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JP2019509993A - 抗ｖｉｓｔａ（ｂ７ｈ５）抗体 - Google Patents

抗ｖｉｓｔａ（ｂ７ｈ５）抗体 Download PDF

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JP2019509993A JP2018542149A JP2018542149A JP2019509993A JP 2019509993 A JP2019509993 A JP 2019509993A JP 2018542149 A JP2018542149 A JP 2018542149A JP 2018542149 A JP2018542149 A JP 2018542149A JP 2019509993 A JP2019509993 A JP 2019509993A
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スナイダー，リンダ，エイ．
パワーズ，ゴードン
ウバニ，エンリケ ズデア
ウバニ，エンリケ ズデア
マーベル，ダグラス，マシュー
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ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ
ヤンセン ファーマシューティカ エヌブイ
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Publication date
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Abstract

本開示は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）に結合する抗体およびフラグメント、ならびにこの抗体を用いていくつかの生物学的応答を誘発する方法に関する。いくつかの生物学的応答を誘発し得る抗ＶＩＳＴＡ抗体を同定する方法もまた含まれる。

Description

関連出願
本出願は、２０１６年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／２９４，９２２号の利益を主張する。上記出願の教示は全て参照により本明細書に組み込まれる。
腫瘍微少環境における癌細胞または免疫細胞によるネガティブ免疫調節因子の発現は、腫瘍に対する宿主免疫応答を抑制し得る。癌と効果的に戦うには、宿主免疫応答の腫瘍媒介抑制をブロックすることが望ましい。したがって、抗腫瘍免疫応答を抑制する腫瘍微少環境におけるネガティブ免疫調節因子を阻害する新しい有効な治療薬が要望されている。
本発明は、一実施形態において、対象において生物学的応答を誘発する方法を提供する。本方法は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象に、その対象において生物学的応答を誘発するのに十分な量投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、循環免疫細胞の数の減少、骨髄および脾臓中の顆粒球数の減少、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせの数の増加、および１種以上のサイトカイン（例えば、ケモカイン）のレベルの増加、あるいはこれらの応答の任意の組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）上のＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６受容体）に結合するＦｃ領域を含む。
他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合し、生物学的応答を誘発する抗体を同定する方法を提供する。この方法は、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗体フラグメントを、細胞、組織、臓器または生物に提供する工程、およびその抗体またはその抗体フラグメントが細胞、組織、臓器または生物において生物学的応答を誘発するか否かを決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、生物学的応答は、単球の活性化、Ｔ細胞の活性化、循環免疫細胞の数の減少、骨髄および脾臓中の顆粒球数の減少、腫瘍微小環境における好中球、マクロファージ、またはそれらの組み合わせの数の増加、および１種以上のサイトカインのレベルの増加、あるいはこれらの応答の任意の組み合わせからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）上のＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６受容体）に結合するＦｃ領域を含む。
本発明の方法は、例えば、ＶＩＳＴＡタンパク質に結合する抗体を特徴付けるため、および潜在的な治療効果に関連する生物学的活性について抗ＶＩＳＴＡ抗体候補をスクリーニングするために有用である。
本特許または本出願ファイルは、色彩を付して作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴っているこの特許または特許出願の公報の写しは、請求および必要な手数料の納付によって、特許庁により提供されるであろう。
ＴＦ１ ＡＭＬ細胞のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。ＴＦ−１ ＡＭＬ細胞株におけるフローサイトメトリーによるＶＩＳＴＡタンパク質の発現を示す。 ヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットを特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。 一人の健常ドナーのヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 多くの健常ドナーのヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 ヒト単球およびマクロファージのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。 ヒト単球およびマクロファージのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 ヒトＴ細胞およびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。 一人の健常ドナーのヒトＴ細胞およびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 多くの健常ドナーのヒトＴおよびＮＫ細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 ヒト樹状細胞サブセットのＶＩＳＴＡ発現を特定するための染色およびゲーティング戦略を示すグラフ。 一人の健常ドナーのヒト樹状細胞サブセットおよび好塩基球のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 多くの健常ドナーのヒト樹状細胞サブセットおよび好塩基球のＶＩＳＴＡ発現を示すグラフ。 健康なヒトの抹消血細胞のＶＩＳＴＡ発現の分析。マルチカラーフローサイトメトリー分析による健康なヒトの抹消血細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：異なる２個体からの全血試料について、単球ＳＳＣlo,ＣＤ１１ｂhiＣＤ１４hiＣＤ１６-veＣＤ３３+veＨＬＡ−ＤＲ+veＣＤ１９-ve）（図１３Ａ）、好中球（ＳＳＣhiＣＤ１７７+ＣＤ１１ｂhiＣＤ１４loＣＤ１６+veＣＤ３３+veＨＬＡ−ＤＲ-veＣＤ１９-ve）（図１３Ｂ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３+veＣＤ４+ve）（図１３Ｃ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３+veＣＤ８+ve）（図１３Ｄ）の分析のために、フィコール勾配を使用して抹消血単核球を単離した。 肺癌患者および対照健常ドナーの末梢血液細胞のＶＩＳＴＡ発現の分析。マルチカラーフローサイトメトリー分析による肺癌患者の抹消血細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：一個体の代表的なＦＡＣＳプロット（図１４Ａ）を示す。末梢血単核球をフィコールにより単離し、単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５−）（図１４Ｂ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−ＨＬＡＤＲ−ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）（図１４Ｃ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。 マルチカラーフローサイトメトリー分析による結腸癌患者の末梢血細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：一個体の代表的なＦＡＣＳプロット（図１５Ａ）を示す。末梢血単核球をフィコールにより単離し、単球（ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１５−）（図１５Ｂ）および骨髄由来サプレッサー細胞（ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３−ＨＬＡＤＲ−ＣＤ１５＋ＣＤ１６＋）（図１５Ｃ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。 マルチカラーフローサイトメトリー分析によるカニクイザルの末梢血細胞のＶＩＳＴＡ発現のプロファイル：異なる４匹のサルからの全血試料について、単球（ＳＳＣloＣＤ１１ｂhiＣＤ１４hiＨＬＡ−ＤＲhiＣＤ１６-veＣＤ１９-ve（図１６Ａ）および好中球ＣＤ１１ｂhiＣＤ１４loＨＬＡ−ＤＲ-veＣＤ１６-veＣＤ１９-ve（図１６Ｂ）のＶＩＳＴＡ発現を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＣＲα／β+veＣＤ４+ve）（図１６Ｃ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＲα／β+veＣＤ８+ve）（図１６Ｄ）の分析のために、フィコール勾配を使用して、３匹のサルから末梢血単核球を単離した。 ヘム細胞株におけるＶＩＳＴＡ ＲＮＡの絶対発現値を示すグラフ。 マウスＡ２０細胞にＧＦＰまたはヒトＶＩＳＴＡを安定にトランスフェクトした。それらをｏｖａペプチドおよびＤＯ１１．１０ Ｔ細胞とインキュベートした。インキュベーションの開始から２４時間後、Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現を測定した。Ａ２０−ｈｕＶＩＳＴＡ細胞はＴ細胞によるＣＤ２５発現を抑制するが、この読み出しはＶＳＴＢ９５と共にインキュベートすることにより大きく回復する。 ヒトＶＩＳＴＡ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。 ヒトＶＩＳＴＡを発現する細胞に結合する抗ＶＩＳＴＡ抗体を示すヒトＶＩＳＴＡ ＦＡＣＳの結果。 ６種の抗ＶＩＳＴＡ抗体候補の混合リンパ球反応物における希釈（３０μｇ／ｍｌ〜０．０μｇ／ｍｌ）の研究。 ６種の抗ＶＩＳＴＡ抗体候補のＳＥＢアッセイ（個々のＣＰＭ値およびＩＦＮ−ｇ濃度）における希釈（３０μｇ／ｍｌ〜０．０μｇ／ｍｌ）の研究。 Ｐｒｏｔｅｏｎ ＳＰＲチップにコーティングした抗ＶＩＳＴＡ抗体ＶＳＴＢ８５、および同チップ上を走らせた表示コンペティター（表１６に記載したコンペティター）によるＶＩＳＴＡタンパク質を用いたセンサーグラムプロット。 ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルの実験計画 雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＢ４９腫瘍増殖。グラフは、抗マウスＶＩＳＴＡ抗体（図２５Ｂ）または対照ＩｇＧ（図２５Ａ）で処理した個々のマウスの腫瘍増殖を示す。 ヒトＶＩＳＴＡのアミノ酸配列（配列番号４６）。 ＶＩＳＴＡオルソログの多重配列アラインメント ＨＤＸにより測定された、ＶＳＴＢ５０およびＶＳＴＢ６０抗体（上）またはＶＳＴＢ９５およびＶＳＴＢ１１２抗体（下）が結合したヒトＶＩＳＴＡの領域 ＶＳＴＢ１１２が結合したＶＩＳＴＡエピトープ。（上）標識された鎖を有するＶＩＳＴＡをイラストで示す。複合体中のＶＳＴＢ１１２の５Å以内の少なくとも１つの原子を有する残基は青色に着色されている。青色および橙色の球体は鎖の切断を示し、青緑色および緑色の球体はそれぞれ、ＶＩＳＴＡ構造のＮ末端およびＣ末端を示す。（下）構造決定に使用したＶＩＳＴＡコンストラクトの配列。配列の下の丸は、ＶＳＴＢ１１２との主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。形状は、所与の残基により接触している最大原子数を有するＣＤＲを示すために図５９に定義するＣＤＲ色で着色してある。二次構造要素は、ＭＯＥプログラムにおいて定義されるように、黄色の矢印はβ鎖を示し、赤色の長方形はαヘリックスを示す。 ＶＳＴＢ１１２パラトープ。（上）ＶＩＳＴＡ抗原をイラストで示し、ＶＩＳＴＡの５オングストローム（Å）以内のＶＳＴＢ１１２の表面を、下の配列で特定したＣＤＲ同一性を指定するために使用した色で示している。ＣＤＲに隣接する接触フレームワーク残基には、ＶＳＴＢ１１２Ｆｖ領域の対応するＣＤＲ（下）配列と同様の色に着色している。背景色を付した部分は、キャバット定義によるＣＤＲを示している。配列の下の丸は、ＶＩＳＴＡとの主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。 結晶学的、かつ水素重水素交換（ＨＤＸ）により同定されたエピトープ領域の比較。構造決定に使用したＶＩＳＴＡコンストラクトの配列。配列の下の丸は、ＶＳＴＢ１１２との主鎖接触部のみを構成する残基を示すために使用され、三角は側鎖接触部を示し、四角は、ＰＩＳＡによる計算で、側鎖接触部が水素結合または塩架橋相互作用をもたらしていることを示す。 全ＰＢＭＣ中のＣＤ１４＋単球のＶＳＴＢ１７４（ＶＳＴＢ１１２由来）による活性化。実験の各部分で、細胞をＰＢＳ、ＩｇＧ１対照抗体、またはＶＳＴＢ１７４（１、０．１もしくは０．０１ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。左のパネルはＣＤ８０ ＭＦＩを示し、右のパネルはＨＬＡ−ＤＲ ＭＦＩを示す（代表的な結果が得られた２つの試験ドナーを示す）。 Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞に対するＶＳＴＢ１７４のＡＤＣＣ活性を示すグラフ。 Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞に対するＶＳＴＢ１７４のＡＤＣＰ活性を示すグラフ。表記した両抗体は同じＦａｂを有するが、ＶＳＴＢ１７４はＩｇＧ１Ｆｃを有し、ＶＳＴＢ１４０はＦｃサイレントＩｇＧ２を有する。 ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９またはＶＳＴＢ１４０ｍＡｂにより仲介されたＫ５６２−ＶＩＳＴＡに対する食作用を示すグラフ。各ｍＡｂを０．０００８μｇ／ｍｌ〜０．５６μｇ／ｍｌの範囲で７種の３．３倍用量（ｈａｌｆ ｌｏｇ ｄｏｓｅ）で試験した。 ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９またはＶＳＴＢ１４０ｍＡｂにより仲介された骨髄腫細胞株Ｋ５６２細胞に対する食作用を示すグラフ。各ｍＡｂを０．０００８μｇ／ｍｌ〜０．５６μｇ／ｍｌの範囲で７種の３．３倍用量（ｈａｌｆ ｌｏｇ ｄｏｓｅ）で試験した。 雌のＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおけるＶＳＴＢ１２３（１、５、７．５および１０ｍｇ／ｋｇ）のＭＢ４９腫瘍効果を評価する研究。移植６日後の投与開始時の腫瘍体積は、約５０ｍｍ3であった。ＶＳＴＢ１２３はマウスＦｃ骨格に接合されたＶＳＴＢ１１２Ｆａｂであり、ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウス中のヒトＶＩＳＴＡに結合する。 グラフは、ＶＩＳＴＡを高／中レベルで発現するＣＤ１４＋細胞が、肺癌試料中１３／１３で、ならびに患者の遠位肺組織および末梢血中に見出されることを示している。 ＧＧ８による肺癌のＶＩＳＴＡのＩＨＣ染色。 抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ＣＤ１６架橋を介して単球活性化を誘発する。ＰＤ−Ｌ１発現は、ヒトＰＢＭＣを使用する骨髄活性化のマーカーとして使用される。陽性対照として用いた抗ＣＤ１６は強力な単球活性化を誘発し、陰性対照として用いたＦｃブロック（Ｆｃ ＩｇＧ１フラグメントの混合物）は単球活性化を遮断した。ヒトＩｇＧ１対照と比較して、ＶＳＴＢ１１２は単球活性化を誘発するが、ＶＳＴＢ１４０は誘発しない。 ｈＶＩＳＴＡ ＫＩ（ノックイン）マウスにおける確立されたＭＢ４９腫瘍の増殖に対するＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４の効果に関する試験計画の概略図。抗体を、試験５日目、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目、２１日目、２４日目および２６日目に注入した。血液試料を、−２日目、−１日目、０日目、４日目、７日目、１１日目、１４日目、１８日目、２４日目、３１日目および３９日目に採取した。抗体注入と同じ日に血液試料を採取する場合、最初に血液試料を採取した。 ｈＶＩＳＴＡ ＫＩ雌マウスにおけるＭＢ４９腫瘍増殖（図４２Ａ）、およびｈＶＩＳＴＡ ＫＩ雌マウスにおけるＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４による処理後のＭＢ４９腫瘍を有するマウスの生存（図４２Ｂ）。図４２Ａでは、マウスＩｇＧ２ａ対照群と比較して、ＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４で処理した雌マウスの平均腫瘍体積測定値（ｍｍ3）を示す。処理期間は５〜２６日目であった。平均＋／−ＳＥＭを示す。なお、グラフ間ではｙ軸が異なる。雌マウスのデータを３３日目までグラフ化し、この３３日目では、マウスの＞７０％が各群で依然として生存していた（１群当たりｎ＝６または７）。図４２Ｂでは、ｈＶＩＳＴＡ ＫＩ雌マウスの生存率をグラフ化している（ＶＳＴＢ１２３ １０ｍｇ／ｋｇ、ｐ＝０．０１０８）。処理期間は５〜２６日目であった。 ＶＳＴＢ１７４で処理したＰＢＭＣによる４１サイトカインの発現の倍数変化。３人の健康なヒトドナーからの全ＰＢＭＣを、示された濃度のＶＳＴＢ１７４またはＩｇＧ１対照抗体で２４時間処理した。サイトカイン産生を、４１サイトカインマルチプレックスキットによって分析した。ＩｇＧ１対照における発現の平均倍数変化を、対数カラースケールのヒートマップとして示す。アスタリスクは、処理試料平均と対照試料平均との間の有意差を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。範囲外（ＯＯＲ）は、そのドナーにおけるサイトカインの全ての試料が正確な検出の限界を超えた（＞上、＜下）ことを示す。 ＭＢ４９腫瘍におけるマクロファージの活性化。図４４Ａは試験計画の概略を示す。図４４Ｂは、腫瘍微小環境におけるＣＤ８０＋マクロファージがＶＳＴＢ１２３により増加し、ＶＳＴＢ１２４では増加しなかったことを示す。ＭＢ４９腫瘍を有するｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスをＶＳＴＢ１２３、ＶＳＴＢ１２４または対照ｍＩｇＧ２ａで処理し、３回目の投与の２４時間後に、それらの腫瘍を分析して、腫瘍浸潤マクロファージにおけるＣＤ８０の相対的発現を決定した。各群は５匹のマウスを含んだ。横棒は平均を示す。＊ｐ＜０．０５。 腫瘍微小環境へのＭＰＯ＋細胞の移動。 ＶＳＴＢ１７４は好中球の一時的な減少を誘発する。 抗ＶＩＳＴＡ抗体（例えば、ＶＳＴＢ１７４）は、作用機序を提示した。
本発明の実施形態例を以下に記載する。
本発明は、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＪＮ６０２１８４）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０、２０１１）と名付けられた新規な免疫グロブリンファミリーリガンドに対する抗体に関する。ＶＩＳＴＡはＰＤ−Ｌ１に対し相同性を有するが、造血系に限定される特有の発現パターンを示す。特に、ＶＩＳＴＡは、ＣＤ１１ｂhigh骨髄細胞では構成的に、かつ多く発現し、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞では低レベルで発現する。ヒトホモログは、マウスＶＩＳＴＡと略８５％の相同性を有し、類似の発現パターンを持つ（Ｌｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４：１９２４，２０１４）。抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現したＶＩＳＴＡは、ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞増殖、およびＰＤ−１と無関係の類似の受容体によるサイトカイン産生を抑制する。受動的ＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）疾患モデルにおいては、ＶＩＳＴＡ特異的モノクローナル抗体は、Ｔ細胞依存免疫応答を増強し、病気を悪化させた。腫瘍細胞におけるＶＩＳＴＡの過剰発現は、腫瘍を持った宿主における防御抗腫瘍免疫を低下させた。ヒトＶＩＳＴＡに関する研究によって、ヒトＴ細胞に対するその抑制機能が確認された（Ｌｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４：１９２４，２０１４）。Ｆｌｉｅｓらによる研究もまた、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−１Ｈと称する）が強力な免疫抑制分子であることを確認した（Ｆｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＶＩＳＴＡは、米国特許出願公開第２０１３０１７７５５７Ａ１号明細書、ならびに米国特許第７，９１９，５８５号明細書および同第８，２３６，３０４号明細書にさらに詳細に記載されており、それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＶＩＳＴＡは、免疫応答を抑制する新規な負の免疫調節因子である。例えば、本明細書の実施例１２に記載するように、マウス腫瘍モデルにおけるＶＩＳＴＡ特異的モノクローナル抗体による処理により、腫瘍免疫微少環境の抑制性を逆転させ、防御抗腫瘍免疫を増強させ、それ故、ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体の癌免疫療法の新しい治療法としての可能性を示すことがわかった。
本発明の抗体およびフラグメント
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに、限定はされないが、酵素的開裂、ペプチド合成または組み換え技術などの知られた技術で得られる、それらのフラグメント、領域または誘導体を含むものとする。本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体は、免疫応答を調節、制御または増強するＶＩＳＴＡの一部に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体は本明細書に記載の１種以上の抗ＶＩＳＴＡ抗体を競合的に阻害する。２種以上の抗体が同じ標的への結合を競合するか否かを決定する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、１つの抗体が他の抗体の標的への結合をブロックするか否かを決定するために、競合結合アッセイを使用することができる。一般に、競合結合アッセイは、固体基質または細胞に結合した精製標的抗原（例えば、ＰＤ−１）、標識されていない試験結合分子、および標識された参照結合分子の使用を含む。競合阻害は、固体基質または細胞に結合した標識量を、試験結合分子の存在下に測定することによって測定される。通常、試験結合分子は過剰に含まれる。一般に、競合結合分子が過剰に存在すると、共通抗原に対する参照結合分子の特異的結合が、少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％またはそれ以上阻害される。いくつかの実施形態では、競合阻害は、競合阻害ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫性が付与された動物の血清に由来する異種の抗体分子の集団である。モノクローナル抗体は、抗原に特異的な抗体の実質的に同種の集団を含み、その集団は実質的に類似のエピトープ結合部位を含む。モノクローナル抗体は、当業者に知られた方法で得ることができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９８７、１９９２）；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）を参照されたい。これらの全ての内容は参照により本明細書にその全体が組み込まれる。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスに分類され得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチューまたはインビボで培養することができる。
本発明はまた、消化フラグメント、その特定の部分および変異体、例えば、抗体類似体、あるいは抗体またはその特定フラグメントもしくは部分の構造および／または機能が類似する抗体部分、例えば、一本鎖抗体およびそのフラグメントを包含する。機能的フラグメントとしては、哺乳動物のＶＩＳＴＡタンパク質に結合する抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、ＶＩＳＴＡまたはその一部に結合することができる抗体フラグメント、例えば、限定はされないが、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、Ｆａｂ’（例えば、ペプシン消化および部分還元による）、およびＦ（ａｂ’）2（例えば、ペプシン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分還元および再集合による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学的技術による）フラグメントは、本発明に包含される（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記を参照）。本発明の抗体フラグメントとしてはまた、Ａａｒｏｎ Ｌ．Ｎｅｌｓｏｎ，ｍＡｂｓ２：１，７７−８３（Ｊａｎｕａｒｙ／Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０）において論じられ、説明されているものが挙げられる。
このようなフラグメントは、例えば、当該分野で知られているような、および／または本明細書中に記載されているような、酵素による切断、合成または組み換え技術によって産生することができる。抗体はまた、１つ以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して、種々の切断形態で産生することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）2重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を、ＣＨ１ドメインおよび／または重鎖のヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。抗体の種々の部分は、従来技術により化学的に結合させることができ、または遺伝子工学手法を用いて隣接タンパク質として作成することができる。
１つの実施形態では、免疫グロブリン鎖、またはその一部（例えば、可変領域、ＣＤＲ）は、本明細書に記載の対応する可変配列鎖のアミノ酸配列に対し、約７０〜１００％の同一性（例えば、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれらの任意の範囲もしくは値）を有する。好ましくは、７０〜１００％のアミノ酸同一性（例えば、８５、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれらの任意の範囲もしくは値）は、当該技術分野で知られているように、好適なコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。
重鎖および軽鎖の可変領域の配列は本明細書に示される。
本発明の抗体、またはその特定の変異体は、本発明の抗体の任意の数の隣接するアミノ酸残基を含むことができ、その数は、抗ＴＮＦ抗体の隣接残基数の１０〜１００％からなる整数の群から選択される。この隣接アミノ酸残基の部分配列は、任意選択により、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０もしくはそれ以上のアミノ酸長、またはそれらの任意の範囲もしくは値である。さらに、そのような部分配列の数は、１〜２０からなる群から選択される整数、例えば、少なくとも２、３、４または５であり得る。
当業者が認識しているように、本発明は、本発明の少なくとも１種の生物学的に活性な抗体を含む。生物学的に活性な抗体は、天然（非合成）の、内因性の、または関連する既知の抗体の少なくとも２０％、３０％または４０％、好ましくは、少なくとも５０％、６０％または７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％、９０％、または９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性および基質特異性の分析および定量的測定の方法は、当業者によく知られている。
