JP2017527256A - ＨＢＶ及びウイルス性疾患及び障害のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的配列の配列及び／又は活性を操作するための系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング及び最適化を提供する。送達部位が標的化される送達系及び組織又は臓器が提供される。また、ベクター及びベクター系であって、その一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分をコードする、ベクター及びベクター系、並びにこのようなベクターの設計及び使用方法も提供される。また、標的認識に対する特異性の増強及び毒性の回避を確実にし、かつ目的のゲノム遺伝子座における標的部位を編集又は改変して疾患状態又は病態を変化又は改善するために、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導する方法も提供される。

Description

関連出願及び参照による組み入れ
本出願は、２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，３０１号明細書、及び２０１４年６月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０１０，３２９号明細書からの優先権を主張するものである。

上記の出願、及びこれらの出願で引用される又はこの若しくはこれらの出願の審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、及びこの出願引用文献において引用又は参照される全ての文献、及び本明細書において引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書の引用文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書において又は本明細書での参照により組み入れられる任意の文献において述べられる任意の製品についての任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。

本発明は、一般に、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分が関係する配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えばゲノム摂動又は遺伝子編集に用いられる系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング、最適化及び治療適用に関する。詳細には、本発明は、哺乳動物を含めた動物においてゲノム編集によって治療利益が得られるようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ系、方法、及び組成物に関する。

連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から授与されたＮＩＨパイオニアアワード（ＮＩＨ Ｐｉｏｎｅｅｒ Ａｗａｒｄ）（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。記載したプロジェクトは、国立総合医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの授与番号Ｔ３２ＧＭ００７７５３により支持された。

ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより原因遺伝子変異体の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、並びに合成生物学、バイオテクノロジー用途、及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼが、標的化されるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数の位置を標的化しやすい新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は特定の配列を標的化するためにカスタム化タンパク質の生成を必要としないが、単一のＣａｓ酵素を短いＲＮＡ分子によりプログラムして、特定のＤＮＡ標的を認識することができる。ゲノムシークエンシング技術及び分析法のレパートリーにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を追加することにより、方法論が著しく簡単になり、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が加速され得る。有害な影響を伴わずにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をゲノム編集に利用するために、特許請求される本発明の態様であるこれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリング、最適化及び細胞型／組織／臓器特異的な送達の態様を理解することが重要である。

多様な用途の核酸配列標的化のための代替的でロバストな系及び技術が早急に必要とされている。本発明の態様は、特に、宿主ゲノムへのウイルスの組込みに起因して、そして／あるいはエピソーム形態の維持によって持続するウイルス感染（例えば、共有結合閉環状ＤＮＡ又はｃｃｃＤＮＡと呼ばれる長寿命のエピソーム二本鎖ＤＮＡ形態によりヒト肝細胞の核内で並外れた持続性を保持するＢ型肝炎ウイルス、ＨＢＶ）の処置に関して、この必要性に対処し、関連する利点を提供する。本出願人は、ウイルスのこのエピソーム形態（ｃｃｃＤＮＡ：細胞核内でＨＢＶの増殖の間に生じ、感染した対象に永久に存在し続けることができるｄｓＤＮＡ構造）を直接切断し、その存在量を低減することが可能であることを示した。

例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。

一態様では、本発明はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、種々の組織及び臓器における多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含む様々な種類の有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子又はゲノム編集、遺伝子療法、創薬、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。

本発明の態様は、野生型Ｃａｓ９酵素よりも長さが短く、最適活性を有するガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系において改善された標的特異性を有するＣａｓ９酵素、及びそれをコードする核酸分子、並びにキメラＣａｓ９酵素と、Ｃａｓ９酵素の標的特異性の改善方法又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の設計方法であって、最適活性を有するガイドＲＮＡを設計若しくは調製するステップ、及び／又は野生型Ｃａｓ９よりも小さいサイズ又は長さを有するＣａｓ９酵素を選択若しくは調製する（これにより、野生型Ｃａｓ９と比べて、送達ベクターにおけるそのコーディングが少ないので、これをコードする核酸の送達ベクター内へのパッケージングはより促進される）ステップ、及び／又はキメラＣａｓ９酵素を作成するステップを含む方法とに関する。

また、本発明の配列、ベクター、酵素又は系の、医薬における使用も提供される。また、遺伝子又はゲノム編集におけるこれらの使用も提供される。

本発明の付加的な態様では、Ｃａｓ９酵素は１つ以上の突然変異を含むことができ、機能ドメインとの融合の有無にかかわらず、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよいし、機能獲得型又は機能喪失型の突然変異であってもよい。突然変異には、それぞれＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の１つにおける突然変異が含まれ得るが、これらに限定されない。さらなる突然変異が特徴付けられている。本発明の一態様では、転写活性化ドメインはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様では、転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。本発明の他の態様は、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能なドメイン又は化学誘導性／制御可能なドメインを含むがこれらに限定されないドメインに融合した突然変異Ｃａｓ９酵素に関する。

さらなる実施形態では、本発明は、突然変異ｔｒａｃｒＲＮＡ及び直接反復配列、又は細胞内のこれらのＲＮＡの性能の増強を可能にする突然変異キメラガイド配列を作成する方法を提供する。また本発明の態様は、前記配列の選択も提供する。

また本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分のクローニング及び送達を単純化する方法も提供する。本発明の好ましい実施形態では、適切なプロモーター、例えばＵ６プロモーターなどはＤＮＡオリゴにより増幅され、ガイドＲＮＡに付加される。得られたＰＣＲ産物は、次に細胞内にトランスフェクトされ、ガイドＲＮＡの発現を駆動することができる。また本発明の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されるか、又は合成会社に注文されて直接トランスフェクトされるガイドＲＮＡにも関する。

一態様では、本発明は、より活性なポリメラーゼの使用によって活性を改善するための方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｔ７プロモーターの制御下でのガイドＲＮＡの発現は、細胞内のＴ７ポリメラーゼの発現によって駆動される。有利な実施形態では、細胞は真核細胞である。好ましい実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。より好ましい実施形態では、ヒト細胞は患者特異的細胞、例えば、患者から取り出された細胞（これは、例えば患者への再投与のために改変され、そして／あるいは細胞集団又は改変細胞集団に拡大され得る）である。

一態様では、本発明は、Ｃａｓ酵素の毒性を低減する方法を提供する。特定の態様では、Ｃａｓ酵素は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９、例えば任意の天然に存在する細菌Ｃａｓ９、及び任意のキメラ、突然変異体、ホモログ又はオルソログである。一態様では、Ｃａｓ酵素はニッカーゼである。好ましい実施形態では、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡの形態で細胞内に送達される。これは酵素の一過性発現を可能にし、それにより毒性が低下する。別の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９酵素をコード及び発現するヌクレオチド構築物において細胞内に送達される。別の好ましい実施形態では、本発明は、誘導性プロモーターの制御下でＣａｓ９を発現させる方法、及びそこで使用される構築物も提供する。

別の態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のｉｎ ｖｉｖｏ適用を改善する方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｃａｓ酵素は野生型Ｃａｓ９であるか、あるいは任意の天然に存在する細菌Ｃａｓ９及び任意のキメラ、突然変異体、ホモログ又はオルソログを含む本明細書に記載される改変型のいずれかである。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインの１つにおける１つ以上の突然変異を含む。一態様では、Ｃａｓ酵素はニッカーゼである。本発明の有利な態様は、送達のためにウイルスベクター内に容易にパッケージングされるＣａｓ９ホモログの選択を提供する。Ｃａｓ９オルソログは、通常、３〜４のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは相補鎖を切断する。全ての表記はガイド配列を参照する。

５’ＲｕｖＣドメイン内の触媒残基は、目的のＣａｓ９と、他のＣａｓ９オルソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するもの）との相同性比較によって同定され、保存Ａｓｐ残基（Ｄ１０）がアラニンに突然変異されて、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に転換される。同様に、ＨＮＨドメイン内の保存Ｈｉｓ及びＡｓｎ残基はアラニンに突然変異され、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に転換される。一部の実施形態では、両方の突然変異セットが作製され、Ｃａｓ９が非切断酵素に転換され得る。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。好ましいＣａｓ酵素は、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大ヌクレアーゼに対する相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指すことができるときにＣａｓ９と同定され得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からのものである、あるいはこれらに由来する。由来とは、本出願人によると、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で大部分は野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載されるように何らかの形で突然変異（改変）されていることを意味する。

他に明白でない限り、Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という用語が一般に本明細書では互換的に使用されることは認識されるであろう。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を参照する。しかしながら、本発明がＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９など、他の微生物種由来のさらに多くのＣａｓ９を含むことは認識されるであろう。さらなる例は本明細書において提供される。当業者は、関連のアミノ酸配列の比較によって、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ９酵素における適切な対応する残基を決定することができるであろう。従って、ＳｐＣａｓ９付番を用いて特定のアミノ酸置換が参照される場合、これが他のＣａｓ９酵素を指すように意図されていないことが内容により明らかでない限り、本開示は、他のＣａｓ９酵素における対応する改変も包含することが意図される。

コドン最適化配列の一例は、この場合にはヒトに最適化されている（すなわち、ヒトでの発現のために最適化されている）が、本明細書において提供されている（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照）。これが好ましいが、他の例も可能であり、宿主種に対するコドン最適化が既知であることは認識されるであろう。

さらなる実施形態では、本発明は、キメラＣａｓ９タンパク質を作成することによってＣａｓ９の機能を増強する方法を提供する。キメラＣａｓ９タンパク質キメラＣａｓ９は、２つ以上の天然に存在するＣａｓ９由来の断片を含有する新規のＣａｓ９であってもよい。これらの方法は、１つのＣａｓ９ホモログのＮ末端断片と、別のＣａｓ９ホモログのＣ末端断片との融合を含み得る。またこれらの方法は、キメラＣａｓ９タンパク質により示される新規特性の選択も可能にする。

本発明の方法において、生物が動物又は植物である場合、改変はｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養において起こり得ること、及び場合によりｉｎ ｖｉｖｏでは起こり得ないことが認識されるであろう。他の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。

一態様では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列（例えば、組み込まれたウイルス配列）の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、本方法は、
（Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
を含むか、或いは、
（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
［転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む。

ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又はｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てはＲＮＡであり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又はｔｒａｃｒ配列をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡであってもよく、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達され得る。

ポリヌクレオチドが言及され、そのポリヌクレオチドがＲＮＡであり、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列などの特徴を「含む」と言われる場合、ＲＮＡ配列がその特徴を含むことは認識されるであろう。ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列などの特徴を含むと言われる場合、ＤＮＡ配列は問題の特徴を含むＲＮＡに転写されるか、又は転写され得る。特徴がＣＲＩＳＰＲ酵素などのタンパク質である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は翻訳されるか、又は翻訳され得る（ＤＮＡの場合には、最初に転写される）。

従って、特定の実施形態では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって、生物、例えば、ヒトを含む哺乳類又は非ヒト哺乳類若しくは生物を改変する方法を提供し、本方法は、その発現のために組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルス又はプラスミドベクターを含むウイルス又はプラスミドベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、一部の実施形態はＮＬＳを含まないこともあるので、任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩが同じベクターに位置し、構成成分ＩＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、構成成分ＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、構成成分Ｉは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩのそれぞれが異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載されるウイルス又はプラスミドベクター系も提供する。

好ましくは、ベクターはレンチウイルス又はバキュロウイルス又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターであるが、他の送達手段（例えば、酵母系、微小胞、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に結合する手段など）も知られており、提供されている。一部の実施形態では、ウイルス又はプラスミドベクターの１つ以上がリポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達され得る。

標的配列の操作とは、本出願人によると、標的配列の後成的操作も意味する。これは、標的配列のメチル化状態の改変（すなわち、メチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧアイランドの付加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への到達性の増大又は低減、又は３次元の折り畳みの促進などによる、標的配列のクロマチン状態の操作であり得る。しかしながら、ウイルス感染の処置に関しては、組み込まれたウイルスゲノム配列の切除が最も興味深い操作である。

目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によりヒトを含む生物若しくは哺乳類又は非ヒト哺乳類若しくは生物を改変する方法が言及される場合、これが、生物（又は哺乳類）に全体として適用されてもよいし、あるいはその生物に由来する単一の細胞又は細胞集団だけに適用されてもよいことは認識されるであろう。例えば、ヒトの場合、本出願人は特に単一の細胞又は細胞集団を想定し、これらは好ましくはｅｘ ｖｉｖｏで改変され、次に再導入され得る。この場合、バイオプシー又は他の組織若しくは生体液サンプルが必要となり得る。これに関して、幹細胞も特に好ましい。しかしながら、当然ながらｉｎ ｖｉｖｏ実施形態も想定される。

特定の実施形態では、本発明は、それを必要としている対象（例えば、哺乳類又はヒト）又は非ヒト対象（例えば、哺乳類）において目的のゲノム遺伝子座に組み込まれたウイルス配列の存在によって引き起こされる病態の治療又は阻害方法であって、組み込まれたウイルス配列中の標的配列の操作による対象又は非ヒト対象の改変を含む方法を提供する。この病態は、その発現のために組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含むＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む治療の提供を含む標的配列の操作による治療又は阻害に対して感受性であり、標的配列は、発現時に組成物によって操作される。この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、一部の実施形態はＮＬＳを含まないこともある、すなわちゼロ個のＮＬＳもあり得るが、有利にはゼロよりも多いＮＬＳ、例えば１つ以上、又は有利には２つ以上のＮＬＳが存在し、従って、本発明は０、１、２、３、又はそれ以上のＮＬＳが存在する実施形態を包含するので、任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩが同じベクターに位置し、構成成分ＩＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、構成成分ＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩが同じベクターに位置し、構成成分Ｉは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩのそれぞれが異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載されるウイルス（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス）ベクター系も提供する。従って、送達は、ウイルスベクターなどのベクター、例えば組換えウイルスベクター送達系によって行うことができ；そしてこの系はＡＡＶ又はレンチウイルスであり得る、又はＡＡＶ又はレンチウイルスに由来し得る（例えば、外来性、異種であるもの、又はそのウイルスに対して相同若しくはネイティブでないものを発現する組換えＡＡＶ又はレンチウイルスは、そのウイルスが親ウイルスに「由来する」と考えることができる）。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターはレンチウイルス由来のベクターである。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターは、植物で使用するためのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉ又はＲｉプラスミドである。

生物又は対象は、真核生物（ヒトを含む哺乳類を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳類である。一部の実施形態では、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよいし、線虫であってもよい。本発明の一部の方法では、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法では、生物又は対象は哺乳類又は非ヒト哺乳類である。非ヒト哺乳類は、例えば、齧歯類（好ましくは、マウス又はラット）、有蹄動物、又は霊長類であり得る。本発明の一部の方法では、生物又は対象は植物又は藻類（微細藻類を含む）である、又は真菌である。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターはＡＡＶ又はレンチウイルスであり、本明細書に記載されるベクター系の一部であり得る。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。本発明の一部の方法では、ガイド配列の発現はＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によって駆動される。本発明の一部の方法では、ガイド配列の発現はＵ６プロモーターの制御下にある。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインの１つに１つ以上の突然変異を含む。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９ニッカーゼである。

本発明は、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを細胞に送達するステップを含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素の送達方法を包含する。これらの方法のいくつかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。これは酵素の一過性発現を可能にし、それにより毒性が低下する。別の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９酵素をコード及び発現するヌクレオチド構築物において細胞内に送達される。

また本発明は、本発明のベクター系、特に本明細書に記載されるウイルスベクター系の調製方法も提供する。本発明は、一部の実施形態では、ＡＡＶをコードする核酸分子を含有するか、又は本質的にこれらからなるプラスミドをＡＡＶ感染細胞にトランスフェクトするステップと、ＡＡＶの複製及びパッケージングに不可欠なＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐを供給するステップとを含む、本発明のＡＡＶの調製方法を包含する。一部の実施形態では、ＡＡＶの複製及びパッケージングに不可欠なＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐは、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスを細胞にトランスフェクトすることによって供給される。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスはポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。一部の実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。そして一部の実施形態では、細胞は昆虫細胞であり、ヘルパーウイルスはバキュロウイルスである。他の実施形態では、ウイルスはレンチウイルスである。

植物において、ウイルス病原体は宿主特異的であることが多いが、これは常に当てはまるわけではない。例えば、カンキツトリステザ（ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ）ウイルスは柑橘属の少数の種にだけ感染するが、キュウリモザイク（ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ）ウイルスは８５の植物ファミリーの１０００を超える種に感染する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗するための現存の誘発性の防御を有するが、本発明は、植物からウイルス感染を排除するための新しい方法を提供する。

本発明はさらに、医薬において、又は治療において使用するための、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を包含する。一部の実施形態では、本発明は、本発明に従う方法で使用するための、本発明に従う組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸分子、例えばｍＲＮＡ）を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集における、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子又はゲノム編集のため又は本発明に従う方法で使用するための薬剤の製造における、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を包含する。従って、本発明は、組織、すなわちＢ型肝炎ウイルスなどのウイルス感染を有する細胞を含有する組織への送達、及び／又はこれらの組織の処置方法において；又はこのような処置のための薬剤又は医薬組成物の調製又は処方において使用するための、本明細書中の任意の記載のいずれかのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体又はその構成成分も想定する。

本発明は、一部の実施形態では、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を包含し、ここで標的配列は、特に、Ｃａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（又はこれらに由来する）場合に、その３’末端においてプロトスペーサー隣接モチーフ又はＰＡＭと呼ばれる５’モチーフにより隣接される。例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は由来酵素）については、以下にそれぞれ記載されるように、５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド）である。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又は由来酵素の場合、適切なＰＡＭは５’−ＮＲＧである。

ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９からのものである、あるいはこれらに由来することは認識されるであろう。

本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９が媒介する遺伝子ターゲティングの特異性の改善、及びＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９によるオフターゲット改変の可能性の低減を包含する。本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１及び第２の標的配列の操作によりオフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、本方法は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物は、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列
を含む第１のポリヌクレオチド配列
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含む第２のポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．１つ以上の突然変異を含む少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、転写されると第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がそれぞれ第１及び第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と、第１及び第２の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）第１の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）第２の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより、オフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する］
を含む。一態様では、ＤＮＡ内の第１のニック及び第２のニックは、二重鎖の少なくとも１つの塩基対だけ互いに対してオフセットされる。一態様では、第１のニック及び第２のニックは、得られるＤＮＡ破壊が３’オーバーハングを有するように互いに対してオフセットされる。一態様では、第１のニック及び第２のニックは、得られるＤＮＡ破壊が５’オーバーハングを有するように互いに対してオフセットされる。一態様では、第１のニック及び第２のニックは、オーバーハングが少なくとも１ヌクレオチド（ｎｔ）、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも２６ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔであるように、又は少なくとも５０ｎｔよりも大きくなるように互いに対して位置決めされる。得られたオフセット二重ニックＤＮＡ鎖を含む本発明の付加的な態様は当業者により認識され得る。そして二重ニック系の例示的使用は、本明細書において提供される。

本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てはＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される。本発明の特定の実施形態では、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、そして／あるいは第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、ここで、１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。極めて好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有する。あるいは、第１の酵素は非相補鎖ニッキング酵素であり、第２の酵素は相補鎖ニッキング酵素であり得る。

ＣＲＩＳＰＲ酵素の突然変異に関連して、酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で起こり得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、ＳｐＣａｓ９では、任意の又は全ての以下の突然変異が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；さらに、任意の置換アミノ酸が保存的置換であることも想定される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の、又はそれぞれの、又は全ての実施形態を提供し、この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つ以上、又は少なくとも２つ以上の突然変異を含み、少なくとも１つ以上の突然変異又は少なくとも２つ以上の突然変異が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、若しくはＤ９８６、例えば、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／若しくはＤ９８６Ａ、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ、又はＳｐ若しくはＳａのオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異である、或いはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＳｐＣａｓ９におけるＨ８４０若しくはＮ８６３Ａ又はＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａが突然変異し；例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、又はＳｐタンパク質若しくはＳａタンパク質のオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異を含む。

本発明の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１及び第２の標的配列の操作によりオフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、本方法は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、前記組成物は、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、及び
ＩＶ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第４の調節エレメント
［構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２の標的配列に対する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、かつ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより、オフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する］を含む、１つ以上のベクターを含むベクター系を含む。

また本発明は、本明細書に記載されるようなベクター系も提供する。この系は１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターを含むことができる。従って、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクター上に位置することができ、本明細書では構成成分の可能な位置及び全ての組み合わせが想定される。例えば、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは同じベクター上に位置することができる；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶはそれぞれ異なるベクター上に位置することができる；全ての位置の組み合わせを想定して、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、合計２つ又は３つの異なるベクター上に位置することができる、など。

本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態では、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、及び／或いは第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。極めて好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素はその酵素が相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素はその酵素が非相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素は非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、第２の酵素は相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、ウイルスベクターの１つ又は複数はリポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される。

本発明の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

本発明は、一部の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含有及び発現する細胞内に、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入することによりオフターゲット改変を最小限にすることによって目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含する。この系は、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質と、ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的化する２つのガイドＲＮＡとを含み、それにより、ガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的にし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより、遺伝子産物の発現が変更され、及びＣａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然に一緒に存在しない。

本発明の好ましい方法では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングするＣａｓタンパク質は５’オーバーハンをもたらす。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは高々２００塩基対、好ましくは高々１００塩基対、又はより好ましくは高々５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

また本発明の実施形態は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含むガイドＲＮＡも包含する。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。以下により詳細に説明されるように、コドン使用頻度は、特定の細胞型（例えば肝臓細胞の）における発現のためにさらに最適化され得る。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤ１０Ａ突然変異を有する。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。

また本発明は、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質と、細胞内の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的化する２つのガイドＲＮＡとを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も包含し、それにより、ガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより遺伝子産物の発現が変更される。

本発明の態様では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤ１０Ａ突然変異を有する。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。

また本発明は、
ａ）遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的化する２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡのそれぞれに機能的に連結された第１の調節エレメントと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質に機能的に連結された第２の調節エレメントと
を含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系も包含し、
構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクター上に位置し、それによりガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより遺伝子産物の発現が変更される。ここでＣａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然に一緒に存在しない。

本発明の態様において、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明のある実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。非常に好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を有する。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、系のベクターは、リポソーム、ナノ粒子エキソソーム、微小胞又は遺伝子銃によって送達される。

一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の位置で１つ又は２つの鎖を切断することを含む。一部の実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらす。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復するステップを含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現において１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態では、本方法はさらに、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップを含み、ここで、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、前記ベクターは対象において真核細胞に送達される。一部の実施形態では、前記改変は、細胞培養下で前記真核細胞において行われる。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記改変の前に前記真核細胞を対象から単離するステップを含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記真核細胞及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップを含む。

一態様では、本発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、それにより、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増大又は減少をもたらすステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、本方法はさらに、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップを含み、ここで、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。

一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。

他の実施形態では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。本方法は、ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いることによって標的ポリヌクレオチドの発現を低減するステップを含む。

所望される場合には、細胞内の発現の変更をもたらすために、ｔｒａｃｒ配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含む１つ以上のベクターが細胞に送達される。一部の方法では、１つ以上のベクターは、核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメント；及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメント、及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流にガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含む。発現されると、ガイド配列は、細胞内の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘発する。通常、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。

一部の方法では、標的ポリヌクレオチドは不活性化されて、細胞内の発現の変更をもたらすことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドは不活性され、従って配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は野生型配列のように配列が機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列は、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡが産生されないように不活性化され得る。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、及び／或いは１つ以上の突然変異はＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１又はＨＮＨドメイン内にあるか、又は本明細書中の他所で議論されるように突然変異である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメイン内に１つ以上の突然変異を有し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び酵素はさらに機能ドメインを含む。一部の実施形態では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態では、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態では、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態では、機能ドメインは後成的修飾ドメインであり、従って後成的修飾酵素が提供される。一部の実施形態では、機能ドメインは活性化ドメインであり、これは、Ｐ６５活性化ドメインであってもよい。従って、一部の実施形態では、突然変異Ｃａｓ９酵素は、タンパク質ドメイン又は機能ドメインに融合され得る。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるが、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。Ｃａｓ酵素は、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大ヌクレアーゼに対する相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指すことができるときにＣａｓ９と同定され得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からのものである、あるいはこれらに由来する。由来とは、本出願人によると、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で大部分は野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載されるように何らかの形で突然変異（改変）されていることを意味する。

他に明白でない限り、Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という用語が一般に本明細書では互換的に使用されることは認識されるであろう。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を参照する。しかしながら、本発明がＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９など、他の微生物種由来のさらに多くのＣａｓ９を含むことは認識されるであろう。

コドン最適化配列の一例は、この場合にはヒトに最適化されている（すなわち、ヒトでの発現のために最適化されている）が、本明細書において提供されている（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照）。これが好ましいが、他の例も可能であり、宿主種に対するコドン最適化が既知であることは認識されるであろう。

好ましくは、送達はベクターの形態であり、ベクターはレンチウイルス又はバキュロウイルス又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得るが、他の送達手段（例えば、酵母系、微小胞、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に結合する手段など）も知られており、提供されている。ベクターは、ウイルス又は酵母系（例えば、目的の核酸がプロモーターに機能的に連結され得る、及びプロモーターの制御下にあり得る（発現に関して、最終的にプロセシングされたＲＮＡを提供するためなど）場合）だけでなく、核酸の宿主細胞への直接的な送達も意味し得る。本明細書における方法では、ベクターはウイルスベクターであってもよく、これは有利にＡＡＶであるが、レンチウイルスなどの、本明細書において議論される他のウイルスベクターが使用されてもよい。例えば、昆虫細胞における発現のためにバキュロウイルスが使用され得る。これらの昆虫細胞は、次に、大量のさらなるベクター、例えば、本発明の送達に適合されるＡＡＶ又はレンチウイルスベクターなどを産生するのに有用であり得る。また、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを細胞に送達するステップを含む、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素の送達方法も想定される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がトランケート型であり、及び／又は１０００未満のアミノ酸又は４０００未満のアミノ酸で構成され、及び／又はヌクレアーゼ又はニッカーゼであり、及び／又はコドン最適化されており、及び／又は１つ以上の突然変異を含み、及び／又はキメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及び／又は本明細書で議論されるような他の選択肢を含むことは認識されるであろう。ＡＡＶ及びレンチウイルスベクターが好ましい。

特定の実施形態では、標的配列は、その３’末端において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、通常Ｃａｓ及び特にＣａｓ９に適したＰＡＭに隣接されるか、又はこのＰＡＭが後に続く。

例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は由来酵素）についてはそれぞれ５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲである。

また本発明は、細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによる、真核生物の細胞の改変方法にも関し、本方法は、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体を形成することができる外因性組成物を細胞内に導入するステップを含み、この組成物は、
（Ａ）（ｉ）転写されると、操作すべき少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が細胞内のＲＮＡとして存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内のタンパク質として存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、標的ウイルス核酸の少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、少なくとも１つのクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体を形成することができる外因性組成物にも関し、この複合体は、細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができ、この組成物は、
（Ａ）：（ｉ）転写されると、操作すべき少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含む、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系ポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が細胞内のＲＮＡとして存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内のタンパク質として存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、標的ウイルス核酸の少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体にも関し、この複合体は、
（Ａ）（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と、
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）にも関し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができ、ｃｈｉＲＮＡは、
（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含み、ｃｈｉＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
ａ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
ｂ）ｃｈｉＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
ｃ）ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

また本発明は、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド分子にも関し、前記ｃｈｉＲＮＡが真核生物の細胞内に導入されると、前記ｃｈｉＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成することができ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができ、ｃｈｉＲＮＡは、
（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含み、ｃｈｉＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
ａ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
ｂ）ｃｈｉＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
ｃ）ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

本明細書に記載される実施形態では、操作すべき標的核酸の配列、及び本明細書に記載されるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズすることができる、本明細書に記載されるガイド配列は、好ましくは、タンデム配列で連結され得る。ここで、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はセンス配列の領域を含む。本明細書に記載されるｔｒａｃｒ配列はアンチセンス配列の領域を含むことができ、これは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列のセンス配列の領域にハイブリダイズすることができる。

好ましくは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（ガイド配列に連結）及びｔｒａｃｒ配列が細胞内に存在する場合、アンチセンス配列の領域はセンス配列の領域にハイブリダイズし、それにより二重ＲＮＡ分子を形成する；そして前記二重ＲＮＡ分子が細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素に結合し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成されると、ガイド配列は標的核酸の配列にハイブリダイズし、それによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的核酸との配列特異的結合を誘導し、その結果、複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素により前記標的核酸の前記配列の操作がもたらされる。

本明細書に記載されるように、特定の実施形態は、任意選択で、キメラシングルガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。このようなｓｇＲＮＡ分子は、好ましくは、
Ｉ．操作すべき標的核酸の配列にハイブリダイズ可能な、本明細書に記載されるガイド配列；
ＩＩ．センス配列の領域を含む、本明細書に記載されるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列；
ＩＩＩ．リンカー配列；及び
ＩＶ．アンチセンス配列の領域を含む、本明細書に記載されるｔｒａｃｒ配列であって、リンカー配列に隣接して配置され、センス配列の領域にハイブリダイズして、ステムループを形成することができるｔｒａｃｒ配列
をタンデム配列で含み得る。

このような場合、リンカーは、任意選択でＧＡＡＡを含む、ポリヌクレオチドリンカーであり得る。他のリンカー、例えば本明細書に記載されるものなどが想定される。好ましくは、任意のこのような場合に、ｓｇＲＮＡ分子が細胞内に存在すると、アンチセンス配列の領域がセンス配列の領域にハイブリダイズし、それによりステムループを形成する；そして前記ｓｇＲＮＡ分子が細胞内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素に結合し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が形成されると、ガイド配列列は標的核酸の配列にハイブリダイズし、それによりＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的核酸との配列特異的結合を誘導し、その結果、複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素により前記標的核酸の前記配列の操作がもたらされる。

本明細書に記載される実施形態では、ガイド配列、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列は非コード配列であってもよい。転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ガイド配列とは対照的に、操作すべき少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズすることができなくてもよい。

本明細書に記載されるように、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって標的ウイルス核酸の種々の操作が実施され得る。標的ウイルス核酸の好ましい操作は、本明細書においてより詳細に記載されるように、ウイルスＤＮＡの切断を含む。

本明細書に記載される特定の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子において、細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸の操作が実施される。しかしながら、明らかになるように、標的ウイルス核酸の異なる配列を標的とする．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって複数の標的ウイルス核酸配列が操作される多重化方法が記載及び例示される。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチドにおいて、「外因性組成物」は、エンジニアリングされた又は天然に存在しない組成物である。

本明細書で言及されるように、標的配列は、その３’端部において、複合体のＣＲＩＳＰＲ酵素、典型的にはＣａｓ酵素、より典型的にはＣａｓ９酵素による認識に適したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接される得る、又はこのＰＡＭが後に続き得る。例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は由来酵素）についてはそれぞれ、５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲである。本明細書に記載されるものなどの他のＰＡＭは、使用される特定のＣＲＩＳＰＲ酵素に応じて、標的配列と関連して認識され得る。

外因性組成物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、（ａ）ＲＮＡ又は（ｂ）ＤＮＡのいずれかを含むポリヌクレオチド配列として提供されてもよく、ここで、ポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするＲＮＡの発現を誘導することができる調節エレメントに機能的に連結される。

外因性組成物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はどれも、（ａ）ＲＮＡ又は（ｂ）ＤＮＡのいずれかを含むことができ、ここで、ポリヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列の発現を誘導することができる１つ以上の調節エレメントに機能的に連結される。

外因性組成物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列のそれぞれはＲＮＡからなることができ、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列は、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡポリヌクレオチド分子を含み得る。

外因性組成物のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されてその発現を誘導することができる少なくとも１つの調節エレメントをさらに含むＤＮＡポリヌクレオチド配列として提供されてもよく、ここで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡポリヌクレオチド（ｃｈｉＲＮＡ）分子を含み得る。

上記の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子において、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列のそれぞれは５’から３’への方向に並ぶことができる；又はガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列のそれぞれは３’から５’への方向に並ぶことができる。

本明細書に記載される方法又は組成物において、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列をコードするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び／又は（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、１つ以上の組換えウイルスベクター内に含まれ得る。（ａ）のポリヌクレオチド配列は、（ｂ）のポリヌクレオチド配列と同じ又は異なる組換えウイルスベクターに位置し得る。

本明細書に記載されるｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子は、組換えウイルスベクター内に含まれ得る。

ウイルスベクターを利用する、本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチドにおいて、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、任意選択で、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクターなど）、又はポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスなど）であり得る。

本明細書に記載される方法では、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列をコードするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、及び／又は（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞又は遺伝子銃によって生物の細胞に送達され得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子において、ｔｒａｃｒ配列は、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子において、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列との間のハイブリダイゼーションは、二次構造、好ましくはヘアピンを有する転写物を生じ得る。ｔｒａｃｒ配列は、二次構造、好ましくはヘアピンを形成することができる１つ以上の領域を含み得る。ｔｒａｃｒ配列は、１つ以上のヘアピン、２つ以上のヘアピン、３つ以上のヘアピン、４つ以上のヘアピン、５つ以上のヘアピン、又は最大で５つのヘアピンを含み得る。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいこともある。

本明細書に記載されるように、好ましいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素であり、好ましくは、ＩＩ型Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はその生物学的に活性な断片又は誘導体である。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子において、ガイド配列は、１０〜３０のヌクレオチド長であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９酵素、又は黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９酵素、又はこれらの生物学的に活性な断片又は誘導体であり得る。本明細書には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素に適用され得る特定のＮＬＳ配列が記載される。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はさらに、生物の細胞の核内においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の蓄積を検出可能な量まで駆動することができる１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳ、４つ以上のＮＬＳ、５つ以上のＮＬＳ、６つ以上のＮＬＳ、７つ以上のＮＬＳ、８つ以上のＮＬＳ、９つ以上のＮＬＳ、又は１０以上のＮＬＳを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素のアミノ末端又はその近傍に少なくとも１つのＮＬＳを含み得る、及び／又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素のカルボキシ末端又はその近傍に少なくとも１つのＮＬＳを含み得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、細胞内にＲＮＡとして存在する場合、ガイド配列は、生物のゲノムに組み込まれないエピソーム核酸分子である標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能であってもよく、ここで、前記操作はエピソームウイルス核酸分子の操作であり、好ましくは、エピソーム核酸分子は二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子である。二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）であるエピソームウイルス核酸であり得る。標的ウイルス核酸がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸である場合、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドは、好ましくは、ｃｃｃＤＮＡであるエピソームウイルス核酸であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、複合体の提供がない場合の生物の細胞内のエピソームウイルス核酸分子の量と比較して、生物の細胞内のエピソームウイルス核酸分子の量を低減可能であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、エピソーム核酸分子の分解を促進するようにエピソーム核酸分子を操作可能であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、細胞内にＲＮＡとして存在する場合、ガイド配列は、生物のゲノムに組み込まれる標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能であり得る。ここで、前記操作は、組み込まれた標的核酸の操作である。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子のいずれかにおいて、細胞内で形成される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、標的ウイルス核酸の全て又は一部の生物ゲノムからの切除を促進するように、組み込まれた核酸を操作可能であり得る。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどれも、本明細書に記載される真核生物の細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸の操作において使用され得る。このような使用はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏであり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、少なくとも１つの標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれた二本鎖ＤＮＡ分子ポリヌクレオチドｃｃｃＤＮＡ及び／又はウイルスＤＮＡ内に含まれ得る。この場合、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体による少なくとも１つの標的ウイルス核酸の操作は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡの切断を含む。切断は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡに導入される１つ以上の二本鎖切断、任意選択で、少なくとも２つの二本鎖切断を含み得る。切断は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡに導入される１つ以上の一本鎖切断、任意選択で、少なくとも２つの一本鎖切断を含み得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、１つ以上の二本鎖切断及び／又は１つ以上の一本鎖切断は、標的ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列及び／又は標的組込みウイルスＤＮＡ配列において１つ以上の挿入及び欠失突然変異（ＩＮＤＥＬ）の形成をもたらし得る。ＩＮＤＥＬの存在は、明細書に記載されるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって評価され得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、生物のゲノムに組み込まれたウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又はウイルスＤＮＡ配列の切断は、ｃｃｃＤＮＡからのウイルスポリヌクレオチド配列の切除をもたらし、それによりウイルス感染を低減し得るか、又は生物のゲノムからのウイルスＤＮＡ配列の切除をもたらし、それによりウイルス感染を低減し得る。

二本鎖切断の形成を促進する本発明の方法又は組成物又は他の施形態において、組成物は、少なくとも２つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分を含むことができ、各タイプの複合体は、標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み、前記切断は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ内、及び／又は生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡ内若しくはそれに隣接して導入された少なくとも２つの二本鎖切断によるウイルスＤＮＡの第１及び第２の鎖の切断である；ここで、
第１の二本鎖切断は第１の標的配列の操作によってＤＮＡの第１の位置に導入され、第２の二本鎖切断は、第２の標的配列の操作によってＤＮＡの第２の位置に導入され；
第１及び第２の二本鎖切断が導入されると、第１及び第２の二本鎖切断間のウイルス配列がｃｃｃＤＮＡから、及び／又は生物のゲノムＤＮＡから切除される。

一本鎖切断の形成を促進する本発明の方法又は組成物又は他の施形態において、組成物は、少なくとも４つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分を含むことができ、各タイプの複合体は、標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み、前記切断は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ内に導入、及び／又は生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡ内若しくはそれに隣接して導入された少なくとも２対の一本鎖切断によるものであり；ここで、
第１の一本鎖切断対を導入するために、第１の標的配列を操作して第１のニックを形成することによって、第１の一本鎖切断がＤＮＡの第１の鎖に導入され、第２の標的配列を操作して第２のニックを形成することによって、第２の一本鎖切断がＤＮＡの反対の鎖に導入され；
第２の一本鎖切断対を導入するために、第３の標的配列を操作して第３のニックを形成することによって、第３の一本鎖切断がＤＮＡの前記第１の鎖に導入され、第４の標的配列を操作して第４のニックを形成することによって、第４の一本鎖切断がＤＮＡの前記反対の鎖に導入され；
第１及び第２の一本鎖切断対が導入されると、第１及び第２の一本鎖切断対間のウイルス配列がｃｃｃＤＮＡから、及び／又は生物のゲノムＤＮＡから切除される。

第１及び第２のニックは二重鎖の少なくとも１つの塩基対だけ互いに対してオフセットされて、第１のオーバーハングを形成することができ、第３及び第４のニックは二重鎖の少なくとも１つの塩基対だけ互いに対してオフセットされて、第２のオーバーハングを形成することができる。ウイルス配列の切除に続いて、ＤＮＡの切断された第１の鎖の端部が一緒にライゲートされ、ＤＮＡの切断された第２の鎖の端部が一緒にライゲートされて、破壊されていない１及び第２の鎖を再形成し得る。

