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CN108472356B - 融合蛋白 - Google Patents

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CN108472356B CN201680058895.1A CN201680058895A CN108472356B CN 108472356 B CN108472356 B CN 108472356B CN 201680058895 A CN201680058895 A CN 201680058895A CN 108472356 B CN108472356 B CN 108472356B
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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防乙肝病毒感染的融合蛋白，其包含与至少一种由氨基酸序列组成的肽融合的至少一种乙肝病毒PreS多肽或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列具有至少80％的同一性。

Description

融合蛋白
本发明涉及用于治疗和/或预防乙肝病毒(HBV)感染的融合蛋白。
乙肝是由乙肝病毒引起的肝脏疾病。该疾病每年影响全世界数百万人。 HBV存在于感染者的血液和体液中，因此可以通过使这些液体与健康人的液体接触而传播。
HBV主要通过在肝细胞中复制来干扰肝脏的功能。在HBV感染期间，宿主免疫应答引起肝细胞损伤和病毒清除两者。
急性HBV感染通常得不到治疗，因为大多数人都能自发清除感染。然而，为了降低肝硬化和肝癌的风险，必须治疗慢性HBV感染。目前用于治疗HBV 感染的抗病毒药物包括拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦(tenofovir)、替比夫定(telbivudine)和恩替卡韦。此外，作为免疫系统调节剂的干扰素α-2a也可用于治疗。但是，这些药物都不能清除HBV感染。这些药物只能阻止HBV复制，从而使肝损伤最小化。
本发明的目的是提供治疗和/或预防HBV感染的新方法，其克服了当前 HBV治疗的缺点。一个特别重要的目标是通过恢复有效的体液和细胞免疫应答来对慢性感染患者中的HBV进行病毒清除。
这些目的通过用于治疗和/或预防乙肝病毒感染的融合蛋白来实现，所述融合蛋白包含与至少一种由氨基酸序列组成的肽融合的至少一种乙肝病毒 PreS多肽或其片段，所述氨基酸序列与选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列具有至少80％同一性。
令人惊讶地证明，包含乙肝病毒PreS多肽或其片段和至少一种由氨基酸序列组成的融合蛋白与单独的PreS或包含与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4不同的肽的其它融合蛋白相比以高得多的程度诱导个体中PreS特异性抗体的形成。此外，响应施用本发明的融合蛋白而产生的抗体显示出优异的乙肝中和作用并且能够抑制乙肝病毒感染。第一次发现，包含PreS的融合蛋白的施用可以成功地用于治疗和/或预防人类受试者中的乙肝病毒感染。
如图2B所示，本发明的融合蛋白的施用导致形成抗体，所述抗体特异性针对HBVPreS的前30个(肽P1)和50个(肽P2)氨基酸残基，在更低程度上针对 HBV PreS的C末端区域(肽P6到P8)以及在忽略不计的程度上针对中心部分 (肽P4和P5)。由于HBV PreS的N端部分已知在HBV的肝细胞附着和HBV感染中起重要作用，针对PreS多肽的这部分的抗体在治疗和/或预防HBV感染中特别有用。与此相反，仅施用HBV PreS不显示这些效果。由此产生的抗体能够结合HBV PreS的几乎任何部分(参见图2A)。这显示由本发明的融合蛋白诱导的免疫应答更集中于涉及HBV感染的HBV PreS多肽的那些部分。
本发明的融合蛋白可以包含一种或多种乙肝病毒PreS蛋白多肽或其一种或多种片段。融合蛋白中超过一种乙肝病毒PreS多肽或其片段的存在具有以下优点：向免疫系统呈递更多抗原，允许形成甚至更多针对PreS的抗体。在本发明的特别优选的实施方案中，融合蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10种乙肝病毒PreS多肽或其片段。如本文定义为本发明融合蛋白的一部分的HBV PreS多肽以及它们的片段可以源自相同的HBV基因型或不同的基因型。例如，本发明的融合蛋白可以仅包含HBV基因型A的PreS多肽或其片段，或者可以与源自HBV基因型B、C、D、E、F或F、G或H的其它PreS多肽或其片段组合。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，融合蛋白包含至少一种由与 SEQ IDNo.1具有至少80％同一性的氨基酸序列组成的肽、至少一种由与 SEQ ID No.2具有至少80％同一性的氨基酸序列组成的肽、至少一种由与 SEQ ID No.3具有至少80％同一性的氨基酸序列组成的肽和至少一种由与 SEQ ID No.4具有至少80％同一性的氨基酸序列组成的肽。或者，本发明的融合蛋白可以以相同的量包含任何可能的组合的这些肽中的1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10种或甚至仅一种特定的肽。
如本文所用，术语“与…融合”或“融合蛋白”是指以单一重组多肽链表达并制备的包含乙肝病毒PreS多肽或其片段的蛋白。
