1或抗ICAM-1抗体的示例性剂量方案如WO 94/04188所公开。
本发明的sRAGE-Ig融合蛋白用于治疗各种疾病或病症的用途如WO2004/016229；WO 2006/017643；WO 2006/017647；WO 2007/094926；WO2007/130302；和WO 2008/100670所公开。
以与良好的医疗实践一致的方式配制、定量和施用所述蛋白质组合物。在这个上下文中考虑的因素包括治疗的特定病症、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、递送物质的部位、施用方法、施用的时间安排以及医生已知的其他因素。待施用的蛋白质的“治疗有效量”会由这类考虑控制，并且是预防、缓解或治疗疾病或病症所需的最小量。所述蛋白质不必但是任选与一种或多种目前用于预防或治疗考虑的疾病的物质配制。这类其他物质的有效量取决于制剂中存在的蛋白质的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。一般以相同剂量和上文所用的施用途径或者此前采用的剂量的约1-99％使用这些制剂。
识别IgE作为其靶标的本发明的抗IgE抗体可以用于治疗“IgE介导的病症”。这些病症包括疾病，如哮喘、过敏性鼻炎&结膜炎枯草热)、湿疹、荨麻疹、特应性皮炎和食物过敏。例如蜂蛰伤、蛇咬伤、食物或药物治疗所引起的过敏性休克的严重生理状况也包括在本发明的范围内。
识别晚期糖基化终产物(AGE)、淀粉状蛋白β(Aβ)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、S100、羧甲基赖氨酸(CML)、两性蛋白和CD11b/CD18作为其靶标的本发明的sRAGE-Ig融合蛋白可以用于治疗由RAGE与其配体的结合所介导或与之相关的任何疾病、疾病状况或病症，即，“RAGE介导的病症”。RAGE涉及各种疾病状态，并且这类RAGE介导的病症包括但不限于糖尿病症状或糖尿病晚期并发症症状，例如，糖尿病肾病、糖尿病视网膜病、糖尿病足溃疡、心血管并发症或糖尿病神经病变；淀粉样变性病、阿尔茨海默病、癌症、肾衰竭、或者与自身免疫相关的炎症、炎症性肠病、类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、低氧症、中风、心脏病发作、失血性休克、脓毒症、器官移植、或者受损伤口愈合；骨质疏松、肾衰竭、移植排斥、与移植相关的炎症和/或排斥等。
参考以下实验实例进一步详细描述了本发明。除非另有说明，仅为了说明的目的提供这些实例，而不是为了限制。因此，本发明不应当以任何方式理解为限于以下实例，而应当理解为包括作为本文所提供的教导的结果变得明显的任何和所有变化。
实施例
实施例1：
糖基化的控制：利用衣霉素糖基化抑制剂减少的聚糖位点占据率影响RAGE配体结合
在许多慢性病症的病理中涉及晚期糖基化终产物受体(RAGE)，因此其作为治疗性干预的靶标被积极推行。最近的研究已证实RAGE为糖蛋白，其糖基化状态可以影响结合至其配体。在本研究中，我们表达了重组人sRAGE-Ig融合蛋白，并且检测其糖基化和蛋白酶解加工。sRAGE-Ig融合蛋白具有三个N-连接糖基化位点，两个在sRAGE结构域中，一个在Fc区中，当在CHO细胞中表达时约70％被完全占据。
衣霉素处理的细胞培养物用于表达该蛋白质的位点占据变体。分离位点占据变体，并且评价聚糖占据率对结合至RAGE配体S100b的影响。与完全占据形式相比，非糖基化变体在结合至S100b中表现出10倍增加，而双占据变体表现出这两者之间的中等结合。此外，我们发现约20％的CHO表达的sRAGE-Ig融合蛋白被枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶弗林蛋白酶切割，导致RAGE结构域的缺失。这些研究为重组RAGE分子的最佳配体结合活性的翻译后要求提供了深入了解，并且突出了与CHO细胞中全长蛋白的表达相关的潜在挑战。
晚期糖基化终产物受体(RAGE)是免疫球蛋白超家族的成员，其表达在包括糖尿病、慢性炎症和阿尔茨海默病在内的许多人类疾病中上调(Ramasamy et al.，2005，Glycobiology 15：16R-28R)。RAGE的配体包括晚期糖基化终产物(AGE)，其为异质结构，这是将脂质和蛋白质暴露至还原糖随后不可逆的复杂分子重排所导致的(Brownlee et al.，1988，New Eng.J.Med.318：1315-1320；Schmidt et al.，1994，Arterioscler.Thromb.14：1521-1528。除了AGE之外，RAGE结合至多个功能和结构不同的配体，包括淀粉状蛋白β(Aβ)、血清淀粉状蛋白A(SAA)、S100(钙粒蛋白家族的促炎成员)、羧甲基赖氨酸(CML)、amphoterin和CD11b/CD18(Bucciarelli et al.，2002，Cell Mol.Life Sci.59：1117-128；Chavakis et al.，2004，Microbes Infect.6：1219-1225；Kokkola et al.，2005，Scand.J.Immunol.61：1-9；Schmidt et al.，2001，J.Clin.Invest.108：949-955；Rocken et al.，2003，Am.J.Pathol.162：1213-1220)。
各种疾病状况涉及在不同组织中通过结合至其配体激活RAGE(Hofmann et al.，1999，Cell 97：889-901；Wautier et al.，1995，J.Clin.Invest.97：238-243；Teillet et al.，2000，J.Am.Soc.Nephrol.11：1488-1497；Vlassara et.al.，1996，Finnish Med.Soc.DUODECIM，Ann.Med.28：419-426；Hammeset al.，1999，Diabetologia 42：603-607)，包括阿尔茨海默病(Yan et al.，1996，Nature 382：685-691)以及肿瘤侵袭和转移(Taguchi et al.，2000，Nature405：354-357)。
配体结合至RAGE受体负责其上调(Schmidt et al.，2000，Biochim.Biophys.Acta 1498：99-111)。增加的受体表达导致细胞信号传导和激活，导致慢性疾病的病理(Schmidt et al.，1999，Circ.Res.84：489-497)。下调RAGE和中断配体配合循环的一种方法是产生“诱饵”或缺少跨膜结构域的可溶性RAGE(sRAGE)。据证实在糖尿病小鼠模型中用外源sRAGE处理会抑制糖尿病动脉粥样硬化的加速(Park et al.，1998，Nature Medicine4：1025-1031)，这为RAGE可以是治疗性干预的有用靶标的想法提供了支持(Hudson&Schmidt，2004，Pharm Res 21：1079-1086，Schmidt&Stem，2000，Trends Endocrinol.Metab.11：368-375，Hudson et al.，2003，Arch.Biochem.Biophys.419：80-88)。
本研究所描述的sRAGE-Ig融合蛋白是设计为潜在的治疗性诱饵的重组分子。该蛋白含有连接至人IgG1重链分子的CH2和CH3结构域的人RAGE的配体结合V样结构域和恒定类型样C1结构域(图1)。虽然sRAGE已作为单体从小鼠分离(Hanford et al.，2004，J.Biol.Chem.279：50019-50024)，并且已作为单体在大肠杆菌(Wilton et al.，2006，ProteinExpression Purif.47：25-35)和酵母(Ostendorp et al.，2006，Biochem.Biophys.Res.Commun.347：4-11)中表达，这里我们报道人sRAGE-Ig融合蛋白表达为二聚体。我们描述了在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达时sRAGE-Ig融合蛋白的蛋白酶剪切和糖基化模式。为了评价人RAGE的N-连接糖基化对结合至其配体的功能作用，我们使用衣霉素以产生sRAGE-Ig融合蛋白的N-连接位点占据变体，并且测量糖基化变体与RAGE配体S100b的结合。
实验方法
表达sRAGE-Ig融合蛋白的宿主细胞系的产生：通过电穿孔用线性化的表达质粒转染来产生表达sRAGE-Ig融合蛋白的CHO细胞系，所述表达载体含有编码图2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的sRAGE-Ig cDNA。编码sRAGE-Ig融合蛋白的核酸包含编码人RAGE信号序列(SEQ ID NO：1的前23个氨基酸)的序列。转染之后，在甲基sulphoximine(MSX)中选择细胞，并且通过ELISA筛选来自存活池的条件培养基(“CM”)的蛋白质产量。将产生融合蛋白的细胞从静置培养转移至悬浮培养，并且放大为非克隆池。将在摇瓶测定中具有可接受的生长速率和滴度的池毛细管克隆。基于它们在摇瓶测定中的生长和表达水平将克隆放大至悬浮培养并改进。从非克隆池和在摇瓶中生长的克隆候选采集条件培养基并通过小MabSelect柱(GEHealthcare，Piscataway，NJ)纯化用于产物质量分析。基于生长、滴度和产物质量特征选择用于本研究的表达sRAGE-Ig融合蛋白的克隆CHO细胞系，
并且所述克隆CHO细胞系是评价的细胞系的总数的代表。
