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ES2203677T3 - Uso de compuestos de tiazolio para prevenir y invertir la formacion de productos finales de glicosilacion avanzada. - Google Patents

Uso de compuestos de tiazolio para prevenir y invertir la formacion de productos finales de glicosilacion avanzada.

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Publication number
ES2203677T3
ES2203677T3 ES96903540T ES96903540T ES2203677T3 ES 2203677 T3 ES2203677 T3 ES 2203677T3 ES 96903540 T ES96903540 T ES 96903540T ES 96903540 T ES96903540 T ES 96903540T ES 2203677 T3 ES2203677 T3 ES 2203677T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
bromide
oxoethyl
thiazolium
carbon atoms
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES96903540T
Other languages
English (en)
Inventor
Anthony Cerami
Peter C. Ulrich
Dilip R. Wagle
San-Bao Hwang
Sara Vasan
John J. Egan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Synvista Therapeutics Inc
Original Assignee
Alteon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/375,155 external-priority patent/US5656261A/en
Application filed by Alteon Inc filed Critical Alteon Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2203677T3 publication Critical patent/ES2203677T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES Y METODOS PARA INHIBIR Y REVERTIR LA UNION NO ENZIMATICA (ENVEJECIMIENTO DE PROTEINAS). POR CONSIGUIENTE, SE REVELAN COMPOSICIONES QUE CONTIENEN UN AGENTE CAPAZ DE INHIBIR LA FORMACION DE PRODUCTOS FINALES DE LA GLUCOSILACION AVANZADA DE LAS PROTEINAS DIANA, Y QUE ADICIONALMENTE REVIERTEN LOS ENLACES FORMADOS PREVIAMENTE EN LOS PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA ROMPIENDO ENLACES ALFA-DICARBONILICOS DE LA PROTEINA QUE ESTAN PRESENTES EN LOS PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA. CIERTOS AGENTES UTILES SON LAS SALES DE TIAZOLIO. EL METODO CONSISTE EN PONER EN CONTACTO LA PROTEINA DIANA CON LA COMPOSICION. SE PREVEN APLICACIONES INDUSTRIALES Y TERAPEUTICAS PARA ESTA INVENCION, YA QUE SE PUEDEN TRATAR EL DETERIORO DE LOS ALIMENTOS Y EL ENVEJECIMIENTO DE LAS PROTEINAS ANIMALES. TAMBIEN SE REVELA UN NUEVO METODO DE INMUNOENSAYO PARA DETECTAR LA REVERSION DE LA UNION NO ENZIMATICA.

Description

Uso de compuestos de tiazolio para prevenir e invertir la formación de productos finales de glicosilación avanzada.
La presente invención de refiere generalmente al envejecimiento de las proteínas que resultan de su reacción con glucosa y otros azúcares reductores, y más particularmente a la inhibición de la reacción de proteínas glicosiladas no enzimáticamente y la destrucción de la reticulación formada posteriormente a la formación de productos finales de glicosilación avanzada (glicación).
La reacción entre glucosa y proteínas se ha conocido hace bastante tiempo. Su manifestación más temprana fue en la aparición de pigmentos pardos durante el cocinado de alimentos, que identificó Maillard en 1912, quien observó que la glucosa u otros azúcares reductores reaccionan con aminoácidos para formar aductos que experimentan una serie de deshidrataciones y redistribuciones para formar pigmentos marrones estables. Los estudios posteriores han sugerido que los alimentos almacenados y tratados por calor experimentan un pardeamineto no enzimático como resultado de la reacción entre la glucosa y la cadena de polipéptidos, y como resultado las proteínas se reticulan y correspondientemente muestran una biodisponibilidad disminuida.
Esta reacción entre azúcares reductores y proteínas de alimentos se encontró que tenía su paralelo in vivo. De este modo, la reacción no enzimática entre glucosa y los grupos amino libres en proteínas para formar un aducto estable de 1-desoxicetosilo, conocido como el producto Amadori, se ha demostrado que se produce con hemoglobina, en el que una redistribución del terminal amino de la cadena beta de hemoglobina mediante la reacción con glucosa, forma el aducto conocido como hemoglobina A1c. También se encontró que la reacción se produce con una diversidad de otras proteínas del cuerpo, tales como cristalinos lenticulares, colágeno y proteínas nerviosas. Véase Bucala y col., "Advenced Glycosylation; Chemistry, Biology, and Implications for Diabetes and Aging" in Advances in Pharmacology, Vol. 23, pp. 1 - 34, Academic Press (1992).
Además, los pigmentos pardos con propiedades espectrales y fluorescentes similares a las de los productos de Maillard de fase tardía se han observado también in vivo en asociación con varias proteínas de larga vida, tales como proteínas lenticulares y colágenos de individuos ancianos. Un incremento lineal en pigmento relacionado con la edad se observó en colágeno dural humano entre las edades de 20 y 90 años. Interesantemente, el envejecimiento del colágeno se puede imitar in vitro mediante la reticulación inducida por glucosa; y también la captura de otras proteínas y la formación de aductos por colágeno, también indicada, se teoriza que se produce por una reacción de reticulación y se cree que es responsable de la acumulación observada de albúmina y anticuerpos en la membrana basal del riñón.
En la patente de Estados Unidos 4.758.583, se describen un procedimiento y agentes asociados que servían para inhibir la formación de productos finales de glicosilación avanzada mediante la reacción con un producto de glicosilación temprana que resulta de la reacción original entre la proteína diana y glucosa. Por consiguiente, se postula que la inhibición que tiene lugar como la reacción entre el inhibidor y el producto de glicosilación temprana parecía interrumpir la reacción posterior de la proteína glicosilada con material proteico adicional para formar el producto de fase tardía reticulado. Uno de los agentes identificados como inhibidor era la aminoguanidina y los resultados de ensayos posteriores han apoyado su eficacia en este asunto.
Aunque el éxito que se ha logrado con aminoguanidina y compuestos similares es prometedor, continúa existiendo una necesidad para identificar y desarrollar inhibidores adicionales que amplíen la disponibilidad y quizás el alcance de esta actividad potencial y su utilidad diagnóstica y terapéutica. Existe una necesidad adicional para encontrar agentes que no solamente inhiban esta reacción y sus consecuencias, sino agentes capaces de destruir las reticulaciones formadas como resultado de productos finales de glicosilación avanzada preexistentes, invirtiendo por lo tanto los efectos resultantes de los mismos.
Resumen de la invención
De acuerdo con la presente invención se describen los compuestos, el uso de compuestos y las composiciones para la inhibición de la formación de glicosilación avanzada de proteínas (envejecimiento de proteínas) y para destruir las reticulaciones que se forman entre los productos finales de glicosilación avanzada (glicación) (abreviadamente AGE) o entre los AGE y otras proteínas. Los productos finales de glicosilación avanzada (glicación) y reticulación ocasionados por otros azúcares reactivos presentes in vivo o en productos alimenticios, incluyendo ribosa, galactosa y fructosa también se evitarían e invertirían mediante los compuestos, el uso de compuestos y las composiciones de la presente invención. En particular, las composiciones comprenden compuestos para inhibir la formación e invertir los productos finales de glicosilación avanzada (glicación) preformados y destruir las reticulaciones posteriores. Aunque sin querer estar sujeto a las limitaciones de ninguna teoría, se cree que la destrucción de los productos finales de glicosilación avanzada (glicación) preformados y reticulaciones es resultado de la escisión de las reticulaciones de las proteínas a base de \alpha dicarbonilo presentes en los productos finales de glicosilación avanzada. De este modo la invención se refiere a compuestos que, por su capacidad para efectuar dicha escisión, se puede utilizar para destruir los productos finales de glicosilación avanzada preformados y reticulación, y, por lo tanto, los efectos deletéreos resultantes de los mismos, tanto in vitro como in vivo.
Ciertos compuestos útiles en la presente invención son miembros de la clase de los compuestos conocidos como tiazolios.
Los compuestos de tiazolio tienen la siguiente fórmula estructural:
1
como se define en la reivindicación 1.
Los compuestos y sus composiciones utilizados en esta invención parece que reaccionan con un producto de glicosilación temprana con lo cual previenen al mismo de la formación posterior de los productos finales de glicosilación avanzada que conducen a reticulaciones y, por lo tanto, al envejecimiento molecular o de las proteínas y otras consecuencias moleculares adversas. Adicionalmente, reaccionan con productos finales de glicosilación avanzada ya formados para reducir la cantidad de dichos productos.
La presente invención proporciona compuestos que se pueden utilizar para inhibir el envejecimiento de las proteínas y otras consecuencias moleculares adversas poniendo en contacto las moléculas glicosiladas inicialmente en la fase del producto de glicosilación temprana con una cantidad de uno o más de los agentes de la presente invención, o una composición que contiene los mismos, y a un procedimiento para destruir los productos finales de glicosilación avanzada ya formados para reducir la cantidad de dichos productos mediante la escisión de las reticulaciones a base de \alpha carbonilo presentes en los productos finales de glicosilación avanzada. Uno o mas de los agentes se pueden aplicar a los productos en cuestión, por ejemplo, bien mediante la introducción en una mezcla del mismo en el caso de un extracto proteico, o mediante la aplicación o introducción en los productos alimenticios susceptibles a glicación avanzada y reticulación, para evitar el envejecimiento prematuro y el deterioro de los productos alimenticios particulares, y para invertir los efectos de los productos finales de glicosilación avanzada ya formados.
La capacidad para inhibir la formación de productos finales de glicosilación avanzada y para invertir los productos finales de glicosilación avanzada ya formados en el cuerpo lleva consigo implicaciones significativas en todas las aplicaciones donde la glicación avanzada y reticulación molecular concomitante es un detrimento grave. De este modo, en el área de la tecnología de alimentos, por ejemplo, el retraso de la degradación de los alimentos conferiría un obvio beneficio económico y social haciendo ciertos alimentos de estabilidad marginal menos perecederos y por lo tanto más disponibles para los consumidores. La degradación se reduciría así como el gasto de inspección, eliminación y sustitución, y la disponibilidad ampliada de los alimentos podría ayudar para estabilizar su precio en el mercado. De manera similar, en otras aplicaciones industriales donde la perecibilidad de las proteínas es un problema, la mezcla de los agentes de la presente invención en composiciones que contienen dichas proteínas facilitaría la ampliación de la vida útil de las mismas. Los conservantes y preventivos de decoloración actualmente utilizados tales como dióxido de azufre, conocidos porque ocasionan toxicidad que incluyen alergia y asma en animales, se pueden reemplazar con compuestos tales como los descritos en esta memoria descriptiva.
El procedimiento de Maillard afecta extremadamente a diversos conjuntos de las masas proteicas significativas en el cuerpo, entre ellas colágeno, elastina, proteínas lenticulares y membranas basales glomerulares del riñón. Estas proteínas se deterioran tanto con la edad como (de aquí la aplicación de la expresión "envejecimiento proteico") como consecuencia de diabetes. Por consiguiente, la capacidad para retrasar o inhibir sustancialmente la formación de productos finales de glicosilación avanzada y reducir la cantidad de reticulaciones formadas entre productos finales de glicosilación avanzada y otras proteínas en el cuerpo lleva la promesa para tratamiento de complicaciones de diabetes y envejecimiento por ejemplo, y por lo tanto mejorando la calidad y, quizás, la duración de la vida del animal o del ser humano.
Los presentes agentes son también útiles en el área de la apariencia e higiene personal, así como evitan e invierten la tinción de los dientes mediante agentes catiónicos antimicrobianos con propiedades antiplaca, tal como clorhexidina.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición tópica como se define en la reivindicación 10.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar una composición tópica como se define en las reivindicaciones 13 y 14.
Otros objetos y ventajas serán aparentes a los expertos en la técnica a partir de una consideración de la descripción siguiente que procede de acuerdo a los siguientes dibujos ilustrativos.
\newpage
Breve descripción de las figuras de los dibujos
La figura 1 es un gel de SDS - PAGE que muestra los mapas de péptido CNBrr de colágeno del tendón de la cola (abreviadamente CTC) de ratas normales y diabéticas después de la incubación con bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio (denominado ALT - 766) de la presente invención.
La figura 2 es un gel de SDS - PAGE que muestra la evidencia física para la destrucción de AGE - BSA reticulados mediante bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio, un compuesto de la presente invención.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
De acuerdo con la presente invención, se han desarrollado los compuestos, composiciones incluyendo composiciones farmacéuticas que contienen dichos compuestos y procedimientos asociados, los cuales se creen que inhiben la formación de productos finales de glicosilación avanzada en numerosas moléculas diana, incluyendo particularmente proteínas, que existen tanto en material animal como vegetal, e invierten los productos finales de glicosilación avanzada ya formados. En particular la invención se refiere al uso de compuestos que tienen la capacidad de efectuar escisión de reticulaciones moleculares a base de \alpha carbonilo presentes en los productos finales de glicosilación avanzada y que tienen la fórmula estructural:
2
como se define en la reivindicación 1.