产生融合蛋白的方法在本领域中是公知的，并且可以在标准分子生物学参考文献中找到，例如Sambrook等(Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)和Ausubel等(Short Protocols in Molecular Biology，第3版；Wiley andSons，1995)。通常，通过首先构建融合基因来产生融合蛋白，所述融合基因插入到合适的表达载体中，继而施用所述表达载体转染合适的宿主细胞。通常，通过一系列限制酶消化和连接反应产生重组融合构建体，其导致期望的序列引入质粒中。如果合适的限制性位点不可用，则可以使用合成的寡核苷酸衔接头或接头，如本领域技术人员已知的并在上面引用的参考文献中描述。编码变应原和天然蛋白质的多核苷酸序列可以在插入合适载体之前组装，或者编码变应原的序列可以插入到编码已经存在于载体中的天然序列的序列附近。在载体内插入序列应当符合读码框，以便序列可以转录成蛋白质。对于本领域普通技术人员将显而易见的，所需要的精确限制性酶、接头和/或衔接子以及精确的反应条件将随所用的序列和克隆载体而变化。然而，DNA构建体的组装在本领域中是常规的并且可以由本领域技术人员容易地完成。
乙肝病毒PreS多肽的片段优选由至少30个，优选至少40个，更优选至少 50个连续氨基酸残基组成，并且可以包含乙肝病毒PreS多肽的PreS1和/或 PreS2。在本发明的一个特别优选的实施方案中，乙肝病毒PreS多肽的片段可包含乙肝PreS多肽，优选由SEQ IDNo.5、7、8、9、10、11、12、13或14组成的HBV PreS多肽的氨基酸残基1至70、优选氨基酸残基1至65、更优选氨基酸残基1至60、更优选氨基酸残基1至55、更优选氨基酸残基1至50、更优选1 至45、更优选氨基酸残基1至40、更优选氨基酸残基1至35、更优选氨基酸残基5至70、更优选氨基酸残基5至65、更优选氨基酸残基5至60、更优选氨基酸残基5至55、更优选氨基酸残基5至50、更优选5至45、更优选氨基酸残基5 至40、更优选氨基酸残基5至35、更优选氨基酸残基10至70、更优选氨基酸残基10至65、更优选氨基酸残基10至60、更优选氨基酸残基10至55、更优选氨基酸残基10至50、更优选10至45、更优选氨基酸残基10至40、更优选氨基酸残基10至35、更优选氨基酸残基15至70、更优选氨基酸残基15至65、更优选氨基酸肝炎的残基15至60、更优选氨基酸残基15至55、更优选氨基酸残基 15至50、更优选15至45、更优选氨基酸残基15至40、更优选氨基酸残基15至 35个，其中SEQ ID No.8-14分别属于HBV基因型B至H。
与至少一种乙肝病毒PreS多肽或其片段融合的至少一种肽与SEQ ID No. 1、SEQID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少92％、更优选地至少94％、更优选地至少96％、更优选地至少98％、更优选地至少99％、特别是100％的同一性。第一氨基酸序列与第二氨基酸的同一性程度可以使用某些算法通过这两个氨基酸序列之间的直接比较来确定。优选通过使用BLOSUM62矩阵，缺口存在罚分11 和缺口延伸罚分1的BLAST比对(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/；Altschul SFet al J.Mol.Bi ol.215(1990):403-410)测定序列同一性。
根据本发明的优选实施方案、PreS多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.5、 SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、 SEQ ID No.12或SEQ IDNo.13、最优选SEQ ID No.5是至少80％相同的。
待与至少一种上述肽融合的乙肝病毒PreS多肽与SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12或SEQ ID No.13具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少92％、更多优选至少94％、更优选至少96％、更优选至少98％、更优选至少99％、特别是100％的同一性。
根据本发明进一步优选的实施方案，至少一种肽与PreS多肽的N和/或C 端融合。
如本文所用，“与N和/或C端融合”是指至少一个肽与PreS多肽或其片段的N和/或C端融合。本发明的融合蛋白可以包含与PreS多肽或其片段的N端或其C端融合的一种或多种肽。
根据本发明的优选实施方案，融合蛋白包含与SEQ ID No.6至少80％相同的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白与SEQ ID No.6具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％，更优选至少99％，特别是100％的同一性。
本发明的融合蛋白可用于治疗和/或预防各种基因型及其亚型的HBV感染。乙肝病毒亚型包括A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、 C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4、D5、F1、F2、F3和F4，如Schaefer 等人(World J Gastroenterol 13(2007):14-21)讨论的。
