JP2018531911A - 融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の治療および／または予防における使用のための融合タンパク質であって、少なくとも１つのペプチドと融合した、少なくとも１つのＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含み、上記少なくとも１つのペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択された配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする融合タンパク質に関する。

Description

発明の詳細な説明

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置および／または予防に用いるための融合タンパク質に関する。

Ｂ型肝炎は、毎年世界中で何百万の人が患う、Ｂ型肝炎ウイルスに起因する肝臓病である。ＨＢＶは、感染者の血液および体液に存在するため、これらの液が健康な人の体液と接することによって広がり得る。

ＨＢＶは、肝細胞において複製することで、主に肝臓の機能を妨げる。ＨＢＶに感染した場合、感染後の免疫応答が肝細胞損傷およびウイルスクリアランスの両方を引き起こす。

急性ＨＢＶ感染の場合、感染を自然に治すことができる場合が多いため、処置しないことが通常である。一方、慢性ＨＢＶ感染の場合、肝硬変および肝臓癌のリスクを低減するために処置する必要がある。現在、ＨＢＶ感染の処置に使用される抗ウイルス薬として、ラミブジン、アデフォビル、テノフォビル、テルビブジン、およびエンテカビルが挙げられる。また、免疫系調節物質として作用するインターフェロンα−２ａも処置に使用し得る。しかし、これらの薬剤はいずれもＨＢＶ感染を治すことができず、ＨＢＶの複製を止めることによって肝臓の損傷を最小限にすることしかできない。

本発明の目的の一つは、ＨＢＶ感染の処置および／または予防のための新規な手段であって、現在のＨＢＶ処置法の短所を克服する手段を提供することにある。特に重要な目的は、慢性ＨＢＶ感染の患者において、効率的な体液免疫応答および細胞免疫応答を回復させることによる、ＨＢＶのウイルスクリアランスである。

これらの目的は、Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置および／または予防における使用のための融合タンパク質であって、少なくとも１つのペプチドと融合した、少なくとも１つのＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含み、上記少なくとも１つのペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択された配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする融合タンパク質によって達成される。

驚くべきことに、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片と、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択された配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる少なくとも１つのペプチドとを含む融合タンパク質は、ＰｒｅＳのみと比べて、また、配列番号１〜４とは異なるペプチドを含む他の融合タンパク質と比べて、個体におけるＰｒｅＳ特異的抗体の形成をより誘導することが分かった。さらに、本発明に係る融合タンパク質の投与に応答して生成された抗体は、優れたＢ型肝炎中和効果を示し、Ｂ型肝炎ウイルス感染を抑制することができる。ヒト対象におけるＢ型肝炎ウイルス感染の処置および／または予防において、ＰｒｅＳを含む融合タンパク質の投与がうまく使用され得るのは今回が初めてである。

図２Ｂに示すように、本発明の融合タンパク質の投与により形成される抗体は、ＨＢＶのＰｒｅＳの最初の３０のアミノ酸残基（ペプチドＰ１）および最初の５０のアミノ酸残基（ペプチドＰ２）を特に対象とし、より低い程度にＣ末端領域（ペプチドＰ６〜Ｐ８）を対象とし、また、わずかな程度にＨＢＶのＰｒｅＳの中央部分（ペプチドＰ４およびＰ５）を対象とする。肝細胞に対するＨＢＶの付着において、また、ＨＢＶ感染において、ＨＢＶのＰｒｅＳのＮ末端部分が重要な役割を果たすことが知られている。そのため、ＰｒｅＳポリペプチドのこの部分を対象とする抗体は、ＨＢＶ感染の処置および／または予防において特に有用である。一方、ＨＢＶのＰｒｅＳのみの投与ではこのような効果が見られない。ＨＢＶのＰｒｅＳのみの投与で生成される抗体は、ＨＢＶのＰｒｅＳのほとんどの部分に結合することができる（図２Ａを参照）。このことは、本発明の融合タンパク質によって誘導される免疫応答が、ＨＢＶのＰｒｅＳポリペプチドのうち、ＨＢＶ感染に関与する部分に向けられていることを示す。

本発明の融合タンパク質はＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を１つ以上含んでもよい。Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を複数含んだ融合タンパク質の場合、より多くの抗原が免疫系に提示されることによって、ＰｒｅＳを対象とする抗体がさらに多く形成できるようになるという利点がある。本発明の特に好ましい実施形態では、上記融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０の、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含む。本発明の融合タンパク質の一部として本明細書中に定義されるＨＢＶのＰｒｅＳポリペプチドおよびその断片は、同一のＨＢＶ遺伝子型に由来してもよく、異なる遺伝子型に由来してもよい。例えば、本発明の融合タンパク質は、ＨＢＶ遺伝子型ＡのみのＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含んでもよく、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧまたはＨに由来するさらなるＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片と組み合わされてもよい。

本発明の特に好ましい実施形態では、上記融合タンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるペプチドを、それぞれ少なくとも１つ含む。代替的に、本発明の融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこれらのペプチドをどの様な組合せで含んでもよく、あるいは、特定の１つのペプチドのみを同量で含んでもよい。

本明細書で使用するとき、「〜と融合した」または「融合タンパク質」という用語は、１つの単一の組換ポリペプチド鎖として発現・調製された、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含むタンパク質を意味する。

融合タンパク質の生成方法は、当該分野で周知であり、Sambrook et al.（Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)やAusubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed; Wiley and Sons, 1995）等の標準的な分子生物学の参考文献に見出すことができる。一般的に、融合タンパク質は、好適な発現ベクターに挿入される融合遺伝子をまず構築することによって生成され、挿入後、発現ベクターは好適な宿主細胞に形質移入するために使用される。一般的に、組み換え融合構築物は、一連の制限酵素消化およびライゲーション反応によって生成される。これらの制限酵素消化およびライゲーション反応の結果として、所望の配列がプラスミドに組み込まれる。好適な制限部位が利用できない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは使用され得る。このことは当業者にとって公知であり、上記に引用した参考文献に記載されている。アレルゲンおよび天然タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好適なベクターに挿入される前に構築され得るか、またはアレルゲンをコードする配列は、ベクター内にすでに存在する天然配列をコードする配列に隣接して挿入され得る。ベクター内への配列の挿入は、配列がタンパク質に翻訳されるように、インフレームに挿入されるべきである。必要となる具体的な制限酵素、リンカーおよび／またはアダプター、ならびに具体的な反応条件が、使用される配列およびクローニングベクターによって変わることは、当業者にとって明白である。しかし、ＤＮＡ構築物の構築は、当該技術において日常的な操作であり、かつ当業者によって容易に達成され得る。

Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの断片は、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも５０の連続したアミノ酸残基からなり、また、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドのＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２を含んでもよい。本発明の特に好ましい実施形態では、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの断片は、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドの１〜７０番目のアミノ酸残基を含んでもよく、好ましくは１〜６５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１〜６０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１〜５５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１〜５０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１〜４５番目を含み、より好ましくは１〜４０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１〜３５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜７０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜６５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜６０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜５５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜５０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜４５番目を含み、より好ましくは５〜４０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは５〜３５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜７０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜６５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜６０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜５５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜５０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜４５番目を含み、より好ましくは１０〜４０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１０〜３５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜７０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜６５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜６０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜５５番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜５０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜４５番目を含み、より好ましくは１５〜４０番目のアミノ酸残基を含み、より好ましくは１５〜３５番目のアミノ酸残基を含み、上記Ｂ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドは、好ましくは、配列番号５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４からなるＨＢＶのＰｒｅＳポリペプチドであり、配列番号８〜１４はそれぞれＨＢＶ遺伝子型Ｂ〜Ｈに属する。

少なくとも１つのＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片に融合される少なくとも１つのペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％の同一性を有する。あるアミノ酸配列に対する、他のアミノ酸の同一性の程度は、両方のアミノ酸配列を、特定のアルゴリズムを用いて直接比較することによって決定できる。配列同一性の決定は、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２のマトリクスを使用し、ギャップイグジステンスペナルティ（gap existence penalty）＝１１、ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）＝１の条件でＢＬＡＳＴアラインメント（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/; Altschul SF et al J. Mol. Biol. 215 (1990): 403-410）によって決定される。

本発明の好ましい実施形態によれば、上記ＰｒｅＳポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３に対して少なくとも８０％が同一であり、最も好ましくは配列番号５に対して少なくとも８０％が同一である。

上述のペプチドの少なくとも１つに融合されるＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％の同一性を有する。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記少なくとも１つのペプチドは、上記ＰｒｅＳポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合している。

本明細書で使用するとき、「Ｎ末端および／またはＣ末端に融合している」とは、少なくとも１つのペプチドがＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片のＮ末端および／もしくはＣ末端に融合していることを意味する。本発明の融合タンパク質は、上記ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片のＮ末端もしくはＣ末端に融合したペプチドを１つ以上含んでもよい。

本発明の好ましい実施形態によれば、上記融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を含む。

本発明の融合タンパク質は、配列番号６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、特に１００％の同一性を有する。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記Ｂ型肝炎ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈまたはこれらのサブタイプに起因する。これらのＨＢＶ遺伝子型に起因するＨＢＶの処置および／または予防には、同一の遺伝子型のＨＢＶのＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を用いることが好ましい（たとえば、ＨＢＶ遺伝子型Ａまたはそのサブタイプの感染を処置・予防するために、ＨＢＶ遺伝子型ＡのＰｒｅＳを用いる）。ＨＢＶ感染に関与することが知られているＰｒｅＳポリペプチドの部分において保存されるアミノ酸配列のため、ある遺伝子型のＨＢＶのＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を、他のＨＢＶ遺伝子型の感染の処置・予防に用いることも無論可能である（たとえば、ＨＢＶ遺伝子型ＡのＰｒｅＳを、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇおよび／またはＨ、またはこれらのサブタイプの感染の処置・予防に用いる）。

本発明の融合タンパク質は、様々な遺伝子型およびそのサブタイプのＨＢＶ感染の処置および／または予防において使用されてもよい。Ｂ型肝炎ウイルスのサブタイプとしては、Schaefer et al.（World J Gastroenterol 13(2007):14-21）において説明されるように、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４が挙げられる。

本発明の特に好ましい実施形態によれば、上記融合タンパク質は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜体重１ｋｇ当たり２ｍｇの量で、個体に少なくとも１回投与される。本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記融合タンパク質は、５〜５０μｇ、好ましくは１０〜４０μｇ、より好ましくは１５〜３０μｇの量で患者に投与され、上記量は体重に依存しない量（つまり、用量は１５、２０、２５、または３０μｇであってもよい）または体重１ｋｇ当たりの量である。

１つの剤形を得るために賦形剤と組み合わせられる融合タンパク質の量は、処置されるホストおよび具体的な投与形態によって変わる。融合タンパク質の投与量は、個体の病状、年齢、性別、体重および個体において所望の抗体反応を誘発する能力等の要素によって変わり得る。投与計画は、最適な処置反応を得るために調節され得る。例えば、毎日数回に分けて投与してもよいし、処置状況の緊急度合によって示されるとおりに比例的に投与量を減少させてもよい。ワクチンの投与量も、環境に応じて最適な予防用量反応を得るために変更され得る。例えば、本発明のポリペプチドおよびワクチンは、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳに特異的なＩｇＧ誘導のレベルに常に応じて、数日、１〜２週間、または数カ月の間隔で個体に投与してもよい。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、２〜１０回、好ましくは２〜７回、さらに好ましくは５回以下、最も好ましくは３回以下与えられる。特に好ましい実施形態では、次のワクチン接種間の間隔は、２週間〜５年、好ましくは１カ月〜最大３年、より好ましくは２カ月〜１．５年になるように選ばれる。本発明の融合タンパク質の反復投与により、処置の最終効果を最大化し得る。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、上記融合タンパク質は、少なくとも１つの、アジュバントおよび／または薬学的に許容可能な賦形剤と共に投与される。

本発明の融合タンパク質の投与は、たとえば、皮下投与、筋内投与、静脈内投与、経粘膜投与であってもよい。剤形および投与経路によって、本発明の融合タンパク質は、賦形剤、希釈剤、アジュバント、および／または担体と組み合わされてもよい。アジュバントは好ましくはミョウバンである。ワクチン調合物の製造のための好適なプロトコールは、当業者にとって公知であり、たとえば「vaccine Protocols」（A. Robinson, M. P. Cranage, M. Hudson; Humana Press Inc., U. S.; 2nd edition 2003）に記載されている。

