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JP2019522653A - Antibody drug conjugate platform using bispecific antibodies - Google Patents

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JP2019522653A JP2018566900A JP2018566900A JP2019522653A JP 2019522653 A JP2019522653 A JP 2019522653A JP 2018566900 A JP2018566900 A JP 2018566900A JP 2018566900 A JP2018566900 A JP 2018566900A JP 2019522653 A JP2019522653 A JP 2019522653A
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キム，スヒョン
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Abstract

本発明は、二重特異性抗体を用いた抗体薬物複合体及びその用途に関する。本発明の抗体薬物複合体は、二価のコチニン−ペプチド及び薬物の接合体と抗コチニン一本鎖可変切片との結合によって、多段階の合成過程なく抗体と薬物との複合体を容易に形成することができる。また、本発明の抗体薬物複合体は、抗体が特異的に結合する標的に薬物を効果的に伝達することができ、体内薬物の半減期を増進させて治療効果を向上させることができる。  The present invention relates to antibody drug conjugates using bispecific antibodies and uses thereof. The antibody-drug conjugate of the present invention easily forms a complex between an antibody and a drug without a multi-step synthesis process by binding a bivalent cotinin-peptide and drug conjugate to an anti-cotinine single-chain variable section. can do. In addition, the antibody-drug conjugate of the present invention can effectively deliver the drug to the target to which the antibody specifically binds, and can increase the half-life of the in-vivo drug and improve the therapeutic effect.

Description

発明の詳細な説明Detailed Description of the Invention

［技術分野］
本発明は、二重特異性抗体を用いた抗体薬物複合体及びその用途に関する。 [Technical field]
The present invention relates to antibody drug conjugates using bispecific antibodies and uses thereof.

本出願は、２０１６年６月２１日出願の米国仮出願第６２／３５２，８０４号に基づく優先権を主張し、該当出願の明細書及び図面に開示された内容は、すべて本出願に援用される。
［背景技術］
抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗癌剤の新たな種類として抗原発現腫瘍細胞に細胞毒性製剤を選択的に伝達するために開発された。従来のＡＤＣは、高い適用性及び部位特異的な結合方法を使用するといった多くの長所がある。しかし、抗体に細胞毒性製剤を連結するためには多段階の結合法が必要となり、個々の抗体を最適化する過程が求められ、ＡＤＣの使用に困難がある。 This application claims priority based on US Provisional Application No. 62 / 352,804, filed June 21, 2016, the entire contents of which are disclosed in the specification and drawings of this application. The
[Background technology]
Antibody drug conjugates (ADCs) have been developed as a new class of anticancer drugs to selectively deliver cytotoxic drugs to antigen-expressing tumor cells. Conventional ADCs have many advantages such as high applicability and use of site-specific binding methods. However, in order to link a cytotoxic preparation to an antibody, a multi-step binding method is required, and a process for optimizing individual antibodies is required, which makes it difficult to use an ADC.

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、ＥｒｂＢ系に属する受容体チロシンキナーゼである。ＥＧＦＲの過発現は、頭頸部がん、結腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、脳腫瘍または膀胱がんなどの多様な人間の癌から頻繁に観察される。癌治療の目的としてＥＧＦＲ信号を遮断するために、下記の二つの薬理学的接近法が用いられてきた：単一クローン抗体であるセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）（Ｅｒｂｉｔｕｘ）及びパニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）と、小分子チロシンキナーゼ抑制剤であるゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）（Ｉｒｅｓｓａ）及びエルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）（Ｔａｒｃｅｖａ）。しかし、ＥＧＦＲ及びこのダウンストリームシグナリング分子のいくつかの突然変異は、ＥＧＦＲ標的治療における臨床反応が低く、治療が困難であった。例えば、ＫＲＡＳ突然変異は、ＥＧＦＲ陽性癌へのＥＧＦＲ標的治療において一次抵抗性に重要な役割を果たす。ＫＲＡＳ突然変異は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の２５％及び結腸がんの３９％で発見される。ＫＲＡＳが人間の癌のうち最もよく発病する癌遺伝子異常の一つであることがよく知られているが、ＫＲＡＳ突然変異を有するＥＧＦＲ陽性癌を効果的に診断及び治療する方法の開発は充分でない実情である。   Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a receptor tyrosine kinase that belongs to the ErbB system. EGFR overexpression frequently occurs from a variety of human cancers such as head and neck cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, brain tumor or bladder cancer. Observed. The following two pharmacological approaches have been used to block the EGFR signal for cancer treatment purposes: the single clone antibodies cetuximab (Erbitux) and panitumumab (Vectibix) and Gefitinib (Iressa) and erlotinib (Tarceva), small molecule tyrosine kinase inhibitors. However, several mutations of EGFR and this downstream signaling molecule have been difficult to treat due to poor clinical response in EGFR targeted therapy. For example, KRAS mutations play an important role in primary resistance in EGFR targeted therapy for EGFR positive cancer. KRAS mutations are found in 25% of non-small cell lung cancer (NSCLC) and 39% of colon cancer. Although KRAS is well known to be one of the most common oncogene abnormalities among human cancers, the development of a method for effectively diagnosing and treating EGFR-positive cancers with KRAS mutations is not sufficient It is a fact.

一方、ＡＤＣは、ＫＲＡＳ変異を有するＥＧＦＲ陽性癌にも効果的であり得る。ＡＤＣは、リンカーによって単一クローン抗体に細胞毒性製剤を架橋結合することで製造することができる。ＡＤＣは、従来の抗体または非特異的細胞毒性製剤が有する治療の限界を乗り越えることができる。例えば、二つのＡＤＣであるブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）（Ａｄｃｅｔｒｉｓ）及びトラスツズマブエムタンシン（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）（Ｋａｄｃｙｌａ）は、食品医薬品局（ＦＤＡ）からリンパ腫及びヒト上皮細胞増殖因子受容体２型（Ｈｅｒ２）陽性転移性乳がんの治療剤として各々承認を得た。   On the other hand, ADCs can also be effective for EGFR positive cancers with KRAS mutations. ADC can be produced by cross-linking a cytotoxic preparation to a single clonal antibody via a linker. ADC can overcome the therapeutic limitations of conventional antibodies or non-specific cytotoxic preparations. For example, two ADCs, brentuximab vedotin (Adcetris) and trastuzumab emtansine (Kadcyla), have been developed from the Food and Drug Administration (FDA) for lymphoma and human epidermal growth factor receptor type 2. (Her2) Each was approved as a therapeutic agent for positive metastatic breast cancer.

小分子と抗体との通常の結合は、リシン残基のε−アミノ酸鎖またはシステイン残基上の酸素が除去された鎖間のジスルフィド結合を用いる。非特異的な結合は、可変薬物に対する抗体の割合（ＤＡＲ）及び接合部位の位置を有するＡＤＣの異種混合を生成する。このような異質性は、ＡＤＣの溶解度、安定性、薬物動態及び配置変化に影響を及ぼす。   Normal binding between small molecules and antibodies uses disulfide bonds between ε-amino acid chains of lysine residues or chains from which oxygen on cysteine residues has been removed. Non-specific binding produces a heterogeneous mixture of ADCs with the ratio of antibody to variable drug (DAR) and the location of the junction site. Such heterogeneity affects ADC solubility, stability, pharmacokinetics, and configuration changes.

このようなＡＤＣの異質性を回避するために、システインまたは非天然アミノ酸残基を意図的に導入するか、または酵素接合方法を用いた部位特異的な結合方法が研究された。また、ＡＤＣの結合活性、安全性及び結合効率は、結合部位によって影響を受ける。そこで、前記ＡＤＣの特性を最大化するためには、適切な結合残基を探し、これを各抗体に最適化させる段階が必要である。通常、ＡＤＣは、多段階の複合体結合過程、または、最終生産物の検証のための精巧な分析が求められる。その結果、部位特異的結合を用いる従来のＡＤＣの開発が容易でなかった。
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、従来の抗体薬物複合体の短所を解消した新たな抗体薬物複合体プラットホームを提供することを目的とする。 In order to avoid such heterogeneity of ADCs, site-specific binding methods have been studied, either intentionally introducing cysteine or unnatural amino acid residues or using enzyme conjugation methods. In addition, the binding activity, safety and binding efficiency of the ADC are affected by the binding site. Thus, in order to maximize the properties of the ADC, it is necessary to find an appropriate binding residue and optimize it for each antibody. ADCs usually require a multi-step complex binding process or elaborate analysis for verification of the final product. As a result, it has been difficult to develop a conventional ADC using site-specific binding.
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a new antibody-drug conjugate platform that eliminates the disadvantages of conventional antibody-drug conjugates.

また、本発明は、前記抗体薬物複合体プラットホームを含む薬学的組成物及びこれを用いた疾病の治療方法を提供することを他の目的とする。
［課題を解決するための手段］
本発明は、抗コチニン一本鎖可変切片 （ｓｃＦｖ）を含む二重特異性抗体と、ペプチドと架橋結合した二価のコチニン及び薬物の接合体と、を含む抗体薬物複合体プラットホームを提供する。 Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the antibody-drug conjugate platform and a method for treating a disease using the same.
[Means for solving problems]
The present invention provides an antibody drug conjugate platform comprising a bispecific antibody comprising an anti-cotinine single chain variable section (scFv) and a bivalent cotinine and drug conjugate cross-linked to a peptide.

本発明の発明者は、従来の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が多段階の結合過程及び抗体の最適化を要する短所を解決するための鋭意研究の結果、ヒトＥＧＦＲ及びハプテン（ｈａｐｔｅｎ）が結合した細胞毒性製剤にともに同時結合する４価の二重特異性抗体を用いる新しい抗体薬物複合体プラットホームを開発した。   The inventor of the present invention, as a result of intensive studies to solve the disadvantages of conventional antibody-drug conjugates (ADCs) that require multi-step binding processes and antibody optimization, human EGFR and hapten were bound. A new antibody-drug conjugate platform has been developed that uses a tetravalent bispecific antibody that binds simultaneously to a cytotoxic agent.

先ず、本発明者は、従来に報告された４価の二重特異性抗体フォーマットを選択し、ヒトＥＧＦＲ及びコチニン（ｃｏｔｉｎｉｎｅ）に反応する二重特異性抗体を開発した。本発明の二重特異性抗体は、コチニンとの複合体の形成のために抗コチニンｓｃＦｖを用いた。コチニンは、ニコチンの主要代謝産物であり、これは、外因性、生理学的不活性及び非毒性のため、臨床接近法において理想的なハプテンとして用いられ得る。   First, the present inventor selected a tetravalent bispecific antibody format reported in the past, and developed a bispecific antibody that reacts with human EGFR and cotinine. The bispecific antibody of the present invention used anti-cotinine scFv for the formation of a complex with cotinine. Cotinine is the major metabolite of nicotine, which can be used as an ideal hapten in clinical access due to its exogenous, physiological inactivity and non-toxicity.

本発明の一実施例において、本発明二重特異性抗体（ＥＲＣ６）は、ヒトＥＧＦＲ結合抗体であるセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）を含んで形成される。その後、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）が架橋結合した二価のコチニン結合ペプチド（コチニン−デュオカルマイシン）を製造し、前記二重特異性抗体との混合によって抗体薬物複合体を形成した。結果的に、本発明の発明者は、二重特異的セツキシマブ×抗コチニン抗体を含む四価の複合体及びデュオカルマイシンで架橋結合した二価のコチニン結合ペプチド（コチニン−デュオカルマイシン）からなる抗体薬物複合体プラットホームを開発した（図１ａ）。前記本発明の抗体薬物複合体プラットホームは、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルの両方ともＫＲＡＳ突然変異を有するＥＧＦＲ−陽性セツキシマブ難治性肺腺がん（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）に対して著しい抗腫瘍活性を示した。このような実験結果は、二重特異性抗体を用いる本発明のＡＤＣプラットホームが、癌のような疾病の治療に有用な伝達道具になれることを意味する。   In one embodiment of the invention, a bispecific antibody (ERC6) of the invention is formed comprising cetuximab, a human EGFR binding antibody. Thereafter, a bivalent cotinin-binding peptide (cotinin-duocarmycin) cross-linked with duocarmycin was produced, and an antibody-drug conjugate was formed by mixing with the bispecific antibody. As a result, the inventors of the present invention consist of a tetravalent complex comprising bispecific cetuximab × anti-cotinine antibody and a bivalent cotinin-binding peptide (cotinin-duocarmycin) cross-linked with duocarmycin. An antibody drug conjugate platform was developed (FIG. 1a). The antibody drug conjugate platform of the present invention is a significant anti-EGFR against EGFR-positive cetuximab refractory lung adenocarcinoma with KRAS mutations in both in vitro and in vivo models. Tumor activity was demonstrated. Such experimental results mean that the ADC platform of the present invention using bispecific antibodies can be a useful transmission tool for the treatment of diseases such as cancer.

本発明の二重特異性抗体の抗コチニンｓｃＦｖは、薬物が接合した二価のコチニン−ペプチドの二価のコチニンと特異的に結合して抗体薬物複合体を成し得る。前記抗コチニンｓｃＦｖのヌクレオチド配列は、配列番号１の重鎖及び配列番号２の軽鎖からなり得る。また、前記抗コチニンｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖からあり得る。また、前記抗コチニンｓｃＦｖの重鎖と軽鎖配列との間にはアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１〜５の整数である。）、望ましくは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４が挿入され得る。これによって、発現された抗コチニンｓｃＦｖが抗原抗体反応を適切に行うように助けることができる。 The anti-cotinine scFv of the bispecific antibody of the present invention can specifically bind to the bivalent cotinin of the bivalent cotinin-peptide conjugated with the drug to form an antibody drug complex. The nucleotide sequence of the anti-cotinin scFv can consist of a heavy chain of SEQ ID NO: 1 and a light chain of SEQ ID NO: 2. The amino acid sequence of the anti-cotinin scFv may be from the heavy chain of SEQ ID NO: 3 and the light chain of SEQ ID NO: 4. Further, an amino acid sequence (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n (n is an integer of 1 to 5) between the heavy chain and light chain sequence of the anti-cotinin scFv, preferably ( Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 4 can be inserted. This can help the expressed anti-cotinine scFv to properly perform the antigen-antibody reaction.

望ましくは、本発明の二重特異性抗体は、グリシン及びセリンが豊富なペプチドリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１〜５の整数である。）、望ましくは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３をＣＨ３ドメインと抗コチニンｓｃＦｖとの間に挿入し得る。これによって、本発明の二重特異性抗体は、柔軟性が向上する。 Desirably, the bispecific antibody of the present invention is a peptide linker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n (n is an integer of 1 to 5) rich in glycine and serine. (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 can be inserted between the C H 3 domain and the anti-cotinine scFv. This improves the flexibility of the bispecific antibody of the present invention.

本発明において、前記二価のコチニンは、二つのコチニンが６〜１８ｍｅｒ ペプチドのＮ末端及びＣ末端に各々架橋結合したものであり得る。望ましくは、前記コチニン及びペプチドの結合時、コチニンは、カルボキシコチニン（トランス−４−コチニンカルボキシル酸）であってもよく、そのカルボキシル基によって前記ペプチドとの架橋結合が効果的に行われ得る。   In the present invention, the divalent cotinin may be one in which two cotinins are cross-linked to the N-terminus and C-terminus of the 6-18mer peptide, respectively. Desirably, at the time of binding of the cotinine and the peptide, the cotinin may be carboxycotinine (trans-4-cotinine carboxylic acid), and the cross-linking with the peptide can be effectively performed by the carboxyl group.