根据本发明的另一个优选实施方案、乙肝病毒感染是由乙肝病毒基因型 A、B、C、D、E、F、G、H或其亚型引起的。优选使用相同基因型的HBV PreS 多肽或其片段来治疗和/或预防由该HBV基因型引起的HBV(例如HBV基因型A的PreS用于治疗/预防HBV基因型A或其亚型之一的感染)。由于已知参与 HBV感染的PreS多肽的那些部分中的保守氨基酸序列、当然也可以使用一种基因型的HBV PreS多肽或其片段来治疗/预防另一种HBV基因型的感染(例如HBV基因型A的PreS用于治疗/预防HBV基因型B、C、D、E、F、G和/或H 或其亚型的感染)。
本发明的融合蛋白可用于治疗和/或预防各种基因型及其亚型的HBV感染。乙肝病毒亚型包括A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2、B3、B4、B5、C1、 C2、C3、C4、C5、D1、D2、D3、D4、D5、F1、F2、F3和F4，如Schaefer 等人(World J Gastroenterol 13(2007):14-21)讨论的。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，将融合蛋白以0.01μg/kg体重至 5mg/kg体重，优选0.1μg/kg体重至2mg/kg体重的量至少一次施用于个体。根据本发明的进一步优选的实施方案，将融合蛋白以5至50μg，优选10至40μg，更优选15至30μg的量(不依赖于体重(即剂量可以包含15、20、25或30pg)或每 kg体重)施用于患者。
可以与赋形剂组合以产生单一剂型的融合蛋白的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而变化。融合蛋白的剂量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及在个体中引发期望的抗体响应的能力而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以每天施用几个分剂量，或者如治疗情况的紧急情况所示，可以按比例减少剂量。疫苗的剂量也可以变化，以根据情况提供最佳的预防剂量响应。例如，本发明的多肽和疫苗可以以几天、一周或两周或甚至数月的间隔施用于个体，这总是取决于乙肝病毒特异性IgG诱导的水平。
在本发明的优选实施方案中，本发明的融合蛋白施用2至10次，优选2至 7次，甚至更优选至多5次，最优选至多3次。在特别优选的实施方案中，后续接种疫苗之间的时间间隔选择为2周至5年，优选1个月-至多3年，更优选2 个月至1.5年。本发明的融合蛋白的重复施用可以最大化治疗的最终效果。
根据本发明的另一个优选实施方案，融合蛋白与至少一种佐剂和/或药学上可接受的赋形剂一起施用。
本发明的融合蛋白可以皮下、肌内、静脉内、粘膜等给药。取决于剂型和给药途径，本发明的融合蛋白可以与赋形剂、稀释剂、佐剂和/或载体组合。优选的佐剂是明矾。用于生产疫苗制剂的合适方案是本领域技术人员已知的并且可以参见例如“Vaccine Protocols”(A.Robinson，M.P.Cranage，M. Hudson；Humana Press Inc.，U.S；第2版，2003)中。
本发明的融合蛋白也可以与常规用于疫苗的其它佐剂一起配制。例如，合适的佐剂可以是MF59、磷酸铝、磷酸钙、细胞因子(例如IL-2、IL-12、 GM-CSF)、皂苷(例如QS21)、MDP衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、聚磷腈、乳剂(例如弗氏，SAF)、脂质体、病毒体、iscoms、cochleates、PLG 微粒、泊洛沙姆颗粒、病毒样颗粒、热不稳定性肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、突变体毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合脂质体。合适的佐剂例如以AS01B(脂质体制剂中的MPL和QS21)、AS02A、AS15、AS-2、AS-03及其衍生物(GlaxoSmithKline，USA)；CWS(细胞壁骨架)，TDM(海藻糖-6,6'-二霉菌酸酯)、LeIF(利什曼原虫延伸起始因子)、铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰基脂质A和quilA 可购得。细胞因子如GM-CSF或白细胞介素-2、-7或-12也可用作佐剂。用于主要引发Th1型应答的优选佐剂包括例如单磷酰脂质A，优选3-O-脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)，任选与铝盐的组合。WO98/43670中描述了包含单磷酰脂质A和表面活性剂的含水制剂。
另一种优选的佐剂是皂苷或皂苷模拟物或衍生物，优选QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.)，其可以单独使用或与其它佐剂组合使用。例如，增强系统涉及单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合，例如QS21和3D-MPL的组合。其它优选的制剂包含水包油乳剂和生育酚。一种特别有效的佐剂制剂是在水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。用于本发明的另外的皂苷佐剂包括 QS7(描述于WO 96/33739和WO 96/11711)和QS17(描述于US5,057,540和EP 0 362 279 B1中)。