また、本発明の融合タンパク質は、ワクチンにおいて通常用いられる他のアジュバントと共に調合されてもよい。たとえば、好適なアジュバントは、ＭＦ５９、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニン（たとえばＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ポリフォスファゼン、乳剤（たとえば、フロイントアジュバント、ＳＡＦ）、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート、ＰＬＧ微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、変異体毒素（たとえばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微粒子、および／または重合リポソームであってもよい。好適なアジュバントは商業的に利用可能であり、たとえば、ＡＳＯ１Ｂ（リポソーム調合物におけるＭＰＬおよびＱＳ２１）、ＡＳＯ２Ａ、ＡＳ１５、ＡＳ−２、ＡＳ−０３、およびこれらの誘導体（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、米国）；ＣＷＳ（ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ ｓｋｅｌｅｔｏｎ、細胞壁骨格）、ＴＤＭ（トレハロース−６，６’ジミコレート）、ＬｅＩＦ（リーシュマニア伸長開始因子）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム等のアルミニウム塩；カルシウム塩、鉄塩、または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖類；カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化多糖類（cationically or anionically derivatized polysaccharides）；ポリフォスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびＱｕｉｌＡが挙げられる。また、アジュバントとして、ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイキン−１２等のサイトカインを用いてもよい。Ｔｈｌ型優位の応答（predominantly Thl-type response）を引き出すために用いられる好ましいアジュバントとして、たとえば、モノホスホリルリピドＡ（好ましくは３−０−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ））の組み合わせが挙げられ、該組み合わせは任意にアルミニウム塩を含む。モノホスホリルリピドＡと表面活性剤とを含む水性調合物は国際公開第９８／４３６７０号に記載されている。

他の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニンのミメティックもしくは誘導体であり、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.）である。これらのアジュバントは単独で用いてもよく、他のアジュバントとの組み合わせで用いてもよい。たとえば、強化されたシステム（enhanced system）はモノホスホリルリピドＡとサポニンの誘導体との組み合わせ（たとえば、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）を含む。他の好ましい調合物は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。ＱＳ２１と、３Ｄ−ＭＰＬと、トコフェロールとを含む水中油型乳剤は特に強力なアジュバント調合物である。本発明における使用のためのさらなるサポニンのアジュバントとして、ＱＳ７（国際公開第９６／３３７３９号および国際公開第９６／１１７１１号に記載）およびＱＳ１７（米国特許第５０５７５４０号および欧州特許公開０３６２２７９号（Ｂ１）に記載）等が挙げられる。

本明細書に記載の配列番号は以下のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号）を有する。

本発明は、以下の図面および実施例によってさらに例証されるが、これらに限定されない。

図１は、異なる遺伝子型の、アラインメントされたＰｒｅＳ配列に対する、ＰｒｅＳペプチドの割り当てを示す。同一のアミノ酸は点によって示されている。ＰｒｅＳ１ドメインは１〜１１８番目のアミノ酸残基を含む。ＰｒｅＳ２ドメインにおける１１９〜１７３番目のアミノ酸残基（配列番号５も参照）および１９〜２８番目のアミノ酸残基（灰色のボックス）は、肝細胞に対するＨＢＶの付着において、また、ＨＢＶの感染において、重要な役割を果たす。

図２は、ＰｒｅＳで免疫付与したウサギ（ｎ＝１、図２Ａ）、およびＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与したウサギ（ｎ＝２、図２Ｂ）のそれぞれのＩｇＧ応答を示す。免疫付与前の応答は左側の灰色のバーで示し、免疫付与後の応答は右側の黒色のバーで示している。光学濃度値（ｙ軸：４０５ｎｍでの光学濃度値）は、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ由来の合成重複ペプチドＰ１〜Ｐ８（ｘ軸）に対するＩｇＧレベルに対応する。結果は、３通りの測定の平均値を標準偏差とともに示す。

図３Ａ〜３Ｃは、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳに対するＩｇＧ応答（図３Ａ）および合成のＰｒｅＳ由来重複ペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧ応答（図３Ｂ〜３Ｃ）を示す。ＰｒｅＳおよびペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値、３通りの測定の平均）が示される。光学濃度値の測定は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ｎ＝２２）またはプラセボ（ｎ＝８）で免疫付与された、事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしたまたはしていない対象において行った。該測定は、免疫付与前（Ｖ５）において、また、免疫付与後の異なる時点（Ｖ８およびＶ１５）において行った。結果は、標準偏差とともに平均値として示され、有意差（Ｖ５，Ｖ８，およびＶ１５において、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物をワクチン接種した全ての個体における有意差）も示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。

図４は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ＰｒｅＳ−ＦＶＭ）またはプラセボをワクチン接種した対象におけるＰｒｅＳ特異的抗体応答を示し、また、Ｂ型肝炎感染の固体に存在する抗体を示す。示されるのは、ＰｒｅＳに特異的な、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値）である。該光学濃度値は、プラセボで免疫付与した対象（ｎ＝８）、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１０）、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（４０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１２）、およびＢ型肝炎感染の個体（ｎ＝１９）における値である（ｘ軸）。グラフは平均値を標準偏差とともに示す。有意差も示されている（***ｐ＜０．００１）。

図５は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ＰｒｅＳ−ＦＶＭ）またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳペプチドＰ１〜Ｐ８に特異的なＩｇＧ応答を示し、また、Ｂ型肝炎感染の個体に存在するＩｇＧを示す。示されるのは、ＰｒｅＳ由来ペプチド（Ｐ１〜Ｐ８）に特異的なＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値）である。該光学濃度値は、プラセボで免疫付与した対象（ｎ＝８）、ＰｒｅＳワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１０）、およびＰｒｅＳワクチン混合物（４０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１２）においてＶ１５での値であり、また、Ｂ型肝炎感染の個体（ｎ＝１９）におけるものである（ｘ軸）。結果は、標準偏差とともに、平均値として示される。

図６は、ＰｒｅＳ特異的Ｔ細胞応答およびペプチド特異的Ｔ細胞応答を示す。図６Ａは、ＰｒｅＳ特異的ＰＢＭＣの増殖（ｙ軸：刺激指標ＳＩ）を示す。該増殖は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与した対象（ｎ＝１９）における［３Ｈ］チミジン取り込みによって、異なる時点（ｘ軸）で評価した。平均値および標準偏差ならびに有意差が示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。図６Ｂ〜６Ｃは、ＰｒｅＳペプチド（Ｐ１〜Ｐ８）、ＰｒｅＳ、または等モルのペプチド混合物（ｙ軸）による刺激後の、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与した対象（ｎ＝１１）の血液試料における、増殖したＣＤ４のＴ細胞のパーセンテージ（図６Ｂ）および増殖したＣＤ８のＴ細胞のパーセンテージ（図６Ｃ）を示す（時点：Ｍ２）。結果は、標準偏差とともに、平均値として示される。