一本鎖切断の形成を促進する本発明の方法又は組成物又は他の実施形態において、一本鎖切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼドメイン又はＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの触媒不活性化をもたらす置換を含む改変Ｃａｓ９酵素であるニッカーゼ酵素によってＤＮＡに導入され得る；任意選択で、置換は、ＳｐＣａｓ９のＤ１０位における置換であり、好ましくはＳｐＣａｓ９関連酵素のＤ１０Ａ置換、又はＤ１０位に相当する残基の置換であるか、あるいは置換は、ＳｐＣａｓ９のＨ８４０位における置換であり、好ましくはＳｐＣａｓ９関連酵素のＨ８４０Ａ置換、又はＨ８４０位に相当する残基の置換である。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、標的ウイルス核酸は、ｃｃｃＤＮＡ及び／又は生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡであり得る。ここで、前記操作は、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列内への若しくはそれに隣接する、又は組込みウイルスＤＮＡ配列内への若しくはそれに隣接する１つ以上のヌクレオチドの挿入、ウイルスｃｃｃＤＮＡ又は組込みウイルスＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドの欠失、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組込みウイルスＤＮＡ配列の転座、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組込みウイルスＤＮＡ配列の転写の抑制、及び／又はウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組込みウイルスＤＮＡ配列の不活性化を含む。ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列及び／又は組込みウイルスＤＮＡ配列の転写の抑制は、１つ以上の転写リプレッサードメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の作用によってもたらすことができ、任意選択で、１つ以上の転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ、ＳＩＤ及び／又はＳＩＤ４Ｘを含み、好ましくはＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素である。操作は、例えば、ＶＰ６４などの１つ以上の転写活性化ドメインに融合した非活性化ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の作用による、ウイルスｃｃｃＤＮＡが保有する遺伝子の活性化を含むことができ、好ましくは、ウイルスｃｃｃＤＮＡはＨＢＶであり、活性化は、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ及び／又はＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、及び／又は他のウイルスインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の活性の増大をもたらし、それにより、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの低下が生じる。ウイルスｃｃｃＤＮＡ又は組込みウイルスＤＮＡのヌクレオチド配列の操作は、１つ以上のウイルスオープンリーディングフレームの破壊、ウイルスｍＲＮＡ発現の破壊及び／又は機能性ビリオンの産生の阻害を引き起こし得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡの操作は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が存在しない場合のレベルと比べて、ウイルスｒｃＤＮＡ、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及びウイルスｓｓＤＮＡの１つ以上のレベルの低下を生じ得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、前記操作の効果は、新しいビリオンの産生の阻害を含み得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、前記改変の効果は、前記生物からウイルス配列を除去し、それによりウイルス感染を低下させることを含み得る。

本明細書に記載される方法及び組成物のいずれかにおいて、記載される組成物はさらに、１つ以上の付加的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分、又は１つ以上の付加的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構築に必要とされる構成成分を含むことができ、複合体の各タイプは、細胞内の標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能な異なるガイド配列を含む。従って、本明細書に記載される方法及び組成物はどれも、１つ以上の付加的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体によって付加的に特徴付けることができ、１つ以上の付加的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のそれぞれは本明細書に記載されるように特徴付けることができる。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、標的ウイルス核酸は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸であり得る。標的ウイルス核酸がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸である場合、生物の細胞は、ＨＢＶが感染することができる細胞である。細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であり得る。細胞は、肝細胞、好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細胞又はヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５又はＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞であり得る。

標的ウイルス核酸がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸である場合、ガイド配列は、ＨＢＶＯＲＦ Ｓ、ＯＲＦ Ｃ、ＯＲＦ Ｐ、又はＯＲＦ Ｘ、好ましくはＯＲＦ Ｃの標的ウイルス核酸にハイブリダイズ可能であってもよく、任意選択でガイド配列の配列は、５’−ｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇ−３’、５’−ｃｃｔｃｔｇｃｃｇａｔｃｃａｔａｃｔｇ−３’又は５’−ｔａａａｇａａｔｔｔｇｇａｇｃｔａｃｔｇ−３’を含む。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用において、標的ウイルス核酸は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）核酸、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）核酸、又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）核酸であり得る。

本明細書に記載される方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用のいずれかにおいて、前記操作はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで実施され得る。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどれも薬剤としての使用のために記載され得る。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどれも、ウイルス感染の処置における使用のために記載され得る。このような処置は、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）など、標的ウイルス配列が生物のゲノムに組み込まれないエピソーム核酸分子内に含まれるウイルス感染の処置であり得る。ウイルス感染は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によって引き起こされ得る。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどれも、薬剤としての使用のため、又はウイルス感染の処置における使用のために記載され得る。ここで、生物は、ヒトなどの哺乳類である。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどれも、薬剤の製造における使用のために記載され得る。

本明細書に記載される組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子はどあれも、ウイルス感染の処置のための薬剤の製造における使用のために記載され得る。このような処置は、共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）など、標的ウイルス配列が生物のゲノムに組み込まれないエピソーム核酸分子内に含まれるウイルス感染の処置であり得る。ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ得るか、あるいはウイルス感染は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によって引き起こされ得る。任意のこのような使用において、生物はヒトなどの哺乳類であり得る。

また本発明は、細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによる真核生物の細胞の改変方法にも関し、本方法は、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体形成することができる外因性組成物を細胞内に導入するステップを含み、この組成物は、
（Ａ）（ｉ）転写されると、操作すべき少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が細胞内のＲＮＡとして存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内のタンパク質として存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、標的ウイルス核酸の少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

このような方法に関して、細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であってもよく、好ましくは、細胞は肝細胞であり得る；ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長である；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素である；標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれ、ＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。このような方法は、適切な場合には、本明細書に記載されるさらなる特定の特徴のいずれかに従って付加的に特徴付けることができる。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、少なくとも１つのクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体を形成することができる外因性組成物にも関し、この複合体は、細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができ、この組成物は、
（Ａ）（ｉ）転写されると、操作すべき少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含む、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系ポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が細胞内のＲＮＡとして存在し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内のタンパク質として存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、標的ウイルス核酸の少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

このような組成物に関して、細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であってもよく、好ましくは、細胞は肝細胞であり得る；ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長である；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素である；標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれ、ＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。このような組成物は、適切な場合には、本明細書に記載されるさらなる特定の特徴のいずれかに従って付加的に特徴付けることができる。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体にも関し、この複合体は、
（Ａ）（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列と、
（Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と
を含み、
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
（ｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
（ｉｉｉ）ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

このような複合体に関して、細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であってもよく、好ましくは、細胞は肝細胞であり得る；ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長である；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素である；標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれ、ＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。このような複合体は、適切な場合には、本明細書に記載されるさらなる特定の特徴のいずれかに従って付加的に特徴付けることができる。

また本発明は、真核生物の細胞内に導入されたときに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）にも関し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することができ、ｃｈｉＲＮＡは、
（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含み、ｃｈｉＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
ａ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
ｂ）ｃｈｉＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
ｃ）ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

このようなｃｈｉＲＮＡに関して、細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であってもよく、好ましくは、細胞は肝細胞であり得る；ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長である；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素である；標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれ、ＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。このようなｃｈｉＲＮＡは、適切な場合には、本明細書に記載されるさらなる特定の特徴のいずれかに従って付加的に特徴付けることができる。

また本発明は、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチド分子にも関し、前記ｃｈｉＲＮＡが真核生物の細胞内に導入されると、前記ｃｈｉＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連することができ、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体は、細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって細胞を改変することでき、このｃｈｉＲＮＡは、
（ｉ）操作すべき標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
（ｉｉ）ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
を含み、ｃｈｉＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が細胞内に存在する場合に、
ａ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
ｂ）ｃｈｉＲＮＡはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
ｃ） ガイド配列は標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が複合体のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される。

このようなＤＮＡに関して、細胞は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現する細胞であってもよく、好ましくは、細胞は肝細胞であり得る；ｔｒａｃｒ配列は１つ以上のヘアピンを有し、３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長である；ガイド配列は１０〜３０の間のヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はＩＩ型Ｃａｓ９酵素である；標的ウイルス核酸は、生物のゲノムに組み込まれないＨＢＶエピソーム核酸内に含まれ、ＨＢＶ二本鎖共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である。このようなＤＮＡは、適切な場合には、本明細書に記載されるさらなる特定の特徴のいずれかに従って付加的に特徴付けることができる。

本明細書に記載される特定の方法、製品及び使用は、ヒト胚の破壊をもたらす状況、及びヒトの生殖系の遺伝的同一性の改変をもたらす状況では適用されないかもしれない。本明細書に記載される方法、製品及び使用は、非治療的な目的のために使用されてもよい。さらに、本明細書に記載される方法はどれもｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで適用され得る。

本明細書に記載される本発明が種々の構成成分を含み、それらがその特定の特徴における変動を示し得ることは認識されるであろう。上記及び本明細書中の特徴の任意の組み合わせが、適切な場合に、本発明を実行するための手段として企図されることは認識されるであろう。

さらに、本発明の目的は、本発明の範囲内に、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を含めないことであり、本出願人らは、あらゆる既知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条の第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３項）の記述及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、プロセス、又はこのような製品の製造、又はこのような製品を使用する方法が本発明の範囲内に含まれないものとし、本出願人らは、既に記載されたあらゆるかかる主題の権利を留保するが、その放棄をここに明示することにさらに留意されたい。

本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、米国特許法による意味を有し得；例えば、これらの語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し；そして「〜本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの語が、米国特許法による意味を有し、例えば、明確に述べられていない要素は許容されるが、従来技術に見られる要素又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。本発明の実施において、条項５３（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣを順守することが有利であろう。本明細書において、誓約は存在しないことを意図する。

これら及び他の実施形態が、開示される、又は以下の詳細な説明から明らかになり、かつこの説明に包含される。

本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の原理が利用された例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面から、本発明の特徴及び利点をより良く理解できるであろう。

ＣＲＩＳＰＲ系の図式モデルを示す。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）は、２０ｎｔガイド配列（青色）及び足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってゲノムＤＮＡを標的化する。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、及びＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流（赤色三角）の二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。 例示的なＣＲＩＳＰＲ系、可能性のある作用機構、真核細胞における発現の適応例、並びに核局在化及びＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 標的例に対するＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的なベクター系及び真核細胞における相同組換えの誘導におけるその使用の結果を示す。 プロトスペーサー配列の表を提供し、ヒト及びマウスゲノム中の遺伝子座に対して対応するＰＡＭと共に、例示的な化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系に基づいて設計されたプロトスペーサー標的についての改変効率の結果を要約する。細胞をＣａｓ９及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ又はキメラＲＮＡのいずれかによりトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に分析した。インデルパーセントは、表示される細胞株からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果に基づいて計算される（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差はＳ．Ｅ．Ｍ．であり、Ｎ．Ｄ．はＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いて検出できないことを示し、Ｎ．Ｔ．は本研究おいて試験しなかったことを示す）。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについて、異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。 二本鎖切断に誘発された微小挿入及び欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの概略図を示す。 真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的なバイシストロン性発現ベクターを示す。 ヒトゲノム中の隣接する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図９Ａ）及びサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図９Ｂ）の間の距離のヒストグラム；及び染色体（Ｃｈｒ）による各ＰＡＭに対する距離（図９Ｃ）を示す。 例示的なＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞における発現のための適応例、及びＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 哺乳類細胞におけるゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的な操作を示す。 哺乳類細胞におけるｃｒＲＮＡプロセシングのノーザンブロット分析の結果を示す。 ヒトＰＶＡＬＢ及びマウスＴｈ遺伝子座におけるプロトスペーサーの例示的な選択を示す。 ヒトＥＭＸ１遺伝子座におけるサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のプロトスペーサー例及び対応するＰＡＭ配列標的を示す。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシークエンシング、及びノーザンブロットアッセイのために使用されるプライマー及びプローブについての配列の表を提供する。 キメラＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ系の例示的な操作、及び真核細胞における系の活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を示す。 真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ系活性についてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果のグラフ表示を示す。 ＵＣＳＣゲノムブラウザを用いた、ヒトゲノム中のいくつかの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位の例示的な可視化を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含む５つのＣａｓ９ファミリーを明らかにする系統発生分析の環状表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含む５つのＣａｓ９ファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 相同組換えによるゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣＩ触媒ドメイン内のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの概略図。（ｂ）修復鋳型としてセンス又はアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを用いたヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す概略図。上方の赤色矢印はｓｇＲＮＡ切断部位を示し；遺伝子型同定のためのＰＣＲプライマー（表Ｊ及びＫ）は右側パネルの矢印として示される。（ｃ）ＨＲによって改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）及びニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測される断片サイズの位置を示す。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。 Ｃａｓ９オルソログの長さ分布を表すグラフを示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。 条件的Ｃａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 構成的Ｃａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 構成的及び条件的Ｃａｓ９構築物における重要なエレメントの概略図を示す。 送達及びｉｎ ｖｉｖｏマウス脳Ｃａｓ９発現データを示す。 細胞内へのＣａｓ９及びキメラＲＮＡのＲＮＡ送達を示す。（Ａ）Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞へのＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかとしてのＧＦＰレポーターの送達。（Ｂ）ＲＮＡとしてのＩｃａｍ２遺伝子に対するＣａｓ９及びキメラＲＮＡの送達は、試験した２つのスペーサーのうちの１つに対して切断をもたらす。（Ｃ）ＲＮＡとしてのＦ７遺伝子に対するＣａｓ９及びキメラＲＮＡの送達は、試験した２つのスペーサーのうちの１つに対して切断をもたらす。 ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復が遺伝子編集をどのように促進するかを示す。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路において、ＤＳＢの末端は内因性ＤＮＡ修復機構によってプロセシングされ、一緒に再結合され、これは、接合部位においてランダム挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらし得る。遺伝子のコード領域内で生じるインデル突然変異はフレームシフト及び未成熟終止コドンを生じることができ、遺伝子ノックアウトがもたらされる。或いは、プラスミド又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復鋳型を供給して、高い忠実性及び正確な編集を可能にする相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用することができる。 ＨＥＫ及びＨＵＥＳ９細胞におけるＨＤＲについて予想される結果を示す。（ａ）相同性アームを有するターゲティングプラスミド又はｓｓＯＤＮ（センス又はアンチセンス）のいずれかを使用して、Ｃａｓ９によって切断される標的ゲノム遺伝子座（赤色三角）において配列を編集することができる。ＨＤＲの効率をアッセイするために、本出願人らは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（赤色バー）を標的遺伝子座に導入し、これを、相同性の領域外でアニールするプライマーによりＰＣＲ増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩによるＰＣＲ産物の消化は、ＨＤＲイベントの発生を明らかにする。（ｂ）目的の遺伝子座に対してセンス又はアンチセンス（ｓ又はａ）のいずれかの方向に向けられたｓｓＯＤＮをＣａｓ９と組み合わせて使用して、標的遺伝子座において効率的なＨＤＲ媒介編集を達成することができる。改変の両側に４０ｂｐ、好ましくは９０ｂｐの最小相同性領域が推奨される（赤色バー）。（ｃ）野生型Ｃａｓ９及びＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）の両方を用いて、ＥＭＸ１遺伝子座においてＨＤＲに対するｓｓＯＤＮの効果の例が示される。各ｓｓＯＤＮは、２つの制限部位の１２ｂｐの挿入に隣接する９０ｂｐの相同性アームを含有する。 嚢胞性線維症ΔＦ５０８突然変異のための修復戦略を示す。 （ａ）は、ＦＸＮイントロン１におけるＧＡＡリピート伸長の概略図を示し、（ｂ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたＧＡＡ伸長領域の切除に使用される戦略の概略図を示す。 Ｔｅｔ１〜３及びＤｎｍｔ１、３ａ及び３ｂ遺伝子座の効率的なＳｐＣａｓ９媒介ターゲティングのスクリーニングを示す。トランスフェクトしたＮ２Ａ細胞からのＤＮＡにおけるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、異なるｇＲＮＡの使用により効率的なＤＮＡ切断を実証する。 ＡＡＶ１／２送達系において２ベクター系を用いる多重ゲノムターゲティングの戦略を示す。Ｔｅｔ１〜３及びＤｎｍｔ１、３ａ及び３ｂ ｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。ＧＦＰ−ＫＡＳＨはヒトシナプシンプロモーターの制御下にある。制限側（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｄｅ）は、サブクローニングによる単純なｇＲＮＡ置換戦略を示す。２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接されたＨＡタグ化ＳｐＣａｓ９が示される。両方のベクターが、１：１の比率でＡＡＶ１／２ウイルスによって脳内に送達される。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１の機能性の検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介切断を試験するために、ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１（＋）及びＳｐＣａｓ９コードベクターによりＮ２Ａ細胞をコトランスフェクトした。ｇＲＮＡのみ（−）は負の対照である。トランスフェクションの４８時間後にＤＮＡ精製及び下流プロセシングのために細胞を回収した。 ＨＢＶ標的化ＣＲＩＳＰＲ構築物のためのガイドＲＮＡ設計を示す。ヒトゲノムＤＮＡに対する低相同性及び保存（ガイド１３〜２４）について切断部位を最適化した。 １回目の実験のＣａｓ９処置に応答してｃｃｃＤＮＡを定量化するためのスキームを示す。 １回目のＨｅｐＧ２．２．１５実験からのｑＰＣＲ結果を示す。 ヌクレアーゼ活性についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。ヌクレアーゼ活性からの繰り返されるＤＳＢ形成による不完全なＮＨＥＪイベントの結果としてインデルが形成する。Ｃａｓ９標的化ゲノム遺伝子座について、多くの場合、１０〜３０％の割合のインデル形成が観察され、５０％に達することもある。 第１セットのＨｅｐＧ２．２．１５実験についての代表的なｓｕｒｖｅｙｏｒを示す。 初期データセットのノイズにより動機付けられた実験的設計のＨｅｐＧ２．２．１５ＨＢＶ定量化スキームを示す。 ソーティングベースの基準化を用いたＨｅｐＧ２．２．１５結果を示す。 ２回目のＨｅｐＧ２．２．１５実験において保存ＨＢＶ配列を標的とするガイドを用いて観察された低レベルのインデルを示す。 ＨｅｐＧ２コトランスフェクション実験を示す。 コホート１についてのＨＤＤデータを示す。 コホート２についてのＨＤＤデータを示す。 コホート２についてのＨＤＤデータを示す。 コホート２についてのＨＤＤデータを示す。 ＨＤＤの９日後のコホート２の肝臓分析を示す。 ＨＤＤの９日後のコホート２の肝臓分析を示す。 ＨＤＤ実験中に形成されたインデルが少ない／全くないことを示す。ガイド２１形成の予測バンドサイズ：２３５＋２７２＋５０７ｂｐ（未消化ＰＣＲ産物）。 ＨＤＤコホート３結果を示す：ＨＢｓＡｇ。 ＨＤＤコホート３結果を示す：ウイルス血症。 ＨＤＤコホート３結果を示す：肝臓中のＨＢＶ ＨＤＤコホート３結果を示す：ＧＡＰＤＨに対して基準化したルシフェラーゼ。 インデル形成が少ない／全くないにもかかわらず、ＨＢＶに対する効果がＣａｓ９ヌクレアーゼ活性に依存することを示す。 （ａ）ＨＢＶの生活環及びＣＲＩＳＰＲ構築物の推定抗ＨＢＶ効果の略図を示し；Ｃａｓ９媒介ＤＳＢ形成は、小さいエピソームｃｃｃＤＮＡを繰り返し直線化しなければならず、潜在的にインデル形成（適切でないウイルス突然変異体を生じる）又はさらに分解をもたらす。（ｂ）（左側）いくつかの試験したガイドＲＮＡ構築物についてのＨＢＶゲノム機構及び標的配列の位置を示し、（右側）各ＨＢＶＯＲＦにおける全ての可能なＣＲＩＳＰＲ標的部位（保存ゲノムの領域の可能な標的部位の数を含む）の表を示す。 （ａ）患者由来のウイルスゲノムの大多数の保存領域標的を標的化するガイドＲＮＡを示す。ＨＢＶ単離物からの全ての全ゲノム配列をＧｅｎＢａｎｋから検索し、３つのガイド（６、１７、及び２１）に対する２３ｎｔ標的配列（２０ｎｔスペーサー＋３ｎｔＰＡＭ）の保存を決定した。ｘ軸は許容されるミスマッチの数を示し、ｙ軸は、ネイティブのｓｇＲＮＡ標的部位に対してこのミスマッチの数の範囲内に入る、配列決定された単離物の割合を示す。（ｂ）ＨｅｐＧ２トランスフェクション実験の略図を示し、（ｃ〜ｄ）：１．３ｘＷＴ ＨＢＶ及びｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ構築物によりコトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞であり、ＨＢｓＡｇ（ｃ）及びＨＢＶ３．５ｋｂ ＲＮＡ（ｄ）に対する効果を示す。 （ａ）（ｂ〜ｃ）の水圧注入実験についての実験概略図を示す：１．３ｘＷＴ ＨＢＶ及びｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙが水圧注入により免疫不全ＮＲＧマウスの肝臓に送達され、（ｂ）ＨＢｓＡｇ及び（ｃ）注入の２日及び４日後のマウス血液中の分泌ＨＢＶ力価が定量化される。２１Ｍ：ｇ２１からの５ｂｐミスマッチを有するガイドＲＮＡ。図示されるデータは１つの代表的な実験からのものであり、複数の実験を通して一貫している。ＵＴ：「非標的化」ガイドＲＮＡ（ＨＢＶゲノムに標的配列がない）。両側ｔ検定で評価される場合に、^＊選択された比較に対してｐ＜０．０５；^＊＊選択された比較に対してｐ＜０．０１；^＊＊＊選択された比較に対してｐ＜０．００１。 （ａ）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞内のＨＢＶの生活環を示す。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞はゲノム的に組み込まれた線形の１．３ｘＷＴ ＨＢＶ配列を含有し、これにより、転写と、その後の翻訳（タンパク質）又は逆転写及び核再輸入（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅ−ｉｍｐｏｒｔ）（ｃｃｃＤＮＡ）とを介して、ウイルスタンパク質及びｃｃｃＤＮＡが構成的に産生される。このシステムにおける持続性のＨＢＶ産生は、ウイルスＤＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の長期抗ＨＢＶ効果のアッセイを可能にし；（ｂ）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞内の持続性ＣＲＩＳＰＲ発現のためのレンチウイルスベクター及び実験戦略の概略図。 ＨＢＶ標的化ＣＲＩＳＰＲが、ＨＢＶ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９活性に依存するＨＢＶのＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを低減することを示す。 ＨＢＶ産物が、長期ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ発現時に低減されることを示す。３つの非ＨＢＶ標的ガイドと共に、ヌクレアーゼ−活性Ｃａｓ９又はヌクレアーゼ−死Ｃａｓ９により３つの異なるオンターゲットガイドを発現するＨｅｐＧ２．２．１５細胞の安定系列を、一貫した細胞密度（２０，０００細胞／ｃｍ２）で播種し、ビリオン及びウイルスタンパク質を上清に分泌させた。７２時間後に、上清を採取し、（ａ）ウイルス力価及び（ｂ）ＨＢｅＡｇ（活性ウイルス複製のマーカーとして臨床的に使用される、Ｃ ＯＲＦから生じる分泌タンパク質）を定量化した（ｃ）。全ＨＢＶ ＲＮＡ及び３．５ｋｂ ＲＮＡ（識別するのが難しい、プレゲノムＲＮＡ及び最長の翻訳ＨＢＶ ＲＮＡ種からなる）を、形質導入の３６日後に定量化し、ＨＢＶ ＲＮＡの抑制はこの最後の時点まで継続した。一元配置ＡＮＯＶＡと、その後のＤｕｎｎｅｔｔの事後検定によって評価される場合に、（ａ−ｂ）^＊ｐ＜０．０５対ＵＴ；^＊＊ｐ＜０．０１対ＵＴ；^＊＊＊ｐ＜０．００１対ＵＴ。 ＨＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ構築物が、ウイルスＤＮＡのターゲティングの成功に依存する（ａ）ｃｃｃＤＮＡ及び（ｂ）全ＨＢＶ ＤＮＡレベルの大幅な漸進的低下を引き起こすことを示す。 長期ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ発現時のＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡの低下が複数のガイドによって生じることを示す。（ａ）３つのガイド（６、１７、及び２１）にわたる形質導入の２１日及び３６日後のｃｃｃＤＮＡの低下；それぞれにおいて大幅な低下が見られる。（ｂ）これら３つのガイドＲＮＡにわたって形質導入の２１日及び３６日後の全ＨＢＶ ＤＮＡの低下も大きい。 ＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットを示す。 ＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットを示す。 全ＨＢＶ ＤＮＡ（上側）及びプラスミド−ｓａｆｅ ＤＮａｓｅによる処置で濃縮されたエピソームＨＢＶ ＤＮＡ（下側）におけるインデル形成を検出するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す；レンチウイルス形質導入は、高レベルのＨＢＶの切断を可能にする。矢じりは、インデル形成に起因するｓｕｒｖｅｙｏｒ消化産物を示す。ｇ６、ｇ１７及びｇ２１について予測されるＰＣＲ産物サイズはそれぞれ、５９９、９４６及び５０７ｂｐである。ｇ６、ｇ１７及びｇ２１についてのｓｕｒｖｅｙｏｒ消化産物のおおよそのサイズはそれぞれ、４２９＋１７０、５７０＋３７６、２７５＋２３２である。 ＨＢＶコアタンパク質の免疫蛍光イメージングにより、コアＯＲＦに対して特異的にｇ１７によりターゲティングされると、コア染色の大幅な低減が実証されることを示す。 新規感染実験の概略図を示す。ｇ１７又はｇ１７Ｍ（ｇ１７の突然変異体、ＨＢＶ ＤＮＡ標的と複合体を形成すると５ｂｐＤＮＡバルジをもたらす）のいずれかと、ＷＴ又は死Ｃａｓ９のいずれかとを含有するＣａｓ９／ｇＲＮＡ構築物をＨｅｐ−ＮＴＣＰ細胞に形質導入し、次にピューロマイシンにより選択して、安定系統を作製した。（左側）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞との共培養においてこれらの細胞を播種し、これにより感染性ＨＢＶビリオンが生じ、これは次に形質導入Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ細胞に感染する。一過性培養の後、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をピューロマイシン選択により死滅させ、Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ細胞を数日間培養してから回収して、ウイルスパラメータをアッセイした。（右側）これらの細胞に、ＨＢＶ＋患者血漿に由来するＨＢＶビリオンを感染させてから培養し、回収して、ウイルスパラメータをアッセイした。 ＨＢｓＡｇ分泌（ａ）、ｃｃｃＤＮＡコピー（ｂ）、５ｂｐミスマッチ対照に対するＨＢＶ３．５ｋｂ ＲＮＡのレベル（ｃ）、及び培地中のＨＢＶ ＤＮＡの力価（ｄ）を示す。データは、Ｃａｓ９／ｇ１７が新規感染に関してＨＢＶ感染を低減することを示す。１７Ｍ：５ｂｐミスマッチ対照。１７Ｄ：ｇ１７を有する死Ｃａｓ９。図示されるデータは１つの代表的な実験からのものであり、複数の実験を通して一貫している。 患者由来のウイルスモデルシステムにおけるＨＢＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性破壊を示す。ガイド１７及び活性又はヌクレアーゼ−死Ｃａｓ９の形質導入の際に、Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ細胞を感染患者血清からのＨＢＶにより感染させた。感染の９日後に、細胞を回収し、ウイルス産物を定量化した。ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９は、ＨＢＶ３．５ｋｂ ＲＮＡ（ａ）、ｃｃｃＤＮＡ（ｂ）、及び全ＤＮＡレベル（ｃ）の低下を生じた。 非エピソームウイルス型を除去するためのプラスミド−Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅにより未処置（左側）又は処置（右側）されたＤＮＡにおいて実施されたＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。矢じりは、インデル形成によって生じるより短いアンプリコンを示す。１７Ｍにおける低レベルのインデル形成は、恐らく、標的ＤＮＡとｇＲＮＡとの間の５ｂｐバルジによって可能になる非効率的な切断に起因する（近年、Ｌｉｎ，Ｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）において認識された）。（ｂ−ｃ）Ｔｕｋｅｙ事後検定を用いて一元配置ＡＮＯＶＡにより評価される場合に、^＊選択された比較に対してｐ＜０．０５；^＊＊選択された比較に対してｐ＜０．０１。 プロットを示しており、「Ｄ」と標識された列は、本出願人がヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を内部対照として使用したことを示す。２９ｄｐｔは形質導入の２９日後に対応し、ここで、Ｕ６−ｓｇＲＮＡ及びＥＦＳ−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏをコードする単一のレンチウイルスベクターをＨｅｐＧ２．２．１５細胞に形質導入した後、ピューロマイシンによる選択を行った。

本明細書の図面は単に説明のためのものであって、必ずしも正確な縮尺で描かれているわけではない。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分、及びこのような構成成分の送達（方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ＡＡＶを含む）、並びにこれらの製造及び使用（量及び製剤に関するものを含む）に関する一般情報（全て、本発明の実施において有用である）については以下が参照される：米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、及び同第８，８９５，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（ＥＰ１３８１８５７０．７号明細書）、欧州特許出願第２７６４１０３号明細書（ＥＰ１３８２４２３２．６号明細書）、及び欧州特許出願第２７８４１６２号明細書（ＥＰ１４１７０３８３．５号明細書）；並びに国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６９４号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、国際公開第２０１４／０９３５９５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０９号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６３５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６５５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。また、それぞれ２０１３年１月３０日、２０１３年３月１５日、２０１３年３月２８日、２０１３年４月２０日、２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日出願の、米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書、同第６１／８０２，１７４号明細書、同第６１／８０６，３７５号明細書、同第６１／８１４，２６３号明細書、同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書（それぞれ、２０１３年６月１７日出願）も付加的に参照される。さらに、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日出願の同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日出願の同第６１／９６０，７７７号明細書、及び２０１３年１０月２８日出願の同第６１／９６１，９８０号明細書も参照される。またさらに、国際特許出願：ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書（それぞれ、２０１４年６月１０日、６／１０／１４に出願）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書（２０１４年６月１１日出願）；及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書（２０１４年１０月２８日出願）、並びに米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、同第６１／９１５，２６７号明細書、及び同第６１／９１５，２６０（それぞれ２０１３年１２月１２日出願）；同第６１／７５７，９７２号明細書及び同第６１／７６８，９５９号明細書（２０１３年１月２９日及び２０１３年２月２５日出願）；同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、同第６１／８３５，９７３号明細書、及び同第６１／８３５，９３１号明細書（２０１３年６月１７日出願）；同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書（いずれも２０１４年６月１１日出願）；同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書（それぞれ２０１４年６月１０日出願）；同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書（それぞれ２０１４年２月１２日出願）；同第６１／９８０，０１２号明細書（２０１４年４月１５日出願）；同第６２／０３８，３５８号明細書（２０１４年８月１７日出願）；同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書（それぞれ２０１４年９月２５日出願）；及び同第６２／０６９，２４３号明細書（２０１４年１０月２７日出願）も参照される。また、米国仮特許出願第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書（２０１４年９月２５日出願）；米国仮特許出願第６１／９８０，０１２号明細書（２０１４年４月１５日出願）；及び米国仮特許出願第６１／９３９，２４２号明細書（２０１４年２月１２日出願）も参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書（２０１４年６月１０日出願）が参照される。米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書（２０１４年１月２２日出願）が参照される。米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書（それぞれ２０１３年１２月１２日出願）が参照される。米国仮特許出願第ＵＳＳＮ６１／９８０，０１２号明細書（２０１４年４月１５日出願）が参照される。特に米国を指定するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１４／４１８０６号明細書（２０１４年６月１０日出願）が参照される。米国仮特許出願第６１／９３０，２１４号明細書（２０１４年１月２２日出願）が参照される。米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書；同第６１／９１５，２６０号明細書及び同第６１／９１５，２６７号明細書（それぞれ２０１３年１２月１２日出願）が参照される。これらの特許、特許公開、及び特許出願のそれぞれ、並びにこれらの特許において又はこれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、並びにその出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、これらの特許又はこれらの特許中のいずれかの文献において言及されて参照により本明細書中に組み入れられる任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照によって本明細書中に組み入れられ、本発明の実施において使用され得る。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公開、及び特許出願、並びに出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により本明細書中に組み入れられる。

また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報については、以下を参照されたい（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３；
Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９，
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ ５，２０１４）（Ｈｓｕ ２０１４），
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１，
Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ オンラインで公表 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６，及び
Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンラインで公表 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．

Ｃｏｎｇらは、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方をベースとした真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、短鎖ＲＮＡによって誘導されて、ヒト細胞及びマウス細胞におけるＤＮＡの正確な切断を誘導できることを実証した。彼らの研究は、切断酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、変異原作用が最小限の真核細胞における相同組換え修復を容易にできることをさらに示した。加えて、彼らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、これにより哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能にすることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術が容易にプログラム可能であること及びその広範な適用性を実証している。細胞においてＲＮＡを用いて配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムするこの能力は、ゲノム工学ツールの新たなクラスを定義した。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、哺乳動物細胞に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム切断も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの態様をさらに改善して、その効率及び多用途性を高めることができることが企図され得る。

Ｊｉａｎｇらは、二重ＲＮＡと複合体を形成した、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。このアプローチは、標的ゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９依存性切断に依存して、突然変異しなかった細胞を殺し、選択マーカー又はカウンター選択系の必要性を回避した。この研究は、編集鋳型が単一ヌクレオチド変化及び複数ヌクレオチド変化を有するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性の再プログラミングを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡの同時の使用により多重突然変異誘発を可能にすることを示した。さらに、このアプローチが、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてリコンビニアリングと組み合わせて使用される場合、説明されるアプローチを用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、回収した６５％が突然変異を含んでいた。

Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらは、ＤＮＡ結合ドメインをベースとするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及び転写アクチベーター様エフェクターの光学的及び化学的調節を可能にする用途の広いロバストな技術についての当該技術分野の要求に対処した。

微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、２０ｎｔのガイド配列により特定のゲノム遺伝子座を標的とし、このガイド配列は、ＤＮＡ標的に対する特定のミスマッチを許容することができ、これにより不所望の標的外の突然変異を促進する。これに対処するために、Ｒａｎらは、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異を対ガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するアプローチを説明した。ゲノム中の個々の切れ目は、高い忠実性で修復されるため、適切にオフセットされたガイドＲＮＡによる同時ニッキングが、二本鎖切断に必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増加させる。著者らは、対ニッキング（ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋｉｎｇ）を用いて、細胞株において標的外活性を１／５０〜１／１，５００に低下させて、標的上の切断有効性を犠牲にすることなく、マウス接合体における遺伝子ノックアウトを容易にできることを実証した。この多用途戦略は、高い特異性を必要とする多様なゲノム編集用途を可能にする。

Ｈｓｕらは、標的部位の選択を知らせて標的外の影響を回避するためにヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特徴付けた。この研究は、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞の１００を超える推定ゲノム標的外遺伝子座における７００を超えるガイドＲＮＡ変異体及びＳｐＣＡｓ９誘導性挿入欠失変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９が、配列依存的に異なる位置でのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチを許容し、ミスマッチの数、位置、及び分布の影響を受けるという。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介切断がＤＮＡメチル化による影響を受けないこと、並びにＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの量を、標的外の変更を最小限にするために増減できることをさらに示した。加えて、哺乳動物ゲノムエンジニアリングの用途を拡大するために、著者らは、標的配列の選択及び評価及び標的外分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールを提供することを報告した。

Ｒａｎらは、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）によるＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツール、及び下流機能の研究のための改変細胞株の作製について説明した。標的外切断を最小限にするために、著者らは、対ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９ニッカーゼ突然変異を使用するダブルニッキング法についてさらに説明した。著者らによって提供されるプロトコルは、標的部位の選択、切断効率の評価、及び標的外の活性の分析についてのガイドラインを経験的に導き出した。この研究は、標的の設計から開始して、遺伝子改変を僅か１〜２週間で達成することができ、改変クローナル細胞系を２〜３週間以内に得ることができることを示した。

Ｓｈａｌｅｍらは、ゲノム規模で遺伝子機能を問い合わせる新たな方法について説明した。著者らの研究は、１８，０８０の遺伝子を標的とするゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの６４，７５１のユニークなガイド配列を用いた送達により、ヒト細胞におけるネガティブ選択スクリーニング及びポジティブ選択スクリーニングの両方が可能になることを示した。第１に、著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌細胞及び多能性幹細胞において細胞の生存に必須の遺伝子の同定を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、その減少が、変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高位の候補が、既に評価された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２、並びに新規にヒットしたＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同じ遺伝子を標的とする独立のガイドＲＮＡと高いヒット確認率との間の高いレベルの一貫性を観察し、従ってＣａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることを実証した。

Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらは、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を２．５Åの解像度で報告した。この構造により、その界面で正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を収容する、標的認識ローブとヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造が明らかになった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であるが、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの相補鎖の切断に適切な位置にあり、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシ末端ドメインも含む。この高解像度構造及び付随する機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機構を明らかにし、従って新規な多用途ゲノム編集技術の合理的設計の道が開かれた。

Ｗｕらは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が付加された化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、試験された４種類のｓｇＲＮＡのそれぞれが、ｓｇＲＮＡの５−ヌクレオチドシード領域によって頻繁に特徴付けられる数十〜数千のゲノム部位とＮＧＧプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）との間のｄＣａｓ９を標的とすることを示した。クロマチン非アクセシビリティ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により、マッチングシード配列を有するｄＣａｓ９の他の部位への結合が減少し；従って、標的外部位の７０％が遺伝子に関連する。著者らは、触媒活性Ｃａｓ９でトランスフェクトされたｍＥＳＣにおける２９５のｄＣａｓ９結合部位のターゲットシークエンシングにより、バックグラウンドレベルよりも高い突然変異部を１つしか同定されなかったことを示した。著者らは、シードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ）が結合をトリガーするが切断のために標的ＤＮＡとの広範な対合を必要とする、Ｃａｓ９の結合及び切断のための２状態モデルを提案した。

Ｈｓｕ ２０１４は、ヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を一般的に論じる総説であり、このゲノム編集には、２０１４年６月５日以前に出願された本出願の系統の出願の情報、データ、及び知見中にある細胞の遺伝子スクリーニングが含まれる。Ｈｓｕ ２０１４の一般的な教示は、特定のモデル、本明細書の動物に無関係である。

本発明又は出願の従来技術とは考えられないが、本発明の実施において考慮され得る、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ，“Ｄｉｍｅｒｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＦｏｋＩ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６）：５６９−７７（２０１４）についても言及される。

一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）で使用され、これらの系はまとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ］）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス−活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、又は本明細書で使用される語である「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核内又は細胞質内に位置する。一部の実施形態では、直接反復は、次の基準：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接したゲノム配列の２Ｋｂの枠内に見られる；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている、のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で特定することができる。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。