本発明において、前記二つのコチニンと架橋結合するペプチドは、６〜１８ｍｅｒ長さのペプチドが使われ得る。前記ペプチドは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）及びリシン（Ｋ）などからなる群より選択されたいずれか一種以上からなり得る。望ましくは、前記ペプチドは、ＧＳＫＧＳＫ、ＧＧＧＧＳＫＧＧＧＧＳＫ、ＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫ、またはＧＧＧＳＧＧＧＳＫＧＧＧＳＧＧＧＳＫなどが使われ得る。より望ましくは、前記ペプチドは、ＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫが使われ得、これは本発明の薬物、例えば、デュオカルマイシンと安定的に接合し得る。   In the present invention, a peptide having a length of 6 to 18 mer may be used as the peptide that cross-links with the two cotinins. The peptide may be composed of one or more selected from the group consisting of glycine (G), serine (S), lysine (K), and the like. Preferably, GSKGGSK, GGGGGSKGGGGSK, GSKGGSKGGSKK, or GGGSGGGSKGGGSGGSK may be used as the peptide. More preferably, the peptide may be GSKGGSKGSKGSKK, which can be stably conjugated with a drug of the present invention, such as duocarmycin.

本発明において、前記二価のコチニンと薬物との接合は、二価のコチニンと架橋結合した６〜１８ｍｅｒペプチドにおいて、リシン残基のε−アミノ基と薬物との接合によって行われ得る。   In the present invention, the divalent cotinine and the drug can be joined by joining the ε-amino group of the lysine residue and the drug in a 6-18mer peptide cross-linked with the divalent cotinine.

本発明の抗体薬物複合体に用いられ得る薬物は、細胞毒性製剤であるデュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、アウリスタチン（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、コルヒチン（Ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、アントラサイクリン（Ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、カリケアマイシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、メイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ピロロベンゾジアゼピン（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ドラスタチン（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）、ツブリシン（Ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、メイタンシノイド（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、クリプトフィシン（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｉｎ）、エポチロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、サフラニン（Ｓａｆｒａｎｉｎ）、デアセチルコルヒチン（Ｄｅａｃｅｔｙｌ ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、メイタンシノール（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）、ベドチン（Ｖｅｄｏｔｉｎ）、マホドチン（Ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、エムタンシン（Ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、メルタンシン（Ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ラブタンシン（Ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ソラブタンシン（Ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、タリリン（Ｔａｌｉｒｉｎｅ）、テシリン（Ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、インドリノベンゾジアゼピン（Ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）、イリノテカンプロドラッグ（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ ｐｒｏｄｒｕｇ）、エキサテカン誘導体（Ｅｘａｔｅｃａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）及びツブリン阻害剤（Ｔｕｂｕｌｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）などからなる群より選択されたいずれか一種であり得る。望ましくは、本発明の抗体薬物複合体は、デュオカルマイシンまたはエムタンシンを含み得る。前記デュオカルマイシンは、強力なＤＮＡアルキル化活性によって癌細胞の死滅に効果的な細胞毒性薬物として用いられ得る。例えば、デュオカルマイシンがペプチドと結合して薬物接合体をなすとき、四つのバリン（ｖａｌｉｎｅ）−シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）ＰＡＢ連結されたジメチルアミノエチルデュオカルマイシンの形態で用いられ得る。また、例えば、エムタンシンがペプチドと結合して薬物接合体をなすとき、ＭＣＣ（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）リンカーを介して連結され得る。本発明の実験例においては、デュオカルマイシン（図３ｅ）またはエムタンシン（図６ｂ）が含まれた抗体−薬物複合体の癌細胞に対する細胞毒性を実験した結果、二つの場合ともＡ５４９細胞に対して著しい抑制活性を示した。このような結果から、本発明の抗体薬物複合体プラットホームは、前記のような多様な薬物と結合可能な多用性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）を有することが分かる。   Drugs that can be used in the antibody drug conjugates of the present invention include the cytotoxic drugs duocarmycin, auristatin, colchicine, anthracycline, calicheamicin, Maytansinoid, Pyrrolobenzodiazepine, Dolastatin, Tubulisin, Maytansinoid, Doxorubicin, Doxorubicin, Doxorubicin ), Deacetyl colchicine (Deacetyl colchicine), maytansinol (Maytansinol), vedotin (Mafodotin), emtansine (Emtansine), mertansine (Mertansine), v ), Tesirine, Indolinobenzodiazepine (Indolinobenzodiazepines), Irinotecan prodrug (Irinotecan prodrug), Exatecan derivative (Exatecan derivative) and Tubulin inhibitor (Tubulin inhibitor) It can be any one type selected. Desirably, the antibody drug conjugate of the present invention may comprise duocarmycin or emtansine. The duocarmycin can be used as an effective cytotoxic drug for killing cancer cells due to its powerful DNA alkylating activity. For example, when duocarmycin binds to a peptide to form a drug conjugate, it can be used in the form of four valine-citrulline PAB-linked dimethylaminoethyl duocarmycins. Also, for example, when emtansine binds to a peptide to form a drug conjugate, it can be linked via an MCC (maleidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) linker. In the experimental example of the present invention, the cytotoxicity of antibody-drug conjugates containing duocarmycin (FIG. 3e) or emtansine (FIG. 6b) to cancer cells was examined. It showed significant inhibitory activity. From these results, it can be seen that the antibody-drug conjugate platform of the present invention has versatility capable of binding to various drugs as described above.

また、本発明の抗体薬物複合体に使用可能な薬物は、癌を発生させる遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであり得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡは、Ｍｃｌ−１、Ｗｎｔ−１、Ｈｅｃ１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、Ｌｉｖｉｎ、Ｂｃｌ−２、ＸＩＡＰ、Ｍｄｍ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＧＡＳＣ１、ＩＧＦ１Ｒ、Ａｋｔ１、Ｇｒｐ７８、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５ａ、β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＷＩＳＰ１、ｃ−ｍｙｃ、ＲＲＭ２、ＫＳＰ、ＰＫＮ３、ＰＬＫ１、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ及びＥＰＨＡ２などからなる群より選択されたいずれか一種以上の遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡより選択され得る。本発明において、ｓｉＲＮＡは、リボ核酸媒介の干渉現象（ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）によって癌細胞で発現される特定遺伝子の発現を抑制して癌細胞を死滅するため、これを含む抗体薬物複合体は、優れた抗癌剤として用いることができる。   The drug that can be used in the antibody-drug conjugate of the present invention can be siRNA that suppresses the expression of a gene that causes cancer. For example, the siRNA includes Mcl-1, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, GASC1, IGF1R, Akt1, Grp78, STAT3, STAT5a, β- It can be selected from siRNAs that suppress the expression of any one or more genes selected from the group consisting of catenin, WISP1, c-myc, RRM2, KSP, PKN3, PLK1, KRAS, MYC and EPHA2. In the present invention, siRNA suppresses the expression of a specific gene expressed in cancer cells by ribonucleic acid-mediated interference phenomenon (RNA-mediated interference, RNAi) and kills cancer cells, so that an antibody drug complex containing the siRNA Can be used as an excellent anticancer agent.

本発明において、ｓｉＲＮＡ及びコチニン−ペプチドの接合は、リンカーを介して行われ得る。これによって、本発明の抗体−薬物複合体は、多様な種類のｓｉＲＮＡを複合体に結合できる多用性を有する。例えば、前記リンカーは、ＳＭＣＣ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｔｒａｎｓ−４−（ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ） リンカーまたはバリン−シトルリンＰＡＢリンカーであり得る。具体的に、ｓｉＲＮＡがＳＭＣＣリンカーを介してコチニン−ペプチドに結合する場合、ｓｉＲＮＡの５’または３’末端を変形してＳＭＣＣリンカーに架橋結合させ、これをコチニン−ＧＳＣＧＳＣＧＳＣＧＳＣＫ−コチニンに接合することができる（Ｃ＝システイン）。または、ｓｉＲＮＡがバリン−シトルリンＰＡＢリンカーを介してコチニン−ペプチドに結合する場合、ｓｉＲＮＡを前記リンカーを介してコチニン−ＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫ−コチニンに接合することができる。   In the present invention, siRNA and cotinine-peptide conjugation can be performed via a linker. Accordingly, the antibody-drug complex of the present invention has versatility that can bind various types of siRNAs to the complex. For example, the linker may be a SMCC (succinimidyl trans-4- (maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carboxylate) linker or a valine-citrulline PAB linker. Specifically, when siRNA is bound to a cotinine-peptide via an SMCC linker, the 5 ′ or 3 ′ end of the siRNA may be modified and cross-linked to the SMCC linker, which may be joined to cotinine-GSCGSCGSSCGSCK-cotinine. Yes (C = cysteine). Alternatively, when siRNA is bound to a cotinine-peptide via a valine-citrulline PAB linker, the siRNA can be conjugated to cotinine-GSKGSKGGSKKK-cotinine via the linker.

本発明の抗体薬物複合体に含まれる二重特異性抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ゲムツズマブ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブ（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、バダスツキシマブ（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブ（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブ（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ）、デニンツズマブ（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、エンフォーツマブ（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ）、テリソツズマブ（Ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ）、チソツマブ（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ）、ピナツズマブ（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ）、リファスツズマブ（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ）、インデュサツマブ（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ）、バンドルツズマブ（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ）、ソフィツズマブ（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ）、ボルセツズマブ（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブ（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ）、コルツキシマブ（Ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ）、ナラツキシマブ（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ）、インダツキシマブ（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ）、アネツマブ（Ａｎｅｔｕｍａｂ）、ロルボツズマブ（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ）、カンツズマブ（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ）、ラプリツキシマブ（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビバツズマブ（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ）、バダスツキシマブ（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ）、ロバルピツズマブ（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ）、イノツズマブ（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、サシツズマブ（Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ルパルツマブ（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ）及びアプルツマブ（Ａｐｒｕｔｕｍａｂ）などからなる群より選択されたいずれか一種を含み得る。望ましくは、本発明の抗体薬物複合体は、ヒトＥＧＦＲ結合抗体であるセツキシマブを含み得る。セツキシマブは、非小細胞肺がん、転移性結腸がんまたは頭頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）の治療のためにＦＤＡによって臨床的に承認された単一クローン抗体である。セツキシマブのヌクレオチド配列は、配列番号５の重鎖配列及び配列番号６の軽鎖配列からなり得る。また、セツキシマブのアミノ酸配列は、配列番号７の重鎖配列及び配列番号８の軽鎖配列からなり得る。   Bispecific antibodies included in the antibody drug conjugates of the present invention include cetuximab, trastuzumab, oregovomab, edrecolomab, alemtuzumab, albetumab, labetumab ), Ibritumomab (Ibritumomab), ofatumumab (Ofatumumab), panitumumab (Panitumumab), rituximab (Rituximab), toxitumumab (Tositimab), ipilimumab (Ipitumumab) adastuximab), Guremubatsumumabu (Glembatumumab), Depatsukishizumabu (Depatuxizumab), Poratsuzumabu (Polatuzumab), Denintsuzumabu (Denintuzumab), Enfotsumabu (Enfortumab), Terisotsuzumabu (Telisotuzumab), Chisotsumabu (Tisotumab), Pinatsuzumabu (Pinatuzumab), Rifasutsuzumabu (Lifastuzumab), Indeyusatsumabu ( Indusatumab, Bundletuzumab, Sofituzumab, Sorituzumab, Vorsetuzumab, Trastuzumab, Mirvetuximab ximab), Korutsukishimabu (Coltuximab), Naratsukishimabu (Naratuximab), Indatsukishimabu (Indatuximab), Anetsumabu (Anetumab), Rorubotsuzumabu (Lorvotuzumab), Kantsuzumabu (Cantuzumab), Lapu rituximab (Laprituximab), Bibatsuzumabu (Bivatuzumab), Badasutsukishimabu (Vadastuximab), Robarupitsuzumabu (Rovalpituzumab), Inotuzumab (Inotuzumab), Sacituzumab (Labituzumab), Miratuzumab (Miratuzumab), Lupartumab (Lupartumab) and Aprutumab Or any one selected from the group consisting of: Desirably, the antibody drug conjugate of the invention may comprise cetuximab, a human EGFR binding antibody. Cetuximab is a monoclonal antibody that has been clinically approved by the FDA for the treatment of non-small cell lung cancer, metastatic colon cancer, or head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). The nucleotide sequence of cetuximab can consist of the heavy chain sequence of SEQ ID NO: 5 and the light chain sequence of SEQ ID NO: 6. Also, the amino acid sequence of cetuximab can consist of a heavy chain sequence of SEQ ID NO: 7 and a light chain sequence of SEQ ID NO: 8.

また、本発明は、前記抗体薬物複合体を含む癌治療用の薬学的組成物を提供する。本発明の抗体薬物複合体が治療効果を示す癌は、頭頸部がん、結腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、腎がん、膵がん、卵巣がん、脳腫瘍または膀胱がんなどのうちいずれか一つ以上であり得る。望ましくは、本発明の二重特異的セツキシマブ×抗コチニン抗体を含む四価の複合体及びデュオカルマイシンによって架橋結合した二価のコチニン結合ペプチド（コチニン−デュオカルマイシン）からなる抗体薬物複合体は、セツキシマブのＥＧＦＲ標的治療に対する一次抵抗性を有するＫＲＡＳ突然変異肺腺がん（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）に著しい治療効果を示す。望ましくは、前記二重特異的セツキシマブ×抗コチニン抗体を含む四価の複合体及びコチニン−デュオカルマイシンからなる抗体薬物複合体の全体アミノ酸配列は、配列番号９の軽鎖配列及び配列番号１０の重鎖配列からなり得る。   The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising the antibody drug conjugate. Cancers for which the antibody-drug conjugate of the present invention has a therapeutic effect include head and neck cancer, colon cancer, lung cancer, breast cancer, prostate cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, brain tumor or bladder cancer, etc. Any one or more of the above. Desirably, a tetravalent complex comprising the bispecific cetuximab x anti-cotinine antibody of the present invention and an antibody drug complex consisting of a bivalent cotinine-binding peptide (cotinin-duocarmycin) cross-linked by duocarmycin , Cetuximab shows significant therapeutic effects on KRAS mutant lung adenocarcinoma with primary resistance to EGFR targeted therapy. Preferably, the total amino acid sequence of the tetravalent complex comprising the bispecific cetuximab × anti-cotinine antibody and the antibody drug complex consisting of cotinine-duocarmycin is the light chain sequence of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10. It can consist of a heavy chain sequence.

本発明の薬学的組成物は、当業界における公知の多様な方法によって投与され得る。投与経路または方式は、希望する結果によって変わり、静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下投与、または標的部位に近接して投与され得る。本発明の抗体薬物複合体は、当業者に公知の通常の方法によって製薬上許容される投与の形態で製剤化され得る。   The pharmaceutical compositions of the invention can be administered by a variety of methods known in the art. The route or mode of administration will depend on the desired result and can be administered intravenously, intramuscularly, intraperitoneally or subcutaneously, or administered close to the target site. The antibody drug conjugates of the present invention can be formulated in a pharmaceutically acceptable dosage form by conventional methods known to those skilled in the art.

また、本発明は、（ｓ１）抗コチニンｓｃＦｖを含む四価の二重特異性抗体を製造する段階と、（ｓ２）ペプチドと架橋結合した二価のコチニン及び薬物の接合体を製造する段階と、（ｓ３）（ｓ１）段階で生成した二重特異性抗体と（ｓ２）段階で生成した接合体とを混合する段階と、を含む抗体薬物複合体の製造方法を提供する。前記（ｓ３）段階は、抗コチニンｓｃＦｖと二価のコチニンとが特異的に結合することで抗体薬物複合体が製造され得る。また、前記二価のコチニンは、二つのコチニンが６〜１８ｍｅｒペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋結合したものを用い得る。また、前記薬物は、二価のコチニンと架橋結合した６〜１８ｍｅｒペプチドにおいて、リシン残基と接合し得る。また、前記製造方法は、ａ）抗コチニンｓｃＦｖが結合した二重特異性抗体をコーディングする核酸分子をベクターに挿入する段階と、ｂ）前記ベクター宿主細胞に導入する段階と、ｃ）前記宿主細胞を培養する段階と、を含み得る。   The present invention also includes (s1) a step of producing a tetravalent bispecific antibody containing an anti-cotinine scFv, and (s2) a step of producing a conjugate of a bivalent cotinin and a drug cross-linked with a peptide. (S3) and a step of mixing the bispecific antibody produced in step (s1) and the conjugate produced in step (s2). In the step (s3), an antibody-drug conjugate can be produced by specifically binding an anti-cotinin scFv and a divalent cotinin. In addition, the divalent cotinin can be obtained by crosslinking two cotinines to the N-terminal and C-terminal of the 6-18mer peptide. The drug can also be conjugated to a lysine residue in a 6-18mer peptide cross-linked to divalent cotinine. The production method also includes a) inserting a nucleic acid molecule encoding a bispecific antibody bound with anti-cotinin scFv into a vector, b) introducing it into the vector host cell, and c) the host cell. Culturing.