図７は、インビトロのウイルス中和アッセイにおいて、Ｂ型肝炎ウイルス感染の抗体誘導性阻害を示す。該アッセイは、インビトロで培養された肝細胞に基づく。培養したＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰの、Ｂ型肝炎感染の阻害のパーセンテージ（ｘ軸）は、ウイルス中和抗体を含む抗血清を用いて、ウイルスを前インキュベーションすることによって得られた。図７Ａは、Ｍａ１８／７（陽性対照）、プラセボ処置を受けたヒト対象からの血清、およびＰｒｅＳ融合ワクチン混合物を用いた免疫付与後のヒト対象からの血清（ｎ＝７）によるウイルス感染の阻害を示す。対象はいずれも事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしていない。図７Ｂは、市販のＢ型肝炎ワクチンＥｎｇｅｒｉｘまたはＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与したウサギからの血清による、ウイルス感染の阻害を示す。

図８は、免疫付与したニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギの血清におけるＰｒｅＳに対する総血清中ＩｇＧの比較を示す。該免疫付与は、完全フロイントアジュバントにおける乳剤状の、組み換えＰｒｅＳまたはＰｒｅＳ融合タンパク質（ＰｒｅＳ−Ｆ１〜ＰｒｅＳ−Ｆ４）によるものである。ｘ軸は、血清の希釈を示し、ｙ軸は、４０５ｎｍで測定した光学濃度値を示す。実験は、２通りの測定を行った。

〔実施例〕
（実施例１：組み換えＰｒｅＳの発現および精製、ＰｒｅＳ重複ペプチドの合成、配列アラインメント）
ヘキサヒスチジンタグ付き組み換えＰｒｅＳタンパク質（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）におけるＰｒｅＳ１＋ＰｒｅＳ２（配列番号５、遺伝子型Ａ、サブタイプ：ａｄｗ２、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＡＴ２８７３５．１由来）の発現および精製を、Niespodziana K et al.（J Allergy Clin Immunol １２７（２０１１）:１５６２−７０）に記載されているように行った。

ＰｒｅＳ（遺伝子型Ａ、サブタイプ：ａｄｗ２、表Ａ、図１）の全配列に及ぶ８つのペプチド（長さ：約３０のアミノ酸、重複：１０のアミノ酸）を、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート］活性化を用いたＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）の方法（ＣＥＭ−Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ＮＣ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）によって合成した。

ペプチドを調製用のＨＰＬＣによって精製し、質量分析（Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｂｒｕｋｅｒ、米国）によってその同一性を確認した。

ＰｒｅＳ遺伝子型Ａ、血清型ａｄｗ２の配列、およびそのペプチド配列と、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ〜Ｈとのアラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを用いて行った。ＨＢＶデータベース（ＨＢＶｄｂ、https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex）からの参照配列を用いた（Hayer J et al. Nucleic Acids Res 2012;gks1022）（図１参照）。

（実施例２：ウサギに対する免疫付与）
精製したＰｒｅＳ（１回の注射当たり２００μｇ）でニュージーランドホワイトウサギに免疫付与して、組み換えＰｒｅＳに対して特異的なウサギ抗体を産出させた。第１の注射では完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用い、第２および第３の注射では不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いた（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ドイツ）。さらに、ＰｒｅＳワクチン混合物の４つの成分をそれぞれ２０μｇ（ｎ＝２）または４０μｇ（ｎ＝２）含んだ混合物（ＰｒｅＳワクチン混合物−２０、ＰｒｅＳワクチン混合物−４０）で、ニュージーランドホワイトウサギを３回免疫付与した。アジュバントとしてＡｌ（ＯＨ）_３を用いた。ＰｒｅＳワクチン混合物の４つの成分は、以下のアミノ酸配列を有するＰｒｅＳ融合タンパク質ＰｒｅＳＦ１、ＰｒｅＳＦ２、ＰｒｅＳＦ３、およびＰｒｅＳＦ４を含む。

ＰｒｅＳＦ１（配列番号２２）

ＰｒｅＳＦ２（配列番号２３）

ＰｒｅＳＦ３（配列番号６）

ＰｒｅＳＦ４（配列番号２４）

さらに、ニュージーランドホワイトウサギ（ｎ＝２）に１カ月の間隔で３回免疫付与して、登録済みのＢ型肝炎ワクチンＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂに特異的なウサギ抗体を得た。該免疫付与において、商業的に利用可能であり、かつ、即時使用可能なプレフィルドシリンジを用いた。

血清試料を、免疫付与前に得て、また、３回目の免疫付与の約４週間後に得て、分析するまで−２０℃で保管した。

ＰｒｅＳワクチン混合物で免疫付与した場合、一連のＰｒｅＳエピトープ（sequential PreS epitopes）に対する特異性を有するＩｇＧ抗体の誘導が見られた。図２は、ウサギにおける、ＰｒｅＳに対するＩｇＧ抗体応答と、合成ＰｒｅＳ由来ペプチドに対するＩｇＧ抗体応答との比較を示す。該ＩｇＧ抗体応答は、ＣＦＡ調合したＰｒｅＳまたは水酸化アルミニウムに吸着されたＰｒｅＳワクチン混合物によって誘導された（図２Ｂ）。ＣＦＡ調合したＰｒｅＳによって誘導したウサギ抗体は、ＰｒｅＳを認識し、Ｐ７以外の各ＰｒｅＳ由来ペプチドを認識した（図２Ａ）。投与量２０μｇの、水酸化アルミニウムに吸着されたＰｒｅＳワクチン混合物は、ＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ抗体を誘導し、また、主にＮ末端ペプチドＰ１〜Ｐ２、ペプチドＰ６、およびＣ末端ペプチドＰ８に対するＩｇＧ抗体を誘導した（図２Ｂ）。免疫付与前のウサギでは、ＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答およびペプチド特異的ＩｇＧ応答は見られなかった（図２、左側のバー）。

（実施例３：ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳペプチド特異的体液免疫応答の評価）
血清試料を、Ａｌ（ＯＨ）_３に吸着したＰｒｅＳワクチン混合物（すなわち、ＰｒｅＳワクチン混合物の成分をそれぞれ１０μｇ、２０μｇ、または４０μｇ含む混合物、またはプラセボ（つまり、Ａｌ（ＯＨ）_３））の注射を３回受けた患者から得た。血清の採取は、３回目の免疫付与前、および３回目の免疫付与の４週間後に行った。採取した血清を、使用まで−２０℃で保管した。血清試料の第２のセットを、Ａｌ（ＯＨ）_３に吸着したＰｒｅＳワクチン混合物（すなわち、ＰｒｅＳワクチン混合物の成分をそれぞれ２０μｇまたは４０μｇ含む混合物、またはプラセボとしてのＡｌ（ＯＨ）_３）の皮下注射を２年間にわたり７回受けた患者から得た。また、Ｂ型肝炎感染を患う患者から血清試料を得た。Ｂ型肝炎感染は、臨床データ、肝臓機能試験、およびＨＢＶ血清マーカーに基づいて診断された。