実質的な類似性は、天然（非合成）の、内因性の、または関連する既知の抗体の少なくとも８５％（例えば、少なくとも９５％）の同一性と、少なくとも８５％（例えば、少なくとも９５％）の活性を有する化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））が、僅かな配列の変化もしくは変異を含む、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体を指す。同様に、霊長目（サル、ヒヒ、チンパンジーなど）、齧歯動物（マウス、ラットなど）、およびその他の哺乳動物を指定した抗体は、そのような種、亜属、属、亜科、科の特異抗体を示す。さらに、キメラ抗体は、上記の任意の組み合わせを含むことができる。そのような変化もしくは変異は、非改変抗体に比べて、ヒトまたは他の種の免疫原性を維持または低減するものであってよく、またそれが好ましい。したがって、ヒト抗体は、キメラもしくはヒト化抗体と異なっている。ヒト抗体は、機能的に再配列されたヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現することができる非ヒト動物細胞、または原核細胞もしくは真核細胞によって産生することができると言える。さらに、ヒト抗体が一本鎖抗体の場合、天然ヒト抗体にはないリンカーペプチドを含むことができる。例えば、Ｆｖは、２〜約８個のグリシンまたは他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含むことができ、それは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域に結合する。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源であると考えられる。
モノクローナル抗体、好ましくは、少なくとも２種の抗原に結合特異性を有するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である二重特異性、異種特異性、ヘテロ共役性、または類似の抗体もまた、使用することができる。この場合、結合特異性の１つは少なくとも１種のＶＩＳＴＡタンパク質に対するものであり、他は、他の任意の抗原に対するものである。二重特異性抗体の生成方法は当該技術分野で知られている。二重特異性抗体の組み換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいて行うことができるが、ここで、２本の重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３））。国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、米国特許第６，２１０，６６８号明細書、同第６，１９３，９６７号明細書、同第６，１３２，９９２号明細書、同第６，１０６，８３３号明細書、同第６，０６０，２８５号明細書、同第６，０３７，４５３号明細書、同第６，０１０，９０２号明細書、同第５，９８９，５３０号明細書、同第５，９５９，０８４号明細書、同第５，９５９，０８３号明細書、同第５，９３２，４４８号明細書、同第５，８３３，９８５号明細書、同第５，８２１，３３３号明細書、同第５，８０７，７０６号明細書、同第５，６４３，７５９号明細書、同第５，６０１，８１９号明細書、同第５，５８２，９９６号明細書、同第５，４９６，５４９号明細書、同第４，６７６，９８０号明細書、国際公開第９１／００３６０号パンフレット、同第９２／００３７３号パンフレット、欧州特許第０３０８９号明細書、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２１：２１０（１９８６）もまた参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、発明は、ＶＩＳＴＡおよび第２の標的タンパク質（例えば、免疫チェックポイントタンパク質）を標的とする二重特異性抗体に関する。二重特異性抗体の例としては、ＶＩＳＴＡおよびＰＤ−Ｌ１を標的とする二重特異性抗体、ならびに、ＶＩＳＴＡおよびＰＤ−Ｌ２を標的とする二重特異性抗体が挙げられる。
ヒトＶＩＳＴＡタンパク質またはそのフラグメントに特異的なヒト抗体は、ＶＩＳＴＡタンパク質またはその一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原性抗原に対して作ることができる。
他の特異的または一般的な哺乳動物抗体を同様に作ることができる。免疫原性抗原の調製およびモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な手法を用いて行うことができる。
例えば、ハイブリドーマは、好適な不死の細胞株（例えば、限定はされないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ＳＡ３、Ｓｐ２ＭＡＩ、Ｓｐ２ＳＳ１、Ｓｐ２ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ１４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ１４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａなどの骨髄腫細胞株、もしくは異種骨髄腫、それらの融合産物、またはそれらから誘導される細胞もしくは融合細胞、あるいは当該技術分野で知られている他の好適な任意の細胞株、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇを参照）を抗体産生細胞と融合させることによって生成することができる。抗体産生細胞としては、単離もしくはクローン化された脾臓、末梢血、リンパ、扁桃腺もしくは他の免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）、あるいは重鎖もしくは軽鎖、定常もしくは可変、またはフレームワークもしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を発現する他の任意の細胞を挙げることができる。そのような抗体産生細胞は、組み換えまたは内因性細胞であってよく、また、原核または真核生物（例えば、齧歯動物、ウマ、ヒツジ、ヤギ、雌ヒツジ、霊長目などの哺乳動物）の細胞であってよい。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記）、およびＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記），ｃｈａｐｔｅｒ２を参照されたい。これらは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
抗体産生細胞はまた、目的の抗原で免疫したヒトまたは他の好適な動物の、末梢血または脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。他の好適な宿主細胞もまた、本発明の抗体、その特定のフラグメントまたは変異体をコードする異種または内因性核酸を発現させるために使用することができる。融合細胞（ハイブリドーマ）または組み換え細胞は選択培養条件または他の好適な知られた方法で単離することができ、また限界希釈法もしくは細胞選択、または他の知られた方法によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、好適なアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ））によって選択することができる。
必要な特異性を有する抗体を産生もしくは単離する他の好適な方法、例えば、限定はされないが、ペプチドもしくはタンパク質ライブラリー（例えば、限定はされないが、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどのディスプレイライブラリー；例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ、ＤＥ；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫ；Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ；Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．、Ｅｎｚｏｎ、Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、Ｃａｌｉｆ．；Ｉｘｓｙｓ．から入手可能。例えば、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５号明細書、国際公開第９０／１４４４３号パンフレット、同第９０／１４４２４号パンフレット、同第９０／１４４３０号パンフレット、ＰＣＴ／Ｕ５９４／１２３４号明細書、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、同第９６／０７７５４号パンフレット、欧州特許第６１４９８９号明細書、国際公開第９５／１６０２７号パンフレット、同第８８／０６６３０号パンフレット、同第９０／３８０９号パンフレット、米国特許第４，７０４，６９２号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９号明細書、国際公開第８９／０６２８３号パンフレット、欧州特許第３７１９９８号明細書、同第５５０４００号明細書、同第２２９０４６号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９号明細書を参照）、または、確率的に生成されたペプチドもしくはタンパク質―米国特許第５，７２３，３２３号明細書、同第５，７６３，１９２号明細書、同第５，８１４，４７６号明細書、同第５，８１７，４８３号明細書、同第５，８２４，５１４号明細書、同第５，９７６，８６２号明細書、国際公開第８６／０５８０３号パンフレット、欧州特許第５９０６８９号明細書（各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）から組み換え抗体を選択する方法；あるいは、当該技術分野で知られているように、かつ／または本明細書に記載されているように、一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物の免疫付与を利用する方法（例えば、ＳＣＩＤマウス、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：９０１−９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：９５−１１８（１９９６）；Ｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３：１５４−１６１（１９９８）；各文献、ならびに関連特許および関連出願は、参照によりその全体が組み込まれる）を使用することができる。そのような手法としては、限定はされないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：４９３７−４９４２（Ｍａｙ １９９７）；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４１３０−１４１３５（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８））；単一細胞抗体産生技術（米国特許第５，６２７，０５２号明細書、Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：８８７−８９２（１９８７）；Ｂａｂｃｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７８４３−７８４８（１９９６））；ゲル微小液滴（ｇｅｌ ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ）およびフローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：３３３−３３７（１９９０）；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．１８２：１５５−１６３（１９９５）；Ｋｅｎｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：７８７−７９０（１９９５））；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ １９：１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｖｏｌ．５，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、ｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられる。
非ヒトまたはヒト抗体を改変またはヒト化する方法もまた使用することができ、当該技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化または改変抗体は、非ヒト源、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長目または他の哺乳動物に由来するアミノ酸残基を１個以上有する。これらのヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、それらは、通常、既知のヒトの配列の「インポート」可変、定常または他の領域から取り込まれる。既知のヒトＩｇ配列は、例えばｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌに開示されており、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
このようなインポートされた配列は、免疫原性の低減、または、当該技術分野で知られているような結合、アフィニティ、親和性、特異性、半減期もしくはその他の好適な特性を低下、増強もしくは改変するために使用することができる。一般に、非ヒトもしくはヒトＣＤＲ配列の一部または全部は維持されるが、フレームワークおよび／または定常領域の非ヒト配列の一部または全部はヒトまたは他のアミノ酸で置換される。抗体はまた、任意選択により、当業者に知られている三次元免疫グロブリンモデルを用いて、抗原に対する高いアフィニティ、および他の好ましい生物学的特性を保持してヒト化され得る。選択した候補免疫グロブリン配列の推定三次元配座構造を説明し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンの抗原結合能力に影響する残基の分析が可能となる。このようにして、フレームワーク（ＦＲ）残基を、標的抗原に対するアフィニティの増大などの所望の抗体特性が得られるように、コンセンサスおよびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原との結合に及ぼす影響に直接的、かつ大きく関与している。本発明の抗体のヒト化または改変は、知られた方法、例えば、限定はされないが、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，７２３，３２３号明細書、同第５，９７６８６２号明細書、同第５，８２４５１４号明細書、同第５，８１７４８３号明細書、同第５，８１４４７６号明細書、同第５，７６３，１９２号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書、同第５，７６６，８８６号明細書、同第５，７１４，３５２号明細書、同第６，２０４，０２３号明細書、同第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書に記載された方法により行うことができる。これらはそれぞれ、本明細書に引用された文献と共に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、任意選択により、本明細書に記載されているような、かつ／または当該技術分野で知られているような、一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物、（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、非ヒト霊長目など）を免疫することによって生成することができる。ヒト抗ＶＩＳＴＡ抗体を産生する細胞は、好適な方法、例えば、本明細書に記載の方法で、そのような動物から単離し、不死化することができる。
ヒト抗原に結合する一連のヒト抗体を産生することができる遺伝子組み換え動物は、知られた方法（例えば、限定はされないが、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．に対し発行された米国特許第５，７７０，４２８号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書および同第５，７８９，６５０号明細書；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ ｅｔ ａｌ．国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ ｅｔ ａｌ．欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ ｅｔ ａｌ．欧州特許出願公開第０７１０７１９Ａ１号明細書、Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，５４５，８０７号明細書、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．欧州特許第０４３８４７４Ｂ１号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．欧州特許出願公開第０８１４２５９Ａ２号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．英国特許出願公開第２２７２４４０Ａ号明細書、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（４）５７９−５９１（１９９４）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３−２１（１９９４）、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６（１９９７）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２８７−６２９５（１９９２）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０（８）３７２０−３７２４（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３（１）：６５−９３（１９９５）、ならびにＦｉｓｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４（７）：８４５−８５１（１９９６）、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で生産することができる。一般に、これらのマウスは、機能的に再配列されるか、または機能的再配列を受けることができる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン座からのＤＮＡを含む少なくとも１つの導入遺伝子を含む。そのようなマウスにおける内因性免疫グロブリン座は、内因性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を除くために、破壊または欠失させることができる。
類似のタンパク質またはフラグメントに特異的に結合する抗体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリーを用いて都合良く行うことができる。この方法は、所望の機能または構造を有する個々のメンバーを膨大な数のペプチドからスクリーニングすることを伴う。ペプチドディスプレイライブラリーの抗体スクリーニングは、当該技術分野でよく知られている。ディスプレイされるペプチド配列は３〜５０００個以上のアミノ酸長、多くの場合５〜１００個のアミノ酸長、さらに多くの場合８〜２５個のアミノ酸長であり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接化学合成法に加えて、いくつかの組み換えＤＮＡ法が報告されている。１つのタイプは、バクテリオファージまたは細胞表面のペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージまたは細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。そのような方法は、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、同第９１／１８９８０号パンフレット、同第９１／１９８１８号パンフレットおよび同第９３／０８２７８に記載されている。ペプチドライブラリーを生成する他のシステムは、インビトロ化学合成法および組み換え法の両方の態様を有する。国際公開第９２／０５２５８号パンフレット、同第９２／１４８４３号パンフレットおよび同第９６／１９２５６号パンフレットを参照されたい。また、米国特許第５，６５８，７５４号明細書および同第５，６４３，７６８号明細書も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクターおよびスクリーニングキットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）などの供給者から商業的に入手可能である。例えば、Ｄｙａｘに譲渡された米国特許第４，７０４，６９２号明細書、同第４，９３９，６６６号明細書、同第４，９４６，７７８号明細書、同第５，２６０，２０３号明細書、同第５，４５５，０３０号明細書、同第５，５１８，８８９号明細書、同第５，５３４，６２１号明細書、同第５，６５６，７３０号明細書、同第５，７６３，７３３号明細書、同第５，７６７，２６０号明細書、同第５，８５６，４５６；５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，８３７，５００号明細書、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに譲渡された同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第；５，８８５，７９３号明細書、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈに譲渡された同第５，７５０，３７３号明細書、同第５，６１８，９２０号明細書、同第５，５９５，８９８号明細書、同第５，５７６，１９５号明細書、同第５，６９８，４３５号明細書、同第５，６９３，４９３号明細書および同第５，６９８，４１７号明細書を参照されたい。
本発明の抗体はまた、乳中にそのような抗体を生成するヤギ、雌ウシ、雌ヒツジなどの遺伝子組み換え動物を提供する、少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする核酸を用いて調製することができる。そのような動物は知られた方法で提供することができる。例えば、限定はされないが、米国特許第５，８２７，６９０号明細書、同第５，８４９，９９２号明細書、同第４，８７３，３１６号明細書、同第５，８４９，９９２号明細書、同第５，９９４，６１６号明細書、同第５，５６５，３６２号明細書、同第５，３０４，４８９号明細書などを参照されたい。これらはそれぞれ参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、遺伝子組み換え植物を用い、知られた方法にしたがって生成することができる。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：９９−１０８（Ｏｃｔｏｂｅｒ、１９９９）、Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４０：９５−１１８（１９９９）、およびこれらに引用された文献；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５２２−７（１９９５）；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９：３４１−６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２２：９４０−９４４（１９９４）；およびこれらに引用された文献もまた参照されたい。上記各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の抗体はヒトＶＩＳＴＡと広範なアフィニティ（ＫD）で結合することができる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのヒトモノクローナル抗体は、任意選択により、ヒトＶＩＳＴＡに高アフィニティで結合することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＶＩＳＴＡに約１０-7Ｍ以下、例えば、限定はされないが、０．１〜９．９（または、その中の任意の範囲もしくは値）×１０-7、１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13またはその中の任意の範囲もしくは値のＫDで結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗体フラグメントは、ヒトＶＩＳＴＡに、少なくとも１×１０-7リットル／モル、例えば、少なくとも１×１０-8リットル／モル、例えば、少なくとも１×１０-9リットル／モルリットル／モルのアフィニティで結合することができる。
抗体の抗原に対するアフィニティまたは親和性は、任意の好適な方法を用いて実験的に決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ、ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；および本明細書に記載の方法を参照されたい。）特定の抗体抗原相互作用のアフィニティ測定値は、異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ）の下で測定した場合には変わり得る。したがって、アフィニティおよび他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫD、Ｋa、Ｋd）の測定は、抗体および抗原の標準液と標準バッファとで行うことが好ましい。
核酸分子
本明細書に示された情報、例えば、少なくとも１つの特定のフラグメントの少なくとも７０〜１００％の隣接アミノ酸をコードする核酸配列、その変異体もしくはコンセンサス配列、またはこれらの配列の少なくとも１つを含む寄託されたベクターを使用して、配列番号１、２および３の重鎖可変ＣＤＲ領域の全て、ならびに／または、配列番号４、５および６の軽鎖可変ＣＤＲ領域の全てを含む少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載の方法、または当該技術分野で知られた方法により得ることができる。
本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態、例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡもしくは他の形態、またはＤＮＡの形態、例えば、限定はされないが、クローニングによって得られた、もしくは合成により生成されたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖もしくは一本鎖、またはこれらの組み合わせであり得る。ＤＮＡもしくはＲＮＡの少なくとも１本の鎖の一部は、センス鎖としても知られるコード鎖、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
本発明の単離核酸分子としては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、限定はされないが、少なくとも１本の重鎖もしくは軽鎖の、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／もしくはＣＤＲ３などの、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定部分を含む核酸分子；抗ＶＩＳＴＡ抗体またはフラグメント、例えば、可変領域を含むフラグメントのコード配列を含む核酸分子；ならびに、上記のものと異なるが、遺伝子コードの縮重のために、本明細書に記載され、かつ／または当該技術分野で知られる少なくとも１つの抗ＶＩＳＴＡ抗体をなおコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を挙げることができる。そのような、本発明の特異的抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする縮重核酸変異体の生成は、当業者であれば日常的な仕事であろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい。そのような核酸変異体は本発明に含まれる。
本明細書に記載のように、抗ＶＩＳＴＡ抗体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子としては、限定はされないが、抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードするもの、全抗体またはその一部をコードする配列；抗体、フラグメントもしくは一部をコードする配列、および追加の配列、例えば、前記追加のコード配列の有無にかかわらず、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチド、例えば、追加の非コード配列（例えば、限定はされないが、非コード５’および３’配列、例えば、転写、ｍＲＮＡプロセッシング、例えば、スプライシング、およびポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合および安定性）に役割を持つ転写された非翻訳配列）と共に含まれる少なくとも１つのイントロン；追加のアミノ酸、例えば追加の機能を付与するアミノ酸をコードする追加のコード配列を挙げることができる。したがって、抗体をコードする配列はマーカー配列、例えば、抗体フラグメントまたは一部を含む融合抗体の精製を促進するペプチドをコードする配列に融合することができる。