また、本発明の抗体薬物複合体の有効量を、癌を有する動物に処理する段階を含む癌治療方法を提供する。また、本発明の癌治療用の薬学的組成物の製造のための本発明の抗体薬物複合体の用途を提供する。   In addition, a method for treating cancer comprising the step of treating an animal having cancer with an effective amount of the antibody-drug conjugate of the present invention is provided. Also provided is the use of the antibody drug conjugate of the present invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for cancer treatment of the present invention.

本発明の癌治療方法は、本発明の抗体薬物複合体を含む組成物を治療学的に有効な量で投与することを含み得る。本発明において、「治療学的に有効な量」とは、癌関連疾患の予防または治療に有効な本発明の抗体薬物複合体またはこれを含む組成物の量を意味する。   The cancer treatment method of the present invention may comprise administering a therapeutically effective amount of a composition comprising the antibody drug conjugate of the present invention. In the present invention, the “therapeutically effective amount” means an amount of the antibody drug conjugate of the present invention or a composition containing the same effective in preventing or treating cancer-related diseases.

本発明の薬学的組成物のうち抗体薬物複合体の実際投与量の水準は、患者に毒性でなく、かつ特定の患者、組成物及び投与方式に対して希望する治療反応の達成に効果的な活性成分の量となるよう変わり得る。投与量の水準は、多様な 薬力学的因子、例えば、使用された本発明の抗体薬物複合体の活性、投与経路、投与時間、使用された複合体の排出速度、処置期間、複合体と共に使用された他の薬物、化合物または物質、治療を受ける患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康及び過去の医学的病歴またはその他の因子などによって変わり得る。   The actual dosage level of the antibody drug conjugate in the pharmaceutical composition of the present invention is not toxic to the patient and is effective in achieving the desired therapeutic response for the particular patient, composition and mode of administration. It may vary to be the amount of active ingredient. Dosage levels depend on a variety of pharmacodynamic factors such as the activity of the antibody-drug conjugate of the invention used, the route of administration, the time of administration, the rate of elimination of the conjugate used, the duration of treatment, the conjugate used It may vary depending on other drugs, compounds or substances administered, the age, sex, weight, condition, general health and past medical history or other factors of the patient being treated.

本発明において、薬学的組成物の治療投与量は、安全性及び効能が最適化するように適正に変り得る。本発明の抗体薬物複合体を全身投与する場合、投与量の範囲は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、より一般的には０．０１〜１５ｍｇの範囲であり得る。例えば、治療方法は、２週ごとに一回、または１ヶ月ごとに１回、または３ヶ月〜６ヶ月ごとに１回の全身投与を伴い得る。   In the present invention, the therapeutic dosage of the pharmaceutical composition may be varied appropriately to optimize safety and efficacy. When systemically administering the antibody drug conjugates of the present invention, the dosage range can be about 0.0001-100 mg / kg of host body weight, more typically 0.01-15 mg. For example, the method of treatment may involve systemic administration once every two weeks, or once every month, or once every 3 to 6 months.

また、本発明の前記抗体薬物複合体によって薬物の半減期を増進させる方法を提供する。本発明の実験例３においては、ＥＲＣ６との複合体を形成するとき、コチニンペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の安全性を評価するために薬物動態分析を行った。実験結果、コチニンペイロードは、分子量が低くて血流で迅速に除去される一方、これがＥＲＣ６に結合する場合、半減期が延長されることを確認した。ひいては、本発明の抗体薬物複合体は、ペプチドと架橋結合した二価のコチニンを使うことで、単一コチニン−薬物接合体に比べて複合体の安定性を大幅増進させることができる。   Also provided is a method for increasing the half-life of a drug by the antibody drug conjugate of the present invention. In Experimental Example 3 of the present invention, when a complex with ERC6 was formed, a pharmacokinetic analysis was performed in order to evaluate the safety of the cotinine payload. Experimental results have confirmed that the cotinine payload has a low molecular weight and is rapidly removed in the bloodstream, while the half-life is extended when it binds to ERC6. As a result, the antibody drug conjugate of the present invention can greatly enhance the stability of the conjugate as compared to a single cotinine-drug conjugate by using a bivalent cotinine cross-linked with a peptide.

本発明において「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味し、その種類は特に制限されない。本明細書において、抗体は、動物抗体、キメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体を全て含み得る。また、本明細書において、抗体とは、抗原結合能を保有した抗体の断片、例えば、Ｆａｂも含み得る。前記キメリック抗体とは、抗体可変領域またはこの相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗体の残り部分と相違した動物由来の抗体を言う。このような抗体は、例えば、抗体可変領域は人間以外の動物（例えば、マウス、ウサギ、家禽類など）から由来し、抗体不変領域は人間から由来した抗体であり得る。このようなキメリック抗体は、当業界における公知の遺伝子再組合などの方法によって製造され得る。   In the present invention, “antibody” means a substance produced by stimulation of an antigen in the immune system, and the kind thereof is not particularly limited. As used herein, antibodies can include all animal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies. In the present specification, the antibody may also include a fragment of an antibody having an antigen-binding ability, such as a Fab. The said chimeric antibody refers to an antibody derived from an animal in which the antibody variable region or this complementarity determining region (CDR) is different from the rest of the antibody. In such an antibody, for example, the antibody variable region may be derived from an animal other than human (eg, mouse, rabbit, poultry, etc.), and the antibody constant region may be an antibody derived from human. Such a chimeric antibody can be produced by a method such as gene recombination known in the art.

本発明において、「重鎖」とは、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域のアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び三つの不変領域ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びこの断片を総称する。また、「軽鎖」とは、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域のアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びこの断片を総称する。 In the present invention, “heavy chain” refers to a variable region domain V H containing a variable region amino acid sequence sufficient to confer specificity to an antigen, and three constant region domains C H 1, C H 2 and The full-length heavy chain including C H 3 and this fragment are generically named. The term “light chain” is a generic term for a full-length light chain comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L that contain sufficient variable region amino acid sequences to confer specificity to the antigen, and fragments thereof.

本発明において、「接合体」とは、異種性分子であって、ポリマー分子、親油性化合物、炭水化物部分または誘導体化剤（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ）のような一つ以上の非ポリペプチド部分、特に、ポリマー部分に、一つ以上のポリペプチド、典型的には一つのポリペプチドを共有的に付着することで作ることができる。さらに、接合体は、一つ以上の炭水化物部分に、特にＮ−またはＯ−グリコシル化を用いて付着し得る。「共有的に付着する」というのは、ポリペプチド及び非ポリペプチド部分を直接互いに共有結合するか、連結橋、スペース、連結部分、または部分のような仲介部分または部分などを介して互いに間接的に共有結合して連結されることを意味する。例えば、本発明に開示の薬物をコチニンと接合した接合体が本定義に含まれる。   In the context of the present invention, a “conjugate” is a heterogeneous molecule, which is a polymer molecule, a lipophilic compound, a carbohydrate moiety or one or more non-polypeptide moieties such as a derivatizing agent, in particular a polymer moiety. Alternatively, it can be made by covalently attaching one or more polypeptides, typically one polypeptide. Furthermore, the conjugate can be attached to one or more carbohydrate moieties, particularly using N- or O-glycosylation. “Covalently attached” means that the polypeptide and non-polypeptide moieties are either covalently bonded directly to each other or indirectly to each other, such as via an intermediary moiety or moiety such as a linking bridge, space, linking moiety, or moiety. To be covalently linked to. For example, a conjugate obtained by conjugating a drug disclosed in the present invention to cotinine is included in this definition.

また、本発明は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）生物学的分析方法において、コチニンと薬物との接合体を分析道具として使用することを特徴とする方法を提供する。前記インビトロ生物学的分析方法は、流動細胞分析法、ウエスタンブロット分析法、免疫沈降法及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などより選択され得る。   In addition, the present invention provides a method characterized in that a conjugate of cotinine and a drug is used as an analytical tool in an in vitro biological analysis method. The in vitro biological analysis method can be selected from a flow cell analysis method, a Western blot analysis method, an immunoprecipitation method, an enzyme immunoassay (ELISA), and the like.

本発明による薬物及びコチニンの接合体に抗コチニン抗体が結合した複合体は、コチニンをハブテンとして用いることで薬物及び抗体固有の特性を全て保有することができる。具体的に、本発明の抗体薬物複合体は、分子の特異的反応性及び機能と、抗体の特性である補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び長い生体内半減期を保有することができる。
［発明の効果］
本発明の抗体薬物複合体は、抗体が特異的に結合する標的に薬物を効果的に伝達することができ、体内薬物の半減期を増進させて治療効果を向上させることができる。特に、本発明の二重特異性セツキシマブ×抗コチニン抗体及びデュオカルマイシンと接合された二価のコチニン−ペプチドの複合体は、ＫＲＡＳ突然変異を有するＥＧＦＲ陽性セツキシマブ難治性肺腺癌に著しい抗腫瘍活性を示す。 A complex in which an anti-cotinine antibody is bound to a conjugate of a drug and cotinin according to the present invention can retain all the characteristics unique to the drug and the antibody by using cotinine as a hub ten. Specifically, the antibody-drug conjugate of the present invention has a specific reactivity and function of a molecule, complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), and long in vivo characteristics of the antibody. Can have a half-life.
[Effect of the invention]
The antibody-drug conjugate of the present invention can effectively deliver a drug to a target to which an antibody specifically binds, and can improve the therapeutic effect by increasing the half-life of the drug in the body. In particular, the bispecific cetuximab x anti-cotinine antibody of the present invention and a bivalent cotinine-peptide conjugate conjugated with duocarmycin are prominent anti-tumor in EGFR-positive cetuximab refractory lung adenocarcinoma with KRAS mutation Shows activity.

また、本発明の抗体薬物複合体プラットホームは、抗体の最適化を要せず、単純培養によって細胞毒性製剤を関心抗体に結合することで多段階複合体の結合段階を大幅減らすことができる。即ち、本発明の抗体薬物複合体プラットホームは、従来のＡＤＣの限界を乗り越え、究極的にさらに効果的な治療剤の開発に使用することができる。
［図面の簡単な説明］
図１ａ〜図１ｄは、二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）の生成及び特性を示す。図１ａは、二重特異性抗体を用いた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）プラットホームの概略図である。二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）は、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンペイロードへの結合特異性を共に有するように設計される。図１ｂは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。精製されたＥＲＣ６を４〜１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに投入した。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色することでバンドを視覚化した。一番または二番レーンは、各々還元剤があるか、またはないサンプルである。図１ｃは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）である。高性能の液体クロマトグラフィーを用いたＳＥＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって精製されたＥＲＣ６を分析した。図１ｄは、ＥＲＣ６の薬物動態の分析結果を示す。２００μｇのＥＲＣ６をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の静脈内に注射し、血液サンプルを眼窩内の静脈から収集した。ＥＲＣ６の循環血清水準を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。 In addition, the antibody-drug conjugate platform of the present invention does not require antibody optimization, and the binding step of the multi-step conjugate can be greatly reduced by binding the cytotoxic preparation to the antibody of interest by simple culture. That is, the antibody drug conjugate platform of the present invention can overcome the limitations of conventional ADCs and can be used for the development of an even more effective therapeutic agent.
[Brief description of drawings]
Figures la-d show the generation and properties of bispecific (cetuximab x anti-cotinine) antibody (ERC6). FIG. 1a is a schematic diagram of an antibody drug conjugate (ADC) platform using a bispecific antibody. Bispecific (cetuximab x anti-cotinine) antibody (ERC6) is designed to have both binding specificity for human EGFR and cotinine payload. FIG. 1 b shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Purified ERC6 was loaded into 4-12% (w / v) SDS-PAGE. Bands were visualized by staining the gel with Coomassie Brilliant Blue. The first or second lane is a sample with or without a reducing agent, respectively. FIG. 1c is size exclusion chromatography (SEC). ERC6 purified by SEC using high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) was analyzed. FIG. 1 d shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6. 200 μg of ERC6 was injected intravenously into Balb / c mice (n = 4) and blood samples were collected from intraorbital veins. Circulating serum levels of ERC6 were analyzed by enzyme immunoassay (ELISA). Results are expressed as mean ± SD from three experiments.

図２ａ〜図２ｄは、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６の結合反応性を示す。図２ａは、酵素免疫測定法による結果を示す。セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧ及びＥＲＣ６を、ヒトＥＧＦＲまたはコチニンがコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに添加した。ウェルをＨＲＰ複合の抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ−特異的）抗体で探知した（ｐｒｏｂｅｄ）。図２ｂは、架橋結合したｄＰＥＧ６ビオチンと二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す （コチニン−ビオチン）。図２ｃは、セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧ及びＥＲＣ６をヒトＥＧＦＲでコーティングされたマイクロタイタープレートの他のウェルに添加した後、コチニン−ビオチンを添加し、ウェルをＨＲＰ結合のストレプトアビジンで探知した結果である。バックグラウンド信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ）は、ＢＳＡでコーティングされた対照群のウェルで測定した。吸光度は、６５０ｎｍにて測定した。図２ｄは、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの薬物動態の分析結果を示す。１００μＬの滅菌ＰＢＳに溶解した１．８５μｇのコチニン−ビオチンと共に、事前培養した２００μｇのＥＲＣ６をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の静脈に注射した。血液サンプルを眼窩内の静脈から収集し、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの循環血清水準をＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。   Figures 2a-2d show the binding reactivity of ERC6 to human EGFR and cotinine. FIG. 2a shows the results from enzyme immunoassay. Cetuximab, anti-cotinine IgG and ERC6 were added to wells of microtiter plates coated with human EGFR or cotinine. Wells were probed with HRP-conjugated anti-human IgG (Fab-specific) antibody. FIG. 2b shows the chemical structure of a cross-linked dPEG6 biotin and a divalent cotinine-conjugated peptide (cotinine-biotin). FIG. 2c is the result of adding cetuximab, anti-cotinine IgG and ERC6 to other wells of a microtiter plate coated with human EGFR, then adding cotinine-biotin, and detecting the wells with HRP-conjugated streptavidin. . Background signals were measured in control wells coated with BSA. Absorbance was measured at 650 nm. FIG. 2d shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6 complex cotinine-biotin. 200 μg ERC6 pre-cultured with 1.85 μg cotinine-biotin dissolved in 100 μL sterile PBS was injected into the vein of Balb / c mice (n = 4). Blood samples were collected from intraorbital veins and circulating serum levels of ERC6-conjugated cotinine-biotin were measured by ELISA. Results are expressed as mean ± SD from three experiments.