本発明の実施形態では、ガイド配列及びガイドＲＮＡという語は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と互換的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列されたときの、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約５０％を超える、約６０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができ、このような適切なアルゴリズムの非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づいたアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、若しくはそれ以上、又は約５を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２１を超える、約２２を超える、約２３を超える、約２４を超える、約２５を超える、約２６を超える、約２７を超える、約２８を超える、約２９を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約７５を超える、若しくはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、又はそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列に対する配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験するべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に導入し、続いて、標的配列内の優先的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験するべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分を用意し、そして標的配列における結合又は切断率を試験配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって試験管で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者であれば想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列として、標的ゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと見なす際に考慮する必要がない。一部の実施形態では、ガイド配列は、このガイド配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。一部の実施形態では、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約１％、若しくはそれより未満、又は約７５％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、若しくはそれ未満が、最適に折り畳まれるときの自己相補的塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの算出に基づいている。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。折り畳みアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズム（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）を用いて、ウィーン大学の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである。

一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に隣接したガイド配列の切除；及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進する、ｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列とｔｒａｃｒ配列の短い方の長さに沿った、これらの配列の最適なアラインメントについてである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、かつ二次構造、例えば、ｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列のいずれかの中の自己相補性をさらに考慮することができる。一部の実施形態では、最適に整列されたときのｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の短い方の長さに沿ったこれらの配列間の相補性の程度は、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約２５％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、若しくはそれを超える、又は約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約４０を超える、約５０を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、これらの配列間のハイブリダイゼーションが、二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を形成するように、単一転写物内に含まれる。本発明の一実施形態では、転写物又は転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、又は５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最多で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、ループの上流の最後の「Ｎ」の５’側の配列の部分がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分がｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に記載）、配列中の「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、小文字の第２のブロックはｔｒａｃｒ配列を表し、かつ最終ポリＴ配列は転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ．
一部の実施形態では、配列（１）〜（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（４）〜（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物とは別個の転写物である。

一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって後に予測することができる：１．反復を誘導する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における推定Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。

一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を含み得る。

毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要である。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞又は非ヒト真核動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、そしてディープシークエンシングを用いて潜在的な標的外ゲノム遺伝子座における変更の程度を分析することによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合は、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における変更のレベルを評価することができる。標的外の変更のレベルを最低にすると共に標的上の変更を最高レベルにする濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択するべきである。別法では、毒性及び標的外の影響のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対で送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。毒性及び標的外の影響を最小限にするガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と同様とすることができる。

ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系から有利に送達される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。

一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が、ゼロ、又は非突然変異型と比較してごく僅かであるときであり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する一部又は全ての残基において生じさせることができる（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、以下の突然変異の一部又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；また置換アミノ酸のいずれかの保存的な置換も企図される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの突然変異の同じ（又は保存的な）置換も好ましい。ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。ＳｐＣａｓ９のオーソログを、本発明の実施に使用することができる。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指し得るため、同定されたＣａｓ９であり得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からであるか、又はこれらに由来する。ＳｔＣａｓ９”は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、このタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在する。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はｓｐＣａｓ９も、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として収蔵されている。由来とは、本発明者らにおいては、由来酵素は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で大いに野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載される任意の方法で突然変異している（修飾されている）ことを意味する。Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのより多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位の配列において二本鎖の切断を果たし、この標的配列は、その２０のヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例として、本明細書に記載されるように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭが挙げられる）を有する。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断についてのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、このガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、及びＰＡＭ配列によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ及びＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載されている。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１の４つの遺伝子のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び短い長さの非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）が間に挿入された反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含む。この系では、標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、４つの連続ステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでこのハイブリダイズしたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成によってプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内にＤＳＢを生じさせる。２つの直接反復（ＤＲ）に隣接した単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイもまた、「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」という語に包含される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在し得る、又は誘導的に存在し得る、又は条件付きで存在し得る、又は投与され得る、又は送達され得る。Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。そしてＣａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。

コドン最適化配列の一例は、この場合には、真核生物、例えば、ヒトでの発現が最適化された配列（即ち、ヒトでの発現が最適化されている）、又は本明細書に記載の別の真核生物、動物、又は哺乳動物での発現が最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であり、かつヒト以外の他の宿主種のコドン最適化、又は特定の生物のコドン最適化も知られていることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されるものではないがヒトを含む哺乳動物、又は非ヒト真核生物、動物、又は本明細書に記載の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物若しくは霊長類であってもよいし、これらに由来するものでもよい。一部の実施形態では、ヒト又は動物に実質的な医学的利点が全くない、ヒト又は動物を苦しめる可能性の高い、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除することができる。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換える一方で、天然アミノ酸配列を維持することにより目的の宿主細胞での発現の促進のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合は、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現の減少、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は遺伝子産物の発現の増加に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能な挿入欠失の発生を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときに挿入欠失を効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメータであることを示唆する。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡがＤＮＡの逆鎖に切れ目を入れるため、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９ｎのＣａｓ９Ｈ８４０Ａでの置換は、オーバーハング型の逆のはずであるが；Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されず、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａが、全ＤＮＡ切断活性が実質的に欠損しているＣＲＩＳＰＲ酵素であることを示唆する（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれ未満であるときであり；これにより、一例は、非突然変異型と比較して、突然変異型のＤＮＡ切断活性がゼロ又はごく僅かである場合、例えば、生化学系又は原核生物系とは対照的に真核生物系におけるＣａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されない場合であり得る）。とはいえ、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを形成するｓｇＲＮＡの対は、原則として、代わりに対応する３’オーバーハング及び二重ニッキングを形成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎでの３’オーバーハングの形成をもたらすｓｇＲＮＡ対を別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用して、５’オーバーハング及び二重ニッキングを形成することができる。従って、一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載される、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によって切れ目が入れられる又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列、及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける調節エレメントを分離するために機能的に連結することができる。或いは、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡを、トランスジェニックＣａｓ９動物又は哺乳動物、例えば、Ｃａｓ９を構成的に、若しくは誘導的に、若しくは条件付きで発現する動物又は哺乳動物；或いは、他の方法、例えば、Ｃａｓ９をコードし、かつｉｎ ｖｉｖｏでＣａｓ９を発現する１つ又は複数のベクターの事前投与によりＣａｓ９を発現する、又はＣａｓ９を含む細胞を有する動物若しくは哺乳動物に送達することができる。別法では、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びこれらの構成成分が、上述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に記載されているように使用される。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡを別個に送達することができ；そして有利なことに、これらの少なくとも１つが、ナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるために、ガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは約２〜６時間）前に投与してもよい。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率の高いレベルのゲノム改変を達成するのに有用であろう。

一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、複数の細胞型内で標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）するステップを含む多種多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断部（例えば、一本鎖又は二本鎖の切断部）を形成する。例えば、この方法を使用して細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって形成された切断部は、修復プロセス、例えば、修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流の配列及び下流の配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。望ましい場合は、ドナーヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソーム若しくはポロキサマーと複合体を形成した核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であってもよいし、又は外因性の配列であってもよい。組み込まれる配列の例として、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、組み込みのための配列を、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結することができる。別法では、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は特に７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変する方法では、二本鎖の切断部をＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に導入し、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断部の存在は、鋳型の組み込みを促進する。他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ酵素の使用によってこの標的ポリヌクレオチドの発現を増加させる又は低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列を不活性化させて、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写が行われないようにすることができる。一部の方法では、制御配列を不活性化させて、この制御配列が制御配列として機能しなくなるようにすることができる。本明細書で使用される「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得；疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に直接関与する、又は疾患の病因に関与する遺伝子と連鎖不平衡である、突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物又は翻訳産物は、既知又は未知であり得、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に関連するはずであると考えられる；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例として、以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞内でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は低下するステップを含み；このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に、同様の考慮及び条件が上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏで全ての段階を行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。

実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分に関連する、ゲノム摂動又は遺伝子編集などの、配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に使用される系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。有利な実施形態において、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９である。本発明の方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系が、オフターゲット結合及びその結果生じる副作用を最小限にする又は回避することである。これは、標的ＤＮＡに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。

Ｃａｓ９
実施例において実証されるように、Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。キメラＣａｓ９タンパク質は、異なるＣａｓ９ホモログからの断片を組み合わせることによって作ることができる。例えば、Ｃａｓ９からの２つのキメラＣａｓ９タンパク質の例が本明細書に記載されている。例えば、本出願人は、Ｓｔ１Ｃａｓ９のＮ末端（このタンパク質の断片は保持される）をＳｐＣａｓ９のＣ末端と融合した。キメラＣａｓ９を作成する利点には、毒性の低減；真核細胞における発現の改善；特異性の増強；タンパク質の分子量の低下（例えば、異なるＣａｓ９ホモログからの最小ドメインを組み合わせることによりタンパク質をより小さくする）及び／又はＰＡＭ配列要求性の変更のいずれか又は全てが含まれる。

実施例において実証されるように、Ｃａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。本出願人は、ＤＮＡ標的の両方の鎖の切断に関与している２つの触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の突然変異によって、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するために、本出願人は転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）をＣａｓ９に融合した。他の転写活性化ドメインが知られている。実施例に示されるように、転写活性化が可能であると共に、標的遺伝子配列に結合し、従ってその活性を抑制するＣａｓ９リプレッサー（ＤＮＡ結合ドメイン）を用いて、遺伝子抑制も可能である。

Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人（例えば、男性成人）に基づく又は外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内であり、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子によって決まる。

ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ここで、ニューロン特異的発現（脳内に潜伏し得るウイルス）はＳｙｎａｐｓｉｎ Ｉプロモーターを使用することができる。

トランスジェニック動物及び植物
トランスジェニック動物も提供される。好ましい例としては、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド又はタンパク質自体という観点から、Ｃａｓ９を含む動物が挙げられる。マウス、ラット及びウサギが好ましい。本明細書に例示されるような構築物によりトランスジェニックマウスを作成するために、偽妊娠メス、例えばＣＢ５６メス由来の接合体の前核に純粋な線状ＤＮＡを注入することができる。次に、ファウンダーが同定され、遺伝子型が決定され、ＣＢ５７マウスと戻し交配され得る。次に、構築物がクローニングされ、任意選択で、例えばＳａｎｇｅｒシークエンシングによって検証され得る。例えばモデルにおいて１つ以上の遺伝子がノックアウトされる場合、ノックアウトが想定される。しかしながら、ノックインも（単独で又は組み合わせで）想定される。ノックインＣａｓ９マウス例を作成した。そしてこれは例示されているが、Ｃａｓ９ノックインが好ましい。Ｃａｓ９ノックインマウスを作成するために、本明細書に記載される（図２５Ａ〜Ｂ及び２６）ように、同じ構成的及び条件的構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座に標的化することができる。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書（Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡）の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修正され得る。別の実施形態では、Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡）の方法も、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修正され得る。

条件的Ｃａｓ９マウスの有用性：本出願人は、２９３細胞において、Ｃｒｅとの同時発現によってＣａｓ９条件的発現構築物を活性化できることを示した。また本出願人は、Ｃｒｅが発現されると、正しく標的化されたＲ１ ｍＥＳＣが活性Ｃａｓ９を有し得ることも示す。Ｃａｓ９の後にＰ２Ａペプチド切断配列が続き、及び次にＥＧＦＰが続くため、本出願人は、ＥＧＦＰの観察により発現の成功を確認する。本出願人は、ｍＥＳＣにおけるＣａｓ９活性化を示した。この同じ概念は、条件的Ｃａｓ９マウスを非常に有用するものである。本出願人は、条件的Ｃａｓ９マウスと、Ｃｒｅを普遍的に発現するマウス（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ系統）との交配により、全ての細胞においてＣａｓ９を発現するマウスを得ることができる。キメラＲＮＡの送達のみにより、胎仔又は成体マウスにおいてゲノム編集を誘導するべきである。興味深いことに、条件的Ｃａｓ９マウスを組織特異的プロモーターの下でＣｒｅを発現するマウスと交配させると、Ｃｒｅも発現する組織においてのみＣａｓ９が存在し得る。このアプローチを使用して、キメラＲＮＡを同じ組織に送達することにより、正確な組織においてだけゲノムを編集することができる。

一般的な送達
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９、及び／又は本発明のＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡは、任意の適切なベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のウイルスベクター型又はこれらの組み合わせなどのプラスミド又はウイルスベクターを使用して送達することができる。Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは１つ以上のベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターは、例えば筋肉内注射によって目的の組織に送達されるが、他の場合には送達は静脈内、経皮、鼻腔内、経口、粘膜、又は他の送達方法による。このような送達は単回投与又は複数回投与であり得る単回投与又は複数回投与のいずれかによることができる。当業者は、本明細書における送達される実際の投薬量が、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、治療対象の全身状態、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方式、求められる形質転換／改変のタイプなどの様々な要因に応じて大幅に異なり得ることを理解する。

このような投薬量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容可能な担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／又は当該技術分野において既知の他の化合物をさらに含有し得る。投薬量は、１つ以上の薬学的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩をさらに含有し得る。さらに、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化材料、香味料、着色料、マイクロスフェア、ポリマー、懸濁剤なども本明細書において存在し得る。加えて、１つ以上の他の従来の医薬品成分、例えば防腐剤、保湿剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、アンチケーキング剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定剤なども、特に剤形が再構成可能な形態である場合に存在し得る。適切な例示的な成分には、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールパラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン及びこれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容可能な賦形剤についての詳細な考察は、参照により本明細書に組み込まれるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。

本明細書の一実施形態では、送達はアデノウイルスにより、この送達は、少なくとも１×１０^５の粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単回ブースター投与であり得る。本明細書の一実施形態では、この用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０^６の粒子（例えば、約１×１０^６〜１×１０^１２の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０^７の粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０^８の粒子（例えば、約１×１０^８〜１×１０^１１の粒子又は約１×１０^８〜１×１０^１２の粒子）、そして最も好ましくは少なくとも約１×１０^０の粒子（例えば、約１×１０^９〜１×１０^１０の粒子又は約１×１０^９〜１×１０^１２の粒子）、又はさらに少なくとも約１×１０^１０の粒子（例えば、約１×１０^１０〜１×１０^１２の粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、用量は、約１×１０^１４以下の粒子、好ましくは約１×１０^１３以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０^１２以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０^１１以下の粒子、そして最も好ましくは約１×１０^１０以下の粒子（例えば、約１×１０^９以下の粒子）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０^６の粒子単位（ｐｕ）、約２×１０^６ｐｕ、約４×１０^６ｐｕ、約１×１０^７ｐｕ、約２×１０^７ｐｕ、約４×１０^７ｐｕ、約１×１０^８ｐｕ、約２×１０^８ｐｕ、約４×１０^８ｐｕ、約１×１０^９ｐｕ、約２×１０^９ｐｕ、約４×１０^９ｐｕ、約１×１０^１０ｐｕ、約２×１０^１０ｐｕ、約４×１０^１０ｐｕ、約１×１０^１１のｐｕ、約２×１０^１１ｐｕ、約４×１０^１１ｐｕ、約１×１０^１２ｐｕ、約２×１０^１２ｐｕ、又は約４×１０^１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの単回用量を含有し得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる２０１３年６月４日にＮａｂｅｌらに付与された米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書のアデノウイルスベクターを参照され、投与量は、その段落２９の３６〜５８行目を参照される。本明細書の一実施形態では、アデノウイルスは、複数回投与によって送達される。

本明細書の一実施形態では、送達はＡＡＶによる。ＡＡＶのヒトへのｉｎ ｖｉｖｏ送達のために治療的に有効な投薬量は、約１×１０^１０〜約１×１０^１０の機能的ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含む約２０〜約５０ｍｌの範囲の生理食塩水であると考えられる。投投薬量は、治療効果をあらゆる副作用に対してバランスさせるために調整することができる。本明細書の一実施形態では、ＡＡＶの用量は、一般に約１×１０^５〜１×１０^５０のゲノムＡＡＶ、約１×１０^８〜１×１０^２０のゲノムＡＡＶ、約１×１０^１０〜約１×１０^１６のゲノム、又は約１×１０^１１〜約１×１０^１６のゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投薬量は、約１×１０^１３のゲノムＡＡＶであり得る。このような濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達することができる。他の有効な投薬量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験によって当業者により容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日にＨａｊｊａｒらに付与された米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書の段落２７の４５〜６０行目を参照されたい。

本明細書の一実施形態では、送達はプラスミドによる。このようなプラスミド組成物では、投薬量は、プラスミドが応答を引き出すのに十分な量にするべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量は、７０ｋｇの人で約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに機能的に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択可能なマーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流の、（ｉｉ）に機能的に連結された転写ターミネーターを含む。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクターにコードされても良い。

本明細書の用量は、平均７０ｋｇの人に基づいている。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内である。また、実験に使用されるマウスは、典型的には、約２０ｇであり、マウスの実験から、７０ｋｇの人にスケールアップすることができることに留意されたい。

一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子はリポソーム又はリポフェクション製剤などで送達され、当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書に記載されている。哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの増強及び改善された送達を特に目的とした送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４； Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０； Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９： ２１０−２１６； Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７： ７６１−７６６； Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２： １０７−１０８、及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１： ２７１７−２７２４を参照）、本発明に適用され得る。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類での遺伝子発現の阻害のための使用に成功している（例えば、本発明にも適用され得るＴｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたい）。

実際、ＲＮＡの送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣａｓ９及びｇＲＮＡ（及び、例えば、ＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９の送達及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム、又はナノ粒子によって行うことができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のためにリポソーム粒子内にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。

ＲＮＡの送達手段はまた、好ましくは、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を含む。実際、エキソソームは、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系の送達に特に有用なはずである。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）に、エキソソームがいかに、様々な生物学的障壁を越える薬物送達にとっての有望なツールであるか、そしてｉｎ ｖｔｉｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかが記載されている。このアプローチでは、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションにより標的エキソソームを作製する。次いで、エキソソームが精製され、トランスフェクトされた細胞上清から特徴付けられ、次いで、ＲＮＡがエキソソーム内に導入される。限定されるものではないが特に脳への本発明による送達又は投与は、エキソソームを用いて行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９ （Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達する方式と同様の方式で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬで満たされ、Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ； Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）によりマウスに注入した。脳注入カニューレを、背側第３脳室内への注入のために正中線におけるブレグマの後約０．５ｍｍに配置した。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法により同程度の標的の減少をもたらすことができることを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを本発明においてヒトで企図することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５ （Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達の方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、１×１０^９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターで発現される同様の量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを本発明においてヒトで企図することができ、例えば、１×１０^９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスでの、脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

脳への局所送達に関して、これを様々な方法で達成することができる。例えば、物質を、例えば、注入により線条体内に送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。

ＮＨＥＪ効率又はＨＲ効率を高めることも送達に役立つ。ＮＨＥＪ効率は、末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）の同時発現によって高められることが好ましい。ＨＲ効率は、ＮＨＥＪ装置、例えば、Ｋｕ７０及びＫｕ８６の一過性の阻害によって増大されるのが好ましい。ＨＲ効率はまた、原核生物又は真核生物相同組換え酵素、例えば、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡの同時発現によっても増大させることができる。

一般的なパッケージング及びプロモーター
ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム改変を媒介するためにＣａｓ９コード核酸分子、例えば、ＤＮＡをベクター、例えば、ウイルスベクター内にパッケージングする方法は以下を含む：
ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため
単一ウイルスベクター：
２つ以上の発現カセットを含有するベクター：
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターのサイズ制限まで）
二重ウイルスベクター：
Ｃａｓ９の発現を駆動するための１つの発現カセットを含有するベクター１
プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター
１つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するためのもう１つの発現カセットを含有するベクター２
プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター
プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（ベクターサイズ制限まで）
相同組換え修復を媒介するため。

上記の単一及び二重ウイルスベクターアプローチに加えて、を送達するために付加的なベクターが使用される。相同組換え修復鋳型を送達することができる。

Ｃａｓ９コード核酸分子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：
ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、付加的なプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）が必要ないという点で有利である。自由になった追加の空間を使用して、付加的なエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現を駆動することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ９の過剰発現による潜在的な毒性を低減するために使用することができる。
遍在発現のために、プロモーター：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、フェリチン重鎖又は軽鎖などを使用することができる。
脳又は他のＣＮＳ発現のために、プロモーター：全てのニューロンに対するシナプシンＩ、興奮性ニューロンに対するＣａＭＫＩＩα、ＧＡＢ作動性ニューロンに対するＧＡＤ６７又はＧＡＤ６５又はＶＧＡＴなどを使用することができる。
肝臓発現のために、アルブミンプロモーターを使用することができる。
肺発現のために、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
内皮細胞のために、ＩＣＡＭを使用することができる。
造血細胞のために、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
骨芽細胞のために、ＯＧ−２を使用することができる。

ガイドＲＮＡを駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：
Ｕ６又はＨ１などのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター
ｇＲＮＡを発現させるためのＰｏｌ ＩＩプロモーター及びイントロンカセットの使用。

アデノ随伴ウイルスウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルスの製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶの製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人（例えば、ヒト成人男性）に基づく又は外挿することができ、そして患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に対して調整することができる。投与の頻度は、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子に応じて、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ニューロン特異的発現（例えば、ＣＮＳ障害を標的とする場合）はＳｙｎａｐｓｉｎ Ｉプロモーターを使用することができる。

ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関しては、ＡＡＶは、いくつかの理由で他のウイルスベクターよりも有利である：
毒性が低い（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る）
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす可能性が低い。

ＡＡＶは、４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。これは、Ｃａｓ９並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て、同じウイルスベクター内に収められなければならないことを意味する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物は、ウイルスの産生を大幅に減少させ得る。ＳｐＣａｓ９は非常に大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超えるため、ＡＡＶ内にパッキングすることが困難である。従って、本発明の実施形態は、比較的短いＣａｓ９のホモログを利用することを含む。例えば：

従ってこれらの種は、一般に、好ましいＣａｓ９種である。

ＡＡＶについては、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せであり得る。標的とすべき細胞に関するＡＡＶについてＡＡＶを選択することができ；例えば、脳又は神経細胞を標的とする場合は、ＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せを選択することができ；心臓組織を標的とする場合はＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓への送達に有用である。本明細書のプロモーター及びベクターは個々に好ましい。これらの細胞についての特定のＡＡＶ血清型の表（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）は次の通りである。

レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸核分裂細胞及び分裂終了細胞の両方に感染してその遺伝子を発現させる能力を有する複合レトロウイルスである。最も良く知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的とする。

レンチウイルスは、以下のように好ましいであろう。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド主鎖を含む）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清が添加された、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中でのトランスフェクションの前日にＴ−７５フラスコに播種して５０％コンフルエンスにした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び次のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇ偽型）、及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）でトランスフェクトした。陽イオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中でトランスフェクションを行った。６時間後に、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質を含まないＤＭＥＭに交換した。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清法が好ましい。

レンチウイルスを以下のように精製することができる。４８時間後にウイルス上清を回収した。まずこの上清からデブリを除去し、これを、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターに通してろ過した。次いで、上清を、２４，０００ｒｐｍで２時間、超遠心機にかけた。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中、４℃で一晩再懸濁した。次いで、これを等分して−８０℃で急速冷凍した。

別の実施形態では、特に眼の遺伝子療法（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５を参照）のための、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとした最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、網型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療用の網膜下注入により送達されるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、即ち、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスをベースとしたレンチウイルス遺伝子療法ベクターも企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２））、このベクターは、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のために改変され得る。

別の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖ、核局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムによって共有される共通のエキソンを標的とするｓｉＲＮＡを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用することができ、そして／あるいは適合させることができる。患者の体重１ｋｇ当たり最低でも２．５×１０^６のＣＤ３４＋細胞を収集して、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、２×１０^６細胞／ｍｌの濃度で１６〜２０時間、前刺激することができる。前刺激した細胞を、フィブロネクチンがコーティングされた７５ｃｍ^２の組織培養フラスコ（２５ｍｇ／ｃｍ^２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で１６〜２４時間、５重感染でレンチウイルスを用いて形質導入することができる。

レンチウイルスベクターはパーキンソン病の治療で開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書並び米国特許第７，３０３，９１０号明細書及び同第７，３５１，５８５号明細書を参照されたい。またレンチウイルスベクターは眼の疾患の治療でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、同第２００９０００７２８４号明細書、同第２０１１０１１７１８９号明細書；同第２００９００１７５４３号明細書；同第２００７００５４９６１号明細書、同第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。またレンチウイルスベクターは脳への送達でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；同第２０１１０２９３５７１号明細書、同第２００４００１３６４８号明細書、同第２００７００２５９７０号明細書、同第２００９０１１１１０６号明細書、及び米国特許第７，２５９，０１５号明細書を参照されたい。

ＲＮＡの送達
ＲＮＡの送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９及び／又は本発明のＲＮＡのいずれか、例えばガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて作製することができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、次のエレメント：βグロビン−ポリＡ尾部（１２０以上の一連のアデニン）からのＴ７＿プロモーター−ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含有するカセットからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて転写することができる。

発現を増強し、かつ可能性のある毒性を低減するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡは、例えば、偽Ｕ又は５−メチル−Ｃを用いて、１つ以上の改変ヌクレオチドを含むように改変され得る。

ｍＲＮＡ送達法は、現在、肝臓への送達に特に有望である。

ＲＮＡ送達についての多くの臨床研究はＲＮＡｉ又はアンチセンスに集中しているが、これらの系は、本発明の実施のためにＲＮＡの送達に適合させることができる。従って、ＲＮＡｉなどについての以下の参照文献を読むべきである。

ナノ粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて同時に送達することができる。例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、リン脂質二重層シェルによって覆われたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子について記載している。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ構成成分は、エンドソームの破壊を促進するために選択されたが、脂質表面層は、ポリカチオンコアの毒性を最小限にするために選択された。従って、これらは、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。

一実施形態では、自己構築生体接着ポリマーに基づいたナノ粒子が企図され、このナノ粒子は、全て脳への送達であるペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用することができる。他の実施形態、例えば、疎水性薬物の経口吸収及び眼送達も企図される。分子エンベロープ技術は、保護された疾患部位に送達される改変ポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織によって単回投与又は複数回投与である。

一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍の成長を停止させることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室は、新たな生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤を完全に自動化した組み合わせシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３を参照されたい。米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与にも特に有用な脂質化合物に関し、この脂質化合物は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様では、アミノアルコール脂質化合物は、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成するために細胞又は対象に送達するべき作用物質と組み合わせられ、粒子、リポソーム、又はミセルによって送達するべき作用物質は、気体、液体、又は固体の形態であり得、この作用物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であり得る。このアミノアルコール脂質化合物は、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子を、任意に医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコール脂質化合物を調製する方法を提供する。アミンの１つ以上の等価物を、本発明のアミノアルコール脂質化合物を形成するのに適切な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させる。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基が、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成するわけではなく、従ってアミノアルコール脂質化合物中に第１級アミン又は第２級アミンが形成される。これらの第１級アミン又は第２級アミンは、そのまま残る、又は別の求電子体、例えば、異なるエポキシド末端化合物と反応することができる。当業者には分かるように、アミンを過剰未満のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数の尾部を有する複数の異なるアミノアルコール脂質化合物が生じる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で十分に官能性を持たせることができるが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部では十分に官能性を持たない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分から離れた１つ、２つ、３つ、又は４つのエポキシド由来化合物尾部を含み得、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンが形成される。特定の実施形態では、全てのアミノ基が、完全には官能性を持たない。特定の実施形態では、２つの同じタイプのエポキシド末端化合物が使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコール脂質化合物の合成は、溶媒を用いて又は用いずに行われ、この合成は、３０〜１００℃の高温、好ましくは約５０〜９０℃で行うことができる。調製したアミノアルコール脂質化合物は、任意に精製することができる。例えば、アミノアルコール脂質化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコール脂質化合物を得ることができる。又は、この混合物を精製して特定の立体異性体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコール脂質化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化することもでき、かつ／又はアシル化することもできる。米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコール脂質化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコール脂質化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを含む高スループット技術を用いて調製及び／又はスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、アミノアルコール脂質化合物は、ポリヌクレオチド又は他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞内にトランスフェクトするその能力についてスクリーニングされる。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、組み合わせ重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（例えば、医療器具又はインプラント用の薄膜又は多層薄膜のコーティング）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細パターン化剤、及び細胞封入剤としてバイオテクノロジー及び医用用途に使用することができる。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、その化学構造により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で異なるレベルの炎症を引き起こした。このクラスの材料の幅広い化学的多様性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの活性を阻害するポリマーコーティングを特定することができた。さらに、これらのコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、かつカルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下注入後の線維症を軽減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合カプセルを形成することができる。本発明はまた、例えば、抗菌コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織のエンジニアリングなどの多くの他の生物学的用途も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。

別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も企図される。特に、脂質ナノ粒子内に封入された抗トランスサイレチン短鎖干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）が、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。静脈投与される体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１ｍｇの用量が企図される。注入に関連した反応のリスクを軽減する薬剤が企図され、例えば、デキサメタゾン、アセトアンピノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが企図される。合計５回の４週間ごとの約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回投与も企図される。ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示され（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３−４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達が企図される。２週間毎のＬＮＰの６ｍｇ／ｋｇの約４回の投与が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏらは、最初の２サイクルの０．７ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ投与後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルの終了までに、患者が、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を含む部分反応を達成したことを実証した。完全反応が、この患者での４０回の投与後に得られ、この患者は、寛解期を維持し、２６か月に亘る投与後に処置を終了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤での前治療の後に進行した、腎臓、肺、及びリンパ節を含む疾患の肝外部位及びＲＣＣを有する２人の患者は、約８〜１２か月間全ての部位で疾患が安定しており、ＰＮＥＴ及び肝転位を有する患者は、疾患が安定した状態で１８か月間（３６回の投与）の延長研究を続けた。しかしながら、ＬＮＰの変化を考慮しなければならない。カチオン性脂質を、細胞内送達を促進する単層構造を誘導するために負に帯電した脂質と組み合わせる。帯電ＬＮＰは、静脈注射の後に循環から迅速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン性カチオン性脂質を開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。負に帯電したポリマー、例えば、ｓｉＲＮＡを低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに導入し、このイオン性脂質は正電荷を示すことができる。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、長い循環時間に適合する低い表面電荷を示す。４種類のイオン性カチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡで）、１，２−ジリノレイオキシケト（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙｋｅｔｏ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に集中した。これらの脂質を含むＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を示し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するシリーズＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従って異なる効力を有することが示された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。特に、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含む製剤の場合は、１μｇ／ｍｌレベルの用量が企図され得る。

ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。カチオン性脂質、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシケト−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−Ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から与えられてもよいし、又は合成してもよい。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０のモル比）のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含むＬＮＰに封入することができる。必要に応じて、０．２％ ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を封入して、細胞の取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価することができる。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）からなる脂質混合物をエタノール中で溶解して、１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度にすることによって行うことができる。この脂質のエタノール溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して多重小胞を形成し、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度にすることができる。押し出し機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて二重の８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに多層小胞を通した後に、大きい単層小胞を形成することができる。この押し出されて事前に形成された大きい単層小胞に、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に２ｍｇ／ｍｌに溶解したＲＮＡを滴下し、そして０．０６／１ ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることによって封入を達成することができる。エタノールの除去及び製剤緩衝液の中和を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対する１６時間の透析によって行った。ナノ粒子のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒子選別機（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を小胞／強度モードで用いた動的光散乱、及びガウシアンフィッティングによって決定することができる。３つ全てのＬＮＰ系の粒子サイズは、直径が約７０ｎｍであり得る。ｓｉＲＮＡの封入効率は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、透析の前及び後に収集されたサンプルからの遊離ｓｉＲＮＡの除去によって決定することができる。封入ＲＮＡは、溶出ナノ粒子から抽出することができ、２６０ｎｍで定量することができる。ｓｉＲＮＡの脂質に対する比は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のコレステロール酵素アッセイを用いた小嚢中のコレステロール含有量の測定によって決定した。大きいＬＮＰの調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度）を、５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含むエタノール中で調製することができる。酢酸ナトリウムを、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で脂質プレミックスに添加することができる。続いて、この混合物を強く撹拌しながら１．８５倍量のクエン酸塩緩衝液（（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と化合させることによって脂質を水和させることができ、これにより、３５％エタノールを含む水性緩衝液中に自然にリポソームが形成される。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒子サイズを時間依存性に増加させることができる。インキュベーション中の様々な時間にアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によってリポソームのサイズの変化を評価することができる。所望の粒子サイズが達成されたら、水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）をリポソーム混合物に添加して、全脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度にすることができる。ＰＥＧ−脂質の添加時に、リポソームは、そのサイズがさらに成長するのを効果的に停止するべきである。次いで、ＲＮＡを、ｓｉＲＮＡと全脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）で空のリポソームに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートして充填ＬＮＰを形成することができる。続いて、この混合物を、ＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５−μｍシリンジフィルターでろ過することができる。

Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ^ＴＭ）構築物及び他のナノ粒子（特に、金ナノ粒子）も、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を目的の標的に送達するための手段として企図される。かなりのデータにより、核酸で機能化された金ナノ粒子に基づいたＡｕｒａＳｅｎｓｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ^ＴＭ））構築物は、以下のような複数の重要な成功因子に基づいて、代替のプラットフォームよりも優れていることが示される：高ｉｎ ｖｉｖｏ安定性（これらの高密度の負荷のために、大部分のカーゴ（ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ）は細胞内部で構築物に結合したままであり、核酸安定性及び酵素分解に対する抵抗性が付与される）。送達性（研究した全ての細胞型（例えば、ニューロン、腫瘍細胞株など）について、構築物は担体又はトランスフェクション剤を必要とせずに９９％のトランスフェクション効率を実証する）。治療の標的化（構築物の独特の標的結合親和性及び特異性により、一致した標的配列に対する精巧な特異性が可能になる（即ち、オフターゲット効果が限定される））。優れた効力（構築物は、主要な従来のトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００及びシトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））よりも性能が著しく優れている）。低毒性（構築物は、明らかな毒性を伴わずに様々な培養細胞、初代細胞、及び組織に侵入することができる）。顕著な免疫応答なし（構築物は、全ゲノムマイクロアレイ研究及びサイトカイン特異的タンパク質アッセイにより測定される際に、包括的な遺伝子発現の最小限の変化を起こす）。化学的な調整可能性（任意の数の単一又は組み合わせの薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を用いて、構築物の表面を調整することができる）。核酸ベースの治療のためのこのプラットフォームは、炎症及び感染症、癌、皮膚障害及び心血管疾患を含む多数の病状に適用可能であり得る。引用可能な文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１１３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。

ｓｉＲＮＡを含む自己構築ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端部に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管を標的とし、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡを送達し、これにより腫瘍の血管新生をもたらすために使用される手段として使用して形成することができる（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に付与して調製することができる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。約１００〜２００ｍｇの用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓらの自己構築ナノ粒子での送達のために考えられる。

Ｂａｒｔｌｅｔｔら（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔらのナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に加えて調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。ＢａｒｔｌｅｔｔらのＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを次のように合成した：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で注文した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）中のアミン修飾ＲＮＡセンス鎖及び１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒと共に微小遠心管に加えた。室温で４時間撹拌して内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンス鎖コンジュゲートをエタノール沈殿させ、水に再懸濁し、そして未修飾アンチセンス鎖にアニーリングさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。微量の金属汚染物を除去するために全ての液体をＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で処理した。Ｔｆ標的ｓｉＲＮＡナノ粒子及びＴｆ非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を、シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用して形成することができる。典型的には、ナノ粒子は、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で、水中で形成された。標的ナノ粒子の表面上の１％のアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆで修飾した（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。このナノ粒子を、注入のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液に懸濁した。

Ｄａｖｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を用いるｓｉＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準癌療法では効果がない固形癌の患者に、３０分間の静脈注射により２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に標的ナノ粒子が投与される。ナノ粒子は：（１）線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、既にｓｉＲ２Ｂ＋５として示された）を含む合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが以前から知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（ＣＡＬＡＡ−０１として示される臨床型）は、非ヒト霊長類での複数回投与試験で十分に耐容性であることが示されている。一人の慢性骨髄性白血病患者に、リポソーム送達によってｓｉＲＮＡが投与されたが、Ｄａｖｉｓらの臨床試験は、標的送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身に送達して、固形癌患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達系が、機能的ｓｉＲＮＡをヒト腫瘍に有効に送達できるかを確認するために、Ｄａｖｉｓらは、３つの異なる投薬コホートを構成する３人の患者：それぞれが転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４、及び３０ｍｇ／ｍ^２の用量のＣＡＬＡＡ−０１が投与された患者Ａ、Ｂ、及びＣからの生検を調べた。本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系でも同様の用量が企図され得る。本発明の送達は、線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むナノ粒子で達成することができる。

エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性ナノ−小胞であり、それは、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡを脳及び他の標的臓器に送達することができる。免疫原性を低減するために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、エキソソームの作製に自己由来樹状細胞を使用した。標的とすることは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチド３に融合したＬａｍｐ２ｂ、エキソソーム膜タンパク質を発現させるために樹状細胞をエンジニアリングすることによって達成した。精製エキソソームを、エレクトロポレーションによって外因性ｓｉＲＮＡに付加した。静脈注射されたＲＶＧ−標的エキソソームは、特に脳内のニューロン、小膠細胞、乏突起膠細胞にＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを送達し、結果として特定の遺伝子ノックダウンが起きた。ＲＶＧエキソソームへの事前曝露は、ノックダウンを弱めず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）のノックダウンによって実証された。免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化物質、例えば、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６を含まない大量のエキソソームを産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、７日間、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心分離プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。得られたエキソソームは、物理的に均質であり、サイズ分布は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定される８０ｎｍの直径でピークであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１０^６細胞当たり６〜１２μｇ（タンパク質濃度に基づいて測定）のエキソソームを得た。次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ナノスケールの適用例に適合されたエレクトロポレーションプロトコルを用いて、外因性カーゴが改変エキソソームに導入される可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションが十分には特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを、エレクトロポレーションのプロトコルの経験的な最適化に使用した。封入されるｓｉＲＮＡの量を、エキソソームの超遠心分離及び溶解の後に分析した。４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーションにより、ｓｉＲＮＡが最大に保持されたため、後の全ての実験にこれを使用した。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１５０μｇのＲＶＧエキソソーム中に封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ノックダウン効率を４つの対照：未処置マウス、ＲＶＧエキソソームのみが注射されたマウス、ｉｎ ｖｉｖｏカチオン性リポソーム試薬と複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ、即ち、ｓｉＲＮＡに静電結合する９Ｄ−アルギニンにコンジュゲートしたＲＶＧペプチドと複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウスと比較した。皮質組織サンプルを、投与の３日後に分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ処置マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム処置マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、これは、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％［＋又は−］１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％［＋又は−］１３％、Ｐ＜０．０１）から生じた。さらに、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム処置動物において、アルツハイマー病の病理におけるアミロイドプラークの主成分である全［β］−アミロイド１〜４２のレベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、ＢＣＡＥ１阻害剤の脳室内注射後の正常なマウスで実証されたβ−アミロイド１〜４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＢＣＡＥ１切断産物におけるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５’迅速増幅を行い、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介ノックダウンのエビデンスを得た。最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ−αの血清濃度を評価することによってｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導したか否かを調べた。ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソーム処置の後、全てのサイトカインにおける有意でない変化が、ＩＬ−６の分泌を強力に刺激するｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的なｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬処置と同様に記録され、エキソソーム処置の免疫学的に不活性なプロフィールが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないとすると、ＲＶＧエキソソームでの送達は、同等のｍＲＮＡのノックダウン及びより大きなタンパク質のノックダウンが、対応するレベルの免疫刺激無しで１／５のｓｉＲＮＡで達成されたため、ＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であると思われる。この実験は、ＲＶＧエキソソーム技術の治療の可能性を実証し、この治療は、神経変性疾患に関連した遺伝子の長期間のサイレンシングに適している可能性がある。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらのエキソソーム送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療標的、特に神経変性疾患への送達に適用することができる。本発明では、約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入される約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量が企図され得る。

Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのようにすれば培養細胞由来のエキソソームをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかを開示している。このプロトコルはまず、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作製を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、トランスフェクト細胞の上清からのエキソソームの精製及び特徴付けの方法を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｓｉＲＮＡをエキソソームに導入する重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでマウスの脳にｓｉＲＮＡを効率的に送達するためにエキソソームをどのように使用するかを概説する。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達が機能アッセイ及びイメージングによって評価される予想結果の例も示される。全プロトコルには、約３週間かかる。本発明による送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されるエキソソームを用いて行うことができる。

別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含む多くの細胞型で産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向き出芽によって形成され、次いで、血漿膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、自然に細胞間でＲＮＡを輸送するため、この特性は、遺伝子療法に有用であり得るであろう。

血漿からのエキソソームは、９００ｇでの２０分間の軟膜の遠心分離によって血漿を分離し、そして細胞上清を回収し、３００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、そして１６５００ｇで３０分間遠心分離し、次いで０．２２ｍｍフィルターに通して濾過することによって調製する。１２００００ｇでの７０分間の超遠心分離によってエキソソームをペレット化する。ｓｉＲＮＡのエキソソームへの化学的トランスフェクションを、ＲＮＡｉ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造者の取扱説明書に従って行う。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌのＰＢＳに加えて、２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度にする。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後、混合物をＲＴで１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／流酸塩ラテックスビーズを用いてエキソソームを再分離する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓのエキソソームへの化学的なトランスフェクションを、ｓｉＲＮＡと同様に行うことができる。エキソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共に培養することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含むエキソソームを単球及びリンパ球に導入して、ヒトに自己再導入できることが企図され得る。従って、本発明による送達又は投与は、血漿エキソソームを用いて行うことができる。

リポソーム
本発明による送達又は投与は、リポソームで行うことができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲んでいる単膜又は多重膜の脂質二重層及び比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層から構成された球形小胞構造である。リポソームは、生体適合性かつ非毒性であり、親水性薬物分子及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、その充填物を生体膜を通過させて血液脳関門（ＢＢＢ）に輸送するため、薬物送達担体としてかなりの注目を集めた（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７（参照用）を参照されたい）。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から形成することができるが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを形成するために最もよく使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自然に起こるが、ホモジナイザー、超音波処理器、又は押し出し機を用いることによって振蘯の形態で力を加えることによって促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加することができる。リポソーム構造を安定させて、リポソーム内部のカーゴの漏れを防止するために、例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズが、約５０〜１００ｎｍに調整された（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。従来のリポソーム製剤は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドから構成される。この製剤は、リン脂質のみから調製されるため、リポソーム製剤は、多数の課題に直面し、その１つが血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するためにいくつかの試み、特に脂質膜の処置が行われた。これらの試みの１つは、コレステロールの処置に重点を置いた。従来の製剤へのコレステロールの添加は、封入された生物活性化合物の血漿への急速な放出を低減する、又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が安定性を高める（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。特定の有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（Ｔｒｏｊａｎ Ｈｏｒｓｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルをｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで確認することができる。これらの粒子は、血管注入後に脳全体に導入遺伝子を送達することができる。限定されるものではないが、特定の抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子は、エンドサイトーシスにより血液脳関門を通過できると考えられる。トロイの木馬リポソームを利用して血管注入によってヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達すると仮定し、これにより、胎児を操作しなくても全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームでの約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が企図され得る。

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）で投与することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ中の標的とされる特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が企図される。毎日の処置を約３日間行い、次いで週１回の投与を５週間行うことができる。別の実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与されるＳＮＡＬＰに封入された特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓも企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含み得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。

別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来肝腫瘍では効果的な分子の送達が証明されたが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では証明されなかった（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを４８／４０／１０／２モル比で、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと調合することによって調製することができる。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍの大きさである。

なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレオイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈注入として、１投与当たり約２ｍｇ／ｋｇの用量の全ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究に使用される製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。

ＲＮＡｉナノ薬剤の安全性プロフィールが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって再検討された（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−ｐＨの低いカチオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から構成されている。この粒子は、直径が約８０ｎｍであり、生理学的ｐＨで中立電荷である。製剤中、イオン性脂質は、粒子形成中にアニオン性ｓｉＲＮＡで脂質を凝縮する役割を果たす。酸性が強まるエンドソーム条件下で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合を媒介し、ｓｉＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ−脂質は、粒子を安定させ、かつ製剤中の凝集を軽減し、かつ薬物動態学的特性を改善する中性で親水性の外部を後に提供する。

今日まで、ＳＮＡＬＰ ｓｉＲＮＡ製剤を用いた２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人ボランティアでＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第１相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸で発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの構築及び分泌に必須である。１７人の対象が、ＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。（前臨床試験に基づいて潜在的な用量制限毒性と予想された）肝臓毒性は見られなかった。最も高い用量の（２人のうちの）１人の対象が、免疫系の刺激に一致するインフルエンザに似た症状を示し、この試験を結論付ける決定がなされた。Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、突然変異型及び野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的としてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する。３つのＡＴＴＲ症状が説明されている：家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−共にＴＴＲにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。近年、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量増加第１相試験がＡＴＲの患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡを基準）の用量範囲で、３１人の患者（試験薬物の２３人とプラセボの８人）に１５分の静脈注入として投与された。処置は、肝機能試験で有意な増加が見られず、良好な耐容性を示した。注射関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、２３人の患者のうち３人で見られ；全てが、注入速度の低下に応答し、全てで試験を継続した。血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＩＬ−１ｒａの最小限及び一過性の上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で２人の患者に見られた（これは前臨床及びＮＨＰ試験から予測された）。血清ＴＴＲの低下により、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の予想された薬力学的効果が、１ｍｇ／ｋｇで観察された。

なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を可溶化することによって行うことができ、これらはそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で、エタノールで可溶化されている（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、混合して最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出しの前に２２℃で２分間平衡化した。この水和脂質を、動的光散乱分析によって決定される７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまでＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて２２℃で、孔径が８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これには、一般に、１〜３回の通過が必要である。（３０％エタノールを含む５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４の水溶液に可溶化された）ｓｉＲＮＡを、混合しながら約５ｍｌ／分の速度で、前平衡化した（３５℃）小胞に添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析又は接線流透析濾過によって外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５）で置換した。ｓｉＲＮＡを、制御された段階希釈法のプロセスを用いてＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。封入粒子が形成されたら、使用の前にＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌した。平均粒子サイズは、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が、脂質粒子内に封入された。ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用される製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を、１０ｍｌ／ｋｇの総量で外側尾静脈に静脈内投与した。この方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に対して外挿することができる。

他の脂質
他のカチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）は、ｓｉＲＮＡに類似したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９ −８５３３を参照されたい）を封入するために利用することができる。次の脂質組成物を含む予備成形小胞が企図され得る：それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、並びに約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／全脂質比。７０〜９０ｎｍの狭い範囲の粒子サイズ分布及び０．１１＿０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数にするために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡを添加する前に８０ｎｍの膜で粒子を最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含む粒子を、４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比で使用することができ、このモル比は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を促進するためにさらに最適化することができる。Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎら（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を説明している。脂質エンベロープの使用は、本発明でも好ましい。

別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質は、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールを含み、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自然小胞形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ、約１２：１及び９：１とすることができる。製剤は、９０％を超える封入効率で、約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。

Ｔｅｋｍｉｒａは、全てが本発明に使用することができ、かつ／又は適合させることができる、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関連する、米国及び海外の約９５の対応特許のポートフォリオ（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書、同第７，７９９，５６５号明細書、同第８，０５８，０６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書、同第７，９０１，７０８号明細書、同第７，７４５，６５１号明細書、同第７，８０３，３９７号明細書、同第８，１０１，７４１号明細書、同第８，１８８，２６３号明細書、同第７，９１５，３９９号明細書、同第８，２３６，９４３号明細書、及び同第７，８３８，６５８号明細書、並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書、同第１５１９７１４号明細書、同第１７８１５９３号明細書、及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）を有する。

ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入して送達することができ、このＰＬＧＡマイクロスフェアは、例えば、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的若しくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質若しくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書、同第２０１３０２４５１０７号明細書、及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）で詳述されているＰＬＧＡマイクロスフェアである。この製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書を参照されたい。

Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む広範囲の治療におけるバイオアベイラビリティの課題に取り組んでいる。この技術が明確な利点を実証した特定の投与経路として、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍への送達、及び眼が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０、及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／又は医薬品を哺乳動物の体に送達するためのカチオン性デンドリマーについて記載している。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、又は心臓への生物活性分子の送達を目的とするのに適している。デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された合成３次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御でき、かつ変更することができる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は多機能コアに向けて（合成への収束型アプローチ）ビルディングブロックを反復付加することにより合成され、ビルディングブロックが３次元シェルに付加される度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、１級アミンへのアクリロニトリルのダブルマイケル付加により、このジアミノブタンに２倍量のアミノ基が付加され、次に、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）を含む。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子送達剤としての使用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ（Ｏ_２）Ｓと共にそれぞれ、ポリアミドアミン及びリン含有化合物を使用することに概ね集中しているが、低位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬剤送達用のｐＨ感受性制御放出システムとして、及び抹消アミノ酸基によって化学的に修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出システムとして研究されている。細胞毒性及びＤＮＡとポリプロピレンイミンデンドリマーとの相互作用、並びにＤＡＢ６４のトランスフェクション効力も研究されている。米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、以前の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えば、ポリプロピレンイミンデンドリマーは、生物活性分子、例えば、遺伝物質の標的への送達に使用されると、適切な特性、例えば、特定の標的化及び低い毒性を示すという知見に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生物活性分子の標的への送達にとって適切な特性を示す。また、カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーについて開示している米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書の生物活性ポリマーを参照されたい。この生物活性ポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、不所望の細胞増殖によって特徴付けられる障害、例えば、新生物及び腫瘍、炎症障害（自己免疫障害を含む）、乾癬、及びアテローム性動脈硬化の処置に有用であり得る。これらのポリマーは、活性剤として単独で、又は他の治療薬、例えば、遺伝子療法用の薬物分子又は核酸の送達ビヒクルとして使用することができる。このような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達されるべき作用物質の活性を補完し得る。

超荷電（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）タンパク質
超荷電タンパク質は、異常に高い正又は負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質のクラスである。正又は負に過剰に荷電されたタンパク質はいずれも、熱的又は化学的に誘導された凝集に耐える優れた能力を示す。正に過剰に荷電されたタンパク質はまた、哺乳動物細胞に進入することができる。プラスミド、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又は他のタンパク質などのカーゴをこれらのタンパク質に関連させると、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でのこれらの巨大分子の哺乳動物細胞への機能的な送達が可能になり得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室が、超荷電タンパク質の作製及び特徴付けを２００７年に報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０−１０１１２）。ｓｉＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの哺乳動物細胞への非ウイルス送達は、研究及び治療用途の両方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ＧＦＰタンパク質（又は他の正に過剰に荷電されたタンパク質）を適切な無血清培地でｓｉＲＮＡと混合し、細胞の添加の前に複合体が形成されるようにする
この段階で血清を含むと、超荷電タンパク質−ｓｉＲＮＡ複合体の形成が阻害され、処置の有効性が低下する。以下のプロトコルは、様々な細胞株に有効であることが分かっている（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６）。しかしながら、タンパク質及びＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの用量を変更するパイロット実験を実施して、特定の細胞株のための手順を最適化するすることができる。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０^５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２００ｎＭの最終濃度にする。ｓｉＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度まで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ＧＦＰ及びｓｉＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ｓｉＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７Ｃで４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬ ヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。ノックダウンについてのアッセイに応じて、細胞を血清含有培地でさらに４８時間又はそれ以上の時間インキュベートする
（７）免疫ブロット、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。

Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、＋３６ＧＦＰが、様々な細胞における有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出した。プラスミドＤＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、効果的にプラスミドを複合体化するためには比例して多い＋３６ＧＦＰタンパク質が必要である。効果的なプラスミド送達のために、本出願人は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質に由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ＧＦＰタンパク質の変異体を開発した。以下のプロトコルは、様々な細胞に有効であるが、上記のようにプラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を、特定の細胞株及び送達の適用例に最適化することが推奨される。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０^５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製ｐ３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２ｍＭの最終濃度にする。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ＧＦＰタンパク質及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に静かに添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を血清含有培地でインキュベートし、さらに２４〜４８時間インキュベートする。
（７）必要に応じて、プラスミド送達を（例えば、プラスミド駆動遺伝子発現によって）分析する。

また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１−８４３（２０１２）を参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は適合され得る。

植え込み型装置
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達のための植え込み型装置も企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に、薬物を局所的に長期間にわたって溶出する植え込み型医療装置が開示され、この開示には、いくつかのタイプのこのような装置、実施の処置モード、及び植え込みの方法が含まれる。この装置は、装置本体として使用される、例えば、マトリックスなどのポリマー物質と、薬物と、場合によっては追加の足場材料、例えば、金属又は追加のポリマーと、視認性及びイメージングを高める材料とを含む。薬物の選択は、薬物を局所的に長期間にわたって有利に放出することに基づいており、ここで、薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に、又は対症的な目的で、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のために直接放出される。１種類の薬物はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく遺伝子サイレンシング薬物であり、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ、リボザイム及びヌクレオシド類似体が含まれるが、これらに限定されない。従って、この系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用及び／又は適合され得る。一部の実施形態における植え込みのモードは、最近開発されて使用されている、近接照射療法及び針生検を含む他の処置用の既存の植え込み手順である。このような場合、本発明に記載される新たなインプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、数個の装置が、同じ処置手順中に植え込まれる。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されているように、空洞部、例えば、腹腔に適用可能なシステムを含む薬物送達植え込み型又は挿入型のシステム、及び／又は、例えば、任意選択でマトリックスであり得る生体安定性及び／又は分解性及び／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、薬物送達系が固定又は付着されないその他のタイプの投与が提供される。「挿入」という語は、植え込みも含むことに留意されたい。薬物送達系は、好ましくは、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている「Ｌｏｄｅｒ」として実施される。１つのポリマー又は複数のポリマーは、生体適合性であり、１つの作用物質及び／又は複数の作用物質を含み、制御された速度での作用物質の放出を可能にし、一部の実施形態では、例えば、マトリックスなどのポリマー基質の総量は、任意選択で、かつ好ましくは、作用物質の治療レベルに達するのを可能にする最大量以下である。非限定的な一例として、このような量は、好ましくは、導入される作用物質の量に応じて０．１ｍ^３〜１０００ｍｍ^３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、例えば、機能性、例えば、限定されるものではないが膝関節及び子宮内又は子宮頸リングなどによってサイズが決まる装置に組み込まれる場合は、任意選択で大きめにすることができる。（組成物送達用の）薬物送達系は、一部の実施形態では、好ましくは分解性ポリマーを利用するように設計され、主な放出機構はバルク浸食である；又は一部の実施形態では、非分解性又は徐々に分解されるポリマーが使用され、主な放出機構は、バルク浸食ではなく拡散であり、このため外部が膜として機能し、その内部は、長期間（例えば、約１週間〜約数か月）にわたって周囲による影響を実際に受けない薬物貯蔵部として機能する。異なる放出機構の異なるポリマーの組み合わせも、任意選択で使用することができる。表面における濃度勾配は、好ましくは、全薬物放出期間のかなりの期間の間、事実上一定に維持され、従って、拡散速度は事実上一定である（「０モード」拡散と呼ばれる）。「一定」という語は、好ましくは、治療効果の下側閾値よりも上に維持される拡散速度を意味するが、任意選択で初期バーストの特徴をなお有することができ、かつ／又は、例えば、一定程度の増減で変動し得る。拡散速度は、好ましくは、長期間にわたってこのように維持され、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するためにあるレベルまで一定であると見なすことができる。薬物送達系は、任意選択で、かつ好ましくは、化学的性質又は対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃によるものであっても、ヌクレオチドベースの治療薬を分解から保護するように設計される。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に記載される薬物送達系は、任意選択で検出器具及び／又は活性化器具に関連し、このような器具は、例えば、任意選択で、限定されるものではないが、熱による加熱及び冷却、レーザービーム、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波を含め、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性の方法によって、装置の植え込み時及び／又は植え込み後に作動される。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によると、局所送達の部位は、腫瘍を含む細胞の異常に高い増殖及びアポトーシスの抑制、自己免疫疾患状態を含む活動性及び／又は慢性炎症及び感染症、筋肉組織及び神経組織を含む組織の変性、慢性痛、変性部位、及び組織の再生が促進される骨折部位及び他の創傷部位、及び損傷した心筋、平滑筋、及び横紋筋によって特徴付けられる標的部位を任意選択で含み得る。組成物の植え込み部位、又は標的部位は、好ましくは、標的局所送達にとって十分に小さい半径、面積、及び／又は体積を有することを特徴とする。例えば、標的部位は、任意選択で、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。標的部位の位置は、好ましくは、最大治療効果が得られるように選択される。例えば、薬物送達系の組成物は（任意選択で、上記の植え込み用の装置と共に）、任意選択で、かつ好ましくは、腫瘍環境又はこの腫瘍環境に関連した血液供給部の内部又はその近傍に植え込まれる。例えば、組成物は（任意選択で、装置と共に）、任意選択で、血管系などの中でニップルを介して膵臓、前立腺、乳房、肝臓の中又はその近傍に植え込まれる。標的位置は：１．大脳基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合の脊椎；３．ＨＰＶ感染を防ぐための子宮頸部；４．活動性及び慢性炎症関節；５．乾癬の場合の真皮；６．鎮痛効果用の交感神経及び感覚神経部位；７．骨移植内；８．急性及び慢性感染部位；９．膣内；１０．内耳−聴覚系、内耳迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心臓内；冠状動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されるものではないが腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む空洞部（例えば、限定されるものではないが、卵巣癌の場合）；２４．食道内、及び２５．直腸内からなる群（単に非限定的な例として、任意選択で、体内のあらゆる部位がＬｏｄｅｒの植え込みに適し得る）から任意選択で選択される。任意選択で、システム（例えば、組成物を含む装置）の挿入は、標的部のＥＣＭ及びその部位の近傍に材料を注入して、標的部位及びこのような部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭ中での薬物の拡散及び／又は薬物動態に作用する他の生物学的因子に影響を与えることに関連する。任意選択で、一部の実施形態によると、前記作用物質の放出は、検出器具及び／又は活性化器具に関連することができ、このような器具は、レーザービーム、照射、熱による加熱及び冷却、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波、及び化学活性剤を含む、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性及び／又は他の方法によって、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に作動される。米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によると、例えば、後述するように、乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性癌の場合には、薬物は、好ましくは、遺伝子サイレンシングの生物学的ＲＮＡｉ薬物を含む。ＲＮＡｉで例示されるが、ｓｉＲＮＡ以外の多くの薬物がＬｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かつこのような薬物がＬｏｄｅｒ基質、例えば、マトリックスなどで封入できる限りは、本発明に関連して使用することができ、この系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用及び／又は適合され得る。

挿入、例えば、植え込みの方法は、任意選択で、このような方法において任意選択で変更を伴うことなく、あるいは任意選択で僅かな変更のみを伴って、他のタイプの組織の植え込み及び／又は挿入及び／又は組織のサンプリングに既に使用されていてもよい。このような方法は、任意選択で、限定されるものではないが、小線源療法、生検、超音波を用いる及び／又は用いない内視鏡検査、例えば、ＥＲＣＰ、脳組織に入れる定位法、腹腔鏡を関節、腹部臓器、膀胱壁、及び体腔に入れる植え込みを含む腹腔鏡検査を含む。

ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、別々に送達することもできる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現される時間を与えるために、ガイドＲＮＡよりも前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）前に投与されてもよい。或いは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与することができる。有利には、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初期投与の１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に、第２のブースター用量のガイドＲＮＡを投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なレベルのゲノム改変を達成するために有用であり得る。毒性及びオフターゲット効果を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であろう。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞又は動物モデルにおいて種々の濃度を試験し、潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度を分析するディープシークエンシングを用いることによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子内の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合、ディープシークエンシングを用いて、以下の２つのオフターゲット遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における改変のレベルを評価することができる。オフターゲット改変のレベルが最低限でありながら最高レベルのオンターゲット改変を与える濃度がｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択されるべきである。或いは、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対と共に送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。それぞれ赤色（単一の下線）及び青色（二重の下線）のガイド配列（これらの例は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ要求に基づく）。

この系のさらなる調査により、本出願人は５’オーバーハングの証拠を得た（例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９及び２０１３年８月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８７１，３０１号明細書を参照）。本出願人は、２つのガイドＲＮＡと組み合わせたときのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体による効率的な切断に関するパラメータをさらに確認し、これらのパラメータには５’オーバーハングの長さが含まれるが、これに限定されない。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対又はより好ましくは３４〜５０塩基対又は１〜３４塩基対である。本発明の他の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他の鎖の切断を誘導することにより、平滑末端又は３’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、３’オーバーハングは最大で１５０、１００又は２５塩基対又は少なくとも１５、１０又は１塩基対である。好ましい実施形態では、３’オーバーハングは１〜１００塩基対である。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対が、検出可能なインデル形成を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときにインデルを効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメータであることが示される。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡはＤＮＡの逆鎖をニッキングするので、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９Ｈ８４０ＡによるＣａｓ９ｎの置換は、オーバーハング型の反転をもたらすはずである。例えば、Ｃａｓ９ｎにより５’オーバーハングを生じ得る一対のｓｇＲＮＡは、原則として、代わりに対応する３’オーバーハングを生じるはずである。従って、Ｃａｓ９ｎにより３’オーバーハングの生成をもたらすｓｇＲＮＡ対は、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと共に使用されて５’オーバーハングを生じ得る。本出願人は、５’及び３’オーバーハング（−２７８〜＋５８ｂｐのオフセット範囲）の両方を生じるように設計されたｓｇＲＮＡ対のセットと共にＣａｓ９Ｈ８４０Ａを試験したが、インデル形成を観察することができなかった。これは、突然変異Ｃａｓ９Ｈ８４０ＡがＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を実質的に低減することができ、それにより、目的の二重ニッキングに関して、突然変異体Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａに対してｓｇＲＮＡに対を形成させることを示す。

肝臓、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）
Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．１９９９ Ｊａｎ；７７（１）：２４４−９）は、ｅｘ−ｖｉｖｏ体細胞遺伝子療法によるインスリン送達を開示し、これには、糖尿病患者から非Ｂ細胞体細胞（例えば、線維芽細胞）を除去し、インスリンを産生及び分泌するようにこれをｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的に改変することが含まれる。細胞を培養下で成長させ、インスリン補充源としてドナーに戻すことができる。このようにして改変された細胞は、移植の前に評価され、予備ストックが凍結保存され得る。患者自身の細胞を使用することにより、この手順では、免疫抑制の必要がなくなり、組織供給の問題が解消される一方、細胞破壊の再発が回避されるはずである。ｅｘ−ｖｉｖｏでの体細胞遺伝子療法には、複数のトランスフェクションに適していると共に制御された増殖を受けやすい、利用しやすくロバストな細胞型が必要である。非Ｂ細胞体細胞の使用に関連する特別な問題には、プロインスリンからインスリンへのプロセシング、並びにグルコース刺激性プロインスリン生合成及び制御されたインスリン放出に対する感受性の付与が含まれる。線維芽細胞、下垂体細胞、腎臓（ＣＯＳ）細胞及び卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる予備的研究により、これらの難問が対処され得ること、及びｅｘ−ｖｉｖｏの体細胞遺伝子療法がインスリン補充療法に対する実行可能なアプローチを提供することが示される。Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．のシステムは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために使用及び／又は適合され得る。

Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２６ Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｐｒｉｌ ２００８、Ｐａｇｅｓ ４３１−４４２）の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達に適用され得る。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．は、ｓｉＲＮＡを保有するビタミンＡ結合リポソームによる処置が、本来致死性のジメチルニトロソアミンによって誘発された肝硬変を有するラットにおいて、用量依存的及び持続時間依存的に、肝線維症をほぼ完全に消散させて生存期間を延長することを見出した。カチオン性脂質としてのＯ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ａ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを４：３：３のモル比で含有するカチオン性リポソーム（Ｌｉｐｏｔｒｕｓｔ）（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達に関して血清添加条件下で高いトランスフェクション効率を示している）を北海道システム・サイエンス社（Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から購入した。リポソームは凍結乾燥させた空のリポソーム方法を用いて製造され、使用前に凍結乾燥脂質混合物に再蒸留水（ＤＤＷ）をボルテックス下で添加することにより１ｍＭ（ＤＣ−１６−４）の濃度で調製された。ＶＡ結合リポソームを調製するために、１．５ｍｌチューブにおいて２５ １Ｃでボルテックスすることによって、ＤＭＳＯ中に溶解した２００ｎｍｏｌのビタミンＡ（レチノール、Ｓｉｇｍａ）をリポソーム懸濁液（ＤＣ−１６−４として１００ｎｍｏｌ）と混合した。ｓｉＲＮＡｇｐ４６を有するＶＡ結合リポソーム（ＶＡ−ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡｇｐ４６）を調製するために、ｓｉＲＮＡｇｐ４６の溶液（ＤＤＷ中５８０ｐｍｏｌ／ｍｌ）を、２５Ｃで撹拌しながらレチノール結合リポソーム溶液に添加した。ｓｉＲＮＡとＤＣ−１６−４との比は１：１１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、ｓｉＲＮＡとリポソームとの比（ｗｔ／ｗｔ）は１：１であった。リポソームによって取り込まれなかった任意の遊離ビタミンＡ又はｓｉＲＮＡを、マイクロ分配システム（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２濃縮器３０，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ、ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてリポソーム調製物から分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに添加し、２５ １Ｃにおいて１，５００ｇで５分間、３回遠心分離した。画分を捕集し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ使用のための所望の用量を達成するように、フィルターに捕捉された材料をＰＢＳにより再構成した。０．７５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの３回の注射が隔日でラットに与えられた。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．のシステムは、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．により記載されるようにリポソーム中約０．５〜１ｍｇ／ｋｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡをヒトに投与することによって、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために使用及び／又は適合される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でｓｉＲＮＡを肝細胞に送達するためのビヒクルについてのＲｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ、Ａｕｇｕｓｔ ７，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３２）の方法（Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌによりｓｉＲＮＡ Ｄｙｎａｍｉｃ ＰｏｌｙＣｏｎｊｕｇａｔｅと命名）も本発明に適用され得る。Ｄｙｎａｍｉｃ Ｐｏｌｙ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ技術の重要な特徴には、膜作用性ポリマー、このポリマーの活性をそれがエンドソームの酸性環境に達するまで可逆的に遮蔽する能力、及び単純な低圧静脈内注射後にｉｎ ｖｉｖｏでこの改変ポリマー及びそのｓｉＲＮＡカーゴを肝細胞に特異的に標的化させる能力が含まれる。ＳＡＴＡ改変ｓｉＲＮＡは、５’アミン改変ｓｉＲＮＡと、１重量当量（ｗｔ ｅｑ）のＮスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．３６ｗｔ ｅｑのＮａＨＣＯ３とを水中において４℃で１６時間反応させることによって合成される。次に、９容積のエタノールの添加及び８０℃で２時間のインキュベーションによって改変ｓｉＲＮＡが沈殿される。沈殿物は１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）中に再懸濁され、２６０ｎｍ波長で吸光度を計測することにより定量化される。１．５ｗｔ％のＳＭＰＴ（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によりＰＢＡＶＥ（５ｍＭＴＡＰＳ中３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９）が改変される。１時間のインキュベーションの後、５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９）を含有する４００μｌの等張グルコース溶液に０．８ｍｇのＳＭＰＴ−ＰＢＡＶＥを添加した。この溶液に５０μｇのＳＡＴＡ改変ｓｉＲＮＡを添加した。［ＰＢＡＶＥ］を一定にした用量反応実験について、種々の量のｓｉＲＮＡが添加される。次に、混合物は１６時間インキュベートされる。次に、この溶液に５．６ｍｇのＨｅｐｅｓ遊離塩基が添加され、その後３．７ｍｇのＣＤＭ−ＮＡＧ及び１．９ｍｇのＣＤＭ−ＰＥＧの混合物が添加される。次に、この溶液が室温で少なくとも１時間インキュベートされた後、注射される。ＣＤＭ−ＰＥＧ及びＣＤＭ−ＮＡＧは、塩化オキサリルを用いることにより生成された酸クロリドから合成される。酸クロリドに１．１モル当量のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（分子量平均４５０）が添加されてＣＤＭ−ＰＥＧが生成されるか、或いは（アミノエトキシ）エトキシ−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが添加されてＣＤＭ−ＮＡＧが生成される。最終生成物は、０．１％ＴＦＡ水／アセトニトリル勾配の逆相ＨＰＬＣを用いて精製される。約２５〜５０μｇのｓｉＲＮＡをマウスに送達した。Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．のシステムは、例えば、ヒトへの送達のために約５０〜約２００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量を想定することによって、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために適用され得る。

脳
脳のための送達の選択肢には、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形態のＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡをリポソームに封入し、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた送達のために分子トロイの木馬にコンジュゲートすることが含まれる。分子トロイの木馬は、Ｂ−ｇａｌ発現ベクターを非ヒト霊長類の脳に送達するのに有効であることが示されている。同じアプローチを用いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡを含有するベクターを送達することができる。例えば、Ｘｉａ ＣＦ ａｎｄ Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２００９ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６（３）：７４７−５１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００１９４）は、受容体特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びアビジン−ビオチン技術の併用による、培養下及びｉｎ ｖｉｖｏでの細胞に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達がどのようにして可能であるかを記載している。著者らは、標的化するｍＡｂとｓｉＲＮＡとの間の結合がアビジン−ビオチン技術により安定しているため、標的化ｓｉＲＮＡの静脈内投与後にｉｎ ｖｉｖｏで、脳などの遠隔部位におけるＲＮＡｉ効果が観察されることも報告している。

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｊａｎ；７（１）：１１−８．））は、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によってｉｎ ｖｉｖｏでアカゲザル脳に標的化された、８５ｎｍペグ化された免疫リポソームで構成された「人工ウイルス」の内部に、ルシフェラーゼなどのレポーターをコードする発現プラスミドがどのように封入されたかを記載している。ＨＩＲＭＡｂは、外因性遺伝子を保有するリポソームが、静脈内注射後に、血液脳関門を越えるトランスサイトーシス及びニューロン膜を越えるエンドサイトーシスを受けることを可能にする。脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、ラットと比較してアカゲザルにおいて５０倍高かった。組織化学及び共焦点顕微鏡法の両方によって、霊長類脳におけるベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の広範なニューロン発現が実証された。著者らは、このアプローチにより、可逆的なトランスジェニックが２４時間で実現可能になることを示す。従って、免疫リポソームの使用が好ましい。これらは、特定の組織又は細胞表面タンパク質を標的化するために抗体と共に使用され得る。例えば、ナノ粒子を用いる（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）、又はエキソソームを用いる（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）などの、他の送達手段又はＲＮＡも好ましい。

実際、エキソソームは、ＣＲＩＳＰＲ系といくらか類似している系であるｓｉＲＮＡの送達において特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）は、エキソソームが如何に種々の生物学的関門を越える薬物送達のために有望なツールであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用され得るかを記載している。このアプローチは、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションにより標的化エキソソームを生成することである。次にエキソソームはトランスフェクト細胞上清から精製及び特徴付けられ、次にｓｉＲＮＡがエキソソームに負荷される。本発明に従う送達又は投与は、限定はされないが特に脳に対して、エキソソームにより実施することができる。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達するためにＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））により成されたものと同様の方法で、ビタミンＥ（α−トコフェロール）はＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓとコンジュゲートされ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達され得る。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は遊離ＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され、脳注入キット３（Ａｌｚｅｔ）と接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を用いてマウスに注入した。背側第三脳室への注入のために正中線においてブレグマの約０．５ｍｍ後側に脳注入カニューレを配置した。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを伴ったわずか３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入方法によるものと同程度の標的の低減を誘導し得ることを見出した。α−トコフェロールにコンジュゲートされ、脳に標的化されたＨＤＬと共に同時投与されるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明ではヒトに対して企図することができ、例えば、脳に標的化される約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的化するショートヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介性送達方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、くも膜下腔内のカテーテルによって、１×１０^９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスを投与した。脳に標的化されるレンチウイルスベクターで発現される同様の投薬量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを本発明においてヒトに対して企図することができ、例えば、１×１０^９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスでの脳に標的化される約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

脳への局所送達に関して、これを様々な方法で達成することができる。例えば、物質を、例えば、注入により線条体内に送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。

標的化した欠失、治療適用
ウイルス遺伝子又は他のウイルスエレメントの標的化した欠失が好ましい。例は実施例１８に示される。従って、潜伏ウイルス遺伝子が好ましい。ここで例示されるように、本出願人によれば、ウイルス又は非ウイルス（例えば、ナノ粒子）のいずれかの送達系を用いた、潜伏ウイルス感染に罹患している、必要性がある対象又は患者の肝臓、脳、眼、上皮、造血、又は別の組織に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子送達が好ましい。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用には、ＨＢＶ感染などのウイルス感染の処置が含まれる。

タンパク質治療薬の慢性投与は、特定のタンパク質に対する許容し難い免疫応答を誘発し得る。タンパク質薬物の免疫原性は、いくつかの免疫優性ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープに起因し得る。これらのタンパク質内に含まれるこれらのＨＴＬエピトープのＭＨＣ結合親和性を低下させると、免疫原性がより低い薬物を作成することができる（Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（「免疫原性が低い合理的にエンジニアリングされた治療用タンパク質（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６）。本発明において、特にＣＲＩＳＰＲ酵素の免疫原性は、当初Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌにおいてエリスロポエチンに関連して示され、続いて展開された手法に従い低下させることができる。従って、定向進化又は合理的設計を用いて、宿主種（ヒト又は他の種）におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣａ９）の免疫原性を低下させることができる。

本出願人は３つの目的のガイドＲＮＡを使用し、ごく一部の細胞においてのみ起こるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なＤＮＡ切断を可視化することができた。本質的に、本出願人がここで示しているものは、標的化されたかをｉｎ ｖｉｖｏ切断である。特に、これは、哺乳動物などの高等生物における特異的標的化も達成可能であるという概念の証明を提供する。またこれは、複数のガイド配列（即ち別個の標的）を同時に使用できる（同時送達という意味で）という点で多重的な態様も強調する。換言すると、本出願人は、いくつかの異なる配列が同時に、しかし独立して標的化される、複数のアプローチを使用した。

本発明の好ましいベクターであるＡＡＶを作製するためのプロトコルの適切な例は、実施例において提供される。

血液
また本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を血液に送達することも企図する。Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ｅ１３０）の血漿エキソソームは以前に記載されており、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を血液に送達するために利用され得る。

心臓
また本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を心臓に送達することも企図する。心臓の場合、心筋向性アデノ随伴（ａｄｅｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶＭ）、特に心臓における優先的遺伝子導入を示したＡＡＶＭ４１が好ましい（例えば、Ｌｉｎ−Ｙａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ １０，２００９，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．１０を参照）。投与は全身投与又は局所投与であり得る。全身投与については約１〜１０×１０^１４ベクターゲノムの投薬量が企図される。例えば、Ｅｕｌａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４９２：３７６及びＳｏｍａｓｕｎｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：７７９０も参照される。

腎臓
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を腎臓に送達することも企図する。治療用核酸の細胞取込みを誘導するための送達戦略には、物理的力又はベクター系、例えばウイルスベース、脂質ベース又は複合体ベースの送達、又はナノ担体が含まれる。核酸が流体力学的高圧注入で全身的に腎細胞に送られたとき見込まれる臨床的意義が低い初期の適用以降、種々の動物腎疾患モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで転写後イベントを標的化するため幅広い遺伝子治療ウイルス及び非ウイルス担体が既に適用されている（Ｃｓａｂａ Ｒｅｖｅｓｚ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｈａｍａｒ（２０１１）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｆ．Ｃｈｕｎｓｈｅｎｇ Ｋａｎｇ （Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−３０７−５４１−９，ＩｎＴｅｃｈ，以下から入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｇｅｎｅ−ｔｈｅｒａｐｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ−ｒｎａｓ−ｉｎ−ｔｈｅ−ｋｉｄｎｅｙ）。腎臓に対する送達方法は、以下のとおり要約される。

肺
また本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の肺に送達することも企図する。当初はＡＡＶ−２ベースのベクターがＣＦ気道に対するＣＦＴＲ送達に提案されたが、他の血清型、例えばＡＡＶ−１、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、及びＡＡＶ−９が種々の肺上皮モデルにおいて遺伝子導入効率の向上を呈している（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＡＡＶ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞の形質導入効率がＡＡＶ−２及びＡＡＶ−５と比べて約１００倍高く５、しかしながらマウス気管気道上皮についてはＡＡＶ−１はｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ−５と同等の効率で形質導入したことが実証された。他の試験では、ＡＡＶ−５はＡＡＶ−２と比べてｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮（ＨＡＥ）に対する遺伝子送達の効率が５０倍高く、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス肺気道上皮における効率が有意に高いことが示されている。ＡＡＶ−６もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞及びｉｎ ｖｉｖｏでのマウス気道における効率がＡＡＶ−２と比べて高いことが示されている８。最近の分離株ＡＡＶ−９は、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス鼻上皮及び肺胞上皮においてＡＡＶ−５より高い遺伝子導入効率を呈することが示され、９ヶ月間にわたり遺伝子発現が検出されたことから、ＣＦＴＲ遺伝子送達ベクターにとって望ましい特性であるｉｎ ｖｉｖｏでの長期遺伝子発現がＡＡＶで実現し得ることが示される。さらに、ＡＡＶ−９は、ＣＦＴＲ発現の損失なしにかつ免疫学的帰結を最小限に抑えてマウス肺に再投与し得ることが実証された。ＣＦ及び非ＣＦ ＨＡＥ培養物の頂端表面に１００μｌのＡＡＶベクターを数時間接種し得る（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＭＯＩは、ウイルス濃度及び実験の目的に応じて１×１０^３から４×１０^５ベクターゲノム／細胞まで異なり得る。上記に引用したベクターは、本発明の送達及び／又は投与に企図される。

Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ Ｖｏｌ １８３．ｐｐ ５３１−５３８，２０１１）は、ヒト感染症の治療に対するＲＮＡ干渉治療薬の適用例、及びまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した肺移植レシピエントにおける抗ウイルス薬の無作為化試験を報告した。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．は、ＲＳＶ気道感染症のＬＴＸレシピエントにおける無作為化二重盲検プラセボ対照試験を実施した。患者はＲＳＶに対する標準治療を受けることが許された。エアロゾル化したＡＬＮ−ＲＳＶ０１（０．６ｍｇ／ｋｇ）又はプラセボが毎日、３日間にわたり投与された。この試験は、ＲＳＶを標的化するＲＮＡｉ治療薬をＲＳＶ感染症のＬＴＸレシピエントに安全に投与し得ることを実証している。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の３回の１日用量は、気道症状の増悪又は肺機能障害をもたらさず、かつサイトカイン又はＣＲＰの誘導などの全身性の炎症誘発効果を呈しなかった。薬物動態が吸入後に僅かな低い一過性の全身曝露を示したが、これは、静脈内投与されるか又は吸入により投与されたＡＬＮ−ＲＳＶ０１がエキソヌクレアーゼ媒介性の消化及び腎排泄によって循環から急速に消失することを示す前臨床動物データと一致している。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．の方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができ、本発明にはエアロゾル化したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを例えば０．６ｍｇ／ｋｇの投薬量で企図することができる。

筋肉
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の筋肉への送達も企図する。

皮膚
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を皮膚に送達することも企図する。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１２９）は、ヒト及びマウス皮膚にセルフデリバリー（ｓｄ）ｓｉＲＮＡを送達するための電動マイクロニードルアレイ皮膚送達装置に関する。ｓｉＲＮＡベースの皮膚治療薬を臨床に移行させる際の主な課題は、有効な送達システムの開発である。種々の皮膚送達技術に多くの試みが投じられてきたが、成功は限られている。皮膚がｓｉＲＮＡで治療された臨床試験では、皮下針注射に伴う激痛のために試験におけるさらなる患者の登録が不可能となっており、改良された、より「患者に優しい」（即ち痛みがほとんど又は全くない）送達手法の必要性が浮き彫りとなっている。マイクロニードルは、ｓｉＲＮＡを含む大型の荷電カーゴを、最大の障壁である角質層を越えて送達する効率的な方法であり、概して従来の皮下針より痛みが少ないと考えられる。電動「スタンプ型」マイクロニードル装置は、Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって使用された電動マイクロニードルアレイ（ＭＭＮＡ）装置を含め、無毛マウス試験で安全性が示されており、かつ（ｉ）化粧品業界での広範な使用、及び（ｉｉ）限られた試験でほぼ全てのボランティアがこの装置の使用はインフルエンザの予防接種と比べてはるかに痛みが少ないと認めたことからも明らかなとおり、痛みをほとんど又は全く引き起こさないため、この装置を使用したｓｉＲＮＡ送達により、皮下針注射を使用した先行臨床試験で経験されたものと比べて痛みがはるかに少なくなることが示唆される。ＭＭＮＡ装置（Ｂｏｍｔｅｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏ、ソウル、韓国からＴｒｉｐｌｅ−Ｍ又はＴｒｉ−Ｍとして市販されている）は、マウス及びヒト皮膚に対するｓｉＲＮＡの送達用に構成された。０．１ｍｍの深さに設定された、使い捨てＴｒｉ−Ｍ針カートリッジ（Ｂｏｍｔｅｃｈ）のチャンバに、ｓｄ−ｓｉＲＮＡ溶液（最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡ）が導入された。ヒト皮膚の治療に関しては、処置前に不特定の皮膚（外科手技後直ちに入手）が手で伸ばされ、コルク製プラットフォームにピンで留められた。皮内注射は全て、２８ゲージ０．５インチ針を備えるインスリンシリンジを使用して実施された。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．のＭＭＮＡ装置及び方法は、例えば皮膚に対して最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量で、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に使用し及び／又は適合させることができる。

潜伏及び慢性ウイルス感染
また本発明は、潜伏又は慢性ウイルス感染の処置にも適用され得る。ウイルス潜伏性は、病原性ウイルスがその生活環の溶原性部分（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ ｐａｒｔ）において細胞内で潜伏又は休眠したままでいる能力である。潜伏感染は、ウイルスが複製及び増殖し続ける慢性感染とは異なる区別される。代わりに、ウイルスの増殖は止まるが、ウイルスゲノムは根絶されず、従って、再活性化して、宿主の再感染を必要とすることなく再びウイルス子孫の産生をもたらすことができる（生活環の溶解性部分）。従って、本発明は、真核細胞内のウイルス、特にウイルスの潜伏形態を不活性化するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の使用を提供する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、組み込まれたプロウイルスを細胞のゲノムから切除する、そして／あるいはエピソーム形態で存在する潜伏ウイルスを不活性化する（例えば、ｃｃｃＤＮＡ形態を切断する）ことができる。

従って、本発明は、真核細胞への送達のための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、ベクターは、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と、（ｉｉ）細胞内のウイルスゲノムの標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡと、（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と、（ｉｖ）ｔｒａｃｒ配列とをコードし、細胞内で発現されるとガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ガイドＲＮＡウイルスゲノムの標的配列にハイブリダイズできるように、（ａ）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と、（ｂ）ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ酵素とを含む。

ベクター、コード酵素、ガイド配列などのさらなる特徴は、本明細書中の他の箇所で開示される。例えば、ガイド配列は、単一のＲＮＡ内にガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列を提供するｃｈｉＲＮＡ配列の一部であってもよく、従ってこの系は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素と、（ｉｉ）ウイルスゲノム中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含むｃｈｉＲＮＡとをコードすることができる。同様に、酵素は、１つ以上のＮＬＳなどを含むことができる。

潜伏ウイルスはエピソーム形態で存在するか、あるいはプロウイルス形態で組み込まれることが可能であり、本発明は、両方のタイプを処置するために使用され得る。本発明は、ＤＮＡウイルス、特に二本鎖ＤＮＡゲノムを有するウイルスに対して特に有用である。エピソーム潜伏形態を有する病原性ＤＮＡウイルスの例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、任意の型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、及び水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が挙げられる。本発明は、これらのウイルスのいずれかによる感染を処置するために使用することができる。また一部の植物ウイルスも潜伏形態を示し、本発明は、これらを除去するためにも使用され得る。本発明のＣＲＩＳＰＲ系は、潜伏ウイルスを保持する細胞型、例えば、ＥＢＶについてはＢ細胞又は上皮細胞、ＨＳＶ及びＶＺＶについてはニューロン、ＨＰＶについては上皮細胞、ＨＢＶについては肝細胞などに対して標的化され得る。ウイルスのゲノム配列は広く利用可能であり、従って、ウイルスゲノムを標的とするためのガイド配列を難なく設計することができる。ウイルスが種々の配列変異体（例えば、ＨＢＶ異なるサブタイプ）を有する場合、保存されるゲノムの領域を標的とし、それにより広い活性を提供するようにガイド配列を設計することが有用である。ウイルスゲノム内の２つ以上の部位に対するガイドＲＮＡを使用するのが好ましい。ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮと比較したときのＣＲＩＳＰＲ技術の重要な利点は、複数配列を標的とするのが相対的に容易なことである。ウイルスゲノムにおける複数部位の標的化は、２つの主要な利点を提供する。第１に、ウイルス株が逃避し得る（例えば、突然変異による）可能性を低減し、ゲノム及び変異体又は擬似種の任意の対象の独特のアンサンブルにおいて少なくとも１つの標的が存在することを保証するのに役立つ。第２に、エピソーム形態は一般に小さく環状である（約３〜４ｋｂ）ため、異なるガイドを用いる複数の部位の標的化により、ＮＨＥＪが容易に修復できない複数の断片へのエピソームの断片化が可能になり得る。従って、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系は、ウイルスゲノム内の複数の遺伝子又はＯＲＦを標的とすることできる。潜伏ウイルスの標的化だけでなく、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して、ＣＲＩＳＰＲ複合体が結合可能なｄｓＤＮＡ形態をその生活環が含むウイルスによる慢性ウイルス感染を標的とすることもできる。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、テノホビル（ＨＢＶ）、エンテカビル（ＨＢＶ）、アシクロビル（ＨＳＶ、ＶＺＶ）などの抗ウイルス性化合物と共に使用することができる。

肝炎ウイルス
また本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の処置にも適用され得る。従って、本発明は、哺乳類細胞内のＨＢＶ、特にＨＢＶの潜伏形態を不活性化するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の使用を提供する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、組み込まれたＨＢＶプロウイルスを細胞のゲノムから切除すること（稀な発生）、及び／又は共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）形態で存在する潜伏ＨＢＶを不活性化することができる。ＨＢＶゲノム配列は広く利用可能であり、従って、ＨＢＶゲノムを標的とするためのガイド配列を難なく設計することができる。ＨＢＶは、一次配列が８％を超えて異なるいくつかの血清学的サブタイプ（例えば、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｙ、ａｄｒ）で存在し、複数のサブタイプ間で保存されるゲノムの領域を標的とするようにガイド配列を設計することが有用である。本出願人は、ＨＢＶゲノムを標的化するために２４のガイドＲＮＡを設計した。これらには、ＨＢＶゲノム内で高度に保存される標的が含まれる；及びこれらのガイド配列のうちの９つの位置は、ＨＢＶゲノムに対してマッピングされる（図３６、図５７を参照）。ガイドＲＮＡを、ＨＢＶゲノムの２つ以上の部位に対して使用するのが好ましい。例えば、以下のうちの２つ以上を認識するガイド配列を提供することが有用である：表面抗原をコードするＯＲＦ Ｓ；コアタンパク質をコードするＯＲＦ Ｃ；ポリメラーゼをコードするＯＲＦ Ｐ；ＨＢＸタンパク質をコードするＯＲＦ Ｘ；ＥｎｈＩエンハンサー調節エレメント；及び／又はＥｎｈＩＩエンハンサー調節エレメント。ＨＢＶを標的化するためのＣＲＩＳＰＲ系は、理想的には、肝臓細胞、特に肝細胞に送達される。従って、ＡＡＶ８ベクターが有用であり得る。同様に、ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分の発現は、理想的には、肝臓特異的又は肝細胞特異的プロモーターの転写制御下にある。

ＣＲＩＳＰＲ系は、テノホビル又はエンテカビルなどの抗ＨＢＶ化合物と共に使用することができる。ｃｃｃＤＮＡを標的とするＣａｓ９は、恐らく、少なくとも部分的にｃｃｃＤＮＡ構造に依存するので、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡにおけるＣａｓ９占有率を高めるために、後成的修飾因子（例えば、クラスＩ及びクラスＩＩＩのＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸、及びニコチンアミド（ＮＡＭ）、及びＩ型インターフェロン）との同時処置が有用であり得る。実際にＨＢＶを処置するために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、例えば、用量及び配列を最適化することによって、内因性小ＲＮＡ経路の過飽和のリスクなどのＲＮＡｉの欠点を回避しなければならない（例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．４４１，２６ Ｍａｙ ２００６を参照）。例えば、約１〜１０×１０^１４粒子／ヒトなどの低用量が企図される。別の実施形態では、ＨＢＶ対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、安定した核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）などのリポソーム内で投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照）。ＨＢＶ ＲＮＡに標的化されたＳＮＡＬＰ中のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈内注射が企図される。毎日の処置は約３日間にわたり、次に毎週の処置が約５週間にわたり得る。別の実施形態では、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）１４，１１−１９）の系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系のために使用され得る及び／又は適合され得る。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、二本鎖アデノ随伴ウイルス８−偽型ベクター（ｄｓＡＡＶ２／８）を使用して、ｓｈＲＮＡを送達する。ＨＢＶ特異的ｓｈＲＮＡを保持するｄｓＡＡＶ２／８ベクターの単回投与（１×１０^１２ベクターゲノム／マウス）は、ＨＢＶトランスジェニックマウスの肝臓においてＨＢＶタンパク質、ｍＲＮＡ及び複製ＤＮＡの定常レベルを有効に抑制し、循環中のＨＢＶ負荷の最大２〜３ｌｏｇ_１０の低下をもたらした。有意なＨＢＶ抑制は、ベクター投与の後、少なくとも１２０日持続した。ｓｈＲＮＡの治療効果は、標的配列に依存性であり、インターフェロンの活性化を伴わなかった。本発明では、ＨＢＶに対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系はｄｓＡＡＶ２／８ベクターなどのＡＡＶベクターにクローニングされ、例えば、約１×１０^１５ベクターゲノム／ヒト〜約１×１０^１６ベクターゲノム／ヒトの投薬量でヒトに投与され得る。別の実施形態では、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２１ ｎｏ．５，９７３−９８５ Ｍａｙ ２０１３）の方法が本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用及び／又は適合され得る。Ｗｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、肝細胞に標的化されたＮ−アセチルガラクトサミン結合メリチン様ペプチド（ＮＡＧ−ＭＬＰ）と、凝固因子ＶＩＩ（Ｆ７）を標的とする肝臓向性のコレステロール結合ｓｉＲＮＡ（ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ）との単純な同時注入が、結果的に、臨床化学又はサイトカインの誘発の変化を起こすことなく、マウス及び非ヒト霊長類における効率的なＦ７ノックダウンを生じることを示している。ＨＢＶ感染の一過性トランスジェニックマウスモデルを用いて、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、ＮＡＧ−ＭＬＰと、保存ＨＢＶ配列を標的とする強力なｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡとの単回同時注入が、結果的に、長期効果のあるウイルスＲＮＡ、タンパク質、及びウイルスＤＮＡのマルチ対数（ｍｕｌｔｉｌｏｇ）抑制を生じることことを示している。例えば、約６ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰ及び６ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの静脈内同時注入が本発明のために想定される。代替例では、約３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰ及び３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的なＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが１日目に投与された後、約２〜３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰ及び２〜３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが２週間後に投与される。

また本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の処置にも適用され得る。Ｒｏｅｌｖｉｎｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２０ ｎｏ．９，１７３７−１７４９ Ｓｅｐ ２０１２）の方法は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用され得る。例えば、ＡＡＶ８などのＡＡＶベクターが企図されるベクターであってもよく、例えば、体重１キログラム当たり約１．２５×１０^１１〜１．２５×１０^１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の投薬量が企図され得る。

他のウイルスの宿主が同様の方法で処置され得ることは容易に明らかであろう。

核酸、アミノ酸、及びタンパク質
本発明は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を使用する。これは、核酸がタンパク質よりも作製するのが遥かに容易で安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められる伸長の長さによって異なり得る。例えば、複数のフィンガーの複雑な３Ｄ位置決めを行う必要がない。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。これらの語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、かつ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。次に示すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって決定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；同第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構築の前又は後で行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合の後に、例えば、標識構成成分との接合によりさらに修飾することができる。

本明細書で使用される「野生型」という語は、当業者によって理解される語であり、突然変異型又は変異型とは区別される、天然に存在する典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。

本明細書で使用される「変異体」という語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味すると解釈するべきである。

「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」という語は、互換的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この語は、核酸分子又はポリペプチドについてである場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然では自然に結合し、かつ自然で見られる少なくとも１つの他の構成成分から少なくとも実質的に解放されていることを意味する。

「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対形成又は他の非従来型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力のことである。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０がそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、因子の数によって異なる。一般に、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列について述べられる場合、相補的な配列又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、好ましくは、高ストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション率を最大化するために、比較的低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される：熱融点（Ｔ_ｍ）よりも低い約２０〜２５℃。このＴ_ｍは、特定の標的配列の５０％が、規定イオン強度及びｐＨで、溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズしたか又はハイブリダイズ可能な配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするため、高ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔ_ｍよりも低い約５〜１５℃であるように選択される。ハイブリダイズしたか又はハイブリダイズ可能な配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするため、中ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔ_ｍよりも低い約１５〜３０℃であるように選択される。高い許容の（非常に低いストリンジェントな）洗浄条件は、Ｔ_ｍよりも低い５０℃であり得、ハイブリダイズしたか又はハイブリダイズ可能な配列間の高レベルのミスマッチが許容される。当業者であれば、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的なパラメータも、標的配列とプローブ配列との間の特定のレベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるように変更できることが分かるであろう。好ましい高ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ中、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳでの６５℃の洗浄を含む。

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定した複合体を形成する反応のことである。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又はその他の配列特異的な方法によって起こり得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多数鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における１つのステップを構成し得る。所与の配列にハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。

本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数形も含む）という語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの伸長、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子単位の遺伝であるＲＮＡ鎖のことである。本発明の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、このような調節配列を含むと見なすことができる。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域を含む。

本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合タンパク質であるが、非タンパク質コード遺伝子、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子の場合は、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及び生存する機能的産物を産生するウイルスによって使用される。本明細書で使用される遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系及びその他の関連における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスである。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分岐であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ非アミノ酸によって中断され得る。この語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の処置、例えば、標識成分との接合がなされたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は天然に存在しない若しくは合成アミノ酸を含む。

本明細書で使用される「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立に存在して機能し得るタンパク質配列の部分を指す。

本発明の態様で説明されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、肉眼で、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの支援で行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、かつ２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列によって共有される配列同一性を計算することもできる。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるｄＴＡＬＥのキャッピング領域は、本明細書で提供されるキャッピング領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性又は共有同一性である配列を有する。

配列相同性は、当該技術分野で公知の多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって作成することができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。

パーセンテージ（％）配列相同性は、連続する配列に対して計算することができる、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列における各アミノ酸又はヌクレオチドが、他方の配列における対応するアミノ酸又はヌクレオチドと、一度に１つの残基が直接比較される。これは、「無ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基に対してのみ行われる。

これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、その他が同一の配列の対でも、１つの挿入又は欠失によって続くアミノ酸残基がアラインメントから外れ、従って全アラインメントが行われたときに相同性（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮できない。結果として、殆どの配列比較法は、起こり得る挿入及び欠失を、全体の相同性又は同一性スコアに著しいペナルティーを課すことなく考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、局所相同性又は同一性を最大にするように配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。

しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同数の同一アミノ酸の場合、ギャップが最少の配列アラインメントは、２つの比較される配列間の高い関連性を反映し、ギャップが多い配列よりも高いスコアを獲得することができる。典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを付与し、ギャップにおける各連続する残基に小さいペナルティーを付与する「親和性ギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップの少ない最適化アラインメントを作成することができる。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列の比較にこのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップが−１２、各伸長が−４である。

最大％相同性の計算はまず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４^ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８、及び米国の国立衛生研究所のウェブサイトに記載のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい）。

最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体が、典型的には、オール・オア・ナッシングの対比較に基づくものではない。むしろ、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又はカスタム記号比較表が提供される場合はこれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアでは、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。

別法として、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数のアラインメントの特徴を用いて計算することができる。このソフトウェアが、最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは、％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として、数値結果を出す。

配列は、サイレント変化を生じさせて機能的に同等の物質にする、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換を、アミノ酸特性の類似性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）に基づいて行うことができ、従って、この計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸を官能基に分類するのに有用である。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異のデータも含めるとより有用である。従って、このように得られたアミノ酸のセットは、構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形式で示すことができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的な置換は、例えば、一般に許容されるアミノ酸分類のベン図を示す下表に従って行うことができる。

本発明の実施形態は、相同置換（本明細書では、置換及び交換は共に、既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドの別のアミノ酸残基又はヌクレオチドでの置き換えを指すために用いられる）を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含み、この相同置換は、即ち、アミノ酸の場合は同種置換、例えば、塩基性の塩基性での置換、酸性の酸性での置換、極性の極性での置換などが起こり得る。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、或いは天然に存在しないアミノ酸、例えば、オルニチン（以降、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンの取り込みを伴う置換も起こり得る。

変異アミノ酸配列は、配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に適切なスペーサー基を含み得、このスペーサー基には、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、又はプロピル基が含まれる。ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う変異のさらなる形態は、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４を参照されたい。

本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。

ベクター
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエンジニアリング及び最適化において使用されるベクターを提供する。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移送を可能にする又は促進するツールである。レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて、この挿入されたセグメントを複製することができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントに結合されると複製を行うことができる。一般に、「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためにウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。

組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができる、即ち、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択できる、１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又はベクターが導入された宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。組換え法及びクローニング法については、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に記載されている。

本発明の態様は、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性ベクターに関する。キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、そして特にこの実施形態では、Ｃａｓ９が、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。キメラＲＮＡは、好ましくは、Ｕ６プロモーターによって駆動され得る。理想的には、この２つのプロモーターが組み合わせられる。キメラガイドＲＮＡは、典型的には、２０ｂｐのガイド配列（Ｎｓ）からなり、これは、ｔｒａｃｒ配列（下鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端まで延びている）に接続することができる。ｔｒａｃｒ配列は、示されているように様々な位置で切断することができる。ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡであり得るｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列によって分離されている。このｔｒａｃｒ配列には、図示されているループ配列ＧＡＡＡが続き得る。これらは共に、好ましい例である。本出願人らは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介挿入欠失を実証している。ＣｈｉＲＮＡは、その「＋ｎ」指定によって示され、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。本出願全体において、キメラＲＮＡは、単一ガイド、又は合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ループは、好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列、又は僅か４ｂｐの長さに限定されるものではない。実際、ヘアピン構造に使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、これよりも長い又は短いループ配列を使用することができ、これらは代替の配列とすることができる。この配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び追加のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。

「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であってもよいし、又はこのように特異的でなくてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。調節配列に関して、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書に記載されている。プロモーターに関しては、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書に記載されている。

ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに議論されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳することができる（とはいえ、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７などの任意の適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用することができる）。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる増幅は、ＲＮＡ−コードＤＮＡにおける適切なプロモーターの存在を必要とする。ポリメラーゼ結合部位に対する配列要求性はご当該技術分野において周知である。天然配列及び人工配列を含む種々のＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が知られている。異なるＴ７ＲＮＡポリメラーゼは異なるプロモーター配列選択性を有することができ、突然変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、特定のプロモーターにマッチするように作製された（例えば、米国特許第５，１２２，４５７号明細書及び同第５，３８５，８３４号明細書を参照）が、当業者はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーター配列をルーチン的に入手することができ、任意の特定のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをその好ましいプロモーター配列に容易にマッチさせることができる。コンセンサス２３塩基対Ｔ７ＤＮＡプロモーターは古典的に２つのドメイン、上流の結合ドメイン（−１７〜−５、転写の開始に対して番号付けされる）、及び下流の開始ドメイン（−４〜＋６）に分けられる。この２３ｍｅｒの１つの鎖は、５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−３’である。効率的な転写に必要とされる最小配列は、この２３ｍｅｒの最初の１９ｍｅｒである。

ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するため、又は真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）として使用される。一部の実施形態では、原核生物は、ベクターのコピーを増幅して１つ以上の核酸を発現させるため、例えば、宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用される。原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる場合が殆どである。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を高めること；及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けることに役立ち得る。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素及びその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。

適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現用のベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質の発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアン・ウイルス４０、及び本明細書に開示され当該技術分野で公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。

一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ｍｉｌｋ ｗｈｅｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含する。これらの原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５０，０５９号明細書に記載されている。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関連することがあり、このようなウイルスベクターについては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書に記載されている。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、これに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，７７６，３２１号明細書に記載されている。

調節エレメント
一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するためにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに機能的に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、通常は特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる短鎖散在配列反復（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）の異なるクラス（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）及び関連する遺伝子を含む。類似の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌でも同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復の構造が他のＳＳＲとは異なり、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、この反復は、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、上記）。反復配列は、株間で高度に保存されているが、散在反復の数及びスペーサー領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されるものではないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む４０を超える原核生物で同定された（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分直接反復を包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を指す。本発明の実施形態において用語のガイド配列とガイドＲＮＡとは同義的に用いられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質中に局在している。

一部の実施形態では、直接反復は、以下の基準のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で同定され得る：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂウィンドウに存在する；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔が置かれている。一部の実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば、１及び２、２及び３、又は１及び３が使用され得る。一部の実施形態では、３つ全ての基準が使用され得る。一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、続いて、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって予測され得る：１．直接反復に対する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における予測Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば、１及び２、２及び３、又は１及び３が使用され得る。一部の実施形態では、３つ全ての基準が使用され得る。一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を組み込むことができる。本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９である。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズしかつ標的配列の２０ヌクレオチドに続いてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例としては、ＮＧＧ／ＮＲＧ又は本明細書に記載されるとおり決定され得るＰＡＭが挙げられる）を有する標的部位配列に二本鎖切断を生じさせる。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断のためのＣａｓ９を介したＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、一部がガイド配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列及びＰＡＭ配列によって規定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様が、Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，「ＣＲＩＳＰＲ系：細菌及び古細菌における低分子ＲＮＡガイド防御（Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ）」，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載される。

化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、これは、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び短い一続きの非反復配列（スペーサー、各約３０ｂｐ）が間に置かれた反復配列（直接反復）の特徴的アレイを含む。この系では、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が４段階の逐次的なステップで作成される（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次にはこれがプロセシングされて、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡとなる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二重鎖形成によって、プロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的にＣａｓ９を仕向ける。最後に、Ｃａｓ９がＰＡＭの上流で標的ＤＮＡの切断を媒介することにより、プロトスペーサー内にＤＳＢが作り出される（図２Ａ）。図２Ｂは、コドン最適化Ｃａｓ９の核局在を実証する。正確な転写開始を促進するため、ｔｒａｃｒＲＮＡの発現の駆動にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースのＵ６プロモーターが選択された（図２Ｃ）。同様に、単一のスペーサーと、それに隣接する２つの直接反復（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」にも包含される；図２Ｃ）からなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを発現させるため、Ｕ６プロモーターベースの構築物が開発された。初期のスペーサーは、大脳皮質の発生に重要な遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座における３３塩基対（ｂｐ）の標的部位（３０ｂｐプロトスペーサー＋Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐ ＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計された（図２Ｃ）。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける別個の調節エレメントに機能的に連結され得る。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。

一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。

一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように、対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、その非突然変異型に対し約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれよりも低い場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応するいずれか又は全ての残基において生じ得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認され得る）。特に、以下の突然変異のいずれか又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａ；及び置換アミノ酸のいずれかの保存的置換も想定される。他のＣａｓ９の対応する位置でのこれらの突然変異の同じ置換（又はこれらの突然変異の保存的な置換）も好ましい。特に好ましいのは、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０である。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基が同様に好ましい。

ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９を参照）、ニッキングされたゲノムＤＮＡが高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）を起こすようにした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎがＥＭＸ１プロトスペーサー標的にインデルを生成しないことが確認された。ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分も同様に有する）をＳｐＣａｓ９と同時発現させると標的部位にインデルが生じたが、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現では生じなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシークエンシングでは、ＳｐＣａｓ９ｎによって誘導されたインデルは検出されなかった。同じ遺伝子座を選択して、ＥＭＸ１を標的とするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９又はｈＳｐＣａｓ９ｎ、並びに制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ）の対をプロトスペーサー近傍に導入するためのＨＲ鋳型をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にコトランスフェクトすることにより、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＲを試験した。

好ましいオルソログは以下で議論される。Ｃａｓ酵素は、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大ヌクレアーゼに対する相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指すことができるときにＣａｓ９と同定され得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からのものである、或いはこれらに由来する。由来とは、本出願人によると、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で大部分は野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載されるように何らかの方法で突然変異（改変）されていることを意味する。

他に明白でない限り、Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という用語が一般に本明細書では互換的に使用されることは認識されるであろう。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を参照する。しかしながら、本発明がＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９など、他の微生物種由来のさらに多くのＣａｓ９を含むことは認識されるであろう。

コドン最適化
コドン最適化配列の一例は、この場合にはヒトに最適化されている（即ち、ヒトでの発現に最適化されている）が、本明細書において提供されている（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照）。これが好ましいが、他の例も可能であることは認識されるであろう。そして、宿主種に対するコドン最適化は既知である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、ヒトを含むがこれらに限定されない哺乳類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト哺乳類又は霊長類などの特定の生物のものであるか、或いはこれらに由来し得る。一部の実施形態では、ヒト又は動物に対する実質的な医学的利点を伴わずにヒト又は動物を苦しませる可能性の高い、ヒトの生殖細胞株の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除され得る。

一般に、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中でより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換えことにより、目的の宿主細胞での発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、次にこれは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に訪問）で得られる「コドン使用頻度データベース」において入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

コドン使用頻度は、特定の細胞型における発現、例えば脳細胞での発現のためにさらに最適化することができる。例えば、Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０１：１２５８８−９１は組織特異的なコドン使用頻度について報告しており、例えば、脳特異的遺伝子が肝臓特異的遺伝子とは特徴的に異なるコドン使用頻度示すことに言及している。従って、タンパク質−コード配列は、目的の標的細胞型における発現、例えば肝臓での発現に対してコドン最適化され得る。

核局在化配列（ＮＬＳ）
一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合に、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスΔ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。

一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ（複数可）、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。

ガイド配列
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約又は約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約又は約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又はそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、又はそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターによるトランスフェクションにより提供することができ、次いで標的配列内の優先的切断を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、例として、試験すべきガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験及び対照ガイド配列反応間の標的配列における結合又は切断の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。

ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、Ａ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、Ａ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。一部の実施形態では、最適に折り畳まれたとき、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％前後又はそれ未満、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、又はそれ未満が、自己相補的塩基対合に関与する。最適な折り畳みは任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーを計算することに基づく。１つのかかるアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用した、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。

Ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列により隣接されているガイド配列の切り出し；及び（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列との間の相補性の程度は、最適に整列された場合、約又は約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれよりも大きい数を超える。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。本発明の一実施形態において、転写物又は転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４又は５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最後の「Ｎ」及びループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａ ｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔ ｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃ ｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴ ＴＴＴＴＴＴ。一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物と別個の転写物である。

組換え鋳型
一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される、本明細書に記載される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によってニッキング又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列と、標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。

融合タンパク質
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のヘテロタンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、若しくはそれ以上の、又は約１つを超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える、５つを超える、６つを超える、７つを超える、８つを超える、９つを超える、１０を超える、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されるものではないが、エピトープタグ、受容体遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、ＤＮＡ分子又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。

誘導系
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導系の構成成分を形成し得る。この系の誘導性は、あるエネルギー形態を用いて遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にするであろう。このエネルギー形態には、限定されるものではないが、電磁放射線、音波エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーが含まれ得る。誘導系の例として、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導系（ファイトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性に変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナからの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例は、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び同第６１／７２１，２８３号明細書に記載されている。（Ｋｏｎｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２４６６も参照。）

送達
一部の態様では、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、及び／又はそれから転写された１つ又はタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、及びそのような細胞を含み、又はそれから産生された動物をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（及び場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。従来のウイルス及び非ウイルスベース遺伝子導入法を使用して核酸を哺乳動物細胞又は標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、又は宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性又は組み込まれるゲノムを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）が参照される。

核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^ＴＭ及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ投与）又は標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に対するものであり得る。

免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。

核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又はそれらを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベース系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法について考えられ、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプ及び標的組織において観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染し、通常は高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用性の長い末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にこれを使用して治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで、永続的な導入遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、及びこれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＷＯ９４／２６８７７号パンフレットを参照）。

別の実施形態において、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号明細書を参照のこと）。コーカルウイルスはベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質はアミノ酸レベルでＶＳＶ−Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスがＶＳＶ−Ｇインディアナ株と血清学的には異なるが、最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９−１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又は１つ以上のアクセサリータンパク質及びコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質はレンチウイルス及び／又はガンマレトロウイルスのものである。

一過的発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価及び発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。

例えば、核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、並びにｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を産生することにより生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びそれに続く宿主中への組込みに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージング及び組込みに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ち、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。従って、ＡＡＶは形質導入ベクターとして使用するのに理想的な候補と考えられる。かかるＡＡＶ形質導入ベクターは、トランスに提供されるアデノウイルス又はヘルペスウイルス又はポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）ヘルパー機能の存在下で複製するのに十分なシス作用性機能を含み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を使用して種々の系統の細胞に外来性遺伝子を運び込むことができる。これらのベクターでは、ＡＡＶ ｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子がウイルスゲノムから欠失され、選択のＤＮＡセグメントに置き換える。現在のＡＡＶベクターは、最大４３００塩基の挿入ＤＮＡを収容し得る。

ｒＡＡＶの作製方法は数多あり、本発明はｒＡＡＶ及びｒＡＡＶの調製方法を提供する。例えば、所望のウイルス構築物を含む又はそれから本質的になる１つ又は複数のプラスミドが、ＡＡＶ感染細胞又はパッケージング細胞にトランスフェクトされる。加えて、第２の又は追加のヘルパープラスミドがこれらの細胞にコトランスフェクトされ、組換えウイルス構築物の複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が提供される。これらの条件下で、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質はトランスに作用してｒＡＡＶ構築物の複製及びパッケージングを刺激する。トランスフェクション後２〜３日でｒＡＡＶは回収される。従来、ｒＡＡＶはアデノウイルスと共に細胞から回収される。次に汚染アデノウイルスが熱処理によって不活性化される。本発明では、ｒＡＡＶは有利には、細胞それ自体からではなく、細胞上清から回収される。従って、最初の態様では本発明はｒＡＡＶを調製することを提供し、及び前述に加えて、以下を含む又はそれから本質的になる方法によりｒＡＡＶを調製することができる：発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡと、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）とを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、ｒＡＡＶが機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損している（及びヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）はｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｖ機能を提供する）ステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させ（組換え体は機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損している）、及びｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するプラスミドを前記細胞にトランスフェクトするステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しており、前記細胞が、組換え体に欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するステップ；又は機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しているＡＡＶと、外来性ＤＮＡが組換え体によって発現されるように外来性ＤＮＡを組換え体に挿入するための、かつｒｅｐ及び／又はｃａｐ機能を提供するためのプラスミドとを感受性細胞にトランスフェクトするステップであって、従ってトランスフェクションにより、機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐが欠損した、発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶがもたらされるステップ。

ｒＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりＡＡＶ由来であってもよく、有利には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを含み得るハイブリッド又はカプシドを有するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はｒＡＡＶであり得る。ｒＡＡＶのＡＡＶは、ｒＡＡＶが標的とする細胞に関連して選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化には、ＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッド若しくはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織のターゲティングには、ＡＡＶ４を選択することができる。２９３細胞に加えて、本発明の実施に用いることのできる他の細胞及びそれらの細胞に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの特定のＡＡＶ血清型の相対的感染力（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）は以下のとおりである。

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる２つ、又はそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含む又はそれからなる複数のカセットを含む又はそれから本質的になるｒＡＡＶ、又は２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つ又は２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書が参照される。

一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的に又は非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトする細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞株に由来する。組織培養のための広範な細胞株は、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々のソースから入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターによりトランスフェクトされた細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞株を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の構成成分により一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションにより）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞株を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過性又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はそのような細胞に由来する細胞株を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。

別の実施形態において、針のアレイを備える流体送達装置（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書を参照のこと）が、固形組織に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に企図され得る。流体を固形組織に送達するための米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書の装置は、アレイ状に配置された複数の針と；各々が複数の針のそれぞれ１つと流体連通している複数のリザーバと；複数のリザーバのそれぞれ１つに動作可能に結合されかつリザーバ内の流体圧力を制御するように構成された複数のアクチュエータとを含み得る。特定の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が複数のプランジャの１つを含むことができ、複数のプランジャの各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに受け入れられ、及び特定のさらなる実施形態では複数のプランジャのプランジャがそれぞれの第２の端部で一体に動作可能に結合され、同時に押し下げることが可能である。特定のさらに別の実施形態は、複数のプランジャの全てを選択的に変更可能な速度で押し下げるように構成されたプランジャ駆動装置を含み得る。他の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が、第１の端部と第２の端部とを有する複数の流体送出路の１つを含むことができ、複数の流体送出路の各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに結合される。他の実施形態では、この装置は流体圧力源を含むことができ、及び複数のアクチュエータの各々が流体圧力源と複数のリザーバのそれぞれ１つとの間の流体継手を含む。さらなる実施形態では、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、マスターシリンダー、マイクロ流体ポンプ、及びバルブのうちの少なくとも１つを含み得る。別の実施形態において、複数の針の各々は、その長さに沿って配置された複数のポートを含み得る。

標的の改変
一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドの改変方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。一部の実施形態では、この方法は、ヒト若しくは非ヒト動物又は植物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて全ての段階で行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これによりこの標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。

一態様では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増大又は低下するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に対して、上記のように同様の考慮及び条件が当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に対して、上記のように同様の考慮及び条件が当てはまる。

キット
一態様では、本発明は、上記の方法で開示されるいずれか１つ以上の要素、及び組成物を含むキットを提供する。要素は、個別に又は組み合わせて提供することができ、かつ任意の適切な容器、例えば、バイアル、瓶、又は管に入れて提供することができる。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語の取扱説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上の要素を利用するプロセスに使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供することができる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能形態で、又は使用の前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含む任意の緩衝液とすることができる。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを機能的に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に一致する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、本発明の系の全ての要素を提供できると有利であろう。

ＣＲＩＳＰＲ複合体
一態様では、本発明はＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化）を含む様々な種類の有用性を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。通常、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断（例えば、一本鎖切断又は二本鎖切断）を引き起こす。例えば、この方法を使用して、細胞内の組込みウイルス遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって生じた切断は、修復プロセス、例えば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる（図２９）。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流配列及び下流配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。所望される場合には、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又は送達ビヒクル（例えば、リポソーム又はポロキサマー）と複合体を形成する核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であってもよいし、又は外因性の配列であってもよい。組み込まれる配列の例として、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が挙げられる。従って、組み込みのための配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結され得る。或いは、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより具体的には７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変するための例示的な方法では、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって二本鎖切断がゲノム配列に導入され、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断の存在は、鋳型の組み込みを促進する。

他の実施形態では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体の使用によってこのポリヌクレオチドの発現を低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質又はＲＮＡが産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列は、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡが産生されないように不活性化され得る。一部の方法では、制御配列は、制御配列として機能しなくなるように不活性化することができる。本明細書で使用される場合、「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性をもたらす任意の核酸配列を指す。制御配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。不活性化された標的配列は、欠失突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（即ち、終止コドンが導入されるような別のヌクレオチドによる単一のヌクレオチドとの置換）を含み得る。一部の方法では、標的配列の不活性化は標的配列の「ノックアウト」をもたらす。