分析した全ての血清は、ＨＢＶの血清学的マーカー（すなわち、Ｂ型肝炎表面抗原［ＨＢｓＡｇ］、Ｂ型肝炎表現抗原に対する抗体［抗−ＨＢｓ］、およびＢ型肝炎コア抗原に対する抗体［抗−ＨＢｃ］）についてスクリーニングされた。

ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）、デンマーク）を抗原（組み換えＰｒｅＳ、合成ＰｒｅＳ重複ペプチド：Ｐ１〜Ｐ８）またはヒト血清アルブミン（陰性対照）（Ｂｅｈｒｉｎｇ、米国）を用いて被覆した。インキュベーションを、ウサギ血清を用いて１：１０，０００の希釈物（ＣＦＡ）または１：５００の希釈物（ＰｒｅＳワクチン混合物−２０、ＰｒｅＳワクチン混合物−４０）において行い、ネズミ血清を用いて１：１，０００の希釈物において行い、また、アイソタイプおよびＩｇＧサブクラスについて異なる程度に希釈されたヒト血清を用いて行った。ヒトにおける総ＩｇＧの検出のため、血清を１：１００に希釈し、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭについて、血清を１：２０に希釈し、ＩｇＥ抗体の検出のため、血清を１：１０に希釈した。

１：２，５００に希釈したロバ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、バッキンガムシャー、英国）を用いて、ウサギＩｇＧを検出した。１：１，０００に希釈したモノクローナルラット抗ネズミＩｇＧ１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国）を用いて、その後、１：２，５００に希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合のヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、スウェーデン）を用いて、結合したネズミＩｇＧ１を検出した。

１：１０，０００に希釈したウサギ抗ヒトＩｇＧのＦｃ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を用いて、その後、１：２，５００に希釈したペルオキシダーゼ結合ロバ抗ウサギＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ヒトＩｇＧを検出した。ヒトＩｇＡ、ＩｇＧサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４、ならびにヒトＩｇＭを、それぞれ、１：１，０００に希釈した精製ネズミ抗ヒトＩｇＡ１／ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびＩｇＭ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の抗体を用いて、その後、１：２，５００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗ネズミＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。モノクローナル抗ヒトＩｇＧ３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を１：５，０００に希釈した。ヤギ抗ヒトセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、米国）を用いて、ヒトＩｇＥを検出した。

（実施例４：ＰｒｅＳワクチン混合物で免疫付与した対象におけるＰｒｅＳ特異的抗体応答は、以前のＢ型肝炎免疫によって影響されない）
ＰｒｅＳワクチン混合物またはプラセボを用いた免疫療法を受けたヒト対象からの血清試料を、ＰｒｅＳおよび合成ＰｒｅＳペプチドに対するＩｇＧ反応性に関してテストした（図３ａ〜３ｃ）。これらの患者（ｎ＝３０）は、Ｂ型肝炎特異的血清マーカー（ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｓ、および抗ＨＢｃの抗体）について処置の前にスクリーニングされ、ＨＢｓＡｇ抗体および抗ＨＢｃ抗体については陰性であった。対象のうち２２人は、以前にＢ型肝炎ワクチンのワクチン接種を受けたため、抗ＨＢｓ抗体を有していた（図３ａ〜３ｃ）。ＰｒｅＳワクチン混合物を用いた免疫療法を受けた患者はいずれも、以前にＨＢワクチン接種をしたか否かにかかわらず、強いＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答を示すが、プラセボで処置した患者は、強いＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答を示さないことが、３回目の注射後（Ｖ８、１回目の注射の３カ月後）の血清テストおよび７回目の注射後（Ｖ１５、１回目の注射の１５カ月後）の血清テストで分かった（図３ａ〜３ｃ）。ＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答は、免疫療法前の基線から有意に増大し（すなわち、Ｖ５対Ｖ８）、また、Ｖ８とＶ１５との間で（すなわち、７回目の注射後に）さらに有意に増大した（図３ａ〜３ｃ）。これらの患者におけるＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答は、主にＮ末端ペプチドであるＰ１、Ｐ２、およびＰ３に対するものであった。Ｐ１特異的ＩｇＧ応答およびＰ２特異的ＩｇＧ応答は、基線Ｖ５とＶ８との間およびＶ８とＶ１５との間で有意な増大を示した（図３ａ〜３ｃ）。また、他のＰｒｅＳ由来ペプチドＰ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、およびＰ８に対するＩｇＧ応答の増大は、ＰｒｅＳワクチン混合物を用いた免疫療法を受けた患者からの血清において見られたが、プラセボで処置した患者においては見られなかった（図３ａ〜３ｃ）。

（実施例５：ＰｒｅＳワクチン混合物で免疫付与した対象におけるＰｒｅＳ特異的抗体応答は、中和エピトープに対するものであり、Ｂ型肝炎感染の個体の応答とは異なる）
図４は、ＰｒｅＳワクチン混合物またはプラセボを用いた免疫療法後の患者におけるＰｒｅＳ特異的アイソタイプおよびＩｇＧサブクラスの応答と、Ｂ型肝炎感染の個体におけるＰｒｅＳ特異的アイソタイプおよびＩｇＧサブクラスの応答との比較を示す。ＰｒｅＳワクチン混合物を用いた免疫療法は、両方の投与量で患者において強いＰｒｅＳ特異的ＩｇＧ応答を誘導した。該応答は、Ｂ型肝炎感染の個体におけるＩｇＧ応答よりも有意に高かった（図４）。ＰｒｅＳワクチン混合物またはプラセボで処置した患者からの血清において、また、Ｂ型肝炎感染の個体において、有意なＰｒｅＳ特異的ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭの応答は検出されなかった（図４）。ＰｒｅＳ特異的ＩｇＧサブクラスの応答は、ＰｒｅＳワクチン混合物で処置した対象と、Ｂ型肝炎感染の個体とで異なった。ＰｒｅＳワクチン混合物で処置した対象は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスの優先的な応答を示した。一方、Ｂ型肝炎感染の個体はＰｒｅＳに対してある程度のＩｇＧ１応答およびＩｇＧ２応答を示した（図４）。