本発明の抗体、フラグメントおよび領域の定常（Ｃ）領域をコードするヒト遺伝子は、知られた方法によって、ヒト胎児肝ライブラリーから取り出すことができる。ヒトＣ領域遺伝子は、ヒト細胞、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現し産生する細胞から取り出すことができる。ヒトＣH領域は、ヒトＨ鎖、例えばγ、μ、α、δもしくはεおよびそれらのサブタイプ、例えば、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４の知られたクラスまたはアイソタイプから取り出すことができる。Ｈ鎖アイソタイプは、抗体の様々なエフェクター機能を担っているため、ＣH領域の選択は、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合、または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性によって導かれるであろう。
組成物
本明細書に開示の医薬組成物は、標準的手順にしたがって調製され、治療、例えば、軽減、予防もしくは除去のため、または、治療する病態の進行の遅延もしくは停止のために選択される用量で投与される（例えば、ヒト治療用の各種薬剤の投与方法の一般的な説明のためのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡおよびＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照（これらの内容は参照によって本明細書に組み込まれる））。開示の抗体および薬剤を含む組成物は、制御もしくは持続放出型送達システム（例えば、カプセル、生分解性マトリックス）によって送達することができる。本開示化合物の組成物の投与に好適な薬物送達のための遅延放出型送達システムは、例えば、米国特許第５，９９０，０９２号明細書，同第５，０３９，６６０号明細書、同第４，４５２，７７５号明細書および同第３，８５４，４８０に記載されており、それらの全教示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体および／またはフラグメントから医薬組成物を調製するために、薬学的に許容される担体は、固体または液体であり得る。固形製剤としては、粉剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、カシェ剤、座薬および顆粒剤が挙げられる。例えば、本発明の化合物は、送達時に再構成する粉末の形態であり得る。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤またはカプセル化材としても機能し得る１種以上の物質であり得る。粉剤では、担体は、微粉化した有効成分との混合物を形成する微粉化した固体である。
粉剤および錠剤は、約１〜約７０パーセントの有効成分を含有することが好ましい。好適な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどである。錠剤、粉剤、カシェ剤、トローチ剤、速く溶けるストリップ剤、カプセル剤および丸剤は、経口投与に好適な有効成分を含有する固形の剤形として使用することができる。
液体製剤としては、溶液、懸濁液、停留かん腸およびエマルション、例えば、水溶液または水性プロピレングリコール溶液が挙げられる。注射剤では、液体製剤を水性プロピレングリコール溶液中に溶液で配合することができる。
医薬組成物は単位剤形とすることができる。そのような剤形では、組成物を適正量の有効成分を含有する単位用量に小分けする。単位剤形はパッケージ製剤とすることができ、パッケージは単位用量の分離量を含有する。投与量は患者の必要性、治療する病態の重症度、化合物および使用する投与経路によって変わり得る。特定の状況に適した投与量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
また、医薬組成物には、必要に応じて、他の混合可能な薬剤、例えば、医薬品、治療薬または予防薬を含有させることができる。治療薬または予防薬としては、限定はされないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣剤、合成薬、無機分子および有機分子が挙げられる。そのような薬剤（例えば、抗癌剤）の分類例としては、限定はされないが、細胞毒素、血管新生阻害薬、免疫調節薬、免疫療法薬、および、痛みの軽減、または１種以上の治療薬の有害作用を相殺するために使用される薬剤（例えば、グルココルチコイドの高カルシウム血作用を軽減するために使用されるビスホスフォネート）が挙げられる。
血管新生阻害薬、本発明に記載の組成物および方法での使用に適した薬剤および療法としては、限定はされないが、アンジオスタチン（プラスミノゲンフラグメント）；血管新生阻害アンチトロンビンＩＩＩ；アンギオザイムが挙げられる。ビスホスフォネートとしては、限定はされないが、アレンドロネート、クロドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネートおよびゾレドロネートが挙げられる。
本明細書に記載の組成物および方法での使用に好適な免疫調節剤および免疫調節療法としては、限定はされないが、抗Ｔ細胞受容体、例えば、抗ＣＤ３抗体（例えば、Ｎｕｖｉｏｎ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）、ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）または抗ＣＤ２０抗体Ｒｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ １Ｈ（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ１１ａ抗体（例えば、Ｘａｎｅｌｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、抗サイトカインまたは抗サイトカイン受容体抗体およびアンタゴニスト、例えば、抗ＩＬ−２受容体抗体（Ｚｅｎａｐａｘ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ））、抗ＩＬ−６受容体抗体（例えば、ＭＲＡ（Ｃｈｕｇａｉ））、および抗ＩＬ−１２抗体（ＣＮＴＯ１２７５（Ｊａｎｓｓｅｎ））、抗ＴＮＦアルファ抗体（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｊａｎｓｓｅｎ））またはＴＮＦ受容体アンタゴニスト（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｉｍｍｕｎｅｘ））、抗ＩＬ−６抗体（ＢＥ８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ）およびシルツキシマブ（ＣＮＴＯ３２（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ））、ならびに、腫瘍関連抗原に免疫特異的に結合する抗体（例えば、トラスツズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））が挙げられる。
本明細書に記載の組成物および方法での使用に好適な免疫療法薬としては、限定はされないが、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＬＡＧ−３抗体が挙げられる。
組成物は、治療有効量の抗体またはフラグメントを含む単位剤形の形態で作成されることが好ましい。単位剤形の例には、錠剤およびカプセル剤がある。治療目的のためには、錠剤およびカプセル剤は、有効成分に加えて、結合剤などの従来の担体、例えば、アカシアガム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトールまたはトラガカント、充填剤、例えば、リン酸カルシウム、グリシン、ラクトース、トウモロコシデンプン、ソルビトールまたはスクロース、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、エチレングリコール、シリカまたはタルク、崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン、香味剤もしくは着色剤、または許容される湿潤剤を含有することができる。一般に水性もしくは油状溶液、懸濁液、エマルション、シロップ剤またはエリキシル剤の形態の経口液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、非水剤、保存料、着色剤および香味剤などの従来の添加剤を含有することができる。液体製剤の添加剤の例としては、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、分画ココナッツ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、食用硬化油脂、レシチン、メチルセルロース、メチルもしくはプロピルパラヒドロキシベンゾエート、プロピレングリコール、ソルビトールまたはソルビン酸が挙げられる。
本明細書に記載の化合物および組成物の作製方法および使用方法に関する他の一般的な詳細は、当該技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第７，８２０，１６９号明細書を参照されたい。その内容はその全体が組み込まれる。
治療方法
当業者、例えば、臨床医は、個人に投与するための、特定の抗体、フラグメントおよび組成物の好適な用量および投与経路を、選択した薬剤、医薬製剤および投与経路、患者の各種因子、ならびに他の検討事項を考慮して決定することができる。用量は、引き起こされる、または生じる有害な副作用が最小、またはゼロになるものであることが好ましい。標準的な多剤投与処方では、薬剤は、患者が受ける治療において、あらかじめ決定された、または最適な血漿濃度を維持するように設計された処方計画にしたがって投与され得る。抗体、フラグメントおよび組成物は適切な用量範囲または治療有効量、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、１０．０ｍｇ／ｋｇ、１１．０ｍｇ／ｋｇ、１２．０ｍｇ／ｋｇ、１３．０ｍｇ／ｋｇ、１４．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、１６．０ｍｇ／ｋｇ、１７．０ｍｇ／ｋｇ、１８．０ｍｇ／ｋｇ、１９．０ｍｇ／ｋｇ、２０．０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇで添加することができる。１つの実施形態では、投与する組成物、抗体またはフラグメントの用量は、１回の投与当たり０．１〜１５ｍｇ／ｋｇである。
抗体またはフラグメントは、１日に、１回、少なくとも１回、２回、少なくとも２回、３回、または少なくとも３回投与することができる。抗体またはフラグメントは、１週間に、１回、少なくとも１回、２回、少なくとも２回、３回、少なくとも３回、４回、少なくとも４回、５回、少なくとも５回、６回、または少なくとも６回投与することができる。抗体またはフラグメントは、１ヶ月に１回、１ヶ月に少なくとも１回、１ヶ月に２回、１ヶ月に少なくとも２回、１ヶ月に３回、または１ヶ月に少なくとも３回投与することができる。抗体または抗体フラグメントは、１年に１回、１年に少なくとも１回、１年に２回、１年に少なくとも２回、１年に３回、１年に少なくとも３回、１年に４回、１年に少なくとも４回、１年に５回、１年に少なくとも５回、１年に６回、または１年に少なくとも６回投与することができる。
抗ＶＩＳＴＡ抗体、フラグメントおよび組成物は、例えば、非経口または経口で、例えば、静脈内に、皮下に、経口で、直腸に、筋肉内に、腹腔内に、粘膜に、経皮的に、髄腔内に、鼻腔内に、または局所的に投与することができる。当業者は、以下の剤形が、有効成分として、本発明の化合物、または本発明の化合物に対応する薬学的に許容される塩を含み得ることを認識していよう。いくつかの実施形態では、これらの剤形は、有効成分として、化合物、または化合物に対応する薬学的に許容される塩を含み得る。
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体を、併用療法（例えば、互いに、または１種以上の他の治療薬と）の一部として投与することができる。本発明の化合物は、１種以上の他の治療薬の前、後、または同時に投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物および他の治療薬は、個別の製剤として、または混合した製剤として、同時に（例えば、一斉に）同時投与することができる。あるいは、薬剤は、個別の組成物として、熟練した臨床医によって決定される適切な時間枠（例えば、療法における医薬効果が重なって現れるのに十分な時間）内で、連続的に投与することができる。本発明の化合物および１種以上の他の治療薬は、単回投与または多数回投与で、順に、所望の治療効果を達成するのに好適なスケジュールで、投与することができる。
本発明はまた、細胞、組織、臓器、動物または患者の少なくとも１つの悪性疾患の調節または治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の化合物および組成物は、癌の治療または予防に使用される。癌には、任意の臓器系または体系の任意の悪性または良性の腫瘍が含まれ得る。例としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：乳癌、消化器／消化管癌、内分泌癌、神経内分泌癌、眼癌、泌尿生殖器癌、胚細胞癌、婦人科癌、頭頸部癌、血液癌、筋骨格癌、神経癌、呼吸器／胸部癌、膀胱癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、子宮内膜、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、胃癌、精巣癌、食道癌、前立腺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌および甲状腺癌。他の癌としては、白血病、メラノーマおよびリンパ腫、ならびに本明細書に記載の癌を挙げることができる。いくつかの実施形態では、固形腫瘍に骨髄細胞および／またはＴ細胞が浸潤する。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群および／または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、リンパ性白血病または骨髄性白血病などの任意の種類またはタイプの白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ性白血病、大型顆粒リンパ球白血病、または成人Ｔ細胞白血病であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、組織球性リンパ腫、濾胞性リンパ腫またはホジキンリンパ腫であり、いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍、例えば、メラノーマまたは膀胱癌である。ある特定の実施形態では、癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌である。
本発明はまた、細胞、組織、臓器、動物または患者の少なくとも１つの悪性疾患、例えば、限定はされないが、白血病、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、大腸癌、膵臓癌、上咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴性症候群／高カルシウム血症、固形腫瘍、腺癌、肉腫、悪性メラノーマ、血管腫、転移疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などの少なくとも１つを調節または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍に骨髄細胞および／またはＴ細胞が浸潤する。ある特定の実施形態では、固形腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および療法は、ワクチン（ウイルスベクターワクチン、細菌ワクチン、細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、ペプチドワクチンまたはタンパク質ワクチンなど）と併用される。そのようなワクチンは、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｓｃｈｌｏｍ、“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｆｏｒｗａｒｄ”，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ；１０４：５９９−６１３（２０１２）を参照されたい。その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物および療法は、化学療法、ホルモン療法および生物学的療法用の薬剤、ならびに／またはビスホスフォネートと併用される。いくつかの実施形態では、化学療法用薬剤としては、次の１種以上が挙げられる：カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ）、シクロヒスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド（ＶｅＰｅｓｉｄ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、トポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）。
他の実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ化合物および療法は、１種以上の免疫チェックポイント抗体、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、イピリムマブ、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＬＡＧ−３ｖ、抗ＯＸ４０抗体および抗ＧＩＴＲ抗体などと併用される。
他の一実施形態では、本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ化合物および療法は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）小分子阻害剤と併用される。
本発明の抗ＶＩＳＴＡ化合物および組成物は、癌を予防（癌の再発防止を含む）または治療（例えば、癌またはその１種以上の症状の管理または改善）するために、それを必要としている対象に投与することができる。癌またはその１種以上の症状の予防、治療、管理または改善に有用であると知られているか、または使用されてきたか、もしくは現在使用されている薬剤または療法（例えば、化学療法、放射線療法、イマチニブ、ソラフェニブおよびベムラフェニブなどの標的療法、ホルモン療法、ならびに／または生物学的療法もしくは免疫療法）は、本明細書に記載の本発明の化合物または組成物と併用することができる。抗癌剤としては、限定はされないが、以下のものが挙げられる：５−フルオロウラシル、アシビシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ビカルタミド、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼルシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロロキシフェンシトラート、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、塩酸エフロルニチン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、フォストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモフォシン、インターロイキンＩｌ（組み換えインターロイキンＩＩ、すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロン アルファ−２ａ、インターフェロン アルファ−２ｂ、インターフェロン アルファ−ｍ、インターフェロン アルファ−ｎ３、インターフェロン ベータ−Ｉａ、インターフェロンガンマ−Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、ランレオチドアセテート、レトロゾール、リュープロリドアセテート、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、塩酸メクロレタミン、メゲストロールアセテート、メレンゲストロールアセテート、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、オルマプラチン、パクリタキセル、ペグアスパルガーゼ、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、ログレチミド、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリソマイシン、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン。標的療法としては、限定はされないが、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ソラフェニブおよびベムラフェニブ）が挙げられる。本発明はまた、ｘ線、ガンマ線および癌細胞を破壊する他の線源の使用を含む放射線療法と組み合わせた本発明の抗ＶＩＳＴＡ化合物の投与を包含する。癌治療は当該技術分野で知られており、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（５７ｔｈ ｅｄ．，２００３）などの文献に記載されている。
本明細書に記載の抗ＶＩＳＴＡ抗体はまた、例えば、慢性感染症、とりわけＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、およびＨＳＶなどの治療に有用である。
本発明の抗ＶＩＳＴＡ抗体を選択するための各種特性および配列情報を本明細書中の表１Ａ、１Ｂおよび２に示す。
Figure 2019509993
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生物学的応答を誘発する方法
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリンサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗体を使用して、対象において生物学的応答を誘発する方法を提供する。本方法は、ＶＩＳＴＡタンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、対象に、その対象において生物学的応答を誘発するのに十分な量投与する工程を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＩＳＴＡに結合する抗体または抗原結合フラグメントによって誘発される生物学的応答は、循環免疫細胞数の減少、骨髄および／または脾臓中の顆粒球数の減少、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせの数の増加、および１種以上のサイトカインのレベルの増加、あるいはこれらの応答の任意の組み合わせである。
一実施形態では、誘発される生物学的応答は、循環免疫細胞の数の減少である。減少する循環免疫細胞は、例えば、単球、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。１つの実施形態では、循環免疫細胞の数の減少は一時的である。
本明細書で使用される場合、循環免疫細胞の数の「一時的」減少は、抗体または抗原結合フラグメントの投与前のレベルに対する一時的な減少を指し、減少したレベルは、その後の時点で、前のレベルに戻るか、またはそれを超える。
一実施形態では、誘発される生物学的応答は、対象の１つ以上の組織（例えば、骨髄）および／または臓器（例えば、脾臓）における顆粒球の数の減少である。
一実施形態では、誘発される生物学的応答は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫細胞の数の増加である。ＴＭＥにおいて増加する免疫細胞としては、限定はされないが、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
一実施形態では、誘発される生物学的応答は、１種以上のサイトカイン（例えば、１種以上のケモカイン）のレベルの増加である。抗ＶＩＳＴＡ抗体または抗原結合フラグメントの投与に応じて増加し得るサイトカインの例としては、例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＩＬ−１Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７Ａ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−９、ＴＧＦα、ＩＬ−１５、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−αα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ｓＣＤ４０Ｌ、エオタキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−５、ならびにＰＤＧＦ−ＢＢが挙げられる。
ある特定の実施形態では、対象に投与される、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、エフェクター機能を有するＦｃ領域（例えば、細胞上のＦｃ受容体に結合する）を含む。ある特定の実施形態では、この抗体、またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）上のＣＤ１６受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ）に結合する。
一実施形態では、対象に投与される、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含み、さらに、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ＶＳＴＢ１７４またはその抗原結合フラグメントである。
一実施形態では、ＶＩＳＴＡに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントが投与される対象は哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。他の一実施形態では、哺乳動物は非ヒト霊長目である。さらに他の実施形態では、哺乳動物は齧歯動物（例えば、マウス、ラット）である。
一実施形態では、対象は、癌（例えば、固形腫瘍、白血病、リンパ腫）を有する。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群および／または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、リンパ性白血病または骨髄性白血病などの任意の種類またはタイプの白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ性白血病、大型顆粒リンパ球白血病、または成人Ｔ細胞白血病であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、組織球性リンパ腫であり、いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍、例えば、メラノーマ、乳癌または膀胱癌である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））である。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌である。
抗体またはそのフラグメントは、例えば、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＱ）または経口（ＰＯ）を含む任意の好適な非経口または経口で投与することができる。
抗ＶＩＳＴＡ抗体のスクリーニング方法
本発明は、一実施形態において、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合し、生物学的応答を誘発する抗体を同定する方法を提供する。この方法は、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗体フラグメントを、細胞、組織、臓器および／または生物に提供する工程、ならびにその抗体またはその抗体フラグメントが細胞、組織、臓器または生物において生物学的応答を誘発するか否かを決定する工程を含む。
一実施形態では、決定する生物学的応答として、単球の活性化、Ｔ細胞の活性化、循環免疫細胞の数の減少、骨髄および脾臓中の顆粒球数の減少、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせの数の増加、１種以上のサイトカイン（例えば、ケモカイン）のレベルの増加、あるいはこれらの応答の任意の組み合わせが挙げられる。
一実施形態では、本方法により同定される、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、エフェクター機能を有するＦｃ領域（例えば、細胞上のＦｃ受容体に結合する）を含む。ある特定の実施形態では、この抗体、またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）上のＣＤ１６受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ）に結合する。
一実施形態では、本方法により同定される、ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含み、さらに、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む。