衣霉素处理：在摇瓶中于50mL培养基中将表达sRAGE-Ig融合蛋白的克隆CHO细胞系培养至对数中期。用5μg/mL溶解在DMSO中的衣霉素(Sigma-Aldrich)处理细胞，并且在摇床中于37℃下培养3天。3天结束后收集条件培养基，过滤并纯化。通过RP-HPLC分析纯化的蛋白质的聚糖位点占据率，并且收集峰级分用于S100b结合测定。
从条件培养基纯化sRAGE-Ig蛋白：在来自GE Healthcare(Piscataway，NJ)的5mL HiTrap MabSelect柱上利用来自GE Healthcare的AKTA FPLC层析滑道进行实验室规模的蛋白质纯化。用5个柱体积(CV)的50mM磷酸盐、1M NaCl，pH 7.0将柱平衡。然后将澄清的CM施用于柱，并且用10个CV的50mM磷酸盐、1M NaCl，pH 7.0洗涤，随后用5个CV的乙酸盐，pH 5.5洗涤。然后利用25mM乙酸盐，pH 3.5将蛋白质从柱洗脱，并且基于280nm吸光度收集洗脱池作为单个级分。在整个操作中以5mL/min运行柱。然后利用来自Pierce(Rockford，IL)的10K透析盒将纯化的蛋白质池透析入稳定缓冲液。在分光光度计上利用280nm吸光度测定纯化的蛋白质的浓度。
sRAGE-Ig、PNGaseF和弗林蛋白酶消化的SDS-PAGE分析：在总体积250μL的缓冲液中用7.5mU肽-N-糖苷酶F(PNGase F)(Cat.No.GKE-5006，Prozyme，San Leandro，CA，)将纯化的sRAGE-Ig融合蛋白(178μg)在37℃下消化30小时。在总体积100μL的缓冲液中用24U弗林蛋白酶(Cat No.P8077S，New England Biolabs，Ipswich，MA)将32μg纯化的sRAGE-Ig融合蛋白在37℃下消化15小时。在还原SDS-PAGE样品缓冲液中制备未消化和已消化的融合蛋白样品，每泳道加入2.7ug总蛋白，并且在4-12％梯度NuPage bis-tris凝胶上跑(Cat.No.NP0322，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
通过尺寸排阻层析(SEC)分析sRAGE-Ig：在流动相(350mM柠檬酸盐，pH 6.0)中将纯化的sRAGE-Ig稀释至3mg/mL，并且利用Alliance 2695液相层析仪(Waters，Millford，MA)通过SEC分析。Superdex 20010/300GL柱用于分离(Cat.No.17-5175-01，GE Healthcare，Piscataway，NJ)，在环境温度下流速0.75mL/min持续40min。所用的检测为在280nm的吸光度。
通过RP-HPLC测定糖基化位点占据率并且通过液相层析/质谱分析(LC/MS)鉴定峰：在反相HPLC条件下测定sRAGE-Ig融合蛋白的糖基化位点占据率。采用具有四个泵和UV检测器的Agilent 1100液相层析仪(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)用于HPLC分离。用Chemstation(Agilent)或Empower(Waters)软件包完成数据采集和集成。简单地说，在Zorbax300SB-C18柱(Agilent)上用浅梯度的HPLC级水和乙腈(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以0.3mL/min的流速分离20μL，1.0mg/mL的蛋白质溶液。在时间零点的初始梯度设置为67％流动相A(含有0.1％三氟乙酸(ACS级，Pierce，Rockford，IL)的水和33％流动相B(含有0.085％三氟乙酸的乙腈))。从t＝0至2分钟，将流动相B增加至34％，从t＝2至10分钟进一步增加至36％，然后在67％流动相A和33％流动相B平衡10分钟。检测为在214nm的吸光度。
为了表征糖基化位点占据变体的质量谱，利用连接至Micromass四级飞行时间(Q-TOF)质谱仪(Q-TOF MS)(Waters，Milford，MA)的Agilent 1100液相层析仪通过LC/MS分析样品。将来自反相分离的洗脱液1∶1分开引入质谱仪源。在每个层析峰中平均质谱，并且利用Masslynx软件提供的MaxEnt算法解析。
用荧光检测通过正相HPLC(NPLC)分析释放的聚糖：将样品稀释至0.25mg，并且利用具有10千道尔顿的分子量截留(MWCO 10K)的Nanosep(P/N OD010C34，Pall Life Sciences，East Hills，NY)膜滤器脱盐。通过与PNGaseF(Cat.No.GKE-5006，Prozyme，San Leandro，CA)在37℃下孵育过夜从糖蛋白释放N-聚糖。在β-巯基乙醇(GKE-5006，Prozyme，San Leandro，CA)和SDS(Prozyme，San Leandro，CA)存在的情况下进行酶促反应。释放之后，利用Nanosep膜滤器(MWCO 10K)从释放的聚糖去除蛋白质。标记反应之前将含有聚糖部分的样品蒸干。然后在65℃下用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)(GKK-404，Prozyme，San Leandro，CA)将聚糖标记3-4小时。利用GlycoCleanS柱体(GKK-4726，Prozyme，San Leandro，CA)去除过量的标记试剂。最后，在装备有荧光检测器的Agilent 1100液相层析仪(Agilent Technologies，PaloAlto，CA)上通过NPLC分析标记的聚糖的混合物。激发(Ex)波长为330nm，并且发射(Em)波长为420nm。维持在30℃的TSK-GEL酰胺-80柱(250mmx4.6mm，5μm粒径)用于分离(Tosoh Bioscience，South San Francisco，CA)。使用梯度分离，流速0.4mL/min，以70％A和30％B起始，并且在90min内增加至40％B。然后在50min内将流动相B增加至95％，并且在5min内增加至100％，然后降低至30％用于重新平衡。使用的流动相如下：流动相A为乙腈，并且流动相B为250mM甲酸铵pH 4.4。10μL的注射体积用于所述分析。
通过阴离子交换层析的电荷特征分析：将样品稀释至0.5mg，并且如上文所述制备用于正相液相层析(NPLC)。通过在装备有荧光检测器的Agilent 1100液相层析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)上的阴离子交换高效液相层析(HPLC)分析释放和标记的聚糖的混合物。激发波长为330nm，并且发射波长为420nm。在环境温度下的GlycoSepC柱(100mmx7.5mm，10μm粒径)(GKI-4721，Prozyme，San Leandro，CA)用于分离。使用梯度分离，流速0.5mL/min，以100％A和0％B起始持续5分钟，并且在45分钟内增加至50％B。然后在5分钟内将流动相B增加至100％并维持5分钟，然后回复至0％用于重新平衡。使用的流动相如下：流动相A为20％乙腈、80％水(v/v)，并且流动相B为20％乙腈、80％250mM乙酸铵(v/v)pH4.5。100μL的注射体积用于分析。
通过胰蛋白酶作图LC/MS的位点特异性分析：在约100mM Tris pH 7.5和25％乙腈中将融合蛋白稀释至4mg/mL，至100μL的终体积。将该溶液加入40μg胰蛋白酶(V511A，Promega，Madison，WI)，并且在37℃下孵育过夜。通过用0.1％三氟乙酸(TFA)1∶10稀释来终止该消化。在连接至Q-TofMicromass分光计(Waters，Millford，MA)的Agilent 1100液相层析仪上通过LC/MS分析该消化物，利用在50min内0％-50％的线性梯度的具有0.1％TFA的乙腈∶水。Zorbax 300-SB柱(4.6x150mm，Agilent，Palo Alto，CA)用于分离和质量分析。引入质谱仪源之前将来自LC的流体～1∶2分开。
收集峰级分用于S100b结合测定：利用10K Amicon超滤柱(Millipore，Bedford，MA)将sRAGE-Ig融合蛋白样品浓缩至4.0mg/mL，然后在如上文所述用于聚糖位点占据率的反相条件下分离。收集代表sRAGE-Ig的位点占据变体的三个级分，为三糖基化(级分1，F1)、双糖基化(级分2，F2)和非糖基化(级分3，F3)。将收集的样品浓缩并交换入稳定缓冲液。在使蛋白质进行S100b ELISA结合测定之前用DU 650分光光度计(Beckman Coulter，Fullerton，CA)测定级分样品的蛋白质浓度。
S100b结合ELISA：用100μL/孔的包被缓冲液(Tris缓冲盐水[TBS]，pH8.0，含有5mM CaCl2)中的20μg/mL S100b蛋白(Cat.No.559290，Calbiochem，Gibbstown，NJ)在4℃下包被ELISA测定板过夜。然后用封闭缓冲液(TBS pH8.0，含有5mM CaCl2、0.05％吐温20和1％牛血清白蛋白[BSA])将该板洗涤3次，并且用封闭缓冲液封闭1-1.5hr。在单独的稀释板中制备sRAGE-Ig融合样品，在封闭缓冲液中的最高浓度为10μg/mL，在封闭缓冲液中1∶4连续稀释低至2.4ng/mL。封闭之后，用封闭缓冲液洗涤测定板，并且将100μL样品从稀释板转移至测定板。将测定板在室温下孵育2.5hr。然后用封闭缓冲液将测定板洗涤3次，洗涤之间有1min浸泡时间。将封闭缓冲液中1∶2500稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG(Cat.No.A2290，Sigma，St.Louis，MO)以100μL/孔加入该板。将该板在室温下孵育1hr。然后再用封闭缓冲液将测定板洗涤3次，将100μL 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB；Cat.No.34022，Pierce，Rockford，IL)加入每个孔，并且将该板在室温下孵育8分钟。然后将100μL 1M H2SO4加入每个孔，摇动该板，并且在酶标仪上于450nm下读数。
