MX2007001556A

MX2007001556A - Proteinas de fusion del receptor para los productos finales glucados avanzados y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2007001556A
Application number: MX2007001556A
Authority: MX
Inventors: Robert Rothlein; Adnan M M Mjalli; Ye E Tian; Jeffrey C Webster; David M Stern; Ann Marie Schmidt; Shi Du Yan
Original assignee: Transtech Pharma Inc
Priority date: 2004-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2008-03-05
Also published as: ECSP077297A; AU2005271449A1; GEP20105111B; JP2008508882A; CN101010430A; CA2575830A1; AP2007003893A0; EP1776459A1; AU2010201531A1; US20060078562A1; MA28781B1; KR20070057818A; US20090060925A1; WO2006017643A1; EA200700402A1; BRPI0514013A; CR8897A; IL180555A0; CR20110557A; NO20070062L

Abstract

Se describen proteinas de fusion RAGE que comprenden secuencias polipeptidicas RAGE enlazadas a un segundo polipeptido que no es RAGE; la proteina de fusion RAGE puede utilizar un dominio de un polipeptido RAGE que comprende un sitio de union al ligando de RAGE y un enlazante interdominio enlazado directamente a un dominio CH2 de inmunoglobulina; tales proteinas de fusion pueden proporcionar una union especifica, de alta afinidad a los ligandos de RAGE; tambien se describe el uso de las proteinas de fusion RAGE como terapeuticos para las patologias mediadas por RAGE.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN DEL RECEPTOR PARA LOS PRODUCTOS FINALES GLUCADOS AVANZADOS Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama la prioridad bajo 35 USC 119(e) de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/598,362, presentada en Agosto 3, del 2004. La descppción de la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. 60/598,362, se incorpora por lo tanto como referencia en su totalidad en la presente.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la regulación del Receptor para los Productos Finales Glucados Avanzados (RAGE). Más particularmente, la presente invención describe las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido RAGE, métodos para hacer tales proteínas de fusión, y el uso de tales proteínas para el tratamiento de trastornos basados en los RAGE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La incubación de las proteínas o lípidos con azúcares de aldosa, resulta en la glucación y oxidación no enzimática de los grupos amino en las proteínas para formar aductos de Amadori. Con el tiempo, los aductos se someten a rearreglos adicionales, deshidrataciones y reticulaciones con otras proteínas para formar complejos conocidos como Productos Finales de la Glucosilación Avanzados (AGE). Los factores que fomentan la formación de los AGE incluyen el recambio retardado de la proteína (por ejemplo, como en la amiloidosis), acumulación de macromoléculas que tienen un alto contenido de lisina, y altos niveles de glucosa en sangre (por ejemplo, como en la diabetes) (Hori et al, J. Biol. Chem. 270: 25752-761 , (1995)). Los AGE se han implicado en una variedad de trastornos incluyendo complicaciones asociadas con la diabetes y el envejecimiento normal. Los AGE muestran una unión específica y saturable a los receptores de la superficie celular en los monocitos, macrófagos, células endoteliales de la microvasculatura, células del músculo liso, células mesengiales y neuronas. El Receptor para los Productos Finales Glucados Avanzados (RAGE), es un miembro de la familia de moléculas del supergen de inmunoglobulina. El dominio (N terminal) extracelular de los RAGE, incluye tres regiones del tipo de inmunoglobulina: un dominio del tipo V (variable), seguido por dos dominios del tipo C (constantes) (Neeper et al, J. Biol. Chem., 267:14998-15004 (1992); Schmidt et al., Circ. (Suppl.) 96#194 (1997)). Un solo dominio que abarca la transmembrana y una cola citosólica corta, altamente cargada, sigue al dominio extracelular. El dominio extracelular N terminal puede aislarse mediante la proteólisis de los RAGE o por los procedimientos de biología molecular para generar RAGE solubles (sRAGE), comprendidos de los dominios V y C. Los RAGE se expresan en múltiples tipos celulares, incluyendo leucocitos, neuronas, células microgliales y endotelio vascular (por ejemplo, Hori et al, J. Biol. Chem., 270:25752-761 (1995)). Los niveles incrementados de RAGE también se encuentran en los tejidos que envejecen (Schleicher et al, J. CHn. Invest., 99 (3): 457-468 (1997)), y en la retina, vasculatura y hígado diabéticos (Schmidt et al, Nature Med., 1 :1002-1004 (1995)). Además de los AGE, otros compuestos pueden unirse a y modular los RAGE. Los RAGE se unen a múltiples ligandos funcional y estructuralmente diversos, incluyendo el amiloide beta (Aß), el suero amiloide A (SAA), los productos Finales de la Glucación Avanzados (AGE), S10O (un miembro proinflamatorio de la familia de Calgranulina), carboximetil lisina (CML), anfoterina y CD11 b/CD18 (Bucciarelli et al, Cell Mol. Life ScL, 59:1117-128 (2002); Chavakis et al, Microbes Infect., 6:1219-1225 (2004); Kokkola et al, Scand. J. Immunol., 61 :1-9 (2005); Schmidt et al, J. Clin. Invest., 108:949-955 (2001 ); Rocken et al, Am. J. Pathol, 162:1213-1220 (2003)). La unión de los ligandos tales como AGE, S100/calgranulina, ß-amiloide, CML (Ne-Carboximetil lisina), y anfoterina a los RAGE, ha mostrado modificar la expresión de una variedad de genes. Estas interacciones puede iniciar entonces los mecanismos de transducción de la señal, incluyendo la activación de p38, p21 ras, cinasas MAP, fosforilación de Erk1-2, y la activación del mediador transcripcional de la señalización inflamatoria, NF-?B (Yeh et al, Diabetes, 50:1495-1504 (2001 )). Por ejemplo, en muchos tipos celulares, la interacción entre los RAGE y sus ligandos, puede generar la agresión oxidativa, que resulta por lo tanto en la activación del factor de transcripción NF-?B sensible a los radicales libres, y la activación de los genes regulados por NF-?B, tales como las citocinas IL-1 ß y TNF-a. Además, la expresión de los RAGE está sobrerregulada vía NF- B y muestra expresión incrementada en sitios de inflamación o agresión oxidativa (Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). Así, una espiral ascendente, con frecuencia dañina, puede activarse por un ciclo de retroalimentación positiva iniciado por la unión del ligando. La activación de los RAGE en diferentes tejidos y órganos, puede conducir a varias consecuencias patofisiológicas. Los RAGE se han implicado en una variedad de condiciones, incluyendo: inflamación aguda y crónica (Hofmann et al, Cell 97:889-901 (1999)), el desarrollo de complicaciones tardías de la diabetes, tales como permeabilidad vascular incrementada (Wautier et al, J. CHn. Invest, 97:238-243 (1995)), nefropatía (Teillet et al, J. Am. Soc. Nephrol, 11 :1488-1497 (2000)), arteriosclerosis (Vlassara et. al, We Finnish Medical Society DUODECIM, Ann. Med., 28:419-426 (1996)), y retinopatía (Hammes et al, Diabetologia, 42:603-607 (1999)). Los RAGE también se han implicado en la enfermedad de Alzheimer (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996)), y en la invasión y metástasis de los tumores (Taguchi et al, Nature, 405:354-357 (2000)). A pesar de la amplia expresión de los RAGE y su papel pleiotrópico aparente en múltiples modelos de diversas enfermedades, los RAGE no parecen ser esenciales para el desarrollo normal. Por ejemplo, los ratones que carecen de RAGE no tienen un fenotipo anormal evidente, sugiriendo que aunque los RAGE pueden jugar un papel en la patología de la enfermedad cuando se estimulan de manera crónica, la inhibición de los RAGE no parece contribuir a ningún fenotipo agudo ¡ndeseado (Liliensiek et al, J. Clin. Invest., 113:1641-50 (2004)). El antagonizar la unión de los ligandos fisiológicos a RAGE puede desregular los cambios patofisiológicos provocados por las concentraciones excesivas de AGE y otros ligandos de RAGE. Al reducir la unión de los ligandos endógenos a RAGE, los síntomas asociados con los trastornos mediados por RAGE pueden reducirse. Los RAGE solubles (sRAGE), son capaces de antagonizar de manera efectiva los ligandos de RAGE a los RAGE. Sin embargo, los sRAGE pueden tener una vida media cuando se administran ¡n vivo, que puede ser demasiado corta para ser terapéuticamente útil para uno o más trastornos. Así, existe la necesidad de desarrollar compuestos que antagonicen la unión de los AGE y otros ligandos fisiológicos al receptor RAGE, en donde los compuestos tienen un perfil farmacocinético deseable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la presente invención comprenden proteínas de fusión RAGE y métodos para utilizar tales proteínas. La presente invención puede incorporarse en una variedad de formas. Las modalidades de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En un modalidad, la proteína de fusión comprende un sitio de unión al ligando de RAGE. La proteína de fusión puede comprender además un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del dominio CH2. La presente invención también comprende un método para hacer una proteína de fusión RAGE. En una modalidad, el método comprende enlazar un polipéptido RAGE a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE. El método puede comprender enlazar un polipéptido RAGE directamente a un polipéptido que comprende el dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción del dominio CH2. En otras modalidades, la presente invención puede comprender métodos y composiciones para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto. El método puede comprender administrar una proteína de fusión de la presente invención al sujeto. La composición puede comprender una proteína de fusión RAGE de la presente invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Existen varias ventajas que pueden asociarse con una modalidad particular de la presente invención. En una modalidad, las proteínas de fusión de la presente ¡nvención pueden ser metabólicamente estables cuando se administran a un sujeto. También, las proteínas de fusión de la presente invención pueden exhibir una unión de alta afinidad por los ligandos de RAGE. En ciertas modalidades, las proteínas de fusión de la presente invención se unen a ligandos de RAGE con afinidades en el intervalo de alto nanomolar a bajo micromolar. Al unirse con alta afinidad a los ligandos de RAGE fisiológicos, las proteínas de fusión de la presente ¡nvención pueden utilizarse para inhibir la unión de los ligandos endógenos a RAGE, proporcionando por lo tanto un medio para aminorar las enfermedades mediadas por RAGE. También, las proteínas de fusión de la presente invención pueden proporcionarse en forma de proteína o de ácido nucleico. En una modalidad ejemplar, la proteína de fusión puede administrarse sistémicamente y permanecer en la vasculatura para tratar potencialmente las enfermedades vasculares mediadas en parte por RAGE. En otra modalidad ejemplar, la proteína de fusión puede administrarse localmente para tratar enfermedades, en donde los ligandos de RAGE contribuyen a la patología de la enfermedad. De manera alterna, un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede suministrarse a un sitio mediante el uso de un portador apropiado, tal como un virus o un ADN descubierto, en donde la expresión local transitoria puede inhibir localmente la interacción entre los ligandos y receptores RAGE. Así, la administración puede ser transitoria (por ejemplo, como en donde se administra la proteína de fusión) o de naturaleza más permanente (por ejemplo, como en donde la proteína de fusión se administra como un ADN recombinante). Existen características adicionales de la invención, que se describirán aquí posteriormente. Se entenderá que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en las siguientes reivindicaciones, descripción y figuras anexas. La invención es capaz de otras modalidades y de practicarse o llevarse a cabo de varias maneras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Varias características, aspectos y ventajas de la presente invención se volverán más evidentes con respecto a las siguientes figuras. Las Figuras 1a-1j muestran varias secuencias RAGE de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención: figura 1 a, SEQ ID NO: 1 , la secuencia de aminoácidos para RAGE humano; y SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos para RAGE humano sin la secuencia de la señal de los aminoácidos 1-22; figura 1b, SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos para RAGE humano sin la secuencia de la señal de los aminoácidos 1-23; figura 1c, SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de sRAGE humano; SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de sRAGE humano sin la secuencia de la señal de los aminoácidos 1-22, y SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de sRAGE humano sin la secuencia de la señal de los aminoácidos 1-23; figura 1d, SEQ ID NO: 7, una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio V del RAGE humano; SEQ ID NO: 8, una secuencia de aminoácidos alterna que comprende el dominio V del RAGE humano; SEQ ID NO: 9, un fragmento N terminal del dominio V del RAGE humano; SEQ ID NO: 10, un fragmento N terminal alterno del dominio V del RAGE humano; SEQ ID NO: 11 , la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 124-221 del RAGE humano; SEQ ID NO: 12, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 227-317 del RAGE humano; SEQ ID NO: 13, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-123 del RAGE humano; figura 1e, SEQ ID NO: 14, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-123 del RAGE humano; SEQ ID NO: 15, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-136 del RAGE humano; SEQ ID NO: 16, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-136 del RAGE humano; SEQ ID NO: 17, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-226 del RAGE humano; SEQ ID NO: 18, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-226 del RAGE humano; figura 1f, SEQ ID NO: 19, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 23-251 del RAGE humano; SEQ ID NO: 20, la secuencia de aminoácidos para los aminoácidos 24-251 del RAGE humano; SEQ ID NO: 21 , un enlazante interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 22, un segundo enlazante interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 23, un tercer enlazante interdominio de RAGE; SEQ ID NO: 24, un cuarto enlazante interdominio de RAGE; figura 1g, SEQ ID NO: 25, ADN que codifica los aminoácidos RAGE humanos 1-118; SEQ ID NO: 26, ADN que codifica los aminoácidos RAGE humanos 1-123; y SEQ ID NO: 27, ADN que codifica los aminoácidos RAGE humanos 1-136; figura 1 h, SEQ ID NO: 28, ADN que codifica los aminoácidos RAGE humanos 1-230; y SEQ ID NO: 29, ADN que codifica los aminoácidos RAGE humanos 1 -251 ; figura 1 i, SEQ ID NO: 38, una secuencia de aminoácidos parcial para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; SEQ ID NO:39, ADN que codifica una porción de los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humana; SEQ ID NO: 40, una secuencia de aminoácidos para los dominios CH2 y CH3 de IgG humana; figura 1j, SEQ ID NO: 41 , un ADN que codifica los dominios CH2 y CH3 humanos de IgG humana; SEQ ID NO: 42, una secuencia de aminoácidos para el dominio CH2 de IgG humana; SEQ ID NO: 43, una secuencia de aminoácidos para el dominio CH3 de IgG humana; y SEQ ID NO: 44, un quinto enlazante interdominio de RAGE. La Figura 2 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 30) de una región que codifica la proteína de fusión RAGE (TTP-4000), de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La secuencia codificante 1-753 resaltada en negrillas, codifica la secuencia de la proteína N terminal RAGE, mientras que la secuencia 754-1386 codifica la secuencia de proteína de IgG Fc (?l) humana.

La Figura 3 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 31 ) de una región que codifica la proteína de fusión RAGE alterna (TTP-3000), de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La secuencia codificante 1-408 resaltada en negrillas, codifica la secuencia de proteína N terminal RAGE, mientras que la secuencia 409-1041 codifica la secuencia de proteína de IgG Fc (?1 ) humana. La Figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 32 (TTP-4000), SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34, que codifican cada una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención. La secuencia RAGE está resaltada con negrillas. La Figura 5 muestra las secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 35 (TTP-3000), SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 37, que cada una codifica una proteína de fusión RAGE de tres dominios, de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención. La secuencia RAGE está resaltada con negrillas. Las Figuras 6a-6b, figura 6a, muestra una comparación de los dominios de la proteína en RAGE humano y la proteína Ig gamma-1 Fc humana, y los puntos de escisión utilizados para hacer TTP-3000 (en la posición 136) y TTP-4000 (en la posición 251 ), de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención; y la figura 6b muestra la estructura del dominio para TTP-3000 y TTP-4000 de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención.

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro para sRAGE, y las proteínas de fusión RAGE TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3), a los ligandos de RAGE amiloide-beta (A-beta), S100b (S100), y anfoterina (Ampho), de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo de unión in vitro para la proteína de fusión RAGE TTP-4000 (TT4) ("Proteína") al amiloide-beta, en comparación con un control negativo que incluye únicamente los reactivos de inmunodetección ("Complejo Solo"), y el antagonismo de tal unión mediante el antagonista de RAGE ("Ligando RAGE"), de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo de unión ín vitro para la proteína de fusión RAGE TTP-3000 (TT3) ("Proteína") al amiloide-beta, en comparación con un control negativo que incluye únicamente los reactivos de inmunodetección ("Complejo Solo"), y el antagonismo de tal unión mediante el antagonista de RAGE ("Ligando RAGE"), de acuerdo con una modalidad de la presente ¡nvención. La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo basado en las células que mide la inhibición de la producción de TNF-a inducida por S100b-RAGE por las proteínas de fusión RAGE TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4), y sRAGE de acuerdo con una modalidad de la presente invención. La Figura 11 muestra un perfil farmacocinético para la proteína de fusión RAGE TTP-4000 de acuerdo con una modalidad de la presente ¡nvención, en donde cada curva representa un animal diferente bajo las mismas condiciones experimentales. La Figura 12 muestra los niveles relativos de la liberación de TNF-a de las células THP-1 debido a la estimulación mediante la proteína de fusión RAGE TTP-4000 y la estimulación de IgG humana como una medida de una respuesta inflamatoria, de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Las Figuras 13a-13b muestran el uso de una proteína de fusión RAGE TTP-4000 para reducir la restenosis en animales diabéticos, de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención, en donde la figura 13a muestra que la proteína de fusión RAGE TTP-4000 reduce la relación íntima/medio en comparación con un control negativo (IgG), y la figura 13b muestra que la proteína de fusión RAGE TTP-4000 redujo la proliferación celular del músculo liso vascular de una manera sensible a la dosis. Las Figuras 14a-14b muestran el uso de la proteína de fusión RAGE TTP-4000 para reducir la formación amiloide y la disfunción cognoscitiva en animales con Enfermedad de Alzheimer (AD), de acuerdo con las modalidades alternas de la presente invención, en donde la figura 14a muestra que la proteína de fusión RAGE TTP-4000 reduce la carga amiloide en el cerebro, y la figura 14b muestra que la proteína de fusión RAGE TTP-4000 mejora la función cognoscitiva.