本文公开的SEQ ID Nos具有以下氨基酸序列
Figure BDA0001622143250000061
Figure BDA0001622143250000071
Figure BDA0001622143250000081
然而，通过以下附图和实例进一步说明本发明，但不限于此。
图1显示PreS肽对来自不同基因型的比对PreS序列的分配。相同的氨基酸由点表示，Pre S1结构域包括氨基酸残基1至118，并且Pre S2结构域氨基酸残基119至173(还参见SEQ ID No.5)和氨基酸残基19至28(灰色框)在HBV的肝细胞附着和感染中起关键作用。
图2显示了免疫之前(左边的灰色柱形)和之后(右边的黑色柱形)，用PreS (n＝1；图2A)或20μg PreS-融合疫苗混合物(n＝2；图2B)免疫的兔的IgG应答。光密度值(y轴：405nm处的OD值)对应于针对PreS和PreS衍生的合成重叠肽 P1-P8的IgG水平(x轴)。结果表示来自一式三份测定的平均值及SD。
图3a 至3c 显示针对用PreS-融合疫苗混合物或安慰剂接种的受试者的 PreS(图3A)和合成的PreS衍生的重叠肽P1-P8(图3b 和3c )的IgG应答。显示了光密度值(y轴：OD值，一式三份测定的平均值)，对应于免疫前(V5)和免疫后不同时间点(V8和V15)用PreS-融合疫苗混合物(n＝22)或安慰剂(n＝8)免疫了的具有或没有在先乙肝疫苗接种的受试者中测量的针对PreS和肽P1-P8的 IgG水平。结果表示为平均值及SD，并且指示显著性差异(在V5、V8和V15 时所有PreS-融合疫苗混合疫苗接种的个体中)：*p<0.05，**p<0.01，***p <0.001。
图4显示用PreS-融合疫苗混合物(PreS-FVM)或安慰剂接种疫苗的受试者的PreS特异性抗体应答和存在于乙肝感染个体中的抗体。显示了光密度值(y- 轴：OD值)，对应于用安慰剂(n＝8)、20μg(n＝10)或40μg PreS-融合疫苗混合物(n＝12)免疫的受试者以及乙肝感染个体(n＝19)的PreS特异性的IgA，IgE，IgM，IgG和IgG亚类(IgG1-IgG4)水平(x轴)。图表显示了平均值及SD。显示了显著性差异：***p<0.001。
图5显示了针对用PreS-融合疫苗混合物(PreS-FVM)或安慰剂接种疫苗的受试者的PreS肽P1-P8特异性的IgG应答和存在于乙肝感染个体中的IgG。显示了光密度值(y轴：OD值)，其对应于在V15时用安慰剂(n＝8)，20μg(n＝10) 或40μg PreS疫苗混合物(n＝12)免疫的受试者以及乙肝感染个体(n＝19)的 PreS衍生肽(P1-P8)特异性IgG水平(x轴)。结果表示为平均值及SD。
图6显示PreS和肽特异性T细胞应答。图6A：在用PreS-融合疫苗混合物免疫的受试者(n＝19)中在不同时间点(x轴)通过[3H]胸苷掺入评估的PreS特异性PBMC增殖(y轴：刺激指数SIs)。指示平均值及SD和显著差异：*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001。图6B和图6C：在时间点M2时用PreS-融合疫苗混合物免疫的受试者的血液样品(n＝11)中用PreS肽(P1-P8)，PreS或等摩尔肽混合物(x-轴)刺激后增殖的CD4(B)和CD8(C)T细胞的百分比(y-轴)。结果表示为平均值及SD。
图7显示了基于体外培养的肝细胞的体外病毒中和测定中抗体诱导的对乙肝病毒感染的抑制。通过用含病毒中和抗体的抗血清预温育病毒实现的培养HepG2-hNTCP的乙肝感染抑制百分比(x轴)。图7A：Ma 18/7(阳性对照)，来自安慰剂处理的人受试者的血清，来自用PreS-融合疫苗混合物免疫后的人受试者的血清(n＝7)对病毒感染的抑制，所有受试者没有在先乙肝疫苗接种。图7B：通过来自用商业乙肝疫苗Engerix或PreS-融合疫苗混合物免疫的兔的血清抑制病毒感染。
图8显示了经历了用重组PreS或PreS-融合蛋白(PreS-F1-PreS-F4)作为弗氏完全佐剂中乳剂的免疫的新西兰白(New Zealand White,NZW)兔的血清中针对PreS的总血清IgG的比较。x轴表示血清稀释度，在y轴上指示在405nm 测量的OD值。一式两份测定实验。
实施例
实施例1：重组PreS的表达和纯化，PreS重叠肽的合成，序列比对
已经在大肠杆菌BL21(DE3，Stratagene，USA)中表达和纯化了六组氨酸标记的重组PreS蛋白(PreS1+PreS2(SEQ ID No.5；基因型A；adw2亚型，源自GenBank：AAT28735.1)，如Niespodziana K等人(J Allergy Clin Immunol 127(2011):1562-70)中所述。
通过Fmoc(9-芴基甲氧基羰基)(用HBTU[2-(1H-苯并三唑-1-基)1,1,3,3 四甲基脲鎓六氟磷酸盐]活化(CEM-Liberty,Matthews,NC；Applied Biosystems,Lifetechnologies,USA)的策略)合成八个长度约为30个氨基酸且跨越PreS(基因型A，adw2亚型；表A；图1)完整序列的10个氨基酸重叠的肽。
表A：
Figure BDA0001622143250000101
(肽的重叠区加下划线)
肽通过制备型HPLC纯化并且其身份通过质谱法(Microflex MALDI-TOF，Bruker，USA)确认。
PreS基因型A，血清型adw2序列及其肽序列与HBV基因型B-H的比对使用来自HBV数据库(HBVdb：https://hbvdb.ibcp.fr/HBVdb/HBVdbIndex)的参考序列用CLUSTAL W进行(Hayer J等人，Nucleic Acids Res 2012；gks1022)(见图1)。