また、ＰｒｅＳワクチン混合物で処置した患者とＢ型肝炎感染の個体とで、ＰｒｅＳ特異的抗体のエピトープ特異性について、著しい違いが見られた（図５）。ＰｒｅＳワクチン混合物で免疫付与した患者は、Ｐ１およびＰ３に対して強いＩｇＧ応答を示したが、Ｂ型肝炎感染の個体は同様の応答を示さなかった（図５）。このことは驚くべきである。なぜならば、Ｐ１によって画定される領域は、Ｂ型肝炎感染の阻害に必須の残基を含むことが報告されている、ＰｒｅＳ１内のモチーフ（図１も参照）に対応するからである。さらに、Ｐ７は、ＰｒｅＳワクチン混合物で処置した対象によってのみ認識され、Ｂ型肝炎感染の個体によって認識されなかったが、Ｐ２およびＰ６に対するＩｇＧ応答は、Ｂ型肝炎感染の個体においても見られた（図５）。

（実施例６：Ｔ細胞応答の評価）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン）を用いた密度勾配遠心分離によって、ヘパリン添加血液試料から得た。血液試料を得ることができた場合、ＰｒｅＳワクチン混合物をワクチン接種した対象（ｎ＝１９）におけるＰｒｅＳ特異的ＰＢＭＣの増殖を、Ｖ５、Ｖ８、Ｍ１（１回目のワクチン接種の５カ月後）、およびＭ２（１回目のワクチン接種の１７カ月後）において、［３Ｈ］−チミジンの取り込みによって決定した。

ＰｒｅＳワクチン混合物で免疫付与した特定の患者（ｎ＝１１）について、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞応答を、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）の標識によって、Ｍ２において評価することができた。

Ｕ字状底部を有する９６ウェルマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）において、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、５０ｍｍｏｌ／Ｌのβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、および０．０２ｍｇのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補ったＵｌｔｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ（商標）無血清培地（Ｌｏｎｚａ、ベルギー）（全量：２００μｌ）中、蛍光色素によって標識した細胞を１つのウェル当たり２００，０００の細胞の量で播種した。細胞を、未刺激のままにした（陰性対照）か、陽性対照としてのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ活性化剤ＣＤ３／ＣＤ２８（３μｇ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国））、ＰｒｅＳ（０．１５μｇ／ウェル）、等モル量のＰｒｅＳ重複ペプチド（０．０３μｇ／ウェル）、または各ペプチドを０．０３μｇ／ウェルの量で含むＰｒｅＳ由来重複ペプチドの混合物を用いて刺激した。細胞を５％のＣＯ_２において３７℃で７日間培養し、その後抗体染色およびＦＡＣＳ分析を行った。

フローサイトメトリーのために以下の試薬を用いた。ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＨＩＴ３ａ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）抗ヒトＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８ａ抗体（クローンＨＩＴ８ａ）、およびアイソタイプ対照、すなわち、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５ネズミＩｇＧ２ａ、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）ネズミＩｇＧ１、ＡＰＣネズミＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）、およびＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）。

フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）を用いて行った。１つの試料当たり２０，０００のイベントを得、ＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ１０を用いて分析した。形態学的基準に基づいて、前方散乱光および側方散乱光のドットブロット（dot blot）においてリンパ球をゲーティングした。死細胞は、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅの染色によって除外した。ゲーティングはＣＤ３ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ３ＣＤ８陽性Ｔ細胞を対象とした。抗原刺激に応じて増殖した細胞は、そのＣＦＳＥ蛍光発光強度の低下によって特定した。結果は３通りの培養の平均値を示し、異なる抗原および分析された患者について、バックグラウンドを超えるＣＤ３＋ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋の刺激パーセンテージの２３５の中央値が示される。

図６は、ＰｒｅＳワクチン混合物を用いた免疫療法を受けた患者における、ＰｒｅＳ特異的Ｔ細胞応答の進展を示す。ＰｒｅＳ特異的Ｔ細胞応答は、徐々に増大し、Ｖ８、Ｍ１、およびＭ２の時点において、Ｖ５での基線と比べて有意に高い（図６Ａ）。ＰｒｅＳ特異的ＣＤ４細胞応答のエピトープ特異性をＣＦＳＥ染色によって分析した結果、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ５、およびＰ６が最も強いＣＤ４細胞増殖を誘導したことが分かったが、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ７に対するＣＤ４応答も見られた（図６Ｂ）。興味深いことに、ペプチドおよびペプチド混合物は、ＰｒｅＳタンパク質と比べて、より強いＣＤ４細胞増殖を誘導した（図６Ｂ）。頻度は低いが、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳペプチドに特異的なＣＤ８細胞応答をある程度検出した。該応答は、主にＰ２、Ｐ３、Ｐ６、Ｐ８、および完全なＰｒｅＳに対するものであった（図６Ｂ）。

（実施例７：Ｂ型肝炎ウイルス中和アッセイ）
感染のためのＨＢＶ接種材料は、ウイルス粒子を単離するためのヘパリンのカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を用いて、ＨｅｐＡｄ３８細胞の上清から調製した。ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞２０を、１つのウェル当たり３×１０^５の細胞の密度で、２４ウェルプレートに播種した。播種後の２日目に、感染培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に２．５％のＤＭＳＯ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を補い、３日目に、細胞がＨＢＶで感染していた。ＨＢＶ粒子の中和のためには、患者の血清（１０μｌ）をＨＢＶ接種材料（１つのウェル当たり６．９×１０^７のゲノム同等物（genome equivalent；ＧＥ））と共に３７℃で３０分間前インキュベーションし、その後、４％のポリエチレングリコール８００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）の存在下において患者の血清およびウイルスで、３７℃で１６時間、細胞の共インキュベーションを行った。陽性対照として、中和モノクローナル抗体Ｍａ１８／７２１を用いた。

１６時間の接種後、細胞をＰＢＳで広く洗浄し、その後、２．５％のＤＭＳＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補った新鮮な分化培地を添加した。感染後の３日目および５日目に、さらなる培地交換を行った。

ＨＢＶ感染の定量化は、感染後の５日目〜７日目において、細胞の上清において分泌されたＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）を測定することで行った。ＨＢｅＡｇの測定は、ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＸＰＴ自動化学ルミネセンスシステム（Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ）を用いて行った。試料は、１Indexを超える信号で陽性と評価した。

ＨＢＶコアタンパク質の発現は、特異的免疫蛍光によって検出した。上清を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、４％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温（ＲＴ）で３０分間固定した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ １００（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、ＰＢＳにおいてＲＴで３０分間透過処理した。その後、一次抗体（抗ＨＢＶコア、ウサギポリクローナルＡＫ、ＤＡＫＯ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、ハンブルク、ドイツ）を２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ＰＢＳにおいて希釈し、細胞を４℃で一晩インキュベーションした。翌日に、細胞をＰＢＳで洗浄し、最後に、細胞を二次抗体（ヤギαウサギＡｌｅｘａ４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および４’，６−ジアミジン−２−フェニルインド／Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）と共に暗所にてインキュベーションした。ＨＢＶコアタンパク質の検出のために、二次抗体を、遮光しながらＲＴで２時間インキュベーションした。Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）については４８０ｎｍを用い、核染色については３６０ｎｍを用いて、細胞を蛍光顕微鏡下で調べた。