La Figura 15 muestra las curvas de saturación-unión con TTP-4000 a varios ligandos de RAGE conocidos inmovilizados, de acuerdo con una modalidad de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para los propósitos de esta especificación, a menos que se indique de otra manera, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción y así sucesivamente, utilizados en la especificación, se entienden como que están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente especificación, son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas buscadas a ser obtenidas por la presente invención. Finalmente, y no como un intento para limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe considerarse al menos a la luz del número de cifras significativas reportadas y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. Sin importar que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos, se reportan de manera tan precisa como sea posible. Cualquier valor numérico, sin embargo, contiene de manera inherente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus mediciones de prueba respectivas. Además, se entiende que todos los intervalos descritos en la presente abarcan cualquiera y todos los subintervalos incluidos en los mismos. Por ejemplo, un intervalo indicado de "1 a 10" debe considerarse que incluye cualquiera y todos los subintervalos entre (e inclusive de) el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10; esto es, todos los subintervalos que empiezan con un valor mínimo de 1 o más, por ejemplo, 1 a 6J , y que terminan con un valor máximo de 10 o menos, por ejemplo, 5.5 a 10. Además, cualquier referencia referida como "incorporada en la presente", se entenderá que está incorporada en su totalidad. Se nota además, que como se utiliza en esta especificación, las formas singulares "un", "uno" y "el, la", incluyen las referencias en plural a menos que se limite de manera expresa e inequívoca a una referencia. El término "o" se utiliza de manera indistinta con el término "y/o" a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. También, los términos "porción" y "fragmento" se utilizan de manera indistinta para referirse a partes de un polipéptido, ácido nucleico u otro constructo molecular. Como se utiliza en la presente, el término "corriente arriba", se refiere a un residuo que es N terminal a un segundo residuo, en donde la molécula es una proteína, o está en la dirección 5' a un segundo residuo, en donde la molécula es un ácido nucleico. También, como se utiliza en la presente, el término "corriente abajo", se refiere a un residuo que es C terminal a un segundo residuo, en donde la molécula es una proteína o en la dirección 3' a un segundo residuo, en donde la molécula es un ácido nucleico. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica. Los practicantes son dirigidos particularmente a Current Protocols in Molecular Biology (Ansubel) para la definiciones y términos de la técnica. Las abreviaturas para los residuos de los aminoácidos son los códigos estándar de 3 letras y/o 1 letra utilizados en la técnica para referirse a uno de los 20 L aminoácidos comunes. Un "ácido nucleico" es un polinucleótido tal como ácido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN). El término se utiliza para incluir ácido nucleicos de una sola hebra, ácido nucleicos de doble hebra y ARN y ADN hechos de análogos nucleotídicos o nucleosídicos. El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede utilizarse para transportar una segunda molécula de ácido nucleico en una célula. En una modalidad, el vector permite la replicación de las secuencias de ADN insertadas en el vector. El vector puede comprender un promotor para mejorar la expresión de la molécula de ácido nucleico en al menos algunas células hospederas. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma (extracromosomal), o pueden integrarse en un cromosoma de la célula hospedera. En una modalidad, el vector puede comprender un vector de expresión capaz de producir una proteína derivada de al menos parte de una secuencia de ácidos nucleicos insertada en el vector. Como se conoce en la técnica, las condiciones para hibridar las secuencias de ácido nucleico unas con otras, pueden describirse como que varían de rigor bajo a alto. Generalmente, las condiciones de hibridación altamente rigurosas se refieren a lavar los híbridos en un amortiguador con bajo contenido de sal a altas temperaturas. La hibridación puede ser filtrar el ADN unido utilizando soluciones de hibridación estándar en la técnica, tal como NaHP04 0.5 M, sulfato de dodecilo sódico al 7% (SDS), a 65°C, y lavando en NaHP04 0.25 M, SDS al 3.5%, seguido por lavado OJ x SSC/SDS al 0.1 % a una temperatura que varía de temperatura ambiente a 68°C, dependiendo de la longitud de la sonda (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al, Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed., Capítulo 2, John Wiley & Sons, N. Y). Por ejemplo, un lavado con alto rigor comprende lavar en 6x SSC/pirofosfato de sodio al 0.05% a 37°C para una sonda oligonucleotídíca de 14 bases, o a 48°C para la una sonda oligonucleotídica de 17 bases, o a 55°C para una sonda oligonucleotídica de 20 bases, o a 60°C para una sonda oligonucleotídica de 25 bases, o a 65°C para una sonda nucleotídica de aproximadamente 250 nucleótidos de longitud. Las sondas de ácido nucleico pueden marcarse con radionucleótidos mediante marcado en el extremo con, por ejemplo, [?-32P]ATP, o la incorporación de nucleótidos radiomarcados tales como [a-32PjdCTP mediante marcado aleatorio con un cebador. De manera alterna, las sondas pueden marcarse mediante la incorporación de nucleótidos biotinilados o marcados con fluoresceína, y la sonda detectada utilizado Estreptavidina o anticuerpos antifluoresceína. Como se utiliza en la presente, "moléculas orgánicas pequeñas", son moléculas de peso molecular menor que 2,000 Daltons, que contienen al menos un átomo de carbono. "Polipéptido" y "proteína" se utilizan de manera indistinta en la presente para describir moléculas de proteína que pueden comprender proteínas de longitud parcial o completa. El término "proteína de fusión", se refiere a una proteína o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivadas de dos o más proteínas. La proteína de fusión puede incluir también enlazar regiones de aminoácidos entre las porciones de aminoácidos derivadas de proteínas separadas. Como se utiliza en la presente, un "polipéptido que no es RAGE" es cualquier polipéptido que no se deriva de RAGE o un fragmento del mismo. Tales polipéptidos que no son RAGE, incluyen péptídos de inmunoglobulina, polipéptidos dimerizantes, polipéptidos estabilizantes, péptidos anfofílicos o polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos que proporcionan "marcas" para seleccionar o para la purificación de la proteína. Como se utiliza en la presente, "péptidos de inmunoglobulina", pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina o una porción de la misma. En una modalidad, la porción de la cadena pesada puede ser un fragmento Fc o una porción del mismo. Como se utiliza en la presente, el fragmento Fc comprende el polipéptido de articulación de cadena pesada, y los dominios CH2 y CR3 de la cadena pesada de una inmunoglobulina, en forma monomérica o dimérica. O, el CHI y el fragmento Fc pueden utilizarse como el polipéptido de inmunoglobulina. La cadena pesada (o porciones de la misma), pueden derivarse de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2) o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. Un ejemplo de actividad biológica que puede alterarse, incluye la reducción de la capacidad de un isotipo para unirse a algunos receptores Fc, como por ejemplo, mediante la modificación de la región de articulación. Los términos "identidad" o "por ciento idéntico", se refieren a la identidad de la secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de ácidos nucleicos. El por ciento de identidad puede determinarse alineando dos secuencias y se refiere al número de residuos idénticos (es decir, aminoácido o nucleótido) en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. La alineación y comparación de la secuencia puede realizarse utilizando los algoritmos estándar en la técnica (por ejemplo, Smith y Waterman, 1981 , Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman y Wunsch, 1970, J Mol. Biol. 48:443; Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati. Acad. Sel, USA, 85:2444), o mediante versiones computarizadas de estos algoritmos (Paquete de Programas de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wl), disponibles al público como BLAST y FASTA. También, ENTREZ, disponible a través de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda MD, puede utilizarse para la comparación de la secuencia. En una modalidad, el por ciento de identidad de dos secuencias puede determinarse utilizando GCG con una ponderación del hueco de 1 , de manera que cada hueco de aminoácidos se pondera como si fuera una sola mala correspondencia de aminoácidos entre las dos secuencias. Como se utiliza en la presente, el término "residuos conservados", se refiere a los aminoácidos que son los mismos entre una pluralidad de proteínas que tienen la misma estructura y/o función. Una región de residuos conservados puede ser importante para la estructura o función de la proteína. Así, los residuos conservados contiguos como se identifican en una proteína tridimensional, pueden ser importantes para la estructura o función de una proteína. Para encontrar los residuos conservados o las regiones conservadas de la estructura en 3-D, puede hacerse una comparación de las secuencias para las mismas o proteínas similares de diferentes especies, o de individuos de las mismas especies. Como se utiliza en la presente, el término "homólogo", significa un polipéptido que tiene un grado de homología con una secuencia de aminoácidos del tipo silvestre. Las comparaciones de la homología pueden realizarse a simple vista, o más usualmente, con la ayuda de programas de comparación de la secuencia fácilmente disponibles. Estos programas para computadora comercialmente disponibles pueden calcular el por ciento de homología entre dos o más secuencias (por ejemplo, Wilbur, W. J. y Lipman, D. J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:726-730). Por ejemplo, las secuencias homologas pueden tomarse para que incluyan secuencias de aminoácidos que en las modalidades alternas son al menos 75% idénticas, 85% idénticas, 90% idénticas, 95% idénticas o 98% idénticas unas con otras. Como se utiliza en la presente, un "dominio" de polipéptido o proteína comprende una región a lo largo de un polipéptido o proteína que comprende una unidad independiente. Los dominios pueden definirse en términos de la estructura, secuencia y/o actividad biológica. En una modalidad, un dominio polipeptídico puede comprender una región de una proteína que se dobla de una manera que es sustancialmente independiente del resto de la proteína. Los dominios pueden identificarse utilizando bases de datos del dominio, tales como, de manera no exclusiva, PFAM, PRODOM, PROSITE, BLOCKS, PRINTS, SBASE, ISREC PROFILES, SAMRT y PROCLASS. Como se utiliza en la presente, "dominio de inmunoglobulina'J es una secuencia de aminoácidos que es estructuralmente homologa o idéntica a un dominio de una inmunoglobulina. La longitud de la secuencia de aminoácidos de un dominio de inmunoglobulina puede ser de cualquier longitud. En una modalidad, un dominio de inmunoglobulina puede ser menor que 250 aminoácidos. En una modalidad ejemplar, un dominio de inmunoglobulina puede ser de aproximadamente 80-150 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, la región variable, y las regiones CH1 , C 2 y C 3 de una IgG son cada una dominios de inmunoglobulina. En otro ejemplo, la variable, las regiones CHP CH2, CH3 y CH4 de una IgM son cada uno dominios de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, un "dominio de inmunoglobulina de RAGE" es una secuencia de aminoácidos de una proteína RAGE que es estructuralmente homologa o idéntica a un dominio de una inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, el dominio C2 tipo 1 ("dominio C1") similar a Ig RAGE o el dominio C2-tipo 2 ("dominio C2") similar a Ig de RAGE. Como se utiliza en la presente, un "enlazante interdominio", comprende un polipéptido que une dos dominios juntos. Una región de articulación Fc es un ejemplo de un enlazante interdominio en una IgG. Como se utiliza en la presente, "enlazado directamente", identifica un enlace covalente entre dos diferentes grupos (por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos, polipéptidos, dominios polipeptídicos), que no tienen ningún átomo interviniente entre los dos grupos que están siendo enlazados. Como se utiliza en la presente, "dominio de unión al ligando", se refiere a un dominio de una proteína responsable para la unión a un ligando. El término dominio de unión al ligando incluye los homólogos de un dominio de unión al ligando o porciones del mismo. A este respecto, las sustituciones deliberadas de aminoácidos, pueden hacerse en el sitio de unión al ligando basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilicidad de los residuos, siempre que la especificidad de unión del dominio de unión al ligando se mantenga. Como se utiliza en la presente, un "sitio de unión al ligando", comprende residuos en una proteína que interactúan directamente con un ligando, o residuos involucrados en la colocación del ligando en proximidad cercana a aquellos residuos que interactúan directamente con el ligando. La interacción de los residuos en el sitio de unión al ligando puede definirse por la proximidad espacial de los residuos a un ligando en el modelo o estructura. El término sitio de unión al ligando incluye homólogos de un sitio de unión al ligando o porciones del mismo. A este respecto, pueden hacerse sustituciones deliberadas de los aminoácidos en el sitio de unión al ligando basándose en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad o hidrofilicidad de los residuos, siempre que la especificidad de unión del sitio de unión al ligando se mantenga. Un sitio de unión al ligando puede existir en uno o más dominios de unión al ligando de una proteína o polipéptido. Como se utiliza en la presente, el término "interactúa", se refiere a una condición de proximidad entre un ligando o un compuesto, o porciones o fragmentos de los mismos, y una porción de una segunda molécula de interés. La interacción puede ser no covalente, por ejemplo, como resultado de un enlace de hidrógeno, interacciones de van der Waals o interacciones electrostáticas o hidrofóbicas o puede ser covalente.

Como se utiliza en la presente, un "ligando" se refiere a una molécula o compuesto o entidad que interactúa con un sitio de unión al ligando, incluyendo sustratos o análogos o partes de los mismos. Como se describió en la presente, el término "ligando" puede referirse a compuestos que se unen a la proteína de interés. Un ligando puede ser un agonista, un antagonista o un modulador. O, un ligando puede no tener un efecto biológico. O, un ligando puede bloquear la unión de otros ligandos, inhibiendo por lo tanto un efecto biológico. Los ligandos pueden incluir, de manera no exclusiva, inhibidores de molécula pequeña. Estas moléculas pequeñas pueden incluir péptidos, peptidomiméticos, compuestos orgánicos y lo similar. Los ligandos pueden incluir también polipéptidos y/o proteínas. Como se utiliza en la presente, un "compuesto modulador", se refiere a una molécula que cambia o altera la actividad biológica de una molécula de interés. Un compuesto modulador puede incrementar o disminuir la actividad, o cambiar las características físicas o químicas, o las propiedades funcionales o inmunológicas de la molécula de interés. Para los RAGE, un compuesto modulador puede incrementar o disminuir la actividad, o cambiar las características, o propiedades funcionales o inmunológicas de los RAGE, o una porción de los mismos. Un compuesto modulador puede incluir péptidos naturales y/o sintetizados químicamente o artificiales, péptidos modificados (por ejemplo, fosfopéptidos), anticuerpos, carbohidratos, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, glucolípidos, compuestos heterocíclicos, nucleósidos o nucleótidos o partes de los mismos, y moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas. Un compuesto modulador puede ser un compuesto fisiológico endógeno o puede ser un compuesto natural o sintético. O, el compuesto modulador puede ser una molécula orgánica pequeña. El término "compuesto modulador" también incluye un ligando o compuesto modificado químicamente, e incluye isómeros y formas racémicas. Un "agonista", comprende un compuesto que se une a un receptor para formar un complejo, que provoca una respuesta farmacológica específica al receptor involucrado. Un "antagonista" comprende un compuesto que se une a un agonista o a un receptor para formar un complejo que no da lugar a una respuesta farmacológica sustancial y que puede inhibir la respuesta biológica inducida por un agonista. Los agonistas de RAGE pueden unirse por lo tanto a RAGE y estimular los procesos celulares mediados por RAGE, y los antagonistas de RAGE pueden inhibir los procesos mediados por RAGE de ser estimulados por un agonista de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, el proceso celular estimulado por los agonistas de RAGE, comprenden la activación de la transcripción del gen de TNF-a. El término "miméticos peptídicos", se refiere a estructuras que sirven como sustitutos para los péptidos en las interacciones entre las moléculas (Morgan et al., 1989, Ann. Reports Med. Chem., 24:243-252). Los mimétícos peptídicos pueden incluir estructuras sintéticas que pueden o no contener aminoácidos y/o enlaces peptídicos, pero que mantienen las características estructurales y funcionales de un péptido, o agonista o antagonista. Los miméticos peptídicos también incluyen peptoides, oligopeptoides (Simón et al., 1972, Proc. Nati. Acad, Sel., USA, 89:9367); y bibliotecas de péptidos que contienen péptidos de una longitud diseñada, que representan todas las secuencias posibles de aminoácidos que corresponden a un péptido, o agonista o antagonista de la invención. El término "tratar", se refiere a mejorar un síntoma de una enfermedad o trastorno y puede comprender curar el trastorno, evitar sustancialmente el inicio del trastorno, o mejorar la condición del sujeto. El término "tratamiento" como se utiliza en la presente, se refiere al espectro completo del tratamiento para un trastorno dado del cual está sufriendo el paciente, incluyendo el alivio de un síntoma o la mayoría de los síntomas que resultan de ese trastorno, una cura para el trastorno particular, o prevención del inicio del trastorno. Como se utiliza en la presente, el término "EC50" se define como la concentración de un agente que resulta en la inhibición del 50% de un efecto biológico medido. Por ejemplo, la EC50 de un agente terapéutico que tiene un efecto biológico mensurable puede comprender el valor al cual el agente muestra 50% del efecto biológico. Como se utiliza en la presente, el término "CI50" se define como la concentración de un agente que resulta en la inhibición del 50% de un efecto medido. Por ejemplo, la CI50 de un antagonista de la unión a RAGE puede comprender el valor al cual el antagonista reduce la unión al ligando al sitio de unión al ligando de RAGE por un 50%. Como se utiliza en la presente, una "cantidad efectiva", significa la cantidad de un agente que es efectiva para producir un efecto deseado en un sujeto. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" denota aquella cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta terapéutica de un animal o humano que se está buscando. La dosis real que comprende la cantidad efectiva puede depender de la ruta de administración, el tamaño y la salud del sujeto, el trastorno siendo tratado y lo similar. El término "portador farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, puede referirse a compuestos y composiciones que son adecuados para utilizarse en sujetos humanos o animales, como por ejemplo, para composiciones terapéuticas administradas para el tratamiento de un trastorno o enfermedad mediada por RAGE. El término "composición farmacéutica", se utiliza en la presente para denotar una composición que puede administrarse a un hospedero mamífero, por ejemplo, de manera oral, tópica, mediante inhalación de rocío, intranasal o rectal, en formulaciones de dosificación unitaria que contienen portadores, diluyentes, adyuvantes, vehículos no tóxicos convencionales y lo similar. El término "parenteral", como se utiliza en la presente, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intracistemal o técnicas de infusión.