Los grupos alquilo inferior referidos anteriormente contienen 1 - 6 átomos de carbono e incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y los correspondientes isómeros de cadena ramificada de los mismos. Los grupos alquinilo inferior contienen entre 2 y 6 átomos de carbono. De manera similar, los grupos alcoxi inferior contienen entre 1 y 6 átomos de carbono, e incluyen metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentoxi y hexoxi y los correspondientes isómeros de cadena ramificada de los mismos. Estos grupos están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos halo, hidroxi, amino, o alquilamino inferior.
Los grupos aciloxi (inferior) alquilo inferior comprendidos en la fórmula anterior incluyen aquellos en los que la parte aciloxi contiene entre 2 y 6 átomos de carbono y la parte alquilo inferior contiene entre 1 y 6 átomos de carbono. Las partes aciloxi típicas son aquellas tales como acetoxi o etanoiloxi, propanoiloxi, butanoiloxi, pentanoiloxi, hexanoiloxi y los correspondientes isómeros de cadena ramificada de los mismos. Las partes alquilo inferior típicas son las descritas en esta memoria descriptiva anteriormente.
Los grupos arilo comprendidos en la fórmula anterior son aquellos que contienen 6 - 10 átomos de carbono, tales como naftilo, fenilo y fenilo alquilo inferior sustituido, por ejemplo, tolilo y xililo, y están opcionalmente sustituidos con 1 - 2 grupos halo, hidroxi, alcoxi inferior o di alquil(inferior)amino. Los grupos arilo preferidos son grupos fenilo, metoxifenilo y 4-bromofenilo.
Los átomos halo en la fórmula anterior pueden ser fluoro, cloro, bromo o yodo.
Para los propósitos de esta invención, los compuestos de fórmula (I) están en forma de sales biológica y farmacéuticamente aceptables. Las formas de sal útiles son haluros, particularmente las sales bromuro y cloruro, tosilato, metanosulfonato y mesitilensulfonato. Se pueden formar otras sales relativas usando de manera similar aniones no tóxicos y bilógica y farmacéuticamente aceptables.
De los compuestos comprendidos en la fórmula I, se prefieren ciertos sustituyentes. Por ejemplo, se prefieren los compuestos en los que R_{1} o R_{2} son grupos alquilo inferior. También altamente preferidos son los compuestos en los que Y es un grupo amino, un grupo 2-amino-2-oxoetilo, un grupo 2-fenil-2-oxoetilo o 2-[fenil sustituido]-2-oxoetilo.
Los compuestos representativos de la presente invención son:
Mesitilensulfonato de 3-aminotiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4,5-dimetilaminotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diaminotiazolinio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2-hidroxietil) tiazolio;
yoduro de 3,4-dimetil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-etil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
cloruro de 3-bencil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 3-(carboximetil)benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-(diamino)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
cloruro de 3-(2-metil-2-oxoetil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(2',4'-dimetoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-fluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(2',4'-difluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-propargiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4-metiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-5-metiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4,5-dimetiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolinio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-clorobenzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metiltiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-viniltiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-6-clorobenzotiazolio;
diclorhidrato de 2,6-diaminobenzotiazol;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(3'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-fluorofenil-2-oxoetil]benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 3-acetamido-4-metil-5-tiazolil-etilacetato;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(2'-naftil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diclorofenetilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-dibutilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-[2-4'-carbetoxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'- hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diisopropilanilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-[2-(2',6'-diclorobenciloxi) etil]tioazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-carbmetoxi-3'-hidroxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4,5-dimetiltiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metil-5-hidroxietiltiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-(3',4'-trimetilendioxifenil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(1',4'-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-[1',4-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4,5- dimetiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolinio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-viniltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-viniltiazolio;
bromuro de 3-(2-terc-butil-2-oxoetil)tiazolio
bromuro de 3-(2-terc-butil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
cloruro de 3-(3'-metoxibencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
cloruro de 3-(2',6'-diclorobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2'-nitrobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
Ciertos compuestos representados en la fórmula I son compuestos nuevos que representan una realización adicional de la presente invención. Estos compuestos son como se definen en las reivindicaciones 13 y 14.
Los compuestos anteriores son capaces de inhibir la formación de productos finales de glicosilación avanzada sobre moléculas diana, incluyendo, por ejemplo, proteínas, así como son capaces de destruir o invertir los productos finales de glicosilación avanzada ya formados en dichas proteínas. La reticulación de proteína mediante la formación de productos finales de glicosilación avanzada contribuye al atrapamiento de otras proteínas y da como resultado el desarrollo in vivo de estados tales como elasticidad reducida y arrugamiento de la piel, ciertas enfermedades renales, aterosclerosis, osteoartritis y similares. De manera similar, el material vegetal que experimenta pardeamiento no enzimático deteriora y, en el caso de productos alimenticios, se llegan a deteriorar o endurecer y, consecuentemente, se hacen incomestibles, impalatables o no nutritivos. De este modo, los compuestos empleados de acuerdo con esta invención inhiben este efecto de Maillard de última fase e intervienen en los cambios deletéreos descritos anteriormente, y reducen el nivel de productos finales de glicosilación avanzada ya presentes en el material proteico.
La razón fundamental de la presente invención es usar agentes que bloqueen, así como inviertan, la etapa posterior de glicosilación, por ejemplo, la formación de cromóforos fluorescentes y reticulaciones, la presencia de las cuales se asocia con, y conduce a secuelas adversas de diabetes y envejecimiento. Un agente ideal evitaría la formación de dichos cromóforos y reticulaciones entre cadenas de proteínas y atrapamiento de proteínas en otras proteínas, tal como se produce en las arterias y en el riñón, e invierten el nivel de dicha formación de reticulaciones ya presentes.
La naturaleza química de los productos de glicosilación temprana con los que los compuestos de la presente invención se cree que reaccionan puede variar, y por consiguiente la expresión "producto (s) de glicosilación temprana" como se usa en esta memoria descriptiva tiene la intención de incluir cualquier y todas estas variaciones dentro de su alcance. Por ejemplo, se han postulado los productos de glicosilación temprana con restos carbonilo que están implicados en la formación de productos finales de glicosilación avanzada, y que se pueden bloquear mediante la reacción con los compuestos de la presente invención. En una realización, se supone que el producto de glicosilación temprana puede comprender los restos de carbonilo reactivos de productos Amadori o su condensación adicional, deshidratación y/o productos de redistribución, que se pueden condensar para formar productos finales de glicosilación avanzada. En otro escenario, los compuestos de carbonilo reactivos, que contienen uno o más restos carbonilo (tales como glicolaldehído, gliceraldehído o 3-desoxiglicosona) se pueden formar a partir de la escisión de productos Amadori u otros productos finales de glicosilación avanzada y mediante reacciones posteriores con una amina o producto Amadori, se pueden formar productos finales de glicosilación avanzada que contienen carbonilo tales como alquilformilglicosilpirroles.
Varios investigadores han estudiado el mecanismo de formación de producto de glicosilación avanzada. Los estudios in vitro de Eble y col., (1983), "Nonenzymatic Glucosylation and Glucose-dependent Cross-linking of Protein", J. Biol. Chem., 258: 9406 - 9412, concerniente a la reticulación de proteína glicosilada con proteína no glicosilada en ausencia de glucosa. Eble y col., pretendieron dilucidar el mecanismo de la reacción de Maillard y por consiguiente llevaron a cabo glicosilación inicial controlada de RNasa como un sistema modelo, que después se examinaba en condiciones variables. En un aspecto, el material proteico glicosilado se aisló y se situó en un ambiente exento de glucosa y por consiguiente se observó para determinar el grado de la reticulación.
Por consiguiente Eble y col., observaron que la reticulación continuaba produciéndose no solamente con la proteína glicosilada sino también con la no glicosilada. Una de las observaciones destacadas por Eble y col., era que la reacción entre la proteína glicosilada y el material proteico parecía producirse en el lugar de la cadena lateral de aminoácidos de la proteína. La experimentación confirmatoria llevada a cabo por Eble y col., a este respecto demostraba que la lisina libre competiría con la lisina en la RNasa para la unión de la proteína glicosilada. De este modo, se podría inferir de estos datos que la lisina puede servir como inhibidor de glicosilación avanzada; sin embargo, esta conclusión y las observaciones fundamentales que conducen a ello se deberían tomar en el contexto relativamente limitado del sistema modelo preparado y examinado por Eble y col.,. Claramente Eble y col., no aprecian, ni hay una sugerencia en ese respecto, de los descubrimientos que subyacen de la presente invención, con relación a la inhibición de glicosilación avanzada de proteínas tanto in vitro como in vivo.
Los experimentos de Eble y col., no sugieren el mecanismo de producción de desdoblamiento reactivo o ningún otro mecanismo en la formación in vivo de los productos finales de glicosilación avanzada en los que ya está presente la glucosa. De hecho, otros investigadores soportan este mecanismo para explicar la formación de productos finales de glicosilación avanzada in vivo (véase, por ejemplo, Hayase y col., J. Biol. Chem., 263: 3758 - 3764 (1989); Sell y Monier, J. Biol. Chem., 264: 21597 - 21602 (1989); Oimomi y col., Agric. Biol. Chem., 53 (6): 1727 - 1728 (1989); y Diabetes Research and Clinical Practise, 6: 311 - 313 (1989). Por consiguiente, el uso de lisina como un inhibidor en el sistema del modelo de Eble y col., no tiene sentido tras la utilidad de los compuestos de la presente invención en la inhibición de productos finales de glicosilación avanzada en presencia de glucosa in vivo, y la mejora de complicaciones de diabetes y envejecimiento.
Aunque no se desea estar sujeto a las limitaciones de ninguna teoría particular como al mecanismo mediante el que los compuestos de la presente invención invierten los productos finales de glicosilación avanzada ya formados, los estudios se han estructurado para dilucidar un posible mecanismo. Los estudios anteriores que examinan el destino del producto Amadori (abreviadamente AP) in vivo han identificado una vía similar que podría conducir a la formación de reticulaciones covalentes de las proteínas derivadas de glucosa. Esta ruta procede de la deshidratación del AP mediante sucesivas eliminaciones beta como se muestra en el esquema A más adelante. De este modo, la pérdida del 4-hidroxilo del AP (1) proporciona un 1,4-didesoxi-1-alquilamino-2,3-hexodiulosa (abreviadamente AP-diona) (2). Una AP-diona con la estructura de una amino-1,4-didesoxiosona se ha aislado mediante el atrapamiento de los AP de modelo con la aminoguanidiina del inhibidor de AGE. La eliminación posterior del 5-hidroxilo proporciona un 1,4,5-tridesoxi-1-alquilamino-2,3-hexulos-4-eno (abreviadamente AP-eno-diona) (3), que se ha aislado como un derivado de triacetilo de su forma 1,2-enol. Las Amadoridionas, particularmente la AP-eno-diona, se esperaría que sean altamente reactivas hacia las reacciones de reticulación de proteínas sirviendo como dianas para la adición de nucleófilos a base de la amina (Lys, His)- o sulfidrilo (Cys)- que existen en proteínas, produciendo por lo tanto reticulaciones estables de la forma (4).
3
Hay que destacar que la AP-eno-diona lineal de (3) y la reticulación estable de (4) se puede cliclizar para formar anillos lactol de 5- ó 6- miembros, aunque solamente la variante cíclica de 6 miembros se muestra en el esquema A expuesto anteriormente.
La posibilidad de que una ruta principal de formación de reticulación derivada de glucosa se obtenga a través de un intermedio de AP-eno-dieno se investigó mediante experimentos diseñados para ensayar la existencia de esta ruta in vivo así como efectuar el desdoblamiento específico de las reticulaciones proteicas a base de \alpha carbonilo. De este modo se cree que los compuestos de tiazolio de la presente invención actúan como nucleófilos "bidentados" nuevos, particularmente diseñado para efectuar una reacción de destrucción de carbono - carbono entre los dos carbonilos de la reticulación, como se muestra en el esquema B más adelante en condiciones fisiológicas. Este esquema muestra la reacción de un agente de escisión de \alpha - diona prototípico de fórmula I, bromuro de N-fenactiltiazolio, con una reticulación derivada de AP-eno-diona.
4
Un experimento adicional para dilucidar esta reacción implica la reacción de un compuesto de fórmula I, bromuro de N-fenactiltiazolio con 1-fenil-1,2-propanodiona para producir el producto de fisión predicho, ácido benzoico. La relación entre bromuro de N-fenactiltiazolio y 1-fenil-1,2-propanodiona era rápida y se producía rápidamente, confirmando este posible mecanismo.