结果
在宿主细胞中表达sRAGE-Ig融合蛋白：来自CHO细胞条件培养基的纯化的融合蛋白在非还原和还原凝胶中的SDS-PAGE分析显示该融合蛋白作为单体迁移，这表明所述二聚体是通过非共价缔合来连接的。应当注意到因为所述融合蛋白的纯化采用A蛋白，预期仅观察到保留与A蛋白结合的部分的含有Fc的片段。图3示出了还原SDS-PAGE凝胶的照片，并且显示迁移在约55kDa的全长单体(FLM)是所述融合蛋白的主要形式(泳道1和6)。在单独的分析中通过质谱分析法确认片段A和B(图3，泳道1和6)的性质。片段A代表迁移在约46kDa的FLM的氨基酸55-438(参见图2)，并且片段B代表迁移在约30kDa的FLM的约氨基酸199-438。氨基酸编号基于图2所示的序列(SEQ ID NO：1)。用PNGaseF处理所述融合蛋白(图3，泳道3)显示所有三条带迁移的转变，表明FLM加上片段A和B是N-糖基化的。用弗林蛋白酶完全消化所述融合蛋白(图3，泳道5)导致所示的两条主带。泳道5中上面的带与泳道6中所见的片段B的N-糖基化形式共迁移。泳道5中下面的带与泳道3中所见的片段B的非糖基化形式共迁移。这个结果与显示片段B含有直接在弗林蛋白酶共有切割位点之后的序列(氨基酸199-438)的质谱分析数据一起表明片段B是由FLM的弗林蛋白酶切割(或者片段A的弗林蛋白酶切割)产生的。
通过尺寸排阻层析分析全长sRAGE-Ig融合：来自CHO条件培养基的纯化的融合蛋白的SEC分析的结果如图4所示并且显示3个主峰：峰1在16.94分钟；峰2在18.64分钟；并且峰3在21.63分钟。利用激光散射联合SEC测定与峰1相关的大约分子量为约96kDa，具有±10％的误差。这个结果与峰1为sRAGE-Ig同源二聚体的指定一致，因为为同源二聚体计算的质量范围为约97-107kDa，取决于糖基化。基于这个结果，可能图4所示的SEC谱上的峰2代表异源二聚体(与弗林蛋白酶切割的Fc片段缔合的一个全长分子)，并且峰3可以代表Fc二聚体或者可能全长单体。也在图4示出的这些峰的组分总结显示sRAGE-Ig融合蛋白主要由同源二聚体(约78％)和异源二聚体(约19％)组成，具有少量Fc二聚体或单体(约3％)以及高分子量类型(HMMS2)/团聚体(少于1％)。
sRAGE-Ig融合蛋白的糖基化位点占据率和位点占据变体的分级分离：sRAGE-Ig融合蛋白FLM的糖基化位点占据谱如图5示出的数据中的样品1(S1)所示。该谱显示样品1主要含有命名为样品1级分1(S1F1)的3-聚糖类型(67％)和命名为样品1级分2(S 1F2)的2-聚糖类型(22％)与非常少量的1-聚糖和0-聚糖类型(命名为样品1级分3[S1F3])。利用反相分离通过重新注射来确认级分的纯度。如下文所述利用LC/MS证实了图5所示的S1样品的3-聚糖和2-聚糖峰的性质的结果。
通过LC/MS分析糖基化位点占据变体：产生如图5所示的命名为S1F1和S1F2的峰的质谱，并且结果如图6所示，包含上图(图6A)和下图(图6B)。该谱证实在每个样品1的级分内存在几个类型，与由该分子中存在的3个潜在的N-连接聚糖位点所预期的糖基化异质性一致。图6(上图，图6A)显示最早的洗脱峰S1F1与所有3个位点均被N-连接聚糖占据的类型一致(52,999-54,105Da)。基于氨基酸序列预测的未占据(0-聚糖位点占据)类型的分子量为48,594Da，约4000-6000Da的质量差异。图6(下图，图6B)示出了解析的峰S1F2的质谱。该质谱显示质量与双占据(2-聚糖位点占据)类型一致(51,785-52,400Da)。总的来说，LC/MS分析显示S1中存在类型的异质群体，具有变化量的糖基化。如相对UV吸光度所示，主要类型为完全占据的糖蛋白，具有较低水平的双糖基化类型，以及推测的单糖基化和非糖基化类型。利用蛋白质水解作图评价3个N-连接位点的相对占据率，并且如下文所述进行每个位点存在的聚糖类型的更详细的分析。
从sRAGE-Ig融合释放的N-聚糖的大小和电荷特征分析：示出通过与PNGaseF孵育而从所述融合蛋白释放的N-连接聚糖的正相HPLC层析谱的图如图7所示。通过与可商购的聚糖标准品比较来鉴定峰。数据显示明显存在唾液酸化的聚糖结构，以及IgG分子典型的核心岩藻糖基化的二触角聚糖。还观察到寡甘露糖结构(Man5，Man6)。每种寡糖的相对量如表1所示，还示出了相应的建议的结构。
表1
N-聚糖的相对量(％)
Figure BPA00001481727801021
图例：■＝N-乙酰葡糖胺(GlcNac)▲＝岩藻糖(Fuc)●＝甘露糖(Man)○＝半乳糖(Gal)◆＝唾液酸
术语“G0”指其中不存在末端唾液酸(NeuAc)或Gal的二触角结构，“G1”指具有一个Gal而无NeuAc的二触角结构，并且“G2”指具有两个末端Gal而无NeuAc的二触角结构。
通过阴离子交换层析的释放的聚糖的分析用于定量存在的中性、单电荷和双电荷类型的相对量。表2所总结的结果与聚糖特征数据吻合良好，显示存在的类型的约25％是唾液酸化的。
表2
带电聚糖的相对量
  中性聚糖(％)   单唾液酸化聚糖(％)   二唾液酸化聚糖(％)
  74.7   20.0   5.3
在层析谱中未具体鉴定唾液酸化的聚糖。图7中标记为“唾液酸化”的峰是通过用唾液酸酶处理和它们在停留时间中的相应变换来鉴定的。利用酸水解，然后标记并比较在反相分离上的停留时间与唾液酸参考图，显示该分子上存在的唾液酸类型为N-乙酰神经氨酸。胰蛋白酶消化的质谱分析证实了这些配置。
sRAGE-Ig融合蛋白的胰蛋白酶作图分析：sRAGE-Ig融合蛋白的胰蛋白酶消化的UV层析谱如图8所示。基于质量鉴定含有共有N-连接位点的胰蛋白酶消化肽段，并且在层析谱中标记为T1、T10和T31。这些胰蛋白酶消化肽段的氨基酸序列为：T1包含pENITAR(SEQ ID NO：5)；T10包含VLPNGSFLPAVGIQDEGIFR(SEQ ID NO：6)；并且T31包含EEQYNSTYR(SEQ ID NO：7)。T1含有RAGE结构域中在Asn2(N2)处的第一N-连接位点，T10含有在Asn58(N58)处的第二个，并且T31含有存在于所述融合蛋白的Asn288(N288)处(但是在其他情况下为人IgG1的Asn297)的Fc结构域N-连接糖基化位点。预测含有糖基化位点的胰蛋白酶消化肽段如图9所示。T1肽具有N端谷氨酰胺(Gln，Q)，其经过环化以形成焦谷氨酸(pE)类型，显示为T1pE。还检测了这些肽的相应糖肽。图8中的插图示出了洗脱T1和T31糖肽的区域的放大视图。因为有共洗脱峰，不可以获得关于位点占据水平的高度准确的定量数据。然而，可以进行在每个位点的水平的估计。即，基于有和没有聚糖存在的胰蛋白酶消化肽段的UV吸光度，含有在Asn2处的第一RAGE糖基化位点的T1肽约90％被占据。T1的糖肽与来自T31肽的糖肽共洗脱，产生这个估计。对于含有在Asn 288处的IgG糖基化位点的T31肽也是如此。然而，观察到非常少的未被占据的肽，因此可以估计这个位点至少95％被占据。最后，估计含有在Asn58处的第二RAGE糖基化位点的T10肽约85％被占据。总的来说，这些测量与本文先前所述通过完整类型的反相分析所获得的值吻合良好。
产生所述糖肽的层析峰的质谱以确定在每个位点存在的聚糖的性质。基于从质谱测量的所述糖肽的质量联合从表1所总结的释放的聚糖的正相层析分析确定的性质，分配聚糖的性质。同时确定了在3个糖基化位点的每个存在的聚糖的性质。数据显示大部分唾液酸化存在于Asn2位点，并且作为分别具有一个和两个末端N-乙酰神经氨酸的G2聚糖、G2+2NANA和G2+NANA连同G1+NANA聚糖存在。Asn58位点大多包含寡甘露糖结构，主要为Man5。在这个位点还存在几个小结构。Asn288显示主要存在G0和G1结构，典型的人IgG聚糖。在每个位点存在的聚糖的总结连同它们的相对丰度的估计如表3所示。
表3
在sRAGE-Ig融合蛋白中的3个位点的每个存在的聚糖的性质
  位点   聚糖   相对丰度
  Asn2(T1pE)   G2+2NANA   ++
  G2+NANA   ++
  G1+NANA   ++
  Asn58(T10)   Man5   ++
  Man6   +
  Man4   +
  Asn288(T31)   G0   +++
  G1   ++
衣霉素处理
抗生素衣霉素是抑制糖基转移酶的糖基化抑制剂，所述糖基转移酶从尿苷二磷酸(UDP)-GlcNAc转移磷酸-N-乙酰葡糖胺(P-GlcNAc)以形成多萜醇磷酸(Dol-P)-GlcNAc。在本文中衣霉素用于证实糖基化的抑制可以减少蛋白质的聚糖位点占据率，并且更优选地，可以影响所述蛋白质与该蛋白质的同源配体结合的结合特征。
衣霉素处理的样品的位点占据率。用衣霉素处理的表达自CHO细胞的全长sRAGE-Ig融合蛋白的糖基化位点占据谱如图10中的样品2(S2)所示。该谱显示所述样品主要含有3-聚糖类型(42％)、2-聚糖类型(16％)和0-聚糖类型(31％)，未检测到1-聚糖类型。在分级分离和收集S2级分1(S2F1)(3-聚糖)、S2F2(2-聚糖)和S2F3(0-聚糖)用于结合分析之前，利用质谱分析法证实了图10中S2样品的3-聚糖、2-聚糖和0-聚糖峰的性质(图11)。0-聚糖类型与在N端具有焦谷氨酸(pE)的sRAGE-Ig融合的理论质量一致，并且有或没有C端赖氨酸的变体的混合物，典型的IgG重链分子，这证实由于表达期间部分蛋白酶解加工(即，赖氨酸剪切)的异质C端。