図３ａ〜図３ｅは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ａは、流動細胞分析結果である。コチニン−ビオチンが存在するか、存在しない場合、セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧまたはＥＲＣ６と共にＡ５４９細胞を培養した。分析のために、細胞をＰＥ接合したストレプトアビジン及びＦＩＴＣ接合した抗ヒトＦｃで探知した。図３ｂは、自由デュオカルマイシン（ｆｒｅｅ ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）の構造を示す。図３ｃは、四つのデュオカルマイシンと架橋結合した二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す（コチニン−デュオカルマイシン）。Ｒは、バリン−シトルリンＰＡＢ連結されたジメチルアミノエチルデュオカルマイシンを示す。図３ｄは、自由デュオカルマイシンの細胞生存力の分析結果である。図３ｅは、コチニン−デュオカルマイシンの細胞生存力の分析結果である。Ａ５４９細胞株をパリビズマブ及びＤＭＳＯ（●）；セツキシマブ及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの四角）；ＥＲＣ６及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの三角）；パリビズマブ及びデュオカルマイシン（○）；セツキシマブ及びデュオカルマイシン（□）；ＥＲＣ６及びデュオカルマイシン（△）で処理した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型の対照群として用いられた。ＤＭＳＯは、コチニン−デュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いられた。細胞を７２時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を用いて細胞のＡＴＰ含量を測定することで相対的な細胞生存力を測定した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。   Figures 3a-3e show the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on EGFR-positive lung adenocarcinoma cell lines. FIG. 3a is a flow cell analysis result. In the presence or absence of cotinine-biotin, A549 cells were cultured with cetuximab, anti-cotinine IgG or ERC6. For analysis, cells were detected with PE-conjugated streptavidin and FITC-conjugated anti-human Fc. FIG. 3b shows the structure of free duocarmycin. FIG. 3c shows the chemical structure of a bivalent cotinine-conjugated peptide cross-linked with four duocarmycins (cotinin-duocarmycin). R represents valine-citrulline PAB-linked dimethylaminoethyl duocarmycin. FIG. 3d shows the results of cell viability analysis of free duocarmycin. FIG. 3e is the analysis result of cell viability of cotinine-duocarmycin. A549 cell lines were transformed into palivizumab and DMSO (●); cetuximab and DMSO (filled squares); ERC6 and DMSO (filled triangles); palivizumab and duocarmycin (◯); cetuximab and duocarmycin (□); ERC6 and duo Treated with carmycin (Δ). Palivizumab was used as a homotypic control group of bispecific antibodies. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine-duocarmycin. After culturing the cells for 72 hours, relative cell viability was measured by measuring the ATP content of the cells using Cell Titer-Glo reagent. Results are expressed as mean ± SD from three experiments.

図４ａ〜図４ｅは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ａは、腫瘍の体積を３２日間測定した結果である。図４ｂは、体重を処理期間の間に観察した結果である。図４ｃは、３２日目の平均腫瘍体積である。図４ｄは、マウスが犠牲されたとき、解剖された腫瘍の平均質量である。図４ｅは、終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）で三つの処理グループの腫瘍の写真を示す。結果は、平均±ＳＤで示した；グループと比較＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。 Figures 4a-4e show the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4a shows the results of measuring the tumor volume for 32 days. FIG. 4b is the result of observing body weight during the treatment period. FIG. 4c is the average tumor volume at day 32. FIG. 4d is the average mass of the dissected tumor when the mouse is sacrificed. FIG. 4e shows a picture of the tumors of the three treatment groups at the end point. Results are expressed as mean ± SD; compared to groups * P <0.05, ** P <0.01, Student's t test.

図５は、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの薬物動態の分析結果である。（ａ）１００μＬの滅菌ＰＢＳに１：１モル比で溶解された９６４ｐｍｏｌｅのコチニン−ビオチンで事前培養した２００μｇのＥＲＣ６を、Ｂａｌｂ／ｃ マウス（ｎ＝４）の静脈内に注射した。ペプチドは、二つのコチニン分子の間に、６ｍｅｒ、１２ｍｅｒまたは１８ｍｅｒの多様な長さを有する。血液サンプルを眼窩内の静脈から収集し、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの循環血清水準をＥＬＩＳＡによって決定した。（ｂ）総ＥＲＣ６の循環血清水準をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、平均±ＳＤで示した；グループと比較＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。   FIG. 5 shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6 complex cotinine-biotin. (A) 200 μg ERC6 pre-cultured with 964 pmole of cotinine-biotin dissolved in a 1: 1 molar ratio in 100 μL sterile PBS was injected intravenously into Balb / c mice (n = 4). Peptides have various lengths of 6 mer, 12 mer or 18 mer between two cotinine molecules. Blood samples were collected from intraorbital veins and the circulating serum levels of ERC6-conjugated cotinine-biotin were determined by ELISA. (B) Circulating serum levels of total ERC6 were measured by ELISA. Results are expressed as mean ± SD; compared to groups * P <0.05, ** P <0.01, Student's t test.

図６は、ＥＧＦＲ−陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−ＤＭ１（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）の抗増殖効果を示す。図６ａは、四つのＤＭ１と架橋結合した二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す（コチニン−ＤＭ１）。Ｒは、ＭＣＣ連結されたＤＭ１を示す。図６ｂは、コチニン−ＤＭ１の細胞生存力の分析結果である。Ａ５４９細胞株をパリビズマブ及びＤＭＳＯ（●）；セツキシマブ及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの四角）；ＥＲＣ６及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの三角）；パリビズマブ及びコチニン−ＤＭ１（○）；セツキシマブ及びコチニン−ＤＭ１（□）；ＥＲＣ６及びコチニン−ＤＭ１（△）で処理した。パリビズマブを二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯをコチニン−デュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。細胞を７２時間培養した後、相対的な細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を用いて細胞ＡＴＰ含量を測定することで決定した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。
［発明を実施するための形態］
以下、添付された図面を参照して本発明の望ましい実施例を詳しく説明する。しかし、本発明による実施例は多くの他の形態に変形でき、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業界で通常の知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。 FIG. 6 shows the anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-DM1 (emtansine) on an EGFR-positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 6a shows the chemical structure of a bivalent cotinine-conjugated peptide cross-linked with four DM1s (Cotinin-DM1). R indicates DM1 linked by MCC. FIG. 6 b is the analysis result of cell viability of cotinine-DM1. A549 cell lines were transformed into palivizumab and DMSO (●); cetuximab and DMSO (filled squares); ERC6 and DMSO (filled triangles); palivizumab and cotinine-DM1 (◯); cetuximab and cotinine-DM1 (□); ERC6 and cotinine -Treated with DM1 (Δ). Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine-duocarmycin. After culturing cells for 72 hours, relative cell viability was determined by measuring cellular ATP content using Cell Titer-Glo reagent. Results are expressed as mean ± SD from three experiments.
[Mode for Carrying Out the Invention]
Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the embodiments according to the present invention can be modified in many other forms, and the scope of the present invention should not be construed to be limited to the embodiments described below. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the concept of the invention to those skilled in the art.

実施例１：細胞培養
Ａ５４９（ヒト肺腺癌）細胞を韓国細胞株銀行から得て、５％のＣＯ２及び湿った環境で３７℃で１０％熱非活性化したウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＷＥＬＧＥＮＥ，韓国）に培養した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、オービタルシェーキング培養基（Ｍｉｎｉｔｒｏｎ，ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、１３５ｒｐｍで７％のＣＯ２及び７０％の湿度で３７℃にてベントキャップ（ｖｅｎｔ ｃａｐ）付きＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＵＳＡ）で、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３発現培地（ＧＩＢＣＯ）で生長させた。 Example 1: Cell Culture A549 (Human Lung Adenocarcinoma) cells were obtained from the Korean Cell Line Bank and fetal calf serum (GIBCO, Grand) 10% heat inactivated at 37 ° C. in 5% CO 2 and humid environment. (Island, NY, USA), cultured in RPMI-1640 medium (WELGENE, Korea) supplemented with 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin. HEK293F cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) were vent-capted using orbital shaking culture medium (Minitron, INFOHT, Bottlingen, Switzerland) at 37 ° C with 7% CO 2 and 70% humidity. (Vent cap) Erlenmeyer tissue culture flasks (Corning Inc., NY, USA) were grown in FreeStyle ™ 293 expression medium (GIBCO) containing 100 U / mL penicillin and 100 μg / mL streptomycin.

実施例２：二重特異性セツキシマブ×抗コチニン抗体（ＥＲＣ６）の製造及び精製
二重特異性セツキシマブ×抗コチニン抗体（ＥＲＣ６）発現ベクターを製造するために、セツキシマブ軽鎖及びセツキシマブ重鎖−リンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３−抗コチニンｓｃＦｖをコーディングする遺伝子を化学的に合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）。制限部位、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩを、セツキシマブの軽鎖をコーディングする遺伝子の５’及び３’末端に各々挿入した。追加的な制限部位、ＮｈｅＩ及びＢｓｉＷＩを、セツキシマブの重鎖をコーディングする遺伝子の５’末端及び抗コチニンｓｃＦｖの遺伝子の３’末端に各々挿入した。［Ｐａｒｋ Ｓ， Ｌｅｅ ＤＨ，Ｐａｒｋ ＪＧ，Ｌｅｅ ＹＴ，Ｃｈｕｎｇ Ｊ．Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｏｔｉｎｉｎｅ ｉｎ ｐａｓｓｉｖｅ ｓｍｏｋｅｒｓ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２０１０；４１１（１７−１８）：１２３８−４２］に開示の方法のように、軽鎖及び重鎖−リンカー−抗コチニンｓｃＦｖを、再組合タンパク質の分泌のために設計された哺乳動物発現ベクターでサブクローンした。 Example 2: Production and purification of bispecific cetuximab x anti-cotinine antibody (ERC6) To produce bispecific cetuximab x anti-cotinine antibody (ERC6) expression vector, cetuximab light chain and cetuximab heavy chain-linker ( Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 -A gene encoding anti-cotinine scFv was chemically synthesized (Genscript, Picaway, NJ, USA). Restriction sites, AgeI and XbaI, were inserted into the 5 ′ and 3 ′ ends of the gene encoding the light chain of cetuximab, respectively. Additional restriction sites, NheI and BsiWI, were inserted into the 5 ′ end of the gene encoding the heavy chain of cetuximab and the 3 ′ end of the anti-cotinin scFv gene, respectively. [Park S, Lee DH, Park JG, Lee YT, Chung J. A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passive smokers. Clin Chim Acta 2010; 411 (17-18): 1238-42], a mammal designed to secrete light and heavy chain-linker-anticotinine scFv for recombination protein secretion. Subcloned with expression vector.

［Ｂｏｕｓｓｉｆ Ｏ，Ｌｅｚｏｕａｌｃ’ｈ Ｆ，Ｚａｎｔａ ＭＡ，Ｍｅｒｇｎｙ ＭＤ， Ｓｃｈｅｒｍａｎ Ｄ， Ｄｅｍｅｎｅｉｘ Ｂ ｅｔ ａｌ． Ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５；９２（１６）：７２９７−３０１］に開示の方法のように、ＥＲＣ６をコーディングする発現ベクターを、２５−ｋＤａ線状ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いてＨＥＫ２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質注入した。［Ｋｉｍ Ｈ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｌｅｅ ＨＫ，Ｃｈｕｎｇ Ｊ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｈａｐｔｅｎ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０１３；４５：ｅ４３］に開示の方法のように、ＥＲＣ６を、タンパク質Ａアガロースビーズ（ＲｅｐｌｉＧｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて親和性クロマトグラフィーによって培養上澄液から精製した。   [Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergey MD, Scherman D, Dimension B et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92 (16): 7297-301], using an expression vector encoding ERC6 using 25-kDa linear polyethyleneimine (Polyscience, Warrington, PA, USA). HEK293F (Invitrogen) was transfected. [Kim H, Park S, Lee HK, Chung J. et al. Application of bispecific antigen again antigen and hapten for immunodetection and immunopurification. ERC6 was purified from the culture supernatant by affinity chromatography using protein A agarose beads (RepliGen, Waltham, MA, USA) as disclosed in Exp Mol Med 2013; 45: e43].

実施例３：ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
精製されたＥＲＣ６を製造者の指示に従ってＮｕＰａｇｅ４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。前記ゲルは、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）で染色した。 Example 3: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Purified ERC6 was analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) using NuPage 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R-250 (Amresco, Colon, OH, USA).

実施例４：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
３００Åの気孔を含む３μｍ粒子で包装されたＢｉｏ ＳＥＣ−３ カラム（７．８×３００ｍｍ）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、精製されたＥＲＣ６を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。移動相は、ｐＨ７．０の５０ｍＭソジウムホスフェート及び１５０ｍＭソジウムクロライドを含む。２０μＬのＥＲＣ６（１ｍｇ／ｍｌ）を注入し、３０分間１ｍＬ／分の流速でイソクラティック溶出した。カラム流出物を２８０ｎｍにて紫外線検出器でモニターし、ｍＡＵで示した。単量体、凝集体及び切片の百分率をピーク面積を基準にして定量化した。 Example 4: Size Exclusion Chromatography (SEC)
An Agilent 1260 Infinity High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) system (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif., USA) equipped with a Bio SEC-3 column (7.8 × 300 mm) packed with 3 μm particles containing 300 μm pores. In use, purified ERC6 was analyzed by SEC-HPLC. The mobile phase contains 50 mM sodium phosphate at pH 7.0 and 150 mM sodium chloride. 20 μL of ERC6 (1 mg / ml) was injected and isocratic eluted at a flow rate of 1 mL / min for 30 minutes. The column effluent was monitored with a UV detector at 280 nm and indicated in mAU. The percentage of monomers, aggregates and sections were quantified based on peak area.

実施例５：コチニン複合体の合成
本実験に用いられた全てのペプチドは、Ｆｍｏｃペプチド固相合成（Ｐｅｐｔｒｏｎ、韓国）を用いて合成した。二つのトランス−４’−コチニンカルボックシル酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、ＧＧＧＧＳＫＧＧＧＧＳＫ及びＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫペプチドのＮ末端及びＣ末端に自由アミン基で架橋結合した。トリフェニルホスフィン（ｔｅｔｒａｋｉｓ）パラジウムでペプチドの中間でリシン上のアリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）基を除去した後、ｄＰＥＧ６（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ，ＵＳＡ）を、ＧＧＧＧＳＫＧＧＧＧＳＫペプチドの自由アミン基に結合した。その後、ビオチンをｄＰＥＧ６結合したペプチド（Ｐｅｐｔｒｏｎ社、韓国）上の自由アミンに架橋結合した。単純化のために、ビオチンと架橋結合した二価のコチニン接合したペプチド（コチニン−ＧＧＧＧＳＫ［（ｄＰＥＧ６）−ビオチン］ＧＧＧＧＳＫ−コチニン）を、コチニン−ビオチンとして略称する。 Example 5: Synthesis of Cotinine Complex All peptides used in this experiment were synthesized using Fmoc peptide solid phase synthesis (Peptron, Korea). Two trans-4'-cotinine carboxylic acids (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) were cross-linked with free amine groups at the N-terminus and C-terminus of GGGGSKGGGGSK and GSKGGSKGGSKK peptides. After removal of the allyloxycarbonyl (alloc) group on lysine in the middle of the peptide with triphenylphosphine (tetrakis) palladium, dPEG6 (Peptide international Inc., Louisville, KY, USA) is coupled to the free amine group of GGGGSKGGGGSK peptide did. Subsequently, biotin was cross-linked to a free amine on a dPEG6-conjugated peptide (Peptron, Korea). For simplicity, the divalent cotinine-conjugated peptide cross-linked with biotin (cotinin-GGGGSK [(dPEG6) -biotin] GGGGSK-cotinine) is abbreviated as cotinine-biotin.

四つのバリン−シトルリンＰＡＢ連結されたジメチルアミノエチルデュオカルマイシンを二価のコチニン架橋結合したＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＫペプチド（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）内の四つのリシンに存在する自由アミノ基に結合した。単純化のために、四つのデュオカルマイシンと架橋結合した二価のコチニン接合したペプチド（コチニン−［ＧＳＫ（デュオカルマイシン）］４Ｋ−コチニン）を、コチニン−デュオカルマイシンとして略称する。 Four valine-citrulline PAB-linked dimethylaminoethyl duocarmycins were attached to the free amino groups present in the four lysines in the divalent cotinine cross-linked GSKGGSKGSKGSK peptide (Concortis, San Diego, CA, USA). For simplicity, the bivalent cotinine-conjugated peptide (cotinin- [GSK (duocarmycin)] 4 K-cotinine) cross-linked with four duocarmycins is abbreviated as cotinine-duocarmycin.

コチニン−ビオチン及びコチニン−デュオカルマイシンをＣ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣを用いて精製した。精製後、これらをＣａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ カラム（４．６×５０ｍｍ，１２０Å）（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）付きのＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＬＣ及びＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｃｏｒｐ．，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた質量分析によって分析及び検証した。   Cotinine-biotin and cotinine-duocarmycin were purified using reverse phase HPLC using a C18 column. After purification, they were subjected to mass spectrometry using an Agilent 1100 capillary LC with a Capcell Pak C18 column (4.6 × 50 mm, 120 mm) (Shiseido, Tokyo, Japan) and an HPLC system (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). And verified.