第１種類のアッセイでは、細胞感染後におけるＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）の発現を、特異的免疫蛍光によって検出する。ＨＢｃＡｇは、未感染の細胞において検出されなかったが、感染した未治療の細胞において検出された。その発現は、大きなＢ型肝炎表面タンパク質のＰｒｅＳ１ドメインに対する中和モノクローナル抗体Ｍａ１８／７２１を用いた、ウイルスの前インキュベーションによって防止することができる。同様に、市販のワクチンＥｎｇｅｒｉｘ−Ｂによって誘導されたウサギ抗体、またはウサギ抗ＰｒｅＳワクチン混合物（投与量２０μｇ）抗体を用いてＢ型肝炎ウイルスを前インキュベーションすることによって、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞の感染が阻害されることが分かった。同様の実験のセットを、ＰｒｅＳワクチン混合物またはプラセボで治療した患者からの血清に対して行った。プラセボで免疫付与した患者から免疫付与前に得た血清および免疫付与後に得た血清は、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞の感染を阻害しなかった。一方、２０μｇで免疫付与した患者または４０μｇで免疫付与した患者から免疫付与後に得た血清は、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞の感染を阻害した。

ＨＢｃＡｇの染色に加え、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞によって分泌されたＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の測定に基づいたアッセイを、ＨＢＶ感染阻害を定量化するための他の代替マーカーとして、ＨＢＶ感染後の７日目に用いた。ＰｒｅＳワクチン混合物で治療した個体からの血清によってＨＢＶ感染が５０〜９９％阻害されたことが分かった（図７Ａ）。３つの注射を受けた患者からの血清（図７Ａ）および７つの注射を受けた患者からの血清（図７Ａ、黒色）について同様の阻害が見られたため、ＰｒｅＳワクチン混合物の注射の投与量および回数による有意差は見られなかった。また、ＰｒｅＳワクチン混合物の投与量が２０μｇの患者と４０μｇの患者とで、阻害の程度に明らかな差異はなかった（図７Ａ）。プラセボで処置した患者からの血清では阻害は見られなかった。モノクローナル抗体Ｍａ１８／７について、９０％を超える阻害が見られた（図７Ａ）。ウサギ抗Ｅｎｇｅｒｉｘ−Ｂおよびウサギ抗ＰｒｅＳワクチン混合物の抗体は、ＨＢＶ感染に対して９９％を超える阻害を引き起こした（図７Ｂ）。

（実施例８）
１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．６）中の、濃度が２μｇ／ｍｌの、組み換えＰｒｅＳおよび陰性対照としてのヒト血清アルブミン（Ｂｅｈｒｉｎｇ、米国）を、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）上に４℃で一晩被覆した。洗浄バッファは、ＰＢＳと０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ／Ｔ）とを含むものを用いた。ブロッキング手順は、２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ＰＢＳ／Ｔを用いて３７℃で２時間行った。その後の、血清および試薬の希釈は全て０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ＰＢＳ／Ｔにおいて行った。

完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）における乳剤状の、組み換えＰｒｅＳまたはＰｒｅＳ融合タンパク質で、完全な免疫付与をされたウサギにおける体液免疫応答を決定するために、血清を異なる希釈度で用い（４℃、一晩）、結合した総ウサギＩｇＧを、１：２，０００に希釈したロバ抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を用いて検出した。呈色反応は、ＡＢＴＳ［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸］によって誘導した。吸収度検出は、マイクロプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を用いて、抗原特異的抗体のレベルに対応して、４０５ｎｍおよび４９０ｎｍで行った。全ての決定を３通り行った。

驚くべきことに、図８に示すように、ＰｒｅＳのみの場合よりも、または異なるペプチド（ＰｒｅＳ−Ｆ１、ＰｒｅＳ−Ｆ２、ＰｒｅＳ−Ｆ４）に融合したＰｒｅＳも含む他の融合タンパク質の場合よりも、かなり多くのＰｒｅＳ特異的ＩｇＧの形成を誘導できたのは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および／または配列番号４のアミノ酸配列を有する１つ以上のペプチドと、ＰｒｅＳ（ＰｒｅＳ−Ｆ３）とを含む融合タンパク質のみであった。