Anteriormente, los productos de adición derivados de glucosa a partir de las proteínas se transforman en proteínas, pueden seguir reacciones adicionales para efectuar una reacción de reticulación covalente, proteína - proteína. Con relación a esto, un compuesto de fórmula I, bromuro de N-fenactiltiazolio, se dejó reaccionar con reliculaciones AGE que se forman cuando BSA modificado con AGE (abreviadamente AGE - BSA) se deja reaccionar con colágeno no modificado, nativo. Esto daba como resultado una liberación dependiente de concentración de BSA a partir de los complejos preformados mediados por AGE. De nuevo, este estudio confirmaba que una parte significativa de las reticulaciones AGE que se forman en condiciones experimentales consisten en una estructura de \alpha-dicetona o relativa que es susceptible de desdoblarse mediante las moléculas ventajosas de tipo bidentado de los compuestos de fórmula I en condiciones fisiológicas.
Para confirmar que se produce la misma situación in vivo, colágeno aislado de tendones de cola de ratas que habían sido diabéticas durante 32 semanas se trataron con un compuesto de fórmula I, bromuro de N-fenaciltiazolio, antes de la digestión con bromuro de cianógeno y análisis de electroforesis en gel. La electroforesis posterior revelaba que el colágeno tratado era indistinguible del colágeno no tratado, no diabético (control), en marcado contraste con el colágeno modificado con AGE, altamente reticulado, resistente a la digestión que típicamente se aísla de animales diabéticos.
Igualmente la presente invención se refiere a la inhibición de la formación de productos finales de glicosilación avanzada e inversión del nivel de los productos finales de glicosilación avanzadaza ya formados, que comprende la puesta en contacto de las moléculas diana con una composición de la presente invención. En el caso en que las proteínas diana estén contenidas en productos alimenticios, tanto de origen vegetal como animal, a estos productos alimenticios se podrían aplicar mediante diversos medios convencionales una composición que contenga los presentes agentes.
En la industria alimentaria, hace años se encontró que los sulfitos inhibían la reacción de Maillard y se usan comúnmente en los alimentos elaborados y almacenados. Sin embargo, recientemente, se ha implicado a los sulfitos en reacciones graves e incluso fatales en asmáticos. Como consecuencia, se ha prohibido el tratamiento de frutos y hortalizas frescas con sulfitos. No se conoce el mecanismo de la reacción alérgica. Por consiguiente, de esta manera, las presentes composiciones y agentes ofrecen una alternativa no tóxica a los sulfitos en el tratamiento de alimentos.
Como es evidente de una descripción del ámbito de la presente invención, los compuestos y composiciones presentes mantenían la promesa de detener e invertir en algún grado el envejecimiento de las proteínas clave tanto en animales como en plantas, y simultáneamente conferir beneficios tanto económicos como médicos como resultado de los mismos. En el caso de productos alimenticios, la administración de la presente composición mantiene el compromiso de retardar el deterioro de alimentos haciendo por lo tanto que los productos alimenticios incrementen su vida de almacenamiento mayor disponibilidad a los consumidores. La sustitución de conservantes actualmente usados, tales como dióxido de azufre que se sabe que ocasionan alergias y asma en seres humanos, con compuestos biocompatibles no tóxicos es una ventaja adicional de la presente invención.
Las implicaciones terapéuticas de la presente invención se refieren a la detención y en algún grado la inversión del proceso de envejecimiento que, como se ha indicado anteriormente, se ha identificado y ejemplificado en el envejecimiento de proteínas clave mediante glicosilación avanzada y reticulación. De este modo, las proteínas corporales y las proteínas estructurales corporales, tales como colágeno, elastina, proteínas lenticulares, proteínas nerviosas, membranas basales glomerulares renales y otros componentes de la matriz extravascular se beneficiarían totalmente en su longevidad y operación a partir de la práctica de la presente invención. De este modo la presente invención reduce la incidencia de patologías que implican el atrapamiento de proteínas mediante proteínas diana reticuladas, tales como retinopatía, cataratas, enfermedad diabética renal, glomeruloesclerosis, enfermedad vascular periférica, arteriosclerosis obliterante, neuropatía periférica, apoplejía, hipertensión, aterosclerosis, osteoartritis, rigidez periarticular, pérdida de elasticidad y arrugamiento de la piel, entumecimiento de las articulaciones, glomerulonefritis, etc. Igualmente, todas estas afecciones son evidentes y tienden a producirse a una velocidad acelerada en pacientes aquejados de diabetes melitus como consecuencia de esta hiperglucemia. De este modo, el presente procedimiento terapéutico es relevante para el tratamiento de estas y afecciones relativas bien en pacientes de avanzada edad o en los que sufren una de las patologías mencionadas.
La reticulación molecular a través de la formación de productos de glicosilación avanzada puede disminuir la solubilidad de las proteínas estructurales tales como colágeno en paredes de vesículas y también pueden atrapar proteínas del suero, tales como lipoproteínas al colágeno. También, esto puede dar como resultado incremento en la permeabilidad del endotelio y consecuentemente atrapamiento covalente de proteínas plasmáticas trasvasadas en la matriz subendotelial y reducción de la susceptibilidad tanto de las proteínas plasmáticas como de la matriz para la degradación fisiológica mediante enzimas. Por estas razones, la progresiva oclusión de vesículas de diabéticos inducida por hiperglucemia crónica se ha planteado la hipótesis de que se producen de la formación excesiva de derivados de azúcares y particularmente reticulaciones derivadas de glucosa. Dichos cambios microvasculares y oclusión microvascular de diabéticos se pueden evitar e invertir eficazmente mediante la inhibición química e inversión de la formación de los productos de glicosilación avanzada utilizando una composición y los procedimientos de la presente invención.
Los estudios indican que el desarrollo del daño diabético crónico en órganos diana está principalmente unido a hiperglucemia de manera que un control metabólico estrecho retrasaría e incluso evitaría el daño final del órgano. Véase Nicholls y col., Lab. Invest. 60, Nº 4, p. 486 (1989), que describe los efectos de trasplante singénico de islotes y de la aminoguanidina en neuropatía diabética de tipo murino. Estos estudios además evidencian que la aminoguanidina disminuye la reticulación de las proteínas de la pared aórtica en ratas diabéticas y confirman estudios anteriores de Brownlee y col., Science, 232: 1629 - 1632 (1986) sobre este órgano diana adicional de complicación de diabetes. También, un estudio adicional, mostró la reducción de atrapamiento de inmunoglobulina en el riñón mediante aminoguanidina (Brownlee y col., Diabetes, 35 (1): 42A (1986)).
Una evidencia adicional en el modelo de rata diabética inducida por estreptozotocina en el que la administración de aminoguanidina interviene en el desarrollo de neuropatía diabética se presentó en el documento de Brownlee y col., 1988, anteriormente, con relación a los cambios morfológicos en el riñón que son identificativos de la enfermedad renal diabética. Esto investigadores describían que el aumento del espesor de la membrana basal, una característica principal de anormalidad estructural de enfermedad renal diabética, se evitaba con aminoguanidina.
Tomado en conjunto, estos datos sugieren fuertemente que la inhibición e inversión de la formación de los productos finales de glicosilación avanzada (abreviadamente AGE), mediante la enseñanza de la presente invención, puede prevenir, así como invertir en algún grado las lesiones estructurales recientes, así como las anteriores, debidas a diabetes, así como cambios durante en envejecimiento ocasionado por la formación de los AGE.
Los cambios inducidos por diabetes en la deformabilidad de glóbulos rojos, que llevan a una mayor rigidez de las membranas celulares, en otra manifestación de reticulación y aminoguanidina se ha mostrado que lo previene in vivo. En dichos estudios, se usan conejos blancos de Nueva Zelanda, con diabetes inducida a largo plazo para estudiar los efectos de un compuesto de ensayo en la deformabilidad (abreviadamente df) de los glóbulos rojos (abreviadamente RBC). El compuesto de ensayo se administra en una cantidad de 100 mg/kg mediante sonda oral a conejos diabéticos.
Una consecuencia adicional de la diabetes es la diferenciación de la matriz ósea inducida por hiperglucemia que da como resultado un descenso de la formación ósea usualmente asociada con diabetes crónica. En los modelos animales, la diabetes reduce la diferenciación ósea inducida por la matriz en un 70%.
En el caso en que las composiciones de la presente invención se utilizan para propósitos in vivo o terapéuticos, se puede destacar que los compuestos o agentes usados en esta memoria descriptiva son biocompatibles. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar con una cantidad terapéuticamente eficaz de agentes o compuestos de la presente invención y pueden incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, seleccionado entre materiales conocidos utilizados para este propósito. Dichas composiciones se pueden preparar en una diversidad de formas, dependiendo del procedimiento de administración. También, se pueden utilizar sales de adición de los compuestos de fórmula I farmacéuticamente aceptables.
Se utilizaría una forma líquida en el caso en que la administración sea por inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. Cuando es apropiado, las formas de dosificación sólidas tales como comprimidos, cápsulas o formulaciones de dosificación líquidas tales como soluciones y suspensiones, etc., se pueden preparar para administración oral. Para aplicación tópica o dérmica a la piel u ojo, se puede formular una solución, una loción o ungüento con un agente en un vehículo adecuado tal como agua, etanol, propilenglicol, incluyendo quizás un vehículo para ayudar en la penetración de la piel o del ojo. Por ejemplo, una preparación tópica podría incluir hasta aproximadamente 10% del compuesto de fórmula I. También se contemplan otras formas adecuadas para la administración a otros tejidos corporales
En el caso en que el procedimiento presente tenga aplicación terapéutica, al huésped animal propuesto para tratamiento se le puede administrar una cantidad de uno o más de los agentes, en una forma farmacéutica adecuada. La administración se puede realizar mediante técnicas conocidas, tales como técnicas orales, tópicas y parenterales, tales como inyección intradérmica, subcutánea, intravenosa o intraperitoneal, así como mediante otros medios convencionales. La administración de los agentes puede tener lugar durante un amplio período de tiempo a un nivel de dosificación de, por ejemplo, hasta 30 mg/kg.
Como se ha indicado anteriormente, la invención también se extiende a un procedimiento para inhibir e invertir la decoloración de los dientes que resulta del pardeamiento no enzimático en la cavidad oral que comprende la administración a un sujeto en necesidad de dicha terapia de una cantidad eficaz, para inhibir e invertir la formación de los productos finales de glicosilación avanzada, de una composición que comprende un agente de fórmula estructural I.
La reacción de pardeamiento no enzimática que se produce en la cavidad oral da como resultado la decoloración de los dientes. Los agentes antiplaca actualmente usados aceleran esta reacción de pardeamiento y posteriormente la coloración de los dientes. Recientemente, se han formulado una clase de agentes antimicrobianos catiónicos con notables propiedades antiplaca en enjuagues orales para uso regular con el fin de destruir las bacterias en la boca. Estos agentes, los antisépticos catiónicos, incluyen agentes tales como alexidina, cloruro de cetilpiridinio, gluconato de clorhexidina, hexetidina y cloruro de benzalconio.
La coloración de los dientes mediante clorhexidina y otros agentes antiplaca aparentemente se produce como resultado de las reacciones de Maillard. Nordbo, J. Dent. Res., 58: 1429 (1979) describió que la clorhexidina y el cloruro de benzalconio catalizan las reacciones de pardeamiento in vitro. La clorhexidina añadida a mezclas que contienen un derivado de azúcar y una fuente de grupos amino experimentaba un incremento en la formación de color, atribuido a la reacción de Maillard. También se sabe que el uso de clorhexidina da como resultado un incremento en la película dental. Nordbo propuso que la clorhexidina daba como resultado la coloración de los dientes en dos etapas: primero, incrementando la formación de la película que contiene más grupos amino y en segundo lugar, mediante catálisis de la reacción de Maillard que conduce a productos coloreados.
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De acuerdo con este procedimiento, los compuestos de fórmula I se formulan en composiciones adaptadas para uso en la cavidad oral. Particularmente las formulaciones adecuadas son enjuagues orales y pastas de dientes que incorporan el ingrediente activo.
En la práctica de esta invención, se utilizan técnicas de formulación convenientes con vehículos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables típicamente utilizados en las cantidades y combinaciones que se conocen bien para la formulación de dichos enjuagues orales y pastas de dientes.
El agente de fórmula I se formula en las composiciones en una cantidad eficaz para inhibir e invertir la formación de productos finales de glicosilación avanzada. Esta cantidad, naturalmente, variará con el agente particular que se utiliza y la forma de dosis particular, pero típicamente estará en el intervalo entre 0,01% y 1% en peso de la formulación particular.
Los compuestos incluidos en la fórmula I se preparan convenientemente mediante síntesis química bien conocida en la técnica. Ciertos compuestos incluidos en la fórmula I son compuestos bien conocidos fácilmente disponibles de las casas de suministros químicos y/o se pueden preparan mediante procedimientos de síntesis publicados específicamente para eso. Por ejemplo, yoduro de 3,4-dimetil-5-(2-hidroxietil)tiazolio; bromuro de 3-etil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio; cloruro de 3-bencil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio; y bromuro de 3-(carboximetil)benzotiazolio se pueden obtener de Aldrich Chem. Co.