実施例６：ＥＲＣ６とコチニンペイロード（ｐａｙｌｏａｄｓ）との複合化
ＥＲＣ６とコチニン接合したペイロードの複合体を生成するために、コチニンペイロード及びＥＲＣ６をピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）アップ及びダウンによって１：１のモル比で混合した。その後、混合物を室温で３０分間培養した。その後、複合体を追加的な変更なくインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で使用した。 Example 6: Conjugation of ERC6 and Cotinine Payloads 1: 1 molar ratio by pipetting up and down the cotinine payload and ERC6 to produce a complex of ERC6 and cotinine conjugated payload. Mixed. The mixture was then incubated for 30 minutes at room temperature. The complex was then used in vitro or in vivo without additional modification.

実施例７：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による分析
９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を、コーティングバッファー（蒸留水内に０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．６）内のヒトＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ）またはＢＳＡ結合したコチニンで４℃で一晩中コーティングし、３７℃で１時間の間ＰＢＳ内の３％［ｗ／ｖ］ウシ胎児血清（ＢＳＡ）で遮断した。５０μＬ遮断バッファー内の１μｇ／ｍＬ濃度の抗体を各ウェルに添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ内の０．０５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した後、遮断バッファー内に希釈されたＨＲＰ結合の抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で１時間培養した。その後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴでさらに洗浄し、５０μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン基質溶液（ＴＭＢ）（ＧｅｎＤＥＰＯＴ，Ｂａｒｋｅｒ，ＴＸ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、吸光度をＭｕｌｔｉｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔマイクロプレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて６５０ｎｍで測定した。 Example 7: Analysis by Enzyme Immunoassay (ELISA) Wells of 96-well microtiter plates (Corning) were washed with human EGFR (Sigma) in coating buffer (0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.6 in distilled water). ) Or BSA-conjugated cotinine at 4 ° C. overnight and blocked with 3% [w / v] fetal bovine serum (BSA) in PBS for 1 hour at 37 ° C. 1 μg / mL concentration of antibody in 50 μL blocking buffer was added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After washing with 0.05% [v / v] Tween 20 (PBST) in PBS, HRP-conjugated anti-human IgG (Fab specific) antibody (Sigma) diluted in blocking buffer was cultured at 37 ° C. for 1 hour. did. The plate was then further washed with 0.05% PBST and 50 μL of 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine substrate solution (TMB) (GenDEPOT, Barker, TX, USA) was added to each well, Absorbance was measured at 650 nm using a Multiscan Ascent microplate reader (Labsystems, Helsinki, Finland).

ＥＲＣ６の二重特異性を確認するために、ヒトＥＧＦＲコーティングされたウェルを前記のように抗体と共に培養した。０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、コチニン−ビオチンを各ウェルに添加し、３７℃で１時間培養した。遮断バッファー内に希釈されたＨＲＰ結合のストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を後で添加し、３７℃で１時間培養した。洗浄後、ＴＭＢを各ウェルに添加し、吸光度を６５０ｎｍで測定した。   To confirm the bispecificity of ERC6, human EGFR-coated wells were incubated with antibodies as described above. After washing with 0.05% PBST, cotinine-biotin was added to each well and incubated at 37 ° C. for 1 hour. HRP-conjugated streptavidin (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA) diluted in blocking buffer was later added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing, TMB was added to each well and the absorbance was measured at 650 nm.

実施例８：薬物動態分析（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）
本実験に用いられた全ての実験動物は、韓国国立癌センター研究所の動物実験倫理委員会によって検討され承認された（許可番号：ＮＣＣ−１５−２６７）。動物は、ＡＡＡＬＡＣ国際動物保護政策によって国立癌センターの動物施設で管理した。 Example 8: Pharmacokinetic analysis
All experimental animals used in this experiment were reviewed and approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the National Cancer Center Research Institute of Korea (permission number: NCC-15-267). Animals were managed at the National Cancer Center's animal facility according to the AAALAC International Animal Protection Policy.

８週齢の雄のＢａｌｂ／ｃマウスに１：１のモル比で１００μＬ滅菌ＰＢＳに溶解されたＥＲＣ６（２００μｇ）及びコチニン−ビオチン（１．８５μｇ）の複合体を静脈に注射した（ｎ＝４／グループ）。注射後、０、１、２４、４８、７２、９６及び１６８時間に眼窩内の静脈から血液サンプルを収集した。血液が凝固するまでサンプルを室温で２時間維持した。その後、４℃で１５分間３５００ｒｐｍで遠心分離によって血清を収集した。全体ＥＲＣ６及びＥＲＣ６複合のコチニンビオチンの循環血清の水準は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。   Eight week old male Balb / c mice were injected intravenously with a complex of ERC6 (200 μg) and cotinine-biotin (1.85 μg) dissolved in 100 μL sterile PBS at a 1: 1 molar ratio (n = 4). /group). Blood samples were collected from intraorbital veins at 0, 1, 24, 48, 72, 96, and 168 hours after injection. Samples were kept at room temperature for 2 hours until blood clotted. Serum was then collected by centrifugation at 3500 rpm for 15 minutes at 4 ° C. Circulating serum levels of total ERC6 and ERC6 complex cotinine biotin were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).

血清サンプル内の総ＥＲＣ６は、下記のようにして測定した：９６−ウェルマイクロタイタープレートのウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）は、４℃で一晩中コーティングバッファー内でヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）捕獲抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でコーティングし、ＰＢＳ内の３％ＢＳＡで遮断した。遮断バッファー及び標準溶液内に希釈された血清サンプルを各ウェルに添加し、３７℃で２時間培養した。０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、遮断バッファー内に希釈されたＨＲＰ結合の抗ヒトＣｋａｐｐａ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ−Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃で１時間培養した。洗浄した後、ＴＭＢ（ＧｅｎＤＥＰＯＴ）を各ウェルに添加し、吸光度を６５０ｎｍで測定した。 Total ERC6 in serum samples was measured as follows: 96-well microtiter plate wells (Corning) captured goat anti-human IgG (Fc specific) in coating buffer overnight at 4 ° C. Coated with antibodies (EMD Millipore, Darmstadt, Germany) and blocked with 3% BSA in PBS. Serum samples diluted in blocking buffer and standard solution were added to each well and incubated at 37 ° C. for 2 hours. After washing with 0.05% PBST, an HRP-conjugated anti-human C kappa antibody (Chemicon-Milipore, Billerica, MA, USA) diluted in blocking buffer was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing, TMB (GenDEPOT) was added to each well and the absorbance was measured at 650 nm.

血清サンプル内のＥＲＣ６及びコチニン−ビオチンの複合体を下記のように測定した：ヒトＥＧＦＲ（Ｓｉｇｍａ）コーティングされたウェルを上述したように血清サンプルと共に培養した。０．０５％ＰＢＳＴで洗浄した後、ＨＲＰ結合したストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し、３７℃で１時間培養した。洗浄した後、ＴＭＢを各ウェルに添加し、吸光度を６５０ｎｍで測定した。   ERC6 and cotinine-biotin complexes in serum samples were measured as follows: Human EGFR (Sigma) coated wells were incubated with serum samples as described above. After washing with 0.05% PBST, HRP-conjugated streptavidin (Thermo Fisher Scientific Pierce) was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. After washing, TMB was added to each well and the absorbance was measured at 650 nm.

実施例９：流動細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
各サンプル当り４×１０５細胞の最終濃度でＡ５４９細胞をｖ−ｂｏｔｔｏｍ９６−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にシードした（ｓｅｅｄｅｄ）。３０分間３７℃で流動細胞分析バッファー（ＰＢＳ内に１％［ｗ／ｖ］ＢＳＡを含む０．１％［ｗ／ｖ］アジ化ナトリウム）内に希釈されたＥＲＣ６及びコチニン−ビオチンの０または１００ｎＭで細胞を処理した。対照群の実験として、ＥＲＣ６の代わりにパリビズマブ（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）（Ｓｙｎａｇｉｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ，Ｂｉｂｅｒａｃｈ ａｎ ｄｅｒ Ｒｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗コチニンＩｇＧまたはセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ，Ｍｅｒｃｋ Ｋ ＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。流動細胞分析バッファーで洗浄した後、暗い所で３７℃で１時間の間、ピコエリスリン（ＰＥ）結合したストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＦＩＴＣ結合した抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ）と共に細胞を培養した。同じバッファーで追加洗浄をした後、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁し、４８８ｎｍのレーザーが装着されたＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて流動細胞分析を行った。測定当り１万個の細胞が検出されており、ＦｌｏｗＪｏ ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いてデータを分析した。 Example 9: Flow cytometry
A549 cells were seeded in v-bottom 96-well plates (Corning) at a final concentration of 4 × 10 5 cells per sample. 0 or 100 nM of ERC6 and cotinine-biotin diluted in flowing cell analysis buffer (0.1% [w / v] sodium azide containing 1% [w / v] BSA in PBS) at 37 ° C. for 30 minutes Cells were treated with. As control experiments, palivizumab (Synagis, Boehringer Ingelheim, Biberach an der Riss, Germany), anti-cotinine IgG or cetuximab (ErbitDumG, Erbitmst) was used instead of ERC6. After washing with flow cytometric buffer, picoerythrin (PE) -conjugated streptavidin (BD Biosciences Pharmogengen, San Diego, CA, USA) and FITC-conjugated anti-human IgG (Fc specific) for 1 hour at 37 ° C. in the dark Cells were cultured with antibodies (Thermo Fisher Scientific Pierce). After additional washing with the same buffer, cells were resuspended in 200 μL PBS and flow cell analysis was performed using a FACS Canto II instrument (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) equipped with a 488 nm laser. . Ten thousand cells were detected per measurement and data was analyzed using FlowJo software (TreeStar, Ashland, OR, USA).

実施例１０：細胞生存能の分析
腫瘍細胞生存力に対するＥＲＣ６及びコチニン−デュオカルマイシンの影響をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて評価した。Ａ５４９細胞を黒色壁の９６−ウェルプレート（ウェル当り４，０００個の細胞）においてＲＰＭＩ−１６４０培地５０μＬにシードし、５％のＣＯ２及び湿った環境で３７℃で一晩中接着した。その後、ＥＲＣ６及びコチニン−デュオカルマイシンの複合体を新鮮な培養培地で１０倍系列希釈した（０．０２ｎＭ〜２０００ｎＭ）。対照群の実験において、ＥＲＣ６の代わりにパリビズマブ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａ）、またはセツキシマブ（Ｍｅｒｃｋ Ｋ ＧａＡ）を用いた。５０μＬの培地内のコチニン−デュオカルマイシン及び抗体希釈物を各ウェルに添加し、７２時間培養した。各ウェルにＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を添加した後、製造者の指示に従ってマイクロプレート発光測定器（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて発光信号を測定した。全ての実験は、３倍数で行った。相対的な細胞生存力は、対照群の発光信号で割ることで計算した［％生存力＝（実験（Ｔｅｓｔ）−背景（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ））／（対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）−背景）×１００］。 Example 10: Analysis of cell viability The effect of ERC6 and cotinine-duocarmycin on tumor cell viability was evaluated using Cell Titer-Glo reagent (Promega Corp., Madison, WI, USA). A549 cells were seeded in 50 μL of RPMI-1640 medium in black-walled 96-well plates (4,000 cells per well) and allowed to adhere overnight at 37 ° C. in 5% CO 2 and humid environment. Thereafter, the ERC6 and cotinine-duocarmycin complex was serially diluted 10-fold with fresh culture medium (0.02 nM to 2000 nM). In the control group experiments, Palivizumab (Boehringer Ingelheim Pharma) or Cetuximab (Merck K GaA) was used instead of ERC6. Cotinine-duocarmycin and antibody dilution in 50 μL of medium were added to each well and incubated for 72 hours. After adding Cell Titer-Glo reagent (Promega Corp.) to each well, the luminescence signal was measured using a microplate luminometer (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. All experiments were performed in triplicate. The relative cell viability was calculated by dividing by the luminescence signal of the control group [% viability = (Experiment (Test) -Background) / (Control group-Background) × 100].

実施例１１：異種移植（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）
６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下にＡ５４９（１×１０７細胞）を注射した。腫瘍の体積が約１５０ｍｍ３に到達するとき、全ての動物を三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ） ５週間処理した。初めの２週間は、一週に二回、適切な対照群をマウスの腹腔に注射した：グループＩは、パリビズマブ（２．１５ｍｇ／ｋｇ）及びコチニン−デュオカルマイシン（９５μｇ／ｋｇ）を投与；グループＩＩは、ＥＲＣ６（３ｍｇ／ｋｇ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を投与；グループＩＩＩは、ＥＲＣ６（３ｍｇ／ｋｇ）及びコチニン−デュオカルマイシン（９５μｇ／ｋｇ）の複合体を投与。その後、前記薬物の３倍の投与量を、以後の３週間、週３回注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群として用いられた。ＤＭＳＯは、コチニン−デュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いられた。腫瘍の体積は、注射してから３２日後、一週間に二回、デジタルキャリパを用いて測定した。腫瘍の体積は、長さ×（幅）２×０．５で計算し、前記長さは最も長い軸であり、幅は前記長さに垂直な距離である。全身毒性は、週二回、体重を測定して評価した。注射してから３５日目にマウスを犠牲させ、腫瘍を切開して重さを測定した。 Example 11: Xenograft
A549 (1 × 10 7 cells) was injected subcutaneously into the left and right flank of 6-week-old female Balb / c nude mice. When the tumor volume reached approximately 150 mm 3 , all animals were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. For the first two weeks, the appropriate control group was injected into the peritoneal cavity twice a week: group I received palivizumab (2.15 mg / kg) and cotinine-duocarmycin (95 μg / kg); group II administered ERC6 (3 mg / kg) and dimethyl sulfoxide (DMSO); group III administered ERC6 (3 mg / kg) and cotinine-duocarmycin (95 μg / kg) complex. Thereafter, three times the dose of the drug was injected three times a week for the following three weeks. Palivizumab was used as an isotype control group of bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine-duocarmycin. Tumor volume was measured with digital calipers 32 days after injection, twice a week. Tumor volume is calculated by length x (width) 2 x 0.5, where the length is the longest axis and the width is the distance perpendicular to the length. Systemic toxicity was assessed by measuring body weight twice a week. Mice were sacrificed 35 days after injection, tumors were dissected and weighed.