Proteínas de fusión RAGE Las modalidades de la presente invención comprenden proteínas de fusión RAGE, métodos para hacer tales proteínas de fusión, y métodos para utilizar tales proteínas de fusión. La presente invención puede incorporarse en una variedad de formas. Por ejemplo, las modalidades de la presente invención proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el dominio más N terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede estar enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polípéptido comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios C 2 o CH3 de una IgG humana. Una proteína o polipéptido RAGE puede comprender una proteína RAGE humana de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de los RAGE humanos. Como se utiliza en la presente, un fragmento de un polipéptido RAGE es de al menos 5 aminoácidos de longitud, puede ser mayor que 30 aminoácidos de longitud, pero es menor que la secuencia de aminoácidos completa. En modalidades alternas, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia que es 70% u 80% u 85% o 90% idéntica a los RAGE humanos, o un fragmento de los mismos. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con la Glicina como el primer residuo más que Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender el RAGE de longitud completa con la secuencia de señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3) (Figuras 1 a y 1 b) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender sRAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a sRAGE, o un fragmento de sRAGE. Como se utiliza en la presente, sRAGE es la proteína RAGE que no incluye la región transmembranal o la cola citoplásmica (Park et al, Nature Med., 4:1025-1031 (1998)). Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender sRAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O un polipéptido RAGE puede comprender sRAGE humano con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6) (Figura 1c) o una porción de esa secuencia de aminoácidos.

En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V de RAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8; Figura 1d) (Neeper et al, (1992); Schmidt et al. (1997)). O una secuencia 90% idéntica al dominio V de RAGE o un fragmento del mismo puede utilizarse. O, la proteína RAGE puede comprender un fragmento del dominio V de RAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, Figura 1d). En una modalidad, la proteína RAGE puede comprender un sitio de unión al ligando. En una modalidad, el sitio de unión al ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento RAGE es un péptido sintético. Así, el polípéptido RAGE utilizado en las proteínas de fusión de la presente invención, puede comprender un fragmento de RAGE de longitud completa. Como se muestra en la técnica, el RAGE comprende tres dominios polipeptídicos similares a inmunoglobulina, el dominio V y los dominios C1 y C2, cada uno enlazado uno al otro mediante un enlazante interdominio. El RAGE de longitud completa también incluye un polipéptido transmembranal y una cola citoplásmica corriente abajo (C terminal) del dominio C2 y enlazada al dominio C2. En una modalidad, el polipéptido RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de la señal. La secuencia de la señal de RAGE puede comprender los residuos 1-22 o los residuos 1-23 del RAGE de longitud completa.

Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11 ) o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12) o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C2 de RAGE. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 y el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde a sRAGE (es decir, que codifica los dominios V, C1 y C2 y los enlazantes interdominio). O pueden utilizarse fragmentos de cada una de estas secuencias. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido de inmunoglobulina puede comprender una cadena pesada de inmunoglobulina o una porción (es decir, fragmento) de la misma. Por ejemplo, el fragmento de cadena pesada puede comprender un polipéptido derivado del fragmento Fc de una inmunoglobulina, en donde el fragmento Fc comprende el polipéptido de articulación de cadena pesada, y los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de inmunoglobulina como un monómero. La cadena pesada (o porciones de la misma), puede derivarse de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y C 3 de una lgG1 humana o porciones de cualquiera o ambos de estos dominios. Como modalidades ejemplares, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40.

La porción Fc de una cadena de ¡nmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Así, en una modalidad, la proteína de fusión RAGE de la presente invención comprende un enlazante interdominio derivado de RAGE más que un polipéptido de articulación interdominio derivado de una inmunoglobulina. Así, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender además un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una inmunoglobulina, o un fragmento o una porción del dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el dominio CH2 O un fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender un sitio de unión al ligando. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. El polipéptido RAGE utilizado en las proteínas de fusión de la presente invención, puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE. De manera adicional o alterna, el fragmento de RAGE puede comprender un enlazante interdominio. O el polípéptido RAGE puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a un enlazante interdominio corriente arriba (es decir, más cercano al término N) o corriente abajo (es decir, más cercano al término C). En aún otra modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender dos (o más) dominios de inmunoglobulina de RAGE, cada uno enlazado uno al otro mediante un enlazante interdominio. El polipéptido RAGE puede comprender además múltiples dominios de inmunoglobulina de RAGE enlazados unos a otros por uno o más enlazantes interdominio, y que tienen un enlazante interdominio terminal unido al dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE N terminal y/o al dominio de inmunoglobulina C terminal. Las combinaciones adicionales de dominios de inmunoglobulina de RAGE y los enlazantes interdominio están dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente a un aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio C 2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de lgG1 humana o una porción de cualquiera o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 O una porción de los mismos de una lgG1 humana, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. Como se describió anteriormente, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender uno solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido RAGE que comprende un enlazante interdominio enlazado a un dominio polipeptídico RAGE, puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15), o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16), o una secuencia 90% idéntica a la misma que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponden al dominio V, el dominio C1 , el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazante interdominio corriente abajo de C1. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de la proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazante interdominio de RAGE enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazante interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N terminal del primer enlazante interdominio está enlazado al aminoácido C terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado a un aminoácido C terminal del primer enlazante interdominio, el aminoácido N terminal del segundo enlazante interdominio está enlazado a un aminoácido C terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C terminal del segundo enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal del dominio de ¡nmunoglobulina C 2. En una modalidad, una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios puede comprender la SEQ ID NO: 32. En modalidades alternas, una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios comprende la SEQ ID NO: 33 o la SEQ ID NO: 34. De manera alterna, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE enlazado vía un enlazante interdominio de RAGE al aminoácido N terminal de un dominio de inmunoglobulina C 2 o una porción de un dominio de inmunoglobulina CH2. En una modalidad, una proteína de fusión RAGE de tres dominios puede comprender la SEQ ID NO: 35. En modalidades alternas, una proteína de fusión RAGE de tres dominios puede comprender la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37. Un fragmento del enlazante del interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural de, y por lo tanto, está enlazada a un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazante interdominio puede comprender las secuencias de aminoácidos que están corriente abajo de manera natural del dominio V. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 117-123 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante interdominio que comprende varios aminoácidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1 -10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 21. Así, en una modalidad, el enlazante interdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 que suprimen, por ejemplo, los aminoácidos 1 , 2 ó 3 de cualquiera extremo del enlazante. En modalidades alternas, el enlazante puede comprender una secuencia que es 70% idéntica u 80% idéntica o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 RAGE, el enlazante puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural del dominio C1. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante que comprende varios aminoácidos (1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 22. O pueden utilizarse fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen, por ejemplo, 1 -3, 1-5 ó 1 -10 ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazante interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. O el enlazante interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos RAGE 318-342.

Métodos para producir las proteínas de fusión RAGE La presente invención también comprende un método para hacer una proteína de fusión RAGE. Así, en una modalidad, la presente invención comprende un método para hacer una proteína de fusión RAGE, que comprende el paso de enlazar de manera covalente un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE. Por ejemplo, el polipéptido RAGE enlazado y el segundo polipéptido que no es RAGE puede codificarse por un constructo de ADN recombínante. El método puede comprender además el paso de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión. También, el método puede comprender el paso de insertar el vector de expresión en una célula hospedera. Por ejemplo, las modalidades de la presente invención proporcionan proteínas de fusión que comprenden un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE.

En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el sitio más N terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede enlazarse a un polipéptído que comprende un dominio de ¡nmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo) de un dominio de ¡nmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de ¡nmunoglobulina, comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o CH3 de la IgG humana. La proteína de fusión puede diseñarse mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, en una modalidad, la presente ¡nvención puede comprender una secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, el polípéptido RAGE puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE. La proteína RAGE o el polipéptido puede comprender un RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de la señal. La secuencia de la señal de RAGE puede comprender los residuos 1 -22 o los residuos 1-23 del RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternas, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia 70%, o 80%, o 90% idéntica al RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender un RAGE de longitud completa con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3) (Figuras 1 a y 1 b) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender un sRAGE (por ejemplo, la SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico al sRAGE, o un fragmento de sRAGE. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender un sRAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender un sRAGE con la secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6) (Figura 1c) o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; Figura 1d). O puede utilizarse una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, Figura 1d). En una modalidad, el sitio de unión al ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento RAGE es un péptido sintético. En una modalidad, la secuencia de ácidos nucleicos comprende la SEQ ID NO: 25 para codificar los aminoácidos 1-118 del RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia que comprende los nucleótidos 1-348 de la SEQ ID NO: 25, para codificar los aminoácidos 1-116 del RAGE humano. O el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 26 para codificar los aminoácidos 1-123 del RAGE humano. O el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 27 para codificar los aminoácidos 1-136 del RAGE humano. O el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 28 para codificar los aminoácidos 1-230 del RAGE humano. O el ácido nucleico puede comprender la SEQ ID NO: 29 para codificar los aminoácidos 1-251 del RAGE humano. O los fragmentos de estas secuencias de ácidos nucleicos pueden utilizarse para codificar los fragmentos del polipéptido RAGE. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los ¡sotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de la cadena pesada conocidos: lgG1 (?l), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 41. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Así, la proteína de fusión RAGE de la presente invención puede comprender un enlazante interdominio derivado de RAGE más que un polipéptido de articulación interdominio derivado de una inmunoglobulina. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede codificarse por un constructo de ADN recombinante. También, el método puede comprender el paso de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión. También, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en una célula hospedera. Así, en una modalidad, la presente invención comprende un método para hacer una proteína de fusión RAGE, que comprende el paso de enlazar de manera covalente un polipéptido RAGE a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio C 2 de una ¡nmunoglobulina. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CR2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. En una modalidad, el dominio CH2 O un fragmento del mismo, comprende la SEQ ID NO: 42. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y C 3 de una lgG1 humana, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 41. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de ambos, o cualquiera de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana, o una porción de los mismos, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido RAGE que comprende un enlazante interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de una proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazante interdominio enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazante interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N terminal del primer enlazante interdominio está enlazado al aminoácido C terminal del primer dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado a un aminoácido C terminal del primer enlazante interdominio, el aminoácido N terminal del segundo enlazante interdominio está enlazado a un aminoácido C terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C terminal del segundo enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 , el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazante interdominio corriente abajo de C1. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo, puede codificar una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios. De manera alterna, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado vía un enlazante interdominio de RAGE al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15), o una secuencia 90% idéntica a la misma o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo, puede codificar una proteína de fusión RAGE de tres dominios.

Un fragmento del enlazante interdominio de RAGE puede comprender una secuencia nucleotídica que está corriente abajo de manera natural de, y por lo tanto, enlazada a un dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazante interdominio puede comprender las secuencias de aminoácidos que están corriente abajo de manera natural del dominio V. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 117-123 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante interdominio que comprende varios aminoácidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos), corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 21. Así, en una modalidad, el enlazante interdominio comprende la SEQ ID NO: 23, que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 , que suprimen, por ejemplo, 1 , 2 ó 3, aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. En modalidades alternas, el enlazante puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazante puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural del dominio C1. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante que comprende varios aminoácidos (1-3, 1-5 ó 1 -10 ó 1 -15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 22. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen, por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazante interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. O un enlazante interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos RAGE 318-342. El método puede comprender además el paso de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión. Así, en una modalidad, la presente invención comprende un vector de expresión que codifica para una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una ¡nmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende constructos, tales como aquéllos descritos en la presente, que tienen un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión utilizado para transfectar las células, puede comprender la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 30, o un fragmento de la misma, o la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma. El método puede comprender además el paso de transfectar una célula con un vector de expresión de la presente invención. Así, en una modalidad, la presente invención comprende una célula transfectada con el vector de expresión que expresa la proteína de fusión RAGE de la presente invención, de manera que la célula expresa una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o una porción de un dominio CH2 de una inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende constructos, tales como aquéllos descritos en la presente, que tienen un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo. Por ejemplo, el vector de expresión puede comprender la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 30, o un fragmento de la misma, o SEQ ID NO: 31 , o un fragmento de la misma. Por ejemplo, pueden construirse plásmidos para expresar las proteínas de fusión Fc RAGE-lgG utilizando diferentes longitudes de una secuencia de ADNc 5' de RAGE humano con una secuencia de ADNc 3' de lgG1 Fc (?1 ) humana. Las secuencias del cásete de expresión pueden insertarse en un vector de expresión tal como el vector de expresión pcADN3J (Invitrogen, CA), utilizando técnicas recombinantes estándar. También, el método puede comprender transfectar el vector de expresión en una célula hospedera. En una modalidad, el recombinante puede transfectarse en células de Ovario de Hámster Chino, y la expresión se optimiza. En modalidades alternas, las células pueden producir de OJ a 20 gramos/litro, o de 0.5 a 10 gramos/litro, o aproximadamente 1-2 gramos/litro. Como se conoce en la técnica, tales constructos de ácido nucleico pueden modificarse mediante mutación, como por ejemplo, mediante amplificación por PCR de un patrón de ácido nucleico con cebadores que comprenden la mutación de interés. De esta manera, pueden diseñarse los polipéptidos que comprenden afinidad variable por los ligandos de RAGE. En una modalidad, las secuencias mutadas pueden ser 90% o más idénticas al ADN de inicio. Por lo tanto, las variantes pueden incluir secuencias nucleotídicas que se hibridan bajo condiciones rigurosas (es decir, equivalentes a aproximadamente 20-27°C debajo de la temperatura de fusión (TM) del dúplex de ADN en una sal 1 molar). La secuencia codificante puede expresarse transfectando el vector de expresión en un hospedero apropiado. Por ejemplo, los vectores recombinantes pueden recombinarse de manera estable en células de Ovario de Hámster Chino (CHO), y células que expresan la proteína de fusión 5 seleccionada y clonada. En una modalidad, las células que expresan el constructo recombinante se seleccionan de resistencia a la neomicina codificada por el plásmido aplicando el antibiótico G418. Las clonas individuales pueden seleccionarse y las clonas que expresan altos niveles de proteína recombinante como se detecta mediante análisis Western Blot del sobrenadante celular pueden expandirse, y el producto génico es purificado mediante cromatografía por afinidad utilizando columnas de Proteína A. Las modalidades de muestra de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas de fusión de la presente invención, se muestran en las Figuras 2-5. Por ejemplo, como se describió anteriormente, la proteína de fusión producida mediante un constructo de ADN recombinante puede comprender un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. La proteína de fusión puede comprender dos dominios derivados de la proteína RAGE y dos dominios derivados de una inmunoglobulina. Un constructo de ácido nucleico ejemplar que codifica una proteína de fusión, TTP-4000 (TT4), que tiene este tipo de estructura, se muestra como la Figura 2 (SEQ ID NO: 30). Como se muestra en la Figura 2, la secuencia codificante 1-753 (resaltada en negrillas), codifica la secuencia de proteína N terminal de FxAGE, mientras que la secuencia de 754-1386 codifica la secuencia de la proteína de IgG Fc. Cuando se deriva de la SEQ ID NO: 30, o una secuencia 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de cuatro dominios de la SEQ ID NO: 32, o el polipéptido con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 33 o la SEQ ID NO: 34) (Figura 4). En la Figura 4, la secuencia de aminoácidos RAGE está resaltada con negrillas. La secuencia de inmunoglobulina es los dominios de inmunoglobulina CH2 y C 3 de IgG. Como se muestra en la Figura 6b, los primeros 251 aminoácidos de la proteína de fusión RAGE TTP-4000 de longitud completa contienen como la secuencia polipeptídíca de RAGE una secuencia de la señal que comprende los aminoácidos 1 -22/23, el dominio V de inmunoglobulina (incluyendo el sitio de unión al ligando), que comprende los aminoácidos 23/24-116, un enlazante interdominio que comprende los aminoácidos 117 a 123, un segundo dominio de inmunoglobulina (C1 ) que comprende los aminoácidos 124-221 , y un enlazante interdominio corriente abajo, que comprende los aminoácidos 222-251. En una modalidad, la proteína de fusión puede no necesariamente comprender el segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Un constructo de ácido nucleico ejemplar que codifica este tipo de proteína de fusión, se muestra como la Figura 3 (SEQ ID NO: 31 ). Como se muestra en la Figura 3, la secuencia codificante de los nucleótidos 1 a 408 (resaltada en negrillas), codifica la secuencia de la proteína N terminal de RAGE, mientras que la secuencia de 409-1041 codifica la secuencia de la proteína lgG1 Fc (?1 ).

Cuando se deriva de la SEQ ID NO: 31 , o una secuencia 90% idéntica a la misma, la proteína de fusión puede comprender la secuencia de aminoácidos de tres dominios de la SEQ ID NO: 35, o el polipéptido con la secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37) (Figura 5). En la Figura 5, la secuencia de aminoácidos RAGE está resaltada con negrillas. Como se muestra en la Figura 6b, los primeros 136 aminoácidos de la proteína de fusión RAGE TTP-3000 de longitud completa, contienen como el polipéptido RAGE, una secuencia de la señal que comprende los aminoácidos 1-22/23, el dominio V de inmunoglobulina (incluyendo el sitio de unión al ligando), que comprende los aminoácidos 23/24-116, y un enlazante interdominio que comprende los aminoácidos 117 a 136. La secuencia de 137 a 346 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender una estabilidad in vivo mejorada con respecto a los polipéptidos RAGE que no comprenden un segundo polipéptido. La proteína de fusión puede modificarse además para incrementar la estabilidad, eficacia, potencia y biodisponibilidad. Así, las proteínas de fusión de la presente invención pueden modificarse mediante procesamiento postraduccional mediante modificación química. Por ejemplo, la proteína de fusión puede prepararse de manera sintética para incluir aminoácidos L, D o no naturales, aminoácidos disustituidos con alfa o N-alquil aminoácidos. Además, las proteínas pueden modificarse mediante acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión de lípidos tales como fosfatidilinositol, formación de enlaces de disulfuro y lo similar. Además, el polietilenglicol puede agregarse para incrementar la estabilidad biológica de la proteína de fusión.