図１は、異なる遺伝子型の、アラインメントされたＰｒｅＳ配列に対する、ＰｒｅＳペプチドの割り当てを示す。同一のアミノ酸は点によって示されている。ＰｒｅＳ１ドメインは１〜１１８番目のアミノ酸残基を含む。ＰｒｅＳ２ドメインにおける１１９〜１７３番目のアミノ酸残基（配列番号５も参照）および１９〜２８番目のアミノ酸残基（灰色のボックス）は、肝細胞に対するＨＢＶの付着において、また、ＨＢＶの感染において、重要な役割を果たす。 図２は、ＰｒｅＳで免疫付与したウサギ（ｎ＝１、図２Ａ）、およびＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与したウサギ（ｎ＝２、図２Ｂ）のそれぞれのＩｇＧ応答を示す。免疫付与前の応答は左側の灰色のバーで示し、免疫付与後の応答は右側の黒色のバーで示している。光学濃度値（ｙ軸：４０５ｎｍでの光学濃度値）は、ＰｒｅＳおよびＰｒｅＳ由来の合成重複ペプチドＰ１〜Ｐ８（ｘ軸）に対するＩｇＧレベルに対応する。結果は、３通りの測定の平均値を標準偏差とともに示す。 図３Ａ〜３Ｃは、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳに対するＩｇＧ応答（図３Ａ）および合成のＰｒｅＳ由来重複ペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧ応答（図３Ｂ〜３Ｃ）を示す。ＰｒｅＳおよびペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値、３通りの測定の平均）が示される。光学濃度値の測定は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ｎ＝２２）またはプラセボ（ｎ＝８）で免疫付与された、事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしたまたはしていない対象において行った。該測定は、免疫付与前（Ｖ５）において、また、免疫付与後の異なる時点（Ｖ８およびＶ１５）において行った。結果は、標準偏差とともに平均値として示され、有意差（Ｖ５，Ｖ８，およびＶ１５において、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物をワクチン接種した全ての個体における有意差）も示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。 図３Ａ〜３Ｃは、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳに対するＩｇＧ応答（図３Ａ）および合成のＰｒｅＳ由来重複ペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧ応答（図３Ｂ〜３Ｃ）を示す。ＰｒｅＳおよびペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値、３通りの測定の平均）が示される。光学濃度値の測定は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ｎ＝２２）またはプラセボ（ｎ＝８）で免疫付与された、事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしたまたはしていない対象において行った。該測定は、免疫付与前（Ｖ５）において、また、免疫付与後の異なる時点（Ｖ８およびＶ１５）において行った。結果は、標準偏差とともに平均値として示され、有意差（Ｖ５，Ｖ８，およびＶ１５において、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物をワクチン接種した全ての個体における有意差）も示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。 図３Ａ〜３Ｃは、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳに対するＩｇＧ応答（図３Ａ）および合成のＰｒｅＳ由来重複ペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧ応答（図３Ｂ〜３Ｃ）を示す。ＰｒｅＳおよびペプチドＰ１〜Ｐ８に対するＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値、３通りの測定の平均）が示される。光学濃度値の測定は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ｎ＝２２）またはプラセボ（ｎ＝８）で免疫付与された、事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしたまたはしていない対象において行った。該測定は、免疫付与前（Ｖ５）において、また、免疫付与後の異なる時点（Ｖ８およびＶ１５）において行った。結果は、標準偏差とともに平均値として示され、有意差（Ｖ５，Ｖ８，およびＶ１５において、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物をワクチン接種した全ての個体における有意差）も示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。 図４は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ＰｒｅＳ−ＦＶＭ）またはプラセボをワクチン接種した対象におけるＰｒｅＳ特異的抗体応答を示し、また、Ｂ型肝炎感染の固体に存在する抗体を示す。示されるのは、ＰｒｅＳに特異的な、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４）のレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値）である。該光学濃度値は、プラセボで免疫付与した対象（ｎ＝８）、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１０）、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（４０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１２）、およびＢ型肝炎感染の個体（ｎ＝１９）における値である（ｘ軸）。グラフは平均値を標準偏差とともに示す。有意差も示されている（***ｐ＜０．００１）。 図５は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物（ＰｒｅＳ−ＦＶＭ）またはプラセボをワクチン接種した対象の、ＰｒｅＳペプチドＰ１〜Ｐ８に特異的なＩｇＧ応答を示し、また、Ｂ型肝炎感染の個体に存在するＩｇＧを示す。示されるのは、ＰｒｅＳ由来ペプチド（Ｐ１〜Ｐ８）に特異的なＩｇＧレベルに対応する光学濃度値（ｙ軸：光学濃度値）である。該光学濃度値は、プラセボで免疫付与した対象（ｎ＝８）、ＰｒｅＳワクチン混合物（２０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１０）、およびＰｒｅＳワクチン混合物（４０μｇ）で免疫付与した対象（ｎ＝１２）においてＶ１５での値であり、また、Ｂ型肝炎感染の個体（ｎ＝１９）におけるものである（ｘ軸）。結果は、標準偏差とともに、平均値として示される。 図６は、ＰｒｅＳ特異的Ｔ細胞応答およびペプチド特異的Ｔ細胞応答を示す。図６Ａは、ＰｒｅＳ特異的ＰＢＭＣの増殖（ｙ軸：刺激指標ＳＩ）を示す。該増殖は、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与した対象（ｎ＝１９）における［３Ｈ］チミジン取り込みによって、異なる時点（ｘ軸）で評価した。平均値および標準偏差並びに有意差が示される（*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１）。図６Ｂ〜６Ｃは、ＰｒｅＳペプチド（Ｐ１〜Ｐ８）、ＰｒｅＳ、または等モルのペプチド混合物（ｙ軸）による刺激後の、ＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与した対象（ｎ＝１１）の血液試料における、増殖したＣＤ４のＴ細胞のパーセンテージ（図６Ｂ）および増殖したＣＤ８のＴ細胞のパーセンテージ（図６Ｃ）を示す（時点：Ｍ２）。結果は、標準偏差とともに、平均値として示される。 図７は、インビトロのウイルス中和アッセイにおいて、Ｂ型肝炎ウイルス感染の抗体誘導性阻害を示す。該アッセイは、インビトロで培養された肝細胞に基づく。培養したＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰの、Ｂ型肝炎感染の阻害のパーセンテージ（ｘ軸）は、ウイルス中和抗体を含む抗血清を用いて、ウイルスを前インキュベーションすることによって得られた。図７Ａは、Ｍａ１８／７（陽性対照）、プラセボ処置を受けたヒト対象からの血清、およびＰｒｅＳ融合ワクチン混合物を用いた免疫付与後のヒト対象からの血清（ｎ＝７）によるウイルス感染の阻害を示す。対象はいずれも事前にＢ型肝炎のワクチン接種をしていない。図７Ｂは、市販のＢ型肝炎ワクチンＥｎｇｅｒｉｘまたはＰｒｅＳ融合ワクチン混合物で免疫付与したウサギからの血清による、ウイルス感染の阻害を示す。 図８は、免疫付与したニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）ウサギの血清におけるＰｒｅＳに対する総血清中ＩｇＧの比較を示す。該免疫付与は、完全フロイントアジュバントにおける乳剤状の、組み換えＰｒｅＳまたはＰｒｅＳ融合タンパク質（ＰｒｅＳ−Ｆ１〜ＰｒｅＳ−Ｆ４）によるものである。ｘ軸は、血清の希釈を示し、ｙ軸は、４０５ｎｍで測定した光学濃度値を示す。実験は、２通りの測定を行った。

Claims (7)

1. Ｂ型肝炎ウイルス感染の処置および／または予防における使用ための融合タンパク質であって、少なくとも１つのペプチドと融合した、少なくとも１つのＢ型肝炎ＰｒｅＳポリペプチドまたはその断片を含み、上記少なくとも１つのペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択された配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、使用のための融合タンパク質。
2. 上記ＰｒｅＳポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３に対して少なくとも８０％が同一であることを特徴とする、請求項１に記載の、使用のための融合タンパク質。
3. 上記少なくとも１つのペプチドは、上記ＰｒｅＳポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合していることを特徴とする、請求項１または２に記載の、使用のための融合タンパク質。
4. 上記融合タンパク質は、配列番号６に対して少なくとも８０％が同一であるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、使用のための融合タンパク質。
5. 上記Ｂ型肝炎ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈまたはこれらのサブタイプに起因する感染であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、使用のための融合タンパク質。
6. 上記融合タンパク質は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜体重１ｋｇ当たり２ｍｇの量で、個体に少なくとも１回投与されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の、使用のための融合タンパク質。
7. 上記融合タンパク質は、少なくとも１つの、アジュバントおよび／または薬学的に許容可能な賦形剤と共に投与されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の、使用のための融合タンパク質。