一実施形態では、生物学的応答は、様々なタイプの試料、例えば、限定はされないが、組織試料、生体液試料（例えば、哺乳動物の血漿、血清、リンパ液、全血、脊髄、羊膜または他の動物由来の液）、細胞（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞）試料などで分析することができる。試料としては、例えば、（ａ）固定されていない新鮮組織および／または細胞を含む標本、（ｂ）固定包埋された組織標本、例えば、保存材料、ならびに（ｃ）凍結した組織または細胞を挙げることができる。したがって、試料は、新鮮であるか、あるいは、液体溶液に、急速冷凍もしくは凍結乾燥、スライドまたは他の支持材上に塗布、または乾燥、包埋もしくは固定して保存され得る。
いくつかの実施形態では、組織または細胞試料は固定または包埋される。例えば、細胞および組織を再生可能で生きているような方法で保存するために、固定液が使用される。固定液はまた、細胞および組織を安定化し、それにより、プロセッシングおよび染色法の厳しさからそれらを保護する。例えば、組織のブロック、切片、塗抹を含む試料を固定液に浸漬、または塗布物の場合には乾燥させることができる。
試料を得るために、対象から試料を採取する任意の方法、例えば、採血、脊椎穿刺、組織スメアもしくはスクレープ、または組織生検を使用することができる。したがって、試料は、生検標本（例えば、腫瘍、ポリープ、腫瘤（固形、細胞））、吸引物、塗抹または血液試料であり得る。試料は、腫瘍（例えば、癌性増殖）および／または腫瘍細胞を有するか、あるいは、腫瘍および／または腫瘍細胞を有する疑いのある組織であり得る。例えば、腫瘍生検は、直視下生検、標的領域から全（切除生検）または部分（切開生検）腫瘤を除去する手順で得ることができる。あるいは、腫瘍試料は、経皮的生検、針様器具を用い、小切開または穿刺を行って（画像装置の助けの有無にかかわらず）、個々の細胞もしくは細胞塊（例えば、微細針吸引（ＦＮＡ））、または組織のコアもしくはフラグメント（コア生検）を得る手順で得ることができる。
試料は、細胞学的に（例えば、塗抹））、組織学的に（例えば、凍結もしくはパラフィン切片）または他の任意の好適な方法（例えば、分子診断法）により検査することができる。腫瘍試料はまた、個体組織由来の培養ヒト細胞からインビトロで採集することによって得ることができる。腫瘍細胞は、必要に応じて、分析前に、急速凍結、または管理された凍結レジームなどの、分析可能な条件で試料のタンパク質および／または核酸を保存する好適な貯蔵手段によって貯蔵することができる。必要に応じて、凍結は、抗凍結剤、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、またはプロパンジオール−スクロースの存在下で行うことができる。腫瘍細胞は、必要に応じて、貯蔵前または貯蔵後に、分析目的のためにプールすることができる。
一実施形態では、生物学的応答は、例えば、免疫学的方法および免疫化学的方法、例えば、限定はされないが、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）、サイトカイン放出アッセイ、ケモカイン放出アッセイ、細胞活性化アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞移動アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、例えば、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫沈降、および他の抗体による定量方法（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ビーズベースアッセイ）などのインビトロアッセイを使用して測定することができる。他の好適な方法としては、例えば、質量分析法が挙げられる。
一実施形態では、生物学的応答は、非ヒト動物において、インビボで測定することができる。一実施形態では、非ヒト動物は非ヒト霊長目である。さらに他の実施形態では、非ヒト動物は齧歯動物（例えば、マウス、ラット）である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はトランスジェニック動物である。
一実施形態では、非ヒト動物は、癌（例えば、固形腫瘍、白血病、リンパ腫）を有する。いくつかの実施形態では、癌は、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群および／または骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、リンパ性白血病または骨髄性白血病などの任意の種類またはタイプの白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ性白血病、大型顆粒リンパ球白血病、または成人Ｔ細胞白血病であり得る。いくつかの実施形態では、リンパ腫は、組織球性リンパ腫であり、いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍、例えば、メラノーマ、乳癌または膀胱癌である。いくつかの実施形態では、癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））である。いくつかの実施形態では、癌は、膀胱癌である。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌である。
一実施形態では、分析する生物学的応答は、循環免疫細胞の数の減少である。減少する循環免疫細胞は、例えば、単球、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。１つの実施形態では、循環免疫細胞の数の減少は一時的である。
一実施形態では、分析する生物学的応答は、対象の１つ以上の組織（例えば、骨髄）または臓器（例えば、脾臓）における顆粒球の数の減少である。
一実施形態では、分析する生物学的応答は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫細胞の数の増加である。ＴＭＥにおいて増加する免疫細胞としては、限定はされないが、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。
一実施形態では、分析する生物学的応答は、１種以上のサイトカイン（例えば、１種以上のケモカイン）のレベルの増加である。抗ＶＩＳＴＡ抗体または抗原結合フラグメントの投与に応じて増加し得るサイトカインの例としては、例えば、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＩＬ−１Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７Ａ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−９、ＴＧＦα、ＩＬ−１５、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−αα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ｓＣＤ４０Ｌ、エオタキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−５、ならびにＰＤＧＦ−ＢＢが挙げられる。
実施例１：ヒト造血細胞におけるＶＩＳＴＡ発現の分析
方法：
ＶＩＳＴＡ発現用の新鮮ヒトＰＢＭＣの調製および染色
いくつかのドナーから新鮮単離したＰＢＭＣ（末梢血単核球）におけるＶＩＳＴＡ発現を試験した。染色に抗ヒトＶＩＳＴＡビオチン（ＧＡ−１）を使用した（５μｇ／ｍｌ）。マウスＩｇＧ１、Ｋビオチン（クローンＭＯＰＣ−２１、５μｇ／ｍｌ）をアイソタイプ対照として使用した。
ドナー材料
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｌｍａｒ、ＰＡ）から血液試料を得、同じ日に採取し、分析した。ヘパリン硫酸を含む全血１０ｍｌを分析のために送った。
試料の調製
血液を滅菌ＰＢＳにより１：１に希釈した。希釈した臍帯血２２ｍｌを、２０ｍｌコニカルチューブ内の滅菌Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ カタログ番号１７−１４４００３）上に注ぎ、層を形成した。チューブを１８００ｒｐｍで２０分間、室温で遠心分離機にかけた。遠心分離後、１ｍｌピペットを用いて界面の単核球を採取し、２本の５０ｍｌコニカルチューブに入れた。滅菌ＰＢＳを各チューブに加えて、体積を５０ｍｌとし、細胞を３００ｇで１０分間、４℃で遠心分離機にかけた。上清を捨てた。細胞を５０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、チューブを３００ｇで１０分間、４℃で回転させた。上清を捨てた。細胞をまとめ、計数前に、５０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。
染色プロトコル：５×１０7個のＰＢＭＣを含有する凍結バイアルを、補償制御のために、かつ染色用対照として使用した。
以下の試薬および／または消耗品を使用した。
０．２％ＥＤＴＡを補充したＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＳＡ）（カタログ番号５５４６５７）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ カタログ番号１４１９０）；９６ウェルポリプロピレン丸底プレート（ＢＤ＃３０７７）；１．２ｍｌプリプロピレンクラスターチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４４５１）；ＩｍｍｕｎｏＮｅｘｔ製のビオチン化抗ＶＩＳＴＡクローンＧＡ−１ロット番号０８０６１２Ｂ（５μｇ／ｍｌで使用）；ビオチン化ｍＩｇＧ１、Ｋアイソタイプ対照（クローンＭＯＰＣ−２１）；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４００１０４、ロット番号Ｂ１１６６４９（５μｇ／ｍｌで使用）；抗ヒト抗体（下の染色表を参照）；近赤外吸収ライブ・デッド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ１０１１９）；およびＳＴＰ−ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ カタログ番号５５４０６７、ロット番号０４２５１）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用）、ＳＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４０５２０３、ロット番号Ｂ１３９６８８）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用）、ＳＴＰ−ＰＥ Ｃｙ７（アイソタイプ対照試料において非特異的結合を示す）、ＳＴＰ−Ｑ６０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ カタログ番号Ｑ１０１０１ＭＰ、ロット番号５３４４９Ａ）（ＦＡＣＳ緩衝液で１：２００に希釈して使用）を含むストレプトアビジン試薬。
細胞表面染色プロトコル
染色前に、１×１０6個の細胞を９６ウェル丸底プレートに移し、１５０μｌのＰＢＳで洗浄した。その後、プレートを、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。
その後、細胞をＰＢＳで再度洗浄し、上記のように遠心分離機にかけた。
その後、０．２５μｌの近赤外吸収ライブ・デッド色素を含有する５０μｌのＰＢＳ中でライブ・デッド染色を行った。室温で１０分後、ウェルを１５０μｌのＦＡＣｓ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。上清を捨てた。
ヒト血清を１：１００で含む５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液で細胞をブロックした。プレートを４℃で、１５分間インキュベートした。その後、ウェルを１５０μｌのＦＡＣｓ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、３分間、遠心分離機にかけた。上清を捨てた。
その後、表面染色のために、以下の抗体を含有するカクテルを各ウェルに加えた。カクテルを下の表３〜６に記載する。各カクテルは対象の個体群に応じて、他とは別に使用される。
Figure 2019509993
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表面染色後、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液で２回、前述のようにして洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、５分間、遠心分離機にかけた。試料を、蛍光標識された適切なストレプトアビジンを含む５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。試料を４℃で３０分間インキュベートした。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液で洗浄し、１３００ｒｐｍ、４℃で、５分間、遠心分離機にかけた。この洗浄工程を繰返した後、試料を２５０μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液中に再懸濁した。同日、試料をＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭセルアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
データ解析
特定の表現型個体群をゲーティングするために、ＦｌｏｗＪｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ９ソフトウエアを用いて、フローサイトメトリーデータを再分析した。異なる細胞サブセットにおけるＶＩＳＴＡ発現を比較するために、幾何平均の一覧を使用した。抗ＶＩＳＴＡ処理試料の平均値からアイソタイプ対照の値を減算することによって、各個体群をバックグラウンドで正規化した。グラフをプリズムで作成し、スチューデントのｔ検定（２種の試料のみを比較する場合）、またはボンフェローニのポスト検定を含む一元配置ＡＮＯＶＡを使用して統計処理を行った。
結果：
ヒトミエロイドおよびリンパ球サブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｇ、４、５Ａ〜５Ｂおよび６Ａ〜６Ｃに示すように、ＣＤ１４+単球におけるＶＩＳＴＡ発現は、他の全ての個体群と大きく異なっていた（ｐ＜０．００１）。他の個体群間では大きな違いは認められなかった。末梢血では、単球が最も高レベルでＶＩＳＴＡを発現し、ＣＤ１４+ＣＤ１６-サブセットがＣＤ１４loＣＤ１６+細胞よりはるかに高い発現を示した。一方、ＡＰＣは中程度のＶＩＳＴＡ発現を示し、リンパ球サブセットは低い発現レベルを示した。
ヒトＴおよびＮＫサブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図７Ａ〜７Ｅ、８Ａ〜８Ｇおよび９に示すように、ＮＫサブセットを含むＣＤ５６lo細胞はＣＤ５６HiＮＫ細胞よりはるかに高いＶＩＳＴＡ発現レベルを示した。Ｔ細胞サブセットのうち、ＣＤ８+記憶細胞は最も高い発現レベルを示したが、ＣＤ８+ナイーブＴ細胞またはＣＤ４+Ｔ細胞よりさほど高くはなかった。
ヒト樹状細胞サブセットにおけるＶＩＳＴＡの発現：
図１０Ａ〜１０Ｄ、１１Ａ〜１１Ｃおよび１２に示すように、ＶＩＳＴＡ発現に大きな違いは認められず、ＤＣおよび好塩基球は低いＶＩＳＴＡ発現を示し、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）は一般にそれらと比較して高かったが顕著なほどではなかった。
結論：これらの結果は、各種の免疫細胞サブセッにおけるＶＩＳＴＡ発現を示し、ＶＩＳＴＡは単球で最も高く発現し、種々のＴ細胞サブセットおよびＮＫ細胞ではいくらか発現し、Ｂ細胞では全く発現しないか殆ど発現しない。
実施例２：末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡ発現
方法：
全血の染色：新鮮単離した全血（１００μｌ）を下記に示した抗体カクテルで、４℃で３０分間インキュベーションすることによって染色した。赤血球（ＲＢＣ）をＲＢＣ溶解緩衝液で溶解し、残りの細胞を染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を２００μｌの染色緩衝液に再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーターを用いてデータを集め、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウエアを用いて解析した。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の染色：末梢血単核球を、フィコール勾配を用いて全血から単離した。新鮮単離した１×１０6個のＰＢＭＣを、１００μｌの染色緩衝液中で抗体カクテルにより染色した。試料を４℃で３０分間インキュベートし、その後、染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を１００μｌの染色緩衝液に再懸濁した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてデータを集め、ＦｌｏｗＪｏ解析ソフトウエアを用いて解析した。
使用した抗体は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１７７、ＣＤ１６、ＣＤ１５、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１２７、ＣＤ６９、およびＦＯＸＰ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）であった。ＡＰＣ−結合マウス抗ヒトＶＩＳＴＡ（クローンＧＧ８）はＩｍｍｕＮｅｘｔ（Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）により作製された。
結論：
健康なヒトの抹消血細胞におけるＶＩＳＴＡ発現
全血および末梢血単核球のＶＩＳＴＡ発現を、マルチカラーフローサイトメトリーを用いて解析した。図１５Ａおよび１５Ｂに示すように、最も高いＶＩＳＴＡ発現は、単核球で検出され、続いて、好中球で検出された。図１３Ｃおよび１３Ｄに示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両Ｔ細胞のＶＩＳＴＡ発現は低レベルであった。
癌患者の末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡの発現
図１４Ａ〜Ｃに示すように、肺癌患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を解析した。図１４Ａは、ＣＤ１４+単球およびＣＤ１５+骨髄由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣ）の解析を示す代表的なＦＡＣＳプロットである。結果は、表現型の上では、ＣＤ１５+細胞が好中球由来のＭＤＳＣであることを示唆している。さらに、これらの細胞は健常者の血液試料には存在しない。図１４Ｂは、健常者と癌患者由来の単球におけるＶＩＳＴＡ発現の代表的なヒストグラムであり、健常対照に比較して癌患者の細胞のＶＩＳＴＡ発現レベルが高いことを示唆している。同様に、図１４Ｃに示すように、癌患者のＭＤＳＣでは、高レベルのＶＩＳＴＡが認められた。
図１５Ａは、結腸癌患者の血液に好中球由来のＭＤＳＣが存在することを示す代表的なＦＡＣＳプロットである。図１５Ｂおよび１５Ｃは、健常なドナーの血液試料に比べて癌患者の単球におけるＶＩＳＴＡ発現がより高いことを示す代表的なヒストグラムである。
カニクイザルの末梢血細胞におけるＶＩＳＴＡの発現
図１６Ａおよび１６Ｂに示すように、サルの全血のフローサイトメトリー解析は、ヒト細胞に似たＶＩＳＴＡ発現パターンを示した。単球および好中球はいずれも、ＣＤ４+（図１６Ｃ）およびＣＤ８+（図１６Ｄ）Ｔ細胞に比べて最高レベルでＶＩＳＴＡを発現した。
実施例３：ヘム悪性細胞株におけるＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルでのＶＩＳＴＡ発現
ＶＩＳＴＡはヘム悪性腫瘍で発現するため、抗ＶＩＳＴＡ抗体は悪性細胞を破壊の標的とし、また、ＶＩＳＴＡをブロックして、抗腫瘍免疫反応を促進する可能性がある。
データは約１４０ヘム悪性細胞株（解析においては、いくつかの細胞種は繰り返される）のＲＮＡｓｅｑを含む。データを図１７に示す。
ＲＮＡｓｅｑ値をＦＰＫＭ（マップされたフラグメント１００万本当たりのエクソン１キロベース当たりのフラグメント数）値で示す。
実質的に、これは、遺伝子のエクソン領域内の全リードが計数され、遺伝子長と１試料当たりの全リード数により正規化されていることを意味する（試料間の差を説明するため）。カットオフ値は１で、１超はＶＩＳＴＡ発現（ＲＮＡレベルで）が陽性であり、１未満はＶＩＳＴＡ発現が陰性である。
結果は、多くの細胞株がＲＮＡレベルで陽性であることを示した（急性骨髄性白血病および慢性骨髄性白血病）。ＶＩＳＴＡは正常な骨髄細胞で高発現し、その機能は抗腫瘍免疫応答などの免疫応答を低下させると考えられることから、このことが予期され得る。
実施例４：ＶＩＳＴＡに対するモノクローナル抗体の生成
ファージパニング
２４のファージパニング実験を行い、Ｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓに対するファージの反応性を向上させた。カニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質は、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質より良好なビオチン結合を示すため、これらの実験にはそのカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質を使用した。ファージ実験の成功を決定するために、それぞれのパニングラウンドからのファージプールをビオチン化ｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓでコーティングしたニュートラアビジンプレートに加え、ＨＲＰ−結合抗Ｍ１３抗体で検出した。ファージ選択ラウンドから個々のコロニーを採取し、９６ウェルプレート中でＦａｂタンパク質を産生させた。発現したＦａｂ上清を、ビオチン化ｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓへの結合について分析した。これには２００より多くがヒットした。
ＦａｂプレートのＶＨおよびＶＬ領域を増幅し、ＤＮＡ配列決定を行い、ＦＡＳＴＡファイルとしてエクスポートした。変質されＭＡＢとして試験されるべきクローンを採取する場合に、クローンは配列多様性ならびに翻訳語修飾の危険性が限られていること、および疎水性残基がなるべく少ないことを基準に選択された。
ファージクローンからのＶＨおよびＶＬを哺乳動物のＩｇＧ１／カッパ発現ベクターにサブクローン化し、ＨＥＫ２９３細胞に導入した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ親和性樹脂により、抗体を精製した。ファージＭＡＢの濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ測定を用いる定量ＥＬＩＳＡによって測定した。抗体パネルを高レベルで発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、発現した各抗体変異体の完全性が示された。
ＶＬ多様性を有するファージベクターへクローニングするための、パニングの最終ラウンドから得られたポリクローナル抗体混合物のＶＨドメインを増幅することによって、ファージ抗体をインライン成熟させた。これにより、濃縮されたＶＨプールが得られ、これはＶＬの多様性が加わった試料となった。ファージは、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ Ｈｉｓタンパク質への非常に高アフィニティの結合を同定しようとする期待を伴った、１〜２ラウンドの厳しいパニングにより採取された。モノクローナルＦａｂのＥＬＩＳＡを行い、成熟が成功したことを決定した。ＥＬＩＳＡおよび発現データを、元のデノボパニング実験から１００％に設定された参照クローンに対して正規化し、ｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ抗原への結合シグナルが参照クローンより強いアフィニティ成熟クローンが同定された。このプロセスは、低濃度の抗原（１ｎＭ）でスクリーニングすると、２００％までの結合を示す数種のクローンを生み出し、最も高いアフィニティを有するクローンが、ＭＡＢとしてその配列が決定され生産された。
ハイブリドーマの生成
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスの１群は、完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ組み換えタンパク質（Ｓｉｎｏ）５０μｇの腹腔内（ＩＰ）注射を１回受け、２週後、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ ＶＩＳＴＡ−Ｉｇ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｆｃ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。全てのマウスは、尾の基部にＰＢＳ中２５μｇのヒトＶＩＳＴＡおよび同２５μｇのｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡの最終注射を受け、５日後、融合のために脾臓を回収した。
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスの別の群は、完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＨｕ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、マウスは、不完全フロイントアジュバント中で乳化したＣｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組み換えタンパク質５０μｇのＩＰ注射を１回受けた。２週間後、全てのマウスは、ＰＢＳ中２５μｇのＨｕ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓおよび同２５μｇのＣｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓの最終注射を受け、３日後、融合のために脾臓を回収した。
融合の日に、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させ、脾臓を取り出し、１０ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水に入れた。小さい乳棒を用いて、細かい網目のスクリーンを通して脾臓をすり潰し、室温でＰＢＳにより濯いで、脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ＲＢＣ溶解に供した。簡潔に記せば、脾臓ごとに細胞を３ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ＃Ｒ７７５７）に再懸濁させ、氷上に５分間置いた。再度、細胞をＰＢＳにより室温で１回洗浄し、磁気ソートのために標識した。製造業者の使用説明書により、細胞には、抗マウスＴｈｙ１．２、抗マウスＣＤ１１ｂおよび抗マウスＩｇＭ磁気ビーズ（それぞれ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ＃１３０−０４９−１０１、同１３０−０４９−６０１および同１３０−０４７−３０１）で標識し、その後、Ｍｉｄｉ ＭＡＣＳを用いてＭＳカラムによりソートした。陰性の細胞画分（陽性の細胞画分は廃棄した）をＦＯ細胞と融合させた。１：１の比のマウス骨髄腫細胞対生脾臓細胞で融合を行った。簡潔に記せば、脾臓および骨髄腫細胞を一緒に混合して、ペレット化し、５０ｍＬのＰＢＳ中で１回洗浄した。１０ｅ８個の脾臓細胞当たり１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（２ｇ ＰＥＧ、分子量４０００、２ｍＬ ＤＭＥＭ、０．４ｍＬ ＤＭＳＯ）を用いて、ペレットを３７℃で３０秒間再懸濁させた。次いで、細胞／融合混合物を緩やかに撹拌しながら３７℃の水浴に約６０秒間浸漬した。３７℃のＤＭＥＭを１分間かけて徐々に添加し、融合反応を停止させた。融合した細胞を室温で５分間静置し、次いで、１５０Ｇで５分間遠心分離した。その後、細胞をＭｅｄｉｕｍ Ｅ−ＨＡＴ（ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ｈ０２６２）を含むＭｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号０３８０５））に再懸濁し、９６ウェル平底ポリスチレン組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３９９７）に播種した。
捕捉ＥＩＡを使用して、ｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡに特異的な抗体について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。簡潔に記せば、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４６６１２）を、少なくとも６０分間、コーティングバッファ（Ｔｈｅｒｍｏ ２８３８２）中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５−００６−０７１）で４μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。プレートを、２００μｌ／ウェルの０．４％（重量／体積）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＰＳＢ中）により、室温で３０分間ブロッキングした。プレートを１回洗浄し、５０μｌ／ウェルのハイブリドーマ上清を加え、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。プレートを１回洗浄し、５０μｌ／ウェルの０．１μｇ／ｍＬｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ−ｈｕＩｇを加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを１回洗浄し、０．４％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：４０，０００のストレプトアビジンＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ０１６−０３０−０８４）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルＴＭＢ Ｔｕｒｂｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４０２２）を使用して、室温で約１０分間インキュベートして、発色させた。２５μｌ／ウェルの４Ｎ硫酸を使用して反応を停止させ、自動プレート分光計を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。限界希釈法により、一次ヒットのうち１５個をサブクローニングのために選択し、一次スクリーニングと同じ形式でスクリーニングした。