「野生型ＳｔＣａｓ９」という用語は、サーモフィラス菌（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、そのタンパク質配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｇ３ＥＣＲ１として提供される。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに受託番号Ｑ９９ＺＷ２として含まれる。

前臨床翻訳
臨床的試験される肝臓特異的遺伝子送達と適合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に切り換えるために、本出願人は、ＳｐＣａｓ９の使用をより小さいＳａＣａｓ９の使用に切り換えることができる。

第１のステップは、ＳａＣａｓ９ＰＡＭと適合するｓｇＲＮＡ配列を再設計及び作製することである。次に、ｓｇＲＮＡはウイルスベクター（おそらく、初期のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞株研究についてはレンチウイルスベクター）にクローニングされ、これらの新しいガイドは、新規の感染においてｃｃｃＤＮＡを切断するその能力について選別される。これらの実験は、ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰノックイン細胞株、及びＨｅｐＧ２．２．１５細胞から精製されたＨＢＶビリオンを使用する。選別は、個々のウェル内の隣り合わせのガイドを用いるか、あるいはＨＢＶに対する全ての可能なｓｇＲＮＡ配列のプールによりレンチウイルスが産生されるプールされたフォーマットを用いるかのいずれかで実施され、次にディープシークエンシングにより、感受性のＳａＣａｓ９による切断に対して最も感受性のＨＢＶゲノムの領域が同定される。

３〜１０のガイドのより小さいリストが選択されたら、初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶ感染のｉｎ ｖｉｔｒｏモデル及びｉｎ ｖｉｖｏモデルの両方で、より的を絞った実験が実施される（例えば、Ｓｃｈｌｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１１（３３）：１２１９３−１２１９８；Ｂｉｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２０（３）：９２４−９３０；Ｌｅｇｒａｎｄ Ｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ＆Ｍｉｃｒｏｂｅ，６（１）：５−９を参照）。これらの実験は、複数のｓｇＲＮＡによる標的化を利用して、ｃｃｃＤＮＡ断片化を同時に誘導することもできる）。付加的な可能性には、本明細書に記載される他の送達系（おそらく、非ウイルス）の使用が含まれる。

抗ＨＢＶ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の適切なｓｇＲＮＡの選択のための理論的根拠：プロセスは多段階プロセスであり、いくつかのパラメータが最適化されなければならない：ｓｇＲＮＡ配列の効力、ｃｃｃＤＮＡの到達可能な部分へのターゲティング、ウイルス遺伝子型を越えた標的配列の保存、及びヒトゲノム標的配列相同性の最小化。これらの基準は、全てのエピソームウイルスにわたる一般的な基準でなければならないが、特異性は異なり得る（例えば、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡコアのＯＲＦにおける切断に対して最も到達可能であると思われ、潜伏ＨＳＶは、潜伏関連転写物ＬＡＴをコードする領域内で最も到達可能であり得ることが可能である）。一般的なワークフローは以下の通りである：
・ ＣＲＩＳＰＲ設計ツールを使用して、目的のＣａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ０、ＳａＣａｓ９）に対するＰＡＭに基づいて、目的のウイルスに対する全ての可能なｓｇＲＮＡを同定する（ＨＢＶなどのｄｓＤＮＡ形態を標的化するために、プラス鎖及びマイナス鎖の両方における標的を見る）。
・ 利用可能な効力予測ツール（例えば、ＳｐＣａｓ９については、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、初期優先順位付けについてのｓｇＲＮＡのオンターゲット効力を予測する。
・ ウイルスゲノムの多様な領域を標的とするｓｇＲＮＡを用いて文献調査及びパイロット実験のある組み合わせを実施し、その後、これらの部位における切断効率を評価して、ウイルスゲノムのどの部分がＣａｓ９によって最も効率的に切断されるかを決定する。これらの領域をヒットするｓｇＲＮＡに優先順位を着ける。
・ このダウンセレクトしたｓｇＲＮＡのリストから、標的配列がウイルス遺伝子型を越えてどのくらい強く保存されるかによってさらに優先順位を付ける。これは、ＧｅｎＢａｎｋに蓄積されたウイルス全ゲノム配列の完全セットに対してプライマーＢＬＡＳＴを実施することによって行うことができる。例えば、ＨＢＶについては、種々の株及び患者単離物からの５０００強の全ゲノム配列がある。これらの配列にわたる理想的な保存は９０＋％である。
・ 最後に、ヒトゲノムに対する低相同性を有するｓｇＲＮＡを選択することによってさらにダウンセレクトする−、ウイルスゲノムについては、これらは一般にヒトゲノム配列とは異なるのでこれは通常問題にならない（おそらく、内因性レトロウイルス領域は例外であるが、これらは優勢的に非機能性である）
・ 次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの効力、並びにオフターゲット効果の選択性及び最小化を、適切なモデルシステムにおいて実験的に決定することができる。

以下は、ＳａＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９の両方について可能性のあるｓｇＲＮＡの徹底したリストである。これらの表において、各列は、ｓｇＲＮＡ標的ＤＮＡ配列（標的配列＋ＰＡＭ）、標的配列及びＰＡＭが見出される鎖（ｃｃｃＤＮＡは二本鎖である）、標的配列が始まる環状ＨＢＶゲノムのヌクレオチド（ＨＢＶｃｃｃＤＮＡは全体で３１８２ｂｐである）、ｓｇＲＮＡがＣｏｒｅ ＯＲＦを標的とするかどうか（本出願人は、これがＣａｓ９による切断の能力が最も高いことを見出した）、そして及び最後に、本出願人の最も有効なｓｇＲＮＡ（ｇ１７）が標的とするところに対してｓｇＲＮＡがＨＢＶゲノムで非常に近い（＋／−５０ｎｔ）かどうかに相当する。

ＳａＣａｓ９ｓｇＲＮＡ

ＳｐＣａｓ９ｓｇＲＮＡ

予備的な次世代シークエンシングを実施して、最大予測オフターゲット部位におけるインデル形成のレベルを特定し（Ｈｓｕ２０１３アルゴリズムを用いて）、本出願人の現在のデータでは、ＨｅｐＧ２．２．１５モデルシステムにおける３つの別個のｓｇＲＮＡ（ｇ６、ｇ１７、ｇ２１）のそれぞれの３つの別個のオフターゲット部位におけるインデル形成は示されない。

図７３に示されるプロットにおいて、「Ｄ」と標識された列は、本出願人が内部対照としてヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９を使用したことを示す。２９ｄｐｔは形質導入の２９日後に対応し、ここで、Ｕ６−ｓｇＲＮＡ及びＥＦＳ−ｈＳｐＣａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏをコードする単一のレンチウイルスベクターをＨｅｐＧ２．２．１５細胞に形質導入した後、ピューロマイシンで選択した。読み深度が理想よりも低かったこと（約２００〜１０００＋読み取り値／標的部位）と、この実験で決定されたオンターゲットインデルがＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより本出願人が見たものよりもいくらか低いことが警告される−しかしながら、ストリンジェントなピューロマイシン選択及び２９日間のＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの構成的発現後に、可能性のあるオフターゲット部位でインデルが依然として検出されないことは有望である。

付加的な抗ＨＢＶ ＣＲＩＳＰＲ戦略：これまでの研究では、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９がアクチベータードメインに融合される場合、転写活性化のためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用できることが示されている。特にＨＢＶに関して、最近、ＨＢＶ感染肝細胞におけるＡＰＯＢＥＣ３Ａ又はＡＰＯＢＥＣ３Ｂ活性を上方制御する特異的な摂動が、ｃｃｃＤＮＡ分解を導くＨＢＶゲノムの特異的なＣ→Ｕ→Ｔ編集によって、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの排除を引き起こし得ることが示された（Ｌｕｃｉｆｏｒａ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １４ Ｍａｒｃｈ ２０１４：Ｖｏｌ．３４３ｎｏ．６１７６ｐｐ．１２２１−１２２８）。ＣＲＩＳＰＲベースの活性化系は標的遺伝子を特異的に上方制御することができるので、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを分解の標的にするために、この系を用いて、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、及び／又は他の抗ウイルス薬インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）を標的とすることが可能である。これは間接的なアプローチであるが、ここでの利点は、ヌクレアーゼコンピテントなＣａｓ９の使用が必要とされず、潜在的に有害なオフターゲット効果の変化を低減されることであり得る。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために記載するものであり、本発明を限定することを一切意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含される本発明における変化及び他の使用に想到するであろう。

実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（直接反復）を含有する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中にＣＲＩＳＰＲ複合体活性を誘導する例示プロセスを記載する。

細胞培養及びトランスフェクション
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。マウスｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞株（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭにより、３７℃、５％のＣＯ_２で維持した。

ＨＥＫ２９３ＦＴ又はＮ２Ａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、トランスフェクション１日前に１ウェル当たり２００，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞をトランスフェクトした。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計８００ｎｇのプラスミドを使用した。

ゲノム改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ及びシークエンシング分析
ＨＥＫ２９３ＦＴ又はＮ２Ａ細胞を、上記プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間及び９８℃において１０分間インキュベートした。抽出されたゲノムＤＮＡを直ちに処理又は−２０℃において貯蔵した。

それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位周囲のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×ＴａｑポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、及び２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ及びＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、切断したＤＮＡの率の尺度としての相対バンド強度に基づくものであった。図７は、このＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの模式的説明を提供する。

相同組換えの検出のための制限断片長多型アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴ及びＮ２Ａ細胞を、プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトし、３７℃において７２時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムＤＮＡを抽出した。相同組換え（ＨＲ）鋳型の相同性アーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。精製産物をＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化し、６％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。

ＲＮＡ二次構造予測及び分析
ＲＮＡ二次構造予測は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。

ＲＮＡ精製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおり維持及びトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。トータル細胞ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルＲＮＡをＮａｏｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、同一濃度に基準化した。

哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノーザンブロット分析
ＲＮＡを等容量の２×ローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱し、氷上で１分間冷蔵し、次いで８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に、少なくとも３０分間のゲルのプレラン後にロードした。サンプルを４０Ｗ限界において１．５時間電気泳動した。その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ｍＡにおいてセミドライ転写装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）中で室温において１．５時間転写した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒのＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上のオートクロスリンクボタンを使用してＲＮＡをメンブレンに架橋させた。メンブレンをＵＬＴＲＡｈｙｂ−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で回転させながら４２℃において３０分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはＩＤＴに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。メンブレンを予備加温（４２℃）された２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより１分間１回洗浄し、次いで４２℃において３０分間２回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において１時間又は一晩曝露させ、次いでｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。

細菌ＣＲＩＳＰＲ系の構築及び評価
ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、及びリーダーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座エレメントを、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）のための隣接する相同性アームを用いてＰＣＲ増幅した。２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位を２つの直接反復間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した（図８）。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＣＹＣ１８４中にｔｅｔプロモーターの下流でクローニングした。Ｃｓｎ２の最後の５０ｂｐは除き、他の内因性ＣＲＩＳＰＲ系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢｓａＩ消化ベクターｐＤＣ０００（ＮＥＢ）中にクローニングし、次いでＴ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によりライゲートしてｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを生成した。哺乳類細胞におけるＰＡＭ発現を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド（発現構築物は、図６Ｂに示すＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果により決定されるとおりの機能と共に図６Ａに示す）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーター及びノーザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノーザンブロットにより確認した。図６Ｃは、長鎖又は短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにＳｐＣａｓ９及びＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物によりトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。左及び右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いず、又は用いてトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物のトランスフェクションは、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノーザンブロット上で検出される。

正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現を駆動した（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つの直接反復（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」にも包含される；図２Ｃ）により隣接されている単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。

哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の切断を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ構成成分の組合せによりトランスフェクトした。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な切断活性を検出した（図７）（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ構成成分のコトランスフェクションは、プロトスペーサーの最大５．０％の切断を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ構成成分のコトランスフェクションも、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮａｓｅ、例えば、関連Ｄｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆している。残り３つの構成成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム切断活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングにより切断活性を確認し；４３個のシークエンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図３〜６、１０、及び１１参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。切断効率を最適化するため、本出願人は、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが切断効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の切断を媒介し得ることを見出した（図６Ｂ）。

図１２は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノーザンブロット分析を提供する。図１２Ａは、２つの直接反復により隣接されている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサー（図６参照）及び直接反復配列を、図１２Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノーザンブロットプローブを生成する領域を示す。図１２Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物によりトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。左及び右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いず、又は用いてトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩの存在に依存的でなかった。トランスフェクト２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの切断を促進することができることを実証する。

図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１及びこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ切断の提案される機序を示す模式図を説明する。直接反復−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサー及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に誘導する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）及びＲＮａｓｅ ＩＩＩ（ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターにより駆動されるＳｐＣａｓ９及びＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ並びに正確な転写開始及び終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６により駆動されるｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介性の少数挿入及び欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＥＭＸ１標的スペーサーを担持するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを用いて又は用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、並びにＳｐＣａｓ９切断部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入及び欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシークエンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、又はミスマッチの塩基は挿入又は突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。

３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させた。同時送達効率を増加させるため、トランスフェクション細胞中のキメラＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９の同時発現を駆動するバイシストロン性発現ベクターを創成した。並行して、バイシストロン性ベクターを使用してｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ）をＳｐＣａｓ９と共に発現させてｃｒＲＮＡへのプロセシングを誘導し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別個に発現させた（図１１Ｂの上図及び下図を比較）。図８は、ｈＳｐＣａｓ９を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ（図８Ａ）又はキメラｃｒＲＮＡ（図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の下流及びＥＦ１αプロモーターの上流の短い線により表わされる）のためのバイシストロン性発現ベクターの模式的説明を提供し、種々のエレメントの局在及びガイド配列挿入の場所を示す。図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の局在周囲の拡大された配列は、部分ＤＲ配列（ＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）及び部分ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ）も示す。ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。オリゴヌクレオチドについての配列設計を図８の模式的説明の下方に示し、適切なライゲーションアダプターを示す。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを表す。キメラＲＮＡ媒介切断の効率を、上記の同一のＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ及びアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングの両方を使用して、本出願人は、キメラＲＮＡ設計がヒトＥＭＸ１遺伝子座の切断を約４．７％の改変比率で促進することを確認した（図３）。

真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介切断の一般化可能性を、ヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ、並びにマウスＴｈ遺伝子座中の複数部位をターゲティングするキメラＲＮＡを設計することによりヒト及びマウス細胞の両方において追加のゲノム遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。図１３は、いくつかの追加のターゲティングされるヒトＰＶＡＬＢ（図１３Ａ）及びマウスＴｈ（図１３Ｂ）遺伝子座中のプロトスペーサーの選択を説明する。遺伝子座及びそれぞれの最後のエクソン内の３つのプロトスペーサーの局在の模式図を提供する。下線付き配列は、３０ｂｐのプロトスペーサー配列及びＰＡＭ配列に対応する３’末端における３ｂｐを含む。センス及びアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方及び下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢ及びマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％及び０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した（図５）。切断はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で切断された（図６及び１３）。

図１１は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図１１Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図１１Ｂは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの直接反復領域間のハイブリダイゼーションを示すｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）及び２０ｂｐのガイド配列、並びにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分直接反復及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ及びｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介切断の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図１１Ｃに説明する。プロセシングされたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）又はキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。

ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギー及びボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用してゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。従って、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。

ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計を図２２に示し、それはガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、及びＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターを説明する。図２２ｂに示されるベクターは、Ｈ１プロモーターに結合しているｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含む。

細菌アッセイでは、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図３Ｃ）。これらの結果は、哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響を与えるさらなる因子が存在し得ることを示唆している。

ＣＲＩＳＰＲ媒介切断の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー切断に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図３Ａ）。図３Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の切断効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム切断を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図３Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム切断を媒介し得る。図３Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図３Ｄは、ＴＡＬＥＮ及びＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。

エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための構成成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高忠実性遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪ及びＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図４Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓａｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニッキングされたゲノムＤＮＡが高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図４Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシークエンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９又はｈＳｐＣａｓ９ｎ、及びプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲ鋳型によりコトランスフェクトすることによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図４Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在及びプライマーアニーリング配列（矢印）と共に提供する。ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲ鋳型の組込みを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図４Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する切断産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人は、ゲノムアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図４Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐ及びＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。

アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な切断が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計及び切断の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域の標的化した欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図４Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。

実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系の改変及び代替例
配列特異的ＤＮＡ切断をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究及び産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率及び多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ^２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとにターゲティング能を制限する（図９、ヒト染色体配列のプラス及びマイナス鎖の両方を評価）。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図１０は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのサーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の適応を説明する。図１０Ａは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１の模式的説明を提供する。図１０Ｂは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化ｈＳｔＣａｓ９を、構成的ＥＦ１αプロモーターを使用して発現させる。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの成熟バージョンを、Ｕ６プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡからの配列を説明する。ｃｒＲＮＡ配列中の小文字「ａ」により示される単一塩基を使用してＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写ターミネーターとして機能するポリＵ配列を除去する。図１０Ｃは、ヒトＥＭＸ１遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図１０Ｄは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する標的遺伝子座中のｈＳｔＣａｓ９媒介切断の結果を示す。ＲＮＡガイドスペーサー１及び２は、それぞれ１４％及び６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる切断活性の統計分析も図５に提供する。図１４は、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の追加のプロトスペーサー及び対応するＰＡＭ配列標的の模式図を提供する。２つのプロトスペーサー配列を強調し、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフを満たすそれらの対応するＰＡＭ配列を対応する強調配列に対して３’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。

実施例３：サンプル標的配列選択アルゴリズム
規定のＣＲＩＳＰＲ酵素についての所望のガイド配列長及びＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ）に基づいてインプットＤＮＡ配列の両方の鎖上の候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧを用いて、インプット配列及びインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを用いて、インプット配列及びインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を探索することにより同定することができる。同様に、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３のＣａｓ９についての標的部位は、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを用いて、インプット配列及びインプットの逆相補鎖の両方の上の５’−Ｎ_ｘ−ＮＧＧＮＧ−３’を探索することにより同定することができる。Ｎ_ｘ中の値「ｘ」は、プログラムにより固定し、又は使用者により規定することができ、例えば、２０である。

ＤＮＡ標的部位のゲノム中の複数の発生は、非特異的ゲノム編集をもたらし得るため、全ての潜在的な部位を同定した後、プログラムは配列が関連参照ゲノム中で出現する回数に基づき配列をフィルタリング除去する。配列特異性が「シード」配列、例えば、ＰＡＭ配列自体を含め、ＰＡＭ配列から５’側の１１〜１２ｂｐにより決定されるそれらのＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリングステップはシード配列に基づき得る。従って、追加のゲノム遺伝子座における編集を回避するため、結果を関連ゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数に基づきフィルタリングする。使用者に、シード配列の長さを選択させることができる。使用者に、フィルター通過の目的のためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の発生数を規定させることもできる。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルトレーションレベルは、シード配列の長さ及びゲノム中の配列の発生数の両方を変えることにより変更する。プログラムは、さらに又は代替的に、同定された標的配列の逆相補鎖を提供することにより、報告された標的配列に相補的なガイド配列の配列を提供し得る。ヒトゲノム中のいくつかの標的部位の例示的な可視化の例は、図１８において提供される。

配列選択を最適化する方法及びアルゴリズムのさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／０６４，７９８号明細書（代理人整理番号４４７９０．１１．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１２／０８４）に見出すことができる。

実施例４：複数のキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を取り込むｔｒａｃｒ配列を有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ；ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、及びｔｒａｃｒ配列を単一転写物中で含む）について得られた結果を記載する。図１６ａは、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Ｃａｓ９はＣＢｈプロモーターにより駆動され、キメラＲＮＡはＵ６プロモーターにより駆動される。キメラガイドＲＮＡは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたｔｒａｃｒ配列（下方の鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端に及ぶ）に結合している２０ｂｐのガイド配列（Ｎ）からなる。ガイド及びｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒメイト配列ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡと、それに続くループ配列ＧＡＡＡにより離隔している。ヒト遺伝子座ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの結果を、それぞれ図１６ｂ及び１６ｃに説明する。矢印は、予測ＳＵＲＶＥＹＯＲ断片を示す。ｃｈｉＲＮＡをそれらの「＋ｎ」表記により示し、ｃｒＲＮＡは、ガイド及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図１７ａ及び１７ｂにヒストグラムにより示し、それぞれ図１６ｂ及び１６ｃに対応する（「Ｎ．Ｄ．」は、インデルが検出されなかったことを示す）。プロトスペーサーＩＤ及びそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、ＰＡＭ配列、及び鎖の位置は以下の表Ｄにおいて提供される。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、又はキメラＲＮＡの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。

ガイド配列を最適化するためのさらなる詳細は、米国仮特許出願第６１／８３６，１２７号明細書（代理人整理番号４４７９０．０８．２０２２；Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｇ）（参照により本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。

最初に、ヒトＨＥＫ２９３ＦＴ細胞中のＥＭＸ１遺伝子座内の３つの部位をターゲティングした。それぞれのｃｈｉＲＮＡのゲノム改変効率は、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ＤＮＡ損傷修復経路によるその後続の修復から生じる突然変異を検出するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して評価した。ｃｈｉＲＮＡ（＋ｎ）と表記される構築物は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎ個のヌクレオチドがキメラＲＮＡ構築物中に含まれることを示し、ｎについては４８、５４、６７、及び８５の値が使用される。野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのより長い断片を含有するキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋８５））は、３つ全てのＥＭＸ１標的部位におけるＤＮＡ切断を媒介し、特にｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、ガイド及びｔｒａｃｒ配列を別個の転写物中で発現する対応するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドよりも顕著に高いレベルのＤＮＡ切断を実証した（図１６ｂ及び１７ａ）。ハイブリッド系（別個の転写物として発現されるガイド配列及びｔｒａｃｒ配列）を検出可能な切断を生じなかったＰＶＡＬＢ遺伝子座中の２つの部位も、ｃｈｉＲＮＡを使用してターゲティングした。ｃｈｉＲＮＡ（＋６７）及びｃｈｉＲＮＡ（＋８５）は、２つのＰＶＡＬＢプロトスペーサーにおける顕著な切断を媒介し得た（図１６ｃ及び１７ｂ）。

ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座中の５つ全ての標的について、ｔｒａｃｒ配列長さの増加に伴うゲノム改変効率の一貫した増加が観察された。いかなる理論によっても拘束されるものではないが、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端により形成される二次構造は、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の比率の向上における役割を担い得る。

実施例５：Ｃａｓ９多様性
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、及びＤＮＡ切断機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び直接反復により隣接されている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、切断に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列及びサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ直接反復配列、それらのエレメントのゲノム構成、及び標的切断のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。

本出願人は、公知のＣａｓ９との配列相同性及び公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ Ｋｏｏｎｉｎ及びＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図１９及び２０Ａ〜Ｆ）。

Ｃａｓ９及びニッカーゼ又はＤＮＡ結合タンパク質に転換するＣａｓ９酵素の突然変異及び変化した機能を有するそれの使用のさらなる詳細は、米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書及び同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２及び４７９０．０７．２０２２及びＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｅ及びＢＩ−２０１３／００４Ｆ）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

実施例６：Ｃａｓ９オルソログ
本出願人は、関連性のあるＰＡＭ配列及び対応するキメラガイドＲＮＡを同定するためＣａｓ９オルソログを分析した。拡張したＰＡＭセットを有することにより、全ゲノムにわたるより幅広いターゲティングが提供され、またユニークな標的部位の数が大幅に増加し、かつゲノムにおいて高い特異性レベルで新規Ｃａｓ９を同定できる可能性がもたらされる。

Ｃａｓ９オルソログの特異性は、各Ｃａｓ９がガイドＲＮＡとそのＤＮＡ標的との間のミスマッチを許容する能力を試験することにより評価し得る。例えば、ガイドＲＮＡにおける突然変異が切断効率に及ぼす効果を試験することにより、ＳｐＣａｓ９の特異性が特徴付けられている。ガイド配列と標的ＤＮＡとの間の単一又は複数のミスマッチを含むガイドＲＮＡのライブラリが作製された。これらの知見に基づき、以下の指針に基づきＳｐＣａｓ９の標的部位を選択することができる：
特定の遺伝子の編集に対するＳｐＣａｓ９の特異性を最大化するため、目的の遺伝子座内の標的部位は、潜在的な「オフターゲット」ゲノム配列が以下の４つの制約条件に従うように選択しなければならない：まず第１に、それらの配列の後に５’−ＮＧＧ又はＮＡＧ配列のいずれかを有するＰＡＭが続いてはならない。第２に、標的配列とのそれらの配列の大域的な配列類似性が最小化されなければならない。第３に、最大数のミスマッチがＰＡＭ−オフターゲット部位の近位領域内になければならない。最後に、最大数のミスマッチが連続しているか又は離れていても４塩基未満でなければならない。

同様の方法を用いて他のＣａｓ９オルソログの特異性を評価し、標的種のゲノム内にある特定の標的部位を選択するための基準を確立することができる。既述のとおり、このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生解析から、３群の大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）及び２群の小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）を含む５つのＣａｓ９ファミリーが明らかとなった（図１９及び図２０Ａ〜図１７Ｆを参照）。Ｃａｓオルソログに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書及び同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２及び４７９０．０７．２０２２及びＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｅ及びＢＩ−２０１３／００４Ｆ）を参照することができる。

実施例７：クローニング及び送達を単純化する方法論的改良。
プラスミド上のＵ６プロモーター及びガイドＲＮＡをコードするよりむしろ、本出願人はＵ６プロモーターをＤＮＡオリゴと共に増幅してガイドＲＮＡを付加した。得られたＰＣＲ産物を細胞にトランスフェクトしてガイドＲＮＡの発現を駆動することができる。

Ｕ６−プロモーター：：ヒトＥｍｘ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡからなるＰＣＲ産物の生成を可能にするプライマー対の例：
フォワードプライマー：ＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃ
リバースプライマー（下線が引かれたガイドＲＮＡを保有する）：ａｃｃｔｃｔａｇＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣ ＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣ ＴＡＧＴＣＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣａａｇ

実施例８：活性を向上させる方法論的改良：
真核細胞でガイドＲＮＡを発現させるためにｐｏｌ３プロモーター、詳細にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えばＵ６又はＨ１プロモーター）を使用するよりむしろ、本出願人は真核細胞でＴ７ポリメラーゼを発現させることにより、Ｔ７プロモーターを使用してガイドＲＮＡの発現を駆動する。

この系の一例は、３つのＤＮＡ断片の導入を伴い得る。
１．Ｃａｓ９の発現ベクター
２．Ｔ７ポリメラーゼの発現ベクター
３．Ｔ７プロモーターと融合したガイドＲＮＡを含む発現ベクター

実施例９：Ｃａｓ９の毒性を低下させる方法論的改良：ｍＲＮＡ形態のＣａｓ９の送達。
Ｃａｓ９をｍＲＮＡの形態で送達することにより、細胞でのＣａｓ９の一過性発現が可能となり、毒性が低下する。例えば、ヒト化ＳｐＣａｓ９は、以下のプライマー対を用いて増幅され得る。
フォワードプライマー（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためにＴ７プロモーターを付加するため）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ
リバースプライマー（ポリＡテールを付加するため）：ＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｔｔｃｔｔａＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧ

本出願人は、真核細胞におけるガイドＲＮＡ発現を駆動するようにＲＮＡ又はＤＮＡカセットの形態のいずれかのガイドＲＮＡと共にＣａｓ９ ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。

実施例１０：実施例１０：Ｃａｓ９の毒性を低下させる方法論的改良：誘導性プロモーターの使用
本出願人は、ゲノム改変を実行するのに必要となった場合に限りＣａｓ９発現を一過性にオンにする。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。

実施例１１：ｉｎ ｖｉｖｏ適用のためのＣａｓ９系の改良
本出願人は、低分子量のＣａｓ９に対してメタゲノム検索を行った。多くのＣａｓ９ホモログはかなり大きい。例えばＳｐＣａｓ９は約１３６８アミノ酸長であり、これは大き過ぎるため送達用のウイルスベクターへのパッケージングが容易でない。ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列からＣａｓ９ホモログの長さ分布を表すグラフが作成される（図２３）。配列の中には誤って注釈されているものもあり、従って各長さについての正確な度数は必ずしも正しいとは限らない。それでもなお、これによりＣａｓ９タンパク質の分布の概観が得られ、より短いＣａｓ９ホモログの存在が示唆される。

本出願人は、コンピューター解析により、細菌株カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に１０００アミノ酸未満のＣａｓ９タンパク質が２つあることを見出した。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来の１つのＣａｓ９の配列を以下に提供する。この長さでは、ＣｊＣａｓ９は、初代細胞への及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのロバストな送達のためＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターに容易にパッケージングすることができる。本発明の好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質が使用される。

＞カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）

このＣｊＣａｓ９に対する推定ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは以下である。
ＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＧ ＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴ

直接反復配列は以下である。
ＡＴＴＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＣ

ＣｊＣａｓ９に対するキメラガイドＲＮＡの例は以下である。
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ

実施例１２：Ｃａｓ９最適化
機能強化のため又は新規機能を開発するため、本出願人は異なるＣａｓ９ホモログの断片を組み合わせることにより、キメラＣａｓ９タンパク質を作成する。例えば、２つの例示的なキメラＣａｓ９タンパク質：
例えば、本出願人は、Ｓｔ１Ｃａｓ９（このタンパク質からの断片は太字とする）のＮ末端を、ＳｐＣａｓ９（このタンパク質からの断片には下線を引く）のＣ末端と融合した。

＞Ｓｔ１（Ｎ）Ｓｐ（Ｃ）Ｃａｓ９

＞Ｓｐ（Ｎ）Ｓｔ１（Ｃ）Ｃａｓ９

キメラＣａｓ９を作製することの利益には、以下が含まれる：
毒性が低下する、
真核細胞における発現が向上する、
特異性が強化される、
タンパク質の分子量が低下し、異なるＣａｓ９ホモログからの最も小さいドメインを組み合わせることによりタンパク質が小さくなる、
ＰＡＭ配列要件の変更。

実施例１３：一般的なＤＮＡ結合タンパク質としてのＣａｓ９の利用
本出願人は、ＤＮＡ標的の両方の鎖の切断に関与している２つの触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の突然変異によって、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するために、本出願人は転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）をＣａｓ９に融合した。本出願人は、転写因子活性化強度が標的で費やされる時間の関数であるため、Ｃａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の強力な核局在を認めることが重要であるという仮説を立てた。従って、本出願人は一組のＣａｓ９−ＶＰ６４−ＧＦＰ構築物をクローニングし、それらを２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後１２時間でその局在を蛍光顕微鏡下で評価した。

嵩高いＧＦＰの存在が妨げとなることなく構築物を機能的に試験するため、同じ構築物を、直接的な融合ではなく、２Ａ−ＧＦＰとしてクローニングした。Ｓｏｘ２遺伝子座は細胞の再プログラム化に有用となり得ると共に、この遺伝子座はＴＡＬＥ−ＴＦ媒介性転写活性化の標的として既に検証されているため、本出願人はＳｏｘ２遺伝子座をＣａｓ９トランス活性化因子による標的とすることにした。Ｓｏｘ２遺伝子座について、本出願人は転写開始部位（ＴＳＳ）近傍の８つの標的を選んだ。各標的は２０ｂｐ長であり、隣接するＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有した。各Ｃａｓ９−ＶＰ６４構築物を各ＰＣＲ生成キメラｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）と２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間でＲＴ−ｑＰＣＲを使用して転写活性化を評価した。

転写活性化因子をさらに最適化するため、本出願人は、ｃｈｉＲＮＡ（Ｓｏｘ２．１及びＳｏｘ２．５）とＣａｓ９（ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ）との比率を滴定し、２９３細胞にトランスフェクトし、及びＲＴ−ｑＰＣＲを使用して定量化した。これらの結果は、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合ドメインとして使用して標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御し得ることを示している。

本出願人は、第２世代の構築物を設計した（下表）。

本出願人はこれらの構築物を使用して転写活性化（ＶＰ６４融合構築物）及び抑制（Ｃａｓ９のみ）をＲＴ−ｑＰＣＲにより評価する。本出願人は抗Ｈｉｓ抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、及びゲルシフトアッセイを使用してＤＮＡ結合親和性を評価する。本発明の好ましい実施形態において、ゲルシフトアッセイはＥＭＳＡゲルシフトアッセイである。

実施例１４：Ｃａｓ９トランスジェニック及びノックインマウス
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するマウスを作成するため、本出願人は２つの一般的戦略、トランスジェニックとノックインとを提示する。これらの戦略は、目的とする任意の他のモデル生物の作成、例えばラットに適用し得る。これらの一般的戦略の各々について、本出願人は、構成的に活性なＣａｓ９と、条件的に発現する（Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性の）Ｃａｓ９とを作製する。構成的に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼは以下のコンテクストで発現する：ｐＣＡＧ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ。ｐＣＡＧはプロモーターであり、ＮＬＳは核局在化シグナルであり、Ｐ２Ａはペプチド切断配列であり、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質であり、ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントであり、及びｂＧＨｐｏｌｙＡはウシ成長ホルモンポリＡシグナル配列である（図２５Ａ〜図２５Ｂ）。条件的バージョンは、プロモーターの後ろ及びＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳの前に１つのさらなる停止カセットエレメント、ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ ｘ３−ｌｏｘＰを有する（即ち ｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡｘ３−ｌｏｘＰ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ）。重要な発現エレメントは図２６のとおり可視化することができる。構成的構築物は開発全体を通して全ての細胞型で発現しなければならないが、条件的構築物は、同じ細胞がＣｒｅリコンビナーゼを発現するときに限りＣａｓ９発現を可能にし得る。この後者のバージョンは、Ｃｒｅが組織特異的プロモーターの発現下にあるときＣａｓ９の組織特異的発現を可能にし得る。さらに、ＣｒｅをＴＥＴ ｏｎ又はｏｆｆシステムなどの誘導性プロモーターの発現下に置くことにより、Ｃａｓ９発現を成体マウスで誘導することができる。

Ｃａｓ９構築物の検証：各プラスミドを３つの方法で機能検証した：１）２９３細胞における一過性トランスフェクションと、続くＧＦＰ発現の確認；２）２９３細胞における一過性トランスフェクションと、続くＰ２Ａ配列を認識する抗体を使用した免疫蛍光法；及び３）一過性トランスフェクションと、続くＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ。２９３細胞は、目的の細胞に応じて２９３ＦＴ細胞又は２９３ Ｔ細胞であってもよい。好ましい実施形態では、細胞は２９３ＦＴ細胞である。Ｓｕｒｖｅｙｏｒの結果は、条件的及び構成的構築物についてゲルのそれぞれ最上列及び最下列で実施した。各々を、ｈＥＭＸ１遺伝子座を標的にするキメラＲＮＡ（キメラＲＮＡ ｈＥＭＸ１．１）の存在下及び非存在下で試験した。結果は、この構築物がキメラＲＮＡ（及び条件的の場合にはＣｒｅ）の存在下においてのみｈＥＭＸ１遺伝子座のターゲティングに成功し得ることを示している。ゲルを定量化した。結果は３サンプルの平均切断効率及び標準偏差として提供する。

トランスジェニックＣａｓ９マウス：構築物を有するトランスジェニックマウスを作成するため、本出願人は純粋な線状ＤＮＡを偽妊娠ＣＢ５６雌由来の接合体の前核に注入する。ファウンダーを同定し、遺伝子型を決定し、ＣＢ５７マウスと戻し交配させる。構築物がクローニングが成功し、これはＳａｎｇｅｒシークエンシングによって確認された。

ノックインＣａｓ９マウス：Ｃａｓ９ノックインマウスを作成するため、本出願人は同じ構成的及び条件的構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座にターゲティングする。本出願人はこれを、以下のエレメントを有するＲｏｓａ２６ターゲティングベクターに各々をクローニングすることにより行った：Ｒｏｓａ２６ショート相同性アーム−構成的／条件的Ｃａｓ９発現カセット−ｐＰＧＫ−Ｎｅｏ−Ｒｏｓａ２６ロング相同性アーム−ｐＰＧＫ−ＤＴＡ。ｐＰＧＫは、ＰＧＫにより駆動される、ネオマイシンに対する耐性を付与するポジティブ選択マーカーＮｅｏ、１ｋｂショートアーム、４．３ｋｂロングアーム、及びネガティブ選択ジフテリア毒素（ＤＴＡ）に対するプロモーターである。

２つの構築物をＲ１ ｍＥＳＣにエレクトロポレートし、２日間成長させておいた後、ネオマイシン選択を適用した。５〜７日目まで生存していた個々のコロニーを取り、個別のウェルで成長させた。５〜７日後にコロニーを回収し、半分は凍結し、残りの半分は遺伝子型同定に使用した。遺伝子型同定はゲノムＰＣＲにより行い、ここでは一方のプライマーをドナープラスミド（ＡｔｔｐＦ）内にアニールし、他方のプライマーをショート相同性アーム（Ｒｏｓａ２６−Ｒ）の外側にアニールした。条件的ケース用に回収した２２個のコロニーのうち、７個が陽性であった（左）。構成的ケース用に回収した２７個のコロニーのうち、陽性は０個であった（右）。Ｃａｓ９がｍＥＳＣにおいてあるレベルの毒性を引き起こし、そのため陽性クローンがなかったものと思われる。これを試験するため、本出願人は正しくターゲティングされる条件的Ｃａｓ９細胞にＣｒｅ発現プラスミドを導入し、培養下で何日も経った後にも極めて低毒性であることを認めた。正しくターゲティングされる条件的Ｃａｓ９細胞におけるＣａｓ９のコピー数の低下（細胞当たり１〜２コピー）は、安定発現及び相対的な無細胞毒性を可能にするのに十分である。さらに、このデータはＣａｓ９コピー数が毒性を決定することを示している。エレクトロポレーション後、各細胞は数コピーのＣａｓ９を得るはずで、これが、構成的Ｃａｓ９構築物の場合に陽性コロニーが認められなかった理由であると思われる。これは、条件的Ｃｒｅ依存戦略を利用すると毒性の低下が示されるはずであるという強力なエビデンスを提供する。本出願人は、正しくターゲティングされる細胞を胚盤胞に注入して雌マウスに移植する。キメラを同定し、戻し交配させる。ファウンダーを同定し、遺伝子型を決定する。

条件的Ｃａｓ９マウスの有用性：本出願人は、２９３細胞において、Ｃｒｅとの同時発現によってＣａｓ９条件的発現構築物を活性化できることを示した。また本出願人は、Ｃｒｅが発現されると、正しく標的化されたＲ１ ｍＥＳＣが活性Ｃａｓ９を有し得ることも示す。Ｃａｓ９の後にＰ２Ａペプチド切断配列が続き、及び次にＥＧＦＰが続くため、本出願人は、ＥＧＦＰの観察により発現の成功を確認する。この同じ概念は、条件的Ｃａｓ９マウスを非常に有用にするものである。本出願人はそれらの条件的Ｃａｓ９マウスを、Ｃｒｅを遍在的に発現するマウス（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ系統）と交配させることができ、あらゆる細胞でＣａｓ９を発現するマウスが得られ得る。胎仔又は成体マウスにおいてゲノム編集を誘導するために必要なことはキメラＲＮＡの送達のみであるはずである。興味深いことに、条件的Ｃａｓ９マウスを組織特異的プロモーターの制御下でＣｒｅを発現するマウスと交配させる場合、同様にＣｒｅを発現する組織にのみＣａｓ９が存在するはずである。この手法を用いて正確な組織に限ったゲノムの編集を、同組織にキメラＲＮＡを送達することにより行い得る。