Los compuestos descritos en la bibliografía química y de patentes o que directamente se pueden preparar mediante procedimientos descritos en esta memoria descriptiva e incluidos en la fórmula I son aquellos tales como bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metiltiazolio y cloruro de 3-bencil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio [Potts y col., J. Org. Chem., 41: 187 - 191 (1976)].
Ciertos compuestos de fórmula (I) son compuestos nuevos no conocidos hasta ahora en la técnica. Estos compuestos son los representados por la fórmula Ia
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en la que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxialquilo (inferior), acetoxialquilo (inferior), alquilo inferior, alquenilo inferior, o R^{1} y R^{2} juntos con sus carbonos del anillo pueden ser un anillo aromático condensado, sustituido opcionalmente con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi;
Z es hidrógeno o un grupo amino;
Y es amino, un grupo de fórmula
-- CH_{2}
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
-- R
en la que R es un grupo alquilo inferior, alcoxi, hidroxi, amino o arilo, dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, halo, dialquilamino, hidroxi, nitro o alquilendioxi;
un grupo de fórmula
-CH_{2}R'
en la que R' es hidrógeno, o un grupo alquilo inferior, alquinilo inferior, o arilo;
o un grupo de fórmula
-- CH_{2}
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
-- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{R''}}
-- R'''
en la que R'' es hidrógeno y R''' es un grupo alquilo inferior, opcionalmente sustituido con un grupo arilo, o un grupo arilo, dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo inferior, halo, o alcoxilcarbonilo; o R'' y R''' son ambos grupos alquilo inferior;
con la condición de que al menos uno de Y y Z sea un grupo amino y la salvedad adicional de que cuando Y es amino y R_{2} y Z son ambos hidrógeno, entonces R_{1} es diferente de un grupo alquilo inferior; y
X es un ion haluro haluro, tosilato, metanosulfonato o mesitilensulfonato.
Otros compuestos nuevos son los de fórmula I en los que Y es grupo alquinilmetilo inferior o un grupo de fórmula
- CH_{2}
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
-- 
\uelm{N}{\uelm{\para}{R''}}
-- R'''
en la que R'' es hidrógeno y R''' es un grupo alquilo inferior, sustituido opcionalmente con un grupo arilo, o un grupo arilo, dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo inferior, halo o alcoxilcarbonilo; o R'' y R''' son ambos grupos alquilo inferior.
Los compuestos de fórmula I en los que Y es un grupo de fórmula
- CH_{2}
\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}
-- R
en la que R es un grupo alquilo inferior, alcoxi, hidroxi, amino o arilo;
o un grupo de fórmula
-CH_{2}R'
en la que R' es hidrógeno, o un grupo alquilo inferior, alquinilo inferior o arilo;
X es un ion haluro, tosilato, metanosulfonato o mesitilensulfonato,
se pueden preparar según los procedimientos descritos en el documento de Potts y col., J. Org. Chem., 41: 187 (1976); y Potts y col., J. Org. Chem., 42: 1648 (1977) o como en el esquema mostrado más adelante.
Esquema I
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en el que R^{1}, R^{2}, Z y R son como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva y X es un átomo da halógeno.
En el esquema de reacción I, el compuesto apropiado de tiazol sustituido de fórmula II en la que R^{1}, R^{2} y Z son como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva, se hace reaccionar con el compuesto halo apropiado de fórmula III en la que R y X son como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva, para proporcionar el compuesto deseado de fórmula I en la que R^{1}, R^{2}, Z, R y X son como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva.
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Típicamente esta reacción se lleva a cabo a temperaturas de reflujo durante tiempos de aproximadamente 1 - 3 horas.
Típicamente, se utiliza un disolvente polar tal como etanol para la realización de la reacción.
Los compuestos de fórmula I en la que Y es grupo amino se pueden preparar según los procedimientos descritos por Tamura y col., Synthesis, 1 (1977), o como se muestra más adelante en el esquema II.
Esquema II
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en la que R^{1}, R^{2} y Z son como se ha definido anteriormente.
En la reacción mostrada en el esquema II, llevada a cabo típicamente en un disolvente polar anhidro a temperatura ambiente, las temperaturas de reacción típicas varían entre temperatura ambiente y reflujo, y los tiempos típicos varían entre 1 y aproximadamente 4 horas. Esta reacción produce el mesitilensulfonato, que se puede convertir después opcionalmente en otras sales de tiazolio mediante reacciones típicas de intercambio.
La presente invención también incluye un nuevo inmunoensayo enzimático de sándwich utilizado para determinar la capacidad de los compuestos de ensayo para "destruir" o invertir productos finales de glicosilación avanzada ya formados mediante la detección de la destrucción de restos de AGE (producto final de glicosilación avanzada) a partir de proteína reticulada de AGE. Este ensayo comprende:
a)
incubar albúmina sérica bovina modificada por AGE (abreviadamente AGE - BSA) en pocillos recubiertos con colágeno de placas de microtitulación durante un período de 2 - 6 horas a una temperatura de 37ºC;
b)
lavar los pocillos con PBS - Tween;
c)
emplear los compuestos de ensayo a los pocillos lavados de la etapa b;
d)
incubar los compuestos de ensayo empleados en los pocillos lavados durante 12 - 24 horas adicionales a una temperatura de aproximadamente 37ºC; y
e)
detectar la destrucción de AGE usando un anticuerpo inducido contra ribonucleasa de AGE o destrucción de las reticulaciones con un anticuerpo contra BSA.
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención.
Ejemplo 1 Bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio
Se calentaron a reflujo durante 2 horas tiazol (850 mg, 10 mmoles), bromoacetato de metilo (1,52, 10 mmoles) y etanol absoluto (50 ml). Después de enfriar, se separó la sal y se recristalizó con etanol absoluto para proporcionar el compuesto del título (1,59 g) p. f. 189 - 190ºC (desc.);
Ejemplo 2 Mesitilensulfonato de 3-amino-4,5-dimetiltiazolio
Se trató gota a gota una solución enfriada en hielo del 4,5-dimetiltiazol (2,26 g, 20 mmoles) en diclorometano seco (15 ml) con una solución de o-mesitilensulfonilhidroxilamina (4,3 g, 20 mmoles) en diclorometano seco (15 ml).
Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se añadió éter anhidro (10 ml). Después de enfriar, se separaron agujas del producto del título, mesitilensulfonato de 3-amino-4,5-dimetiltiazolio (3,48 g), p. f. 165 - 168ºC.
Ejemplo 3
Usando los procedimientos descritos anteriormente en los ejemplos 1 y 2, se prepararon los siguientes ejemplos.
Los compuestos representativos de la presente invención son:
Mesitilensulfonato de 3-aminotiazolio, p. f. 102 - 104ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diaminotiazolio, p. f. 173 - 175ºC (desc.).
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 184 - 185ºC (desc.).
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metiltiazolio, p. f. 149 - 151ºC (desc.).
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metiltiazolio, p. f. 218 - 220ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 212 - 213ºC (desc.);
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metiltiazolio, p. f. 143 - 144ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-5-metiltiazolio, p. f. 193 - 194ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-5-metiltiazolio, p. f. 193 - 194ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-[4'-bromofenil]-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 269 - 270ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-[4'-bromofenil]-2-oxoetil)-4-metiltiazolio, p. f. 248 - 249ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-[4'-bromofenil]-2-oxoetil)-5-metiltiazolio, p. f. 216 - 217ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-[4'-bromofenil]-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 223 - 224ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio, p. f. 137 - 138ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio, p. f. 180 - 181ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-[4'-bromofenil]-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil) tiazolio, p. f. 251 - 252ºC (desc.);
yoduro de 3,4-dimetil-5-(2-hidroxietil)tiazolio, p. f. 85 - 87ºC;
bromuro de 3-etil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio, p. f. 84 - 85ºC;
cloruro de 3-bencil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio, p. f. 144 - 146ºC;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 144 - 145ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 240 - 241ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 261 - 262ºC (desc.);
bromuro de 3-(carboximetil)benzotiazolio, p. f. 250ºC (desc.);
mesitilensulfonato de 2,3-(diamino)benzotiazolio, p. f. 212 - 214ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 205 - 206ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metiltiazolio, p. f. 220 - 222ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-5-metiltiazolio, p. f. 179 - 180ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 147 - 148ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 222 - 223ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio, p. f. 182 - 183ºC;
mesitilensulfonato de 3-amino-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio, p. f. 94 - 95ºC;
cloruro de 3-(2-metil-2-oxoetil)tiazolio p. f. 178 - 179ºC;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio, p. f. 118 - 120ºC;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 217 - 218ºC;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio, p. f. 217 - 218ºC;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio, p. f. 233 - 234ºC;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 191 - 192ºC;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 236 - 237ºC;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 209 - 210ºC;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 234 - 235ºC;
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 248 - 249ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(2',4'-dimetoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 214 - 216ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-fluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 209 - 210ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(2',4'-difluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 226 - 228ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 233 - 235ºC (desc.);
bromuro de 3-propargiltiazolio, p. f. 64 - 66ºC;
bromuro de 3-propargil-4-metiltiazolio, p. f. 213 - 215ºC;
bromuro de 3-propargil-5-metiltiazolio, p. f. 127 - 129ºC;
bromuro de 3-propargil-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 198 - 200ºC;
bromuro de 3-propargil-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio, p. f. 132 - 134ºC;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 224 - 225ºC;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio, p.f. 164 - 165ºC;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 215 - 217ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-clorobenzotiazolio, p. f. 228 - 230ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metiltiazolio, p. f. 204 - 205ºC;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-viniltiazolio, p. f. 145 - 147ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-6-clorobenzotiazolio, p. f. 244 - 246ºC;
diclorhidrato de 2,6-diaminobenzotiazol, p. f. 318 - 320ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 243 - 245ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(3'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 217 - 218ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 223 - 225ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 258 - 259ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio, p. f. 208 - 210ºC (desc.);
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-fluorofenil-2-oxoetil]benzotiazolio, p. f. 251 - 252ºC (desc).
mesitilensulfonato de 3-acetamido-4-metil-5-tiazolil-etilacetato, p. f. material de jarabe;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-metiltiazolio, p. f. 149 - 152ºC;
bromuro de 3-[2-(2'-naftil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 219 - 220ºC;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 206 - 207ºC;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diclorofenetilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 193 - 195ºC;
bromuro de 3-[2-dibutilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio, p. f. 78 - 80ºC;
bromuro de 3-[2-4'-carbetoxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio,p. f. 204 - 206ºC;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diisopropilanilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio, p. f. 166 - 168ºC;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-[2-(2',6'-diclorobenciloxi) etil]tioazolio,p. f. 164 - 166ºC;
bromuro de 3-[2-(4'-carbmetoxi-3'-hidroxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 222 - 223ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 166 - 168ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metil-5-hidroxietiltiazolio, p. f. 132 - 134ºC;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-(3',4'-trimetilendioxifenil)tiazolio, p. f. 224 - 226ºC;
bromuro de 3-[2-(1',4'-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio, p. f. 196 - 198ºC;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 164 - 166ºC;
bromuro de 3-(2-[1',4-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]tiazolio, p. f. 238 - 239ºC;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]tiazolio, p. f. 246 - 248ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] tiazolio, p. f.
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metiltiazolio, p.f. 226 - 228ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio, p.f. 210 - 211ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4,5-dimetiltiazolio, p. f. 243 - 244ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] benzotiazolio, p. f. 239 - 294ºC (desc.);
bromuro de 1-metil-3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] imidazolio, p. f. 148 - 150ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]tiazolinio, p. f. 218 - 220ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolinio, p. f. 178 - 180ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolinio, p. f. 184 - 186ºC (desc.);
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-viniltiazolio, p. f. 176 - 177ºC;
bromuro de 3-[2-(3',5'-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-viniltiazolio,p. f. 208 - 209ºC;
bromuro de 3-(2-terc-butil-2-oxoetil)tiazolio, p. f. 211 - 212ºC;
bromuro de 3-(2-terc-butil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio, p. f. 186 - 187ºC;
cloruro de 3-(3'-metoxibencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 135 - 136ºC;
cloruro de 3-(2',6'-diclorobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 192 - 194ºC;
bromuro de 3-(2'-nitrobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio, p. f. 215 - 216ºC;
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]tiazolio, p. f. 239 - 241ºC (desc.);
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio, p. f.240 - 251ºC (desc.); y
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio, p.f. 229 - 231ºC (desc.).