全てのｃｙｎｏ ＶＩＳＴＡ反応性ハイブリドーマ細胞株を、ヒトＶＩＳＴＡ−Ｉｇを使用して交差スクリーニングし、交差反応性を評価した。簡潔に記せば、プレート（Ｎｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４６６１２）を、０．１Ｍ炭酸−重炭酸ナトリウムバッファ、ｐＨ９．４（Ｐｉｅｒｃｅ ２８３８２ ＢｕｐＨＴＭ）中４μｇ／ｍＬのヤギ抗ｍｓ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１１５−００６−０７１）により、４℃で終夜コーティングした。洗浄せずに、ウェルを、２００μｌのブロック液（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中０．４％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）（重量／体積））により、４℃で終夜ブロッキングした。ブロック溶液を除去した後、希釈していないハイブリドーマ上清を、コーティングしたプレート上、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ）（重量／体積））で１回洗浄し、その後、Ｈｕ ＶＩＳＴＡ−Ｉｇをブロック液で１００ｎｇ／ｍｌに希釈して３０分間インキュベートした。プレートを１回洗浄し、ブロック液で１：１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−０３６−０９８）により、室温で３０分間プローブ処理した。プレートを再度洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのＴＭＢ Ｔｕｒｂｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３４０２２）を使用して、室温で約１０分間インキュベートし、発色させた。２５μｌ／ウェルの４Ｎ硫酸を使用して反応を停止させ、自動プレート分光計を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
ヒトおよびカニクイザルの両方のＶＩＳＴＡに反応性を有することを示したハイブリドーマは、クローニングされたＶ領域抗体配列を有した。ハイブリドーマ細胞を調製し、その後、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃｅｌｌｓ Ｄｉｒｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍを用いて逆転写酵素（ＲＴ）反応を行った。簡潔に記せば、培養培地を廃棄し、プレートを氷上に置き、２００μｌの冷ＰＢＳに再懸濁させた。４０μｌをＭｉｃｒｏＡｍｐ高速９６ウェル反応ＰＣＲプレートに移し、プレートを冷金属プレートベース上に置き、プラスチックフィルムで密封して、７００ｒｐｍで３分間回転させた。ＰＢＳを廃棄し、各ウェルに１０μｌの再懸濁バッファおよび１μｌの溶解促進剤を加えた。プレートを密封し、７５℃で１０分間インキュベートして、−８０℃で保存した。
ＲＴ反応のために、各ウェルは、５μｌの水、１．６μｌの１０×ＤＮａｓｅバッファ、１．２μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ、２μｌのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（５０ｍＭ）および１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘを含んだ。プレートを７０℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートし、その後、以下の試薬を各ウェルに加えた：６μｌの５×ＲＴバッファ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）および１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ。プレートを密封し、５０℃に予備加熱したサーマルサイクラー上に置き、５０℃で５０分間インキュベートし、その後、不活化させた（８５℃で５分間のインキュベーション）。反応物を氷上で冷やし、一本鎖ｃＤＮＡを、次に使用するまで−８０℃で保存した。
Ｖ領域増幅のために、２０μｌのＰＣＲ反応を設定した。各ウェルは、１６．２μｌの水、２．０μｌの１０×ＰＣＲ反応バッファ、０．８μｌのＭｇＳＯ４（５０ｍＭ）、０．４μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．１５μｌの１００μＭフォワードプライマー混合物、０．０５μｌの１００μＭリバースプライマー、０．２μｌのＨｉＦｉ Ｔａｇ酵素を含んだ。上記のように調製したｃＤＮＡ（２μｌ／ウェル）をＰＣＲ内容混合物に移し、プレートを密封して、増幅反応を行った：ＶＨに対して、プログラムは、（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６８℃で１分間とした。工程（ｉｉ〜ｉｖ）を合計３５サイクル繰り返し、その後、６８℃で３分の最後の伸長を続けた。ＶＬに対して、プログラムは、（ｉ）９４℃で１分間、（ｉｉ）９４℃で１５秒間、（ｉｉｉ）５５℃で３０秒間、（ｉｖ）６５℃で３０秒間、（ｖ）６８℃で１分間とした。工程（ｉｉ〜ｖ）を合計３５サイクル繰り返し、その後、６８℃で３分の最後の伸長を続けた。
フォワードプライマーを予め混合し、そうした混合物とリバースプライマーを３：１の比で使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で検証した。促進剤（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＣ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、カタログ番号６３９６５０、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を加えることにより、注入クローニングのための反応物を調製した。５μｌのＰＣＲ反応物をＰＣＲプレートに移し、続いて２μｌの促進剤／ウェルを移した。プレートを密封し、サーマルサイクラー（３７℃で１５分および８０℃で１５分）中でインキュベートした。Ｅｓｐ３Ｉ消化により目的のベクター（ｖＤＲ２４３またはｖＤＲ３０１）を調製した（３０μｌの反応において、１．５μｇのベクターを３μｌのＴａｎｇｏバッファ、２ｌのＥｓｐ３Ｉおよび水中で、３７℃で２時間かけて消化した）。
注入クローニングのために、２μｌの促進剤で処理したＰＣＲ産物を１００ｎｇのＥｓｐ３Ｉ消化ベクターおよび２μｌの５Ｘ注入酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と混合した。注入反応は、９６ウェルＰＣＲプレート形式で行った。ＰＣＲマシンでプレートを５０℃で１５分間インキュベートし、Ｓｔｅｌｌａコンピテントセルを、振盪することなく４２℃で４０秒間ヒートショックにより形質転換し、選択抗生物質を有するＬＢ寒天プレート上に撒き、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、コロニーを、ＬＢ／カルベニシリン培地を含む９６ウェルの深底ウェルプレートに採取し、３７℃で終夜増殖させた。等体積の３０％重量／体積グリセロールと混合した終夜培養物から凍結ストックを作製した。配列決定プライマーＳＰＦ００５２を使用してＶ領域を配列決定した。配列を解析して、ハイブリドーマｖＨおよびｖＬ当たり１つの陽性ウェルを選択し、新しいプレートに再配置して、アンピシリンを含む富化培地中で終夜増殖させた。次いで、９６ウェルプレート中、小規模トランスフェクションのためにクローンをミニプレップＤＮＡ調製した。
重鎖および軽鎖の両方について４８個の選択されたマウスハイブリドーマ配列は、インターナルソフトウエアプログラムを使用して適合させたヒトフレームワークであった。マウスｖＨまたはｖＬのそれぞれ１つについて、１つのヒトフレームワークを選択した。逆翻訳によりＶ領域ＤＮＡ配列を得た。ＨＦＡアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡ領域は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に注文した。予め切断したｖＤＲ１４９およびｖＤＲ１５７、ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパそれぞれにクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐキットを使用してＤＮＡを調製した。Ｅｘｐｉ２９３（１００ｍｌ）培養物を使用してこの抗体パネルを発現させた。
実施例５：インビトロにおけるヒトＶＩＳＴＡ−ＩＧ Ｔ細胞抑制アッセイのためのプロトコル
マウスＡ２０細胞に、ＧＦＰまたはヒトＶＩＳＴＡのいずれかを安定にトランスフェクトした。それらをｏｖａペプチドおよびＤＯ１１．１０ Ｔ細胞とインキュベートした。インキュベーションの開始から２４時間後、Ｔ細胞によるＣＤ２５の発現を測定した。Ａ２０−ｈｕＶＩＳＴＡ細胞は、Ｔ細胞によるＣＤ２５発現を抑制するが、この読み出しは、この読み出しはＶＳＴＢ９５と共にインキュベートすることにより大きく回復する（図１８）。
実施例６：抗ＶＩＳＴＡ抗体のヒトフレームワーク領域の適合
重鎖および軽鎖の両方のマウスハイブリドーマ配列は、インターナルソフトウエアプログラムを使用してＣＤＲ移植（Ｊｏｎｅｓ、ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）により適合されたヒトフレームワークであった。このプログラムは、Ｋａｂａｔの定義（Ｗｕ、Ｔ．Ｔ．＆ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０）．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１３２，２１１−５０）に従ってＶ領域配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）を表し、Ｂｌａｓｔを使用してフレームワーク領域とヒト生殖細胞系遺伝子を比較する。マウスフレームワークに対して最も高い配列同一性を有するヒト生殖細胞系を、ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）のためのアクセプター遺伝子として選択した。いくつかの場合では、ヒトフレームワークが良好に発現した以前の実験に基づいて、密接に関連のあるヒト生殖細胞系遺伝子を代わりに選択した。マウスｖＨまたはｖＬのＶ領域のそれぞれについて選択したヒトフレームワークについてのＤＮＡ配列を逆翻訳により得た。ＨＦＡアミノ酸配列に対応する合成ＤＮＡ領域は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に注文した。ヒトＩｇＧ１およびヒトカッパのそれぞれへのクローニングを行った。
実施例７：抗ＶＩＳＴＡ抗体コンストラクト
細胞株開発用分子のためのプラスミドおよび配列情報：ＶＳＴＢ１１２可変領域、およびＩｇＧ１κ定常領域（ＶＳＴＢ１７４、定常領域中のアロタイプ変化のために新しい番号）、ＩｇＧ２シグマ定常領域（ＶＳＴＢ１４０）またはＩｇＧ１プロテアーゼ耐性定常領域（ＶＳＴＢ１４９）を有する抗ＶＩＳＴＡ抗体のためにプラスミドコンストラクトを作製した。
Ｌｏｎｚａベクター
ｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１２．４チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）発現ベクター系（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＰＬＣ）は、哺乳動物発現細胞株における治療用ｍＡｂ作製のための一次発現系としてＢｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＢＲ）およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰＤＭＳ）で確立された。各ベクターは、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）の発現を駆動するヒトサイトメガロウイルス（ｈｕＣＭＶ−ＭＩＥ）プロモーターを含み、アンピシリン耐性遺伝子を含む。ｐＥＥ１２．４ベクターはまた、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）酵素をコードする遺伝子を含む。グルタミンシンテターゼ活性を必要とする増殖条件は、発現ベクターを維持するために、細胞に選択的な圧力を加える（ＧＳ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍａｎｕａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０）。一遺伝子ベクターとして、ｐＥＥ６．４を使用してＨＣ遺伝子をクローニングし、ｐＥＥ１２．４を使用してＬＣ遺伝子をクローニングした。これらの２つのＬｏｎｚａ一遺伝子ベクターからＬｏｎｚａ二重遺伝子プラスミドが作製される。
選択ＶＩＳＴＡ ｍＡｂの重鎖可変領域のアミノ酸配列
＞ＶＳＴＢ１１２重鎖（配列番号３７）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ５０重鎖（配列番号３８）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ５３重鎖（配列番号３９）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ９５重鎖（配列番号４０）
Figure 2019509993
選択ＶＩＳＴＡ ｍＡｂの軽鎖可変領域のアミノ酸配列
＞ＶＳＴＢ５０軽鎖（配列番号４１）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ５３軽鎖（配列番号４２）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ９５軽鎖（配列番号４３）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ１１２軽鎖（配列番号４４）
Figure 2019509993
 ＞ＶＳＴＢ１１６軽鎖（配列番号４５）
Figure 2019509993
実施例８：抗ＶＩＳＴＡ抗体のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳスクリーニング
これらの実験は、産生された抗体のヒトまたはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質に対する結合能をＥＬＩＳＡにおいて測定するため、および、ＦＡＣＳスクリーニングにより、その抗体の、ヒトまたはカニクイザルＶＩＳＴＡタンパク質を発現するＫ５６２細胞（ヒト骨髄性白血病細胞株）の表面のＶＩＳＴＡタンパク質に対する結合能を測定するために行われた。
方法：
ＥＬＩＳＡ手順概要：プレートに、終夜、４℃で、１μｇ／ｍｌのＳＢ０３６１（ヒト）またはＳＢ０３６１（ｃｙｎｏ（カニクイザル））タンパク質をコーティングした。それらはそれぞれの種からのＶＩＳＴＡの細胞外ドメインである。抗体を出発濃度として１μｇ／ｍｌに希釈し、計４種の濃度に１：４の段階希釈を行い、室温室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。マウス抗ヒトＩｇＧ１−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を検出のために使用し、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄は全て、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）を用いて行った。
ＦＡＣＳ手順概要：２×１０5個のＫ５６２−Ｇ８（ヒト）またはＫ５６２−Ｃ７（ｃｙｎｏ）細胞を、５μｇ／ｍｌの各試験抗体で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ１−ＰＥ（フィコエリスリン）抗体を、二次検出抗体として５μｇ／ｍｌで使用した。細胞をＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａにかけ、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｇ、ＯＲ）を用いて、生きた集団のＭＦＩ（平均蛍光強度）で解析した。
データ解析／結果：各抗体について、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ解析の両方で、抗体が確実に結合したか否かに関する主観的スコア（イエス／ノー）を、４アッセイのそれぞれで示した。抗体がいずれかのアッセイで結合に対し「ノー」という結果を示したなら、それがネガティブであることを確認することを繰り返した。結果を、下の表７と、図１９Ａ〜１９Ｆおよび２０Ａ〜２０Ｆに示す。
Figure 2019509993
Figure 2019509993
実施例９：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）およびブドウ球菌（ＳＴＡＰＨＹＬＯＣＯＣＣＵＳ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）活性化アッセイを使用した抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体のスクリーニング結果
この試験の目的は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイおよびブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ活性化（ＳＥＢ）アッセイにおいて細胞性免疫応答を高める多機能的α−ＶＩＳＴＡ抗体の同定を支援するデータを示すことであった。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、同種異系Ｔ細胞応答を駆動するのにミスマッチなＭＨＣクラスＩおよびＩＩに依存する標準的な免疫学的アッセイである。末梢血単核細胞を２つのミスマッチの個体から単離して、一緒にインキュベートし、これらのミスマッチの結果として増殖およびサイトカイン産生が起こる。
材料と方法：
５００ｍｌのＲＰＭＩを、５０ｍｌのヒトＡＢ血清、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）、５ｍｌのＬ−グルタミン（１００×）および１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）と合わせて１０％ＡＢ培地を調製した。培地は１４日を超えない日数保存した。０．２ｍｌのチミジンストック（１ｍＣｉ／ｍｌ）を９．８ｍｌのＲＰＭＩで希釈して、１ｍＣｉの力価のチミジンを調製した。
可溶性ＶＩＳＴＡ抗体を１０％ＡＢ血清培地中で２０μｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌの適切な抗体溶液を９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ＃３５３０７７または同等物）の適切なウェルに加えた。種々の細胞集団を添加した後、最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
白血球の単離：ドナーは少なくとも１８歳で、概ね健康であり、地域個体群から無作為に選択した。単離チューブから５０ｍｌコニカルチューブにドナーの血液を移した。２５ｍｌの血液当たり１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ １０７７を、血液と混合しないように注意して下層に位置させた。室温で、細胞を１２５０Ｇで２５分間中断せずに遠心分離した。Ｆｉｃｏｌｌと血清の界面で白血球を単離し、４０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に加えて希釈した。細胞を、４℃で１０分間、４５３Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離した。細胞を５０ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁させ、５００μｌの別のチューブに移して計数した。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）９６ウェルプレートの設定：分析する試料の数に基づいて、アッセイに必要な「刺激細胞」および「応答細胞」の適切な数を決定した。９６ウェルＵ底プレートに、刺激個体群は０．５×１０5細胞／ウェルで播種し、応答個体群は１．０×１０5細胞／ウェルで播種する。全ての条件は３回実施しなければならない。適切な数の「刺激細胞」を新しいコニカルチューブにピペッティングし、前述のように遠心分離した。細胞を１０ｍｌに再懸濁し、４０００ｒａｄで照射した。細胞を前述のように遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地に１×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁させ、５０μｌを適切なウェルに加えた。必要な数の応答細胞を単離し、前述のように遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地に２×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁させ、５０μｌを適切なウェルに加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で５日間インキュベートした。５日目に、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ産生の分析のために、３０μｌの上清を除去した。５日目に、４０μＣｉ／ｍｌの力価のチミジン溶液２５μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2で８時間インキュベートした。製造業者の使用説明書により、細胞を９６ウェルマイクロシンチレーションプレートに移した。製造業者に使用説明書により、マイクロシンチレーション計数器を使用して計数した。ＩＦＮ−γ濃度を、製造業者のプロトコルを使用して、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号８８−７３１６−８８）により測定した。
データ解析：未処理のウェルについて、１分当たりの平均カウント数（ＣＰＭ）またはＩＦＮ−γ濃度を計算した。各試験群の平均ＣＰＭまたはＩＦＮ−γを計算した。データセットをＬｏｇ10変換した。それぞれの化合物について、１２ＭＬＲ倍のスコアを使用して、それぞれの化合物の１２試験群のセットについての平均を計算した。１２試験の平均スコア＝Σ［（ｌｏｇ10（試験化合物についての３回の平均ＣＰＭ））−（ｌｏｇ10（未処理についての３回の平均ＣＰＭ））］／１２
許容基準：アッセイを行う前に、全ての試験試薬および適切な対照をエンドトキシンについて試験し、それらは＜０．１ＥＵ／ｍｇのレベルを有した。応答細胞は単独では、平均で７００ＣＰＭ未満のＣＰＭカウントを有し、単独でインキュベートしたときに、細胞が休眠状態にあったことが示された。ＭＬＲ群についてのＣＰＭは、単独でインキュベートした応答細胞のＣＰＭよりも少なくとも２倍高く、反応が起こったことおよびドナーがミスマッチであったことが示された。全てのＭＬＲアッセイは、ヒトＩｇＧ１陰性対照タンパク質を含んだ。ヒトＩｇＧ１陰性対照の結果は、スチューデントｔ検定の使用に基づいて、未処理試料とは統計的に異ならなかった。
ＭＬＲにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体のスクリーニング：全ての化合物の最初のスクリーニング。抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いたＭＬＲを行う前に、抗体が、ＦＡＣＳ分析により細胞結合ＶＩＳＴＡに、またＥＬＩＳＡによりＶＩＳＴＡタンパク質に共に結合することを確認した。抗体Ｓ２６（ＶＳＴＢ７７）、Ｓ３０（ＶＳＴＢ８６）、Ｓ３１（ＶＳＴＢ８８）、Ｓ３２（ＶＳＴＢ９０）およびＳ３９（ＶＳＴＢ７４）は、この最初のスクリーニングに失敗したが、アッセイにおいて依然試験中である。最初のスクリーニングの目的で、全ての抗体を、増殖を伴うＭＬＲ中１０μｇ／ｍｌで試験し、ＩＦＮ−γが測定されたパラメータであった（図２１Ａ〜２１Ｄおよび２２Ａ〜２２Ｂ）。
６個の誘導抗体の選択。最初のスクリーニングから、さらなる分析のために６個の候補：ＶＳＴＢ１１２（Ｓ２）、ＶＳＴＢ１１６（Ｓ５）、ＶＳＴＢ９５（Ｓ１６）、ＶＳＴＢ５０（Ｓ４１）、ＶＳＴＢ５３（Ｓ４３）およびＶＳＴＢ６０（Ｓ４７）を選択した。
ＭＬＲにおける上位６個の候補の希釈試験：プロトコルの調整。プロトコルは前述のものと同じであり、抗体が以下の濃度に希釈されるように調整した：３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１および０μｇ／ｍｌ。
ＩＣ50値の決定：元のＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度を使用して、各抗体のＩＣ50を決定した。ＩＣ50の計算は、プログラム「ＥＺ−Ｒ ｓｔａｔｓ」を使用して決定した。６個の個々の応答体を使用してＩＣ50値を決定した。誘導候補の用量力価を有するＭＬＲにおける個々のＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度。
Figure 2019509993
結論：最初のスクリーニングは、複数のＶＩＳＴＡ特異的抗体がＭＬＲ細胞性免疫応答を高め得ることを示した。次いで、有効性および変動に基づいて抗体をランク付けし、これらの結果に基づいて、ＶＳＴＢ１１２、ＶＳＴＢ１１６、ＶＳＴＢ９５、ＶＳＴＢ５０、ＶＳＴＢ５３およびＶＳＴＢ６０を選択して、用量−力価実験で評価した。ＶＳＴＢ６０は、用量−力価実験において、他の５種の抗体よりも弱い応答を誘発した。
ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）活性化アッセイ：ＳＥＢは、特異的なＶβ＋Ｔ細胞の活性化を誘発する細菌性の超抗原である。末梢血単核細胞を単離して、培養下でＳＥＢ抗原とインキュベートすると、強いサイトカイン産生が誘発される。このアッセイは、５個の誘導候補に対して行った。
１０％ＡＢ培地の調製、１ｍＣｉ力価チミジンの調製、可溶性ＶＩＳＴＡ抗体の調製、および白血球細胞の単離は全てＭＬＲにおいて上述の通りに行った。
ＳＥＢ９６ウェルプレートの設定：分析する試料の数に基づいて、アッセイに必要な応答細胞の適切な数を決定した。９６ウェルＵ底プレートに２．０×１０5細胞／ウェルで応答個体群を播種する。全ての条件は３回行わなければならない。前述のように細胞を遠心分離し、１０％ＡＢ血清培地に４×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁し、５０μｌを適切なウェルに加えた。４０ｎｇ／ｍｌの濃度でＳＥＢ抗原を含有する１０％ＡＢ血清培地５０μｌを添加した。記載の実験において、ＳＥＢは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手した（カタログ番号Ｓ０８１２）。ウェル中の最終濃度は１０ｎｇ／ｍｌであった。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。３日目に、ＩＦＮ−γ産生の分析のために、３０μｌの上清を除去した。１ｍＣｉ／ｍｌ力価のチミジン溶液２５μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ2で８時間インキュベートした。製造業者の使用説明書により、細胞を９６ウェルマイクロシンチレーションプレーに移した。マイクロシンチレーション計測器を使用して、製造業者の使用説明書により計測を行った。ＩＦＮ−γ濃度を、製造業者のプロトコルを使用して、ＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号８８−７３１６−８８）により測定した。
プロトコル：データ解析。それぞれの抗体について、全ての濃度で、１分当たりの平均カウント数（ＣＰＭ）またはＩＦＮ−γ濃度を計算した。許容基準を前述のように行った。記載のようにＩＣ50値を決定した。誘導候補の用量力価を有するＳＥＢアッセイにおける個々のＣＰＭ数およびＩＦＮ−γ濃度。
Figure 2019509993
結論：ＳＥＢアッセイにおいて、ＶＩＳＴＡ特異的抗体は、用量依存的にサイトカイン産生および増殖を高めた。ＳＥＢ試験によるＩＣ50値は一般に、ＭＬＲ希釈試験の結果に類似していた。
実施例１０：エピトープビニングアッセイ
方法：ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６系（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、エピトープビニングを行った。アミンカップリング化学（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７６−２４１０）についての製造業者の使用説明書を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１７６−５０１１）を２組の６個のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）でコーティングした。