实施例2：免疫兔
使用弗氏完全佐剂(CFA)进行第一注射和不完全弗氏佐剂(IFA)进行第二和第三次注射用纯化的PreS(每次注射200μg)免疫新西兰白兔来产生针对重组PreS的特异性兔抗体(Charles River,Germany)。另外，使用Al(OH)3作为佐剂用含有20μg(n＝2)或40μg(n＝2)的四种PreS疫苗混合物组分(PreS疫苗混合物-20/PreS疫苗混合物-40)中的每一种的混合物免疫新西兰白兔三次。四种 PreS疫苗混合物组分包括具有以下氨基酸序列的PreS融合蛋白PreSFl， PreSF2，PreSF3和PreSF4：
PreSF1(SEQ ID No.22)
MVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESKVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADT SYESKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHW PAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPTPI SPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSI SARTGDPVTNVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESKVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADTSYESK
PreSF2(SEQ ID No.23)：
MFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEEFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIG ATYAPEEGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKD HWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSGRQPT PISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHIS SISARTGDPVTNFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEEFRFLTEKGMKNVFDDVVPEKYTIGATYAPEE
PreSF3(SEQ ID No.6)：
MEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVA ATAANAAPANDKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDF NPIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQS GRQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNI ASHISSISARTGDPVTNADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYR
PreSF4(SEQ ID No.24)：
MGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKGKATTEEQKLIEDVNASFRAAM ATTANVPPADKGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFN PIKDHWPAANQVGVGAFGPGLTPPHGGILGWSPQAQGILTTVSTIPPPASTNRQSG RQPTPISPPLRDSHPQAMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIA SHISSISARTGDPVTNGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADKGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVPPADK
此外，通过用市售即用预充式注射器以一个月的间隔免疫新西兰白兔(n ＝2)三次来获得对注册乙肝疫苗ENGERIX-B特异性的兔抗体。
在免疫前和第三次免疫后约4周时获得血清样品，并储存于-20℃直至分析。
用PreS疫苗混合物免疫显示出对顺序PreS表位具有特异性的IgG抗体的诱导。图2显示了用CFA配制的PreS或氢氧化铝吸附的PreS疫苗混合物对兔诱导的PreS和合成的PreS衍生的肽的IgG抗体应答的比较(图2B)。用CFA配制的 PreS诱导的兔抗体识别PreS和除P7之外的每种PreS衍生的肽(图2A)。20μg剂量的氢氧化铝吸附的PreS疫苗混合物诱导PreS特异性IgG抗体和主要针对N 端肽P1，P2，肽P6和针对C端肽P8的IgG抗体(图2B)。免疫前在兔中未发现 PreS或肽特异性IgG应答(图2，左侧柱)。
实施例3：PreS-和PreS肽特异性体液免疫应答的评估