実施例１５：Ｃａｓ９の多様性及びキメラＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌及び古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外来性ＤＮＡに対する適応免疫機構である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への外来ＤＮＡの「獲得」に関与するタンパク質をコードする一組の遺伝子、並びにＤＮＡ切断機構の「遂行」をコードする一組の遺伝子からなる；これらには、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒ−ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び外来ＤＮＡ由来のスペーサーに直接反復が隣接したアレイ（ｃｒＲＮＡ）が含まれる。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ二重鎖が、スペーサーガイド配列により特定されるＣａｓ９ヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列にガイドし、切断に必要でかつ各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な、標的ＤＮＡの短鎖配列モチーフ近傍でのＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は細菌界全体にわたり見られ、Ｃａｓ９タンパク質配列及びサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ直接反復配列、これらのエレメントのゲノム構成、及び標的切断のモチーフ要件の点で高度に多様である。１つの種が複数の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。

本出願人は、既知のＣａｓ９との配列相同性及び既知のサブドメイン、例えばＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ Ｋｏｏｎｉｎ及びＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生解析から、３群の大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）及び２群の小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）を含む５つのＣａｓ９ファミリーが明らかとなった（図１９Ａ〜図１９Ｄ及び図２０Ａ〜図２０Ｆ）。

本出願人はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を用いてＣａｓ９ガイドＲＮＡの最適化も行っている。

実施例１６：Ｃａｓ９突然変異
本実施例において、本出願人は、以下の突然変異がＳｐＣａｓ９をニッキング酵素に変換し得ることを示す：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ。

本出願人は、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内のどこに局在するかを示す配列を提供する（図２４Ａ〜Ｍ）。本出願人は、ニッカーゼが相同組換えを依然として媒介し得ることも示す。さらに、本出願人は、これらの突然変異を有するＳｐＣａｓ９が（個々に）二本鎖切断を誘導しないことを示す。

Ｃａｓ９オルソログは全て、３〜４のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは相補鎖を切断する。全ての表記はガイド配列を参照する。

５’ＲｕｖＣドメイン内の触媒残基は、目的のＣａｓ９と、他のＣａｓ９オルソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するもの）との相同性比較によって同定され、保存Ａｓｐ残基がアラニンに突然変異されて、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に転換される。同様に、ＨＮＨドメイン内の保存Ｈｉｓ及びＡｓｎ残基はアラニンに突然変異され、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に転換される。

実施例１７：Ｃａｓ９転写活性化及びＣａｓ９リプレッサー
Ｃａｓ９転写活性化
第２世代の構築物を設計して試験した（表１）。これらの構築物を使用して転写活性化（ＶＰ６４融合構築物）及び抑制（Ｃａｓ９のみ）をＲＴ−ｑＰＣＲにより評価する。本出願人は、抗Ｈｉｓ抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、及びゲルシフトアッセイを使用してＤＮＡ結合親和性を評価する。

Ｃａｓリプレッサー
ｄＣａｓ９を一般的なＤＮＡ結合ドメインとして使用して遺伝子発現を抑制し得ることがこれまでに示されている。本出願人は、改良されたｄＣａｓ９設計並びにリプレッサードメインＫＲＡＢ及びＳＩＤ４ｘに対するｄＣａｓ９融合を報告する。以下の表におけるＣａｓ９を使用して転写を調節するため作成されたプラスミドライブラリから、以下のリプレッサープラスミドがｑＰＣＲにより機能的に特徴付けられた：ｐＸＲＰ２７、ｐＸＲＰ２８、ｐＸＲＰ２９、ｐＸＲＰ４８、ｐＸＲＰ４９、ｐＸＲＰ５０、ｐＸＲＰ５１、ｐＸＲＰ５２、ｐＸＲＰ５３、ｐＸＲＰ５６、ｐＸＲＰ５８、ｐＸＲＰ５９、ｐＸＲＰ６１、及びｐＸＲＰ６２。

各ｄＣａｓ９リプレッサープラスミドを、β−カテニン遺伝子のコード鎖にターゲティングされた２つのガイドＲＮＡと共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間でＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによって遺伝子発現を定量化した。内在性対照遺伝子はＧＡＰＤＨであった。２つのバリデートされたｓｈＲＮＡを陽性対照として使用した。陰性対照はｇＲＮＡなしにトランスフェクトした特定のプラスミド（これらは「ｐＸＲＰ＃＃対照」と表される）であった。プラスミドｐＸＲＰ２８、ｐＸＲＰ２９、ｐＸＲＰ４８、及びｐＸＲＰ４９は、指定される標的化戦略を用いるときβ−カテニン遺伝子を抑制することができた。このようなプラスミドは、機能ドメインを有しないｄＣａｓ９（ｐＸＲＰ２８及びｐＸＲＰ２８）、及びＳＩＤ４ｘに融合したｄＣａｓ９（ｐＸＲＰ４８及びｐＸＲＰ４９）に対応する。

さらなる研究では以下を調べる：上記の実験の反復、種々の遺伝子のターゲティング、他のｇＲＮＡを利用した最適なターゲティング位置の決定、及び多重抑制。

実施例１８：コレステロール生合成、脂肪酸生合成、及び他の代謝障害に関与する遺伝子、アミロイド病及び他の疾患に関与する誤って折り畳まれたタンパク質をコードする遺伝子、細胞形質転換を引き起こす癌遺伝子、潜伏ウイルス遺伝子、並びにドミナントネガティブ障害を引き起こす遺伝子（数ある障害の中でも特に）の標的化した欠失
本出願人は、ウイルス送達系或いはナノ粒子送達系を用いた、代謝疾患、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異及び転座により生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、及び他の関連症状に罹患した、必要性のある対象又は患者における肝組織、脳組織、眼組織、上皮組織、造血組織、又は別の組織でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子送達を実証する。

研究設計：代謝障害、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患に罹患した、必要性のある対象又は患者としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、他の家畜及び関連哺乳動物が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はキメラガイドＲＮＡにガイドされ、切断しようとするヒトゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。切断及び非相同末端結合媒介性修復の後、フレームシフト突然変異により遺伝子のノックアウトがもたらされる。

本出願人は、上述の障害に関わる遺伝子を標的にするガイドＲＮＡを、最小限のオフターゲット活性で内因性遺伝子座に特異的であるように選択する。２つ以上のガイドＲＮＡを単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることによりＤＮＡに同時の二本鎖切断を誘導し、罹患した遺伝子又は染色体領域の微小欠失を生じさせてもよい。

遺伝子標的の同定及び設計
各候補疾患遺伝子について、本出願人は目的のＤＮＡ配列を選択し、それにはタンパク質コードエクソン、既知のドミナントネガティブ突然変異部位を含みかつそれに隣接する配列、病的反復配列を含みかつそれに隣接する配列が含まれる。遺伝子ノックアウト手法に関して、開始コドンに最も近接した初期コードエクソンが、完全なノックアウトを達成し、かつ部分的な機能を保持するトランケート型タンパク質産物となる可能性を最小限に抑えるのに最良の選択肢を提供する。

本出願人は、ＮＧＧモチーフ（ＳｐＣａｓ９系について）又はＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ１Ｃａｓ９系について）の直ちに５’側にある可能な全てのターゲティング可能な２０ｂｐ配列に関して目的の配列を分析する。本出願人は、特異性を決定する計算アルゴリズムに基づきオフターゲット効果が最小限に抑えられるように、ゲノムにおけるＲＮＡによってガイドされるユニークな単一のＣａｓ９認識用配列を選択する。

送達系へのガイド配列のクローニング
ガイド配列は二本鎖２０〜２４ｂｐオリゴヌクレオチドとして合成される。オリゴを５’−リン酸化処理し、アニーリングにより二重鎖を形成した後、オリゴを送達方法に応じた好適なベクターにライゲートする：
ウイルスベースの送達方法
ＡＡＶベースのベクター（ＰＸ２６０、３３０、３３４、３３５）が他の部分に記載されている。

レンチウイルスベースのベクターは、Ｕ６プロモーターによって駆動されるキメラＲＮＡ足場と、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動されるＣａｓ９又はＣａｓ９ニッカーゼとを担持する単一のベクターにガイド配列を直接ライゲートする同様のクローニング戦略を用いる。

ウイルス産生については他の部分に記載される。

ナノ粒子ベースのＲＮＡ送達方法
１．Ｔ７プロモーター−ガイド配列キメラＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖としてガイド配列を合成する。Ｔ７プロモーターをＣａｓ９の５’にＰＣＲ方法によって付加する。

２．Ｔ７により駆動されるＣａｓ９及びガイドキメラＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、市販のキットを使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡをさらにキャッピングし、Ａテールを付加する。キットの説明書に従いＲＮＡ産物を精製する。

流体力学的尾静脈送達方法（マウスに対して）
ガイド配列を、上記及び本出願の他の部分に記載するとおりＡＡＶプラスミドにクローニングする。

細胞株に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
トランスフェクション
１．ＤＮＡプラスミドトランスフェクション
ガイド配列を担持するプラスミドをヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞又はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、他の関連性のある細胞型に、脂質ベース、化学ベース又はエレクトロポレーションベースの方法を使用してトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２４ウェルトランスフェクション（約２６０，０００細胞）に対しては、５００ｎｇの総ＤＮＡを、リポフェクタミン２０００を使用して各ウェルにトランスフェクトする。ｈＥＳ細胞の１２ウェルトランスフェクションに対しては、１ｕｇの総ＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを使用して単一のウェルにトランスフェクトする。

２．ＲＮＡトランスフェクション
上記に記載する精製ＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに使用する。１〜２ｕｇのＲＮＡを、製造者の指示に従いリポフェクタミン２０００を使用して約２６０，０００個にトランスフェクトし得る。Ｃａｓ９及びキメラＲＮＡのＲＮＡ送達を図２８に示す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏインデル形成アッセイ
トランスフェクション後７２時間で細胞を回収し、二本鎖切断の指標としてのインデル形成に関してアッセイする。

簡潔に言えば、標的配列の周りのゲノム領域を、高忠実性ポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅する（約４００〜６００ｂｐアンプリコンサイズ）。産物を精製し、等濃度に標準化し、９５℃から４℃まで徐々にアニーリングしてＤＮＡヘテロ二本鎖を形成させる。アニーリング後、Ｃｅｌ−Ｉ酵素を使用してヘテロ二本鎖を切断し、得られた産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、インデル効率を計算する。

動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ原理証明
送達機構
ＡＡＶ又はレンチウイルス作製については他の部分に記載される。
ナノ粒子製剤：ナノ粒子製剤にＲＮＡを混合する。

市販のキットを使用して、マウスにおけるＤＮＡプラスミドの流体力学的尾静脈注射を実施する。

Ｃａｓ９及びガイド配列は、ウイルス、ナノ粒子コーティングＲＮＡ混合物、又はＤＮＡプラスミドとして送達され、被験動物に注射される。並行する一組の対照動物に、滅菌生理食塩水、Ｃａｓ９及びＧＦＰ、又はガイド配列及びＧＦＰ単独を注射する。

注射後３週間で症状の改善に関して動物を調べて犠牲にする。関係する臓器系のインデル形成を分析する。表現型アッセイには、ＨＤＬ、ＬＤＬ、脂質の血中濃度が含まれる。

インデル形成のアッセイ
市販キットを使用して組織からＤＮＡを抽出する；インデルアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実証について記載されるとおり実施し得る。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用は、候補疾患遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された、標的化した欠失の達成に適している。例としては、数ある障害の中でも特に、コレステロール及び脂肪酸代謝、アミロイド病、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染症に関与する遺伝子が挙げられる。

遺伝子座に標的インデルを導入するためのシングルガイドＲＮＡの例

遺伝子座に染色体微小欠失を導入するためのガイドＲＮＡ対の例

実施例１９：ＡＡＶを使用する嚢胞性線維症におけるΔＦ５０８又は他の突然変異の標的補修
本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子治療粒子と生体適合性医薬担体とを含み得る医薬組成物を提供する。別の態様によれば、ＣＦＴＲ遺伝子に突然変異を有する対象を治療するための遺伝子治療方法は、対象の細胞に治療有効量のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子治療粒子を投与することを含む。

本実施例は、嚢胞性線維症又は嚢胞性線維症関連症状に罹患した、必要性がある対象又は患者の気道における、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入又は遺伝子送達を実証する。

研究設計：必要性がある対象又は患者：関連するヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及び他の家畜。この研究は、ＡＡＶベクターによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入の有効性を試験する。本出願人は、遺伝子発現に十分な導入遺伝子レベルを決定し、Ｃａｓ９酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してΔＦ５０８又は他のＣＦＴＲ誘導突然変異をターゲティングする。

治療対象は、自発呼吸下に各肺につき薬学的に有効な量のエアロゾル化したＡＡＶベクター系の気管支内送達を受ける。対照対象は、内在性の対照遺伝子を含む同量の偽型ＡＡＶベクター系の投与を受ける。ベクター系は、薬学的に許容可能な又は生体適合性の医薬担体と共に送達され得る。ベクター投与後３週間又は適切なインターバルを置いて、嚢胞性線維症関連症状の改善に関して治療対象を調べる。

本出願人は、アデノウイルス又はＡＡＶ粒子を使用する。

本出願人は、各々が１つ以上の調節配列（Ｃａｓ９用のＣｂｈ又はＥＦ１ａプロモーター、キメラガイドＲＮＡ用のＵ６又はＨ１プロモーター）に機能的に連結している以下の遺伝子構築物を、１つ以上のアデノウイルス又はＡＡＶベクター又は任意の他の適合性ベクターにクローニングする：ＣＦＴＲΔ５０８ターゲティングキメラガイドＲＮＡ（図３１Ｂ）、ΔＦ５０８突然変異の修復鋳型（図３１Ｃ）及び場合により１つ以上の核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）、例えば２つのＮＬＳを有するコドン最適化Ｃａｓ９酵素。

Ｃａｓ９標的部位の同定
本出願人はヒトＣＦＴＲゲノム遺伝子座を解析し、Ｃａｓ９標的部位を同定した（図３１Ａ）。（ＰＡＭはＮＧＧ又はＮＮＡＧＡＡＷモチーフを含み得る）。

遺伝子修復戦略
本出願人は、Ｃａｓ９（又はＣａｓ９ニッカーゼ）及びガイドＲＮＡを含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系を、Ｆ５０８残基を含有する相同性修復鋳型を含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系と共に対象に、先に考察した送達方法の１つによって導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はＣＦＴＲΔ５０８キメラガイドＲＮＡによりガイドされ、ニッキング又は切断されるＣＦＴＲゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。切断後、嚢胞性線維症をもたらし又は嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を補修する相同組換えによって切断部位に修復鋳型が挿入される。適切なガイドＲＮＡでＣＲＩＳＰＲ系を直接送達し、その全身性の導入を提供するこの戦略を用いて遺伝子突然変異をターゲティングし、代謝、肝臓、腎臓及びタンパク質の疾患及び他の障害を引き起こす遺伝子を編集又は他の方法で操作することができる。

実施例２０：ＣＲＩＳＰＲ系の送達
Ｃａｓ９及びそのキメラガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの組み合わせは、ＤＮＡとしても、あるいはＲＮＡとしても送達することができる。Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡを両方ともにＲＮＡ（普通の又は塩基若しくは骨格改変を含む）分子として送達することを用いて、Ｃａｓ９タンパク質が細胞内に留まる時間を低減することができる。これにより標的細胞におけるオフターゲット切断活性のレベルが低下し得る。ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９の送達はタンパク質に翻訳されるまでに時間がかかるため、Ｃａｓ９ｍＲＮＡを送達した数時間後にガイドＲＮＡを送達して、Ｃａｓ９タンパク質との相互作用に利用可能なガイドＲＮＡのレベルを最大化することが有利であり得る。

ガイドＲＮＡの量が限られている状況では、Ｃａｓ９をｍＲＮＡとして導入し、かつガイドＲＮＡを、ガイドＲＮＡの発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ発現カセットの形態で導入することが望ましい場合もある。このようにして利用可能なガイドＲＮＡの量を転写によって増幅し得る。

Ｃａｓ９（ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に導入するため種々の送達系を導入することができる。これには、リポソーム、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ナノワイヤ（Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２）、エキソソームの使用が含まれる。分子トロイの木馬リポソーム（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１０；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７）を使用して、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡを血液脳関門を越えて送達してもよい。

実施例２１：トリヌクレオチドリピート障害のための治療戦略；ガイド設計
本出願で既述したとおり、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは複数の疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドを含んでもよく、それらの疾患関連遺伝子の一部はトリヌクレオチドリピート障害と称される（またトリヌクレオチドリピート伸長障害、トリプレットリピート伸長障害又はコドン反復障害とも称される）一連の遺伝的障害に属し得る。

これらの疾患は、特定の遺伝子のトリヌクレオチドリピートが正常な安定閾値（通常は遺伝子の点で異なり得る）を超える突然変異により引き起こされる。リピート伸長障害の発見が増えるにつれ、これらの障害を、根底にある類似した特性に基づきいくつかのカテゴリーに分類することが可能となっている。特定の遺伝子のタンパク質コード部分におけるＣＡＧリピート伸長によって引き起こされるハンチントン病（ＨＤ）及び脊髄小脳失調症は、カテゴリーＩに含められる。伸長を有する疾患又は障害であって、その表現型が多様になる傾向のある、かつ伸長が通常は規模が小さく、遺伝子のエクソンにも認められるものは、カテゴリーＩＩに含められる。カテゴリーＩＩＩは、カテゴリーＩ又はＩＩと比べてはるかに大きいリピート伸長によって特徴付けられ、かつ概してタンパク質コード領域の外側に位置する障害又は疾患を含む。カテゴリーＩＩＩ疾患又は障害の例には、限定はされないが、脆弱Ｘ症候群、筋強直性ジストロフィー、脊髄小脳失調症と、若年性ミオクローヌスてんかんと、フリードライヒ失調症とのうちの２つが含まれる。

以下でフリードライヒ失調症に関して言及するものなどの、同様の治療戦略を取り入れて、さらに他のトリヌクレオチドリピート又は伸長障害にも対処し得る。例えば、ほぼ同一の戦略を用いて治療することのできる別のトリプルリピート疾患は、３’ＵＴＲに伸長したＣＴＧモチーフがある筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）である。フリードライヒ失調症においては、疾患はフラタキシン（ＦＸＮ）の最初のイントロンにおけるＧＡＡトリヌクレオチドの伸長により生じる。ＣＲＩＳＰＲを使用した一つの治療戦略は、最初のイントロンからＧＡＡリピートを切り出すことである。伸長したＧＡＡリピートはＤＮＡ構造に影響を及ぼすと考えられ、ヘテロクロマチンの形成の動員がもたらされてフラタキシン遺伝子がオフになる（図３２Ａ）。

他の治療戦略と比べて競争力のある利点を以下に列挙する：
疾患がフラタキシンの発現低下に起因するため、この場合にｓｉＲＮＡノックダウンは適用できない。ウイルス遺伝子療法が現在調査されている。動物モデルにおいてＨＳＶ−１ベースのベクターを使用してフラタキシン遺伝子が送達され、治療効果が示されている。しかしながら、ウイルスベースのフラタキシン送達の長期有効性は、いくつかの問題を抱えている：第一に、フラタキシンの発現を健常者の天然レベルに一致するように調節することが困難であり、第二に、フラタキシンの長期過剰発現は細胞死を引き起こす。

ヌクレアーゼを使用してＧＡＡリピートを切り出すことにより健常な遺伝子型を回復し得るが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮ戦略は、高い有効性のヌクレアーゼの２つのペアを送達する必要があり、これは送達並びにヌクレアーゼのエンジニアリングの両方にとって困難である（ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮによるゲノムＤＮＡの効率的な切り出しは達成が困難である）。

上記の戦略とは対照的に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系には明らかな利点がある。Ｃａｓ９酵素は効率性が高く、かつ多重化し易い、つまり１つ以上の標的を同時に設定し得るということになる。これまでのところ、ゲノムＤＮＡの効率的な切り出しはＣａｓ９によるとヒト細胞で３０％を超え、３０％もの高さであることもあり、将来改善され得る。さらに、ハンチントン病（ＨＤ）のような特定のトリヌクレオチドリピート障害に関しては、２つのアレル間に違いがある場合にコード領域におけるトリヌクレオチドリピートが対処され得る。具体的には、ＨＤ患者が突然変異体ＨＴＴに関してヘテロ接合であり、かつ野生型と突然変異体とのＨＴＴアレル間にＳＮＰなどのヌクレオチドの違いがある場合、Ｃａｓ９を使用して突然変異体ＨＴＴアレルを特異的に標的化し得る。ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮは、一塩基の違いに基づく２つのアレルを区別する能力を有しないであろう。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９酵素を使用してフリードライヒ失調症に対処する戦略を採るにおいて、本出願人は、ＧＡＡ伸長に隣接する部位を標的にする複数のガイドＲＮＡを設計し、最も効率性及び特異性が高いものを選択する（図３２Ｂ）。

本出願人は、ＦＸＮのイントロン１を標的にするガイドＲＮＡとＣａｓ９との組み合わせを送達することにより、ＧＡＡ伸長領域の切り出しを媒介する。ＡＡＶ９を使用してＣａｓ９の及び脊髄における効率的な送達を媒介し得る。

ＧＡＡ伸長に隣接するＡｌｕエレメントが重要であると考えられる場合、標的にすることのできる部位の数に制約があり得るが、本出願人はＡｌｕエレメントの破壊を回避する戦略を採り得る。

代替的な戦略：
Ｃａｓ９を使用してゲノムを改変するよりむしろ、本出願人はまた、Ｃａｓ９（ヌクレアーゼ活性欠損）ベースのＤＮＡ結合ドメインを使用して転写活性化ドメインをＦＸＮ遺伝子にターゲティングすることでＦＸＮ遺伝子を直接活性化し得る。

実施例２２：Ｃａｓ９ニッカーゼを使用してオフターゲット切断を最小限にするための戦略
本出願において既述したとおり、Ｃａｓ９を、以下の１つ以上の突然変異を介して一本鎖切断を媒介し得るように突然変異させ得る：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、及びＨ８４０Ａ。

ＮＨＥＪによる遺伝子ノックアウトを媒介するため、本出願人はニッカーゼバージョンのＣａｓ９を２つのガイドＲＮＡと共に使用する。各個別のガイドＲＮＡによるオフターゲットニッキングは主に突然変異を伴わず修復されてもよく、二本鎖切断（ＮＨＥＪによる突然変異を生じさせ得る）は、標的部位が互いに隣接するときに限り起こる。二重ニッキングにより導入される二本鎖切断は平滑末端ではないため、ＴＲＥＸ１などの末端プロセシング酵素の同時発現がＮＨＥＪ活性レベルを増加させ得る。

以下の表形式の標的リストは、以下の疾患に関与する遺伝子に対するものである：
ラフォラ病−ニューロンにおけるグリコーゲンを低下させるための標的ＧＳＹ１又はＰＰＰ１Ｒ３Ｃ（ＰＴＧ）。
高コレステロール血症−標的ＰＣＳＫ９

標的配列をペア（Ｌ及びＲ）で列挙し、ここではスペーサーにおけるヌクレオチドの数は異なる（０〜３ｂｐ）。各スペーサーそれ自体を野生型Ｃａｓ９と共に使用して標的遺伝子座に二本鎖切断を導入し得る。

ガイドＲＮＡの安定性を向上させかつ特異性を増加させるための代替的な戦略
１．ガイドＲＮＡの５’におけるヌクレオチドは、天然ＲＮＡのようなリン酸エステル結合よりむしろ、チオールエステル結合で連結され得る。チオールエステル結合は、内因性ＲＮＡ分解機構によるガイドＲＮＡの消化を防止し得る。
２．ガイドＲＮＡのガイド配列（５’２０ｂｐ）におけるヌクレオチドは、結合特異性を改善するための塩基として架橋核酸（ＢＮＡ）を使用することができる。

実施例２３：迅速多重ゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
本発明の態様は、標的設計後３〜４日以内に遺伝子改変の効率及び特異性を試験することができ、かつ２〜３週間以内に改変されたクローン細胞株を得ることができるプロトコル及び方法に関する。

プログラム可能なヌクレアーゼは、ゲノムエンジニアリングを高精度で媒介するのに強力な技術である。微生物ＣＲＩＳＰＲ適応免疫系由来のＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して、単純にそのガイドＲＮＡにおいて２０ｎｔターゲティング配列を指定することにより真核細胞における効率的なゲノム編集を促進することができる。本出願人は、哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を促進し、かつ下流機能性研究用の細胞株を作成するためＣａｓ９を応用する一組のプロトコルを記載する。標的設計から始めて３〜４日以内に効率的かつ特異的な遺伝子改変を達成することができ、かつ２〜３週間以内に改変されたクローン細胞株を得ることができる。

生体系及び生物をエンジニアリングする能力は、基礎科学、医薬、及びバイオテクノロジー全域にわたる非常に大きな適用可能性を有している。ここで、内在性ゲノム遺伝子座の正確な編集を促進するプログラム可能な配列特異的エンドヌクレアーゼが、これまで遺伝学的に扱い易くなかったものを含め、広範囲の種における遺伝的エレメント及び原因遺伝子変異の体系的調査を可能にする。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼシステムを含め、いくつかのゲノム編集技術が近年出現している。最初の２つの技術は、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインをモジュール式ＤＮＡ結合タンパク質にテザー係留して、特定のゲノム遺伝子座に標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するという共通した戦略を用いる。対照的に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡとのワトソン・クリック型塩基対合を介して小さいＲＮＡにガイドされるヌクレアーゼであり、設計が容易で効率的な、かつ種々の細胞型及び生物のハイスループットの多重化した遺伝子編集に良く適したシステムを呈する。ここで本出願人は、最近開発されたＣａｓ９ヌクレアーゼを応用して哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を促進し、かつ下流機能性研究用の細胞株を作成する一組のプロトコルを記載する。

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、Ｃａｓ９は標的ゲノム遺伝子座におけるＤＳＢを刺激することによりゲノム編集を促進する。Ｃａｓ９によって切断されると、標的遺伝子座は２つの主要なＤＮＡ損傷修復経路であるエラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうちの一方を経る。いずれの経路を利用しても所望の編集結果を達成し得る。

ＮＨＥＪ：修復鋳型が存在しない場合、ＮＨＥＪプロセスはＤＳＢを再びライゲートし直し、これによりインデル突然変異の形態の傷跡が残り得る。コードエクソン内に現れるインデルはフレームシフト突然変異及び未成熟終止コドンをもたらし得るため、このプロセスを利用して遺伝子ノックアウトを達成することができる。ゲノムにおいて大きい欠失を媒介するため複数のＤＳＢも利用し得る。

ＨＤＲ：相同組換え修復は、ＮＨＥＪの代替となる主要なＤＮＡ修復経路である。ＨＤＲは典型的にはＮＨＥＪと比べて起こる頻度が低いが、ＨＤＲを利用すると、外因的に導入された修復鋳型の存在下で標的遺伝子座に正確な定義付けられた改変を作成し得る。修復鋳型は、二本鎖ＤＮＡの形態であって、挿入配列に隣接する相同性アームを含む従来のＤＮＡターゲティング構築物と同様に設計されてもよく、或いは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態であってもよい。後者は、原因遺伝子変異を探索するための単一のヌクレオチド突然変異の導入など、ゲノムに小さい編集を作製するための有効かつ単純な方法を提供する。ＮＨＥＪと異なり、ＨＤＲは概して分裂細胞においてのみ活性であり、その効率は細胞型及び細胞状態に応じて変化する。

ＣＲＩＳＰＲの概要：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、対照的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと低分子ガイドＲＮＡとからなる最小でも二成分系である。Ｃａｓ９を異なる遺伝子座にターゲティングし直し、又は複数の遺伝子を同時に編集するために必要なことは、単純に、異なる２０ｂｐオリゴヌクレオチドのクローニングである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの特異性は未だ完全には解明されていないが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の単純なワトソン・クリック型塩基対合はＺＦＮ又はＴＡＬＥＮドメインのそれより予測可能性が高いように思われる。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、Ｃａｓ９を使用して外来性遺伝子エレメントを切断する細菌適応免疫系である。Ｃａｓ９は、可変的ｃｒＲＮＡと必須の補助的ｔｒａｃｒＲＮＡとの非コードＲＮＡのペアによりガイドされる。ｃｒＲＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対合で標的ＤＮＡの位置を特定することにより特異性を決定する２０ｎｔガイド配列を含む。天然の細菌系では複数のｃｒＲＮＡが共転写され、Ｃａｓ９を種々の標的に向けさせる。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、標的ＤＮＡが５’−ＮＧＧ／ＮＲＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（他のＣＲＩＳＰＲ系については異なり得る）の直前になければならない。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、哺乳類細胞ではヒトコドン最適化Ｃａｓ９及び必須のＲＮＡ構成成分の異種発現により再構成される。さらに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを融合してキメラの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作り出すことができる。このように、ｓｇＲＮＡ内の２０ｎｔガイド配列を変えることにより、目的とするいかなる標的にもＣａｓ９を仕向け直すことができる。

その実現の容易さ及び多重化可能性を所与として、Ｃａｓ９は、ＮＨＥＪ及びＨＤＲの両方による特定の突然変異を担持するエンジニアリングされた真核細胞の作成に用いられてきた。加えて、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの胚への直接注入が、複数の改変アレルを有するトランスジェニックマウスの迅速な作成を可能にしている；これらの結果は、本来遺伝的に扱いが困難な生物の編集に有望である。

その触媒ドメインの１つに破壊を有する突然変異体Ｃａｓ９が、ＤＮＡを切断するというよりむしろそれにニックを入れるようにエンジニアリングされており、一本鎖切断及びＨＤＲによる優先的修復が可能となって、オフターゲットＤＳＢによる望ましくないインデル突然変異が潜在的に改良されている。加えて、突然変異したＤＮＡ切断触媒残基を両方ともに有するＣａｓ９突然変異体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における転写調節を可能にするように適合されており、多様な適用に合わせてＣａｓ９を機能性にし得る可能性を実証している。本発明の特定の態様は、ヒト細胞の多重編集用Ｃａｓ９の構築及び適用に関する。

本出願人は、真核生物遺伝子編集を促進するため核局在化配列が隣接するヒトコドン最適化Ｃａｓ９を提供している。本出願人は、２０ｎｔガイド配列を設計するに当たっての考慮点、ｓｇＲＮＡの迅速な構築及び機能検証プロトコル、及び最後に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用したヒト胎児腎臓系（ＨＥＫ−２９３ＦＴ）及びヒト幹細胞株（ＨＵＥＳ９）におけるＮＨＥＪベース及びＨＤＲベースの両方のゲノム改変の媒介を記載する。このプロトコルは他の細胞型及び生物にも同様に適用することができる。

ｓｇＲＮＡの標的選択：遺伝子ターゲティング用の２０ｎｔガイド配列の選択には、２つの主な考慮点がある：１）化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９については標的配列が５’−ＮＧＧ ＰＡＭの前になければならず、及び２）ガイド配列はオフターゲット活性を最小限に抑えるように選択されなければならない。本出願人は、目的の入力配列を取り込み好適な標的部位を同定するオンラインＣａｓ９ターゲティング設計ツールを提供した。各ｓｇＲＮＡについてオフターゲット改変を実験的に評価するため、本出願人はまた、塩基対合ミスマッチの同一性、位置、及び分布の効果に関する本出願人の定量的特異性分析に従い順位が付けられた、意図する各標的についての計算的に予測されたオフターゲット部位も提供する。

計算的に予測されたオフターゲット部位に関する詳細情報は以下のとおりである：
オフターゲット切断活性の考慮点：他のヌクレアーゼと同様に、Ｃａｓ９は低い頻度でゲノムにおけるオフターゲットＤＮＡ標的を切断し得る。所与のガイド配列がオフターゲット活性を呈する程度は、酵素濃度、用いられる特定のガイド配列の熱力学、及び標的ゲノムにおける同様の配列の存在量を含めた複合的な要因に依存する。Ｃａｓ９の常法の適用については、オフターゲット切断の程度を最小限に抑えると共に、オフターゲット切断の存在を検出可能である方法を考慮することが重要である。

オフターゲット活性の最小化：細胞株における適用について、本出願人は、以下の２ステップでオフターゲットゲノム改変の程度を低下させることを推奨する。第１に、本発明者らのオンラインＣＲＩＳＰＲ標的選択ツールを使用して、所与のガイド配列がオフターゲット部位を有する可能性を計算的に評価することが可能である。このような分析は、ガイド配列と同様の配列であるオフターゲット配列に関してゲノムを網羅的に検索することにより実施される。ｓｇＲＮＡとその標的ＤＮＡとの間のミスマッチ塩基の効果の包括的な実験研究から、ミスマッチの許容範囲は、１）位置依存性−ガイド配列の３’末端側８〜１４ｂｐは、５’塩基と比べてミスマッチに対する許容度が低い、２）数量依存性−一般に３個より多いミスマッチは許容されない、３）ガイド配列依存性−一部のガイド配列は他と比べてミスマッチに対する許容度が低い、及び４）濃度依存性−オフターゲット切断はトランスフェクトされたＤＮＡの量に対する感度が極めて高いことが明らかになった。本出願人の標的部位分析ウェブツール（ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓで利用可能）は、これらの基準を統合し、標的ゲノムにおける推定オフターゲット部位の予測を提供する。第２に、本出願人は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量を滴定してオフターゲット活性を最小限に抑えることを推奨する。

オフターゲット活性の検出：本出願人のＣＲＩＳＰＲターゲティングウェブツールを使用して、最も可能性の高いオフターゲット部位並びにそれらの部位のＳＵＲＶＥＹＯＲ又はシークエンシング分析を実施するプライマーのリストを作成することが可能である。Ｃａｓ９を使用して作成されるアイソジェニッククローンについて、本出願人は、これらの候補オフターゲット部位のシークエンシングにより任意の望ましくない突然変異を調べることを強く推奨する。予測された候補リストに含まれない部位にオフターゲット改変があり得ることは注記に値し、完全なゲノム配列を実施してオフターゲット部位がないことを完全に確かめるべきである。さらに、同じゲノム内にいくつかのＤＳＢが誘導される多重アッセイでは、低率の転座イベントがあり得、ディープシークエンシングなどの種々の技法を用いて評価され得る。

本オンラインツールは、１）ｓｇＲＮＡ構築物の調製、２）標的改変効率のアッセイ、及び３）潜在的なオフターゲット部位における切断の評価に必要なあらゆるオリゴ及びプライマーの配列を提供する。ｓｇＲＮＡの発現に使用されるＵ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、その転写物の最初の塩基としてグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを好むため、２０ｎｔガイド配列がＧから始まらないｓｇＲＮＡの５’に追加のＧが付加されることは注記に値する。

ｓｇＲＮＡの構築及び送達手法：所望の適用に応じて、ｓｇＲＮＡは、１）発現カセットを含有するＰＣＲアンプリコン、又は２）ｓｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかとして送達され得る。ＰＣＲベースのｓｇＲＮＡ送達は、Ｕ６プロモーター鋳型の増幅に使用されるリバースＰＣＲプライマーにカスタムのｓｇＲＮＡ配列を付加する。得られるアンプリコンが、Ｃａｓ９含有プラスミド（ＰＸ１６５）とコトランスフェクトされ得る。この方法は、ｓｇＲＮＡコードプライマーを得て僅か数時間後に機能性試験用の細胞トランスフェクションを実施することができるため、複数の候補ｓｇＲＮＡの迅速スクリーニングに最適である。この単純な方法ではプラスミドベースのクローニング及び配列検証が不要となるため、大規模なノックアウトライブラリの作成又は他のスケールに影響される適用のため多数のｓｇＲＮＡを試験し又はコトランスフェクトすることに良く適している。プラスミドベースのｓｇＲＮＡ送達に必要な約２０ｂｐオリゴと比較して、ｓｇＲＮＡコードプライマーが１００ｂｐを超える点は留意すべきである。

ｓｇＲＮＡ用の発現プラスミドの構築もまた単純かつ高速であり、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのペアによる単一のクローニングことを含む。オリゴペアのアニーリング後、得られるガイド配列が、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ配列の残り部分を有する不変の足場の両方を有するプラスミド（ＰＸ３３０）に挿入され得る。トランスフェクションプラスミドもまた、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用のウイルス産生を可能にするように改変され得る。

ＰＣＲ及びプラスミドベースの送達に加え、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡの両方をＲＮＡとして細胞に導入することができる。

修復鋳型の設計：従来、標的ＤＮＡ改変は、変化させる部位に隣接する相同性アームを含むプラスミドベースのドナー修復鋳型を使用する必要があった。両側の相同性アームの長さは様々であってもよいが、典型的には５００ｂｐより長い。この方法を使用して、蛍光タンパク質又は抗生物質耐性マーカーなどのレポーター遺伝子の挿入を含む大きい改変を作成することができる。ターゲティングプラスミドの設計及び構築は、他の部分に記載されている。

最近になって、クローニングを含まない定義付けられた遺伝子座の範囲内の短い改変には、ターゲティングプラスミドの代わりに一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）が使用されている。高いＨＤＲ効率を達成するため、ｓｓＯＤＮは標的領域と相同の少なくとも４０ｂｐの隣接配列を両側に含み、標的遺伝子座に対してセンス方向にも、又はアンチセンス方向にも向くことができる。

機能性試験
ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ：本出願人は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ（又はＰＣＲアンプリコンシークエンシングのいずれかによりインデル突然変異を検出した。本出願人のオンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツールは、両方の手法に推奨されるプライマーを提供する。しかしながら、ＳＵＲＶＥＹＯＲ又はシークエンシングプライマーはまた、ゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅し、かつ非特異的なアンプリコンを回避するようにＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔを使用して手動で設計されてもよい。ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーは、ゲル電気泳動による切断バンドの明確な可視化を可能にするため、Ｃａｓ９標的の両側で３００〜４００ｂｐ（６００〜８００ｂｐの総アンプリコンに対して）を増幅するように設計されなければならない。過剰なプライマー二量体形成を防ぐため、ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーは、典型的には融解温度が約６０℃の２５ｎｔ長未満であるように設計されなければならない。本出願人は、特定のＰＣＲアンプリコンに対する候補プライマーの各ペアを試験し、並びにＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化プロセスの間に非特異的な切断が存在しないことについても試験することを推奨する。