過剰（２５０ｎＭ終濃度）な競合ｍＡｂを、ヒトＶＩＳＴＡ（終濃度２５ｎＭ）と、室温で４時間予備インキュベートして、コーティングｍＡｂのパネルでコーティングしたチップ上で同時に６個を、４分の結合時間で走らせ、５分間解離させた。それぞれの施行の後、１００ｍＭリン酸でチップを再生させた。
データ分析は、リガンドによる全てのセンサーグラムのグループ分け、およびＸおよびＹ軸整列および人為的影響の除去を自動で行う整列ウィザードの適用を含んだ。次いで、データにスポット間補正を適用した。
非競合性ｍＡｂは、Ａ１シグナル（ヒトＶＩＳＴＡのみに結合）と同じかまたはそれより大きい結合シグナルを有するものと定義した。
競合性ｍＡｂは、Ａ１シグナル（すなわち、ヒトＶＩＳＴＡのみに結合）よりはるかに小さい結合シグナルを有するものと定義した。
結果：図２３に示される例示センサーグラムにおいて、ＶＳＴＢ８５抗体をＰｒｏｔｅｏｎ ＳＰＲチップにコーティングし、指定の競合剤を用いて予備インキュベートしたＶＩＳＴＡタンパク質を、チップ上に走らせた。ＶＩＳＴＡ／ＶＳＴＢ５０複合体を走らせた場合に陽性の応答が見られたので、ＶＳＴＢ５０は非競合性抗体の例である。ＶＩＳＴＡと複合化したＧＧ８、ＶＳＴＢ４９およびＶＳＴＢ５１は、チップ上にコーティングされたＶＳＴＢ８５に結合せず、そのためＶＩＳＴＡ上のＶＳＴＢ８５と同じ結合部位に対して競合すると分類された。
Figure 2019509993
Figure 2019509993
実施例１１：ＰＲＯＴＥＯＮアフィニティ決定
抗ＩｇＧ Ｆｃコーティング表面を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎチップ上で抗体を捕捉した。０．３９ｎＭ〜１００ｎＭの範囲のＶＩＳＴＡタンパク質の濃度でのヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合について、抗体を試験した。抗原を、抗体コーティングチップに４分間結合させ、その後、解離を３０分間モニタリングした。１００ｍＭリン酸による１８秒間の２回の処理でチップを再生させた。全ての実験を２５℃で行い、データを１：１ラングミュア結合モデルに適合させた。
実施例１２：ＭＢ４９マウス膀胱腫瘍モデルにおける抗ＶＩＳＴＡ処理の効果
方法：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＭＢ４９腫瘍細胞を注入した。腫瘍が確立されたところで、抗ＶＩＳＴＡ処理を開始した。その後、腫瘍増殖を１週間に３回モニタリングした。腫瘍が任意の寸法で１５ｍｍに達したところでＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。
それぞれの実験で、ＭＢ４９細胞の凍結バイアルを解凍し、１０％血清およびペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質を加えたＲＰＭＩ １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ）中で増殖させた。培養の３日後、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を回収し、５×１０6細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩに再懸濁してマウス１匹当たり５０μｌを注入した。
６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをアメリカ国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から購入した。到着した際に、マウスを１日間順化させ、その後、右脇腹の毛を剃り、尾に入れ墨をした。次いで、３〜５日後にマウスに注入した。
腫瘍注入（皮内）：マウスの毛を剃った脇腹に、５０μｌのＭＢ４９細胞懸濁物（約２５０，０００細胞）を皮内（ｉ．ｄ．）注入した。
腫瘍増殖のモニタリング：最初に広い寸法（Ｌ）、次いで最初の測定に対して９０°の角度（Ｗ）を横切る電気毛細管を使用して、腫瘍の増殖を測定した。腫瘍体積を次のようにして得た：
体積＝（Ｌ2 *Ｗ2）／２
腫瘍の直径が約５ｍｍ（体積約６０ｍｍ3）に達したところで、腫瘍が確立されたとみなした。確立されたところで、治療を開始した。治療の間、実験が終了するまで、１週間に３回、腫瘍の増殖を測定した。
抗ＶＩＳＴＡ治療：キメラ化１３Ｆ３−ｍＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。注射スケジュールは、４週間にわたり毎週３回とした。
マウスの安楽死：ＩＡＣＵＣ要件に従い、腫瘍が最も長い寸法で１５ｍｍに達した際に動物を安楽死させた。
有効性の分析：データ管理のためにエクセル、およびグラフ化のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してマウス腫瘍体積を分析した。Ｒ統計学的コンピューターソフトウェアについてマクロを使用して統計学的分析を行った。
実験計画を図２４に示す。
結果：
雌マウスにおけるＣｈ１３Ｆ３−ｍＩｇＧ２ａ治療により、７０％の動物で完全な腫瘍拒絶（ＣＲ）に至り、３０％（ｎ＝７）で部分寛解（ＰＲ）に至った（表１３および図２５Ｂ）。対照的に、全ての対照ｍＩｇＧ２ａ処理マウスは、腫瘍の進行性増殖を示した（６／６）（図２５Ａ）。これらのデータは、抗ＶＩＳＴＡ処理が腫瘍増殖に大きな効果を有し得ることを示している。
Figure 2019509993
ヒトＶＩＳＴＡ配列を図２６および２７に示す（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１、上記、による。この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
実施例１３：水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換試験を使用した抗ＶＩＳＴＡ抗体のエピトープマッピング
ヒトＶＩＳＴＡ上のＶＳＴＢ５０、６０、９５および１１２についてのエピトープを同定するために、対応するＦａｂを使用して、溶液水素／重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）を行った。Ｈ／Ｄ交換について、Ｆａｂ摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を分析するために使用した手順は、いくつかの変更を有して前述のもの（Ｈａｍｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：１７１−１８２，２００３；Ｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５：８４８８−８４９８，２００６）と同様であった。Ｐｉｅｒｃｅ Ｆａｂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４９８５）を使用して、パパイン消化およびプロテインＡ捕捉によりＩｇＧからＦａｂを調製した。ヒトＶＩＳＴＡタンパク質配列は、６個のＮ結合グリコシル化部位を含む。配列カバー率を向上させるために、ＰＮＧａｓｅ Ｆによりタンパク質を脱グリコシル化した。脱グリコシル化ＶＩＳＴＡタンパク質を、重水素化水溶液中で所定時間インキュベートして、交換可能水素原子に重水素取り込みを生じた。重水素化ＶＩＳＴＡタンパク質を、４℃で３０秒、２分、１０分および６０分の間、４６μＬの酸化重水素（Ｄ2Ｏ）中で、ＶＳＴＢ５０、ＶＳＴＢ６０、ＶＳＴＢ９５またはＶＳＴＢ１１２のＦａｂと複合体化した。低ｐＨにより交換反応を停止させ、ペプシンでタンパク質を消化した。同定されたペプチドでの重水素レベルを、ＬＣ−ＭＳの質量シフトからモニタリングした。参照対照として、Ｆａｂ分子と複合体化しないこと以外は、ＶＩＳＴＡタンパク質を同様に処理した。Ｆａｂに結合した領域は、交換から比較的保護され、そのため参照ＶＩＳＴＡタンパク質よりも多くの重水素の画分を含む部位であると推測された。タンパク質の約９４％を、特定のペプチドにマッピングし得た。
ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ５０／ＶＳＴＢ６０、およびＶＳＴＢ９５／ＶＳＴＢ１１２の溶液ＨＤＸ−ＭＳ摂動マップを図２８の上および下にそれぞれ示す。２つのエピトープ群を同定した。抗ＶＩＳＴＡ ＶＳＴＢ５０はＶＳＴＢ６０と同じエピトープを認識し、ＶＳＴＢ９５は、ＶＩＳＴＡ上でＶＳＴＢ１１２とは別のエピトープに結合する。抗ＶＩＳＴＡ ＶＳＴＢ５０および６０は、断片103ＮＬＴＬＬＤＳＧＬ111（配列番号６２）および136ＶＱＴＧＫＤＡＰＳＮＣ146（配列番号６３）を含む同じエピトープを共有する（図２８、上）。抗ＶＩＳＴＡ ＶＳＴＢ９５および１１２は、断片27ＰＶＤＫＧＨＤＶＴＦ36（配列番号７５）および54ＲＲＰＩＲＤＬＴＦＱＤＬ65（配列番号：６５）を含む同様のエピトープを標的すると思われる（図２８、下）。残基３９〜５２および１１８〜１３４を含むＶＳＴＢ９５および１１２による弱い摂動を示す２つの他の断片がある。しかしながら、減少のレベルは、差動マップにおける以前の領域（２７〜３６および５４〜６５）ほど強くはない。ＶＳＴＢ９５および１１２による強い摂動を示す１つのペプチド100ＴＭＲ102がＶＩＳＴＡ表面の他の面に位置するが、これはエピトープ領域２７〜３６および５４〜６５とは離れている。この摂動はアロステリック効果のためであり得る。これらのＨＤＸ−ＭＳの結果は、抗ＶＩＳＴＡ抗体についてのペプチドレベルでのエピトープを提供する。これら２つのエピトープ群についてエピトープ領域の重複はなかった。これらの結果は、互いに競合しない以前の競合ビニングデータと一致する。
実施例１４：タンパク質結晶学によるヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１１２ ＦＡＢ複合体の構造決定
ＶＩＳＴＡ構造を決定して、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と誘導抗体ＶＳＴＢ１１２のＦａｂフラグメントの間の相互作用を規定するエピトープおよびパラトープを示す努力において、複合体を結晶化し、１．８５Åの解像度まで構造を決定した。抗体ＶＳＴＢ１１２のＦａｂフラグメントと複合体化したヒトＶＩＳＴＡのＥＣＤの構造は、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ自身の構造の決定と、この相互作用のためのエピトープ／パラトープの規定に共に努力する中で決定された。この構造は、ＶＩＳＴＡが、ＩｇＶ折りたたみにＴＣＲ Ｖα鎖と同様の鎖トポロジーを適用することを明らかにする。βサンドイッチの背面および前面のＢ鎖とＦ鎖を架橋する標準的なジスルフィド結合に加えて、該構造により、ＥＣＤが、２つのさらなるジスルフィド結合を有し、その１つがＣＣ’ループを前面シートにつなぎ、第２のものがＡ’鎖とＧ’鎖の間にあることが明らかになる。ＶＩＳＴＡ分子間に結晶接触が存在するが、それらは小さなものであり、この構造に基づくＶＩＳＴＡ ＥＣＤの二量体についての証明はない。ＶＳＴＢ１１２エピトープは、ＶＩＳＴＡ ＢＣ、ＣＣ’およびＦＧループと最も近い前面ベータシート（Ｃ’ＣＦＧ）の残基と共に、これらのループの一部を含むことが示される。パラトープは、接触を最小にするＣＤＲ Ｌ３との重鎖相互作用に対して大きく偏る。
ＶＩＳＴＡ：ＶＳＴＢ１１２相互作用を規定するエピトープ／パラトープ
ＶＳＴＢ１１２ Ｆａｂは、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤへの結合の際に１０２４．３Å２の表面積が埋まり、重鎖表面の埋没はこの合計の７１５．３Å２となる。ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ１１２軽鎖の間に７個の水素結合および４個の塩の架橋相互作用が形成され、ＶＩＳＴＡとＶＳＴＢ１１２重鎖の間に１０個の水素と２個の塩の架橋相互作用が形成される。ＶＳＴＢ１１２は、ＦＧループの近位の末端で前面シート鎖Ｃ’、Ｃ、ＦおよびＧ中の残基、ならびにＢＣ、ＦＧおよびＣＣ’ループ中の残基を認識する（図２９および３０）。ＣＣ’ループとの相互作用は、さらなる軽鎖相互作用を作製するＦＧループ中の残基Ｅ１２５およびＲ１２７のみを有するＦａｂ軽鎖との接触のほとんどの原因となる。ＶＩＳＴＡ ＦＧループに対応する残基１１９〜１２７は、ＶＳＴＢ１１２との結合時に埋まる合計１０３４．８Å２の表面積の３８％になる。特に、このループは極性が高く、次の配列−ＩＲＨＨＨＳＥＨＲ−（配列番号７６）から構成される。さらに、ＶＳＴＢ１１２ ＣＤＲ Ｈ３中のＷ１０３は、ＶＩＳＴＡの主鎖の残基Ｈ１２２およびＨ１２３を正確に包み、ＶＩＳＴＡ Ｈ１２１は、ＣＤＲ Ｈ２中のＦ５５の芳香族環との相互作用の端を形成する。
結晶学およびＨＤＸにより同定されたエピトープ領域の比較を図３１に示す。
実施例１５：抗ＶＩＳＴＡ抗体によるＴ細胞および単球の活性化
抗ＶＩＳＴＡ抗体の機能的効果を２つのインビトロアッセイ、混合白血球反応（ＭＬＲ）およびＳＥＢ（スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ）で評価した。両アッセイは、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン誘導を一次読み出しとして測定するが、これらの効果は異なるメカニズムによる。ＭＬＲにおいて、異なる２人のヒトドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を一緒にインキュベートし、１人のドナーのＴ細胞と他方のドナーの樹状細胞間の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の不適合は、Ｔ細胞の増殖およびインターフェロン（ＩＦＮγ）産生をもたらす。ＳＥＢアッセイでは、単一ドナーからのＰＢＭＣを細菌性超抗原と共にインキュベートする。これは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面のＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩタンパク質をＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に直接結合させ、Ｔ細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン分泌を引き起こす。両アッセイにおいて、ＶＳＴＢ１７４の親分子であるＶＳＴＢ１１２は、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生の用量依存的誘導を示し、候補の中で最も強力であった（図２１Ａ〜２１Ｄ、表１２）。
Figure 2019509993
単球活性化アッセイ
表１２に示したアッセイデータは、ＶＳＴＢ１７４の親分子であるＶＳＴＢ１１２で生成された。ＶＳＴＢ１７４の活性をより理解するために、単球活性化アッセイを行った。結果は、全ＰＢＭＣと共にＶＳＴＢ１７４をインキュベートすると、ＣＤ１４＋単球上の活性化マーカー（ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御を誘導し、ＶＩＳＴＡを高レベルで発現すると知られている免疫細胞サブセットに結合する抗体の効果を示すことを示した（図３２）。他の問題は、全ＰＢＭＣにおける単球活性化に対する作用が、ＶＩＳＴＡに結合し、ＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体によって促進されるか否かである。抗体ＶＳＴＢ１０３およびＶＳＴＢ６３は、ＶＳＴＢ１１２およびＶＳＴＢ１１１と同様、ＶＩＳＴＡに高アフィニティ（それぞれ、ＫＤ６．３６Ｅ−１０および８．３０Ｅ−１０）で結合し、かつＶＩＳＴＡタンパク質を発現する細胞に結合する。ＶＳＴＢ１０３はＶＳＴＢ１１２と同じエピトープ・ビンにあり、一方、ＶＳＴＢ６３は異なるエピトープ・ビンにあり、抗体はいずれも単球活性化を促進しない。総合すると、これらの結果は、ＶＳＴＢ１７４がＴ細胞活性化／増殖に影響を及ぼし得るメカニズムの１つは、ＮＫ細胞によって促進される単球活性化によるものであることを示している。
培地の調製
５００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０−０４０−ＣＶ）を５０ｍｌのヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ、ロット番号３Ｃ０４０５）、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１７−６０２Ｅ）１０，０００Ｕ／ｍｌ、５ｍｌのＬ−グルタミンｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−０８１）および１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｆｉｓｈｅｒ ＢＰ２９９−１００、ロット番号−１）と混合した。培地を４℃で、１４日を超えない日数保存した。
可溶性ＶＩＳＴＡおよび対照抗体の調製
抗体を１０％ＡＢ血清で２×所望の濃度に希釈した：ＶＳＴＢ１７４：ｌｏｔ ＶＳＴＢ１７４．００３
９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７７）の適切なウェルに１００μｌの適切な抗体溶液を加えた。種々の細胞集団を１００μｌに加え、各抗体の最終濃度を１、０．１または０．０１ｇ／ｍｌとした。ＩｇＧ１対照抗体ＣＮＴＯ ３９３０（Ｌｏｔ ６４０５、ＥＮＤＯ＜０．１ＥＵ／ｍｇ）を最終濃度１μｇ／ｍｌで加えた。
ＰＢＭＣを単離した。
ドナーは、少なくとも１８歳で、概ね健康であり、地域個体群から無作為に選択した。
ドナーの血液を、単離チューブから５０ｍｌコニカルチューブに移した。
１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ １０７７（ＳＩＧＭＡ、１０７７１）を、血液と混合しないように注意しながら、下層に位置させた。これは血液２５ｍｌ当たりであった。
室温で、細胞を１２５０Ｇで２５分間中断せずに遠心分離した。
Ｆｉｃｏｌｌと血清の界面で白血球を単離し、４０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に加えて希釈した。
細胞を４℃で１０分間、４５３Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離した。
細胞を５０ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、個別のエッペンドルフチューブに５００ｌを移すことによってカウントした。
さらに、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ製のＰａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ単離キットを製造会社の使用説明書（カタログ番号１３０−０９６−５３７）どおりに使用して、いくつかの処理群における陰性選択によってＣＤ１４＋細胞を単離した。
インビトロ培養手順
分析する試料の数に基づいて、アッセイに必要な細胞の適切な数を決定した。９６ウェルＵ底プレートに２．０×１０5細胞／ウェルで応答個体群を播種した。ＣＤ１４負の選択個体群は、０．５×１０5個の細胞を播種した。全ての条件を３回行った。
細胞を上記のように遠心分離し、全ＰＢＭＣ個体群では、１０％ＡＢ血清培地中に、２×１０6／ｍｌの濃度に、ＣＤ１４負の選択個体群では、０．５×１０6／ｍｌの濃度に再懸濁し、試験抗体１００ｌを適切なウェルに加え、各ウェルの全体積を２００ｌとした。
細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、１、２、または３日間インキュベートした。
抗体染色およびフローサイトメトリー
９６ウェルＵ底プレートを４５３Ｇで５分間遠心分離機にかけ、上清を除去した。
細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、工程５．５．１．と同様にして遠心分離機にかけた。
上清を捨て、以下の抗体を含有する５０μｌのＰＢＳに再懸濁した：
・ＣＤ１４−ＡＰＣ（クローン ＨＣＤ１４）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号３２５６０８）
・ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ Ｃｙ７（クローン Ｌ２４３）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号３０７６１６）
・ＣＤ８０−ＰＥ（クローン ２Ｄ１０）１：２５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号３０５２０８）
・Ｈｕ ＦｃＲ結合阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号１４−９１６１−７３）
暗所の濡れた氷上で２０分間インキュベートした。
１５０μｌのＰＢＳを加え、工程５．５．１．と同様にして遠心分離機にかけた。
１５０ｌのＰＢＳ緩衝液を添加し、ＦＡＣＳにより分析した。
試料をＭｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０−パラメータ フローサイトメーターにかけ、ＦｌｏｗＪｏ９．７．５を用いて、ＣＤ１４＋個体群上のＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８０の発現を分析した。幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）、一連の数の中央傾向を決める統計値を、処理を比較する定義統計として使用した。
統計解析
全ての統計をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ，ｖｅｒｓｉｏｎ６で行った。多重性に対するテューキーの補正を含むＯｎｅ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して、各タイムポイントで、グループ間の一対比較を行った。全ての検定および比較で、０．０５未満のＰ値は、有意であると見なした。全てのグラフおよび表で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
実施例１６：抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ活性
ＶＳＴＢ１７４はＩｇＧ１ Ｆｃを有し、それは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性を与え得る。両タイプのアッセイを行い、ＶＳＴＢ１７４は、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞を溶解または貪食する（図３３〜３４）が、Ｋ５６２骨髄腫細胞株親細胞はしないことがわかった（データは示さず）。ＶＩＳＴＡの阻害作用を調節するＶＳＴＢ１７４の作用のさらなるメカニズムは、ＶＩＳＴＡを高レベルで発現する細胞の溶解または呑食であり、したがって、局所微少環境からそれらを除去する。
実施例１７：さらなる抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＰ活性
抗ヒトＶＩＳＴＡ ｍＡｂ（ＶＳＴＢ１７３およびＶＳＴＢ１７４）によりＶＩＡＴＡを異所的に発現する細胞のマクロファージ媒介食作用増強の研究に、インビトロ食作用アッセイを使用した。これらのｍＡｂを異なるＦｃ骨格（ＩｇＧ１ ＷＴ（野生型）、ＩｇＧ１ ＰＲ（プロテアーゼ耐性）およびＩｇＧ２σ）にクローニングし、食作用の増強に関し異なる活性を持つ可能性があると仮定した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ１ ＰＲ骨格は、Ｆｃ受容体に結合することができ、ＡＤＣＰを引き起こす可能性があるが、ＩｇＧ２σは、Ｆｃ受容体に結合せず、ＡＤＣＰを媒介しない。
ＡＤＣＰアッセイにおいて、Ｋ５６２親細胞およびＫ５６２−ＶＩＳＴＡ標的細胞を用いて抗ＶＩＳＴＡ抗体を試験した。図３５〜３６に示すように、ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９、ＶＳＴＢ１７３およびＶＳＴＢ１４５は、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞のｈＭａｃ食作用を増強した。Ｆｃ受容体に結合しなかったＩｇＧ２σ Ｆｃを有するＶＩＳＴＡ抗体、ＶＳＴＢ１４０またはＶＳＴＢ１３２、予想どおり食作用を増強しなかった。ＩｇＧ１ Ｆｃを有するＶＩＳＴＡ ｍＡｂ、ＶＳＴＢ１７４およびＶＳＴＢ１７３は、ＩｇＧ１ＰＲ Ｆｃを有するＶＳＴＢ１４９およびＶＳＴＢ１４５より、より強い食作用を示した（ＥＣ50値を示す表１３および１４を参照）。
Figure 2019509993
Figure 2019509993
ＶＳＴＢ１７４およびＶＳＴＢ１７３は、最大濃度でもＫ５６２親細胞の食作用に対する増強は弱く（図３５〜３６）、これはＫ５６２細胞によるＶＩＳＴＡの発現が低いためであり得る。他の抗ＶＩＳＴＡ抗体はＫ５６２細胞の食作用を増強しなかった。
Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ食作用アッセイにおいて、陰性対照抗体をそれぞれ２種類の濃度で試験したが、食作用は全く誘導されなかった。この結果は、抗ＶＩＳＴＡ抗体によって媒介される食作用が特異的で、Ｋ５６２−ＶＩＳＴＡ細胞によるＶＩＳＴＡ抗原の発現によるものであることを示している。
実施例１８：さらなる抗ＶＩＳＴＡ抗体のＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣを誘導するそれらの能力を試験するために、以下の３種のヒト抗ＶＩＳＴＡ抗体を試験した：
ＶＳＴＢ１７４（ＩｇＧ１）
ＶＳＴＢ１４９（ＩｇＧ１ ＰＲ）
ＶＳＴＢ１７４．ＬＦ（ＩｇＧ１ ＬＦ（低フコース））。
各抗体について、同じプレートで、６種の異なる濃度を、２回の個別の実験で、全６個のデータポインドで各３回試験した。
ＶＳＴＢ１７４、ＶＳＴＢ１４９、およびＶＳＴＢ１７４．ＬＦはそれぞれ１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬで、測定可能なＡＤＣＣ活性を示したが、０．００１μｇ／ｍＬでは、ＬＦ抗体のみが測定可能なＡＤＣＣ活性を示し、０．０００１μｇ／ｍＬでは抗体はいずれもＡＤＣＣを示さなかった。これらの各抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ１変異Ｆｃを有しており、この結果が予想される。ＬＦ抗体曲線のＥＣ50値（０．００２２９３μｇ／ｍＬ）が標準のＩｇＧ１抗体曲線（０．０２３８１μｇ／ｍＬ）に比べて小さいことから明らかなように、ＬＦ抗体は、ＡＤＣＣ効力の増大を示した。ＩｇＧ１ ＰＲ抗体曲線は、標準のＩｇＧ１曲線（０．０１８４６μｇ／ｍＬ）に類似したＥＣ50値を有した。
Figure 2019509993
ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１ ＰＲおよびヒトＩｇＧ１ ＬＦ抗体は全て、１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬ抗体濃度で、測定可能なＡＤＣＣ媒介性傷害を示したが、ＬＦ抗体のみが０．００１μｇ／ｍＬ抗体濃度で傷害を示した。０．０００１μｇ／ｍＬ抗体濃度では、抗ＶＩＳＴＡ抗体はいずれも傷害を示さなかった。
ＥＣ５０値から明らかなように、ＬＦ抗体は、標準のＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ１ ＰＲ抗体の約１０倍を超えるＡＤＣＣ傷害効果を示した。
実施例１９：ＶＳＴＢ１７４のヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡに対するアフィニティ
ヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するＶＳＴＢ１７４のアフィニティを、ＰｒｏｔｅＯｎ装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した。ＶＳＴＢ１７４は各タンパク質に対して非常に類似したＫＤ値を示した（ヒトＶＩＳＴＡ ＥＣＤで１．５６Ｅ−１０ＭおよびカニクイザルＶＩＳＴＡで８．６６Ｅ−１１Ｍ）。
実施例２０：マウス腫瘍モデルにおいて、ＶＩＳＴＡ抗体は有効性を示す
マウス種、試薬および腫瘍モデル
インビボ試験では、Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドと戻し交配したヒトＶＩＳＴＡノックイン（ＶＩＳＴＡ−ＫＩ）マウスを使用した。
抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体を作製して、マウスＦｃ ＩｇＧ２ａに移植したＶＳＴＢ１７４可変領域（ＶＳＴＢ１２３）を使用したＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおける試験が可能になった。
ＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおいて、ＭＢ４９膀胱癌を評価した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体療法が野生型マウスにおいて腫瘍増殖を抑制することを示す公開された試験（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）に加えて、異なる投与スケジュールを使用したｗｔマウス、およびＶＳＴＢ１２３で治療したＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおいて、代理ハムスター抗体による抗腫瘍の有効性が示された。
ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスのＭＢ４９腫瘍モデルにおけるインビボ有効性試験
雌ＶＩＳＴＡ−ＫＩマウスにおいてＭＢ４９有効性試験を行い、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲のいくつかの用量でＶＳＴＢ１２３を試験した。０日目に、マウスに２５０，０００個のＭＢ４９腫瘍細胞を皮内注入した。６日目に、図３７に示すように投与を開始した（１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ｍＩｇＧ２ａ、または示した用量のＶＳＴＢ１２３；１０匹のマウス／群）。