从已经接受Al(OH)3吸附的PreS疫苗混合物(即，10、20或40μg每种PreS 疫苗混合物组分的混合物或安慰剂，即Al(OH)3)的三次注射的患者获得血清样品。在第三次免疫之前和之后四周收集血清，并储存于-20℃直至使用。第二组血清样品获自在两年期间用Al(OH)3吸附的PreS疫苗混合物(即，20或 40μg的每种PreS疫苗混合物组分的混合物或Al(OH)3作为安慰剂)的七次皮下注射治疗的患者。此外，从根据临床数据，肝功能检测和HBV血清标志物诊断患有乙肝感染的患者获得血清样品。
对分析的所有血清筛选HBV血清学标志物(即乙肝表面抗原[HBsAg]；针对乙肝表面抗原的抗体[抗-HBs]以及针对乙肝核心抗原的抗体[抗HBc]。
用抗原(重组PreS，合成PreS-重叠肽：P1-P8)或人血清白蛋白(阴性对照)(Behring，USA)包被ELISA板(NUNC
Figure BDA0001622143250000121
Denmark)。用1:10,000 (CFA)或1:500(PreS疫苗混合物-20/PreS疫苗混合物-40)稀释的兔血清进行温育，小鼠血清以1:1,000的稀释度稀释并且人血清针对同种型和IgG亚类以不同的方式稀释。为了检测人类总IgG，以1:100稀释血清，对于IgA，IgG1，IgG2， IgG3，IgG4以及IgM将血清以1:20稀释，并且为了检测IgE抗体，将血清以1:10 稀释。
用1:2,500(GE Healthcare，Buckinghamshire，Great Britain)稀释的驴抗兔辣根过氧化物酶缀合的IgG抗体检测兔IgG。用1:1,000稀释的单克隆大鼠抗小鼠IgG1(BDPharmingen，USA)，随后用1:2,500稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗大鼠IgG抗体(Amersham Biosciences，Sweden)检测结合的小鼠 IgG1。
用1:10,000稀释的兔抗人IgG Fc-特异性抗体(Jackson-Dianova， Germany)，然后用以1:2,500稀释的过氧化物酶连接的驴抗兔IgG(GE Healthcare)检测人IgG。分别用以1:1,000稀释的纯化的小鼠抗人IgA1/IgA2， IgG1，IgG2，IgG4和IgM(BD Pharmingen)抗体，然后用以1:2,500稀释的过氧化物酶连接的绵羊抗小鼠IgG(GE Healthcare)检测人IgA，IgG亚类IgG1， IgG2和IgG4以及人IgM。单克隆抗人IgG3(Sigma Aldrich，USA)以1:5,000稀释。用山羊抗人辣根过氧化物酶缀合的IgE抗体(KPL，USA)检测人IgE。
实施例4：PreS疫苗混合物免疫受试者的PreS特异性抗体应答不受先前乙肝免疫 力的影响
对接受用PreS疫苗混合物或安慰剂的免疫疗法的人受试者的血清样品测试对PreS和合成PreS肽的IgG反应性(图3a至3c)。这些患者(n＝30)在治疗前已经筛选出乙肝特异性血清标志物(HBsAg，抗-HBs和抗-HBc抗体)，并发现其对HBsAg和抗-HBc抗体呈阴性。由于先前用乙肝疫苗接种疫苗，22名受试者含有抗-HB抗体(图3a至3c)。发现每个用PreS疫苗混合物接受免疫治疗的患者(无论他们之前是否接受过HB疫苗接种)，而不是用安慰剂治疗的患者在第三次注射后(V8，第一次注射后三个月)以及第七次注射后(V15；第一次注射后15个月)测试血清时发展了强烈的PreS特异性IgG应答(图3a至3c)。PreS 特异性IgG应答在免疫治疗前从基线显著增加(即V5对V8)，并在V8和V15之间(即第七次注射后)显著进一步增加(图3a至3c)。这些患者中的PreS特异性 IgG应答主要针对N端肽P1，P2和P3，并且再次PI和P2特异性IgG应答显示从基线V5至V8以及从V8至V15显著增加(图3a到3c)。在来自接受用PreS疫苗混合物的免疫疗法的患者，而不是安慰剂治疗的患者中的血清中也发现针对其它PreS衍生肽P4，P5，P6，P7和P8的IgG应答增加(图3a至3c)。
实施例5：PreS疫苗混合物免疫受试者的PreS特异性抗体应答针对中和表位并且 不同于乙肝感染个体的那些
图4显示用PreS疫苗混合物或安慰剂免疫治疗后患者的PreS特异性同种型和IgG亚类应答与乙肝感染个体的那些应答的比较。两种剂量的PreS疫苗混合物的免疫治疗在每个治疗的患者中诱导了强烈的PreS特异性IgG应答，其显著高于乙肝感染个体中的IgG应答(图4)。在用PreS疫苗混合物或安慰剂治疗的患者以及乙肝感染个体的血清中未检测到相关的PreS特异性IgA，IgE 或IgM应答(图4)。PreS特异性IgG亚类应答在PreS疫苗混合物治疗的受试者和乙肝感染个体之间不同。PreS疫苗混合物治疗的受试者显示对PreS的优先IgG1和IgG4亚类应答，而乙肝感染个体引发针对PreS的一些IgG1和IgG2应答 (图4)。
还发现PreS疫苗混合物治疗的患者与乙肝病毒感染的个体中就PreS特异性抗体的表位特异性而言的显著差异(图5)。PreS疫苗混合物免疫的患者，而不是乙肝感染的个体对PI和P3显示出强烈的IgG应答(图5)。此发现是令人惊讶的，因为由PI定义的区域对应于PreS1内的基序(也参见图1)，据报道该基序含有抑制乙肝感染的必需残基。此外，P7仅被PreS疫苗混合物治疗的受试者，而不是乙肝感染的个体识别，而在乙肝感染的个体中也发现针对P2和P6 的IgG应答(图5)。
实施例6：评估T细胞应答
通过使用Ficoll(Amersham Biosciences，Swden)的密度梯度离心从肝素化血液样品获得外周血单个核细胞(PBMC)。当可以获得血液样品时，在V5， V8，M1(第一次疫苗接种后5个月)和M2(第一次疫苗接种后17个月)通过[3H]- 胸苷掺入在PreS疫苗混合物接种疫苗的受试者(n＝19)中测定PreS特异性 PBMC增殖。