测定位点占据变体结合至S100b。S100b是已知的RAGE配体，其与RAGE的相互作用已作图至VC1结构域。S100b在胞外结合至RAGE刺激RAGE水平升高，这导致增加的细胞反应以及慢性炎症和疾病的建立。因此测试如上文所述从sRAGE-Ig融合蛋白分离的位点占据变体的混合物和级分结合至S100b的能力，并且结果如表4所示。结果报道为IC50值以及与S1对照(在无衣霉素的情况下生长的CHO细胞所产生的未处理的sRAGE-Ig)相比的相对结合至S100b(％)。
表4
S100b结合ELISA
当在用衣霉素处理的CHO细胞中表达sRAGE-Ig融合蛋白时(样品S2)，聚糖占据谱从67％3-聚糖+22％2-聚糖的混合物(未处理/对照样品S1)变换至42％3-聚糖+16％2-聚糖+31％0-聚糖(用衣霉素处理/样品S2)。样品S2相对结合至S100b(295％)是样品S1(100％)的约3倍，这表明混合物的较低聚糖占据率导致sRAGE-Ig更好结合至S100b。额外的用分离的聚糖级分的结合研究证实了这个发现。与也从S1对照分离的3-聚糖级分(46％)(S1F1)相比，从S1对照分离的2-聚糖级分(S1F2)表现出提高的结合至S100b(173％)。在从衣霉素处理的样品S2分离的0-聚糖级分(S2F3)观察到最高的结合至S100b。非糖基化变体(S2F3)在结合至S100b中与样品S1F1的完全被占据3-聚糖形式(46％)相比表现出10倍增加(529％)，并且与未分级分离的未处理的S1对照(100％)相比表现处5倍增加。
讨论
在本研究中表达并表征了人sRAGE-Ig融合蛋白。此外，检测了糖基化对该蛋白结合至RAGE配体S100b的影响。虽然传统上产生融合蛋白以增加融合伙伴的血清半衰期，很少知道将部分RAGE或部分sRAGE连接至免疫球蛋白结构域或者二聚化可以怎样影响sRAGE的折叠和糖基化或者其吸引配体的能力。
本文所公开的数据表明在CHO细胞中表达的sRAGE-Ig融合蛋白主要作为非共价同源二聚体存在，剩余蛋白作为异源二聚体存在，所述异源二聚体是通过所述同源二聚体的弗林蛋白酶切割丢失单个RAGE V样结构域来形成的。因为RAGE的C1结构域中有弗林蛋白酶共有序列，不清楚为什么所述同源二聚体群体没有被更有效地切割。不希望被任何特定理论束缚，导致切割和未切割的二聚体的异质群体的FLM被弗林蛋白酶不完全切割可能是由于CHO细胞和哺乳动物细胞一般产生非常少量的内源性弗林蛋白酶这一事实(Ayoubi et al.，1996，Molecular Biology Reports.23：87-95)。
还令人感兴趣的是RAGE分子中弗林蛋白酶切割位点的生物学目的以及弗林蛋白酶切割是否对内源性RAGE分子的生物学功能具有任何功能意义。据证实弗林蛋白酶切割释放可溶形式的载脂蛋白E受体2(ApoER2)(Koch et al.，2002，EMBO J.21：5996-6004)和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)(Herz et al.，1990，EMBO J.9：1769-1776)。因此，并且不希望被任何特定理论束缚，弗林蛋白酶在体内可以参与产生可溶性RAGE受体片段，所述可溶性RAGE受体片段可以用于调节或抑制配体与其细胞靶标相互作用或者控制RAGE信号传导。虽然据证实人RAGE mRNA的新剪接变体是负责产生可溶形式的RAGE受体的一个机制(Yonekura et al.，2003，Biochem.J.370：1097-1109)，较少知道可以产生内源可溶性RAGE的蛋白酶解过程。有趣的是，在小鼠中，可溶性RAGE是通过羧基端截短产生的，与人中报道的可变剪接机制形成对比(Hanaford et al.，2004，J.Biol.Chem.279：50019-50024)。因此，不希望被任何特定理论束缚，在sRAGE-Ig融合蛋白中观察到的弗林蛋白酶切割可以是RAGE的内源性切割的指示，并且在体内可以在该分子的生物学功能中起作用。
天然RAGE在V样结构域中的两个潜在的位点N2和N58是N-糖基化的。许多研究显示RAGE的糖基化可以影响其对RAGE配体的亲和力和/或特异性，并且该结合可以根据考虑的配体变化。Wilton等人(2006，ProteinExpression Purif.47：25-35)报道细菌中表达的可溶性RAGE(单体、非糖基化)结合至几种RAGE配体，包括晚期糖基化终产物(AGE)-BSA、免疫球蛋白轻链淀粉状蛋白纤维和糖胺聚糖。然而，不是融合蛋白的来源于大肠杆菌的sRAGE不结合AGE羧甲基赖氨酸(CML)-BSA。Dattilo等人(2007，Biochemistry 46：6957-6970)还证实除了结合S100b和amphoterin之外，细菌表达的可溶性RAGE结合AGE-BSA。相比之下，Srikrishna等人(2002，J.Neurochem.80：998-1008)报道从牛肺分离的天然全长糖基化的RAGE受体在该受体去糖基化时表现出结合至amphoterin的显著减少。Osawa等人(2007，Biochimica et Biophysica Acta 1770：1468-1474)还显示在哺乳动物细胞中表达的可溶性RAGE的去糖基化突变体与糖基化野生型相比表现出结合至AGE的减少。因此，不清楚糖基化或其缺少对RAGE或sRAGE配体结合的影响是什么。此外，以前的研究均未检测当sRAGE融合至Ig结构域时糖基化对sRAGE结合至其配体的影响。
本文所公开的数据第一次证实将免疫球蛋白区连接至sRAGE看来不干扰RAGE的V样结构域的糖基化，因为表达的融合蛋白显示在该融合蛋白中Asn2和Asn58处的N-连接位点分别约90％和85％被占据。不希望被任何特定理论束缚，可能是因为这个融合蛋白作为二聚体存在，sRAGE的二聚化可以对其与配体的亲和力具有影响。Ostendorp等人(2007，EMBO J.26：3868-3878)的研究表明二聚化在配体结合中起作用，他们已证实四聚体S100b最优结合至二聚体sRAGE。本研究证实与非糖基化形式(例如，具有不超过2个被占据的N-连接糖基化位点的形式)相比，在所有3个位点-V样结构域中2个和Ig区中1个具有N-糖基化的sRAGE-Ig融合蛋白(3-聚糖类型)表现出很少结合至S100b。当所述蛋白中的1个N-连接位点不被占据时(2-聚糖类型)，sRAGE-Ig融合蛋白结合至S100b增加，并且所述蛋白中的所有3个位点均未被占据时(0-聚糖类型)表现出最高的结合至S100b。因为不能区分RAGE V样结构域中被占据的N-连接位点和Ig区中被占据的位点，2-聚糖类型可以代表RAGE V样结构域中两个位点(N2和N58)均被占据而在N288没有聚糖，或者2-聚糖类型可以代表在N2和N288或者在N58和N288处的聚糖占据。然而，因为胰蛋白酶作图数据显示Ig区中的N-聚糖位点(Asn288)是3个中最高度占据的(与Asn2的90％和Asn58的85％相比95％)，该数据表明至少2/3的2-聚糖类型会含有在Asn288处被占据的位点，因此2/3的2-聚糖类型应当在RAGE V样结构域中仅具有单个被占据的N-连接位点，Asn2或Asn58。本文所公开的数据显示与3-聚糖类型相比，sRAGE-Ig融合蛋白的2-聚糖类型结合至S100b增加，因此，不希望被任何特定理论束缚，增加的结合可以是RAGE V样结构域中糖基化丢失的结果。本文所公开的数据证实了这个趋势，所述数据显示与2-聚糖或3-聚糖类型相比，sRAGE-Ig融合蛋白的0-聚糖类型结合至S100b最高。这些数据进一步显示增加的配体结合是RAGE V样结构域中减少的糖基化的结果，这对于RAGE V样结构域中完全缺少糖基化的0-聚糖类型是最明显的。
总的来说，本文所公开的数据第一次证实sRAGE-Ig融合蛋白的非糖基化变体提供最佳的与RAGE配体S100b的结合。因为RAGE上对于S100b的结合位点已鉴定为VC1结构域(Datillo et al.，2007，Biochemistry46：6957-6970)，并且不希望被任何特定理论束缚，这些数据表明在可溶性RAGE中位置Asn2和Asn58的N-糖基化可以物理上抑制S100b，或者可以改变配体结合位点的识别。除了研究RAGE配体S100b的结合之外，检测了sRAGE-Ig融合蛋白及其糖基化变体结合至A-β肽，并且如下文所证实，发现了相似的结果。
实施例2：
包含减少的聚糖位点占据率的RAGE的增加的Aβ结合
如本文中先前其他地方所述，在未处理的CHO细胞(对照；样品1＝S1)和衣霉素(TMYCN)处理的CHO细胞(样品2＝S2)中表达sRAGE-Ig。然后如先前所述将样品分级分离以获得包含融合蛋白的级分，所述融合蛋白具有以下聚糖位点占据：样品1-级分1(S1F1)＝未处理的细胞，3-聚糖占据；样品1-级分2(S1F2)＝未处理的细胞，2-聚糖占据；样品2-级分1(S2F1)＝TMYCN处理的细胞，3-聚糖占据；样品2-级分2(S2F2)＝TMCYN处理的细胞，2-聚糖占据；样品2-级分3(S2F3)＝TMYCN处理的细胞，0-聚糖占据。与S1(对照，未处理的细胞)的结合比较每种级分结合至Aβ，并且结果如下文表5所总结。
Aβ肽结合活性的测定：简单地说，测试两种人Aβ肽：Aβ1-40(产品编号#A-1153-2，Rpeptide)，和Aβ1-28(产品编号#24232，AnaSpec)。用1％NH4OH中的20μg/mL肽将板在4℃下包被过夜。然后用封闭缓冲液(TBS pH8.0、0.05％吐温20和1％BSA)洗涤板，并且在室温下封闭1hr。基本上如本文先前对于S100b结合测定所述进行所有其他步骤。
表5
聚糖位点占据率对sRAGE-Ig结合至Aβ的影响
Figure BPA00001481727801091