実施例１２：免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
Ａ５４９（１×１０７細胞）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側わき腹の皮下に注射した。平均腫瘍体積が５００ｍｍ３に到達したとき、腫瘍を有するマウスに、下記の単一腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を投与した：グループＩは、１４４μｇのパリビズマブ及び１．８５μｇのコチニン−ビオチンを投与；グループＩＩは、２００μｇのＥＲＣ６及びビヒクル（蒸留水）を投与；グループＩＩＩは、ＥＲＣ６（２００μｇ）及びコチニン−ビオチン（１．８５μｇ）の複合体を投与。注射してから２４時間後にマウスをイソフルランで麻酔し、ＰＢＳ内の４％［ｗ／ｖ］パラホルムアルデヒド１０ｍｌで経心腔的潅流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）で安楽死した。解剖された腫瘍を４℃で２４時間の間、ＰＢＳ中に３０％［ｗ／ｖ］スクロースを含む凍結保存溶液中に平衡化し、最適切断温度（ＯＣＴ）を有する内装培地（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に入れて凍結し、切開するまで−８０℃で保存した。免疫蛍光染色のために、４μｍの厚さで凍結切片（ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎｓ）を準備し、ＰＢＳ内の４％パラホルムアルデヒドで１０分間室温で固定した。ＰＢＳで洗浄した後、前記切片（ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を室温で１時間の間、ＩＨＣ−Ｔｅｋ 抗体希釈液（ｐＨ７．４）（ＩＨＣ ＷＯＲＬＤ，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＭＤ， ＵＳＡ）内の１０％［ｖ／ｖ］正常ヤギ血清（ｎｏｒｍａｌ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）（ＣＳＴ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）で遮断した。前記組織切片をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合したストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）と共に８時間培養し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４結合した抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）で４℃の暗くて湿ったチャンバで１６時間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、製造者の指示に従って４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドル（ＤＡＰＩ；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）で核を染色した。前記切片を蛍光固定培地（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にスライド上に固定し、ＦＶ１０００レーザースキャニング顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてＦＶ１０ ＡＳＷソフトウェアで４０倍の拡大イメージを得た。放出及び励起フィルターは同時に３色イメージ化するように配列した。 Example 12: Immunofluorescence (Immunofluorescence)
A549 (1 × 10 7 cells) was injected subcutaneously into the left and right flank of Balb / c nude mice. When the mean tumor volume reached 500 mm 3 , tumor-bearing mice were administered the following single intraperitoneal (ip) injection: Group I received 144 μg palivizumab and 1.85 μg cotinine-biotin. Administration; Group II administered 200 μg ERC6 and vehicle (distilled water); Group III administered ERC6 (200 μg) and cotinine-biotin (1.85 μg) complex. Twenty-four hours after injection, mice were anesthetized with isoflurane and euthanized with 10 ml of 4% [w / v] paraformaldehyde in PBS for transcardial perfusion. Dissected tumors were equilibrated in a cryopreservation solution containing 30% [w / v] sucrose in PBS for 24 hours at 4 ° C., and an internal medium with optimal cutting temperature (OCT) (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA), frozen and stored at −80 ° C. until incision. For immunofluorescence staining, cryosections at 4 μm thickness were prepared and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 10 minutes at room temperature. After washing with PBS, the sections were 10% [v / v] normal in IHC-Tek antibody dilution (pH 7.4) (IHC WORLD, Woodstock, MD, USA) for 1 hour at room temperature. Blocked with normal goat serum (CST, Danvers, MA, USA). The tissue sections were incubated with Alexa Fluor 488-conjugated streptavidin (Molecular Probes Inc., Eugene, Oreg., USA) for 8 hours and darkened at 4 ° C. with Alexa Fluor 594-conjugated anti-human IgG antibody (Molecular Probes Inc.). Stained for 16 hours in a wet chamber. After washing with PBS, nuclei were stained with 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Pierce, Rockford, IL, USA) according to the manufacturer's instructions. The sections were fixed on slides with fluorescent fixation medium (DAKO, Glostrup, Denmark), and 40-fold magnified images were obtained with FV10 ASW software using an FV1000 laser scanning microscope (Olympus, Tokyo, Japan). The emission and excitation filters were arranged to image three colors simultaneously.

統計分析
実験に使用された統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。結果は、表示された独立的な測定回数に対する±標準偏差（ＳＤ）の平均値で示した。統計的有意性は、２標本スチューデントｔ検定（ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）を用いて決定し、０．０５未満のｐ値は統計的に重要なものとして看做した。Ｐ値は、図面及びその凡例で示した。 Statistical analysis Statistics used for the experiments were performed using GraphPad Prism version 5.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). The result was shown by the average value of +/- standard deviation (SD) with respect to the independent measurement number displayed. Statistical significance was determined using a two-sample student unpaired Student's t-test, and a p-value less than 0.05 was considered statistically significant. P values are shown in the drawing and its legend.

実験例１：４価の二重特異性抗体フォーマットを用いた抗体薬物複合体プラットホームの設計
重鎖のＣＨ３ドメインに二つの一本鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）を融合することでＩｇＧに基づく４価のフォーマットで二重特異性抗体を設計した（図１ａ）。柔軟性のために、グリシン及びセリンの豊富なペプチドリンカー［（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３］をＣＨ３ドメインとｓｃＦｖとの間に挿入した。これによって、二重特異性抗体の二つのＦａｂアーム及び重鎖のＣ末端上における二つのｓｖＦｖを含む４価の抗体が生成され、各々上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）とコチニンとを同時に標的化した。二重特異的セツキシマブ×抗コチニンｓｃＦｖ抗体（ＥＲＣ６）を開発するために、セツキシマブＩｇＧ、リンカー及び抗コチニンｓｃＦｖをコーディングする遺伝子構造を真核発現ベクターにクローニングした。ＥＲ６は、タンパク質Ａ親和性カラムクロマトグラフィーを用いて一時的に形質導入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＨＥＫ３９３Ｆ培養上澄液から精製した。 Experimental Example 1: Design of an antibody drug conjugate platform using a tetravalent bispecific antibody format Tetravalent based on IgG by fusing two single chain antibodies (scFvs) to the C H 3 domain of the heavy chain Bispecific antibodies were designed in the format of (Figure 1a). For flexibility, a peptide linker rich in glycine and serine [(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 ] was inserted between the C H 3 domain and the scFv. This produces a tetravalent antibody containing two Fab arms of the bispecific antibody and two svFvs on the C-terminus of the heavy chain, each targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) and cotinine simultaneously. did. In order to develop a bispecific cetuximab × anti-cotinine scFv antibody (ERC6), the gene structure encoding cetuximab IgG, linker and anti-cotinine scFv was cloned into a eukaryotic expression vector. ER6 was purified from HEK393F culture supernatants that were transiently transfected using protein A affinity column chromatography.

従来の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、抗体に薬物を結合するとき、複合体に対する多段階の過程を要し、通常、最適化過程が必須となる。一方、コチニン結合の二重特異性抗体を使用する薬物の標的伝達は、コチニンと薬物との接合を要する。そこで、カルボキシコチニン（トランス−４−コチニンカルボキシル酸）化学架橋段階をよく確立すれば、従来のＡＤＣよりもプラットホームに利点がある。二つのカルボキシコチニンは、１３個のアミノ酸長さのペプチドのＮ末端及びＣ末端で架橋結合した。二価のコチニン架橋結合したペプチドに対する二重特異性抗体の結合力は、原子価（ｖａｌｅｎｃｙ）効果によってより安定した（図５）。目的に応じてペプチド内のリシンのε−アミノ酸鎖に多様なペイロードを結合することができる。本発明において、ビオチンまたはデュオカルマイシンを二価のコチニンが複合されたペプチドに結合させた（図２ｂ、図３ｃ）。   Conventional antibody-drug conjugates (ADC) require a multi-step process for the conjugate when a drug is bound to an antibody, and usually an optimization process is essential. On the other hand, target delivery of drugs using cotinine-binding bispecific antibodies requires conjugation of cotinine with the drug. Therefore, if the carboxycotinine (trans-4-cotinine carboxylic acid) chemical cross-linking step is well established, the platform has advantages over conventional ADCs. Two carboxycotinines were cross-linked at the N-terminus and C-terminus of a 13 amino acid long peptide. The binding power of the bispecific antibody to the bivalent cotinine cross-linked peptide was more stable due to the valence effect (FIG. 5). Depending on the purpose, various payloads can be bound to the ε-amino acid chain of lysine in the peptide. In the present invention, biotin or duocarmycin was bound to a peptide conjugated with divalent cotinine (FIGS. 2b and 3c).

実験例２：二重特異的セツキシマブ×抗コチニンｓｃＦｖ抗体（ＥＲＣ６）の特徴
精製されたＥＲＣ６の純度及び分子量を分析するために、ＥＲＣ６をクマシーブリリアントブルーで染色されたソジウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルで視覚化した。２０６ｋＤａの分子量を有する主要バンドは、非還元条件で観察されており、７８ｋＤａ及び２５ｋＤａの二つの主要バンドが還元条件で観察された（図１ｂ）。２０６ｋＤａの分子量を有する再組合タンパク質は、ＰｒｏｔＰａｒａｍツール（ＥｘＰＡＳｙ）によって予測された、完全に組み立てられたＥＲＣ６に相応する。２５ｋＤａの非変形の軽鎖及び７５ｋＤａのＣＨ３ドメイン上における一つのｓｃＦｖと融合した重鎖は、二硫化結合の減少によって視覚化した。したがって、データは、二重特異性抗体が純粋で損傷なく製造されたことを立証した。 Experimental Example 2: Characteristics of bispecific cetuximab x anti-cotinine scFv antibody (ERC6) To analyze the purity and molecular weight of purified ERC6, sodium dodecyl sulfate (SDS) poly stained with ERC6 stained with Coomassie Brilliant Blue Visualized on an acrylamide gel. A major band with a molecular weight of 206 kDa was observed under non-reducing conditions, and two major bands at 78 kDa and 25 kDa were observed under reducing conditions (FIG. 1b). The recombination protein with a molecular weight of 206 kDa corresponds to the fully assembled ERC6 predicted by the ProtParam tool (ExPASy). The heavy chain fused to one scFv on the 25 kDa unmodified light chain and the 75 kDa C H 3 domain was visualized by disulfide bond reduction. Thus, the data demonstrated that the bispecific antibody was produced pure and undamaged.

精製された再組合タンパク質の物理化学的性質を高圧液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィで分析した。ＥＲＣ６は、正しく組み立てられた形態に相応する明確な分子量を有する単一主要ピークとして示された。このようなデータは、ＥＲＣ６が切片を生産せず、凝集することなく、マルチマー（ｍｕｌｔｉ−ｍｅｒｓ）を生産することを示す（図１ｃ）。   The physicochemical properties of the purified recombined protein were analyzed by size exclusion chromatography using high pressure liquid chromatography (SEC-HPLC). ERC6 was shown as a single major peak with a well-defined molecular weight corresponding to the correctly assembled form. Such data indicate that ERC6 does not produce sections and does not aggregate, producing multi-mers (FIG. 1c).

また、薬物動態分析をインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でＥＲＣ６の安定性を測定するために行った。ＥＲＣ６の血清半減期をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）から決定した。ＥＲＣ６の循環血清水準は、眼窩内の静脈から得た血液サンプルを用いて酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。静脈内に注入されたＥＲＣ６は、マウスの血清で５日目まで安定し、これは、セツキシマブＩｇＧの結果と類似であった。   Pharmacokinetic analysis was also performed to measure the stability of ERC6 in vivo. The serum half-life of ERC6 was determined from Balb / c mice (n = 4). Circulating serum levels of ERC6 were determined by enzyme immunoassay (ELISA) using blood samples obtained from intraorbital veins. ERC6 injected intravenously was stable up to day 5 in mouse serum, which was similar to that of cetuximab IgG.

実験例３：ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６結合反応性
ＥＧＦＲ及びコチニンに対してＥＲＣ６の反応性を実験するために、酵素免疫測定による分析を適用した（図２ａ）。ＥＧＦＲに対するＥＲＣ６の結合活性が確認されることで、ＥＧＦＲに対する反応性が追加的ｓｃＦｖとは関係ないことが立証された。また、コチニンに対する抗コチニンｓｃＦｖモジュールの親和度が維持されたことが確認された（図２ａ）。 Experimental Example 3: Reactivity of ERC6 binding to human EGFR and cotinine To investigate the reactivity of ERC6 to EGFR and cotinine, an analysis by enzyme immunoassay was applied (Fig. 2a). Confirmation of the binding activity of ERC6 to EGFR demonstrated that reactivity to EGFR was not related to additional scFv. It was also confirmed that the affinity of the anti-cotinine scFv module for cotinin was maintained (FIG. 2a).

ＥＲＣ６がヒトＥＧＦＲ及びコチニンに同時に結合するか否かを決定するために、ストレプトアビジン−ビオチン検出システムを用いて追加的な酵素免疫測定を行った。ヒトＥＧＦＲコーティングされたマイクロタイタープレートをＥＲＣ６と共に培養した後、ビオチンと架橋結合した二価のコチニン結合したペプチド（コチニン−ビオチン）（図２ｂ）を各ウェルに添加した後、ＨＲＰ結合したストレプトアビジンを添加した。ＥＲＣ６は、ＥＧＦＲとコチニンとに同時に結合した（図２ｃ）。   To determine whether ERC6 binds simultaneously to human EGFR and cotinine, additional enzyme immunoassays were performed using a streptavidin-biotin detection system. After culturing human EGFR-coated microtiter plates with ERC6, bivalent cotinine-linked peptide (cotinin-biotin) cross-linked with biotin (FIG. 2b) was added to each well, and then HRP-conjugated streptavidin was added. Added. ERC6 bound to EGFR and cotinine simultaneously (FIG. 2c).

ＥＲＣ６との複合体を形成するとき、コチニンペイロードの安全性を評価するために、薬物動態分析を行った。コチニン−ビオチンで予め培養されたＥＲＣ６をマウス（ｎ＝４）の静脈に注射して循環血清水準をＥＬＩＳＡによって測定した。コチニンペイロードは、その低い分子量（ｔ１／２＝０．５５７ｈ）によってマウス血流で迅速に除去される。一方、コチニン−ビオチンの循環半減期は、ＥＲＣ６に結合することで延長される（ｔ１／２＝１８時間）（図２ｄ）。コチニンに対するＥＲＣ６の二元性は、増加した結合力によってＥＲＣ６の複合コチニン−ビオチンの安定性を向上させる（図６）。また、コチニン−ビオチンのクリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）パターンは、ＥＲＣ６の分解パターンと一致し、これは、複合体の半減期が主にＥＲＣ６の薬物動態に依存することを意味する（図２ｄ）。 In order to evaluate the safety of the cotinine payload when complexed with ERC6, a pharmacokinetic analysis was performed. ERC6 pre-cultured with cotinine-biotin was injected into the vein of mice (n = 4) and circulating serum levels were measured by ELISA. The cotinine payload is cleared rapidly in the mouse bloodstream by its low molecular weight (t 1/2 = 0.557 h). On the other hand, the circulating half-life of cotinine-biotin is prolonged by binding to ERC6 (t 1/2 = 18 hours) (FIG. 2d). The duality of ERC6 to cotinine improves the stability of the complex cotinine-biotin of ERC6 due to increased binding force (FIG. 6). The cotinine-biotin clearance pattern is also consistent with the degradation pattern of ERC6, which means that the half-life of the complex depends mainly on the pharmacokinetics of ERC6 (FIG. 2d).

実験例４：ＫＲＡＳ変異を有する肺腺癌細胞に力強い細胞毒性効果を誘発するＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシン
Ａ５４９は、セツキシマブのようなＥＧＦＲ標的治療に対する一次抵抗性を示すＫＲＡＳ突然変異と共に野生型ＥＧＦＲを発現する肺腺癌細胞株である。したがって、野生型のＥＧＦＲ及びＫＲＡＳ突然変異を有する癌細胞にＥＲＣ６結合したコチニン細胞毒性剤の効能をテストするために前記細胞株を使用した。 Example 4: ERC6 complex cotinine-duocarmycin A549 induces a potent cytotoxic effect on lung adenocarcinoma cells with KRAS mutations, wild type with KRAS mutations showing primary resistance to EGFR targeted treatments such as cetuximab A lung adenocarcinoma cell line that expresses EGFR. Therefore, the cell line was used to test the efficacy of ERC6-bound cotinine cytotoxic agents on cancer cells with wild-type EGFR and KRAS mutations.

細胞毒性分析に先立ち、Ａ５４９細胞の表面におけるＥＧＦＲの発現は流動細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって確認した（図３ａ）。ＥＲＣ６は、セツキシマブと類似の水準で原形質膜に発現したＥＧＦＲと類似の結合活性を示した。予想のとおり、コチニン−ビオチンは、ＥＲＣ６が存在するときのみにＡ５４９細胞に結合活性を示した。コチニン−ビオチン及び抗コチニンＩｇＧまたはセツキシマブの混合物は、ストレプトアビジン−ＰＥに起因した有意味な信号を生成しなかった。さらに、コチニン−ビオチンは、ＥＧＦＲに対するＥＲＣ６の結合能力に影響を及ぼさなかった。このようなデータは、ＥＲＣ６が同時結合活性によって標的特異的方式でＥＧＦＲ 陽性細胞にコチニン−ビオチンの伝達を媒介することを立証する。   Prior to cytotoxicity analysis, EGFR expression on the surface of A549 cells was confirmed by flow cytometry analysis (FIG. 3a). ERC6 showed similar binding activity to EGFR expressed in the plasma membrane at a level similar to cetuximab. As expected, cotinine-biotin showed binding activity on A549 cells only in the presence of ERC6. Mixtures of cotinine-biotin and anti-cotinine IgG or cetuximab did not produce meaningful signals due to streptavidin-PE. Furthermore, cotinine-biotin did not affect the binding ability of ERC6 to EGFR. Such data demonstrates that ERC6 mediates cotinine-biotin transmission to EGFR positive cells in a target specific manner by co-binding activity.