对于某些PreS疫苗混合物免疫的患者(n＝11)，可以通过羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记在M2时评估CD4和CD8T细胞应答。
将荧光染料标记的细胞以200,000个细胞/孔接种到带有U形底部的96孔微板(Thermo Fisher，USA)中总体积200μl补充有2mmol/L L-谷氨酰胺(Sigma Aldrich，USA)，50mmol/Lβ-巯基乙醇(Sigma Aldrich)和0.02mg庆大霉素/毫升(Sigma Aldrich)的UltracultureTM无血清培养基(Lonza,Belgium)中。将细胞保持未刺激(阴性对照)或者用作为阳性对照的
Figure BDA0001622143250000141
人T-活化剂 CD3/CD28(3μg/孔(Invitrogen，USA))或用PreS(0.15μg/孔)，等摩尔量的PreS 重叠肽(0.03μg/孔)或用含有0.03μg/孔每种肽的PreS衍生的重叠肽的混合物刺激，并在37℃，5％CO2下培养7天，然后进行抗体染色和FACS分析。
对于流式细胞术，使用以下试剂：
PerCP/Cy5.5抗人CD3抗体(Clone HIT3a)，Brilliant Violet 421TM抗人CD4 抗体(Clone RPA-T4)，APC抗人CD8a抗体(Clone HIT8a)以及同种型对照，即 PerCP/Cy5.5小鼠IgG2a，Brilliant Violet 421TM小鼠IgG1，APC小鼠IgG1 (BioLegend，USA)和FixableViability
Figure BDA0001622143250000151
780(eBioscience，USA)。
流式细胞术在BD FACS Canto II(Becton，Dickinson and Company，USA) 上进行。每个样品获得2万个事件并通过FlowJoSoftware版本10进行分析。根据正向和侧向散射点印迹上的形态学标准对淋巴细胞进行门控，通过活力染料的染色排除死细胞，并且门控集中在CD3CD4和CD3CD8阳性T细胞上。那些响应抗原刺激而增殖的细胞通过其CFSE荧光强度降低来鉴定。结果代表一式三份培养物的平均值，并且对于不同的抗原和分析的患者，显示高于背景的CD3+CD4+和CD3+CD8+的235个中值百分比刺激。
图6显示了接受用PreS疫苗混合物的免疫治疗的患者中PreS特异性T细胞应答的发展。发现逐渐增加的PreS特异性T细胞应答，其在V8，M1和M2 时显著高于V5时的基线(图6A)。当通过CFSE染色分析PreS特异性CD4细胞应答的表位特异性时，我们发现P1，P2，P5和P6诱导最强的CD4细胞增殖，但还发现了对P3，P4和P7的CD4应答(图6B)。有趣的是，肽和肽混合物比PreS 蛋白诱导更强的CD4细胞增殖(图6B)。尽管频率较低，但检测到一些PreS和PreS肽特异性CD8细胞应答，其主要针对P2，P3，P6和P8以及完整的PreS(图6B)。
实施例7：乙肝病毒中和测定
使用肝素柱(GE Healthcare，Great Britain)分离病毒颗粒从HepAd38细胞的上清液制备用于感染的HBV接种物。将HepG2-hNTCP细胞20以3x105个细胞/孔的密度接种在24孔板中。在接种后的第二天，感染培养基(DMEM， Invitrogen，USA)补充有2.5％DMSO(Merck，Germany)，第三天用HBV感染细胞。为了中和HBV颗粒，在37℃下将患者的血清(10μl)与HBV接种物 (6.9x107个基因组当量(GE)/孔)一起预温育30分钟，然后将细胞与患者血清和病毒在4％聚乙二醇800(Sigma Aldrich，USA)存在下在37℃下共温育16小时。中和单克隆抗体Ma18/721用作阳性对照。
接种16小时后，用PBS充分洗涤细胞并加入补充有2.5％DMSO(Invitrogen) 的新鲜分化培养基。在感染后第三天和第五天进行另外的培养基更换。
通过在感染后第5天至第7天测量细胞上清液中分泌的乙肝e抗原 (HBeAg)进行HBV感染的定量。HBeAg由ADVIA Centaur XPT自动化学发光系统(Siemens，Germany)测定。在高于1指数的信号下，认为样品是阳性的。
通过特异性免疫荧光检测HBV核心蛋白的表达。除去上清液，并用PBS 洗涤细胞，之后用4％多聚甲醛(Sigma Aldrich)在室温(RT)下固定30分钟。接下来，用PBS洗涤细胞，随后在RT下用PBS中的0.25％Triton X 100(AppliChem GmbH，Germany)透化30分钟。然后，将细胞在4℃用2％w/v BSA，PBS稀释的一抗(抗HBV核心，兔多克隆AK，DAKO DeutschlandGmbH，Hamburg， Germany)温育过夜。次日，用PBS洗涤细胞，并最终与二抗(山羊α兔Alexa488；Invitrogen，Carlsbad，CA)和4’,6-二脒-2-phenylindo/Hoechst 33342(RocheApplied Science，Germany)在黑暗中温育。为了检测HBV核心蛋白，二抗在室温避光温育2小时。在荧光显微镜下使用480nm(用于Alexa-488标记的二抗 (Invitrogen，Carlsbad，CA))和360nm(用于核染色)检查细胞。