如本文先前所公开的关于融合蛋白与S100b的结合，当在用衣霉素处理的CHO细胞中表达sRAGE-Ig融合蛋白时(样品S2)，聚糖占据谱从包含约67％3-聚糖+22％2-聚糖的混合物(未处理/对照样品S1)变换至包含约42％3-聚糖+16％2-聚糖+31％0-聚糖的混合物(用衣霉素处理/样品S2)。
样品S2对Aβ相对结合(151％)是样品S1(100％)的大约一倍半，表明与更多糖基化的S1样品相比，S2混合物的较低聚糖聚糖占据率导致sRAGE-Ig更好地结合至Aβ。额外的用分离的聚糖级分的结合研究证实了这个发现。与先前公开的关于S100b结合的结果相似，与也从S1对照分离的3-聚糖级分(102％)(S1F1)相比，从S1对照分离的2-聚糖级分(S1F2)表现出提高的结合至S100b(170％)。对于从衣霉素处理的样品S2分离的0-聚糖级分(S2F3)观察到最高的结合至Aβ。与样品S2F1的完全被占据的3-聚糖形式(49％)相比，非糖基化变体(S2F3)在结合至Aβ中表现出6倍增加(295％)，并且与未分级分离、未处理的S1对照(100％)相比表现出3倍增加。
总之，减少的聚糖位点占据率介导增加的sRAGE-Ig融合蛋白结合至Aβ。因此，本文所公开的数据证实糖基化的控制可以用于改进蛋白质结合至其配体的特征。
实施例3：
利用2-脱氧-D-葡萄糖控制糖基化：减少的聚糖位点占据率影响RAGE配体结合
本研究所用的RAGE-Fc融合蛋白含有RAGE的配体结合位点，其包含连接至人IgG1分子的部分CH2结构域和CH3结构域的人RAGE的V样和C样C1结构域。所述融合蛋白包含3个N-连接糖基化位点，RAGE结构域中2个在N2和N58，以及Fc区中1个(在融合肽的氨基酸残基288号)，当在CHO细胞中表达时约70％被完全占据。如本文中先前其他地方所公开的，在细胞培养中使用衣霉素以表达所述融合蛋白并产生位点占据变体。分离糖基化变体，并且测定聚糖占据率对结合至RAGE配体的影响。如先前所公开的，与完全被占据的3-聚糖形式(46％)相比，非糖基化的0-聚糖位点占据变体在结合至S100b中表现出10倍增加(529％)，而双占据的2-聚糖变体表现出两者之间的中等结合(180％)。相似的，关于结合至Aβ，相对于完全被占据的3-聚糖形式(与未分级分离的对照混合物相比49％)，非糖基化的0-聚糖变体在结合至Aβ中表现出6倍增加(与未分级分离的对照聚糖混合物相比295％)，并且2-聚糖位点占据变体(相对于未分级分离的混合物238％)在结合中表现出中等增加(与未分级分离的对照混合物相比238％)，与0-聚糖变体的非常相似。总之，本文其他地方公开的利用衣霉素作为聚糖位点占据抑制剂的数据第一次证实减少的位点占据率增加RAGE结合至其配体的亲和力，更具体的，可以通过抑制聚糖位点占据来控制RAGE-Ig融合蛋白结合亲和力。因此，这些数据证实可以在胞内操纵重组蛋白的糖基化模式以增加所述蛋白结合至其配体。这些数据提示开发利用N-聚糖位点占据抑制剂用于制造具有增加的结合活性的分子的生物方法是有用的。
成本较低和无毒的N-连接聚糖位点占据抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖用于开发这样的新生物方法。2-脱氧-D-葡萄糖通过竞争性抑制己糖激酶和葡萄糖磷酸异构酶(phosphoisomerase)来作为糖酵解拮抗物发挥功能，并且在N-连接糖基化期间通过并入多萜醇-焦磷酸连接的寡糖来与甘露糖竞争。评价了利用2-脱氧-D-葡萄糖对细胞培养物的影响，所述细胞培养物利用控制的补料分批生物反应器方法表达先前所述的sRAGE-Fc融合蛋白。本文所公开的数据证实了这个抑制剂对N-连接位点占据以及对后续所述融合蛋白结合至S100b配体的活性的影响。本文所公开的结果证实因为该抑制剂的使用，相对于更多糖基化的变体，所述融合蛋白的非糖基化变体的产量增加。更重要的是，本文所公开的数据证实利用含有2-脱氧-D-葡萄糖的生物方法产生的融合蛋白证实了增加的对S100b配体的亲和力。
因此，本文所公开的数据证实2-脱氧-D-葡萄糖可以有效地用于生物反应器方法以控制哺乳动物细胞中表达的重组分子的N-连接聚糖位点占据。同样地，这个抑制剂在制造过程中可以用于操纵分子的优选特征，如最佳靶标/配体/组织结合活性、溶解度、半衰期/从血清清除率等。
材料和方法
细胞系维持和生物反应器接种物训化
在125、250、500、1000或2000ml通气摇瓶(Corning)中作为悬浮培养物维持和扩大表达RAGE-Fc融合蛋白的CHO细胞，所述通气摇瓶在摇床平台培养箱上以140rpm、1英寸摆幅和36.5℃振荡。
0.5L生物反应器运行-DASGIP细胞培养系统
具有最多8个pH和O2控制设置的用于哺乳动物细胞平行培养的模块系统DASGIP Cellferm-pro培养系统(Jülich，Germany)根据制造商的说明书用于0.5L生物反应器运行。
1L生物反应器系统
对于1L生物反应器运行，具有浸没的O2/CO2充气和恒定空气的1L工作体积的搅拌玻璃容器的Applikon培养系统(Cat No.V3MB010012，Applikon Inc.，Foster City，CA)覆盖入与Applikon流量控制台和P100ADI1032搅拌器控制器连接的Applikon 1030ADI控制器所控制的顶部空间。
对于底物定量给料(dosing)，使用Watson-Marlow 101U/R泵(Cat No.010.4202.00A，Watson-Marlow Bredel Inc.，Wilmington，MA)。
对照培养基
可商购的生产培养基CD CHO培养基是用于CHO生长和单克隆抗体生产的无蛋白质的化学成分确知培养基(Cat No.10743.029，Invitrogen，Carlsbad，CA)。向接种物训化培养基补充250μl(25μM)100mM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(L-methionine sulfoximine)(Cat No.GSS-1015-F Millipore)。向生产培养基预载额外的氨基酸，0.77g/L异亮氨酸、1.08g/L亮氨酸、0.91g/L酪氨酸2Na、0.38g/L缬氨酸、0.405g/L半胱氨酸和0.07gL色氨酸。
实验培养基
可商购的CD Opti-CHO培养基是无蛋白质的化学成分确知培养基(RefNo.12681-01，Invitrogen)。向接种物训化培养基补充250μl(25μM)100mML-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(Cat No.GSS-1015-F，Millipore，Bedford，MA)。
无脂质的Opti-CHO是无蛋白质的化学成分确知的可商购的培养基(Invitrogen，Sku.ME080016)。向接种物训化培养基补充250μl(25μM)100mM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)(Millipore，Cat No.GSS-1015-F)。
Ex-Cell 325培养基是无蛋白质的可商购的培养基(Cat No.14340C，Sigma)。向接种物训化培养基补充250μl(25μM)100mM L-甲硫氨酸亚砜亚胺(Millipore，Cat No.GSS-1015-F)。
营养补料和补充物：专用补料CDFv6.2营养补料溶液是由Invitrogen(Carlsbad，CA)制造的粉末制剂的化学成分确知的粉末。配制CDFv6.2无脂质营养补料溶液，没有脂肪酸前体亚类。这些补料的重组包括将补料溶解于WFI中并将pH调整至7.0。
葡萄糖补料溶液：所述补料为300g/L(30％)葡萄糖(Cat No.G-8920，Sigma)溶液。
2-脱氧-D-葡萄糖处理：将2-脱氧-D-葡萄糖(Cat No.D8375-100G或CatNo.D3179，Sigma)溶解于约40ml注射用水(WFI)中，并且如下文表6所见到的基于每种反应器的定量给料策略进行推注。
Figure BPA00001481727801131
ViCell细胞计数器：由Beckman Coulter(型号ViCell XR)制造的自动细胞活力分析仪通过流过细胞的视频成像进行台盼蓝排除方法。
Cedex细胞计数器：自动细胞计数器(型号CEDEX AS20，innovatis AG，Bielefeld，Germany)设计为等于血细胞计数器，其通过Cedex流动细胞的显微图像的图像分析的台盼蓝排除方法来检测和区分活细胞和死细胞。
NOVA BioProfile 400和Flex分析仪：使用用于哺乳动物细胞悬浮液的自动代谢物分析仪(型号BioProfile 400和型号BioProfile Flex，NOVABiomedical，Waltham，MA)。BioProfile 400分析细胞悬浮液的营养物/代谢物(谷氨酰胺、葡萄糖、乳酸、谷氨酸)、酸/碱状态(pH，PCO2，PO2)、电解质(钠、钾)以及通过特定酶或非酶传感器计算的参数(重量摩尔渗透压浓度、空气和CO2饱和、HCO3)。BioProfile Flex将多个分析仪合并在单个模块化仪器中，其分析细胞悬浮液，模块1：Gluc、Lac、Gln、Glu、NH4+、pH、PCO2、PO2、Na+、K+、Ca++，通过电化学；模块2：重量摩尔渗透压浓度，通过冰点降低；以及模块3：细胞密度/细胞活力，通过数字成像。
渗透压计：使用设计为处理20-μl样品的自动、单个样品渗透压计高级微渗透压计(型号3320)(Advanced Instruments，Inc.，Norwood，MA)。型号3320通过在分析样品的重量摩尔渗透压浓度之前将样品冷却来采用冰点降低法。