Ejemplo 4
mg/comprimido
Compuesto de fórmula I 50
Almidón 50
Manitol 75
Estearato de magnesio 2
Ácido esteárico 5
El compuesto, una porción del almidón y la lactosa se combinan y se granulan en húmedo con pasta de almidón. La granulación en húmedo se coloca en bandejas y se deja secar durante una noche a una temperatura de 45ºC. La granulación seca se desmenuza en un desmenuzador hasta un tamaño de partícula de aproximadamente de malla 20. El estearato de magnesio, ácido esteárico y el resto de almidón se añaden y la combinación entera se mezcla antes de la compresión en una prensa de comprimidos adecuada. Los comprimidos se comprimen a un peso de 223 mg usando un punzón de 11/32'' con una fuerza de 4 kg. Estos comprimidos se desintegran en media hora según el procedimiento descrito en USP XVI.
Ejemplo 5
Loción mg/g
Compuesto de fórmula I 1,0
Alcohol etílico 400,0
Polietilenglicol 400 300,0
Hidroxipropilcelulosa 5,0
Propilenglicol hasta hacer 1,0 g
Ejemplo 6
Enjuague oral
Compuesto de fórmula I 1,4 %
Gluconato de clorhexidina 0,12 %
Etanol 11,6 %
Sacarina sódica 0,15 %
Azul FD \textamp C Nº 1 0,001 %
Aceite de pipermín 0,5%
Glicerina 10,0 %
Tween 60 0,3 %
Agua hasta 100 %
Ejemplo 7
Pasta de dientes
Compuesto de fórmula I 5,5 %
Sorbitol, 70% en agua 25 %
Sacarina sódica 0,15 %
Lauril sulfato sódico 1,75 %
Carbopol 934, dispersión al 6 % en 15 %
Aceite de pipermín 1,0 %
Hidróxido sódico, 50% en agua 0,76 %
Dihidrato de fosfato cálcico dibásico 45 %
Agua hasta 100 %
Ejemplo 8 Ensayo de inhibición de reticulación
Se utilizó el siguiente procedimiento para evaluar la capacidad de los compuestos de la presente invención de inhibir la reticulación de albúmina sérica bovina glicada (abreviadamente AGE - BSA) a la placa de 96 pocillos recubierta con colágeno del tendón de la cola de rata.
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La AGE - BSA se preparó mediante incubación de BSA a una concentración de 200 mg por ml con glucosa 200 mM en tampón fosfato sódico 0,4 M, pH 7,4 a 37ºC durante 12 semanas. Después la BSA glicada se dializó ampliamente contra una solución de tampón fosfato (abreviadamente PBS) durante 48 horas con 5 veces de cambios de tampón adicionales. La placa recubierta con colágeno de tendón de cola de rata se bloqueó primero con 300 \mul de tampón bloqueante superbloc (Pierce nº 37515X) durante una hora. La solución bloqueante se retiró de los pocillos lavando la placa dos veces con solución de PBS - Tween 20 (Tween 20 al 0,05%) usando una multisonda NUNC o lavador de placas Dynatech de ELISA. La reticulación de AGE - BSA (1 a 10 \mug por pocillo dependiendo del lote de AGE - BSA) a una placa recubierta con colágeno de tendón de cola de rata se realizó con y sin el compuesto de ensayo diluido en tampón PBS a pH 7,4 a las concentraciones deseadas mediante la adición de 50 \mug cada una de la AGE - PBS diluida en PBS o en la solución del compuesto de ensayo a 37ºC durante 4 horas. Las BSA no pardeadas en tampón PBS con o sin compuesto de ensayo se añadieron a los pocillos separados como blanco. Después la AGE - BSA reticulada se separó mediante lavado de los pocillos tres veces con tampón PBS - Tween. Después la cantidad de AGE - BSA reticulada a la placa recubierta con colágeno de tendón de cola se cuantificó usando un anticuerpo policlonal inducido contra AGE - RNasa. Después de un período de incubación de una hora, el anticuerpo de AGE se retiró lavando 4 veces con PBS - Tween.
Después el anticuerpo de AGE unido se detectó con la adición de peroxidasa de rábano rusticano - anticuerpo secundario conjugado - inmunoglobulina de cabra anti-conejo e incubación durante 30 minutos. Se añadió el sustrato del ácido 2,2-azino-di-(3-etilbenzotiazolinsulfónico) (cromógeno ABTS) (Zymed nº 00-2011). Se dejó la reacción durante 15 minutos adicionales y se leyó la absorbancia a 410 nm en un lector de placas Dynatech.
El porcentaje de inhibición de cada compuesto de ensayo se calculó como sigue.
% de inhibición = {[Densidad Óptica (sin compuesto) - densidad óptica (con compuesto)]/densidad óptica (sin compuesto)} x 100%
Los valores de CI_{50} o la inhibición a varias concentraciones por los compuestos de ensayo son como sigue:
(Tabla pasa a página siguiente)
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Los experimentos anteriores sugieren que este tipo de terapia de fármacos puede tener beneficio reduciendo la patología asociada con la glicosilación avanzada de proteínas y la formación de reticulaciones entre proteínas y otras macromoléculas. La terapia de fármacos se puede utilizar para prevenir el atrapamiento y reticulación de proteínas que se produce en diabetes y envejecimiento que conduce a secuelas tales como lesión de la retina, y lesión extravascular a los tendones, ligamentos y otras articulaciones. Esta terapia podría retrasar aterosclerosis y cambios en el tejido conectivo que se producen con diabetes y envejecimiento. Se contempla tanto la vía tópica, oral y parenteral de administración para proporcionar la terapia local y sistémicamente.
Ejemplo 9 Ensayo de destrucción de reticulaciones
Con el fin de averiguar la capacidad de los compuestos de la presente invención para "destruir" o invertir los productos finales de glicosilación avanzada ya formados, se desarrolló un nuevo inmunoensayo enzimático de sándwich que detecta la destrucción de restos de AGE (producto final de glicosilación avanzada) a partir de la proteína reticulada de AGE. Este ensayo utiliza placas de microtitulación de 96 pocillos recubiertas de colágeno que se obtienen comercialmente. La proteína modificada de AGE (AGE - BSA), preparada, por ejemplo, como en el ejemplo 8, anterior, se incuba en los pocillos recubiertos con colágeno durante 4 horas, se lava en los pocillos con PBS - Tween y se añaden soluciones de los compuestos de ensayo. Después de un período de incubación de 16 horas (37ºC) se detecta la rotura de reticulación usando un anticuerpo inducido contra ABE - ribonucleasa o con un anticuerpo contra BSA. Los resultados positivos en este ensayo indican compuestos que son capaces de reducir la cantidad de AGE - BSA previamente reticulada al colágeno mediante la destrucción de reticulaciones y dejando que el material liberado fluya hacia fuera en las posteriores etapas de lavado. Los detalles del ensayo son como sigue:
Materiales Productos inmunoquímicos y químicos
Albúmina sérica bovina (Tipo V), (BSA) Calbiochem
Dextrosa
Superbloc, Pierce, Inc.
Anti conejo - albúmina sérica bovina.
Peroxidasa de rábano rusticano (abreviadamente HPR) - cabra-anti-conejo, Zymed
Tampón sustrato de HPR, Zymed
Cromógeno ABTS, Zymed
Solución salina de tampón fosfato
Tween 20, Sigma
Equipo
Lavador de placas de ELISA, Dynatech
Lector de placas de ELISA, Dynatech
Baño de agua de precisión
Peachímetro digital Corning
Material de vidrio y de plástico
Micropipeta multicanal de Finneppette, Baxter
Pipetas Eppendorf, Baxter
Pipeta repetidora Eppendorf, Baxter
Puntas de pipeta para Finneppettee, Baxter
Puntas de pipeteador para Eppendorf, Baxter
Tubos de ensayo de vidrio, 13 x 100 mm; Baxter
Tapa de cierre hermético para placas de 96 pocillos Mylar, Corning
Placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno tipo 1 de cola de rata Biocoat Cellware, Collaborative Biomedical Products
Métodos Preparación de soluciones y tampones
1.
Las soluciones madre de AGE - BSA se prepararon como sigue. Se preparó tampón fosfato sódico (0,4 M) disolviendo 6 gramos de fosfato sódico monobásico en 100 ml de agua destilada, 7 gramos de fosfato sódico dibásico (0,4 M) en 100 ml de agua destilada y ajustando el pH de la solución dibásica hasta 7,4 con la solución monobásica. Se añadió azida sódica (0,02 gramos) por 100 ml de volumen para inhibir el desarrollo bacteriano. La solución de BSA se preparó como sigue: 400 mg de BSA de tipo V (albúmina sérica bovina) se añadieron por cada ml de tampón fosfato sódico (anterior). Una solución de glucosa 400 mM se preparó disolviendo 7,2 gramos de dextrosa en 100 ml de tampón fosfato sódico (anterior). Las soluciones de BSA y glucosa se mezclaron 1:1 y se incubaron a 37ºC durante 12 semanas. El pH de la mezcla de incubación se controló semanalmente y se ajustó hasta pH 7,4 si es necesario. Después de 12 semanas, la solución de AGE - BSA se dializó frente a PBS durante 48 horas con cuatro cambios de tampón, cada uno a una relación de 1:500 de solución para tampón de diálisis. La concentración de proteínas se determinó mediante el método de micro-Lowry. Se formaron alícuotas de la solución madre de AGE - BSA y se almacenaron a -20ºC. Las soluciones diluidas de AGE - BSA eran inestables cuando se almacenaban a -20ºC.
2.
Las soluciones de trabajo para estudios de reticulación y destrucción se prepararon como sigue. Se disolvieron los compuestos de ensayo en PBS y se ajustó el pH hasta 7,4 si era necesario. La solución madre de AGE - BSA se diluyó en PBS para medir la reticulación máxima y la solución inhibidora para ensayar la actividad inhibidora de los compuestos. La concentración de AGE - BSA necesaria para conseguir la sensibilidad óptima se determinó mediante titulación inicial de cada lote de AGE - BSA.
3.
El tampón de lavado ("PBS-Tween") se preparó como sigue. Se preparó PBS disolviendo las sales siguientes en un litro de agua destilada: NaCl, 8 gramos; KCl, 0,2 gramos, KH_{2}PO_{4}, 1,15 gramos; NaN_{3}, 0,2 gramos. Se añadió Tween 20 hasta una concentración final de 0,05% (vol/vol).
4.
Los sustratos para la detección de unión al anticuerpo secundario se prepararon diluyendo el tampón sustrato de HPR 1:10 en agua destilada y mezclando con cromógeno de ABTS 1:50 justo antes de usar.
Procedimientos de ensayo
1.
Las placas Biocoat se bloquearon con 300 \mul de "Superbloc". Las placas se bloquearon durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron con PBS - Tween tres veces con el lavador de placas Dynatech antes de la adición de los reactivos de ensayo.
2.
Se puso en marcha cada experimento de la manera siguiente. Los primeros tres pocillos de la placa se usaron para el blanco de reactivos. Cincuenta microlitros de soluciones de AGE - BSA se añadieron a los pocillos de ensayo por triplicado y solamente PBS en los pocillos de blanco. Se incubó la placa a 37ºC durante cuatro horas y se lavó con PBS - Tween tres veces. Se añadieron cincuenta microlitros de PBS a los pocillos control y se añadieron 50 \mul del compuesto "desintegrador de reticulación de AGE" a los pocillos de ensayo y de blanco. Se incubó la placa durante una noche (aproximadamente 16 horas) con el compuesto "desintegrador de reticulación de AGE" de ensayo, seguido de lavado en PBS antes de la adición de anticuerpo primario (más adelante).
3.
Cada lote de anticuerpo primario, bien anti-BSA o anti-RNasa, se ensayó para capacidad de unión óptima en este ensayo preparando diluciones en serie (1:500 hasta 1:2000) y sembrando 50 \mul de cada dilución en los pocillos de las placas Biocoat. El anticuerpo primario óptimo se determinó a partir de cinética de saturación. Se añadieron cincuenta microlitros de anticuerpo primario de dilución apropiada, determinado mediante titulación inicial y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después la placa se incubó con PBS - Tween.
4.
Las placas se incubaron con el anticuerpo secundario, HPR-(Cabra-anti-conejo), que se diluyó 1:4000 en PBS y se utilizó como anticuerpo secundario final. La incubación se realizó a temperatura ambiente durante treinta minutos.
5.
La detección de reticulación máxima y destrucción de reticulaciones de AGE se realizó como sigue. El sustrato de HRP (100 \mul) se añadió a cada pocillo de la placa y se incubó a 37ºC durante quince minutos. Las lecturas se hicieron en el lector de placas de ELISA Dynatech. El filtro de muestra se estableció en "1" y el filtro de referencia se estableció en "5".
Procedimiento de operación habitual Etapas preliminares
1.
Titular cada lote nuevo de preparación de AGE - BSA como se describe en la tabla 4 y determinar la concentración óptima de AGE - BSA para el ensayo de ELISA a partir de la cinética de saturación.
2.
Al principio del día, hacer aclarar el cabezal lavador de las placas con agua caliente, enjuagar con agua destilada y 50% de etanol. Llenar el recipiente del tampón del lavador de placas con PBS - Tween (0,05%) y purgar el sistema tres veces antes de usar.