Ａ５４９細胞に対する細胞毒性活性は、細胞生存能分析によって調査した（図３ｅ）。相対的な細胞生存力は生存可能な細胞数と直接的に関連する細胞ＡＴＰ含量を測定することで決定した。ペイロードのないデュオカルマイシン（自由デュオカルマイシン）は、コチニン−デュオカルマイシンよりも強力な抗腫瘍効果を示した（図３ｄ、図３ｅ）。コチニン−デュオカルマイシンの毒性が自由デュオカルマイシンよりも低ければ、細胞質膜を介した浸透が余り効率的ではない。   Cytotoxic activity against A549 cells was investigated by cell viability analysis (FIG. 3e). Relative cell viability was determined by measuring cellular ATP content directly related to viable cell number. Duocarmycin without payload (free duocarmycin) showed a stronger antitumor effect than cotinine-duocarmycin (FIGS. 3d, 3e). If the toxicity of cotinine-duocarmycin is lower than that of free duocarmycin, the permeation through the cytoplasmic membrane is not very efficient.

ＥＲＣ６またはセツキシマブもＡ５４９細胞のＥＧＦＲ標的治療に対する一次抵抗性のため、Ａ５４９細胞の増殖を有意味に抑制できなかった（図３ｅ）。しかし、ＥＲＣ６とコチニン−デュオカルマイシンとを組み合わせた場合、セツキシマブまたは陰性対照群の抗体と比較するとき、コチニン−デュオカルマイシン混合物に比べて細胞毒性効果が大幅向上した。   Neither ERC6 nor cetuximab could significantly suppress A549 cell proliferation due to primary resistance to EGFR targeted treatment of A549 cells (FIG. 3e). However, when ERC6 and cotinine-duocarmycin were combined, the cytotoxic effect was greatly improved when compared to the cetuximab or negative control antibody compared to the cotinine-duocarmycin mixture.

最大抑制濃度の半分（ＩＣ５０）は、０．３ｎＭである。実験結果は、ＥＲＣ６が受容体を介した飲食作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって、ＥＧＦＲ陽性細胞へのコチニン−デュオカルマイシンの内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を効率的に促進することを立証した。結果的に、ＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンは、セツキシマブのＫＲＡＳ媒介の一次抵抗性を克服することができた。
また、追加実験によってＥＲＣ６とコチニン−エムタンシン（Ｃｏｔ−ＤＭ１）とが組み合わされた抗体薬物複合体の細胞毒性効果を実験した。このような抗体薬物複合体も、前記コチニン−デュオカルマイシンが組み合わせられた複合体と同様に、Ａ５４９細胞株に対して著しく高い細胞毒性効果を示した（図６ｂ）。 Half of the maximum inhibitory concentration (IC 50 ) is 0.3 nM. The experimental results demonstrated that ERC6 efficiently promotes the internalization of cotinine-duocarmycin into EGFR positive cells by receptor-mediated endocytic action. Consequently, ERC6 complex cotinine-duocarmycin was able to overcome the KRAS-mediated primary resistance of cetuximab.
In addition, the cytotoxic effect of the antibody-drug conjugate in which ERC6 and cotinine-emtansine (Cot-DM1) were combined was tested as an additional experiment. Such an antibody-drug conjugate also showed a remarkably high cytotoxic effect on the A549 cell line, as was the case with the cotinine-duocarmycin combination (FIG. 6b).

実験例５：肺腺癌を有する動物モデルにおいて腫瘍の成長を抑制するＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシン
ＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）効能を評価するために、セツキシマブ−難治性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）Ａ５４９細胞をマウス（ｎ＝４／グループ）に移植した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のデュオカルマイシンを５週間腹腔内に注射した。マウスに薬物を２週間は週２回、その後、３週間は週３回投与した。 Experimental Example 5: In order to evaluate the in vivo efficacy of ERC6 complex cotinine-duocarmycin that inhibits tumor growth in an animal model with lung adenocarcinoma, cetuximab-refractory Reflexory A549 cells were transplanted into mice (n = 4 / group). When the tumor volume reached 150 mm 3 , palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 conjugated duocarmycin were injected intraperitoneally for 5 weeks. Mice were dosed twice weekly for 2 weeks and then 3 times weekly for 3 weeks.

ＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンを投与したマウスは、コチニン−デュオカルマイシンまたはＥＲＣ６単独で処理した動物に比べて腫瘍の成長が抑制されることが示された（図４ａ）。コチニン−デュオカルマイシンがインビトロでＡ５４９に強力な抗増殖効果を示したが、二重特異性抗体の同型（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群は、インビボで腫瘍の成長を抑制することができなかった。このような観察結果は、インビボの条件下でコチニン−デュオカルマイシンのみが選択的に腫瘍部位に伝達され、腫瘍の成長を抑制することができないことを示す。非特異性及び低い分子量によるマウスの血流からの迅速な除去は、このような効能不足を説明することができる。一方、ＥＲＣ６は、コチニンデュオカルマイシンの循環半減期を延長し、ＥＧＦＲ発現腫瘍組織に伝達されるようにする。したがって、ＥＲＣ６及びコチニン−デュオカルマイシンは、インビボにおけるＥＧＦＲ陽性セツキシマブ−難治性腫瘍において抗増殖効能を相乗的に向上させる。   Mice treated with ERC6 conjugated cotinine-duocarmycin were shown to suppress tumor growth compared to animals treated with cotinine-duocarmycin or ERC6 alone (FIG. 4a). While cotinine-duocarmycin showed a potent antiproliferative effect on A549 in vitro, the bispecific antibody isotype control group was unable to inhibit tumor growth in vivo. Such observations indicate that under in vivo conditions, only cotinine-duocarmycin is selectively transmitted to the tumor site and cannot inhibit tumor growth. Rapid removal from the bloodstream of mice due to non-specificity and low molecular weight can explain this lack of efficacy. ERC6, on the other hand, extends the circulating half-life of cotinine duocarmycin and is transmitted to EGFR-expressing tumor tissue. Thus, ERC6 and cotinine-duocarmycin synergistically improve anti-proliferative efficacy in EGFR positive cetuximab-refractory tumors in vivo.

また、５週間の処理期間の間、マウスの有意味な体重減少はなかった（図４ｂ）。このような観察結果は、間接的にＥＲＣ６及びコチニン−デュオカルマイシンには全身毒性がないことを意味する。結果的に、このようなデータは、ＥＲＣ６が薬物伝達体として作用し、全身毒性なく標的特異的な方式でコチニン結合細胞毒性薬物をＥＧＦＲ発現腫瘍組織に選択的に伝達することができることを示す。   Also, there was no significant weight loss of mice during the 5 week treatment period (FIG. 4b). Such observations imply that ERC6 and cotinine-duocarmycin are not systemically toxic. Consequently, such data indicate that ERC6 acts as a drug carrier and can selectively transmit cotinine-binding cytotoxic drugs to EGFR-expressing tumor tissues in a target specific manner without systemic toxicity.

実験例６：マウス異種移植腫瘍モデルにおけるＥＲＣ６複合のコチニンペイロードの組織分布
薬物動態分析は、ＥＲＣ６複合されたペイロードの循環半減期がＥＲＣ６に結合することで延長されることを立証した。抗原発現腫瘍組織へのコチニンペイロードの特異的伝達を調査するために、Ａ５４９異種移植マウスモデルにおいて免疫蛍光分析を行った。Ａ５４９細胞を、各Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側わき腹の皮下に注射した。腫瘍が５００ｍｍ３に至ったとき、腫瘍保有マウスにパリビズマブ及びコチニン−ビオチン、セツキシマブ及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンを腹腔内に注射した。注射してから２４時間後に動物を犠牲させ、解剖した腫瘍組織をエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）イメージ化した。腫瘍組織上のコチニンペイロード及び抗体を蛍光標識された二次抗体を通じて検出した。抗体は、Ａｌｅｘａ ５９４標識された抗ヒトＦｃ（赤色）によって検出され、コチニン−ビオチンは、Ａｌｅｘａ ４８８標識されたストレプトアビジン（緑色）によって検出された。参照までに、核はＤＡＰＩ（青色）で染色し、イメージ倍率は×４０であった。共焦点顕微鏡によってＥＲＣ６複合コチニン−ビオチンの組織分布を観察した。 Experimental Example 6: Tissue Distribution of ERC6 Complexed Cotinine Payload in a Mouse Xenograft Tumor Model Pharmacokinetic analysis demonstrated that the circulating half-life of ERC6 complexed payload was extended by binding to ERC6. To investigate the specific transmission of cotinine payload to antigen-expressing tumor tissue, immunofluorescence analysis was performed in an A549 xenograft mouse model. A549 cells were injected subcutaneously into the left flank of each Balb / c nude mouse. When tumors reached 500 mm 3 , tumor-bearing mice were injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-biotin, cetuximab and vehicle or ERC6-conjugated cotinine-biotin. Animals were sacrificed 24 hours after injection and dissected tumor tissue was imaged ex vivo. Cotinine payload and antibodies on the tumor tissue were detected through a fluorescently labeled secondary antibody. The antibody was detected with Alexa 594 labeled anti-human Fc (red) and cotinine-biotin was detected with Alexa 488 labeled streptavidin (green). For reference, nuclei were stained with DAPI (blue) and image magnification was x40. The tissue distribution of ERC6 complex cotinine-biotin was observed with a confocal microscope.

二重特異性抗体の同型（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群で使われたパリビズマブと比較するとき、ヒトＥＧＦＲ陽性腫瘍組織にＥＲＣ６の蓄積が観察された。また、コチニン−ビオチンの腫瘍内における位置は、ＥＲＣ６を注射した場合のみに観察された。ＥＲＣ６のないコチニン−ビオチンは、その低い分子量のため血流から速く除去される。このような観察結果は、ＥＲＣ６が標的特異的方式でインビボで希望する腫瘍部位に選択的にコチニンペイロードを伝達するということを証明する。   ERC6 accumulation was observed in human EGFR positive tumor tissues when compared to the palivizumab used in the isotype control group of bispecific antibodies. In addition, the position of cotinine-biotin in the tumor was observed only when ERC6 was injected. Cotinine-biotin without ERC6 is rapidly removed from the bloodstream due to its low molecular weight. Such observations demonstrate that ERC6 selectively transmits the cotinine payload to the desired tumor site in vivo in a target specific manner.