Agilent HPLC分析：利用抗体亲和法流程POROS6B.M(Lincoln PGMSOP“Protein A HPLC，HB-0004-01”)和Agilent 1100系列仪器(型号G1316A，SN DE11122116和型号G1329A，SN DE91603800)分析未纯化的细胞培养液样品的sRAGE-Ig Fc融合蛋白生产滴度。所述流程包括以下层析条件：平衡流动相：1x PBS(Invitrogen没有MgCl2和CaCl2)；洗脱流动相：12mMHCl、150ml NaCl，pH 2.25；洗涤缓冲液：WFI水；清洗缓冲液：6M胍和70％乙醇；柱：Applied BioSystems A蛋白免疫检测传感器柱体(Cat.No.2-1001-00，SN 6940，7318)；注射体积：20μL；以及检测器：紫外吸光度λ＝280nm。
结果和讨论
衣霉素处理-测定位点占据变体与S100b的结合
抗生素衣霉素是抑制糖基转移酶的糖基化抑制剂，所述糖基转移酶从尿苷二磷酸(UDP)-GlcNAc转移磷酸-N-乙酰葡糖胺(P-GlcNAc)以形成多萜醇磷酸(Dol-P)-GlcNAc。本文先前其他地方所公开的数据证实衣霉素可以用于减少蛋白质的聚糖位点占据率，更优选地，影响所述蛋白质结合至其配体。然而，因为有毒和昂贵，衣霉素不是期望用于生物反应器方法的抑制剂。因此，另一聚糖位点占据抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖在RAGE-Ig融合蛋白测定中用于控制聚糖位点占据率。
如本文先前其他地方所指出的，S100b是已知的RAGE配体，其与RAGE的相互作用已作图至V/C1结构域的配体结合位点。测试如上文所述从衣霉素处理的RAGE-Fc融合蛋白分离的位点占据变体的混合物和级分结合至S100b的能力，并且结果如上文表5所示。结果报道为IC50值和与S1对照(由未处理的细胞产生的未分级分离的RAGE-Fc)相比的相对结合至S100b(％)。当在用衣霉素处理的CHO细胞中表达RAGE-Fc融合蛋白时(样品S2)，聚糖占据谱从约67％3-聚糖+22％2-聚糖的混合物(未处理/对照样品S1)变换至包含约42％3-聚糖+16％2-聚糖+31％0-聚糖的混合(用衣霉素处理/样品S2)。样品S2相对结合至S100b(295％)是样品S1(100％)的大约3倍，这表明所述混合物的较低聚糖占据率导致RAGE-Fc更好地结合至S100b。额外的用分离的聚糖级分的结合研究证实了这个发现。与也从S1对照分离的3-聚糖级分(46％)(S1F1)相比，从S1对照分离的2-聚糖级分(S1F2)表现处提高的结合至S100b(173％)。在从衣霉素处理的样品S2分离的0-聚糖级分(S2F3)观察到最高的结合至S100b。非糖基化变体(S2F3)在结合至S100b中与样品S1F1的完全被占据的3-聚糖形式(46％)相比表现出10倍增加(529％)，并且与未处理的S1对照(100％)相比表现出5倍增加。
2-脱氧-D-葡萄糖处理-测定位点占据变体与S100b的结合
据报道用2-脱氧-d-葡萄糖处理培养物干扰N-连接糖基化途径中的特定步骤或者作为底物拮抗物发挥功能。2-脱氧-D-葡萄糖通过竞争性抑制己糖激酶和葡萄糖磷酸异构酶来作为糖酵解拮抗物发挥功能。此外，据报道这个糖类似物在N-连接糖基化期间通过并入多萜醇-焦磷酸连接的寡糖来与甘露糖竞争。
如表6所列在第10天采样的反应器运行39(R39)代表RAGE-Fc融合蛋白的基线聚糖位点占据谱和S100b结合活性，其从第10天收获的条件培养基纯化，在0.5L DASGIP生物反应器中利用CHO控制方法。CHO控制方法包括在第7天从34℃至31℃的温度转换。如表7所示，对于这个反应器，第10天和第12天的结果基本上相同。在这个控制方法中RAGE-Fc融合蛋白主要是高糖基化的，大部分分子是3-聚糖(约46％)和2聚糖(约28％)形式的。这些样品表现出最少量的与S100b的结合。
Figure BPA00001481727801151
表7示出结果的反应器R53是与R39相同的反应器，用相同的方法运行但是添加在该方法的第9天和第11天施用两次1mg/mL(基于反应器容积6mM)推注的2-脱氧-D-葡萄糖。从第10天和第12天收获的这个反应器的条件培养基纯化的RAGE-Fc融合蛋白的聚糖位点占据谱和S100b结合活性也如表2和图1所示。本文所公开的数据证实与基线生物反应器R39的结合活性相比，在这个反应器中于第12天结合活性增加100-1521％。结合活性的这种增加与非糖基化类型的增加以及较高糖基化形式的减少相关。
在不同培养基配方和施用策略中观察到结合活性和位点占据率之间的相关性。与专有浓度的培养基组分，如氨基酸、葡萄糖、维生素、盐和痕量元素配制可商购的CHO培养基(即，Ex Cell 325PF CHO和OptiCHO)。为了证实在生物反应器中添加培养基联合2-脱氧-D-葡萄糖对糖基化分布模式的影响，使表达RAGE-Fc融合蛋白的CHO细胞直接适应CD OptiCHO(Invitrogen)培养基和Ex Cell 325PF CHO(Sigma)。将化学成分确知、无动物组分和蛋白质的培养基CD OptiCHO配制为不同批次：目录配方以及无脂质的定制配方以对应Invitrogen CD CHO目录培养基的无脂质配方。生物反应器R66利用减去氨基酸预载的1L CHO Applikon控制方法、无脂质前体的CD OptiCHO培养基和无脂肪酸前体亚类的CDFv6.2营养补料。在第9天向该生物反应器施用单次1mg/ml(基于1L反应器容积6mM)推注的2-脱氧-d-葡萄糖。在第12天和第14天收获培养基样品，纯化条件培养基样品并测定聚糖位点占据率和S100b结合活性，结果如表7和图12所列。结果显示在收获时，相对于基线“对照”生物反应器R39，完全糖基化类型减少并且非糖基化类型增加(3-聚糖：第12天R39 45.8vs.第12天R6632.9％；0-聚糖：第12天R39 0.3vs.第12天R6612.2％)。糖形分布的这种变换与S100b结合活性的32倍增加(与第10天R39相比100％基线vs.第12天R66 3246％)相关，当与第12天基线生物反应器R39样品相比S100b结合活性增加32倍。此外，表6和图12所示的结果表明聚糖占据谱和S100b结合活性随着持续培养提高。
在利用减去6个氨基酸培养基预载的CHO控制方法的1L Applikon生物反应器运行R79中研究配制为没有谷氨酰胺的无蛋白质培养基Ex-Cell325PF CHO培养基。在第7天和第9天向该生物反应器施用两个1mg/mL(基于1L生物反应器容积6mM)推注的2-脱氧-d-葡萄糖。在第12天和第14天收获培养基样品，纯化条件培养基并测定聚糖位点占据率和S100b结合活性。这些生物反应器条件的数据如表7和图12中R79所示。本文所公开的数据显示完全糖基化类型增加(3-聚糖：第12天R7968.0％vs.第12天R3945.8％)和0-聚糖形式增加(第12天0.8％R79vs.第12天0.3％R39)。糖形分布的这种变化与第12天S100b结合活性与基线生物反应器R39(第10天)相比增加5倍(R39基线的100％与R79相对于基线527％相比，基线为第10天对照R39的结合)相关。此外，本文所公开的数据，例如表7和图12，表明聚糖占据谱和S100b结合活性随着持续培养提高。
当利用CD CHO培养基实施2-脱氧-d-葡萄糖推注时获得了非糖基化变体和S100b结合的相似增加。表7中的反应器R80与反应器R79相同，用相同方法运行，但是利用CD-CHO代替Ex Cell 325PF CHO培养基。这个生物反应器的数据如表7和图12中R80所示。本文所公开的数据显示与R79相似，用2-脱氧-D-葡萄糖处理产生完全糖基化类型全面减少，并且还介导0-聚糖形式增加。值得注意的是，相对于基线生物反应器(第10天R39)，完全糖基化类型减少(45.7-21.7％)，并且非糖基化增加(0.3-31.8％)。对于每种生物反应器运行的第12天获得的条件培养基，聚糖占据率的变换显著提高S100b结合活性(100-1632％)。来自R80反应器的第14天样品的S100b结合活性是所获得的最高的，并且显著高于与来自基线反应器R39的样品相关的结合活性-令人惊讶的是，在第10天生物反应器运行R80比对照生物反应器R39大约8077％或约80倍。
总的来说，2-脱氧-D-葡萄糖补充产生了RAGE-Ig非糖基化(0-聚糖位点占据)变体的增加，RAGE-Ig非糖基化(0-聚糖位点占据)变体还表现出提高的结合至S100b配体。令人惊讶的非糖基化变体增加与提高的结合亲和力是2-脱氧-D-葡萄糖定量给料策略之后糖基化分布模式变换的结果。利用CHO控制方法联合两次1g/L施用2-脱氧-D-葡萄糖，在生物反应器中证实了RAGE-Ig融合蛋白的非糖基化变体产量的增加。增加的非糖基化变体产量转而介导与具有更大量完全糖基化(3-聚糖位点被占据)变体的未处理的参考生物反应器相比S100b结合活性的惊人增加。本文所公开的数据证实聚糖位点占据抑制剂，例如但不限于2-脱氧-D-葡萄糖可以用于制造方法以控制重组蛋白的N-连接位点占据率，以便操纵被糖基化影响的所述蛋白质的优选特征，如最佳靶标/配体/组织结合活性、溶解度、半衰期、从血清清除率等。本领域技术人员会理解一旦提供本文所提供的公开，所述公开利用聚糖位点占据抑制剂来控制重组蛋白中的聚糖位点占据率而不需要引入氨基酸突变以删除糖基化位点，提供了重要的新方法，用于快速控制蛋白质特征并不影响蛋白质构象、丧失活性、增加免疫原性等，这些潜在地与此类突变相关。
实施例4：
利用2-脱氧-D-葡萄糖控制糖基化：抗体减少的聚糖位点占据率
特异性结合人免疫球蛋白E的抗体用于确定本发明的新的细胞培养方法可以用于产生糖蛋白，所述糖蛋白包含与在其他方面相同的细胞培养条件下但是在不存在糖基化抑制剂的情况下产生的相同蛋白的糖基化水平相比减少的糖基化。