Unión de los antagonistas de RAGE a las proteínas de fusión de RAGE Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender varias aplicaciones. Por ejemplo, la proteína de fusión de la presente invención puede utilizarse en un ensayo de unión para identificar los ligandos de RAGE, tales como agonistas, antagonistas o moduladores de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para la detección de moduladores de RAGE que comprende: (a) proporcionar una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando; (b) mezclar un compuesto de interés y un ligando que tiene una afinidad de unión conocida por RAGE con la proteína de fusión; y (c) medir la unión del ligando de RAGE conocido a la proteína de fusión RAGE en la presencia del compuesto de interés. En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el dominio más N terminal de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión RAGE también pueden proporcionar equipos para la detección de los moduladores de RAGE. Por ejemplo, en una modalidad, un equipo de la presente invención puede comprender (a) un compuesto que tiene una afinidad de unión conocida a RAGE como un control positivo; (b) una proteína de fusión RAGE que comprende un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE; y (c) instrucciones para el uso. En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el dominio más N terminal de la proteína de fusión. La proteína o el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de la señal. La secuencia de la señal de RAGE puede comprender los residuos 1-22 o los residuos 1-23 del RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternas, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia 70%, 80% o 90% idéntica al RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender un RAGE de longitud completa con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3) (Figuras 1a y 1 b), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender un sRAGE (por ejemplo, SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a sRAGE o un fragmento de sRAGE. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender un sRAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O el RAGE humano puede comprender un sRAGE con la secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6) (Figura 1c), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; Figura 1d). O puede utilizarse una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, Figura 1d). En una modalidad, el sitio de unión al ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento RAGE es un péptido sintético. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o una porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de la cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (oc2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 41. La porción Fc de una cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Así, las proteínas de fusión RAGE de la presente invención, pueden comprender una secuencia Fc derivada de RAGE más que una cadena de inmunoglobulina. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender un polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de ambos o cualquiera de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana, o una porción de los mismos, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido RAGE que comprende un enlazante interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de una proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazante interdominio enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazante interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N terminal del primer enlazante interdominio está enlazado al aminoácido C terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado a un aminoácido C terminal del primer enlazante interdominio, el aminoácido N terminal del segundo enlazante interdominío está enlazado al aminoácido C terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C terminal del segundo enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina C 2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 , el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazante interdominio corriente abajo de C1. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma puede codificar una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios. De manera alterna, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado vía un enlazante interdominio de RAGE al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma, puede codificar una proteína de fusión RAGE de tres dominios.

Como se describió en la presente, el fragmento del enlazante interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural de, y por lo tanto, está enlazada a un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazante interdominio puede comprender las secuencias de aminoácidos que están corriente abajo de manera natural del dominio V. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 117-123 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante interdominio que comprende varios aminoácidos (por ejemplo, 1 -3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 21. Así, en una modalidad, el enlazante interdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 que suprimen, por ejemplo, 1 , 2 ó 3 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. En modalidades alternas, el enlazante puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazante puede comprender la secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural del dominio C1. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 del RAGE de longitud completa.

O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante que comprende varios aminoácidos (1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 22. O pueden utilizarse fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que supriman, por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazante interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. O un enlazante interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos 318-342 de RAGE. Por ejemplo, la proteína de fusión RAGE puede utilizarse en un ensayo de unión para identificar los ligandos potenciales de RAGE. En una modalidad ejemplar de tal ensayo de unión, un ligando de RAGE conocido puede recubrirse con un sustrato sólido (por ejemplo, placas Maxisorb) a una concentración de aproximadamente 5 microgramos por pozo, en donde cada pozo contiene un volumen total de aproximadamente 100 microlitros (µL). Las placas pueden incubarse a 4°C durante la noche para permitir que el ligando se absorba. De manera alterna, pueden utilizarse periodos de incubación más cortos a una temperatura más alta (por ejemplo, temperatura ambiente). Después de un periodo de tiempo para permitir que el ligando se una al sustrato, los pozos del ensayo pueden aspirarse y puede agregarse un amortiguador de bloqueo (por ejemplo, BSA al 1 % en amortiguador de imidazol 50 mM, pH 7.2), para bloquear la unión no específica. Por ejemplo, el amortiguador de bloqueo puede agregarse a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas pueden aspirarse a continuación y/o lavarse con un amortiguador de lavado. En una modalidad, puede utilizarse un amortiguador que comprende imidazol 20 mM, NaCI 150 mM, Tween-20 al 0.05%, CaCI2 5 mM y MgCI2 5 mM, pH 7.2, como un amortiguador de lavado. La proteína de fusión puede agregarse a continuación a diluciones que se incrementan a los pozos de ensayo. La proteína de fusión RAGE puede entonces dejarse incubar con un ligando inmovilizado en el pozo de ensayo, de manera que la unión puede alcanzar el equilibrio. En una modalidad, la proteína de fusión RAGE se deja incubar con el ligando inmovilizado durante aproximadamente una hora a 37°C. En modalidades alternas, pueden utilizarse periodos de incubación más largos a temperaturas más bajas. Después de que la proteína de fusión y el ligando inmovilizado se han inmovilizado, la placa puede lavarse para eliminar cualquier proteína de fusión no unida. La proteína de fusión no unida al ligando inmovilizado puede detectarse de una variedad de formas. En una modalidad, la detección emplea un ELISA. Así, en una modalidad, un complejo de inmunodetección que contiene lgG1 antihumana de ratón monoclonal, IgG antirratón de cabra biotinilada y una alcalino fosfatasa enlazada a avidita, pueden enlazarse a la proteína de fusión inmovilizada en el pozo de ensayo. El complejo de inmunodetección puede dejarse unir a la proteína de fusión inmovilizada, de manera que la unión entre la proteína de fusión y el complejo de inmunodetección alcance el equilibrio. Por ejemplo, el complejo puede dejarse unir a la proteína de fusión durante una hora a temperatura ambiente. En este punto, cualquier complejo no unido puede eliminarse lavando el pozo de ensayo con amortiguador de lavado. El complejo unido puede detectarse agregando el sustrato de fosfatasa alcalina, para-nitrofenilfosfato (PNPP), y midiendo la conversión de PNPP a para-nitrofenol (PNP) como un incremento en la absorbancia a 405 nm. En una modalidad, el ligado de RAGE se une a la proteína de fusión RAGE con afinidad nanomolar (nM) o micromolar (µM). Un experimento que ilustra la unión de los ligandos de RAGE a las proteínas de fusión RAGE de la presente invención se muestra en la Figura 7. Se prepararon soluciones de TTP-3000 (TT3) y TTP-4000 (TT4), que tienen concentraciones iniciales de 1.082 mg/mL y 370 µg/mL, respectivamente. Como se muestra en la Figura 7, a varias diluciones, las proteínas de fusión TTP-3000 y TTP-4000 son capaces de unirse a ligandos de RAGE inmovilizados Amiloide-beta (Abeta) (Amiloide Beta (1-40) de Biosource), SlOOb (S100), y anfoterina (Ampho), resultando en un incremento en la absorbancia. En ausencia del ligando (es decir, recubriendo únicamente con BSA), no hubo un incremento en la absorbancia. El ensayo de unión de la presente invención puede utilizarse para cuantificar el ligando que se une a RAGE. En modalidades alternas, los ligandos de RAGE pueden unirse a las proteínas de fusión de la presente invención con afinidades de unión que varían de 0J a 1000 nanomolar (nM), o de 1 a 500 nM, o de 10 a 80 nM.

La proteína de fusión de la presente ¡nvención también puede utilizarse para identificar compuestos que tienen la capacidad de unirse a RAGE. Como se muestra en las Figuras 8 y 9, respectivamente, un ligando de RAGE puede probarse por su capacidad para competir con el amiloide beta inmovilizado para unirse a las proteínas de fusión TTP-4000 (TT4) o TTP-3000 (TT3). Así, puede observarse que un ligando de RAGE a una concentración final del ensayo (FAC) de 10 µM puede desplazar la unión de la proteína de fusión RAGE a amiloide-beta a concentraciones de 1 :3, 1 :10, 1 :30 y 1 JOO de la solución inicial de TTP-4000 (Figura 8) o TTP-3000 (Figura 9).

Modulación de los efectores celulares Las modalidades de las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para modular una respuesta biológica mediada por RAGE. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden diseñarse para modular los incrementos inducidos por RAGE en la expresión del gen. Así, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para modular la función de las enzimas biológicas. Por ejemplo, la interacción entre RAGE y sus ligandos puede generar agresión oxidativa y activación de NF-?B, y genes regulados por NF-?B, tales como las citocinas IL-1 ß, TNF-a, y lo similar. Además, varias otras trayectorias reguladoras, tales como aquéllas que involucran p21 ras, cinasas MAP, ERK1 y ERK2, han mostrado activarse uniendo los AGE y otros ligandos a RAGE.

El uso de las proteínas de fusión de la presente invención para modular la expresión del efector celular TNF-a se muestra en la Figura 10. Las células mieloides THP-1 pueden cultivarse en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10% e inducirse para secretar TNF-a vía la estimulación de RAGE con Sl OOb. Cuando tal estimulación ocurre en la presencia de una proteína de fusión RAGE, la inducción de TNF-a por SlOOb que se une a RAGE puede inhibirse. Así, como se muestra en la Figura 10, la adición de 10 µg de las proteínas de fusión TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4), reduce la inducción de SlOOb de TNF-a por aproximadamente 50% a 75%. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser al menos tan efectiva en bloquear la inducción de Sl OOb de TNF-a como en el sRAGE (Figura 10). La especificidad de la inhibición para las secuencias RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se muestra por el experimento en el cual la IgG sola se agregó a células estimuladas con SlOOb. La adición de IgG y SlOOb al ensayo muestra los mismos niveles de TNF-a como S1 OOb solo.

Características fisiológicas de las proteínas de fusión RAGE Aunque el sRAGE puede tener un beneficio terapéutico en la modulación de las enfermedades mediadas por RAGE, el sRAGE humano puede tener limitaciones como un terapéutico autónomo basándose en la vida media relativamente corta del sRAGE en plasma. Por ejemplo, mientras que el sRAGE de roedor tiene una vida media en las ratas normales y diabéticas de aproximadamente 20 horas, el sRAGE humano tiene una vida media de menos que 2 cuando se valora mediante la retención de la inmunorreactividad del sRAGE (Renard et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 290:1458-1466 (1999)). Para generar un RAGE terapéutico que tenga características de unión similares a sRAGE, pero un perfil farmacocinético más estable, puede utilizarse una proteína de fusión RAGE que comprende un sitio de unión al ligando de RAGE enlazado a uno o más dominios de inmunoglobulina humana. Como se conoce en la técnica, los dominios de inmunoglobulina pueden incluir la porción Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina. La porción Fc de inmunoglobulina pueden conferir varios atributos a una proteína de fusión. Por ejemplo, la Fc proteína de fusión puede incrementar la vida media en suero de tales proteínas de fusión, con frecuencia de horas a varios días. El incremento en la estabilidad farmacocinética es generalmente un resultado de la interacción del enlazante entre las regiones CH2 y C 3 del fragmento Fc con un receptor FcRn (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)). Aunque las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido Fc de inmunoglobulina pueden proporcionar la ventaja de estabilidad incrementada, las proteínas de fusión de inmunoglobulina pueden provocar una respuesta inflamatoria cuando se introducen en un hospedero. La respuesta inflamatoria puede deberse, en gran parte, a la porción Fc de la inmunoglobulina de la proteína de fusión. La respuesta proinflamatoria puede ser una característica deseable si el objetivo se expresa en un tipo de célula con enfermedad que necesita eliminarse (por ejemplo, una célula cancerosa, o una población de linfocitos que causan una enfermedad autoimmune). La respuesta proinflamatoria puede ser una característica neutra si el objetivo es una proteína soluble, puesto que la mayoría de las proteínas solubles no activan las inmunoglobulinas. Sin embargo, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si el objetivo se expresa en los tipos celulares cuya destrucción conduciría a efectos laterales indeseados. También, la respuesta proinflamatoria puede ser una característica negativa si una cascada inflamatoria se establece en el sitio de unión de una proteína de fusión a un tejido objetivo, puesto que muchos mediadores de la inflamación pueden ser dañinos al tejido circundante y/o pueden causar efectos sistémicos. El sitio proinflamatorío primario en los fragmentos Fc de inmunoglobulina residen en la región de articulación entre CH1 y CH2. Esta región de articulación interactúa con FcR1-3 en varios leucocitos y provoca que estas células atraquen el objetivo. (Wines et al, J. Immunol, 164:5313-5318 (2000)). Como terapéuticos para enfermedades mediadas por RAGE, las proteínas de fusión RAGE pueden no requerir la generación de una respuesta inflamatoria. Así, las modalidades de las proteínas de fusión RAGE de la presente invención pueden comprender una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina, en donde la región de articulación Fc de la inmunoglobulina se elimina y reemplaza con un polipéptido RAGE. De esta manera, la interacción entre la proteína de fusión RAGE y los receptores Fc en las células inflamatorias puede reducirse al mínimo. Puede ser importante, sin embargo, mantener un apilado apropiado y otras interacciones estructurales tridimensionales entre los varios dominios de inmunoglobulina de la proteína de fusión. Así, las modalidades de las proteínas de fusión de la presente invención pueden sustituir el enlazante interdominio de RAGE biológicamente inerte, pero estructuralmente similar, que separa los dominios V y C1 de RAGE, o el enlazante que separa los dominios C1 y C2 de RAGE, en lugar de la región de articulación normal de la cadena pesada de inmunoglobulina. Así, el polipéptido RAGE de la proteína de fusión puede comprender una secuencia del enlazante interdominio que se encuentra naturalmente corriente abajo de un dominio de inmunoglobulina de RAGE para formar un fragmento de un dominio/enlazante de inmunoglobulina de RAGE. De esta manera, pueden mantenerse las interacciones tridimensionales entre los dominios de inmunoglobulina contribuidos por el RAGE o la inmunoglobulina. En una modalidad, una proteína de fusión RAGE de la presente invención puede comprender un incremento sustancial en la estabilidad farmacocinética, en comparación con sRAGE. Por ejemplo, la Figura 11 muestra que una vez que la proteína de fusión RAGE TTP-4000 ha saturado sus ligandos, puede mantener una vida media de más de 300 horas. Esto puede contrastarse con la vida media de sRAGE de sólo unas pocas horas en el plasma humano.

Así, en una modalidad, las proteínas de fusión RAGE de la presente invención pueden utilizarse para antagonizar la unión de los ligandos fisiológicos de RAGE como un medio para tratar las enfermedades mediadas por RAGE sin generar una cantidad inaceptable de inflamación. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden exhibir una disminución sustancial en la generación de una respuesta proinflamatoria, en comparación con la IgG. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 12, la proteína de fusión RAGE TTP-4000 no estimula la liberación de TNF-a de las células bajo condiciones en donde la estimulación de IgG humana de la liberación de TNF-a se detecta.

Tratamiento de la enfermedad con proteínas de fusión RAGE La presente invención también puede comprender métodos para el tratamiento de un trastorno mediado por RAGE en un sujeto humano. En una modalidad, el método puede comprender administrar a un sujeto una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE que comprende un sitio de unión al ligando de RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el dominio más N terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede enlazarse a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo), de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 O CH3 de una IgG humana. La proteína o polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento de RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de la señal. La secuencia de la señal de RAGE puede comprender los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternas, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia que es 70%, 80% o 90% idéntica al RAGE humano o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender un RAGE de longitud completa con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3) (Figuras 1 a y 1 b), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender un sRAGE (por ejemplo, la SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a sRAGE, o un fragmento de sRAGE. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender un sRAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al, (1992)). O el RAGE humano puede comprender un sRAGE con la secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6) (Figura 1c), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; Figura 1d). O puede utilizarse una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, Figura 1d). En una modalidad, el sitio de unión al ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento RAGE es un péptido sintético. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no son derivados de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o una porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de la cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos isotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 41. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11 ), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C2 de RAGE. O el polípéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 y el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde a sRAGE (es decir, que codifica los dominios V, C1 y C2 y los enlazantes interdominio). O pueden utilizarse fragmentos de cada una de estas secuencias. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Así, en una modalidad, la proteína de fusión RAGE de la presente invención comprende un enlazante interdominio derivado de RAGE más que un polipéptido de articulación interdominio derivado de una inmunoglobulina. Así, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender además un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina o un fragmento del mismo. En una modalidad, el dominio C 2 o un fragmento del mismo, comprende la SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una ¡nmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido RAGE que comprende un enlazante interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE, puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de una proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE y un primer enlazante interdominio enlazado a un segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazante interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N terminal del primer enlazante interdominio está enlazado al aminoácido C terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado a un aminoácido C terminal del primer enlazante interdominio, el aminoácido N terminal del segundo enlazante interdominio está enlazado a un aminoácido C terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C terminal del segundo enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 O un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 19), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 de RAGE humano (SEQ ID NO: 20), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 , el enlazante ¡nterdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazante interdominio corriente abajo de C1. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento de la misma, puede codificar una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios. De manera alterna, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de ¡nmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado vía un enlazante interdominio de RAGE al aminoácido N terminal del polipéptido, que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento del mismo, puede codificar una proteína de fusión RAGE de tres dominios. Un fragmento de un enlazante interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural de, y por lo tanto, está enlazada a un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazante interdominio puede comprender las secuencias de aminoácidos que están corriente abajo de manera natural del dominio V. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 117-123 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante ¡nterdominio que comprende varios aminoácidos (por ejemplo, 1 -3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 21. Así, en una modalidad, el enlazante ¡nterdominio comprende la SEQ ID NO: 23 que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 que suprimen, por ejemplo, 1 , 2 ó 3 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. En modalidades alternas, el enlazante puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23.