図３７に示すように、ＶＳＴＢ１２３は、低用量に対して高用量でより有効であった。１０ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇの用量は同等であったが、５または１ｍｇ／ｋｇで投与したマウスで腫瘍はより速く増殖した。
実施例２１：抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いたヒト腫瘍におけるＶＩＳＴＡ発現の検出
図１は、ＡＭＬ腫瘍細胞株によるＶＩＳＴＡ発現を示し、これと、図１７のＲＮＡ ｓｅｑ発現データは、ＡＭＬ細胞によりＶＩＳＴＡが発現されるという考え、および抗ＶＩＳＴＡ薬物が、免疫調節または抗体媒介性傷害に対し、これらの細胞を直接標的にすることにより効果的であるという考えを支持する。
肺癌においてＶＩＳＴＡ発現を評価するためのデータは、外科的切除による肺腫瘍試料から得た。細胞を解離させ、ＶＩＳＴＡおよび多くの他のマーカーの発現について特徴付けした。結果は、１３／１３肺腫瘍（扁平上皮癌または腺癌）がＣＤ１４＋ＶＩＳＴＡ＋骨髄細胞を含むことを示した（図３８）。
実施例２２：抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いた肺腫瘍におけるＶＩＳＴＡ発現の検出
クローンＧＧ８、抗ヒトＶＩＳＴＡマウスＩｇＧ１を使用して、免疫組織化学アッセイを最適化した。このｍＡｂを使用して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＦＦＰＥ腫瘍切片におけるＶＩＳＴＡの染色を調べた。
ＦＦＰＥ腫瘍切片を、標準的な抗原賦活化法により処理した後に染色した。ＧＧ８マウス抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体を１：５００希釈で使用した。ウサギ抗マウスポリクローナル抗体、その後、抗ウサギポリマーＨＲＰを使用して、ＧＧ８結合を検出した。続いて、ヘマトキシリンでの対比染色を行い、その後、腫瘍切片をスコアリングした。
肺癌におけるＶＩＳＴＡ発現は、免疫浸潤にほぼ限定され（図３９に示した例）、高レベルのＶＩＳＴＡ陽性細胞は、多くの肺癌試料に存在した。
実施例２３：ＶＳＴＢ１７４のＦＡＢフラグメントと複合体化されたヒトＶＩＳＴＡの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の構造
ＶＩＳＴＡ抗原変異体を作製して、結晶学のために精製した。組み換えｈｉｓタグ付加ＶＳＴＢ１７４ Ｆａｂを内部発現させて精製した。結晶を作製し、シンクロトロン照射を使用してＶＩＳＴＡ ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１７４ Ｆａｂ複合体についての高解像度データを集めるために使用し、相同性モデリングおよび電子密度分析を併用して、構造決定を解決した（図２９（上））。
ｘ線結晶学により、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤ：ＶＳＴＢ１７４ Ｆａｂ複合体の構造を、１．８５Åの解像度まで決定し、ＶＩＳＴＡ ＥＣＤの第１の構造を提供し、ＶＳＴＢ１７４エピトープおよびパラトープを示した。ＶＩＳＴＡ ＥＣＤは、ＩｇＶ折りたたみにＣＴＬＡ−４ＥＣＤと類似のトポロジーを採用するが、βサンドイッチの前面シートから伸長する特有のＧ’鎖を有する。Ａ’およびＧ’は、Ａ’鎖の残基Ｃ１２とＧ’鎖の残基Ｃ１４６の間に形成されるジスルフィド架橋を介してさらに化学的に接続される。３つの分子内ジスルフィド結合に繋がれる６個のシステインが見られたが、結晶接触に基づけば、二量体化ＶＩＳＴＡの証拠はない。
ＶＳＴＢ１７４は、ＦＧループの近位の末端で前面シート鎖Ｃ’、Ｃ、ＦおよびＧ中の残基、ならびにＢＣ、ＦＧおよびＣＣ’ループ内の残基を認識する。
実施例２４：抗ＶＩＳＴＡ抗体による単球活性化はＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）架橋を必要とする
本研究は、培養下、単球を活性化する抗ＶＩＳＴＡ抗体の能力を評価するために設計された。単球活性化を、単球活性化の標準マーカーの表面発現の上方制御によって評価した：ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１。ＶＳＴＢ１７４が活性なＦｃを有すると仮定して、抗ＶＩＳＴＡ媒介単球活性化におけるＣＤ１６および他のＦｃ受容体の役割を調べた。特に、ＶＳＴＢ１１２（ＨｕＩｇＧ１活性Ｆｃ）またはＶＳＴＢ１４０（ＩｇＧ２シグマサイレントＦｃ）を用いて単球活性化を誘発し、抗ＶＩＳＴＡ媒介単球活性化を遮断する抗ＣＤ１６、抗ＣＤ３２、および抗ＣＤ６４抗体の能力を調べた。可溶性Ｆｃフラグメントもまた、Ｆｃ結合を非特異的にブロックするために、同アッセイにおいて使用した。
ＰＢＭＣ（好中球を欠く）でのＣＤ１６発現は、通常、ＮＫ細胞および炎症性単球（ＣＤ１４＋／−、ＣＤ１６＋）に限定されている。抗ＶＩＳＴＡ誘導単球活性化におけるＮＫ細胞の役割を決定するために、ＮＫ細胞を枯渇させた。さらに、単球活性化が可能な活性化ＮＫ細胞の主要産物であるＩＦＮ−γをブロックして、その個々の寄与を評価した。
方法
培地の調製
全ての希釈および培養は、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ５６６７）および１％Ｐｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１５１４０−１２２）を含有するＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１１８７５−０９３）で行った。
遮断抗体
抗ＣＤ１６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号３０２０５０、クローン３Ｇ８）、抗ＣＤ３２（ＢＤ カタログ番号５５２９３０、クローンＦＬＩ８．２６）、および抗ＣＤ６４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ カタログ番号３０５０１６、クローン１０．１）を、示されるように、完全培地で２０μｇ／ｍｌに希釈した。インハウスブロック（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ ｂｌｏｃｋ）（ＩＨＢ）もまた完全培地で８ｍｇ／ｍＬに希釈した。
５０μｌのこれらのストックを、示された各活性化／ブロッキング条件について、９６ウェルプレート上に三連でプレートアウトした。抗体を含まない培地５０μＬを「非遮断対照」に使用した。
細胞調製
示された各ドナー当たり２バイアルの凍結ＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ ＰＢ００９Ｃ−１、１０×１０6細胞／バイアル）を３７℃の水浴で解凍し、完全培地で１０ｍＬに希釈し、１５００ＲＰＭで５分間遠心分離した。
希釈した凍結培地を含む培地を除去し、細胞を１０ｍＬの新鮮な培地で洗浄し、上記のように遠沈させた。この回転の前に、各試料について１０μＬの試料を保持した。
試料をトリパンブルーで１：２に希釈し、ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（カタログ番号Ｃ１０２２７）でカウントして、細胞数を決定した。細胞を完全培地に２×１０6細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。この細胞調製物１００μＬを全ての実験ウェルに添加した。細胞／遮断抗体混合物含有プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。
活性化
ＶＳＴＢ１１２、ＶＳＴＢ１４０、およびＨｕＩｇＧ１アイソタイプ対照（１１．７６ｍｇ／ｍＬ）を全て完全培地で２０μｇ／ｍＬに希釈した。インキュベーション工程の完了後、５０μＬの活性化抗体ストックを、細胞および遮断試薬を含む適切なウェルに添加した。遮断抗体および活性化抗体の最終濃度は５μｇ／ｍＬであった。ＩＨＢの最終濃度は２ｍｇ／ｍＬであった。細胞を３７℃で終夜（２０時間）インキュベートした。
分析
インキュベーション後、全ての実験プレートを１５００ＲＰＭで５分間回転させた。培地１５０μＬをピペッティングにより除去し、後の分析のために−８０℃で保存した。１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；カタログ番号５５４６５７）を各ウェルに添加し、ピペッティングにより混合し、試料を再び１５００ＲＰＭで５分間回転させた。細胞を、２ｍｇ／ｍＬのＩＨＢを含む５０ｕＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、暗所において４℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液で希釈した５０μＬの以下の染色混合物を、全ての試料に添加した（全ての抗体を１：２５に希釈した）：ＣＤ１４−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＨＣＤ１４）；ＣＤ８０−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＣＤ１０）；ＣＤ８６−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＩＴ２．２）；ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＬ２４３）；ＰＤ−Ｌ１−ＰｅＣｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン２９Ｅ２Ａ３）。試料を暗所において４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを１５００ＲＰＭで５分間回転させた。細胞を上記のように１Ｘで洗浄し、最終的にＡｑｕａ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｌ３４９５７）を含む２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に製造業者の使用説明書に従って再懸濁した。試料をＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭＩＩにかけ、ＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒ９．２で分析した。
結果
培養完了後、生存ＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１の発現を分析した（図４０、ＰＤ−Ｌ１発現を示す）。ＨｕＩｇＧ１アイソタイプ対照で処理したＰＢＭＣ培養物中の単球と比較して、ＶＳＴＢ１１２で処理した培養物中の単球は、これらのマーカー各々のレベルを増加させた。この増加のレベルは、ドナーによって変化した（データは示さず）。ＶＳＴＢ１４０で処理した培養物中の単球は、活性化マーカーのレベルの上昇を示さず、活性なＦｃ領域がその作用に必要であることを示した（図４０）。いくつかの場合において、さらに、培養物に競合結合インヒビターＦｃフラグメント（ＩＨＢ）を加えると、ＶＳＴＢ１１２媒介活性化を弱め、いくつかの場合には、そして完全に無効にした。これらの受容体を遮断する抗体はＶＳＴＢ１１２媒介単球活性化を遮断しなかったため、この作用はＣＤ３２またはＣＤ６４依存性ではなかった（データは示さず）。
ＰＢＭＣ（好中球を欠く）でのＣＤ１６発現は、通常、ＮＫ細胞および炎症性単球（ＣＤ１４＋／−、ＣＤ１６＋）に限定されている。予備データは、抗ＶＩＳＴＡ抗体による単球のインビトロでの活性化におけるＮＫ細胞の役割を同定した。ＮＫ細胞の枯渇またはＩＦＮγ受容体の遮断は、抗ＶＩＳＴＡ誘導単球活性化の程度を大きく減少させ、ＮＫ細胞およびＩＦＮγがいずれもインビトロでの抗ＶＩＳＴＡ媒介単球活性化に寄与することを示唆する（データは示さず）。
要約すると、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＰＤ−Ｌ１を単球活性化のマーカーとして用いて、ＶＳＴＢ１１２（抗体ＶＳＴＢ１７４の親分子）およびそのサイレントＦｃ誘導体、ＶＳＴＢ１４０のＰＢＭＣ培養における単球活性化能を、非特異的ヒトＩｇＧ１対照抗体（ＣＮＴＯ ３９３０）と比較した。全てのパラメータにより、単球はＶＳＴＢ１１２により活性化され、ＶＳＴＢ１４０によっては活性化されなかった。ＶＳＴＢ１４０が活性化できず、可溶性ＦｃフラグメントがＶＳＴＢ１１２の活性化能力を部分的に消失させる能力を有することから、この活性はＦｃ依存性であると思われる（図４０、ＰＤ−Ｌ１を単球活性化のマーカーとして示す）。さらに、この活性化は、これらの培養物中のＮＫ細胞の存在、およびＩＦＮ−γの抗体誘導産生に依存した。というのも、インビトロ培養系からのこれらの成分のいずれかを除去すると単球活性化が顕著に弱められた（データは示さず）。本明細書に示すように、活性化のメカニズムは、ＶＩＳＴＡ結合抗体の非存在下でさえ、ＣＤ１６を架橋する抗体の付加によって完全かつ確実に模倣され得るので、Ｆｃ受容体ＣＤ１６の架橋に依存すると思われる。
実施例２５：抗ＶＩＳＴＡ抗体による腫瘍増殖阻害にはエフェクター機能が必要である
Ｔ細胞の負の調節因子であるＶＩＳＴＡは多くの造血細胞で発現し、腫瘍微小環境において高度に発現する（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７４（７）：１９３３−４４，２０１４）。腫瘍を有するマウスを抗マウスＶＩＳＴＡ抗体によりインビボで処理すると、腫瘍増殖が大きく抑制される（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．）。
この研究は、雄または雌のｈＶＩＳＴＡ ＫＩ（ノックイン）マウスにおける確立したＭＢ４９腫瘍の増殖に対する抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体ＶＳＴＢ１２３およびＶＳＴＢ１２４の効果を調べるために実施した。これらのマウスは、マウスＶＩＳＴＡ遺伝子の代わりにノックインされたヒトＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡを有し、ＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方でヒトＶＩＳＴＡのみを発現する。ＭＢ４９腫瘍細胞は雄性Ｈ−Ｙ抗原（Ｗａｓｉｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６１：２２７３−８２、２０１２）（雄性マウスにおいては自己抗原であるが、雌マウスにおいては外来抗原である）を発現する。腫瘍の直径が３〜５ｍｍに達したときに処理を開始した。抗ＶＩＳＴＡまたは対照抗体を、１０回の投与で１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇとなる量で、週３回投与した。実験の期間中、全てのマウス群を、腫瘍体積、生存、体重、および末梢血の免疫個体群の変化で評価した。薬物動態（ＰＫ）および抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生も評価した。
方法
試験計画
雄および雌ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおいて、並行および同一の試験を行った。各性で、マウスを、１０および５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＶＳＴＢ１２３もしくはＶＳＴＢ１２４、または１０ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａ対照抗体でそれぞれ処理した６〜７匹のマウスの５群に分けた。実験計画については図４１を参照されたい。
細胞源および調製
ＭＢ４９細胞をＲ．Ｎｏｅｌｌｅ博士の研究室（元は、Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ博士から）から入手した。ＭＢ４９細胞が、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）および他の汚染物質を含まないことを確認した（ＩＤＤＥＸ ＲＡＤＩＬ ケース番号２２２０９−２０１４におけるＩＭＰＡＣＴＴＭＳＣ試験）。１つの細胞バイアルを解凍し、１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質を含むＲＰＭＩ １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ）中で増殖させた。培養３日後、細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）との短時間のインキュベーションによって回収し、２回洗浄し、５×１０6細胞／ｍｌで冷ＲＰＭＩに再懸濁した後、マウスに注入した。全ての培養試薬は、ＧｉｂｃｏおよびＨｙｃｌｏｎｅから購入した。
試験薬剤および用量
ＶＳＴＢ１２３およびＶＳＴＢ１２４は、Ｊａｎｓｓｅｎによって作製されたキメラ抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体である。各々はＶＳＴＢ１７４由来の同じ抗ヒトＶＩＳＴＡ可変領域を有するが、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃ（ＶＳＴＢ１２３）またはマウスＩｇＧ２ａ ａｌａ／ａｌａサイレントＦｃ（ＶＳＴＢ１２４）にクローニングされる。抗体およびｍＩｇＧ２ａ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＢＥ００８５、クローンＣ１．１８．１４ ロット番号５０３５／０５１４）対照をＰＢＳで希釈し、０．２ｍｌの容量で腹腔内注射により投与して、１０または５ｍｇ／ｋｇの投与量を送達した。
マウス
ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスをＳａｇｅ Ｌａｂｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）で繁殖させた。８〜１２週齢のマウスを、最初に検疫施設で３週間経過させ、その後、通常の施設に移した。それらを２日間順化させ、その後、右脇腹の毛を剃り、尾に入れ墨をした。５日後、腫瘍細胞を注入した。
細胞の皮内注入
マウスの毛を剃った右脇腹に、５０μｌのＭＢ４９細胞懸濁物（約２５０，０００細胞）を皮内注入した。注入が不十分となったマウス（注入部位からの漏出、または皮内注入の代わりに皮下注入）は全て実験から除外した。
ランダム化、処理開始および腫瘍測定
腫瘍が３ｍｍ〜５ｍｍの直径に達した注入後４日目に、ほとんどの雄マウスにおいて腫瘍を測定した。ほとんどのマウスが測定または目視検査によって腫瘍増殖の証拠を示したという観察に基づいて、マウスを処理群に無作為に割り当てた。５日目に処理を開始した。処理期間中、実験が終了するまで、１週間に２〜３回、腫瘍の増殖をモニタリングした。腫瘍体積の決定に、式（Ｌ×Ｗ2）／２を用いた（Ｌは長さまたは最長寸法であり、Ｗは腫瘍の幅である）。
３回の連続測定で腫瘍が初期の体積の半分（またはサイズはより小さいが、１３．５ｍｍ3以上）になったとき、部分寛解（ＰＲ）に達した。３回の連続測定でいずれかの腫瘍が１３．５ｍｍ3未満になったとき、完全寛解に達した。
結果
図４２Ａ（左）に示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＶＳＴＢ１２３で処理した雌マウスは、対照群と比較して腫瘍体積が大きく減少した。腫瘍増殖に対する効果は、３回の抗体投与後、早くも１３日目に検出できた。さらに、各ＶＳＴＢ１２３処理群中に、完全で持続的な腫瘍退縮を示したマウスが存在した：１０ｍｇ／ｋｇ群において５／７、および５ｍｇ／ｋｇ群において３／６。６匹の対照群のマウスはいずれも退縮しなかった（データは示さず）。
ＶＳＴＢ１２４による処理では、いずれの投与量でも雌の腫瘍増殖を阻害しなかった（図４２Ａ、右）。ＶＳＴＢ１２３はＦｃ受容体に結合可能なマウスＩｇＧ２ａを有するが、ＶＳＴＢ１２４はサイレントＦｃを有するので、この結果は、Ｆｃ結合がこのモデルにおける有効性にとって重要であることを示唆している。
マウスの生存を５２日間モニタリングした（図４２Ｂ）。雌マウスについては、６匹の対照動物のうち２匹が５２日目に依然として生存していたため、生存比較はより困難であった。しかし、１０ｍｇ／ｋｇのＶＳＴＢ１２３で処理したマウスは７／７が５２日目に生存していたが（ｐ＝０．０１０８）、５ｍｇ／ｋｇのＶＳＴＢ１２３で処理したマウスは４／６がその日に依然として生存していた。ＶＳＴＢ１２４による雌マウスの処理では、生存は改善されなかった。
本明細書に示すように、ＭＢ４９腫瘍を有する雌ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスのＶＳＴＢ１２３による処理では、１０ｍｇ／ｋｇの群の８５％（５／７のマウス）が完全寛解（ＣＲ）に達し、生存が大幅に増大し（ｐ＝０．０１０８）；５ｍｇ／ｋｇでのＶＳＴＢ１２３による処理では、６匹のマウスのうち３匹がＣＲに達した（５０％）。対照的に、ＶＳＴＢ１２４は、腫瘍の増殖または生存にさほど影響を及ぼさなかった。この結果は、ＶＳＴＢ１２３の結果と比較して、ＭＢ４９モデルにおける抗ＶＩＳＴＡ抗体の有効性に活性ＦＣを必要とし得ることを示唆している。
実施例２６：ＶＳＴＢ１７４はサイトカインの放出を誘発する
抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ＣＤ８０およびＨＬＡＤＲなどの共刺激マーカーの上方制御によって測定されるように、全ＰＢＭＣ培養物においてＣＤ１４＋単球の活性化を誘導する。本研究は、抗ＶＩＳＴＡ抗体ＶＳＴＢ１７４と共に培養したヒトＰＢＭＣ培養物におけるサイトカインの変化を、もしあれば、決定した。
単球は、Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって単離された末梢血の約１０〜３０％に相当する先天性白血球である。単球は、それらが発現する共刺激タンパク質およびサイトカインのレベルに基づいて、炎症性応答および抗炎症性応答の両方において重要な役割を果たすことが示されている。抗ＶＩＳＴＡ抗体（例えば、ＶＳＴＢ１７４）は、ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲなどの細胞表面の共刺激マーカーの上方制御によって測定されるように、全ＰＢＭＣ培養物においてＣＤ１４＋単球を活性化する。抗ＶＩＳＴＡ抗体処理がアッセイにおいてサイトカインの産生を変化させるか否かを決定するために、全ＰＢＭＣをＶＳＴＢ１７４で２４時間処理し、上清をＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）により４１サイトカインの差次的発現について分析した。
本明細書に示すように、抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体ＶＳＴＢ１７４の全ＰＢＭＣとの培養は、インビトロでのヒトＰＢＭＣにおける多くのサイトカインの発現を大きく増大させた。
方法
培地の調製
５００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０−０４０−ＣＶ）を５０ｍｌのヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ、ロット番号３Ｃ０４０５）、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、１７−６０２Ｅ）１０，０００Ｕ／ｍｌ、５ｍｌのＬ−グルタミンｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０−０８１）および１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（１Ｍ）（Ｆｉｓｈｅｒ ＢＰ２９９−１００、ロット番号−１）と混合した。培地を４℃で、１４日を超えない日数保存した。
抗ＶＩＳＴＡ ＶＳＴＢ１７４および対照抗体の調製
抗体を１０％ＡＢ血清培地で２×所望の濃度に希釈した。９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７７）の適切なウェルに、１００μｌの適切な抗体溶液を加えた。細胞を１００μｌに加え、各抗体の最終濃度を１０、１、０．１または０．０１μｇ／ｍｌとした。ＩｇＧ１対照抗体ＣＮＴＯ ３９３０（Ｌｏｔ ６４０５、ＥＮＤＯ＜０．１ＥＵ／ｍｇ）を最終濃度１０μｇ／ｍｌで加えた。各条件を３回行った。
ＰＢＭＣの単離
ドナーは、少なくとも１８歳で、概ね健康であり、地域個体群から無作為に選択した。３人のドナーが、この研究のためにＰＢＭＣを提供した。ドナーの血液を、単離チューブから５０ｍｌコニカルチューブに移した。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ １０７７（ＳＩＧＭＡ、１０７７１）を、血液と混合しないように注意しながら、下層に位置させた。これは血液２５ｍｌ当たりであった。室温で、細胞を１２５０Ｇで２５分間中断せずに遠心分離した。Ｆｉｃｏｌｌと血清の界面で白血球を単離し、４０ｍｌのハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に加えて希釈した。細胞を４℃で１０分間、４５３Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離した。細胞を５０ｍｌのＨＢＳＳに再懸濁し、個別のエッペンドルフチューブに５００μｌを移すことによってカウントした。
インビトロ培養手順
分析する試料の数に基づいて、アッセイに必要な細胞の適切な数を決定した。９６ウェルＵ底プレートに２．０×１０5細胞／ウェルでＰＢＭＣを播種した。全ての条件を技術的三重反復で行った。
細胞を４℃で１０分間、４５３Ｇ（１５００ｒｐｍ）で遠心分離し、１０％ＡＢ培地に２×１０6／ｍｌの濃度で再懸濁し、適切なウェルに１００μｌを加え、各ウェルの全体積を２００μｌにした。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で、２４時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）による分析のために、１００μｌの上清を回収した。
多重分析
サイトカインを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏ／ｃｈｅｍｏ ＭＡＧ Ｐｒｅｍｉｘ ４１ Ｐｌｅｘキット（カタログ番号 ＨＣＹＴＭＡＧ−６０Ｋ−ＰＸ４１、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて測定した。組換えサイトカイン標準からの較正曲線を、試料と同じマトリックス中で３倍希釈工程で調製した。高スパイクおよび低スパイク（刺激されたヒトＰＢＭＣおよび樹状細胞由来の上清）を、サイトカインリカバリーを決定するために含めた。標準および品質対照を技術的三重反復で測定し、各三重反復試験試料を１回測定し、ブランク値を全ての読み取り値から差し引いた。全てのアッセイを室温で９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）において直接的に行い、光から保護した。簡潔に記せば、ウェルを、１％ＢＳＡを含有する１００μｌのＰＢＳで予め湿潤させ、次いで、ビーズを、標準、試料、スパイク、またはブランクと一緒に、１００μｌの最終容量で添加し、そして室温で３０分間、連続的に振盪しながら一緒にインキュベートした。ビーズを１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ビオチン化抗体のカクテル（５０μｌ／ウェル）をビーズに添加し、室温で３０分間、連続的に振盪しながらインキュベートした。ビーズを３回洗浄し、次いでストレプトアビジン−ＰＥを１０分間添加した。ビーズを再び３回洗浄し、１％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１２５μｌのＰＢＳに再懸濁した。ビーズの蛍光強度を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）アレイリーダーを用いて測定した。５つのパラメトリック曲線フィッティングを有するＢｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）Ｍａｎａｇｅｒソフトウエアをデータ分析に使用した。
統計解析
全ての統計をＲ統計コンピューティング言語で行った。検出を下回る（＜ＯＯＲ）サイトカイン濃度値を検出可能な最小濃度に再スケーリングし、正確な定量を上回る（＞ＯＯＲ）値を直線的に定量可能な最大濃度に再スケーリングした。統計解析の前に、統計的外れ値を、グラブスのｐ＜０．０５および群平均から１標準偏差より大きい外れ値距離に基づいて、単一ステップを用いて除去した。テューキーのＨＳＤ（Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を含むＯｎｅ−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して、各タイムポイントで、グループ間の一対比較を行った。全ての検定および比較で、０．０５未満のＰ値は、有意であると見なした。全てのグラフおよび表で、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図４３は、Ｒのｇｐｌｏｔｓパッケージのｈｅａｔｍａｐ．２関数を用いて、サイトカインの完全な階層的クラスタリングにより作成された。
結果
全ＰＢＭＣに対する抗ＶＩＳＴＡ抗体の効果を決定するために、ＶＳＴＢ１７４を種々の濃度で２４時間、細胞培養物に添加し、そして上清を４１サイトカインのレベルについて分析した。ＶＳＴＢ１７４で処理した全ＰＢＭＣは、多数のサイトカインの発現において統計的に有意な増加を示し、その多くは単球細胞および顆粒球細胞によって正準的に発現する（図４３）。各ドナーのＰＢＭＣ応答は、ＶＳＴＢ１７４によって駆動される応答の強さにおいて特有であった。ドナー１および２は、ドナー３が示したよりもはるかに多くの分析物において有意な増加を示した（図４３）。また、３人のドナー全てが特定の分析物において有意な増加を示した場合、ベースラインに対する倍数変化は、通常、ドナー３で最も低かった（データは示さず）。
ＶＳＴＢ１７４の効果は、薬剤が０．１〜１０μｇ／ｍｌの間に存在する場合に最も検出される可能性が高く、０．０１μｇ／ｍｌでは、有意に上方制御された分析物はほとんどなかった（図４３）。
全てのドナーで、ＩｇＧ１対照よりも有意に上昇したサイトカインは以下のものであった：ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＩＬ−１Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ７０およびＧＲＯ。