如图13A至13D所示，全人抗IgE抗体命名为抗体5.948.1(在本文中也被称为“IgE mAb”或“mAb 5.948.1”)。抗体5.948.1包含潜在的N-连接糖基化位点，即，[nts]，在重链多肽V结构域的氨基酸残基73-75处，以及在恒定结构域的氨基酸残基301-303处，即，[NST](参见图13A)。还参见2008年4月1日提交的国际专利申请第PCT/US2008/004286号，现在公开为2008年10月16日的WO 2008/123999(整体援引加入本文)。图13A示出了重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，可变结构域残基为小写字母，CDR有下划线。V结构域糖基化位点(N2)大写，并且恒定结构域糖基化位点(N301)有下划线。图13B示出了编码重链氨基酸序列(SEQ ID NO：8)的核酸序列(SEQ ID NO：9)。图13C示出了轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，可变结构域残基为小写字母，CDR有下划线。图13D示出了编码轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：10)的核酸序列(SEQ ID NO：11)。
因此，mAb 5.948.1是包含重链的全人IgG2，所述重链包含两个糖基化位点：V结构域的框架区3(FR3)中的Asn73和典型的Fc重链糖基化位点Asn301。图14提供了示出抗体5.948.1的4种可能的聚糖占据位点变体的图。即，不包含聚糖的0-聚糖占据位点变体、在Asn301包含聚糖的1-聚糖占据位点变体、在Asn73包含聚糖的1-聚糖占据位点变体以及在Asn73和Asn301均包含聚糖的2-聚糖占据变体。因为每个抗体包含两条重链，各种排列是可能的，包含上述聚糖占据变体的每种与两条轻链的各种组合。
使表达mAb 5.948.1的细胞培养物在存在和不存在2-脱氧-D-葡萄糖的情况下生长。简单地说，将表达mAb 5.948.1的CHO细胞的克隆群体以0.3x106个细胞/mL接种入6x500mL通气摇瓶，100mL培养基每瓶。将含有细胞的摇瓶(S5、S6、S7、S9、S10、S11，参见表9)放置在非加湿摇床上，在36.5℃与5％CO2以及具有1英寸摆度的140rpm的振荡。在14天的培养中每天采样细胞计数和活力。培养的第3天开始，向所有摇瓶补料营养物(16mL/L/天)和推注的葡萄糖(2.5mL/天100g/L葡萄糖原液)。在培养的第7天和第9天将1g/L 2-脱氧-d-葡萄糖加入测试摇瓶(分别为S10和S11)，然而没有将2-脱氧-d-葡萄糖抑制剂加入对照摇瓶(S6和S7)。在培养的第7天，收获摇瓶S5和S9用于通过HPLC测定滴度和聚糖位点占据率分析。在加入2-脱氧-d-葡萄糖之前收获S9。在培养的第12天，收获摇瓶S6(没有抑制剂)和S10(有抑制剂)用于滴度测定和聚糖位点占据率分析。在培养的第14天，收获摇瓶S7(没有抑制剂)和S11(有抑制剂)用于滴度测定和聚糖位点占据率分析。
测量每个样品的蛋白质滴度，并且结果如表8所提供。蛋白质滴度随培养时间增加，并且没有2-脱氧-D-葡萄糖的培养物和包含糖基化抑制剂的培养物之间蛋白质滴度没有显著差异。因此，2-脱氧-D-葡萄糖的存在看来不影响在存在所述抑制剂的情况下生长的细胞的蛋白质表达。
表8
  样品   样品ID   2-脱氧-D-葡萄糖  滴度(mg/ml)
  S5   S5第7天   无  3.77
  S6   S6第12天   无  4.37
  S7   S7第14天   无  4.92
  S9   S9第7天   无  3.79
  S10   S10第12天   有  4.43
  S11   S11第14天   有  4.61
将添加2-脱氧-D-葡萄糖对聚糖位点占据率的影响与在不存在所述抑制剂的情况下细胞产生的mAb 5.948.1的聚糖位点占据率比较。测定每个样品的聚糖谱，并且层析谱如图16至24所示。测定每个样品中每种聚糖位点占据变体的量，并且结果如以下表9所示。
表9
Figure BPA00001481727801201
更具体地，在提供最大糖基化的条件下产生的mAb 5.948.1的对照样品的聚糖谱如图15所示。此外，该对照证实约98％2-聚糖和约2％1-聚糖，没有可检测的0-聚糖存在。有趣的是，大部分存在的1-聚糖变体(约75％)是在存在于恒定区中的Fc糖基化位点Asn301包含糖的聚糖，剩余的25％1-聚糖级分包含Asn73聚糖，其在可变区(抗原结合片段；Fab)中包含N-连接聚糖。
在第7天采集的均没有抑制剂的两个培养物样品(S5和S9)的聚糖谱与对照相似。即，在第7天，所述聚糖包含约98％2-聚糖和约2％1-聚糖，没有可检测的0-聚糖变体。此外，大部分1-聚糖形式在Fc糖基化位点(Asn301)被糖基化，剩余的1-聚糖在可变区被糖基化。
在不存在抑制剂的情况下生长的对照培养物中产生的抗体的聚糖谱证实随着时间的推移存在的2-聚糖的百分比减少，在第14天2-聚糖的百分比从约98％减少至约95.5％。此外，在Fc区中糖基化的1-聚糖的百分比从约1.2％增加至约4.1％。然而，在对照培养物中于任何时间均未检测到0-聚糖，并且在Fab中糖基化的1-聚糖的量不随时间变化。
第12天，在存在所述抑制剂的情况下生长的培养物中产生的抗体(S10)证实了聚糖谱的变换。更具体地，2-聚糖的百分比减少至约94％，并且1-聚糖的百分比显著增加，在Fab区糖基化的1-聚糖(1.6％)和在Fc区糖基化的1-聚糖(3.5％)的水平均提高。甚至更令人惊讶的是，在2-脱氧-D-葡萄糖存在的情况下生长的细胞产生可检测量(0.9％)的0-聚糖变体。2天之后，在第14天，1-聚糖和0-聚糖变体的增加甚至更戏剧性，并且2-聚糖级分的减少更明显。即，在S11中，2-聚糖变体包含所产生的抗体的约90％，并且1-聚糖变体包含2.3％在Fab区糖基化和5.2％在Fc区糖基化。没有糖基化(0-聚糖)的抗体的百分比包含所产生的抗体5.948.1的约1.7％。
这些结果证实可以利用糖基化抑制剂控制哺乳动物细胞培养物中产生的糖蛋白的糖基化。更具体地，在存在2-脱氧-D-葡萄糖的情况下于细胞培养物中产生的在重链中包含2个糖基化位点的抗体包含减少量的2-聚糖变体以及增加量的1-聚糖和0-聚糖形式。不希望被任何特定理论束缚，看来与在所述抗体的Fab区的糖基化相比，所述抗体Fc结构域中的糖基化优选发生。也不希望被任何特定理论束缚，可能在将所述抑制剂加入培养基之前产生的2-聚糖抗体继续存在于培养物中。因此，随着时间的推移存在的2-聚糖变体的相对减少与1-聚糖和最终0-聚糖变体的随之增加看来表明一旦加入所述抑制剂，如果有，仅产生非常少的额外的2-聚糖变体。还可以表明一旦加入所述抑制剂，在一些额外的1-聚糖Fc变体继续产生的同时，产生了1-聚糖Fab形式。结果还表明添加所述抑制剂介导0-聚糖非糖基化变体的产生。因此，本文所公开的数据第一次证实可以控制糖蛋白的糖基化，并且甚至更优选地，蛋白质滴度没有显著减少。结果进一步表明培养条件的额外修改，包括但不限于增加培养时间的长度，可以提供0-和1-聚糖形式的产量的进一步增加，增加至大约或大于所产生的糖蛋白的30％。
实施例5：
利用2-脱氧-D-葡萄糖减少的抗IgE抗体的糖基化：减少的聚糖位点占据率和对抗体结合与IgE结合的影响
利用标准方法评价减少的聚糖位点占据率所介导的对mAb 5.948.1的抗原结合的任何影响，例如但不限于WO 2008/123999所公开的方法(例如，利用RBL-2H3细胞的IgE细胞结合测定、脱粒抑制测定、从血清消耗游离IgE、ELISA IgE结合测定、BIAcoreTM测定等)，以及本领域众所周知用于评价抗体结合特征的其他测定。
更具体地，利用BIAcoreTM 3000仪(BIAcoreTM，Uppsala，Sweden)通过BIAcoreTM分析评价在不存在(S5、S6和S7)和存在(S9、S10、S11)2-脱氧-D-葡萄糖的情况下培养的细胞产生的mAb 5.948.1的结合特征。简单地说，利用标准EDC-NHS偶联化学和10mM乙酸钠、ph 5.0的固定缓冲液将来自各个样品的抗体共价固定在CM5传感器芯片(BIAcoreTM)上。通过EDC-NHS激活参考流动细胞并用乙醇胺封闭，但是没有蛋白质固定在其上。
利用流速50或100μL/min的HBS-EP缓冲液(10mM HEPES、150mMNaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P-20 pH 7.4，由BIAcoreTM供应)利用浓度范围约0.09-600nM的IgE(Serotec，Cat.No.PHP008X2或EuropaBioproducts，Cat.No.CP1035K)获得了动力学测量。每个浓度的注入时间为约3.25分钟，然后是20分钟的解离相。解离相之后包括利用再生溶液(10mM甘氨酸、pH 1.7)的再生步骤。利用BIA评价软件4.1(BIAcoreTM)和Scrubber软件版本2.0(BioLogic Software)本地拟合传感图(Sensorgram)。
将在不存在抑制剂的情况下产生的每个样品(S5、S6和S7)的亲和力(KD)、结合速率(ka，M-1s-1)和解离速率(kd)与在存在抑制剂的情况下产生的样品(S9、S10和S11)比较以评价减少的糖基化对mAb 5.948.1与其抗原人IgE的抗体结合的影响。
本文所述的核酸和氨基酸序列与它们的序列标识号如以下表10所列。
表10
序列
Figure BPA00001481727801221
Figure BPA00001481727801231
本文所引用的每个公开和每个专利、专利申请和出版物整体援引加入本文。