Para el dominio C1 de RAGE, el enlazante puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural del dominio C1. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante que comprende varios aminoácidos (1 -3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente abajo de la SEQ ID NO: 22. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazante ¡nterdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. O un enlazante interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos 318-342 de RAGE. En una modalidad, una proteína de fusión de la presente invención puede administrarse mediante varias rutas. La administración de la proteína de fusión RAGE de la presente invención puede emplear inyección intraperitoneal (IP). De manera alterna, la proteína de fusión RAGE puede administrarse oralmente, intranasalmente o como un aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenosa (IV). La proteína de fusión RAGE puede también inyectarse subcutáneamente. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión es intraarterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede emplear una cápsula de liberación con el tiempo. En aún otra modalidad, la administración puede ser transrectal, como mediante supositorios o lo similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar los trastornos crónicos cuando la autoadministración es deseable. Una variedad de modelos anímales se ha utilizado para validar el uso de los compuestos que modulan los RAGE como agentes terapéutico. Los ejemplos de estos modelos son como sigue: a) el sRAGE inhibió la formación de neoíntima en un modelo de rata de restenosis después de una lesión arterial en ratas diabéticas y normales inhibiendo la activación endotelial, del músculo liso y del macrófago vía RAGE (Zhou et al, Circulation 107:2238-2243 (2003)); b) La inhibición de las interacciones RAGE/ligando, utilizando sRAGE o un anticuerpo anti-RAGE, redujo la formación de placa amiloide en un modelo de ratón de amiloidosis sistémica (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Acompañando a la reducción en las placas amiloides, hubo una reducción en las citocinas inflamatorias, interleucina-6 (IL-6) y el factor de estimulación de la colonia del macrófago (M-CSF), así como una activación reducida de NF-?B en los animales tratados; c) Los ratones transgénicos RAGE (que sobreexpresan RAGE y que expresan RAGE dominante negativo), exhiben formación de placa y déficits cognoscitivos en un modelo de ratón de AD (Arancio et al, EMBO J, 23:4096-4105 (2004)); d) El tratamiento de ratas diabéticas con sRAGE, redujo la permeabilidad vascular (Bonnardel-Phu et al, Diabetes, 48:2052-2058 (1999)); e) El tratamiento con sRAGE redujo las lesiones ateroscleróticas en ratones que carecen de la lipoproteína E, diabéticos, y evitó los índices funcionales y morfológicos de nefropatía diabética en ratones db/db (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)); y f) El sRAGE atenuó la severidad de la inflamación en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (Hofmann et al, Genes Immunol, 3:123-135 (2002)), un modelo de ratón de encefalomielitís alérgica experimental (Yan et al, Nat. Med. 9:28-293 (2003)), y un modelo de ratón de enfermedad inflamatoria del intestino (Hofmann et al, Cell, 97:889-901 (1999)). Así, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar un síntoma de diabetes y/o las complicaciones que resultan de diabetes mediada por RAGE. En modalidades alternas, el síntoma de diabetes o las complicaciones diabéticas tardías pueden comprender nefropatía diabética, retinopatía diabética, úlcera del pie diabético, una complicación cardiovascular de la diabetes o neuropatía diabética. Originalmente identificado como un receptor para moléculas cuya expresión está asociada con la patología de la diabetes, el RAGE mismo es esencial para la patofisiología de las complicaciones diabéticas. In vivo, la inhibición de la interacción de RAGE con sus ligandos, ha mostrado ser terapéutica en múltiples modelos de complicaciones diabéticas e inflamación (Hudson et al., Arch. Biochem. Biophys., 419:80-88 (2003)). Por ejemplo, un tratamiento de dos meses con anticuerpos anti-RAGE normalizó la función del hígado y redujo la histopatología anormal del hígado en ratones diabéticos (Flyvbjerg et al, Diabetes 53:166-172 (2004)). Además, el tratamiento con una forma soluble de RAGE (sRAGE), que se une a los ligandos de RAGE e inhibe las interacciones RAGE/ligando, redujo las lesiones ateroscleróticas en ratones que carecen de la apolipoproteína E, diabéticos, y atenuó la patología funcional y morfológica de la nefropatía diabética en ratones db/db (Bucciarelli et al, Circulation 106:2827-2835 (2002)). También, se ha mostrado que la glucoxidación no enzímática de macromoléculas que resulta finalmente en la formación de productos finales de la glucación avanzados (AGE), se mejora en los sitios de inflamación, en la falla renal, en la presencia de hipergiucemia y otras condiciones asociadas con la agresión oxidante sistémica o local (Dyer et al, J. Clin. Invest., 91 :2463-2469 (1993); Reddy et al, Biochem., 34:10872-10878 (1995); Dyer et al, J. Biol. Chem., 266:11654-11660 (1991 ); Degenhardt et al, Cell Mol Biol, 44:1139-1145 (1998)). La acumulación de AGE en la vasculatura puede ocurrir focalmente, como en el amiloide conjunto, compuesto de AGE-ß2-microglobulina encontrada en pacientes con amiloidosis relacionada con la diálisis (Miyata et al, J. Clin. Invest, 92:1243-1252 (1993); Miyata et al, J. Clin. Invest., 98:1088-1094 (1996)), o generalmente, como se ejemplifica por la vasculatura y los tejidos de pacientes con diabetes (Schmidt et al, Nature Med., 1 :1002-1004 (1995)). La acumulación progresiva de AGE con el tiempo en pacientes con diabetes, sugiere que los mecanismos de eliminación endógena no son capaces de funcionar de manera efectiva en los sitios de deposición de los AGE. Tales AGE acumulados tienen la capacidad de alterar las propiedades celulares mediante varios mecanismos. Aunque el RAGE se expresa a bajos niveles en tejidos y vasculatura normales, en un medio en donde los ligandos del receptor se acumulan, se ha mostrado que el RAGE se sobrerregula (Li et al, J. Biol Chem., 272:16498-16506 (1997); Li et al, J. Biol. Chem., 273:30870-30878 (1998); Tanaka et al, J. Biol. Chem., 275:25781-25790 (2000)). La expresión de RAGE se incrementa en el endotelio, células del músculo liso y los fagocitos mononucleares infiltrantes en la vasculatura diabética. También, los estudios en los cultivos celulares han demostrado que la interacción AGE-RAGE causa cambios en las propiedades celulares importantes en la homeostasis vascular. El uso de la proteína de fusión RAGE en el tratamiento de la patología relacionada con la diabetes, se ilustra en la Figura 13. La proteína de fusión RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis, que involucró la medición de la proliferación del músculo liso y la expansión de la íntima después de una lesión vascular. Como se ilustra en la Figura 13, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir de manera significativa la relación íntima/medio (l/M) (Figura 13 A; Cuadro 1 ) en la restenosis asociada con la diabetes, de una manera sensible a la dosis. También, el tratamiento con TTP-4000 puede reducir de manera significativa la proliferación de las células del músculo liso vascular asociada con la restenosis de una manera sensible a la dosis.

CUADRO 1 Efecto de TTP-4000 en el modelo de rata de restenosis *P<0.05 "* Para la dosis alta y baja, se utilizó una dosis de carga de 3 mg/animal.

En otras modalidades, las proteínas de fusión de la presente invención también pueden utilizarse para tratar o invertir la amiloidosis y la enfermedad de Alzheimer. El RAGE es un receptor para el amiloide beta (Aß), así como otras proteínas amiloidogénicas incluyendo SAA y amilina (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Proc. Nati. Acad. ScL, USA, 94:5296-5301 (1997); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000); Sousa et al, Lab Invest., 80:1101-1110 (2000)). También, los ligandos de RAGE, incluyendo AGE, Sl OOb y proteínas Aß, se encuentran en el tejido que rodea la placa senil en el hombre (Luth et al, Cereb. Cortex 15:211 -220 (2005); Petzold et al, Neurosci. Lett., 336:167-170 (2003); Sasaki et al, Brain Res., 12:256-262 (2001 ; Yan et al, Restor. Neurol Neurosci., 12:167-173 (1998)). Se ha mostrado que el RAGE se une al material fibrilar de la laminilla ß sin ¡mportar la composición de las subunidades (péptido amiloide-ß, amilina, suero amiloide A, péptido derivado del prión) (Yan et al, Nature, 382:685-691 (1996); Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Además, la deposición de los amiloides ha mostrado resultar en una expresión mejorada de RAGE. Por ejemplo, en los cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD), la expresión de RAGE se incrementa en las neuronas y la neuroglia (Yan, et al, Nature 382:685-691 (1996)). De manera concurrente con la expresión de los ligandos de RAGE, el RAGE se sobrerregula en los astrocitos y las células microgliales en el hipocampo de individuos con AD, pero no se sobrerregula en individuos que no tienen AD (Lúe et al, Exp. Neurol, 111 :29-45 (2001 )). Estos hallazgos sugieren que las células que expresan RAGE son activadas vía las interacciones de RAGE/ligando de RAGE en la vecindad de la placa senil. También, in vitro, la activación mediada por Aß de las células microgliales puede bloquearse por anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión al ligando de RAGE (Yan et al., Proc. Nati. Acad. Sel, USA, 94:5296-5301 (1997)). También se ha demostrado que el RAGE puede servir como un punto focal para el montaje fibrilar (Deane et al, Nat. Med. 9:907-913 (2003)). También, la inhibición ¡n vivo de las interacciones de RAGE/ligando utilizando ya sea sRAGE o un anticuerpo anti-RAGE puede reducir la formación de la placa amiloide en un modelo de ratón de amiloidosis sistémica (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)). Los ratones transgénicos 8 dobles que sobreexpresan el RAGE humano y la proteína precursora amiloide humana (APP) con las mutaciones Swedish y London (mutante hAPP) en las neuronas, desarrollaron defectos del aprendizaje y anormalidades neuropatológicas antes que sus contrapartes transgénicas hAPP con un solo mutante. En contraste, los ratones transgénicos dobles con capacidad de señalización Aß disminuida debido a las neuronas que expresan una forma negativa dominante de RAGE en el mismo antecedente hAPP mutante, muestran un inicio retrasado de anormalidades neuropatológicas y de aprendizaje en comparación con su contraparte transgénica APP única (Arando et al., EMBO J, 23:4096-4105 (2004)). Además, la inhibición de la interacción de RAGE-amiloide ha mostrado disminuir la expresión de RAGE celular y los marcadores de agresión de la célula (así como activación de NF-?B), y disminuir la deposición de amiloide (Yan et al, Nat. Med., 6:643-651 (2000)), sugiriendo un papel para la interacción RAGE-amiloide en la perturbación de las propiedades celulares en un medio enriquecido para los amiloides (incluso en etapas iniciales), así como en la acumulación de amiloides. Así, las proteínas de fusión RAGE de la presente ¡nvención puede utilizarse también para tratar de reducir la amiloidosis y reducir las placas amiloides y la disfunción cognoscitiva asociada con la Enfermedad de Alzheimer (AD). Como se describió anteriormente, el sRAGE ha mostrado reducir tanto la formación de la placa amiloide en el cerebro como el incremento subsiguiente en los marcadores inflamatorios en un modelo animal de AD. Las Figuras 14a y 14b muestran que los ratones que tienen AD, y son tratados durante 3 meses con TTP-4000 o sRAGE de ratón, tuvieron menos placas de amiloide beta (Aß) y menos disfunción cognoscitiva que los animales que recibieron un vehículo o un control negativo de IgG humana (lgG1 ). Como el sRAGE, la TTP-4000 también puede reducir las citocinas inflamatorias IL-1 y TNF-a (datos no mostrados), asociados con AD. También, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar la aterosclerosis y otros trastornos cardiovasculares. Así, se ha mostrado que la enfermedad cardiaca isquémica es particularmente alta en pacientes con diabetes (Robertson, et al, Lab Invest, 18:538-551 (1968); Kaniiel et al, J. Am. Med. Assoc, 241 :2035-2038 (1979); Kannel et al, Diab. Care, 2:120-126 (1979)). Además, los estudios han mostrado que la aterosclerosis en pacientes con diabetes es más acelerada y extensa que en pacientes que no sufren de diabetes (véase, por ejemplo, Waller et al, Am. J. Med., 69:498-506 (1980); Crall et al, Am. J. Med. 64:221-230 (1978); Hamby et al, Chest, 2:251-257 (1976); y Pyorala et al, Diab. Metab. Rev., 3:463-524 (1978)). Aunque las razones para la aterosclerosis acelerada en un entorno con diabetes son muchas, se ha mostrado que la reducción de los AGE puede reducir la formación de la placa. Por ejemplo, las proteínas de fusión RAGE de la presente invención también pueden utilizarse para tratar la apoplejía. Cuando TTP-4000 se comparó con sRAGE en un modelo animal relevante de enfermedad de apoplejía, se encontró que la TTP-4000 proporciona una reducción significativamente mayor en el volumen del infarto. En este modelo, la arteria carótida media de un ratón se liga y a continuación se reperfunde para formar un infarto. Para valorar la eficacia de las proteínas de fusión RAGE para tratar o prevenir la apoplejía, los ratones se trataron con sRAGE o TTP-4000 o con inmunoglobulina de control justo antes de la reperfusión. Como puede observarse en el Cuadro 2, la TTP-4000 fue más eficaz que el sRAGE para limitar el área del infarto en estos animales, sugiriendo que la TTP-4000, debido a su mejor vida media en plasma, fue capaz de mantener una protección mayor que el sRAGE.

CUADRO 2 Reducción del infarto en la apoplejía "Significativo a p<0.001 ; **En comparación con suero fisiológico En otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar el cáncer. En una modalidad, el cáncer tratado utilizando las proteínas de fusión de la presente invención comprende células cancerosas que expresan RAGE. Por ejemplo, los cánceres que pueden tratarse con la proteína de fusión RAGE de la presente invención, incluyen algunos cánceres de pulmón, algunos gliomas, algunos papilomas, y lo similar. La anfoterina es una proteína que se une al ADN cromosomal no de histona del grupo I de alta movilidad (Rauvala et al, J. Biol. Chem., 262:16625-16635 (1987); Parkikinen et al, J. Biol. Chem. 268:19726-19738 (1993)), que ha mostrado interactuar con el RAGE. Se ha mostrado que la anfoterina fomenta la excreción de neuritas, así como que sirve como una superficie para el montaje de complejos de proteasa en el sistema fibrinolítico (también conocido por contribuir a la movilidad celular). Además, se ha observado un efecto inhibidor del crecimiento del tumor local del RAGE bloqueante en un modelo de tumor primario (glioma C6), el modelo de metástasis de pulmón de Lewis (Taguchi et al, Nature 405:354-360 (2000)), y los papilomas que surgen espontáneamente en ratones que expresan el transgen v-Ha-ras (Leder et al, Proc. Nati. Acad. ScL, 87:9178-9182 (1990)). En aún otra modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar la inflamación. Por ejemplo, en una modalidad alterna, la proteína de fusión de la presente invención se utiliza para tratar la inflamación asociada con la autoinmunidad, la inflamación asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino, la inflamación asociada con la artritis reumatoide, la inflamación asociada con soriasis, la inflamación asociada con esclerosis múltiple, la inflamación asociada con hipoxia, la inflamación asociada con apoplejía, la inflamación asociada con ataque cardiaco, la inflamación asociada con choque hemorrágico, la inflamación asociada con sepsis, la inflamación asociada con el transplante de órganos o la inflamación asociada con una curación disminuida de las heridas. Por ejemplo, después de un tratamiento trombolítico, las células inflamatorias tales como los granulocitos se infiltran en el tejido isquémico y puede producir radicales oxígeno que pueden destruir más células de las que fueron destruidas por la hipoxia. La inhibición del receptor en el neutrófilo responsable de que los neutrófilos sean capaces de infiltrarse en el tejido con los anticuerpos u otros antagonistas de las proteínas, ha mostrado aminorar la respuesta. Puesto que el RAGE es un ligando para este receptor del neutrófilo, una proteína de fusión que contiene un fragmento de RAGE puede actuar como un señuelo y evitar que el neutrófilo circule al sitio reperfundido y evite así una destrucción adicional del tejido. El papel del RAGE en la prevención de la inflamación puede indicarse por estudios que muestran que el sRAGE inhibió la expansión de la neoíntima en un modelo de rata de restenosis después de una lesión arterial tanto en ratas diabéticas como normales, supuestamente inhibiendo la proliferación de las células endoteliales, del músculo liso y la activación del macrófago vía RAGE (Zhou et al, Circulation, 107:2238-2243 (2003)). Además, el sRAGE inhibió los modelos de inflamación, incluyendo la hipersensibilidad del tipo retrasado, la encefalitis autoinmune experimental y la enfermedad inflamatoria del intestino (Hofman et al, Cell, 97:889-901 (1999)). También, en una modalidad, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar trastornos basados en la autoinmunidad. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar la falla del riñon. Así, las proteínas de fusión de la presente invención pueden utilizarse para tratar la nefritis del lupus sistémico o la nefritis del lupus inflamatorio. Por ejemplo, S100/calgranulinas han mostrado comprender una familia de polipéptidos que se unen al calcio estrechamente relacionados, caracterizados por dos regiones de dominio EF, enlazadas a un péptido de conexión (Schafer et al, TIBS, 21 :134-140 (1996); Zimmer et al, Brain Res. Bull., 37:417-429 (1995); Rammes et al, J. Biol. Chem., 272:9496-9502 (1997); Lugering et al, Eur. J. Clin. Invest, 25:659-664 (1995)). Aunque carecen de péptidos de señal, se ha sabido por largo tiempo que Sl OO/calgranulinas ganan acceso al espacio extracelular, especialmente en sitios de respuestas inmunes/inflamatorias crónicas, como en la fibrosis quística y la artritis reumatoide. El RAGE es un receptor de muchos miembros de la familia de S100/calgranulina, que median sus efectos proinflamatorios en las células, tales como los linfocitos y los fagocitos mononucleares. También, los estudios en la respuesta de la hipersensibilidad del tipo retardado, colitis en ratones que carecen de IL-IO, artritis inducida por colágeno y modelos de encefalitis autoinmune experimental, sugieren que la interacción RAGE-ligando (supuestamente con S-100/calgranulinas), tiene un papel proximal en la cascada inflamatoria. Así, en varias modalidades seleccionadas, la presente invención puede proporcionar un método para inhibir la interacción de un AGE con RAGE en un sujeto, administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión de la presente invención. El sujeto tratado utilizando las proteínas de fusión RAGE de la presente invención, puede ser un animal. En una modalidad, el sujeto es un humano. El sujeto puede sufrir de una enfermedad relacionada con AGE, tal como diabetes, complicaciones diabéticas tales como nefropatía, neuropatía, retinopatía, úlcera del pie, amiloidosis, o falla renal e inflamación. O el sujeto puede ser un individuo con la enfermedad de Alzheimer. En una modalidad alterna, el sujeto puede ser un individuo con cáncer. En aún otras modalidades, el sujeto puede sufrir de lupus eritematoso sistémico o nefritis del lupus inflamatorio. Otras enfermedades pueden mediarse por RAGE y por lo tanto, pueden tratarse utilizando las proteínas de fusión de la presente invención. Así, en modalidades alternas adicionales de la presente invención, las proteínas de fusión pueden utilizarse para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, artritis, vasculitis, neuropatías, retinopatías y neuropatías en sujetos humanos o animales. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede comprender una cantidad que es capaz de evitar la interacción de RAGE con un AGE u otros tipos de ligandos de RAGE endógenos en un sujeto. En consecuencia, la cantidad variará con el sujeto siendo tratado. La administración del sujeto puede ser de manera horaria, diaria, semanal, mensual, anual, o como un solo evento. En varias modalidades alternas, la cantidad efectiva de la proteína de fusión puede variar de aproximadamente 1 ng/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 100 µg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad efectiva real puede establecerse mediante ensayos dosis/respuesta utilizando los métodos estándar en la técnica (Johnson et al, Diabetes. 42:1179, (1993)). Así, como se conoce por aquellos en la técnica, la cantidad efectiva puede depender de la biodisponibilidad, bioactividad y biodegradabilidad del compuesto.