いくつかのサイトカインは、ドナー１および２においてのみ有意に上昇した：ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＦＮα（ドナー３で上昇したが、依然としてベースラインに近い）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−９、ＴＧＦα、ＩＬ−１５、ＥＧＦ、およびＰＤＧＦ−αα。
２つのサイトカイン、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８は、ドナー３においてのみ有意に上昇した。これらのサイトカインのベースラインレベルはドナー１および２のアッセイで定量できる範囲を超えていたので、分析物はＶＳＴＢ１７４による処理で上昇した可能性があるが、測定することはできなかった（ＯＯＲ＞として記載）。ＭＣＰ−１およびＩＬ−８のベースラインおよび処理レベルは、ドナー３についてのアッセイのダイナミックレンジ内であった。
ＶＳＴＢ１７４による処理を受けたいずれのドナーにおいても、ベースラインと比較して変化しなかったサイトカインがいくつか存在した：ｓＣＤ４０Ｌ、エオタキシン、ＩＬ−５、ＰＤＧＦ−ββ、ＩＬ−２、ＩＬ−３。ＩＬ−２、ＩＬ−３およびｓＣＤ４０Ｌは薬物投与によりドナー１において有意に上昇したが、ＩＬ−２およびＩＬ−３のレベルは依然として非常に低いままであった。ｓＣＤ４０Ｌのみ、０．１μｇ／ｍｌの用量でドナー１において上昇し、他の用量では上昇しなかった。
本明細書に示すように、ＶＳＴＢ１７４は、用量依存的に、多数のヒトドナー試料のＰＢＭＣからの多くのサイトカインの産生の増強を誘導した。
さらに、雌ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおけるインビボ研究はまた、ＶＳＴＢ１２３に応答して炎症性サイトカイン（例えばＭＣＰ−１、ＩＰ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−１０、ＩＬ−７、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−１ａ、ＩＬ−１ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３および／またはエオタキシン）の産生が増加することを示した。特に、上方制御されたサイトカインが、骨髄細胞の動員、移動または活性化に関与することが示された。ＭＢ４９腫瘍細胞を移植したｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスならびにナイーブｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスはいずれも、類似のサイトカイン放出プロフィールを示した（データは示さず）。
実施例２７：ＶＳＴＢ１２３はＣＤ８０＋マクロファージの腫瘍環境への移行を誘発する
ＶＩＳＴＡは、ほとんどの造血細胞で発現するＴ細胞の負の調節因子である。本研究は、抗ヒトＶＩＳＴＡのＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４抗体による処理に反応したＭＢ４９腫瘍担持ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける免疫個体群数および活性化表現型の変化を特定するために実施した。ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスは、マウスＶＩＳＴＡ遺伝子の代わりにノックインされたヒトＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡを有し、ＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方でヒトＶＩＳＴＡのみを発現することが先に確認された。ＭＢ４９腫瘍細胞は、雄マウスでは自己抗原であるが雌マウスでは外来抗原であり、腫瘍微小環境で高度に発現する、雄性Ｈ−Ｙ抗原を発現する。本明細書に示すように、腫瘍を有するマウスは、ＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４による処理後に骨髄浸潤の増加、およびＡＶＳＴＢ１２３による処理での腫瘍浸潤マクロファージ上のＣＤ８０活性化マーカーの発現の増加で応答した。
方法
試験計画
ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスを、それぞれ５匹の雌マウスからなる３つの群に分けた。それぞれのマウスに、０日目に右脇腹にＭＢ４９腫瘍細胞を注入した。７日目、９日目、および１１日目に、１０ｍｇ／ｋｇのｍＩｇＧ２ａ対照抗体、ＶＳＴＢ１２３、またはＶＳＴＢ１２４をマウスに注入した。１２日目に、マウスを安楽死させ、血液、脾臓、および腫瘍を複数のパラメータによって分析した。図４４Ａはこの実験計画を示す。
マウス
ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスをＳａｇｅ Ｌａｂｓ（Ｂｏｙｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）で繁殖させる。８〜１２週齢のマウスを、最初に検疫施設で３週間経過させ、その後、通常の施設に移した。それらを２日間順化させ、その後、右脇腹の毛を剃り、尾に入れ墨をした。５日後、腫瘍細胞を注入した。
細胞源および調製
ＭＢ４９細胞をＲ．Ｎｏｅｌｌｅ博士の研究室（元は、Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ博士から）から入手した。ＭＢ４９細胞が、マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）および他の汚染物質を含まないことを確認した（ＩＤＤＥＸ ＲＡＤＩＬ ケース番号２２２０９−２０１４におけるＩＭＰＡＣＴＴＭＳＣ試験）。１つの細胞バイアルを解凍し、１０％ＦＢＳおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ抗生物質を含むＲＰＭＩ １６４０（＋Ｌ−Ｇｌｕｔ）中で増殖させた。培養３日後、細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）との短時間のインキュベーションによって回収し、２回洗浄し、５×１０6細胞／ｍｌの濃度で冷ＲＰＭＩに再懸濁し、マウス１匹当たり５０ｍｌ（２．５×１０5細胞）を注入した。全ての培養試薬は、ＧｉｂｃｏおよびＨｙｃｌｏｎｅから購入した。
細胞の皮内注入
マウスの毛を剃った右脇腹に、５０μｌのＭＢ４９細胞懸濁物（約２５０，０００細胞）を皮内注入した。注入が不十分となったマウス（注入部位からの漏出、または皮内注入の代わりに皮下注入）は全て実験から除外した。
被験薬および投与
ＶＳＴＢ１２３およびＶＳＴＢ１２４はＪａｎｓｓｅｎによって作製された。ＶＳＴＢ１２３は、ｍｕＩｇＧ２ａ Ｆｃスキャフォールド上のＶＳＴＢ１７４可変領域からなる抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体である。ＶＳＴＢ１２４は、Ｆｃをサイレンシングするａｌａ／ａｌａ変異を有するｍｕＩｇＧ２ａ Ｆｃスキャフォールド上のＶＳＴＢ１７４可変領域からなる抗ヒトＶＩＳＴＡ抗体である。対照マウス抗体（ｍＩｇＧ２ａ）は、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、クローンＣ１．１８．４、ロット番号５３８６−２／１０１４により、ＰＢＳ中８．４ｍｇ／ｍｌ １×で生成された。
投与のために、抗体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈した。マウスに０．２ｍｌの容量を腹腔内注入し、最終濃度１０ｍｇ／ｋｇを送達した。図４４Ａに概説したように、マウスは、腫瘍注入後７、９および１１日目に抗体療法を受けた。
組織の採取
マウスを、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ ＩＡＣＵＣプロトコルに従ってＣＯ2を用いて安楽死させた。マウスを心臓穿刺により放血し、血液を採取した。脾臓および腫瘍を解剖した。
ＨＢＳＳ中のコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳＴＭ分散装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、製造業者の使用説明書に従って脾臓の細胞を分離させた。細胞を４０μｍフィルターに通し、次いで、３ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ、ロット番号００００４００４１９）中で５分間、赤血球を溶解させた。ＨＢＳＳ中で１回洗浄した後、細胞をＰＢＳに再懸濁し、免疫染色した。
腫瘍解離キットおよびｇｅｎｔｌｅ ＭＡＣＳＴＭ分散装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って腫瘍細胞を分離させた。分離後、細胞を４０μｍフィルターに通し、次いで、ＡＣＫ溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解させた。ＨＢＳＳ中で１回洗浄した後、細胞を微量のＰＢＳに再懸濁し、免疫染色した。流入領域リンパ節からの単細胞懸濁液を、機械的破砕および４０μｍフィルターを通過させることによって調製した。細胞を洗浄し、計数し、ＲＰＭＩに再懸濁した。
血液試料を遠心沈澱させて、血漿および全血細胞を分離した。血漿を回収し、続いて凍結させ、−８０℃に保ち、サイトカインおよびＡＮＡ ＥＬＩＳＡ分析に使用した。全血細胞を３ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ、ロット番号００００４００４１９）中で５分間、赤血球の溶解に供した。細胞をＨＢＳＳ中で１回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁し、免疫染色に使用した。
フローサイトメトリー
単細胞懸濁液を抗マウスＣＤ１６／３２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）（１：２００）により４℃で１５分間Ｆｃブロックした。細胞をＰＢＳで希釈した抗体カクテルと共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、氷上で３０分間、固定／透過希釈標準溶液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁した。細胞を回転させ、上清を廃棄し、ＰＢＳに再懸濁し、終夜インキュベートした。
骨髄パネル：
−Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｙｅｌｌｏｗ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（１：１０００）
−Ｌｙ６Ｇ−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１Ａ８）（１：２００）
−ＣＤ４５−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０−Ｆ１１）（１：８００）
−ＣＤ８０−ＰＥ／ＣＦ５９４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６−１０Ａ１）（１：２００）
−Ｌｙ６Ｃ−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＨＫ１．４）（１：１００）
−ＣＤ１１ｃ−ＰＥ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ、Ｎ４１８）（１／２００）
−ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｍ５／１１４．１５．２）（１／４００）
−ＣＤ８６−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＧＬ−１）（１／２００）
−Ｆ４／８０−ＡＰＣ／Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＢＭ８）（１／２００）
−ＣＤ１１ｂ−ＢｒＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｍ１／７０）（１／１００）
細胞を濯ぎ、Ｇａｌｌｉｏｓ １０カラーフローサイトメーターにかけた。全ての細胞を、ライブ・デッドおよびポジティブＣＤ４５染色でゲーティングした。顆粒球はＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ＋およびＬｙ６Ｃ−であった。単球はＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ−およびＬｙ６Ｃ＋であった。マクロファージはＣＤ１１ｂ＋、Ｌｙ６Ｇ−、Ｌｙ６Ｃ−およびＦ４／８０＋であった。樹状細胞をＬｙ６Ｇ−、Ｌｙ６Ｃ−、ＣＤ１１ｃ＋でゲーティングし、ＣＤ１１ｂは中間または高かった。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏを用いて分析した。
統計解析
全ての統計をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ，ｖｅｒｓｉｏｎ６で行った。各条件について、ＡＮＯＶＡとテューキーの補正を用いて値を比較した。全ての場合において、ｍＩｇＧ２ａ対照処理動物との比較を行った。有意性はＧｒａｐｈＰａｄ標準を使用したアスタリスクによって要約され、１つのアスタリスクは＊Ｐ＜０．０５を示し、２つの＊＊はＰ＜０．０１を示し、３つの＊＊＊はＰ＜０．００１を示し、４つの＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を示す。
結果
抗ＶＩＳＴＡまたは対照抗体処理動物の脇腹から解剖した腫瘍を分析して、フローサイトメトリーによって細胞個体群に対する効果を決定した。腫瘍浸潤マクロファージを、活性化マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＭＨＣクラスＩＩの発現における抗ＶＩＳＴＡ誘導変化について調べた。図４４Ｂは、フローサイトメトリー解析の結果を示す。腫瘍浸潤マクロファージは、処理に関係なく、脾臓マクロファージよりも高レベルのＣＤ８６を発現したが（データは示さず）、抗ＶＩＳＴＡ処理に応じてＣＤ８６をさらに上方制御しなかった。逆に、ＣＤ８０の発現はＶＳＴＢ１２３で処理したｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスの腫瘍浸潤マクロファージで有意に増加したが、ＶＳＴＢ１２４で処理したマウスでは増加しなかった（図４４Ｂ）。
実施例２８：ＶＳＴＢ１２３は腫瘍微小環境へのＭＰＯ＋細胞の移動を誘発する
本研究は、抗ヒトＶＩＳＴＡのＶＳＴＢ１２３またはＶＳＴＢ１２４抗体による処理に反応したＭＢ４９腫瘍担持ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスにおける腫瘍環境の変化を、もしあれば、特定するために実施した。本明細書に示すように、ＶＳＴＢ１２３は、腫瘍環境へのミエロペルオキシダーゼ染色細胞の移動を誘発した。
方法
実施例２７に記載のように処理したＭＢ４９腫瘍担持ｈＶＩＳＴＡ ＫＩマウスから死亡後に腫瘍および脾臓を迅速に解剖した。次いで、腫瘍および脾臓試料をカセットに入れ、１０％ホルマリンに室温で２〜３週間固定し（通常は４日間以下で固定）固定し、次いで、ＰＢＳで簡単に洗浄し、７０％エタノールに移して保持した（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓ）後、Ｇｅｉｓｅｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ ＤａｒｔｍｏｕｔｈのＰａｔｈｏｌｏｇｙ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｅに移し、そこでパラフィン包埋し、切片化し、次いで染色した。
パラフィン包埋組織切片（４μｍ）を、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ ＲＸ自動染色機を用いて染色した。脱蝋後、切片を抗原回復（Ｂｏｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２、１００oＣ、２０分）に供し、一次抗体（以下の表１７の希釈を参照のこと）と共に３０〜６０分間、Ｌｅｉｃａ希釈剤中、室温でインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３×５分洗浄し、二次抗体（Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｅｆｉｎｅ検出キット、ＤＳ９８００）と共にインキュベートした。ＰＢＳで３回最終洗浄した後、切片をＤＡＢ（Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄポリマー検出キット）と共にインキュベートし、濯ぎ、ヘマトキシリンで対比染色し、マウントした。
スライドを、Ｌｅｉｃａ（Ａｐｅｒｉｏ（登録商標）ＡＴ２、ＳＣＮ４００）ホールスライドスキャナーでスキャンした。ホールスライドスキャンを、ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を用いて定量した。
Figure 2019509993
結果
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色スライドを、本明細書に記載するようにスキャンし、Ａｐｅｒｉｏ（登録商標）ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅにおいて評価した。１２の腫瘍試料（６つのｍＩｇＧ２ａ腫瘍、６つのＶＳＴＢ１２３腫瘍）を単独および集合して可視化した。ＭＰＯ染色陽性細胞は、好中球と一致する形態を有していた。ＩｇＧ処理対照において、ＭＰＯ細胞は、腫瘍組織全体にわたって、高密度であるが限局的で、十分に区別されたクラスターを示した。典型的には、これらの高密度凝集体は単一の脂肪細胞を取り囲んだ。より多くのＭＰＯ陽性細胞がＶＳＴＢ１２３処理腫瘍において観察され、ｍＩｇＧ２ａ対照と比較して腫瘍実質へのより広い浸潤性分布を示した。
実施例２９：ＶＳＴＢ１７４は血液中の好中球の一時的な減少を誘発する
ＶＳＴＢ１７４（ＣＮＴＯ８５４８）をカニクイザルに１ヶ月間静脈内ボーラス注入により投与し、潜在的な毒性を評価し、また、もしあれば、毒性の潜在的な可逆性を評価した。赤血球質量および白血球数などの臨床病理学的パラメータ（例えば、血液学）を測定した。本明細書に示すように、ＶＳＴＢ１７４は、循環好中球の一時的な減少を誘発した。
方法
この研究の目的のために、本明細書中に記載の手順を、３６日目まで全ての動物に適用する。
被験物質：ＶＳＴＢ１７４（５０ｍｇ／ｍｌ、−７０℃に維持し、かつ光から保護）。各投与日に、ストック被験物質の新しいバイアルを凍結保存から取り出し、約１時間室温まで平衡化し、バイアルを穏やかに旋回させ（振盪もボルテックスもしなかった）、溶液が均質になるまで混合した。被験物質の名目濃度（５０ｍｇ／ｍＬ）を、投与溶液の調製のための希釈計算に使用した。バイオセーフティーフード下で、被験物質を対照物質（０．９％塩化ナトリウム）により希釈して、製剤を調製した。最終的な被験物質製剤を、０．２２ミクロンのシリンジフィルター（ＰＶＤＦ膜）を通して濾過し、保持時間が４時間を超える前に、投与のために適切なサイズの注入器に充填した。注入器サイズは、投与量について可能な限り最小とした。調製した投与用注入器を、調製後、４時間以内に使用した。調製手順を、生データで維持した。残留量を廃棄した。
対照物質：注射用０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ、バッチ番号Ｐ３２６６０３、室温で保存。
実験計画を表１８に示す。
Figure 2019509993
被験物質および対照物質の投与
被験物質または対照物質を、グループ１、２、３および４の適切な動物に、好適な末梢静脈への静脈内（ゆっくりしたボーラス）注入により、週１回、５週間（すなわち、１、８、１５、２２、および２９日目）、合計５回投与した。各動物に対する投与量は、投与前日までに得られた最新の体重測定値に基づいた。動物を、用量投与のために一時的に拘束し、鎮痛剤は使用しなかった。使い捨ての滅菌注入器を、各動物／用量に使用した。投与初日を１日目とした。
試料採取
静脈穿刺により血液を採取した。尿は、処理前および剖検の日に、特殊なステンレス鋼製ケージパンから排液することにより採取した。ケージパン採取が成功しなかった場合、剖検時に膀胱穿刺により尿を採取した。採取後、試料を適切な実験室に移して処理した。臨床化学血液採取前に動物を絶食させた。試料は以下のように採取した：（−２）週目、（−１）週目、１日目（投与４時間後）、２日目、４日目、８日目（前）、１５日目（前）、２２日目（前）、２９日目（投与４時間後）、３１日目、３４日目、６週目、７週目および８週目。
血液学
血液試料を好中球数（絶対）について分析した。血液塗抹標本を各血液試料から調製した。血液塗抹標本を標識し、染色し、保存し、保管した。
結果
一般に、５週間（すなわち、１日目、８日目、１５日目、２２日目、および２９日目）にわたる１週間に１回、計５回の静脈内（ゆっくりとしたボーラス）注入によるＶＳＴＢ１７４の投与は、カニクイザルにおいて、≦３０ｍｇ／ｋｇ／週のレベルで概ね良好な耐容性を示した。好中球は２日目に顕著な減少が始まり、２９日目までに徐々に基準値に戻り、投与後の３１日目および３４日目に１００ｍｇ／ｋｇ／週で減少した（図４６）。
本明細書中に引用した全ての特許、公開された出願、および文献の教示は、参照によりその全体が組み込まれる。
本発明を、その実施形態例に関して詳細に説明し記載してきたが、当業者であれば、添付した特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細に様々な変化を加え得ることは理解するであろう。

Claims (34)

  1. 対象に生物学的応答を誘発する方法であって、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、前記対象に、前記対象において生物学的応答を誘発するのに十分な量投与する工程を含み、前記生物学的応答は、
    ａ）循環免疫細胞数の減少、
    ｂ）骨髄および脾臓における顆粒球数の減少、
    ｃ）腫瘍微小環境における好中球、マクロファージ、Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせの数の増加、および
    ｄ）１種以上のサイトカインのレベルの増加、あるいは
    ｅ）これらの組み合わせ
    からなる群から選択される方法。
  2. 前記生物学的応答は循環免疫細胞数の減少である請求項１に記載の方法。
  3. 前記循環免疫細胞は、単球、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球、またはこれらの組み合わせである請求項２に記載の方法。
  4. 前記循環免疫細胞数の減少は一時的である請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 前記生物学的応答は、骨髄および脾臓における顆粒球数の減少である請求項１に記載の方法。
  6. 前記生物学的応答は、腫瘍微小環境における好中球、マクロファージまたはこれらの組み合わせの数の増加である請求項１に記載の方法。
  7. 前記生物学的応答は、１種以上のサイトカインのレベルの増加であり、前記１種以上のサイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＩＬ−１Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−９、ＴＧＦα、ＩＬ−１５、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−αα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ｓＣＤ４０Ｌ、エオタキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−５、ならびにＰＤＧＦ−ＢＢからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
  8. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞上のＦｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記Ｆｃ受容体はＣＤ１６受容体である請求項８に記載の方法。
  10. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含み、さらに、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記対象は哺乳動物である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記哺乳動物はヒトである請求項１１に記載の方法。
  13. 前記哺乳動物は非ヒト霊長目である請求項１１に記載の方法。
  14. 前記哺乳動物は齧歯動物である請求項１１に記載の方法。
  15. 前記対象は腫瘍を有する請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記対象は、肺癌、膀胱癌または乳癌を有する請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）タンパク質に結合し、生物学的応答を誘発する抗体を同定する方法であって、
    ａ）ＶＩＳＴＡに結合する抗体、またはその抗体フラグメントを、細胞、組織、臓器または生物に提供する工程；ならびに
    ｂ）前記抗体またはその抗体フラグメントが前記細胞、組織、臓器または生物において生物学的応答を誘発するか否かを決定する工程であって、前記生物学的応答が
    ｉ）単球の活性化；
    ｉｉ）Ｔ細胞の活性化；
    ｉｉｉ）循環免疫細胞数の減少；
    ｉｖ）骨髄および脾臓における顆粒球数の減少；
    ｖ）腫瘍微小環境における好中球、マクロファージまたはその両方の数の増加；および
    １種以上のサイトカインのレベルの増加；
    あるいはそれらの組み合わせ
    からなる群から選択される工程
    を含む方法。
  18. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、免疫細胞上のＦｃ受容体に結合するＦｃ領域を含む請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｆｃ受容体はＣＤ１６受容体である請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＨドメインを含み、さらに、配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む抗体ＶＬドメインを含む請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記生物学的応答は、インビトロアッセイを用いて決定される請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記インビトロアッセイは、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色アッセイ、サイトカイン放出アッセイ、ケモカイン放出アッセイ、細胞活性化アッセイ、細胞増殖アッセイ、細胞移動アッセイ、およびフローサイトメトリーアッセイからなる群から選択されるアッセイである請求項２１に記載の方法。
  23. 前記生物学的応答は、非ヒト動物においてインビボで決定される請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記非ヒト動物は非ヒト霊長目である請求項２３に記載の方法。
  25. 前記非ヒト動物は齧歯動物である請求項２３に記載の方法。
  26. 前記非ヒト動物はトランスジェニック動物である請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記非ヒト動物は腫瘍を有する請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記非ヒト動物は、肺癌、膀胱癌または乳癌を有する請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記生物学的応答は循環免疫細胞数の減少である請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記循環免疫細胞は、単球、好中球、リンパ球、好酸球もしくは好塩基球、またはこれらの組み合わせである請求項２９に記載の方法。
  31. 前記循環免疫細胞数の減少は一時的である請求項２９または３０に記載の方法。
  32. 前記生物学的応答は、骨髄および脾臓における顆粒球数の減少である請求項１７に記載の方法。
  33. 前記生物学的応答は、腫瘍微小環境における好中球、マクロファージまたはその両方の数の増加である請求項１７に記載の方法。
  34. 前記生物学的応答は、１種以上のサイトカインのレベルの増加であり、前記１種以上のサイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１β、ＩＰ−１０、ＩＬ−１Ｒα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＦＧＦ−２、フラクタルカイン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ−９、ＴＧＦα、ＩＬ−１５、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−αα、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、ｓＣＤ４０Ｌ、エオタキシン、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−５、ならびにＰＤＧＦ−ＢＢからなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
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