在参考具体实施方案公开本发明的同时，显然本领域的其他技术人员可以设计本发明的其他实施方案和变化而不背离本发明的真正精神和范围。所附的权利要求应当理解为包括所有这样的实施方案和相等变化。
Figure IPA00001481727300011
Figure IPA00001481727300041
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Claims (36)

1.一种用于降低蛋白质的糖基化水平的方法，所述方法包括在存在糖基化抑制量的糖基化抑制剂的情况下，在生长于培养物中的宿主细胞中表达包含至少一个糖基化位点的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下在其他方面相同的条件下生长的其他方面相同的宿主细胞中产生的其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质包含较低水平的糖基化，从而控制所述蛋白质的糖基化水平。
2.权利要求1的方法，其中所述糖基化位点在配体结合位点或抗原结合位点中。
3.权利要求2的方法，其中所述糖基化水平选自在所述糖基化位点的聚糖位点占据率和在所述糖基化位点的糖基化程度。
4.权利要求3的方法，其中所述糖基化位点选自O-连接糖基化位点和N-连接糖基化位点。
5.权利要求4的方法，其中所述糖基化位点为N-连接糖基化位点，并且进一步地，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸。
6.权利要求5的方法，其中所述糖基化抑制剂为选自以下抑制剂的至少一种：衣霉素、衣霉素同系物、链病毒菌素、杀枝孢菌素、安福霉素、津枝霉素、抗生素24010、抗生素MM 19290、杆菌肽、corynetoxin、焦土霉素、金霉素、1-脱氧甘露糖野尻霉素、脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧甘露糖野尻霉素、布雷菲德菌素A、葡萄糖类似物、甘露糖类似物、2-脱氧-D-葡萄糖、2-脱氧葡萄糖、D-(+)-甘露糖、D-(+)半乳糖、2-脱氧-2-氟-D-葡萄糖、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(DIM)、氟代葡萄糖、氟代甘露糖、UDP-2-脱氧葡萄糖、GDP-2-脱氧葡萄糖、甲羟戊二酸单酰-CoA还原酶抑制剂、25-羟基胆甾醇、羟基胆甾醇、苦马豆素、放线酮、嘌呤霉素、放线菌素D、莫能菌素、羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)、密实菌素、多萜长醇-磷酰基-2-脱氧葡萄糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、葡糖胺、甘露糖胺、栗精胺、谷氨酰胺、溴代环己烯四醇、环己烯四醇环氧化物、环己烯四醇衍生物、糖基甲基对硝基苯三氮烯、β-羟基正缬氨酸、苏型β-氟代天冬酰胺、D-(+)-葡糖酸δ-内酯、二(2-乙基己基)磷酸酯、磷酸三丁酯、十二烷基磷酸酯、(二苯甲基)-磷酸的2-二甲氨基乙酯、[2-(二苯基磷氧基)乙基]三甲基碘化铵、碘乙酸酯和氟乙酸酯。
7.权利要求6的方法，其中所述糖基化抑制剂为2-脱氧-D-葡萄糖。
8.权利要求7的方法，其中所述糖基化抑制量的范围为约0.5g/L-3g/L。
9.权利要求8的方法，所述方法还包括将所述培养物中的葡萄糖浓度维持在范围为约0.05g/L-10g/L的量。
10.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞选自酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、NS0/1、Sp2/0、人细胞、HEK 293、BHK、COS、Hep G2、PER.C6、COS-7、TM4、CV1、VERO-76、MDCK、BRL 3A、W138、MMT 060562、TR1、MRC5和FS4。
12.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述糖基化位点为包含选自天冬酰胺-异亮氨酸-苏氨酸(NIT)、天冬酰胺-甘氨酸-丝氨酸(NGS)、天冬酰胺-丝氨酸-苏氨酸(NST)和天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸(NTS)的氨基酸序列的至少一个糖基化位点。
14.根据权利要求10的方法产生的蛋白质。
15.根据权利要求13的方法产生的蛋白质。
16.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质为抗体或其抗原结合部分，并且进一步地，其中所述抗体为抗人IgE抗体。
17.权利要求16的蛋白质，其中所述抗体为人抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
18.权利要求17的蛋白质，其中与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的抗体相比，所述抗体包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点选自重链中相应于SEQ ID NO：8的氨基酸序列的天冬酰胺73(N73)处的糖基化位点和天冬酰胺301(N301)处的糖基化位点。
19.权利要求18的蛋白质，其中所述抗体包含未被占据的在天冬酰胺73处的N-连接糖基化位点。
20.权利要求15的蛋白质，其中所述蛋白质包含晚期糖基化终产物受体(RAGE)的配体结合位点(LBS)，所述配体结合位点包含选自SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
21.权利要求20的蛋白质，其中所述蛋白质为RAGE融合蛋白，其包含没有信号序列的SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述信号序列包含氨基酸残基1至23号氨基酸残基，其中所述融合蛋白缺少末端赖氨酸残基(Lys438)。
22.权利要求21的蛋白质，与在不存在所述糖基化抑制剂的情况下产生的其他方面相同的RAGE融合蛋白相比，所述RAGE融合蛋白包含至少一个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分，其中所述位点为选自在2号氨基酸残基(N2)处的天冬酰胺、在58号氨基酸残基(N58)处的天冬酰胺和在288号氨基酸残基(N288)处的天冬酰胺的至少一个位点，全部相应于没有信号序列(氨基酸1至23)的SEQID NO：1的氨基酸序列。
23.权利要求22的蛋白质，其中所述蛋白质包含至少两个以下所述的N-连接糖基化位点，所述位点未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
24.权利要求22的蛋白质，其中所述蛋白质包含三个N-连接糖基化位点，其中至少一个未被占据和/或少包含至少一个糖部分。
25.权利要求18的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与抗原的结合。
26.权利要求22的蛋白质，其中与在不存在所述抑制剂的情况下产生的所述其他方面相同的蛋白质相比，所述蛋白质表现出增加的与RAGE配体的结合。
27.权利要求11的方法，所述方法还包括从范围为约34℃-39℃的温度至范围为约28℃-33℃的温度的温度转换。
28.权利要求27的方法，所述方法包括从范围为约34℃-37℃的温度至范围为约30.5℃-31.5℃的温度的温度转换。
29.一种药物组合物，其包含权利要求14的蛋白质和药学可接受的载体。
30.一种药物组合物，其包含权利要求15的蛋白质和药学可接受的载体。
31.包含一定量的融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含连接至免疫球蛋白多肽的RAGE多肽，
a)其中所述RAGE多肽包含人RAGE(SEQ ID NO：3)的片段，其中所述人RAGE的片段包含配体结合位点和至少一个可以被糖基化的氨基酸残基，
b)其中所述免疫球蛋白多肽包含免疫球蛋白的CH2结构域或部分CH2结构域和免疫球蛋白的CH3结构域，以及
c)其中所述免疫球蛋白多肽的N端残基连接至所述RAGE多肽的C端残基；以及
其中所述融合蛋白的量的至少0.5％是非糖基化的。
32.权利要求31的组合物，其中所述融合蛋白的总量的至少30％是非糖基化的。
33.权利要求31的组合物，其中完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率少于所有非完全糖基化形式的融合蛋白量的百分率。
34.权利要求31的组合物，其中所述融合蛋白包含至少三个可以被糖基化的氨基酸残基，其中糖基化的第一潜在位点是所述RAGE配体结合位点的氨基酸残基，糖基化的第二潜在位点是所述RAGE多肽的氨基酸残基，糖基化的第三潜在位点是所述免疫球蛋白多肽的氨基酸残基。
35.一种组合物，其包含一种蛋白质，所述蛋白质包含至少一个潜在的糖基化位点，其中完全糖基化的蛋白质的量少于糖基化低于完全糖基化的蛋白质的量，并且还包含药学可接受的载体。
36.权利要求35的组合物，其中所述蛋白质包含两个潜在的糖基化位点，并且其中完全糖基化的蛋白质的量少于包含一个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的加和量与包含两个未被糖基化和/或较低水平糖基化的位点的蛋白质的量。
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