Composiciones La presente invención puede comprender una composición que comprende una proteína de fusión de la presente invención, mezclada con un portador farmacéuticamente aceptable. La proteína de fusión puede comprender un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE. En una modalidad, la proteína de fusión puede comprender un sitio de unión al ligando de RAGE. En una modalidad, el sitio de unión al ligando comprende el dominio más N terminal de la proteína de fusión. El sitio de unión al ligando de RAGE puede comprender el dominio V de RAGE, o una porción del mismo. En una modalidad, el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma. En una modalidad, el polipéptido RAGE puede enlazarse a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción (por ejemplo, un fragmento del mismo) de un dominio de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o C 3 de una IgG humana. La proteína o el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano de longitud completa (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ), o un fragmento del RAGE humano. En una modalidad, el polipéptido RAGE no incluye ningún residuo de la secuencia de la señal. La secuencia de la señal de RAGE puede comprender los residuos 1-22 o los residuos 1-23 de RAGE de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ). En modalidades alternas, el polipéptido RAGE puede comprender una secuencia que es 70%, 80% o 90% idéntica a RAGE humano, o un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender RAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O el RAGE humano puede comprender un RAGE de longitud completa con una secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3) (Figuras 1a y 1 b), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. Las proteínas de fusión de la presente invención también pueden comprender un sRAGE (por ejemplo, la SEQ ID NO: 4), un polipéptido 90% idéntico a sRAGE, o un fragmento de sRAGE. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender un sRAGE humano, o un fragmento del mismo, con Glicina como el primer residuo más que una Metionina (véase, por ejemplo, Neeper et al., (1992)). O el RAGE humano puede comprender un sRAGE con la secuencia de la señal eliminada (por ejemplo, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6) (Figura 1 c), o una porción de esa secuencia de aminoácidos. En otras modalidades, la proteína RAGE puede comprender un dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8; Figura 1 D). O puede utilizarse una secuencia 90% idéntica al dominio V o un fragmento del mismo. O la proteína RAGE puede comprender un fragmento de RAGE que comprende una porción del dominio V (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10, Figura 1d). En una modalidad, el sitio de unión al ligando puede comprender la SEQ ID NO: 9, o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10, o una secuencia 90% idéntica a la misma. En aún otra modalidad, el fragmento RAGE es un péptido sintético. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 7), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-116 de RAGE humano (SEQ ID NO: 8), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 124-221 de RAGE humano (SEQ ID NO: 11 ), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C1 de RAGE. En otra modalidad, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 227-317 de RAGE humano (SEQ ID NO: 12), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio C2 de RAGE. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 13), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-123 de RAGE humano (SEQ ID NO: 14), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 17), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-226 de RAGE humano (SEQ ID NO: 18), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 y el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios. O el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 5), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o 24-339 de RAGE humano (SEQ ID NO: 6), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde a sRAGE (es decir, que codifica los dominios V, C1 y C2 y los enlazantes interdominio). O pueden utilizarse fragmentos de cada una de estas secuencias. La proteína de fusión puede incluir varios tipos de péptidos que no se derivan de RAGE o un fragmento del mismo. El segundo polipéptido de la proteína de fusión puede comprender un polipéptido derivado de una inmunoglobulina. La cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los isotipos de cadena pesada conocidos: IgG (?), IgM (µ), IgD (d), IgE (e) o IgA (a). Además, la cadena pesada (o porción de la misma), puede derivarse de cualquiera de los subtipos de la cadena pesada conocidos: lgG1 (?1 ), lgG2 (?2), lgG3 (?3), lgG4 (?4), lgA1 (a1 ), lgA2 (a2), o mutaciones de estos ¡sotipos o subtipos que alteran la actividad biológica. El segundo polipéptido puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana o una porción de cualquiera o ambos de estos dominios. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y CH3 de la lgG1 humana o una porción de la misma, puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. El péptido de inmunoglobulina puede codificarse por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 39 o la SEQ ID NO: 41. La porción Fc de la cadena de inmunoglobulina puede ser proinflamatoria in vivo. Así, en una modalidad, la proteína de fusión RAGE de la presente invención comprende un enlazante interdominio derivado de RAGE más que un polipéptido de articulación interdominio derivado de una inmunoglobulina. Así, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender además un polipéptido RAGE enlazado directamente a un polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o un fragmento de la misma. En una modalidad, el dominio CH2, O un fragmento del mismo comprende la SEQ ID NO: 42. En una modalidad, el polipéptido RAGE comprende un enlazante interdominio de RAGE enlazado a un dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE, de manera que el aminoácido C terminal del dominio de inmunoglobulina de RAGE está enlazado al aminoácido N terminal del enlazante interdominio, y el aminoácido C terminal del enlazante interdominio de RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal de un polipéptido que comprende un dominio C 2 de una inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. El polipéptido que comprende un dominio CH2 de una inmunoglobulina, o una porción del mismo, puede comprender los dominios CH2 y CH3 de una lgG1 humana. Como una modalidad ejemplar, el polipéptido que comprende los dominios CH2 y C 3 de una lgG1 , humana puede comprender la SEQ ID NO: 38 o la SEQ ID NO: 40. La proteína de fusión de la presente invención puede comprender un solo o múltiples dominios de RAGE. También, el polipéptido RAGE que comprende un enlazante interdominio enlazado a un dominio de inmunoglobulina de RAGE puede comprender un fragmento de una proteína RAGE de longitud completa. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión puede comprender dos dominios de inmunoglobulina derivados de una proteína RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. La proteína de fusión puede comprender un primer dominio de inmunoglobulina de RAGE y un primer enlazante interdominio enlazado a un segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE y un segundo enlazante interdominio de RAGE, de manera que el aminoácido N terminal del primer enlazante interdominio está enlazado al aminoácido C terminal del primer dominio de inmunoglobulina de RAGE, el aminoácido N terminal del segundo dominio de ¡nmunoglobulina de RAGE está enlazado a un aminoácido C terminal del primer enlazante interdominio, el aminoácido N terminal del segundo enlazante interdominio está enlazado a un aminoácido C terminal del segundo dominio de inmunoglobulina de RAGE, y el aminoácido C terminal del segundo enlazante interdominio del RAGE está enlazado directamente al aminoácido N terminal del polipéptído que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-251 del RAGE humano (SEQ ID NO: 19), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-251 del RAGE humano (SEQ ID NO: 20), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V, el dominio C1 , el enlazante interdominio que enlaza estos dos dominios, y un segundo enlazante interdominio corriente debajo de C1. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 30 o un fragmento del mismo, puede codificar una proteína de fusión RAGE de cuatro dominios. De manera alterna, una proteína de fusión de tres dominios puede comprender un dominio de inmunoglobulina derivado de RAGE y dos dominios de inmunoglobulina derivados de un polipéptido de Fc humano. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un solo dominio de inmunoglobulina de RAGE enlazado vía un enlazante interdominio de RAGE al aminoácido N terminal del polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 o un fragmento del mismo. Por ejemplo, el polipéptido RAGE puede comprender los aminoácidos 23-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 15), o una secuencia 90% idéntica a la misma, o los aminoácidos 24-136 de RAGE humano (SEQ ID NO: 16), o una secuencia 90% idéntica a la misma, que corresponde al dominio V de RAGE y un enlazante interdominio corriente abajo. En una modalidad, un constructo de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 31 o un fragmento de la misma, puede codificar una proteína de fusión RAGE de tres dominios.

Un fragmento de un enlazante interdominio de RAGE puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural de, y por lo tanto, está enlazada a un dominio de inmunoglobulina de RAGE. Por ejemplo, para el dominio V de RAGE, el enlazante interdominio puede comprender las secuencias de aminoácidos que están corriente debajo de manera natural del dominio V. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 21 , que corresponde a los aminoácidos 117-123 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante interdominio que comprende varios aminoácidos (por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos) corriente arriba y corriente debajo de la SEQ ID NO: 21. Así, en una modalidad, el enlazante interdominio comprende la SEQ ID NO: 23, que comprende los aminoácidos 117-136 de RAGE de longitud completa. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 21 , que suprimen, por ejemplo, 1 , 2 ó 3 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. En modalidades alternas, el enlazante puede comprender una secuencia que es 70% idéntica, u 80% idéntica, o 90% idéntica a la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 23. Para el dominio C1 de RAGE, el enlazante puede comprender una secuencia peptídica que está corriente abajo de manera natural del dominio C1. En una modalidad, el enlazante puede comprender la SEQ ID NO: 22, que corresponde a los aminoácidos 222-251 del RAGE de longitud completa. O el enlazante puede comprender un péptido que tiene porciones adicionales de la secuencia RAGE natural. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazante que comprende varios aminoácidos (1-3, 1-5 ó 1 -10 ó 1 -15 aminoácidos) corriente arriba y corriente debajo de la SEQ ID NO: 22. O pueden utilizarse los fragmentos de la SEQ ID NO: 22, que suprimen, por ejemplo, 1-3, 1-5 ó 1-10 ó 1-15 aminoácidos de cualquier extremo del enlazante. Por ejemplo, en una modalidad, un enlazante interdominio de RAGE puede comprender la SEQ ID NO: 24, que corresponde a los aminoácidos 222-226. O un enlazante interdominio puede comprender la SEQ ID NO: 44, que corresponde a los aminoácidos RAGE 318-342. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender cualquiera de los portadores estándar farmacéuticamente aceptables, conocidos en la técnica. El portador puede comprender un diluyente. En una modalidad, el portador farmacéutico puede ser un líquido y la proteína de fusión o el constructo de ácido nucleico puede estar en la forma de una solución. En otra modalidad, el portador farmacéutícamente aceptable puede ser un sólido en la forma de un polvo, un polvo liofilizado o una tableta. O el portador farmacéutico puede ser un gel, supositorio o una crema. En modalidades alternas, el portador puede comprender un liposoma, una microcápsula, una célula encapsulada en un polímero o un virus. Así, el término portador farmacéuticamente aceptable abarca, de manera no exclusiva, cualquiera de los portadores estándar farmacéuticamente aceptados, tales como agua, alcoholes, solución salina amortiguada con fosfato, azúcares (por ejemplo, sacarosa o manitol), aceites o emulsiones tales como emulsiones aceite/agua o una emulsión de triglicérido, varios tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas recubiertas y cápsulas. La administración de las proteínas de fusión RAGE de la presente invención, puede emplear varias rutas. Así, la administración de la proteína de fusión RAGE de la presente invención puede emplear inyección intraperitoneal (IP). De manera alterna, la proteína de fusión RAGE puede administrarse oralmente, intranasalmente, o como un aerosol. En otra modalidad, la administración es intravenosa (IV). La proteína de fusión RAGE también puede inyectarse subcutáneamente. En otra modalidad, la administración de la proteína de fusión es intraarterial. En otra modalidad, la administración es sublingual. También, la administración puede emplear una cápsula con liberación en el tiempo. En aún otra modalidad, la administración puede ser transrectal, como mediante un supositorio o lo similar. Por ejemplo, la administración subcutánea puede ser útil para tratar trastornos crónicos cuando la autoadministración es deseable. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de una solución inyectable estéril en un solvente o vehículo parenteralmente aceptable no tóxico. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer, 3-butandiol, solución isotónica de cloruro de sodio o amortiguadores acuosos, como por ejemplo, amortiguadores de citrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptables. La solución inyectable puede contener estabilizantes para protegerla contra la degradación química y la formación de agregados. Los estabilizantes pueden incluir antioxidantes tales como hidroxi anisol butilado (BHA), e hidroxi tolueno butilado (BHT), amortiguadores (citratos, glicina, histidina) o tensioactivos (polisorbato 80, poloxámeros). La solución también puede contener conservadores antimicrobianos, tales como alcohol bencílico y parabenos. La solución también puede contener tensioactivos para reducir la agregación, tales como Polisorbato 80, poloxámero u otros tensioactivos conocidos en la técnica. La solución también puede contener otros aditivos, tales como azúcares o suero fisiológico, para ajustar la presión osmótica de las composiciones para sea similar a la sangre humana. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la forma de un polvo liofilizado estéril para la inyección tras la reconstitución con un diluyente. El diluyente puede ser agua para inyección, agua bacteriostática para inyección o suero fisiológico estéril. El polvo liofilizado puede producirse mediante secado por congelación de una solución de la proteína de fusión para producir la proteína en forma seca. Como se conoce en la técnica, la proteína liofilizada generalmente tiene una estabilidad incrementada y una vida útil más larga que una solución líquida de la proteína. El polvo liofilizado (torta), puede contener un amortiguador para ajustar el pH, como por ejemplo, un amortiguador de cítrato, acetato, glicina, histidina, fosfato, tris o succinato fisiológicamente aceptable. El polvo liofilizado también puede contener lioprotectores para mantener su estabilidad física y química. Lo lio protectores utilizados comúnmente son azúcares no reductores y disacáridos tales como sacarosa, manitol o trehalosa. El polvo liofilizado puede contener estabilizantes para protegerlo contra la degradación química y la formación de agregados. Los estabilizantes pueden incluir, de manera no exclusiva, antioxidantes (BHA, BHT), amortiguadores (citratos, glicina, histidina), o tensioactivos (polisorbato 80, poloxámeros). El polvo liofilizado puede contener también conservadores antímicrobianos, tales como alcohol bencílico y parabenos. El polvo liofilizado también puede contener tensioactivos para reducir la agregación, tales como, de manera no exclusiva, Polisorbato 80 y poloxámero. El polvo liofilizado puede contener también aditivos (por ejemplo, azúcares o suero fisiológico), para ajustar la presión osmótica para que sea similar a la sangre humana tras la reconstitución del polvo. El polvo liofilizado también puede contener agentes para aumentar el volumen, tales como azúcares y disacáridos. Las composiciones farmacéuticas para la inyección también pueden estar en la forma de una suspensión oleaginosa. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con los métodos conocidos, utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión descritos anteriormente. Además, se emplean de manera conveniente aceites fijos estériles como el solvente o el medio de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo o blando puede emplearse utilizando mono o diglicéridos sintéticos. También, las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Por ejemplo, los ácidos grasos tales como el ácido oleico encuentran unos en la preparación de los inyectables. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Estas composiciones pueden conservarse por la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en la forma de emulsiones aceite en agua o suspensiones acuosas. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuate, o un aceite mineral, por ejemplo, una parafina líquida, o una mezcla de los mismos. Los agentes emulsificantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo, goma de acacia o goma de tragacanto, fosfátidos naturales, por ejemplo, soya, lecitina y esteres o esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitan, y productos de la condensación de los esteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, polioxietilen sorbitan. Las suspensiones acuosas pueden contener también los compuestos activos en mezcla con los excipientes. Tales excipientes pueden incluir agentes de suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; agentes de dispersión o humectantes, tales como un fosfátido natural tal como lecitina, o productos de la condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilen oxicetanol, o productos de la condensación del óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de la condensación de óxido de etileno con esteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de polietilen sorbitan. Los polvos y granulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua, pueden proporcionar el compuesto activo en mezcla como un agente de dispersión, un agente de suspensión y uno o más conservadores. Los conservadores adecuados, los agentes de dispersión y los agentes de suspensión se describen anteriormente. Las composiciones también pueden estar en la forma de supositorios para la administración rectal de los compuestos de la invención. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias, pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles, por ejemplo. Para uso tópico, pueden utilizarse cremas, ungüentos, jaleas, soluciones o suspensiones que contienen los compuestos de la invención.

Las aplicaciones tópicas pueden incluir lavados bucales y gárgaras. Pueden utilizarse conservadores adecuados, antioxidantes tales como BHA y BHT, dispersantes, tensioactivos o amortiguadores. Los compuestos de la presente ¡nvención también pueden administrarse en la forma de sistemas de suministro de liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas pueden formarse de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención pueden modificarse para retardar además la eliminación de la circulación por las enzimas metabólicas. En una modalidad, los compuestos pueden modificarse por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol (PEG), copolímeros de PEG y polipropilenglicol, polivinilpirrolidona o poliprolina, carboximetil celulosa, dextrano, alcohol polivinílico y lo similar. Tales modificaciones también pueden incrementar la solubilidad del compuesto en solución acuosa. Los polímeros tales como PEG pueden unirse de manera covalente a uno o más residuos de amino, residuos de sulfhidrilo o residuos de carboxilo activos. Numerosas formas activadas de PEG se han descrito, incluyendo los esteres activos de ácido carboxílico o derivados de carbonato, particularmente aquellos en los cuales los grupos salientes son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobencen-3-sulfona para la reacción con los grupos amino, derivados multimodo o de halo acetilo para la reacción con los grupos sulfhidrilo, y derivados de amino hidracina o hidrazida para las reacciones con los grupos carbohidrato. Los métodos adicionales para la preparación de las formulaciones de proteína que pueden utilizarse con las proteínas de fusión de la presente invención, se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,267,958 y 5,567,677. En un aspecto adicional de la presente invención, los moduladores RAGE de la invención, se utilizan en tratamientos terapéuticos adyuvantes o terapéuticos en combinación con otros agentes terapéuticos conocidos. Lo siguiente es una lista no exhaustiva de los adyuvantes y los agentes terapéuticos adicionales que pueden utilizarse en combinación con los moduladores de la proteína de fusión RAGE de la presente invención: Clasificaciones farmacológicas de los agentes anticanceríqenos: 1. Agentes alquilantes: Ciclofosfamida, nitrosoureas, carboplatina, cisplatina, procarbazina 2. Antibióticos: Bleomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina 3. Antimetabolitos: Metotrexato, Citarabina, Fluorouracilo 4. Alcaloides de plantas: Vinblastina, Vincristina, Etopósido, Paclitaxel, 5. Hormonas: Tamoxifeno, Acetato de octreótido, Finasterida, Flutamida 10 6. Modificadores de la respuesta biológica: Interferones, Interleucinas.