在第一种类型的测定中，通过特异性免疫荧光检测细胞感染后乙肝核心抗原(HBeAg)的表达。在未感染的细胞中未检测到HBeAg，但在感染的且未处理的细胞中检测到HBeAg，并且可以通过病毒与针对大乙肝表面蛋白的 Pre S1结构域的中和性单克隆抗体Ma18/721的预温育预防表达。同样发现乙肝病毒与商业疫苗Engerix-B诱导的兔抗体或兔抗PreS疫苗混合物(20μg剂量) 抗体预温育抑制HepG2-hNTCP细胞的感染。使用来自PreS疫苗混合物或安慰剂治疗的患者的血清进行类似的一组实验。在用安慰剂免疫之前和之后从患者获得的血清不抑制HepG2-hNTCP细胞的感染，而用20μg免疫后从患者获得的血清或者在用40μg免疫后从患者获得的血清抑制HepG2-hNTCP细胞的感染。
除了HBcAg的染色之外，在用HBV感染后七天使用基于HepG2-hNTCP 细胞测量分泌的乙肝e抗原(HBeAg)的测定作为另一替代标志物以量化对 HBV感染的抑制。发现来自PreS疫苗混合物处理者的血清抑制50-99％的HBV 感染(图7A)。根据PreS疫苗混合物注射的剂量和次数，没有发现相关差异，因为对接受了三次注射的患者的血清(图7A)以及来自接受了七次注射的患者的血清(图7A，黑色)观察到相似的抑制作用。而且，接受20μg或40μg剂量的PreS疫苗混合物的患者之间的抑制程度没有明显差异(图7A)。对安慰剂治疗的患者的血清没有观察到抑制，并且观察到单克隆抗体Ma 18/7的超过90％抑制(图7A)。兔抗Engerix-B和兔抗PreS疫苗混合物抗体引起超过99％的HBV 感染抑制(图7B)。
实施例8：
将重组PreS和作为阴性对照的人血清白蛋白(Behring，USA)在4℃下在 100mM磷酸钠缓冲液(pH 9.6)中以2μg/ml的浓度包被到Nunc Maxisorb微板 (Thermo-FisherScientific，USA)上过夜。洗涤缓冲液由PBS，0.05％v/v Tween20(PBS/T)构成，封闭程序用2％w/v BSA，PBS/T在37℃下进行2小时。所有随后的血清和试剂稀释均在0.5％w/v BSA，PBS/T中完成。
为了确定经过用重组PreS或PreS-融合蛋白作为完全弗氏佐剂(CFA)中的乳剂的完全免疫的兔的体液免疫应答，以不同稀释度使用血清(4℃，过夜)，用1:2.000稀释的驴抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(GE Healthcare，Great Britain)检测结合的总兔IgG。通过ABTS[2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6- 磺酸)诱导显色反应，并且在405nm和490nm下使用微板阅读器(Molecular Devices，USA)进行吸光度检测，其对应于抗原特异性抗体的水平。所有的测定一式三份进行。
令人惊讶地证明，仅包含一种或多种具有氨基酸序列SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和/或SEQ ID No.4的肽和PreS(PreS-F3)的融合蛋白与单独的PreS或其它融合蛋白相比能够以高得多的程度诱导PreS特异性IgG的形成，所述其它融合蛋白也包含与不同肽(PreS-F1，PreS-F2，PreS-F4)融合的PreS，如图8所示。
Figure IDA0001622143300000011
Figure IDA0001622143300000021
Figure IDA0001622143300000031
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Figure IDA0001622143300000311
Figure IDA0001622143300000321
Figure IDA0001622143300000331
Figure IDA0001622143300000341

Claims (8)

1.融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防乙肝病毒感染，其中所述融合蛋白包含乙肝PreS多肽，其与由SEQ ID No. 1组成的肽、由SEQ ID No. 2组成的肽、由SEQ ID No. 3组成的肽和由SEQ ID No. 4组成的肽融合。
2.根据权利要求1的用途，其中所述PreS多肽的氨基酸序列由SEQ ID No. 5组成。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述由氨基酸序列SEQ ID No. 1、SEQ IDNo.2、 SEQ ID No. 3 和SEQ ID No. 4组成的肽与所述PreS多肽的N和/或C端融合。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述融合蛋白由SEQ ID No. 6的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述乙肝病毒感染是由乙肝病毒基因型A、B、C、D、E、F、G、H或其亚型引起的。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中以0.01μg/kg体重至5mg/kg体重的量至少一次对个体施用所述融合蛋白。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述融合蛋白与至少一种佐剂和/或药学上可接受的赋形剂一起施用。
8.根据权利要求1或2所述的用途，其中以0.1μg/kg体重至2mg/kg体重的量至少一次对个体施用所述融合蛋白。
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