3.
Preparar un molde de ensayo para poner en marcha el experimento como se describe en "Puesta en marcha, nº 2", más adelante.
Puesta en marcha del ensayo
1.
Calentar el reactivo Superbloc hasta 37ºC. Añadir 300 \mul de Superbloc a cada pocillo de la placa Biocoat y dejar en reposo durante sesenta minutos a 37ºC. Lavar los pocillos tres veces con PBS - Tween (0,05%). Girar la placa 180 grados y repetir este ciclo de lavado.
2.
Diluir la AGE - BSA en PBS de manera que 50 \mul de la muestra diluida contengan la cantidad de AGE - BSA necesaria para una reticulación e inhibición mínima mediante pimagedina (aminoguanidina), determinado mediante la titulación inicial descrita anteriormente. Preparar los controles negativos disolviendo BSA no pardeado en PBS a la misma concentración que AGE - BSA. Añadir 50 \mul de AGE - BSA o BSA a cada pocillo que corresponde a las etiquetas "AGE - BSA" y de "BSA" en el molde.
3.
Disolver los compuestos de ensayo en PBS a una concentración de 30 mM para evaluación preliminar. El pH se debe comprobar y ajustar hasta 7,4 cuando sea necesario. Pretratar las placas recubiertas de colágeno con AGE - BSA para obtener una reticulación máxima. Preparar los compuestos negativos para experimentos de inhibición disolviendo BSA en la solución de inhibición a la misma concentración de proteína que la usada para AGE - BSA. Añadir 50 \mul de AGE - BSA o BSA en las soluciones de inhibidor a los pocillos que corresponden a "ALT nº + AGE - BSA" y a "ALT nº blanco", respectivamente, en el molde. Incubar la placa a 37ºC durante cuatro horas. Después de la unión covalente de AGE - BSA a las placas, lavar las placas con PBS-Tween como preparación de la reacción de detección (más adelante).
4.
La unión del anticuerpo primario a las placas de Biocoat se lleva a cabo como sigue. Al final de la hora cuatro de incubación, los pocillos se lavan con PBS - Tween. Las diluciones adecuadas (según se determina mediante titulación inicial) de los anticuerpos anti-conejo-AGE-RNasa o conejo-anti-BSA se prepararon en PBS y se añadieron 50 \mul a cada pocillo y la placa se dejó en reposo a temperatura ambiente durante sesenta minutos..
5.
Los pocillos de unión del anticuerpo secundario se lavaron con PBS - Tween y se añaden 50 \mul de HPR (peroxidasa se rábano rusticano) (suero de cabra anti-conejo) diluido hasta 1 - 4000 en PBS a cada pocillo. La placa se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
6.
El desarrollo del color se llevó a cabo como sigue. Se lavaron las placas como en la etapa 4 anterior. Diluir el tampón sustrato de HPR 1:10 en agua. Añadir 200 \mul de solución de ABTS, mezclar bien y añadir 100 \mul de este reactivo a cada pocillo. Incubar la placa a 37ºC durante 15 minutos. Leer la densidad óptica a 410 nm con el filtro de muestra establecido en "1" y el filtro de referencia establecido en "5" en el lector de placas de ELISA Dynatech. Calcular el porcentaje de inhibición del compuesto como se ha descrito anteriormente. Los compuestos que se encuentran que reducen la cantidad de inmunorreactividad se consideran que son útiles terapéuticamente en la medida en que invierten y reducen los niveles de los productos finales de glicosilación avanzada.
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Ejemplo 10
Con el fin de determinar la capacidad de los compuestos de la invención de reducir la cantidad de IgG reticulada a glóbulos rojos circulantes en ratas diabéticas inducidas con estreptozotocina se hicieron mediciones mediante el siguiente ensayo. Los compuestos de ensayo se administran a los animales de ensayo bien oralmente o intraperitonealmente y las muestras de sangre se recogen y se ensayan a diversos tiempos, por ejemplo, 4, 7 ó 19 días después de la administración para valorar la eficacia.
Protocolo para el ensayo de RBC IgG A. Preparación de glóbulos rojos
Se recoge sangre de las ratas en tubos heparinizados y se centrifugan a 2000 x g durante 10 minutos y se retira el plasma cuidadosamente. Después, se añaden aproximadamente 5 ml de PBS por ml de sangre, se mezcla suavemente y después de centrifuga otra vez. Después se retira el sobrenadante mediante aspiración. Después se repite el lavado dos veces mas. Después, se recogen 0,2 a 0,3 ml de RBC envasado del fondo del tubo usando una pipeta y se añade al PBS para conseguir una dilución 1 a 10. Después esta dilución se diluye 1 a 25 y 1 a 50 en PBS.
B. Puesta en marcha del ensayo
1. Calentar Superbloc a 37ºC.
2. Coger una placa de Multiscreen-HA, 0,45 \mu. Placa de 96 pocillos cerrada herméticamente con membrana de éster de celulosa (Millipore MAHAS45).
3. Humedecer los pocillos con 100 \mul de PBS.
4. Añadir 300 \mul de superblock a cada pocillo e incubar a 37ºC durante una hora.
5. Colocar la placa en el soporte de Millititer Vacuum, cerrar el vacío y presionar la placa una vez para mantener el cierre hermético. Los líquidos en los pocillos se succionarán. Lavar los pocillos con 300 \mul de PBS - Tween al 0,5%.
6. Dresconectar el vacío y añadir 100 \mul de PBS a cada pocillo.
7. Agitar en un aparato Vortex suavemente las muestras de RBC y pipetear 50 \mul a los pocillos, según la hoja del protocolo. Dejar los tres primeros pocillos para blancos de reactivos. Dejar otros tres pocillos para blanco de anticuerpos.
8. Succionar el líquido como se ha indicado anteriormente y lavar los RCS dos veces con PBS.
9. Diluir AP (Rb-anti-rata) (Sigma A-6066), 1 a 25000 en PBS.
10. Añadir 50 \mul a los pocillos y dejar en reposo a temperatura ambiente durante dos horas.
11. Succionar el líquido como se ha indicado anteriormente y lavar el RCS dos veces con PBS.
12. Añadir sustrato de pNPP (1 mg/ml en tampón DEA). 100 \mul por pocillo.
13. Dejar desarrollar el color durante dos horas a 37ºC.
14. Colocar la placa de micromedida Corning en la cámara de vacío.
15. Colocar la placa de muestra en el colector de vacío. Asegurarse que el fondo de la placa está completamente seco.
16. Aplicar vacío durante aproximadamente 5 minutos, Añadir 100 \mul de PBS a todos los pocillos y aplicar vacío otra vez durante 5 minutos. Levantar suavemente la placa y asegurarse que no hay gotas suspendidas en el fondo de la placa. Si es necesario aplicar vacío durante unos pocos minutos. Leer la DO de la solución recogida en la placa Corning en el filtro de muestra del lector de placas Dynatech 1 y filtro Ref. 4.
17. Calcular el porcentaje de destrucción: 100* (DO 410 control - DO410 tratado)/DO410 control.
El porcentaje de inhibición en animales dosificados oralmente con una cantidad de 10mg/kg de peso corporal es como se enumera más adelante:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Mesitilensulfonato de
3-amino-4-metil-5-viniltiazolio
\+ 11  \pm  1 @ 19 días\cr  Bromuro de
3-[2-(2'-naftil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio
\+  40  \pm   24 @ 19 días\cr  Bromuro de
3-[2-(3',5'-di- terc -butil-4'-hidroxi-fenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio
\+ 65  \pm   15 @ 19 días\cr  Bromuro de
3-(2-fenil)-2-oxoetil)-4-metil-5-viniltiazolio
\+ 58  \pm   21 @ 19 
días\cr}
El grado amplio de inversión de reticulación observado en estos estudios acentúa dos importantes conclusiones de los solicitantes. Primero, un gran porcentaje de las reticulaciones formadas in vivo son susceptibles de atacarse y escindirse mediante compuestos dinucleofílicos a base de tiazolio de la presente invención, y de este modo, por deducción, que estas reticulaciones comprenden un segmento de \alpha-dicetona consistente con el modelo mostrado en los esquemas A y B. Segundo, los agentes de reticulación - destrucción de la presente invención pueden actuar catalíticamente, en el sentido de que una sola molécula nucleofílica a base de tiazolio de la presente invención pueden atacar y ocasionar la escisión de más de una reticulación de glicación.
Ejemplo 11
Este ejemplo describe la preparación mapas del péptido CNBr del colágeno del tendón en reposo de rata de animales normales y diabéticos después del tratamiento con un compuesto de fórmula I, es decir, bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio (ALT 766). Fibras de colágeno (5 mg) de ratas diabéticas por estreptozotocina y de animales de control de edad similar se hidrataron en PBS land a 60º durante 1 hora, se retiró el colágeno soluble y se lavaron los sedimentos varias veces con PBS después se trataron con bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio a una concentración de 30 mM durante 16 horas. Después de la incubación se centrifugaron los sedimentos, se lavaron y se trataron con CNBr (40 mg/ml en ácido fórmico a 30ºC durante 48 horas. Las digestiones de CNBr se liofilizaron repetidamente para retirar CNBr y ácido y después se sometieron a SDS - PAGE (20% de acrilamida) en condiciones reductoras (bandas 1, 2 y 9, MWS; banda 3, 4 y 5, colágeno de tendón de cola de animales no diabéticos con 3 y 5 tratados con bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio, 4 se trató con PBS; bandas 6, 7 y 8, colágeno de animales diabéticos con 6 y 8 tratados con bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio, 7 se trató con PBS). Los geles que se producen son como se muestra en la figura 1.
Ejemplo 12 Preparación de AGE - BSA y AGE - BSA reticulado:
Preparar las siguientes soluciones.
1. Tampón: fosfato sódico0,4 M, pH 7,4.
NaH_{2}PO_{4}: 6 g/100 ml
NaH_{2}PO_{4}: 7 g/100 ml
el pH del fosfato sódico monobásico se ajustó hasta 7,4 con el dibásico se añadieron 0,02 g de azida sódica por 100 ml de tampón.
2.
Solución de BSA
BSA: Calbiochem Tipo V; 400 mg/ml en el tampón 1. Volumen total preparado 50 g/125 ml. Filtrada a través de un filtro de 0,45 \mu en un matraz estéril Corning de 1 litro.
3.
Solución de glucosa. 400 \muM.
Glucosa: 400 mM 9 g/125 ml de tampón. Filtrada a través de un filtro de 0,45 \mu en un matraz estéril Corning de 1 litro.
Puesta en marcha de la reacción:
Soluciones de BSA y glucosa (100 ml cada una) se mezclaron en el matraz estéril Corning de 1 litro, se cerraron con tapa de rosca y se incubaron a 56ºC sin agitación. Se abrió la botella una vez a la semana para retirar alícuotas para análisis. La reacción se continuó durante 9 semanas hasta que se observó la formación de polímero AGE-BSA.
Destrucción del polímero
Se lavaron trozos del gel de AGE - BSA con PBS hasta que no se percoló más proteína en el sobrenadante, se secaron con toallas de papel. Se incubaron aproximadamente 50 mg del gel lavado bien con PBS o con 10 mm de bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio (ALT 766) durante una noche a 37ºC. Se analizaron los sobrenadantes mediante SDS - PAGE y se tiñeron con azul commasie. Los geles resultantes se muestran en la figura 2.
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Ejemplo 13
Para estudiar además la capacidad de los agentes de inhibir e invertir la reticulación de AGE de la presente invención para evitar la decoloración de proteína en una superficie, tal como la que se produce en la superficie de los dientes, se realizan los siguientes experimentos de pardeamiento superficial. Como sustituto de una película que cubre la superficie de los dientes, se usa papel fotográfico no expuesto y revelado para proporcionar una superficie proteica fijada (gelatina, es decir, colágeno) sobre un respaldo de papel. Se perforaron círculos de cinco milímetros y se sumergieron durante una semana a 50ºC en una solución de glucosa-6-fosfato 100 mM en un tampón fosfato 0,5 M, pH 7,4, que contenía azida sódica 3 mM. La glucosa-6-fosfato es un azúcar capaz de participar en el pardeamiento no enzimático a una velocidad más rápida que la glucosa. Además de la glucosa-6-fosfato, se incluyen clorhexidina y/o un compuesto de la fórmula I. Después de la incubación, discos de gelatina/papel se enjuagan con agua, se observan para color marrón y se fotografían.