Clasificaciones farmacológicas del tratamiento para la Artritis Reumatoide 1. Analgésicos: Aspirina 2. NSAID (Fármacos antiinflamatorios no esteroidales): Ibuprofeno, Naproxeno, Diclofenaco 3. DMARD (Fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad): Metotrexato, preparaciones de oro, hidroxicloroquina, sulfasalazina 4. Modificadores de la respuesta biológica, DMARD: Etanercept, Infliximab, Glucocorticoides Clasificaciones farmacológicas del tratamiento de la Diabetes Mellitus 1. Sulfonilureas: Tolbutamída, Tolazamida, Gliburida, Glipizida 2. Biguanidas: Metformina 3. Agentes orales misceláneos: Acarbosa, Troglitazona 4. Insulina Clasificaciones farmacológicas del tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer 1. Inhibidor de la colinesterasa: Tacrina, Donepezilo 2. Antisicóticos: Haloperidol, Tioridazina 3. Antidepresivos: Desipramina, Fluoxetina, Trazodona, Paroxetina 4. Anticonvulsivos: Carbamazepina, Acido valproico En una modalidad, la presente ¡nvención puede proporcionar por lo tanto, un método para tratar enfermedades mediadas por RAGE, el método comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión RAGE en combinación con agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste de agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de plantas, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, NSAID, DMARD, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de la colinesterasa, antisicóticos, antidepresívos y anticonvulsivos. En una modalidad adicional, la presente invención proporciona la composición farmacéutica de la invención como se describió anteriormente, que comprende además uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste de agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de plantas, antibióticos, hormonas, modificadores de la respuesta biológica, analgésicos, NSAID, DMARD, glucocorticoides, sulfonilureas, biguanidas, insulina, inhibidores de la colinesterasa, antisicóticos, antidepresivo y anticonvulsivos. 1 8 EJEMPLOS Las características y ventajas del concepto inventivo cubierto por la presente invención, se ilustran además en los ejemplos que siguen.

EJEMPLO 1 Producción de las proteínas de fusión RAGE-lgG Fc Se construyeron dos plásmidos para expresar las proteínas de fusión RAGE-lgG Fc. Ambos plásmidos se construyeron ligando diferentes longitudes de una secuencia de ADNc 5' de RAGE humano con la misma secuencia de ADNc 3' de IgG Fc (?1 ) humana. Estas secuencias de expresión (es decir, productos de ligación), se insertaron entonces en el vector de expresión pcADN3.1 (Invitrogen, CA). Las secuencias de ácido nucleico que codifican la región que codifica la proteína de fusión se muestran en las Figuras 2 y 3. Para la proteína de fusión TTP-4000, la secuencia de ácido nucleico de 1 a 753 (resaltada en negrillas), codifica la secuencia de la proteína N terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácidos nucleicos de 754 a 1386, codifica la secuencia de la proteína IgG Fc (Figura 2). Para TTP-3000, la secuencia de ácidos nucleicos de 1 a 408 (resaltada en negrillas), codifica la secuencia de proteína N terminal de RAGE, mientras que la secuencia de ácidos nucleicos de 409 a 1041 , codifica la secuencia de proteína de IgG Fc (Figura 3).

Para producir las proteínas de fusión RAGE, los vectores de expresión que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 30 o la SEQ ID NO: 31 , se transfectaron de manera estable en células CHO. Los transformantes positivos se seleccionaron para la resistencia a la neomicina conferida por el plásmido y se clonaron. Las clonas de alta producción como se detectaron por los análisis Western Blot del sobrenadante se expandieron, y el producto génico se purificó mediante cromatografía por afinidad, utilizando columnas de la Proteína A. La expresión se optimizó de manera que las células producían TTP-4000 recombinante a niveles de aproximadamente 1.3 gramos por litro. Los polipéptidos expresados que codifican las dos proteínas de fusión se ilustran en las Figuras 4-6. Para la estructura de cuatro dominios de TTP-4000, los primeros 251 aminoácidos (mostrados en negrilla en la Figura 4), contienen una secuencia de la señal (1 -22/23), el dominio de inmunoglobulina V (y la unión al ligando) (23/24-116), un segundo enlazante interdominio (117-123), un segundo dominio de inmunoglobulina (C 1 ) (124_221 ), y un segundo enlazante (222-251 ) de la proteína RAGE humana (Figuras 4, 6b). La secuencia de 252 a 461 incluye los dominios de inmunoglobulinas CH2 y CH3 de IgG. Para la estructura de tres dominios de TTP-3000, los primeros 136 aminoácidos (mostrados en negrilla), contienen una secuencia de la señal (1-22/23), el dominio de inmunoglobulina V (y la unión al ligando) (23/24-116) y una secuencia enlazante interdominio (117-136) de la proteína RAGE humana (Figuras 5, 6b). Además, para TT3, la secuencia de 137 a 346 incluye los dominios de inmunoglobulina CH2 y CH3 de IgG.

EJEMPLO 2 Método para probar la actividad de la proteína de fusión RAGE-lgG1 A. Unión al ligando in vitro: Los ligandos de RAGE conocidos, se recubrieron en la superficie de placas Maxisorb a una concentración de 5 microgramos por pozo. Las placas se incubaron a 4°C durante la noche. Después de la incubación del ligando, las placas se aspiraron y se agregó a un amortiguador de bloqueo de BSA al 1 % en amortiguador de imidazol 50 mM (pH 7.2), a las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se aspiraron y/o lavaron con amortiguador de lavado (Imidizol 20 mM, NaCI 150 mM, Tween-20 al 0.05%, CaCI2 5 mM y MgCI2 5 mM, pH 7.2). Se preparó una solución de TTP-3000 (TT3) a una concentración inicial de 1.082 mg/mL y una solución de TTP-4000 (TT4) a una concentración inicial de 370 µg/mL. La proteína de fusión se agregó a diluciones que se incrementan de la muestra inicial. La proteína de fusión RAGE se dejó incubar con el ligando inmovilizado a 37°C durante una hora, después de lo cual la placa se lavó y probó para la unión de la proteína de fusión. La unión se detectó por la adición de un complejo de inmunodetección que contiene lgG1 antihumana de ratón monoclonal diluida a 1 :11 ,000 a una concentración de ensayo final (FAC) de 21 ng/100 µL, una IgG antirratón de cabra biotinilada diluida a 1 :500, a una FAC de 500 ng/µL, y una fosfatasa alcalina enlazada a avidina. El complejo se incubó con la proteína de fusión inmovilizada durante una hora a temperatura ambiente, después de lo cual la placa se lavó y el sustrato de fosfatasa alcalina para el nitrofenilfosfato (PNPP), se agregó. La unión del complejo a la proteína de fusión inmovilizada se cuantificó midiendo la conversión de PNPP a para-nitrofenol (PNP), que se midió espectrofotométricamente a una corrida de 405. Como se ilustra en la Figura 7, las proteínas de fusión TTP-4000 (TT4) y TTP-3000 (TT3) interactúan de manera específica con los ligandos de RAGE conocidos amiloide-beta (Abeta), SlOOb (S100), y anfoterina (Ampho). En la ausencia del ligando, es decir, recubrimiento de BSA solo (BSA o BSA + lavado) no hubo incremento en la absorbancia sobre los niveles atribuibles a la unión no específica del complejo de inmunodetección. En donde se utiliza el amiloide beta como el ligando marcado, puede ser necesario preincubar el amiloide beta antes del ensayo. La preincubacíón puede permitir que el amiloide beta se autoagregue en una forma de hoja plegada, puesto que el amiloide beta puede unirse de manera preferida al RAGE en la forma de una hoja plegada. La evidencia adicional para una interacción específica entre las proteínas de fusión RAGE TTP- 4000 y TTP-3000 con los ligandos de RAGE se ejemplifica en los estudios que muestran que el ligando de RAGE es capaz de competir de manera efectiva con un ligando de RAGE conocido para la unión a las proteínas de fusión. En estos estudios, el amiloide-beta (A-beta) se inmovilizó en una placa Maxisorb y la proteína de fusión se agregó como se describió anteriormente, además, un ligando de RAGE se agregó a algunos de los pozos al mismo tiempo que la proteína de fusión. Se encontró que el ligando de RAGE puede bloquear la unión de TTP-4000 (TT4) por aproximadamente 25% a 30%, en donde TTP-4000 estaba presente a 123 µg/mL (dilución 1 :3, Figura 8). Cuando la solución inicial de TTP-4000 se diluyó por un factor de 10 ó 30 (1 :10 ó 1 :30), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizado se inhibió completamente por el ligando de RAGE. De manera similar, el ligando de RAGE bloqueó la unión de TTP-3000 (TT3) por aproximadamente 50%, en donde TTP- 3000 estaba presenta a 360 µg/mL (dilución 1 :3, Figura 9). Cuando la solución inicial de TTP-3000 se diluyó por un factor de 10 (1 :10), la unión de la proteína de fusión al ligando inmovilizado se inhibió completamente por el ligando de RAGE. Así, la especificidad de la unión de la proteína de fusión RAGE al ligando de RAGE fue dependiente de la dosis. También, como se muestra en las Figuras 8 y 9, esencialmente no hubo unión en la ausencia de la proteína de fusión, es decir, utilizando sólo el complejo de inmunodetección ("Complejo solo").

B. Efecto de las proteínas de fusión RAGE en un ensayo basado en las células El trabajo previo ha mostrado que las células mieloides THP-1 pueden secretar TNF-a en respuesta a los ligandos de RAGE. En este ensayo, las células THP-1 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10% utilizando un protocolo proporcionado por la ATCC. Las células se indujeron para que secretaran TNF-a vía la estimulación de RAGE con OJ mg/ml de Sl OOb, tanto en la ausencia como en la presencia de proteínas de fusión TTP-3000 (TT3) o TTP-4000 (TT4) (10 µg), sRAGE (10 µg), e IgG humana (10 µg) (es decir, como un control negativo). La cantidad de TNF-a secretado por las células THP-1 se midió 24 horas después de la adición de las proteínas al cultivo celular, utilizando un equipo para ELISA comercialmente disponible, para TNF-a (R&D Systems, Mínneapolis, MN). Los resultados en la Figura 10 demuestran que las proteínas de fusión inhiben la producción de TNFa ¡nducida por S1 OOb/RAGE en estas células. Como se muestra en la Figura 10, tras la adición de 10 µg de proteína de fusión RAGE TTP-3000 o TTP-4000, la inducción de TNF-a por Sl OOb (0J mg/ml de FAC) se redujo por aproximadamente 45% a 70%, respectivamente. La proteína de fusión TTP-4000 puede ser al menos tan efectiva en bloquear la inducción de TNFa por SlOOb como en el sRAGE (Figura 10). La especificidad de la inhibición para las secuencias RAGE de TTP-4000 y TTP-3000 se muestra por el experimento en el cual la IgG sola se agrega a células estimuladas con Sl OOb. La adición de IgG y SlOOb al ensayo muestra los mismos niveles de TNF-a como Sl OOb solo. La especificidad de la inhibición de la inducción de TNF-a por TTP-4000 y TTP-3000 para las secuencias RAGE de la proteína de fusión, se muestra por un experimento en el cual la IgG sola se agregó a células estimuladas con Sl OOb. Puede observarse que la adición de IgG, es decir, IgG humana sin la secuencia RAGE (IgG humana de Sigma agregada a 10 µg/pozo), y Sl OOb al ensayo, muestra los mismos niveles de TNF-a como Sl OOb solo.

EJEMPLO 3 Perfil farmacocinético de TTP-4000 Para determinar si la TTP-4000 tendría un perfil farmacocinético superior en comparación con el sRAGE humano, se les proporcionó a ratas y primates no humanos una inyección intravenosa (IV) de TTP-4000 (5mg/kg) y a continuación, el plasma se valoró para la presencia de TTP-4000. En estos experimentos, dos monos machos sin exposición previa recibieron una sola dosis de bolo IV de TTP-4000 (5mg/ml/kg) en una vena periférica, seguido por un lavado con suero fisiológico de aproximadamente 1.0 mililitro (mL). Se recolectaron muestras de sangre (aproximadamente 1.0 mL) a la predosis (es decir, antes de la inyección del TTP-4000), o a 0.083, 0.25, 0.5, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240, 288 y 336 horas posteriores a la dosis en tubos que contienen (heparina con litio). Después de la recolección, los tubos se colocaron en hielo húmedo (máximo 30 minutos) hasta la centrifugación bajo refrigeración (de 2 a 8°C) a 1500 x g durante 15 minutos. Cada muestra de plasma recolectada se almacenó entonces congelada (-70°C ± 10°C) hasta que se probaron para el polipéptido RAGE utilizando un ELISA a varios puntos de medición después de la inyección, como se describió en el Ejemplo 6. El perfil cinético mostrado en la Figura 11 revela que una vez que la TTP-4000 ha saturado sus ligandos, como se evidencia por la pendiente claramente empinada de la fase alfa en 2 animales, mantiene una vida media terminal de más de 300 horas. Esta vida media es significativamente mayor que la vida media del sRAGE humano en plasma (generalmente aproximadamente 2 horas) y proporciona una oportunidad para inyecciones únicas para las indicaciones agudas y semicrónicas. En la Figura 11 , cada curva representa un animal diferente bajo las mismas condiciones experimentales.

EJEMPLO 4 Activación de Fc TTP-4000 Se realizaron experimentos para medir la activación del receptor Fc por la proteína de fusión RAGE TTP-4000 en comparación con la IgG humana. La activación del receptor Fc se midió mediante la secreción de TNF-a de las células THP-1 que expresan el receptor Fc. En estos experimentos, una placa de 96 pozos se recubrió con 10 µg/pozo de TTP-4000 o IgG humana. La estimulación de Fc resulta un la secreción de TNF-a.

La cantidad de TNF-a se midió mediante un Enzimoinmunoanálisis de Adsorción (ELISA). Así, en este ensayo, la línea celular mieloide, THP-1 (ATTC # TIB-202) se mantuvo en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% por las instrucciones de la ATCC. Típicamente, 40,000-80,000 células por pozo se indujeron para secretar TNF-alfa vía la estimulación del receptor Fc, prerrecubriendo el pozo con 10 ug/pozo con TTP-4000 o lgG1 humana agregada con calor (63°C durante 30 minutos). La cantidad de TNF-alfa secretado por las células THP-1 se midió en los sobrenadantes recolectados de cultivos de 24 horas de las células en los pozos tratados, utilizando un equipo para ELISA para TNF comercialmente disponible (R&D Systems, Minneapolis, MN # DTAOOC), para las instrucciones. Los resultados se muestran en la Figura 12, en donde puede observarse que la TTP-4000 genera menos que 2 ng/pozo de TNF y la IgG generó más de 40 ng/pozo.

EJEMPLO 5 Actividad in vivo de la TTP-4000 La actividad de la TTP-4000 se comparó con el sRAGE en varios modelos in vivo de la enfermedad humana. 1 A. TTP-4000 en un modelo animal de restenosis La proteína de fusión RAGE TTP-4000 se evaluó en un modelo de rata diabética de restenosis, que involucró medir la proliferación del músculo liso y la expansión de la íntima 21 días después de la lesión vascular. En estos experimentos, se realizó una lesión con un globo de la arteria carótida común en ratas Zucker diabéticas y no diabéticas, utilizando un procedimiento estándar. Una dosis de carga (3 mg/rata) de IgG, TTP-4000 o suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS) se administró intraperitonealmente (IP) un día antes de la lesión. Se suministró una dosis de mantenimiento cada tercer día hasta 7 días después de la lesión (es decir, en el día 1 , 3, 5 y 7 después de la lesión). La dosis de mantenimiento fue alta = 1 mg/animal para un grupo o baja = 0.3 mg/animal para el segundo grupo. Para medir la proliferación de las células del músculo liso vascular (VSMC), los animales se sacrificaron a los 4 días y los 21 días después de la lesión. Para la medición de la proliferación celular, los animales a los cuatro días recibieron una inyección intraperitoneal de bromodesoxiuridina (BrDdU) 50 mg/kg a las 18, 12 y 2 horas antes de la eutanasia. Después del sacrificio, todas las arterias carótidas izquierda y derecha se recolectaron. Los especímenes de almacenaron en Histochoice durante al menos 24 horas antes de la inclusión. La valoración de la proliferación VSMC se realizó utilizando anticuerpo monoclonal anti-BrdU. Se aplicó un anticuerpo secundario antirratón de cabra marcado con fluorescencia. El número de núcleos positivos a BrdU por sección se contaron por dos observadores con anonimato a los regímenes de tratamiento. Las ratas restantes se sacrificaron en el día 21 para los análisis morfométricos. Los análisis morfométricos se realizaron por un observador con anonimato a los grupos de estudio, utilizando un programa de planimetría digital microscópico digital computarizado Image-Pro Plus en las secciones en serie (separadas 5 mm) de las arterias carótidas teñidas con tinción de Van Gieson. Los datos AU se expresaron como la media ± SD. Los análisis estadísticos se realizaron con el uso del programa SPSS. Las variables continuas se compararon utilizando pruebas t no apareadas. Los valores de P < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Como se observa en las Figuras 13a y 13b, el tratamiento con TTP-4000 redujo de manera significativa la relación íntima/medio y la proliferación de las células del músculo liso vascular de una manera sensible a la dosis. In la Figura 13b, el eje y representa el número de células proliferantes BrdU.