図１ａは、二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）の生成及び特性を示す。図１ａは、二重特異性抗体を用いた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）プラットホームの概略図である。二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）は、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンペイロードへの結合特異性を共に有するように設計される。FIG. 1a shows the generation and properties of a bispecific (cetuximab × anti-cotinine) antibody (ERC6). FIG. 1a is a schematic diagram of an antibody drug conjugate (ADC) platform using a bispecific antibody. Bispecific (cetuximab x anti-cotinine) antibody (ERC6) is designed to have both binding specificity for human EGFR and cotinine payload. 図１ｂは、二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）の生成及び特性を示す。図１ｂは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。精製されたＥＲＣ６を４〜１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに投入した。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色することでバンドを視覚化した。一番または二番レーンは、各々還元剤があるか、またはないサンプルである。FIG. 1b shows the generation and properties of a bispecific (cetuximab × anti-cotinine) antibody (ERC6). FIG. 1 b shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Purified ERC6 was loaded into 4-12% (w / v) SDS-PAGE. Bands were visualized by staining the gel with Coomassie Brilliant Blue. The first or second lane is a sample with or without a reducing agent, respectively. 図１ｃは、二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）の生成及び特性を示す。図１ｃは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）である。高性能の液体クロマトグラフィーを用いたＳＥＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって精製されたＥＲＣ６を分析した。FIG. 1c shows the generation and properties of a bispecific (cetuximab × anti-cotinine) antibody (ERC6). FIG. 1c is size exclusion chromatography (SEC). ERC6 purified by SEC using high performance liquid chromatography (SEC-HPLC) was analyzed. 図１ｄは、二重特異性（セツキシマブ×抗コチニン）抗体（ＥＲＣ６）の生成及び特性を示す。図１ｄは、ＥＲＣ６の薬物動態の分析結果を示す。２００μｇのＥＲＣ６をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の静脈内に注射し、血液サンプルを眼窩内の静脈から収集した。ＥＲＣ６の循環血清水準を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって分析した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。FIG. 1d shows the generation and properties of a bispecific (cetuximab × anti-cotinine) antibody (ERC6). FIG. 1 d shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6. 200 μg of ERC6 was injected intravenously into Balb / c mice (n = 4) and blood samples were collected from intraorbital veins. Circulating serum levels of ERC6 were analyzed by enzyme immunoassay (ELISA). Results are expressed as mean ± SD from three experiments. 図２ａは、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６の結合反応性を示す。図２ａは、酵素免疫測定法による結果を示す。セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧ及びＥＲＣ６を、ヒトＥＧＦＲまたはコチニンがコーティングされたマイクロタイタープレートのウェルに添加した。ウェルをＨＲＰ複合の抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ−特異的）抗体で探知した（ｐｒｏｂｅｄ）。FIG. 2a shows the binding reactivity of ERC6 to human EGFR and cotinine. FIG. 2a shows the results from enzyme immunoassay. Cetuximab, anti-cotinine IgG and ERC6 were added to wells of microtiter plates coated with human EGFR or cotinine. Wells were probed with HRP-conjugated anti-human IgG (Fab-specific) antibody. 図２ｂは、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６の結合反応性を示す。図２ｂは、架橋結合したｄＰＥＧ６ビオチンと二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す （コチニン−ビオチン）。FIG. 2b shows the binding reactivity of ERC6 to human EGFR and cotinine. FIG. 2b shows the chemical structure of a cross-linked dPEG6 biotin and a divalent cotinine-conjugated peptide (cotinine-biotin). 図２ｃは、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６の結合反応性を示す。図２ｃは、セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧ及びＥＲＣ６をヒトＥＧＦＲでコーティングされたマイクロタイタープレートの他のウェルに添加した後、コチニン−ビオチンを添加し、ウェルをＨＲＰ結合のストレプトアビジンで探知した結果である。バックグラウンド信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｓｉｇｎａｌ）は、ＢＳＡでコーティングされた対照群のウェルで測定した。吸光度は、６５０ｎｍにて測定した。FIG. 2c shows the binding reactivity of ERC6 to human EGFR and cotinine. FIG. 2c is the result of adding cetuximab, anti-cotinine IgG and ERC6 to other wells of a microtiter plate coated with human EGFR, then adding cotinine-biotin, and detecting the wells with HRP-conjugated streptavidin. . Background signals were measured in control wells coated with BSA. Absorbance was measured at 650 nm. 図２ｄは、ヒトＥＧＦＲ及びコチニンへのＥＲＣ６の結合反応性を示す。図２ｄは、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの薬物動態の分析結果を示す。１００μＬの滅菌ＰＢＳに溶解した１．８５μｇのコチニン−ビオチンと共に、事前培養した２００μｇのＥＲＣ６をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝４）の静脈に注射した。血液サンプルを眼窩内の静脈から収集し、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの循環血清水準をＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。FIG. 2d shows the binding reactivity of ERC6 to human EGFR and cotinine. FIG. 2d shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6 complex cotinine-biotin. 200 μg ERC6 pre-cultured with 1.85 μg cotinine-biotin dissolved in 100 μL sterile PBS was injected into the vein of Balb / c mice (n = 4). Blood samples were collected from intraorbital veins and circulating serum levels of ERC6-conjugated cotinine-biotin were measured by ELISA. Results are expressed as mean ± SD from three experiments. 図３ａは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ａは、流動細胞分析結果である。コチニン−ビオチンが存在するか、存在しない場合、セツキシマブ、抗コチニンＩｇＧまたはＥＲＣ６と共にＡ５４９細胞を培養した。分析のために、細胞をＰＥ接合したストレプトアビジン及びＦＩＴＣ接合した抗ヒトＦｃで探知した。FIG. 3a shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on an EGFR positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 3a is a flow cell analysis result. In the presence or absence of cotinine-biotin, A549 cells were cultured with cetuximab, anti-cotinine IgG or ERC6. For analysis, cells were detected with PE-conjugated streptavidin and FITC-conjugated anti-human Fc. 図３ｂは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ｂは、自由デュオカルマイシン（ｆｒｅｅ ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）の構造を示す。FIG. 3b shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on an EGFR positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 3b shows the structure of free duocarmycin. 図３ｃは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ｃは、四つのデュオカルマイシンと架橋結合した二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す（コチニン−デュオカルマイシン）。Ｒは、バリン−シトルリンＰＡＢ連結されたジメチルアミノエチルデュオカルマイシンを示す。FIG. 3c shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on an EGFR-positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 3c shows the chemical structure of a bivalent cotinine-conjugated peptide cross-linked with four duocarmycins (cotinin-duocarmycin). R represents valine-citrulline PAB-linked dimethylaminoethyl duocarmycin. 図３ｄは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ｄは、自由デュオカルマイシンの細胞生存力の分析結果である。FIG. 3d shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on EGFR-positive lung adenocarcinoma cell lines. FIG. 3d shows the results of cell viability analysis of free duocarmycin. 図３ｅは、ＥＧＦＲ陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。図３ｅは、コチニン−デュオカルマイシンの細胞生存力の分析結果である。Ａ５４９細胞株をパリビズマブ及びＤＭＳＯ（●）；セツキシマブ及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの四角）；ＥＲＣ６及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの三角）；パリビズマブ及びデュオカルマイシン（○）；セツキシマブ及びデュオカルマイシン（□）；ＥＲＣ６及びデュオカルマイシン（△）で処理した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型の対照群として用いられた。ＤＭＳＯは、コチニン−デュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いられた。細胞を７２時間培養した後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を用いて細胞のＡＴＰ含量を測定することで相対的な細胞生存力を測定した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。FIG. 3e shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-duocarmycin on an EGFR positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 3e is the analysis result of cell viability of cotinine-duocarmycin. A549 cell lines were transformed into palivizumab and DMSO (●); cetuximab and DMSO (filled squares); ERC6 and DMSO (filled triangles); palivizumab and duocarmycin (◯); cetuximab and duocarmycin (□); ERC6 and duo Treated with carmycin (Δ). Palivizumab was used as a homotypic control group of bispecific antibodies. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine-duocarmycin. After culturing the cells for 72 hours, relative cell viability was measured by measuring the ATP content of the cells using Cell Titer-Glo reagent. Results are expressed as mean ± SD from three experiments. 図４ａは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ａは、腫瘍の体積を３２日間測定した結果である。FIG. 4a shows the enhanced antiproliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4a shows the results of measuring the tumor volume for 32 days. 図４ｂは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ｂは、体重を処理期間の間に観察した結果である。FIG. 4b shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4b is the result of observing body weight during the treatment period. 図４ｃは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ｃは、３２日目の平均腫瘍体積である。FIG. 4c shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4c is the average tumor volume at day 32. 図４ｄは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ｄは、マウスが犠牲されたとき、解剖された腫瘍の平均質量である。FIG. 4d shows the enhanced anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4d is the average mass of the dissected tumor when the mouse is sacrificed. 図４ｅは、マウス異種移植腫瘍モデルにおいてＥＲＣ６複合のコチニンデュオカルマイシンの増進した抗増殖効果を示す。Ａ５４９細胞を各々の Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの左側及び右側のわき腹の皮下に注射した。腫瘍の体積が１５０ｍｍ３に至ったとき、マウスを三つのグループにランダムで分けて（ｎ＝４／グループ）５週間処理した。各グループを、パリビズマブ及びコチニン−デュオカルマイシン、ＥＲＣ６及びビヒクルまたはＥＲＣ６複合のコチニン−デュオカルマイシンで腹腔内に注射した。パリビズマブは、二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯは、コチニンデュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。図４ｅは、終点（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ）で三つの処理グループの腫瘍の写真を示す。結果は、平均±ＳＤで示した；グループと比較＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。FIG. 4e shows the enhanced antiproliferative effect of ERC6-conjugated cotinine duocarmycin in a mouse xenograft tumor model. A549 cells were injected subcutaneously into the left and right flank of each Balb / c nude mouse. When the tumor volume reached 150 mm 3 , the mice were randomly divided into three groups (n = 4 / group) and treated for 5 weeks. Each group was injected intraperitoneally with palivizumab and cotinine-duocarmycin, ERC6 and vehicle or ERC6 complex cotinine-duocarmycin. Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine duocarmycin. FIG. 4e shows a picture of the tumors of the three treatment groups at the end point. Results are expressed as mean ± SD; compared to groups * P <0.05, ** P <0.01, Student's t test. 図５は、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの薬物動態の分析結果である。（ａ）１００μＬの滅菌ＰＢＳに１：１モル比で溶解された９６４ｐｍｏｌｅのコチニン−ビオチンで事前培養した２００μｇのＥＲＣ６を、Ｂａｌｂ／ｃ マウス（ｎ＝４）の静脈内に注射した。ペプチドは、二つのコチニン分子の間に、６ｍｅｒ、１２ｍｅｒまたは１８ｍｅｒの多様な長さを有する。FIG. 5 shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6 complex cotinine-biotin. (A) 200 μg ERC6 pre-cultured with 964 pmole of cotinine-biotin dissolved in a 1: 1 molar ratio in 100 μL sterile PBS was injected intravenously into Balb / c mice (n = 4). Peptides have various lengths of 6 mer, 12 mer or 18 mer between two cotinine molecules. 図５は、ＥＲＣ６複合のコチニン−ビオチンの薬物動態の分析結果である。（ｂ）総ＥＲＣ６の循環血清水準をＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、平均±ＳＤで示した；グループと比較＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントt検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。FIG. 5 shows the pharmacokinetic analysis results of ERC6 complex cotinine-biotin. (B) Circulating serum levels of total ERC6 were measured by ELISA. Results are expressed as mean ± SD; compared to groups * P <0.05, ** P <0.01, Student's t test. 図６は、ＥＧＦＲ−陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−ＤＭ１（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）の抗増殖効果を示す。図６ａは、四つのＤＭ１と架橋結合した二価のコチニン接合したペプチドの化学的構造を示す（コチニン−ＤＭ１）。Ｒは、ＭＣＣ連結されたＤＭ１を示す。FIG. 6 shows the anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-DM1 (emtansine) on an EGFR-positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 6a shows the chemical structure of a bivalent cotinine-conjugated peptide cross-linked with four DM1s (Cotinin-DM1). R indicates DM1 linked by MCC. 図６は、ＥＧＦＲ−陽性肺腺癌の細胞株にＥＲＣ６複合のコチニン−ＤＭ１（ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）の抗増殖効果を示す。図６ｂは、コチニン−ＤＭ１の細胞生存力の分析結果である。Ａ５４９細胞株をパリビズマブ及びＤＭＳＯ（●）；セツキシマブ及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの四角）；ＥＲＣ６及びＤＭＳＯ（塗りつぶしの三角）；パリビズマブ及びコチニン−ＤＭ１（○）；セツキシマブ及びコチニン−ＤＭ１（□）；ＥＲＣ６及びコチニン−ＤＭ１（△）で処理した。パリビズマブを二重特異性抗体の同型対照群として用いた。ＤＭＳＯをコチニン−デュオカルマイシンのビヒクル対照群として用いた。細胞を７２時間培養した後、相対的な細胞生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を用いて細胞ＡＴＰ含量を測定することで決定した。結果は、３回の実験から得た平均±ＳＤで示した。FIG. 6 shows the anti-proliferative effect of ERC6-conjugated cotinine-DM1 (emtansine) on an EGFR-positive lung adenocarcinoma cell line. FIG. 6 b is the analysis result of cell viability of cotinine-DM1. A549 cell lines were transformed into palivizumab and DMSO (●); cetuximab and DMSO (filled squares); ERC6 and DMSO (filled triangles); palivizumab and cotinine-DM1 (◯); cetuximab and cotinine-DM1 (□); -Treated with DM1 (Δ). Palivizumab was used as a homotypic control group for the bispecific antibody. DMSO was used as a vehicle control group for cotinine-duocarmycin. After culturing cells for 72 hours, relative cell viability was determined by measuring cellular ATP content using Cell Titer-Glo reagent. Results are expressed as mean ± SD from three experiments.

Claims (15)

抗コチニン一本鎖可変切片を含む二重特異性抗体と、
ペプチドと架橋結合した二価のコチニン及び薬物の接合体と、を含むことを特徴とする抗体薬物複合体。 A bispecific antibody comprising an anti-cotinine single chain variable section;
An antibody-drug conjugate comprising a conjugate of a bivalent cotinine and a drug cross-linked with a peptide. 前記抗コチニン一本鎖可変切片が、前記二価のコチニンと結合したことを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。   The antibody-drug conjugate according to claim 1, wherein the anti-cotinine single-chain variable section is bound to the divalent cotinin. 前記二価のコチニンは、二つのコチニンが各々６〜１８ｍｅｒペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋結合したことを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。   The antibody-drug conjugate according to claim 1, wherein the bivalent cotinin is obtained by crosslinking two cotinins to the N-terminus and C-terminus of the 6-18mer peptide, respectively. 前記薬物が、二価のコチニンと架橋結合した６〜１８ｍｅｒペプチドにおいてリシン残基と接合したことを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。   The antibody drug conjugate according to claim 1, wherein the drug is conjugated to a lysine residue in a 6-18mer peptide cross-linked to divalent cotinine. 前記二重特異性抗体が、ＣＨ３ドメインと抗コチニン一本鎖可変切片との間にペプチドリンカー（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３が挿入されたことを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。 2. The bispecific antibody, wherein a peptide linker (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 is inserted between a C H 3 domain and an anti-cotinine single-chain variable section. The antibody-drug conjugate described in 1. 前記薬物が、デュオカルマイシン、アウリスタチン、コルヒチン、アントラサイクリン、カリケアマイシン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、ドキソルビシン、クリプトフィシン、エポチロン、サフラニン、デアセチルコルヒチン、メイタンシノール、ベドチン、マホドチン、エムタンシン、メルタンシン、ラブタンシン、ソラブタンシン、タリリン、テシリン、インドリノベンゾジアゼピン、イリノテカンプロドラッグ、エキサテカン誘導体及びツブリン阻害剤からなる群より選択されたいずれか一種、または
癌を発生させる遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。 The drug is duocarmycin, auristatin, colchicine, anthracycline, calicheamicin, maytansinoid, pyrrolobenzodiazepine, dolastatin, tubricin, maytansinoid, doxorubicin, cryptophycin, epothilone, safranin, deacetylcolchicine, maytanci Or any one selected from the group consisting of nor, vedotin, mahodotin, emtansine, mertansine, labtansine, solabtansine, talin, tecillin, indolinobenzodiazepine, irinotecan prodrug, exatecan derivative and tubulin inhibitor, or a gene that causes cancer 2. The antibody-drug conjugate according to claim 1, which is an siRNA that suppresses expression. 前記二重特異性抗体が、セツキシマブ、トラスツズマブ、オレゴボマブ、エドレコロマブ、アレムツズマブ、ラベツズマブ、ベバシズマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、トシツモマブ、イピリムマブ、ゲムツズマブ、ブレンツキシマブ、バダスツキシマブ、グレムバツムマブ、デパツキシズマブ、ポラツズマブ、デニンツズマブ、エンフォーツマブ、テリソツズマブ、チソツマブ、ピナツズマブ、リファスツズマブ、インデュサツマブ、バンドルツズマブ、ソフィツズマブ、ボルセツズマブ、トラスツズマブ、ミルベツキシマブ、コルツキシマブ、ナラツキシマブ、インダツキシマブ、アネツマブ、ロルボツズマブ、カンツズマブ、ラプリツキシマブ、ビバツズマブ、バダスツキシマブ、ロバルピツズマブ、イノツズマブ、サシツズマブ、ラベツズマブ、ミラツズマブ、ルパルツマブ及びアプルツマブからなる群より選択されたいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体薬物複合体。   The bispecific antibody is cetuximab, trastuzumab, olegobomab, edrecolomab, alemtuzumab, rabetuzumab, bevacizumab, ibritumomab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositumumab, ipilimumabumab Enfortumab, terisotuzumab, tisotumab, pinatuzumab, rifatsuzumab, indusuzumab, bundle tuzumab, sofituzumab, bolsetuzumab, trastuzumab, milvetuximab, coltuximab, narutuximab, indatumumab , Inotsuzumabu, Sashitsuzumabu, labetuzumab, milatuzumab, antibody drug conjugate of claim 1, characterized in that it comprises one selected from the group consisting of Ruparutsumabu and Apurutsumabu. 請求項１に記載の抗体薬物複合体を含むことを特徴とする癌治療用の薬学的組成物。   A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising the antibody drug conjugate according to claim 1. 前記癌が、ＫＲＡＳ突然変異を有する肺腺癌であることを特徴とする請求項８に記載の癌治療用の薬学的組成物。   The pharmaceutical composition for cancer treatment according to claim 8, wherein the cancer is lung adenocarcinoma having a KRAS mutation. （ｓ１）抗コチニン一本鎖可変切片を含む二重特異性抗体を製造する段階と、
（ｓ２）ペプチドと架橋結合した二価のコチニン及び薬物の接合体を製造する段階と、
（ｓ３）（ｓ１）段階で生成した二重特異性抗体と（ｓ２）段階で生成した接合体とを混合する段階と、を含むことを特徴とする抗体薬物複合体の製造方法。 (S1) producing a bispecific antibody comprising an anti-cotinine single chain variable section;
(S2) producing a conjugate of divalent cotinine and drug cross-linked with the peptide;
(S3) A method for producing an antibody drug conjugate, comprising the step of mixing the bispecific antibody produced in step (s1) and the conjugate produced in step (s2). 前記（ｓ３）段階は、抗コチニン一本鎖可変切片と二価のコチニンとが特異的に結合することを特徴とする請求項１０に記載の抗体薬物複合体の製造方法。   The method for producing an antibody drug conjugate according to claim 10, wherein in the step (s3), the anti-cotinine single-chain variable segment and the divalent cotinin are specifically bound. 前記二価のコチニンは、二つのコチニンが６〜１８ｍｅｒペプチドのＮ末端及びＣ末端に架橋結合したことを特徴とする請求項１０に記載の抗体薬物複合体の製造方法。   The method for producing an antibody drug conjugate according to claim 10, wherein the bivalent cotinin is obtained by crosslinking two cotinins to the N-terminal and C-terminal of a 6-18mer peptide. 前記薬物が、二価のコチニンと架橋結合した６〜１８ｍｅｒペプチドにおいてリシン残基と接合したことを特徴とする請求項１０に記載の抗体薬物複合体の製造方法。   The method for producing an antibody-drug conjugate according to claim 10, wherein the drug is conjugated to a lysine residue in a 6-18mer peptide cross-linked to divalent cotinine. 請求項１に記載の抗体薬物複合体の有効量を、癌を有する動物に処理する段階を含む癌治療方法。   A method for treating cancer, comprising the step of treating an animal having cancer with an effective amount of the antibody-drug conjugate according to claim 1. 請求項１に記載の抗体薬物複合体を用いて薬物の半減期を増進させる方法。   A method for increasing the half-life of a drug using the antibody-drug conjugate according to claim 1.
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