La incubación de los discos en glucosa-6-fosfato sola, muestra un color ligeramente marrón frente a discos sumergidos en tampón solo. La inclusión de clorhexidina (en forma de Peridex® a una concentración final de 0,04% de clorhexidina) muestra un pardeamiento significativo. La adición de un compuesto de fórmula I a la clorhexidina inhibe completamente el pardeamiento de la gelatina, como hace la inclusión de un compuesto de fórmula I en ausencia de clorhexidina. El ligero color marrón formado por la acción de glucosa-6-fosfato en la superficie de la gelatina sola y su prevención mediante un compuesto de fórmula I demuestra la utilidad de la presente invención en la prevención del pardeamiento no enzimático de las superficies de los dientes. El pardeamiento potenciado en presencia de clorhexidina y su prevención con un compuesto de fórmula I demuestra la utilidad de la presente invención en prevenir el pardeamiento no enzimático potenciado por un agente antiplaca que se produce con clorhexidina.
Ejemplo 14
Como una demostración de la utilidad general de los compuestos de la presente invención para destruir las reticulaciones indeseadas en biomoléculas médicamente relevantes, los solicitantes llevaron a cabo los siguientes experimentos con el péptido amiloide de la enfermedad de Alzheimer. Este péptido de 14 kDalton comprende un constituyente principal de los agregados de tipo placa que se forman en el parénquima cerebral de pacientes con la enfermedad de Alzheimer. La acumulación gradual de dichas placas amiloides, junto con otras características anormales tales como ovillos amiloides perivasculares y neurofibrilares, se cree que es responsable de ciertos procesos neurotóxicos y otros patogénicos de esta demencia, que invariablemente es fatal y actualmente incurable. Se sabe que el péptido amiloide de Alzheimer acumula in vivo modificaciones de los AGE, y tras la exposición a concentraciones fisiológicamente relevantes de glucosa, in vivo, su glicación potencia la formación de agregados insolubles del péptido, que son reminiscencias de las placas amiloides de Alzheimer.
El AGE-\beta-péptido se preparó incubando una alícuota del péptido soluble \beta-amiloide, preparado sintéticamente y correspondiente en secuencia al péptido \beta-amiloide encontrado en las placas típicas de Alzheimer, en una solución neutra de glucosa tamponada durante tres meses, generalmente como se ha descrito anteriormente para la preparación de AGE - BSA excepto que el \beta-péptido se sustituyó con BSA como sustrato de glicación. El AGE-\beta-péptido, glicado y reticulado después de esta exposición prolongada a glucosa in vivo, se separó de los reactivos de bajo peso molecular mediante cromatografía por exclusión de tamaño (por ejemplo, en una columna PFD-10) y se yodó mediante procedimientos habituales para dar ^{125}I- AGE-\beta-péptido como el reactivo radiomarcado deseado útil pata ensayar o seleccionar compuestos para actividad molecular de destrucción de AGE según el procedimiento siguiente. Se incubaron alícuotas de ^{125}I- AGE-\beta-péptido con o sin compuestos de ensayo añadidos de la presente invención, a concentraciones predeterminadas (por ejemplo compuesto 766 10 mM) durante un tiempo predeterminado (por ejemplo, durante una noche), después del cual se preparó una muestra de la mezcla de incubación para electroforesis en gel desnaturalizante (SDS - PAGE) y se analizaron para determinar el peso molecular aparente según procedimientos bien conocidos.
Los autorradiogramas expuestos en los geles de electroforesis resultantes se exploraron en un sistema de formación de imágenes y análisis radiográfico digital que se utilizó para registrar la radiactividad en función del peso molecular aparente (mobilidad electroforética en tampón que contiene SDS). La inspección de los resultados de este experimento mostró que si ^{125}I- AGE-\beta-péptido no estaba expuesto a un compuesto "destructor de AGE" de la presente invención, eluía una banda de alto peso molecular (> 40 kDalton), sugiriendo que su glicación estaba acompañada de la agregación y formación de reticulaciones covalentes estables. Sin embargo, si ^{125}I-AGE-\beta-péptido se incuba primero en una solución de un agente soporte de reticulación de AGE de la presente invención, el ^{125}I-AGE-\beta-péptido se disgregaba significativamente como se muestra por la aparición de material yodado de bajo peso molecular (> 18 kDalton) en el final del radiograma. Este experimento sugiere no solamente que los agentes dinucleofílicos de tipo tiazolio de la presente invención se pueden usar para hidrolizar las reticulaciones covalentes mediadas por AGE entre hebras de proteínas, sino también que dicha inhibición e inversión de los AGE pueden invertir las consecuencias moleculares adversas de acumulación de AGE en una proteína relevante a la enfermedad de un ser humano.
Ejemplo 15
Los compuestos con estructura reticulada y relativos de la presente invención también encuentran utilidad como antígenos o haptenos para mostrar anticuerpos dirigidos específicamente a eso. Del mismo modo, dichos anticuerpos de la presente invención son útiles a su vez para identificar estructuras AAA de la presente invención. Por ejemplo, cuando se construyen inmunoensayos, empleando anticuerpos de estructura anti-reticulada de la presente invención, se puede medir el grado en que dichas reticulaciones modifican las proteínas. Como se ha descrito anteriormente, y dependiendo de la vida media de la proteína así modificada, las mediciones inmunoquímicas de los epítopos reticulados en una muestra de proteínas, tales como hemoglobina, proporcionan un índice de la formación reciente de AGE. Del mismo modo, la detección inmunoquímica de epítopos reticulados en proteínas circulantes y/o tisulares se puede usar para controlar el curso de terapia con agentes de la presente invención, cuyos agentes se dirigen hacia la inhibición, y destrucción de glicación avanzada. La BSA modificada por reticulación para uso como inmunógeno se puede preparar mediante el acoplamiento de una estructura reticulada con albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA) usando cualquiera de los numerosos reactivos de acoplamiento divalente bien conocidos, tales como una carbodiimida del tipo EDC. Diversos otros haptenos, antígenos e inmunógenos conjugados correspondientes a estructuras reticuladas de la presente invención, incluyendo sin limitación los descritos específicamente en esta memoria descriptiva, se pueden preparar convenientemente, bien mediante aislamiento de mezclas de incubación o mediante planteamientos de síntesis directa. Esta estructura cruzada se puede usar entonces como inmunógeno para inducir una diversidad de anticuerpos que reconocen epítopos específicos o características moleculares de los mismos.
En una realización preferida, la propia estructura reticulada se considera un hapteno, que se acopla correspondientemente a cualquier proteína portadora preferida, incluyendo por ejemplo hemocianina de lapa californiana (abreviadamente KLH), tiroglobulina y la más preferida, albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA), usando un reactivo de acoplamiento divalente tal como EDC, según los protocolos que circulan ampliamente en la técnica.
La estructura reticulada, bien sola o acoplada a una proteína portadora, se puede emplear en cualquier protocolo de inmunización bien conocido para generar anticuerpos y reactivos inmunológicos relativos que son útiles en numerosas aplicaciones debido a la especificidad de los anticuerpos con respecto a características moleculares de estructura reticulada.
Siguiendo un protocolo preferido, se puede inmunizar cualquiera de las especies animales para producir antisueros policlonales dirigidos contra el conjugado proteína - estructura reticulada que incluye, por ejemplo, ratones, ratas, hámsters, cabras, conejos y pollos. Las tres primeras especies mencionadas anteriormente son elecciones que se desean particularmente para la producción posterior de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales de hapteno específico. La producción de dichos hibridomas a partir de las células esplénicas de animales inmunizados se puede llevar a cabo convenientemente mediante cualquiera de los diversos protocolos practicados popularmente en la técnica, y que describen las condiciones adecuadas para la inmortalización de células esplénicas inmunizadas mediante la fusión con una estirpe celular apropiada, por ejemplo, un estirpe celular de mieloma. Dichos protocolos de producción de hibridomas también proporcionan procedimientos para seleccionar y clonar hibridomas de células de esplenocitos/mielomas inmunes y para identificar clones de hibridomas que secretan establemente anticuerpos dirigidos contra el (los) epítopo (s) deseados. Las especies animales tales como conejo y cabra se emplean más comúnmente para la generación de antisueros policlonales, pero independientemente de si se desean los antisueros policlonales o anticuerpos monoclonales en último lugar, la proteína portadora modificada con hapteno típicamente se administra inicialmente junto con un adyuvante tal como adyuvante de Freund completo. Las inmunizaciones se pueden administrar mediante cualquiera de una diversidad de vías, típicamente intraperitoneal, intramuscular o intradérmica; en la técnica se prefieren ciertas vías según la especie a inmunizar y el tipo de anticuerpo que se va a producir finalmente. Posteriormente, las inmunizaciones estimuladoras se administran generalmente junto con un adyuvante tal como alumbre o adyuvante de Freund incompleto. Las inmunizaciones estimuladoras se administran a intervalos después de la inmunización inicial; generalmente un mes es un intervalo adecuado, con muestras de sangre tomadas entre una y dos semanas después de cada inmunización estimuladora. Alternativamente, una variedad de los también llamados programas de hiperinmunización, que generalmente representan las inmunizaciones estimuladoras espaciadas más cerca en tiempo, se emplean algunas veces en un esfuerzo para producir anticuerpos de anti-haptenos preferiblemente en anticuerpos de proteínas anti-portadoras.
Las titulaciones de los anticuerpos en las muestras de sangre después de la estimulación se pueden comparar con respecto a la titulación inmune específica de hapteno en cualquiera de los diversos formatos convenientes que incluyen, por ejemplo, geles de difusión de Ouchterlony y protocolos de ELISA directos. En un típico ELISA directo, se inmoviliza un antígeno definido en el interior de la superficie del pocillo de ensayo, típicamente en un formato de placa de 96 pocillos o de microtitulación, seguido de una serie de incubaciones separadas por enjuagues de la superficie de los pocillos de ensayo para separar las moléculas de unión no unidas. A modo de ejemplo no limitante, los pocillos de una placa de ensayo pueden recibir una solución acuosa, diluida, tamponada del conjugado hapteno/vehículo, preferiblemente donde la proteína portadora difiere de la usada para inmunizar el animal productor de anticuerpos a ensayar; por ejemplo, suero del animal inmunizado con el conjugado AAA/KLH se podría ensayar contra pocillos de ensayos decorados con conjugado AAA/BSA inmovilizado. Alternativamente, la superficie de ensayo se puede decorar mediante incubación con el hapteno solo. Generalmente, después, la superficie de los pocillos de ensayo se expone a una solución de una proteína irrelevante, tal como caseína, para bloquear sitios no ocupados en las superficies plásticas. Después de enjuague con una solución tamponada neutra que típicamente contiene sales y detergente para minimizar las interacciones no específicas, el pocillo se pone después en contacto con uno de una serie de diluciones de suero preparado a partir de la muestra de sangre de interés (el antisuero primario). Después de otro enjuague, se puede estimar el grado de anticuerpos de ensayo inmobilizados en los pocillos de ensayo mediante la interacción con el hapteno deseado o el conjugado hapteno/vehículo mediante la incubación con un conjugado enzima - anticuerpo comercialmente disponible, en el que la porción del anticuerpo de este conjugado secundario se dirige contra la especie utilizada para producir el antisuero primario; por ejemplo, si el antisuero primario se induce en conejos, una preparación comercial de anticuerpos anti-conejo inducidos en cabra y conjugados a una de varias enzimas, tal como peroxidasa de rábano rusticano, se puede usar como anticuerpo secundario. Siguiendo los procedimientos especificados por el fabricante, la cantidad de este anticuerpo secundario se puede entonces estimar cuantitativamente mediante la actividad de la enzima conjugada asociada en un ensayo colorimétrico. Muchos de los protocolos relativos a ELISA o radioinmunométricos, tales como los ELISA competitivo o los ELISA de sándwich, todos los cuales son bien conocidos en la técnica, se pueden sustituir opcionalmente para identificar los antisueros deseados de alta titulación; es decir, los antisueros particulares que proporcionan un verdadero resultado positivo a alta dilución (por ejemplo, mayor que 1/1000 y más preferiblemente mayor que 1/10.000).
Los protocolos inmunométricos similares se pueden usar para estimar el título de los anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos de hidridomas preparados a partir de células esplénicas de animales inmunizados. Cuando se caracteriza de esta manera los antisueros de sobrenadantes o hibridomas, es deseable emplear varias incubaciones control, por ejemplo, con diferentes proteínas portadoras, relacionadas pero haptenos o antígenos estructuralmente diferentes, y omitiendo diversos reactivos en el procedimiento inmunométrico con el fin de minimizar las señales no específicas en el ensayo e identificar determinaciones fiables de la especificidad de anticuerpos y titulación de los resultados de falsos positivos y falsos negativos. A este respecto los tipos de incubaciones de control para uso se conocen bien. También, posteriormente se pueden emplear los mismos protocolos inmunométricos generales con los antisueros identificados mediante los procedimientos anteriores que van a ser de titulo alto y que van a dirigir contra determinantes estructurales específicos en las estructuras reticuladas en muestras biológicas, productos alimenticios u otros comestibles, u otras sustancias portadoras de aminas y biomoléculas de interés. Estas últimas aplicaciones de los anticuerpos de los productos Amadori modificados con anti-aldehído, tanto policlonales como monoclonales, junto con las instrucciones y opcionalmente con otros reactivos y diluyentes útiles, incluyendo, sin limitación, un conjunto de patrones moleculares de la estructura reticulada, se pueden suministrar en un kit para la conveniencia del operador.