B. TTP4000 en un modelo animal de AD Se realizaron experimentos para evaluar si la TTP-4000 puede afectar la formación de amiloide y la disfunción cognoscitiva en un modelo de ratón de AD. Los experimentos utilizaron ratones transgénicos que expresan la proteína precursora amiloide (APP)del mutante Swedish humano, bajo el control del promotor de la cadena PDGF-B. Con el tiempo, estos ratones generan altos niveles del ligando de RAGE, amiloide beta (Aß). Previamente, el tratamiento con sRAGE durante 3 meses ha mostrado reducir tanto la formación de la placa amiloide en el cerebro como el incremento asociado en los marcadores inflamatorios en este modelo. Los ratones APP (machos) utilizados en este experimento se diseñaron mediante la microinyección del gen APP humano (con las mutaciones Swedish y London) en huevos de ratón bajo el control del promotor del gen de la cadena del factor B de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF-B). Los ratones se generaron en una base C57BL/6 y se desarrollaron por Molecular Therapeutics Inc. Los animales se alimentaron ad limitum y se mantuvieron mediante un apareamiento hermano hermana. Los ratones generados de este constructo desarrollaron depósitos amiloides iniciando a los 6 meses de edad. Los animales se criaron durante 6 meses y a continuación se mantuvieron durante 90 días y se sacrificaron para la cuantificación amiloide. Se les administró a los ratones transgénicos APP el vehículo o TTP4000 cada tercer día [qod (i.p.)] durante 90 días, iniciando a los 6 meses de edad. Al final del experimento, los animales se sacrificaron y se examinaron para la carga de la placa Aß en el cerebro (es decir, número de placas). Un grupo de control APP de 6 meses se utilizó para determinar la línea basal de los depósitos amiloides, además, al final del estudio, los animales se sometieron a un análisis del comportamiento (laberinto de agua de Morris). Los investigadores tenían anonimato a los compuestos del estudio. Las muestras se les dieron a los ratones a 0.25 ml/ratón/cada tercer día. En adición, a un grupo de ratones se le dio 200 ug/día de sRAGE humano. 1. Deposición de Amiloide Beta Para el examen histológico, los animales se anestesiaron con una inyección intraperitoneal (IP) de pentobarbital sódico (50 mg/kg). Los animales se prefundieron transcardiacamente con suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS) a 4°C, seguido por paraformaldehído al 4%. Los cerebros se retiraron y colocaron en paraformaldehído al 4% durante la noche. Los cerebros se procesaron para parafina y se incluyeron. Se obtuvieron diez secciones en serie de 30-µm de espesor a través del cerebro. Las secciones se sometieron a un anticuerpo primario durante la noche a 4°C (anticuerpo del péptido Aß) con el fin de detectar los depósitos amiloides en el cerebro de los animales transgénicos (Guo et al, J. Neurosci., 22:5900-5909 (2002)). Las secciones se lavaron en suero fisiológico amortiguado con Tris (TBS) y se agregó el anticuerpo secundario y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se incubaron como se indica en el equipo del Vector ABC Élite (Vector Laboratories) y se tiñeron con ácido diaminobenzoico (DAB). Las reacciones se detuvieron en agua y se cubrieron con deslizamiento después del tratamiento con xileno. El área amiloide en cada sección se determinó con un sistema de análisis de imágenes asistido por computadora, que consiste de una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta de posesión de serie de bits Quick Capture, una cámara CCD Hitachi montada a un microscopio Olympus y un soporte para la cámara. Se utilizó un Programa NIH Image Analysis, v. 1.55. Las imágenes se capturaron y el área total de amiloide se determinó sobre diez secciones. Un solo operador con anonimato para el estado del tratamiento realizó todas las mediciones. La suma de los volúmenes amiloides de las secciones y la división entre el número total de las secciones se hizo para calcular el volumen amiloide. Para los análisis cuantitativos, se utilizó un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) para medir los niveles de Aß humano total, Aßtota¡ y Aßi. 2 en los cerebros de los ratones transgénicos APP (Biosource International, Camarillo, CA). Aßtotai y Aßi_ 2 se extrajeron de los cerebros de ratón mediante clorhidrato de guamdina y se cuantificaron como se describió por el fabricante. Este ensayo extrae el péptido Aß total del cerebro (tanto soluble como agregado). 2. Función cognoscitiva Se realizó la prueba del laberinto de agua de Morris como sigue: los ratones AU se probaron una vez en la prueba del laberinto de agua de Morris al final del experimento. Los ratones se entrenaron en un laberinto de agua de campo abierto de 1.2 m. La poza se llenó a una profundidad de 30 cm con agua y se mantuvo a 25°C. La plataforma de escape (10 cm cuadrados) se colocó 1 cm debajo de la superficie del agua. Durante los ensayos, la plataforma se retiró de la poza. La prueba con guía se llevó a cabo en la poza rodeada con cortinas blancas para ocultar cualesquier guías adicionales del laberinto. Los animales AU se sometieron a un preentrenamiento no espacial (NSP) durante tres días consecutivos. Estos ensayos son para preparar a los animales para la prueba de comportamiento final para determinar la retención de la memoria para encontrar la plataforma. Estos ensayos no se registraron, sino que fueron para propósitos de entrenamiento únicamente. Para los estudios de entrenamiento y de aprendizaje, las cortinas se retiraron para las guías adicionales del laberinto (esto permitió la identificación de animales con nadado disminuido). En el día 1 , los ratones se colocaron en la plataforma escondida durante 20 segundos (ensayo 1 ), para los ensayos 2-3, los animales se liberaron en el agua a una distancia de 10 cm de la plataforma con guías o la plataforma escondida (ensayo 4) y se dejaron nadar hacia la plataforma. En el segundo día de los ensayos, la plataforma escondida se movió de manera aleatoria entre el centro de la poza o el centro de cada cuadrante. Los animales se liberaron en la poza, orientados de manera aleatoria hacia la pared y se dejaron 60 segundos para alcanzar la plataforma (3 ensayos), en el tercer ensayo, se les dio a los animales tres ensayos, dos con una plataforma escondida y uno con una plataforma con guías. Dos días después de NSP, los animales se sometieron a ensayos del comportamiento finales (prueba del laberinto de agua de Morris). Para estos ensayos (3 por animal), la plataforma se colocó en el centro de un cuadrante de la poza y los animales se liberaron orientados hacia la pared de una manera aleatoria. Se dejó que el animal encontrara la plataforma o nadara durante 60 segundos (periodo de latencia, el tiempo que toma encontrar la plataforma). Los animales AU se probaron en el transcurso de 4-6 horas de la dosificación y se seleccionaron de manera aleatoria para la prueba por un operador con anonimato al grupo de prueba. Los resultados se expresan como la media ± las desviaciones estándar (SD). La significancia de las diferencias en el amiloide y los estudios del comportamiento se analizaron utílizando una prueba t. Las comparaciones se hicieron entre el grupo de control APP de 6 meses de edad y los animales tratados con TTP-4000, así como el grupo tratado con vehículo APP de 9 meses de edad y los animales tratados con TTP-4000. Las diferencias debajo de 0.05 se consideran significativas. Los cambios porcentuales en el amiloide y el comportamiento se determinaron tomando la suma de los datos en cada grupo y dividiendo entre la comparación (es decir, 1 , i.p./control de 6 meses = % de cambio). Las Figuras 14a y 14b muestran que los ratones tratados durante 3 meses con TTP-4000 o sRAGE de ratón tuvieron menos placas Aß y menos disfunción cognoscitiva que los anímales tratados con el vehículo y la lgG1 humana del control negativo (lgG1 ). Estos datos indican que la TTP-4000 es efectiva en reducir la patología AD en un modelo de ratón transgénico. Se encontró también que como el sRAGE, la TTP-4000 puede reducir las citocinas inflamatorias IL-I y TNF-a (datos no mostrados).

C. Eficacia de la TTP-4000 en un modelo animal de apoplejía La TTP-4000 también se comparó al sRAGE en un modelo animal de enfermedad de apoplejía. En este modelo, la arteria carótida media de un ratón se ligó durante 1 hora, seguido por 23 horas de reperfusión, punto en el cual los ratones se sacrificaron y se valoró el área de infarto en el cerebro. Los ratones se trataron con sRAGE o TTP-4000 o inmunoglobulina de control justo antes de la reperfusión. En estos experimentos, C57BL/6 machos se inyectaron con vehículo a 250 µl/ratón o los artículos de prueba TTP (TTP-3000, TTP-4000 a 250 µl/ratón). Los ratones se inyectaron intraperitonealmente, 1 hora después del inicio de la isquemia. Los ratones se sometieron a una hora de isquemia cerebral seguida por 24 horas de reperfusión. Para inducir la isquemia, cada ratón se anestesió y la temperatura corporal se mantuvo a 36-37°C medíante calentamiento externo. La arteria carótida común izquierda (CCA) se expuso a través de una incisión en la línea media en el cuello. Se colocó una pinza microquirúrgica alrededor del origen de la arteria carótida interna (ICA). El extremo distal de la ECA se ligó con seda y se transectó. Una seda 6-0 se ató de manera suelta alrededor del muñón de la ECA. La punta pulida con fuego de una sutura de nylon se insertó suavemente en el muñón de la ECA. El rizo de seda 6-0 se apretó alrededor del muñón y la sutura de nylon se hizo avanzar hacia y a través de la arteria carótida interna (ICA), hasta que descansó en la arteria cerebral anterior, ocluyendo por lo tanto la comunicación anterior y las arterias cerebrales medias. Después de que la sutura de nylon se ha colocado en su lugar durante 1 hora, el animal se volvió a anestesiar, la temperatura rectal se registró y la sutura se eliminó y la incisión se cerró. El volumen del infarto se determinó anestesiando a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg) y a continuación retirando los cerebros. Los cerebros se seccionaron entonces en cuatro secciones de 2-mm a través de la región infartada y se colocaron en cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) al 2% durante 30 minutos. Después, las secciones se colocaron en paraformaldehído al 4% durante la noche. El área del infarto en cada sección se determinó con un sistema de análisis de la imagen asistido por computadora, que consiste de una computadora Power Macintosh equipada con una tarjeta de posesión de la serie de bits Quick Capture, una cámara CCD Hitachi montada en un soporte para la cámara. Se utilizó el Programa NTH Image Analysis, v. 1.55. Las imágenes se capturaron y el área total del infarto se determinó sobre las secciones. Un solo operador con anonimato al estado del tratamiento realizó todas las mediciones. La suma de los volúmenes del infarto de las secciones calculó el volumen total del infarto. Los resultados se expresan como la media ± la desviación estándar (SD). La significancia de la diferencia en los datos del volumen del infarto se analizó utilizando una prueba t. Como se ilustra por los datos en el Cuadro 2, la TTP-4000 fue más eficaz que el sRAGE en limitar el área de infarto en estos animales, sugiriendo que la TTP-4000, debido a su mejor vida media en plasma, fue capaz de mantener una mayor protección en estos ratones.

EJEMPLO 6 Detección de la proteína de fusión RAGE mediante ELISA Inicialmente, 50 uL del anticuerpo monoclonal específico de RAGE IHB101 a una concentración de 10 ug/mL en IX PBS pH 7.3, se recubrieron en placas vía incubación durante la noche. Cuando estaban listas para utilizarse, las placas se lavaron tres veces con 300 uL de amortiguador de lavado de IX Imidazol-Tween y se bloquearon con BSA al 1 %. Las muestras (diluidas) y las diluciones estándar de diluciones conocidas de TTP-4000 se agregaron a 100 uL de volumen final. Las muestras se dejaron incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, las placas se lavan tres veces. Un conjugado de AP de lgG1 1 anti-humana de cabra (Sigma A3312) en IXPBS con BSA al 1 % se agregó y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces. El color se elucidó con paranitrofenilfosfato.

EJEMPLO 7 Cuantificación de la unión del ligando de RAGE a la proteína de fusión RAGE La Figura 15 muestra las curvas de saturación-unión con TTP- 4000 a varios ligandos de RAGE inmovilizados conocidos. Los ligandos se inmovilizaron en una placa de microtítulo y se incubaron en la presencia de concentraciones que se incrementan de proteína de fusión de 0 a 360 nM. Las interacciones proteína de fusión-ligando se detectan utilizando un anticuerpo policlonal conjugado con fosfatasa alcalina que es específico para la porción de IgG de la quimera de fusión. Las Kd relativas se calcularon utilizando un programa Graphpad Prizm y corresponden con los valores establecidos en la literatura de los valores de RAGE-ligando de RAGE. HMGIB = Anfoterina, CML= Carboximetil Lisina, A beta = Amiloide beta 1 -40. Lo anterior se considera como ilustrativo únicamente de lo principal de la invención. Puesto que numerosos cambios y modificaciones se les ocurrirán fácilmente a aquéllos con experiencia en la técnica, no se pretende limitar la invención a las modalidades exactas mostradas y descritas, y todas las modificaciones y equivalentes que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas se consideran dentro del presente concepto inventivo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE.

2.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido RAGE está enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción de un dominio de ¡nmunoglobulina.

3.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el polipéptido comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CR2 O CH3 de una IgG humana.

4.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

5.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 que corresponde a los aminoácidos 24-116 del RAGE humano.

6.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14 que corresponde a los aminoácidos 24-123 del RAGE humano.

7.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18 que corresponde a los aminoácidos 24-226 del RAGE humano.

8.- La proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 que corresponde a los aminoácidos 24-339 del RAGE humano o sRAGE.

9.- Una secuencia aislada de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polípéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE.

10.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el polipéptido RAGE está enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción de un dominio de inmunoglobulina.

11.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque el polipéptido comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o C 3 de una IgG humana.

12.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

13.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende la SEQ ID NO: 25 o un fragmento de la misma.

14.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende la SEQ ID NO: 26 o un fragmento de la misma.

15.- La secuencia aislada de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende la SEQ ID NO: 28 o un fragmento de la misma.

16.- Una composición, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión RAGE en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la proteína de fusión RAGE comprende un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el polipéptido RAGE está enlazado a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción de un dominio de inmunoglobulina.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque el polipéptido comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 O CH3 de una IgG humana.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 que corresponde a los aminoácidos 24-116 del RAGE humano.

21.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la proteína de fusión RAGE se formula como una solución inyectable.

22.- La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la proteína de fusión RAGE se formula como un polvo liofilizado estéril.

23.- Un método para hacer una proteína de fusión RAGE, que comprende el paso de enlazar de manera covalente un polipéptido RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en donde el polipéptido RAGE comprende un sitio de unión al ligando de RAGE.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el polipéptido RAGE enlazado y el segundo polipéptido que no es RAGE se codifican por un constructo de ADN recombinante.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende el paso de incorporar el constructo de ADN en un vector de expresión.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende insertar el vector de expresión en una célula hospedera.

27.- Un método para la detección de moduladores de RAGE, que comprende: (a) proporcionar una proteína de fusión que comprende un polipéptido RAGE que comprende un sitio de unión al ligando de RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE; (b) mezclar un compuesto de interés y un ligando que tiene una afinidad de unión conocida para el RAGE con la proteína de fusión; y (c) medir la unión del ligando de RAGE conocido a la proteína de fusión RAGE, en la presencia del compuesto de interés.

28.- Un equipo para la detección de moduladores de RAGE, que comprende: (a) un compuesto que tiene una afinidad de unión conocida al RAGE como un control positivo; (b) una proteína de fusión RAGE que comprende un polipéptido RAGE que comprende un sitio de unión al ligando de RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE; y (c) instrucciones para el uso.

29.- El uso de un polipéptido que comprende un polipéptido RAGE que comprende un sitio de unión al ligando de RAGE enlazado a un segundo polipéptido que no es RAGE, en la elaboración de un medicamento útil para tratar un trastorno mediado por RAGE en un sujeto.

30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el polipéptido RAGE está enlazada a un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina o una porción de un dominio de inmunoglobulina.

31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde el polipéptido comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende al menos una porción de al menos uno de los dominios CH2 o C 3 de una IgG humana.

32.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el sitio de unión al ligando de RAGE comprende la SEQ ID NO: 9 o una secuencia 90% idéntica a la misma, o la SEQ ID NO: 10 o una secuencia 90% idéntica a la misma.

33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el polipéptido RAGE comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 que corresponde a los aminoácidos 24-116 del RAGE humano.

34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento está adaptado para ser intravenosamente administrable al sujeto.

35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento está adaptado para ser intraperitonealmente administrable al sujeto.

36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento está adaptado para ser subcutáneamente administrable al sujeto.

37.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar un síntoma de la diabetes o un síntoma de las complicaciones diabéticas tardías.

38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el síntoma de la diabetes o las complicaciones diabéticas tardías comprenden nefropatía diabética.

39.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el síntoma de la diabetes o las complicaciones diabéticas tardías comprenden retinopatía diabética.

40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el síntoma de la diabetes o las complicaciones diabéticas tardías comprenden una úlcera del pie diabético.

41.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el síntoma de la diabetes o las complicaciones diabéticas tardías comprenden una complicación cardiovascular.

42.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 37, en donde el síntoma de la diabetes o las complicaciones diabéticas tardías comprenden neuropatía diabética.

43.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la amiloidosis.

44.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la enfermedad de Alzheimer.

45.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar el cáncer.

46.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la autoinmunidad.

47.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la enfermedad inflamatoria del intestino.

48.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la artritis reumatoide.

49.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la soriasis.

50.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la esclerosis múltiple.

51.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la hipoxia.

52.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la apoplejía.

53.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con el ataque cardiaco.

54.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con el choque hemorrágico.

55.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la sepsis.

56.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con el transplante de órganos.

57.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la inflamación asociada con la curación disminuida de las heridas.

58.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde el medicamento es útil para tratar la falla del riñon.