Esta invención también se puede realizar en otras formas o llevarse a cabo en otras formas sin salir del espíritu o características esenciales de las mismas. Por lo tanto, la presente descripción se considera en todos los aspectos ilustrativa y no restrictiva, estando el alcance de la invención indicada en las reivindicaciones anexas, y todos los cambios que se producen en el significado e intervalo de equivalencia se intenta que se comprendan en esta memoria descriptiva.

Claims (15)

1. Uso de un compuesto de fórmula estructural (I):
14
en la que R_{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno, hidroxialquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, aciloxialquilo en el que la porción aciloxi contiene entre 2 y 6 átomos de carbono y la porción alquilo contiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o R_{1} y R^{2} junto con sus carbonos en el anillo forman un anillo condensado aromático (C_{6} - C_{10}), sustituido opcionalmente con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi;
Z es hidrógeno o un grupo amino;
Y es amino, un grupo de fórmula CH_{2}C(=O)R en la que R es un alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alcoxi, hidroxi, amino o un grupo arilo (C_{6} - C_{10}), dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos alcoxi que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, dialquilamino en los que la porción alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos hidroxi, nitro o alquilendioxi;
un grupo de fórmula -CH_{2}R'en la que R' es hidrógeno, o un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquinilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o grupo arilo (C_{6} - C_{10}); dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno a dos grupos que son halo, hidroxi, alcoxi teniento entre 1 y 6 átomos de carbono o grupos dialquilamino en los que la porción alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono; o un grupo de fórmula -CH_{2}(=O)N(R'')R''' en la que R'' es hidrógeno y R''' es un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, sustituido opcionalmente con un grupo arilo (C_{6} - C_{10}), o un grupo arilo (C_{6} - C_{10}), dicho grupo arilo sustituido con uno o más alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, o alcoxilcarbonilo; o R'' y R''' son ambos grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono;
X es un anión farmacéuticamente aceptable; y cualquiera de dichos alquilo teniendo entre 1 y 6 átomos de carbono, alquinilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono o alcoxi que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono se puede sustituir con uno o más grupos halo, amino o alquilamino teniendo entre 1 y 6 átomos de carbono;
y dichos grupos alquilo, alquinilo, alcoxi y aciloxialquilo están sustituidos opcionalmente con uno o más grupos halo, hidroxi, amino o grupos alquilamino que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono; en la fabricación de un medicamento para tratar (i) diabetes o tratar o mejorar (ii) secuelas adversas de diabetes, (iii) lesiones renales, (iv) arterosclerosis, (v) hipertensión, (vi) retinopatía, (vii) neuropatía periférica, (viii) cataratas, (ix) enfermedad de Alzheimer, (x) lesión a un tejido ocasionada por contacto con elevados niveles de azúcares reductores, (xi) elasticidad reducida o arrugamiento de la piel, (xii) rigidez periarticular o (xiii) cambios inducidos por azúcares reductores en la deformabilidad de glóbulos rojos.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que R_{1} y R_{2} son independientemente hidrógeno, hidroxialquilo teniendo entre 1 y 6 átomos de carbono, aciloxialquilo que tiene una parte aciloxi con 2 a 6 átomos de carbono y una parte alquilo con entre 1 y 6 átomos de carbono, alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o R_{1} y R_{2} junto con sus carbonos en el anillo forman un anillo condensado aromático (C_{6} - C_{10}), sustituido opcionalmente con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi.
3. El uso según la reivindicación 2, en el que Y es un grupo de fórmula -CH_{2}C(=O)R.
4. El uso según la reivindicación 3 en el que R es un grupo arilo (C_{6} - C_{10}).
5. El uso según la reivindicación 2 o reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para tratar diabetes o secuelas adversas de diabetes.
6. El uso según la reivindicación 2 o reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para tratar una lesión renal.
7. El uso según la reivindicación 2 o reivindicación 4, en la fabricación de un medicamento para tratar aterosclerosis.
8. El uso de la reivindicación 1, en el que el compuesto es bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio, o una sal biológica o farmacéuticamente aceptable del mismo.
9. El uso según la reivindicación 1 de uno cualquiera de los compuestos u otra sal biológica o farmacéuticamente aceptable del mismo:
Mesitilensulfonato de 3-aminotiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4,5-dimetilaminotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diaminotiazolinio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2-hidroxietil) tiazolio;
yoduro de 3,4-dimetil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-etil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
cloruro de 3-bencil-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 3-(carboximetil)benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-(diamino)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio;
cloruro de 3-(2-metil-2-oxoetil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-metoxi-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-acetoxietil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-metoxi-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 2-amino-3-(2-amino-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(2',4'-dimetoxifenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-fluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(2',4'-difluorofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-propargiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4-metiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-5-metiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4,5-dimetiltiazolinio;
bromuro de 3-propargil-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolinio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-(2-[3'-metoxifenil]-2-oxoetil)benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-clorobenzotiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metiltiazolio;
mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-viniltiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-6-clorobenzotiazolio;
diclorhidrato de 2,6-diaminobenzotiazol;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(3'-metoxifenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3[2-(4'-bromofenil)-2-oxoetil]benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3-(2-fenil-2-oxoetil)benzotiazolio;
bromuro de 2,6-diamino-3-[2-(4'-fluorofenil-2-oxoetil]benzotiazolio;
mesitilensulfonato de 3-acetamido-4-metil-5-tiazolil-etilacetato;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(2'-naftil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diclorofentilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-dibutilamino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-[2-4'-carbetoxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-(2',6'-diisopropilanilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-carbmetoxi-3'-hidroxianilino)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4,5-dimetiltiazolio;
mesitilensulfonato de 2,3-diamino-4-metil-5-hidroxietiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(1',4'-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)-tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2-[1',4'-benzodioxan-6-il)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',4'-trimetilendioxifenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] tiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4,5-dimetiltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil] benzotiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-n-pentilfenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolinio;
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'- hidroxietil)-tiazolinio;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-viniltiazolio;
bromuro de 3-[2-(3',5'-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-viniltiazolio;
bromuro de 3-(2)-terc-butil-2-oxoetil)tiazolio
bromuro de 3-(2-terc-butil-2-oxoetil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
cloruro de 3-(3'-metoxibencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
cloruro de 3-(2',6'-diclorobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-(2'-nitrobencil)-4-metil-5-(2'-hidroxietil)tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-clorofenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
bromuro de 3-[2-(4'-metoxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-(2'-hidroxietil) tiazolio;
10. Una composición tópica que comprende uno o más compuestos seleccionados de los compuestos de fórmula.
15
en la que R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente del grupo constituido por hidrógeno, hidroxialquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, aciloxialquilo que tiene una porción aciloxi con entre 2 y 6 átomos de carbono y la porción alquilo con entre 1 y 6 átomos de carbono, alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, arilo (C_{6} - C_{10}) (en el que el arilo está opcionalmente sustituido con uno o dos grupos que son grupos halo, hidroxi, alcoxi teniendo entre 1 y 6 átomos de carbono, alquilendioxi o dialquilamino que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono) o R^{1} y R^{2} junto con sus carbonos en el anillo forman un anillo condensado aromático (C_{6} - C_{10}), sustituido opcionalmente con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi;
Z es hidrógeno o un grupo amino;
Y es amino,
un grupo de fórmula -CH_{2}C(=O)R
en la que R es un alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, hidroxi, amino o un grupo arilo (C_{6} C_{10}), dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos alcoxi que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, dialquilamino que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos hidroxi, grupos nitro o grupos alquilendioxi;
un grupo de fórmula -CH_{2}R^{1}
en la que R^{1} es hidrógeno, o un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquinilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o grupo arilo (C_{6} - C_{10}); dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno a dos grupos que son halo, hidroxi, alcoxi que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono o grupos dialquilamino que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono; o
un grupo de fórmula -CH_{2}(=O)N(R'')R''' en la que R'' es hidrógeno y R''' es un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, sustituido opcionalmente con un grupo arilo (C_{6} - C_{10}), o un grupo arilo (C_{6} - C_{10}), dicho grupo arilo sustituido con uno o más alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, o alcoxilcarbonilo que tienen una parte alcoxi que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono; o R'' y R''' son ambos grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono;
X es un anión farmacéuticamente aceptable; y
dicho alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquinilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono o alcoxi que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono se puede sustituir con uno o más grupos halo, amino o alquilamino teniendo entre 1 y 6 átomos de carbono; y
un vehículo farmacéuticamente aceptable del mismo adecuado para administración tópica.
11. La composición según la reivindicación 10 adaptada para administración ocular.
12. La composición tópica de la reivindicación 10 o reivindicación 11, en la que dicho compuesto es un 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio.
13. Un compuesto de fórmula (I) como se muestra en la reivindicación 1 en el que:
(i)
Y y Z son ambos grupos amino y R^{1} y R^{2} son independientemente hidroxialquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, aciloxialquilo que tiene una porción aciloxi con 2 a 6 átomos de carbono y una porción alquilo con entre 1 y 6 átomos de carbono o alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, o uno de R^{1} y R^{2} es hidrógeno, o R^{1} y R^{2} junto con sus carbonos en el anillo forman un anillo aromático condensado sustituido con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi; o
(ii)
R^{1} y R^{2} y Z son hidrógeno;
Y es un grupo de fórmula -CH_{2}C(=O)R en la que R es un alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alcoxi, hidroxi, amino o un grupo arilo, dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, alcoxi que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo dialquilamino, hidroxi, nitro o alquilendioxi, con la condición de que Y no sea 2-fenil-2-oxoetil o 2-(3'-metoxifenil)-2-oxoetil; un grupo de fórmula -CH_{2}R' en la que R' es hidrógeno, o un grupo alquilo, que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquinilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o arilo; o un grupo de fórmula -CH_{2}(=O)N(R'')R''' en la que R'' es hidrógeno y R''' es un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, sustituido opcionalmente con un grupo arilo, o un grupo arilo, dicho grupo arilo sustituido con uno o más alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, o alcoxilcarbonilo; o R'' y R''' son ambos grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono; o
(iii)
R^{1} y R^{2} son independientemente hidrógeno, hidroxialquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, aciloxialquilo que tiene una porción aciloxi con entre 2 a 6 átomos de carbono y una porción con entre 1 y 6 átomos de carbono, alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, alquenilo que tiene entre 2 y 6 átomos de carbono, o R^{1} y R^{2} junto con sus carbonos en el anillo forman un anillo aromático condensado sustituido con uno o más grupos amino, halo o alquilendioxi;
Z es hidrógeno o un grupo amino;
Y es un grupo alquinilmetilo o un grupo de fórmula -CH_{2}C(=O)NHR en el que R es un grupo alquilo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono, sustituido opcionalmente con un grupo arilo, o un grupo arilo, dicho grupo arilo sustituido opcionalmente con uno o más grupos alquilo que tienen entre 1 y 6 átomos de carbono, grupos halo, o alcoxilcarbonilo; o
X es un anión farmacéuticamente aceptable.
14. Uno cualquiera de los compuestos
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-5-metiltiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
bromuro de 3-[2-(3',5'-di-terc-butil-4'-hidroxifenil)-2-oxoetil]-4-metil-5-viniltiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo ;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4-metil-5-viniltiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
bromuro de 3-[2-(4'-dietilaminofenil)-2-oxoetil]tiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
bromuro de 3-(2-fenil-2-oxoetil)-4,5-dimetiltiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
bromuro de 3-(2-amino-2-oxoetil)-4-metil-5-(2-hidroxietil)tiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
mesitilensulfonato de 3-amino-5-(2-hidroxietil)-4-metiltiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo; o
cloruro de 3-(2-metil-2-oxoetil)tiazolio u otra sal biológicamente aceptable del mismo;
15. Uso de mesitilensulfonato de 3-amino-4-metil-5-[2-(2',6'-diclorobenciloxi)etil]tiazolio o mesitilensulfonato de 2,3-diamino-5-(3',4'-trimetilendioxifenil)tiazolio en la fabricación de un medicamento para tratar (i) diabetes o tratar o mejorar (ii) secuelas adversas de diabetes, (iii) lesiones renales, (iv) arterosclerosis, (v) hipertensión, (vi) retinopatía, (vii) neuropatía periférica, (viii) cataratas, (ix) enfermedad de Alzheimer, (x) lesión a un tejido ocasionada por contacto con elevados niveles de azúcares reductores, (xi) elasticidad reducida o arrugamiento de la piel, (xii) rigidez periarticular o (xiii) cambios inducidos por azúcares reductores en la deformabilidad de glóbulos rojos.
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