プラスミド媒介性又はｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲ：ＨＤＲは改変領域のＰＣＲ増幅及びシークエンシングにより検出することができる。この目的上、ＰＣＲプライマーは、残存する修復鋳型（ＨＤＲ Ｆｗｄ及びＲｅｖ、図３０）の誤検出を回避するため相同性アームが広がる領域の外側にアニールしなければならない。ｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲはＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲプライマーを使用することができる。

シークエンシングによるインデル又はＨＤＲの検出：本出願人は、Ｓａｎｇｅｒ法又は次世代ディープシークエンシング（ＮＧＳ）のいずれかにより標的ゲノム改変を検出した。前者については、ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマー又はＨＤＲプライマーのいずれかを使用して改変領域からゲノムＤＮＡを増幅することができる。アンプリコンは、形質転換のためｐＵＣ１９などのプラスミドにサブクローニングしなければならない；個々のコロニーをシークエンシングすることによりクローン遺伝子型を明らかにすることができる。

本出願人は、より短いアンプリコン用の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プライマーを、典型的には１００〜２００ｂｐのサイズ範囲で設計した。ＮＨＥＪ突然変異の検出には、より長いインデルの検出が可能であるように、プライミング領域とＣａｓ９標的部位との間が少なくとも１０〜２０ｂｐのプライマーを設計することが重要である。本出願人は、多重ディープシークエンシング用のバーコード付きアダプターを取り付ける二段階ＰＣＲ法に関する指針を提供する。本出願人は、偽陽性インデルレベルが全般的に低いことから、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを推奨する。次に、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、又は単純な配列解析スクリプトなどのリードアラインメントプログラムを用いてオフターゲット分析（先述した）を実施することができる。

材料及び試薬
ｓｇＲＮＡ調製：
超高純度ＤＮアーゼＲＮａｓｅ不含蒸留水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９７７−０２３）
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
重要。標準Ｔａｑポリメラーゼ、これは３’−５’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠いており、忠実性が低く、増幅エラーをもたらし得る。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩは高忠実性ポリメラーゼ（Ｐｆｕと同等の忠実性）であり、最小限の最適化で高収率のＰＣＲ産物を生じる。他の高忠実性ポリメラーゼに代えてもよい。
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ反応緩衝液（５×；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポリメラーゼと同梱）
ｄＮＴＰ溶液ミックス（各２５ｍＭ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｎ２０５Ｌ）
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ０９７１）
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）
ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０６）
超高純度ＴＢＥ緩衝液（１０×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５８１−０２８）
ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５０００４）
ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡ染色（１０，０００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ３３１０２）
１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７８７−０１８）
ＴｒａｃｋＩｔ ＣｙａｎＯｒａｎｇｅローディング緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４８２−０２８）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｂｓＩ（ＢｐｉＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ１０１４）
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｔａｎｇｏ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＢＹ５）
ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ０８６２）
Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
重要：より一般的に用いられるＴ４リガーゼを代用しないこと。Ｔ７リガーゼは付着末端で平滑末端と比べて１，０００倍高い活性を有し、かつ市販の高濃度Ｔ４リガーゼと比べて全体的な活性が高い。
Ｔ７ ２×迅速ライゲーション緩衝液（Ｔ７ ＤＮＡリガーゼと同梱、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０１Ｓ）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（１０×；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ０２０２Ｓ）
アデノシン５’−三リン酸（１０ｍＭ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｐ０７５６Ｓ）
ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ ＡＴＰ依存性ＤＮアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号Ｅ３１０１Ｋ）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３化学的コンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｃ７３７３−０３）
ＳＯＣ培地（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ９０２０Ｓ）
ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ３０２２）
ＬＢ寒天培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ２８９７）
アンピシリン、滅菌ろ過済み（１００ｍｇ ｍｌ−１；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５３５４）

哺乳類細胞培養：
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｒ７００−０７）
ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ、１×、高グルコース；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３１３−０３９）
ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ、１×、高グルコース、フェノールレッド不含；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１０５３−０２８）
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、１×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−２５０）
ウシ胎仔血清、適格品（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）かつ熱失活済み（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４３８−０３４）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ低血清培地（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１０５８−０２１）
ペニシリン−ストレプトマイシン（１００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０−１６３）
ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＥｘｐｒｅｓｓ（１×、フェノールレッド不含；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２６０４−０１３）
リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８０２７）
Ａｍａｘａ ＳＦ細胞株４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＸキットＳ（３２ ＲＣＴ；Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＣ−２０３２）
ＨＵＥＳ ９細胞株（ＨＡＲＶＡＲＤ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｇｅｌｔｒｅｘ ＬＤＥＶ不含低成長因子基底膜マトリックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１４１３２０１）
ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５８５０）
Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９２０）
ＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ−２７６３２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＭ０７５）
Ａｍａｘａ Ｐ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＸキットＳ（３２ ＲＣＴ；Ｌｏｎｚａカタログ番号Ｖ４ＸＰ−３０３２）

遺伝子型解析：
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）
ＳＵＲＶＥＹＯＲ、ＲＦＬＰ分析、又はシークエンシング用のＰＣＲプライマー（プライマー表参照）
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
重要。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは一塩基ミスマッチの感度を有するため、高忠実性ポリメラーゼを使用することが特に重要である。他の高忠実性ポリメラーゼに代えてもよい。
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ反応緩衝液（５×；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポリメラーゼと同梱）
ｄＮＴＰ溶液ミックス（各２５ｍＭ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｎ２０５Ｌ）
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）
Ｔａｑ緩衝液（１０×；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｂ０００５）
標準ゲル電気泳動用のＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、カタログ番号７０６０２５）
超高純度ＴＢＥ緩衝液（１０×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５８１−０２８）
ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５０００４）
４〜２０％ＴＢＥゲル １．０ｍｍ、１５ウェル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＥＣ６２２５５ＢＯＸ）
Ｎｏｖｅｘ（登録商標）高密度ＴＢＥサンプル緩衝液（５×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＬＣ６６７８）
ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（１０，０００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−１１４９４）
１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７８７−０１８）
ＴｒａｃｋＩｔ ＣｙａｎＯｒａｎｇｅローディング緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４８２−０２８）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ０５０４）

機器
フィルター付き滅菌ピペットチップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
標準１．５ｍｌ微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号００３０ １２５．１５０）
Ａｘｙｇｅｎ９６ウェルＰＣＲプレート（ＶＷＲ、カタログ番号ＰＣＲ−９６Ｍ２−ＨＳＣ）
Ａｘｙｇｅｎ ８ストリップＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４−２２２−２５０）
Ｆａｌｃｏｎチューブ、ポリプロピレン、１５ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２０９７）
Ｆａｌｃｏｎチューブ、ポリプロピレン、５０ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２０７０）
細胞ストレーナーキャップ付き丸底チューブ、５ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２２３５）
ペトリ皿（６０ｍｍ×１５ｍｍ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５１００７）
組織培養プレート（２４ウェル；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０４７）
組織培養プレート（９６ウェル、平底；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０７５）
組織培養皿（１００ｍｍ；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、３５３００３）
プログラム可能な温度ステッピング機能付き９６ウェルサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｅｒｉｔｉ、カタログ番号４３７５７８６）。
卓上微量遠心機５４２４、５８０４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ゲル電気泳動システム（ＰｏｗｅｒＰａｃ ｂａｓｉｃ ｐｏｗｅｒ ｓｕｐｐｌｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６４−５０５０、及びＳｕｂ−Ｃｅｌｌ ＧＴシステムゲルトレー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−４４０１）
Ｎｏｖｅｘ ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＥＩ０００１）
デジタルゲルイメージングシステム（ＧｅｌＤｏｃ ＥＺ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−８２７０、及び青色サンプルトレー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−８２７３）
青色光トランスイルミネーター及びオレンジフィルターゴーグル（ＳａｆｅＩｍａｇｅｒ ２．０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｇ６６００）
ゲル定量化ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＩｍａｇｅＬａｂ、ＧｅｌＤｏｃ ＥＺと同梱、又は国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のオープンソースＩｍａｇｅＪ、ウェブサイトｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／で利用可能）
紫外分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）

試薬セットアップ
トリス−ホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）電気泳動溶液 ＴＢＥ緩衝液を蒸留水に希釈し、アガロースゲルをキャスティングするため及びゲル電気泳動用緩衝液として使用するための１×ワーキング溶液とする。緩衝液は室温（１８〜２２℃）で少なくとも１年間保存しておくことができる。
・ ＡＴＰ、１０ｍＭ １０ｍＭ ＡＴＰを５０μｌアリコートに分け、−２０℃で最長１年間保存する；凍結−融解サイクルを繰り返すことは避ける。
・ ＤＴＴ、１０ｍＭ 蒸留水中に１０ｍＭ ＤＴＴ溶液を調製し、２０μｌアリコートとして−７０℃で最長２年間保存する；ＤＴＴは酸化し易いため、反応毎に新しいアリコートを使用する。
・ Ｄ１０培養培地 ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を培養するため、ＤＭＥＭに１× ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清を補給することによりＤ１０培養培地を調製する。プロトコルに示すとおり、この培地はまた１×ペニシリン−ストレプトマイシンを補給してもよい。Ｄ１０培地は前もって作製しておき、４℃で最長１ヶ月間保存することができる。
・ ｍＴｅＳＲ１培養培地 ヒト胚性幹細胞の培養のため、５×サプリメント（ｍＴｅＳＲ１基本培地と同梱）、及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎを補給してｍＴｅＳＲ１培地を調製する。

手順
ターゲティング構成成分の設計及びオンラインツールの使用・タイミング１日
１｜標的ゲノムＤＮＡ配列を入力する。本出願人は、目的の入力配列を受け取り、好適な標的部位を同定してそれに順位を付け、及び意図する標的毎にオフターゲット部位を計算的に予測するオンラインＣａｓ９ターゲティング設計ツールを提供する。或いは、任意の５’−ＮＧＧの直ちに上流で２０ｂｐ配列を同定することにより、ガイド配列を手動で選択してもよい。

２｜オンラインツールによって特定されるとおりの必要なオリゴ及びプライマーを注文する。部位を手動で選択する場合、オリゴ及びプライマーを設計しなければならない。

ｓｇＲＮＡ発現構築物の調製
３｜ｓｇＲＮＡ発現構築物を作成するため、ＰＣＲベース又はプラスミドベースのいずれのプロトコルも用いることができる。

（Ａ）ＰＣＲ増幅による・タイミング２時間
（ｉ）本出願人は希釈Ｕ６ ＰＣＲ鋳型を調製する。本出願人はＰＸ３３０をＰＣＲ鋳型として使用することを推奨するが、任意のＵ６含有プラスミドを同様にＰＣＲ鋳型として使用することができる。本出願人は鋳型を１０ｎｇ／ｕｌの濃度となるようにｄｄＨ２Ｏで希釈した。Ｕ６によって駆動されるｓｇＲＮＡを既に含んでいるプラスミド又はカセットが鋳型として使用される場合、ゲル抽出を実施して、産物が意図したｓｇＲＮＡのみを含み、鋳型からのｓｇＲＮＡキャリーオーバーの痕跡を含まないことを確実にする必要がある点に留意されたい。

（ｉｉ）本出願人は希釈ＰＣＲオリゴを調製した。Ｕ６−Ｆｗｄ及びＵ６−ｓｇＲＮＡ−Ｒｅｖプライマーは、ｄｄＨ２Ｏ中１０ｕＭの最終濃度に希釈される（１０ｕｌの１００ｕＭプライマーを９０ｕｌ ｄｄＨ２Ｏに添加する）。

（ｉｉｉ）Ｕ６−ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ反応。本出願人は、各Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−Ｒｅｖプライマー及び必要に応じてマスターミックスに対して以下の反応をセットアップした。

（ｉｖ）本出願人は、ステップ（ｉｉｉ）の反応物に対し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

（ｖ）反応の完了後、本出願人は産物をゲル上で泳動させて、シングルバンドの増幅の成功を確かめた。１×ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ色素を含む１×ＴＢＥ緩衝液に２％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲルをキャスティングする。５ｕｌのＰＣＲ産物をゲル中１５Ｖｃｍ−１で２０〜３０分間泳動させる。成功したアンプリコンは、１つのシングル３７０ｂｐ産物を生じるはずであり、鋳型は見えないはずである。ＰＣＲアンプリコンをゲル抽出する必要はないはずである。

（ｖｉ）本出願人は、製造者の指示に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ産物を精製した。３５ｕｌの緩衝液ＥＢ又は水中にＤＮＡを溶出させる。精製したＰＣＲ産物は４℃又は−２０℃で保存しておくことができる。

（Ｂ）Ｃａｓ９含有バイシストロン性発現ベクターへのｓｇＲＮＡのクローニング・タイミング３日
（ｉ）ｓｇＲＮＡオリゴインサートを調製する。本出願人は、各ｓｇＲＮＡ設計について、１００ｕＭの最終濃度となるようにオリゴの上部鎖及び下部鎖を再懸濁した。オリゴを以下のとおりリン酸化及びアニーリングする。

（ｉｉ）以下のパラメータを使用してサーモサイクラーでアニーリングする：
３７℃で３０分
９５℃で５分
毎分５℃で２５℃まで下降させる。

（ｉｉｉ）本出願人は、１ｕｌのオリゴを１９９ｕｌの室温ｄｄＨ_２Ｏに添加することにより、リン酸化及びアニーリングしたオリゴを１：２００希釈した。

（ｉｖ）ｓｇＲＮＡオリゴをＰＸ３３０にクローニングする。本出願人は、各ｓｇＲＮＡについてＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応をセットアップする。本出願人は、インサートのない、ＰＸ３３０のみの陰性対照を設定することを推奨する。

（ｖ）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を合計１時間インキュベートする。
サイクル数 条件
１−６ ３７℃で５分、２１℃で５分

（ｖｉ）本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼでＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を処理することにより、任意の残留する線状ＤＮＡを消化させた。このステップは任意選択であるものの、強く推奨される。

（ｖｉｉ）本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７０℃で３０分間不活性化した。休題：完了後、反応物を凍結させて後に続行してもよい。環状ＤＮＡは少なくとも１週間安定しているはずである。

（ｖｉｉｉ）形質転換。本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理したプラスミドを、細胞と共に提供されるプロトコルに従いコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。本出願人は迅速な形質転換のためＳｔｂｌ３を推奨する。簡潔に言えば、本出願人は、ステップ（ｖｉｉ）からの５ｕｌの産物を２０ｕｌの化学的にコンピテントな氷冷Ｓｔｂｌ３細胞に添加した。次にこれを氷上で１０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、直ちに氷上に２分間戻し、１００ｕｌのＳＯＣ培地を添加し、これを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにプレーティングして３７℃で一晩インキュベートする。

（ｉｘ）２日目：本出願人はコロニーの成長に関してプレートを調べた。典型的には、陰性対照プレート（ＢｂｓＩ消化ＰＸ３３０のみのライゲーション、アニーリングされたｓｇＲＮＡオリゴなし）にはコロニーはなく、ＰＸ３３０−ｓｇＲＮＡクローニングプレートには数十個ないし数百個のコロニーがある。

（ｘ）本出願人は各プレートから２〜３個のコロニーを取り、ｓｇＲＮＡが正しく挿入されていることを確かめた。本出願人は、滅菌ピペットチップを使用して単一のコロニーを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地の３ｍｌ培養液に接種した。３７℃で一晩インキュベートし、振盪する。

（ｘｉ）３日目：本出願人はＱｉＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキットを製造者の指示に従い使用して、一晩培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。

（ｘｉｉ）ＣＲＩＳＰＲプラスミドを配列検証する。本出願人はＵ６プロモーターからＵ６−Ｆｗｄプライマーを使用してシークエンシングすることにより各コロニーの配列を検証した。任意選択：以下のプライマー表に掲載するプライマーを使用してＣａｓ９遺伝子を配列決定する。

本出願人はシークエンシングの結果をＰＸ３３０クローニングベクター配列と照合し、Ｕ６プロモーターとｓｇＲＮＡ足場の残り部分との間に２０ｂｐガイド配列が挿入されたことを確かめた。ＧｅｎＢａｎｋベクターマップフォーマット（＊．ｇｂ ｆｉｌｅ）でのＰＸ３３０マップの詳細及び配列を、ウェブサイトｃｒｉｓｐｒ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇで見ることができる。

（任意選択）ｓｓＯＤＮ鋳型の設計・タイミング３日 事前計画
３｜ｓｓＯＤＮを設計及び注文する。センス又はアンチセンスのいずれかのｓｓＯＤＮを供給業者から直接購入することができる。本出願人は、両側に少なくとも４０ｂｐ及び最適なＨＤＲ効率のためには９０ｂｐの相同性アームを設計することを推奨する。本出願人の経験上、改変効率はアンチセンスオリゴの方がやや高い。

４｜本出願人はｓｓＯＤＮウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）を１０ｕＭの最終濃度となるように再懸濁して希釈した。センスｓｓＯＤＮとアンチセンス ｓｓＯＤＮとを組み合わせない、又はアニーリングしないこと。−２０℃で保存する。

５｜ＨＤＲ適用に関する注記として、本出願人はｓｇＲＮＡをＰＸ３３０プラスミドにクローニングすることを推奨する。

ｓｇＲＮＡの機能検証：細胞培養及びトランスフェクション・タイミング３〜４日
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は多くの哺乳類細胞株で使用されている。細胞株毎に条件が異なり得る。以下のプロトコルは、ＨＥＫ２３９ＦＴ細胞のトランスフェクション条件を詳説する。ｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲトランスフェクションに関する注記として、ｓｓＯＤＮの最適な送達のためＡｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットが使用される。これは次節に記載する。

７｜ＨＥＫ２９３ＦＴの維持。細胞は製造者の推奨に従い維持される。簡潔に言えば、本出願人は、Ｄ１０培地（１０％ウシ胎仔血清を補給したＧｌｕｔａＭａｘ ＤＭＥＭ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で細胞を培養した。

８｜継代のため、本出願人は培地を取り出し、細胞を押し退けないようＤＰＢＳを容器の側面に穏やかに加えることにより１回リンスした。本出願人はＴ７５フラスコに２ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。１０ｍｌの温Ｄ１０培地を添加して失活させ、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。本出願人は細胞を穏やかに粉砕することにより解離させ、必要に応じて新しいフラスコに播種し直した。本出願人は、典型的には２〜３日毎に１：４又は１：８の分割比で細胞を継代し、細胞を７０％を超えるコンフルエンシーに至らせることが絶対にないようにする。細胞株は継代数が１５に達したところで再出発する。

９｜トランスフェクション用細胞の調製。本出願人は、トランスフェクションの１６〜２４時間前に、十分に解離した細胞を２４ウェルプレートの抗生物質不含Ｄ１０培地にウェル当たり１．３×１０^５細胞の播種密度及び５００ｕｌの播種容積でプレーティングした。必要に応じて製造者のマニュアルに従いスケールアップ又はスケールダウンする。推奨される密度より多い細胞をプレーティングすることは、そうすることによってトランスフェクション効率が低下し得るため勧められない。

１０｜トランスフェクション当日、細胞は７０〜９０％コンフルエンシーで最適である。細胞は、リポフェクタミン２０００又はＡｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットで製造者のプロトコルに従いトランスフェクトし得る。

（Ａ）ＰＸ３３０にクローニングされるｓｇＲＮＡについては、本出願人は５００ｎｇの配列検証したＣＲＩＳＰＲプラスミドをトランスフェクトした；２つ以上のプラスミドをトランスフェクトする場合、等モル比及び合計５００ｎｇ以下で混合する。

（Ｂ）ＰＣＲによって増幅するｓｇＲＮＡについては、本出願人は以下を混合した。
ＰＸ１６５（Ｃａｓ９のみ） ２００ｎｇ
ｓｇＲＮＡアンプリコン（各） ４０ｎｇ
ｐＵＣ１９ 全ＤＮＡが５００ｎｇになるまで補充

本出願人は、信頼のおける定量化のため技術的トリプリケートでトランスフェクトすること及びトランスフェクション対照（例えばＧＦＰプラスミド）を入れてトランスフェクション効率をモニターすることを推奨する。加えて、下流機能アッセイの陰性対照としてＰＸ３３０クローニングプラスミド及び／又はｓｇＲＮＡアンプリコンを単独でトランスフェクトしてもよい。

１１｜本出願人はリポフェクタミン複合体を細胞に添加し、ここでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞はプレートから容易に剥がれ易く、トランスフェクション効率の低下がもたらされ得るため、穏やかに添加した。

１２｜本出願人は、蛍光顕微鏡を使用して対照（例えばＧＦＰ）トランスフェクションにおける蛍光細胞の割合を推定することにより、トランスフェクション後２４時間の細胞の効率を調べた。典型的には７０％を超える細胞がトランスフェクトされる。

１３｜本出願人は、培養培地にさらに５００ｕｌの温Ｄ１０培地を補給した。細胞が容易に剥がれ得るため、Ｄ１０はウェルの側面に極めてゆっくりと加え、低温の培地は使用しないこと。

１４｜細胞はトランスフェクション後合計４８〜７２時間インキュベートしてからインデル分析のため回収する。４８時間以降はインデル効率の著しい増加はない。

（任意選択）ＨＲ用のＣＲＩＳＰＲプラスミドとｓｓＯＤＮ又はターゲティングプラスミドとのコトランスフェクション・タイミング３〜４日
１５｜ターゲティングプラスミドを線状化する。ターゲティングベクターは、可能な場合には、相同性アームの一方の近傍又はいずれかの相同性アームの遠位端におけるベクター骨格中の制限部位で１回切断することにより線状化する。

１６｜本出願人は、少量の線状化プラスミドを切断されていないプラスミドと共に０．８〜１％アガロースゲル上で泳動させて、線状化の成功を確認した。線状化プラスミドはスーパーコイルプラスミドより上に泳動するはずである。

１７｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットで線状化プラスミドを精製した。

１８｜トランスフェクション用の細胞を調製する。本出願人はＴ７５又はＴ２２５フラスコでＨＥＫ２９３ＦＴを培養した。トランスフェクション当日までに十分な細胞数が計画される。Ａｍａｘａストリップキュベットフォーマットには、トランスフェクション当たり２×１０^６細胞が使用される。

１９｜トランスフェクション用のプレートを調製する。本出願人は１２ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの温Ｄ１０培地を添加した。プレートはインキュベーターに置かれ、培地が温かいまま保たれる。

２０｜ヌクレオフェクション。本出願人は、以下のステップに適合させて、Ａｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄキットの製造者の指示に従いＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。

ａ．ｓｓＯＤＮとＣＲＩＳＰＲとのコトランスフェクションについては、ＰＣＲチューブに以下のＤＮＡを予め混合する。
ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド（Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ） ５００ｎｇ
ｓｓＯＤＮ鋳型（１０ｕＭ） １ｕｌ

ｂ．ＨＤＲターゲティングプラスミドとＣＲＩＳＰＲとのコトランスフェクションについては、ＰＣＲチューブに以下のＤＮＡを予め混合する。
ＣＲＩＳＰＲプラスミド（Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ） ５００ｎｇ
直線化標的プラスミド ５００ｎｇ

トランスフェクション対照に関しては前節を参照されたい。加えて、本出願人は、陰性対照としてｓｓＯＤＮ又はターゲティングプラスミドを単独でトランスフェクトすることを推奨する。

２１｜単一細胞に解離する。本出願人は培地を取り出し、細胞を押し退けないよう注意しながらＤＰＢＳで１回穏やかにリンスした。２ｍｌのＴｒｙｐＬＥをＴ７５フラスコに添加し、３７℃で５分間インキュベートする。１０ｍｌの温Ｄ１０培地を添加して失活させ、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて穏やかに粉砕する。細胞は穏やかに粉砕して単一細胞に解離することが推奨される。大きい凝集塊はトランスフェクション効率を低下させ得る。本出願人は懸濁液から１０ｕｌアリコートを取り、カウントのため９０ｕｌのＤ１０培地に希釈した。本出願人は細胞をカウントし、トランスフェクションに必要な細胞数及び懸濁液の容積を計算した。本出願人は、典型的にはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを使用して条件当たり２×１０^５細胞をトランスフェクトしたと共に、後続のピペッティングステップでの容積損失を調整するため所要数より２０％多い細胞を計算することを推奨する。必要な容積を新しいＦａｌｃｏｎチューブに移す。

２３｜本出願人はこの新しいチューブを２００×ｇで５分間スピンダウンした。

本出願人は、ＳＦ溶液とＳ１サプリメントとをＡｍａｘａが推奨するとおり混合してトランスフェクション溶液を調製した。Ａｍａｘａストリップキュベットについては、トランスフェクション当たり合計２０ｕｌの補給ＳＦ溶液が必要である。同様に、本出願人は、所要量より２０％多い容積を計算することを推奨する。

２５｜本出願人は、ステップ２３のペレット化した細胞から培地を完全に取り除き、適切な容積（２×１０^５細胞当たり２０ｕｌ）のＳ１補給ＳＦ溶液に穏やかに再懸濁した。細胞をＳＦ溶液中に長時間置いたままにしないこと。

２６｜２０ｕｌの再懸濁した細胞をステップ２０の各ＤＮＡプレミックスにピペッティングする。穏やかにピペッティングして混合し、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップチャンバに移す。これをトランスフェクション条件毎に繰り返す。

Ａｍａｘａが推奨するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４ＤプログラムＣＭ−１３０を使用して細胞をエレクトロポレートする。

２８｜本出願人は、１００ｕｌの温Ｄ１０培地を各Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップチャンバに穏やかにかつゆっくりとピペッティングし、全容積をステップ１９の予め温めたプレートに移す。重要。この段階で細胞は極めて脆弱であり、苛酷なピペッティングは細胞死を引き起こし得る。２４時間インキュベートする。この時点で、陽性トランスフェクション対照における蛍光細胞の割合からトランスフェクション効率を推定することができる。ヌクレオフェクションは、典型的には７０〜８０％より高いトランスフェクション効率をもたらす。本出願人は、各ウェルに１ｍｌの温Ｄ１０培地を、細胞を押し退けないようにしてゆっくりと添加した。細胞を合計７２時間インキュベートする。

ヒト胚性幹細胞（ＨＵＥＳ ９）培養及びトランスフェクション・タイミング３〜４日
ｈＥＳＣ（ＨＵＥＳ９）株の維持。本出願人はＨＵＥＳ９細胞株をｍＴｅＳＲ１培地による無フィーダー条件に常法で維持する。本出願人は、基本培地と同梱の５×サプリメント及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎを添加することによりｍＴｅＳＲ１培地を調製した。本出願人は、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害薬をさらに補給したｍＴｅＳＲ１培地の１０ｍｌアリコートを調製した。組織培養プレートをコーティングする。冷ＧｅｌＴｒｅｘを冷ＤＭＥＭに１：１００希釈し、１００ｍｍ組織培養プレートの表面全体をコーティングする。

プレートをインキュベーターに３７℃で少なくとも３０分間置く。細胞のバイアルを１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて３７℃で解凍し、５ｍｌのｍＴｅＳＲ１培地を添加し、及び２００×ｇで５分間ペレット化する。ＧｅｌＴｒｅｘコーティングを吸い取り、Ｒｏｃｋ阻害薬を含有する１０ｍｌ ｍＴｅＳＲ１培地に約１×１０^６細胞を播種する。トランスフェクション後２４時間で通常のｍＴｅＳＲ１培地に交換し、毎日リフィードする。細胞を継代する。細胞に新鮮なｍＴｅＳＲ１培地を毎日リフィードし、７０％のコンフルエンシーに達するまで継代する。ｍＴｅＳＲ１培地を吸い取り、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄する。２ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅを添加して３７℃で３〜５分間インキュベートすることにより細胞を解離する。１０ｍｌ ｍＴｅＳＲ１培地を添加して細胞を剥がし、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移して穏やかに再懸濁する。ＧｅｌＴｒｅｘをコーティングしたプレートの１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害薬含有ｍＴｅＳＲ１培地に改めてプレーティングする。プレーティング後２４時間で通常のｍＴｅＳＲ１培地に交換する。

トランスフェクション。本出願人は、解凍後少なくとも１週間細胞を培養した後にＡｍａｘａ Ｐ３初代細胞４−Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクトすることを推奨する。対数期増殖細胞に新鮮培地を２時間リフィードした後トランスフェクトする。ａｃｃｕｔａｓｅで単一細胞又は１０細胞以下の小さいクラスターに解離し、穏やかに再懸濁する。ヌクレオフェクションに必要な細胞の数をカウントし、２００×ｇで５分間スピンダウンする。培地を完全に取り除き、推奨される容積のＳ１補給Ｐ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁する。１×Ｒｏｃｋ阻害薬の存在下で、コーティングされたプレートにエレクトロポレートした細胞を穏やかにプレーティングする。

トランスフェクションの成功を確かめ、通常のｍＴｅＳＲ１培地を毎日、ヌクレオフェクション後２４時間目から始めてリフィードする。典型的には、本出願人はＡｍａｘａヌクレオフェクションで７０％より高いトランスフェクション効率を観察する。ＤＮＡを回収する。トランスフェクション後４８〜７２時間でａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を解離し、５倍容積のｍＴｅＳＲ１を添加することにより失活させる。細胞を２００×ｇで５分間スピンダウンする。ペレット化した細胞はＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液によるＤＮＡ抽出用に直接処理することができる。細胞をａｃｃｕｔａｓｅを用いずに機械的に解離することは推奨されない。ａｃｃｕｔａｓｅを失活させずに又は推奨速度より高速で細胞をスピンダウンすることは推奨されない；それを行うと細胞の溶解が引き起こされ得る。

ＦＡＣＳによるクローン細胞株の単離。タイミング・２〜３時間ハンズオン；２〜３週間拡大
トランスフェクション後２４時間でＦＡＣＳによるか又は段階希釈によりクローン単離を実施し得る。

５４｜ＦＡＣＳ緩衝液を調製する。有色の蛍光を使用して選別する必要のない細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給した通常のＤ１０培地で選別し得る。有色の蛍光選別もまた必要である場合、フェノール不含ＤＭＥＭ又はＤＰＢＳが通常のＤＭＥＭに代用される。１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給し、０．２２ｕｍ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターでろ過する。

５５｜９６ウェルプレートを調製する。本出願人は、各ウェルにつき１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給した１００ｕｌのＤ１０培地を添加し、所望の数のクローンに必要なとおりのプレート数を調製した。

５６｜ＦＡＣＳ用の細胞を調製する。本出願人は培地を完全に吸い取り、２４ウェルプレートのウェル当たり１００ｕｌ ＴｒｙｐＬＥを添加することにより、細胞を解離した。５分間インキュベートし、４００ｕｌの温Ｄ１０培地を添加した。

５７｜再懸濁した細胞を１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、２０回穏やかに粉砕する。確実に単一細胞に解離したことを顕微鏡下で確かめることが推奨される。

５８｜細胞を２００×ｇで５分間スピンダウンする。

５９｜本出願人は培地を吸引し、細胞を２００ｕｌのＦＡＣＳ培地に再懸濁した。

６０｜細胞を３５ｕｍメッシュフィルターでろ過し、ラベルを付したＦＡＣＳチューブに入れる。本出願人は、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ細胞ストレーナーキャップ付き１２×７５ｍｍチューブを使用することを推奨する。選別時まで細胞を氷上に置く。

６１｜本出願人は単一細胞を、ステップ５５で調製した９６ウェルプレートに選別した。本出願人は、各プレート上の１つの単一の指定されたウェルに１００細胞を陽性対照として選別することを推奨する。

注。残りの細胞をとっておき、集団レベルでの遺伝子型同定に使用して全体的な改変効率を評価し得る。

６２｜本出願人は細胞をインキュベーターに戻して２〜３週間拡大させた。選別後５日で１００ｕｌの温Ｄ１０培地を添加する。必要に応じて３〜５日おきに１００ｕｌの培地を交換する。

６３｜選別後１週間でコロニーの「クローンのような」外観、即ち中心点から放射状に広がる丸いコロニーについて調べる。空のウェル、又はダブレット又はマルチプレットが播種された可能性のあるウェルに印を付ける。

６４｜細胞が６０％を上回ってコンフルエントになったとき、本出願人は、継代用に一組のレプリカ平板を調製した。レプリカ平板の各ウェルに１００ｕｌのＤ１０培地を添加する。本出願人は上下に激しく２０回ピペッティングすることにより細胞を直接解離した。調製したレプリカ平板に再懸濁容積の２０％をプレーティングしてクローン株を維持した。その後培地を２〜３日おきに交換し、それに従い継代する。

６５｜残りの８０％の細胞はＤＮＡ単離及び遺伝子型同定に使用する。

任意選択：希釈によるクローン細胞株の単離。タイミング・２〜３時間ハンズオン；２〜３週間拡大
６６｜本出願人は上記に記載したとおり２４ウェルプレートから細胞を解離した。確実に単一細胞に解離する。細胞ストレーナーを使用して細胞の凝集を防ぐことができる。

６７｜条件毎に細胞の数をカウントする。各条件を１００ｕｌ当たり０．５細胞の最終濃度となるようにＤ１０培地に段階稀釈する。各９６ウェルプレートについて、本出願人は、１２ｍｌのＤ１０中６０細胞の最終カウントとなるように希釈することを推奨する。適切なクローン希釈のため細胞数を正確にカウントすることが推奨される。正確を期すため細胞を段階希釈の中間段階で再度カウントしてもよい。

６８｜マルチチャンネルピペットを使用して１００ｕｌの希釈細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにピペッティングした。

注。残りの細胞をとっておき、集団レベルでの遺伝子型同定に使用して全体的な改変効率を評価し得る。

６９｜本出願人は、プレーティング後約１週間でコロニーの「クローンのような」外観、即ち中心点から放射状に広がる丸いコロニーについて調べた。ダブレット又はマルチプレットが播種された可能性のあるウェルに印を付ける。

７０｜本出願人は細胞をインキュベーターに戻して２〜３週間拡大させた。前節に詳説したとおり必要に応じて細胞にリフィードする。

ＣＲＩＳＰＲ切断効率のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。タイミング・５〜６時間
トランスフェクション細胞の切断効率をアッセイする前に、本出願人は、以下に記載するプロトコルを使用するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化のステップにより陰性（トランスフェクトされていない）対照サンプルでそれぞれの新規ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを試験することを推奨する。時折、シングルバンドのクリーンなＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲ産物であっても非特異的ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ切断バンドを生じ、正確なインデル分析を妨げる可能性がある。

７１｜ＤＮＡ用の細胞を回収する。細胞を解離し、２００×ｇで５分間スピンダウンする。注。トランスフェクション細胞株をとっておく必要に応じてこの段階でレプリカ平板を作製する。

７２｜上清を完全に吸引する。

７３｜本出願人はＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を製造者の指示に従い使用した。本出願人は典型的には２４ウェルプレートの各ウェルに５０ｕｌの溶液を使用し、及び９６ウェルプレートについては１０ｕｌを使用した。

７４｜本出願人は抽出ＤＮＡをｄｄＨ２Ｏで１００〜２００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるように標準化した。休題：抽出ＤＮＡは−２０℃で数ヶ月間保存しておくことができる。

７５｜ＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲをセットアップする。本出願人のオンライン／コンピュータアルゴリズムツールによって提供されるＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを使用して以下をマスターミックスする。

７６｜本出願人は、各反応について１００〜２００ｎｇのステップ７４からの標準化ゲノムＤＮＡ鋳型を添加した。

７７｜３０回以下の増幅サイクルに対し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

７８｜本出願人は２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認した。これらのＰＣＲ条件は多くのＳＵＲＶＥＹＯＲプライマー対で機能するように設計されているが、一部のプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ_２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要になり得る。

７９｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ反応物を精製し、溶離液を２０ｎｇ／ｕｌに標準化した。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

８０｜ＤＮＡヘテロ二重鎖形成。アニーリング反応を以下のとおりセットアップした。
Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液、１０Ｘ ２ｕｌ
基準化したＤＮＡ（２０ｎｇ／ｕｌ） １８ｕｌ
総容積 ２０ｕｌ

８１｜以下の条件を用いて反応物をアニーリングする。

８２｜ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼＳ消化。本出願人はマスターミックスを調製し、氷上で以下の構成成分を添加して、２５ｕｌの総最終容積についてステップ８１のヘテロ二本鎖をアニーリングした。

８３｜十分にボルテックスし、スピンダウンする。反応物を４２℃で１時間インキュベートする。

８４｜任意選択：ＳＵＲＶＥＹＯＲキットの停止液２ｕｌを添加してもよい。休題。消化産物は、後の分析のため−２０℃で保存しておくことができる。

８５｜ＳＵＲＶＥＹＯＲ反応を可視化する。２％アガロースゲル上でＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化産物を可視化し得る。分解能を良くするため、産物を４〜２０％勾配ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上で泳動させてもよい。本出願人は推奨されるローディング緩衝液で１０ｕｌの産物をロードし、製造者の指示に従いゲルを泳動させた。典型的には、本出願人はブロモフェノールブルー色素が移動してゲルの底に達するまで泳動させる。同じゲル上にＤＮＡラダー及び陰性対照を含める。

８６｜本出願人は、ＴＢＥ中に希釈した１×ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素でゲルを染色した。ゲルを１５分間穏やかに揺り動かした。

８７｜本出願人は、バンドを過度に露光することなく定量的イメージングシステムを使用してゲルをイメージングした。陰性対照は、ＰＣＲ産物のサイズに対応する１つのバンドのみを有するはずであるが、時折、他のサイズの非特異的な切断バンドを有し得る。これらは、標的の切断バンドとサイズが異なる場合には分析を妨げない。本出願人のオンライン／コンピュータアルゴリズムツールによって提供される標的切断バンドのサイズの合計は、ＰＣＲ産物のサイズと等しいはずである。

８８｜切断強度を推定する。本出願人はＩｍａｇｅＪ又は他のゲル定量化ソフトウェアを使用して各バンドの面積強度を定量化した。

８９｜各レーンについて、本出願人は、以下の式を使用して切断されたＰＣＲ産物の割合（ｆ_ｃｕｔ）を計算した：ｆ_ｃｕｔ＝（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）（式中、ａは消化されなかったＰＣＲ産物の面積強度であり、ｂ及びｃは各切断産物の面積強度である）。９０｜切断効率は、二重鎖形成の二項確率分布に基づき、以下の式を使用して推定し得る。９１｜

ＣＲＩＳＰＲ切断効率を評価するためのＳａｎｇｅｒシークエンシング。タイミング・３日
最初のステップは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのステップ７１〜７９と同じである。注：フォワード及びリバースプライマーに適切な制限部位が付加される場合、ＳａｎｇｅｒシークエンシングにＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを用い得る。推奨されるｐＵＣ１９骨格へのクローニングに関しては、ＦｗｄプライマーにＥｃｏＲＩ及びＲｅｖプライマーにＨｉｎｄＩＩＩを用い得る。

９２｜アンプリコン消化。消化反応を以下のとおりセットアップする。

９３｜ｐＵＣ１９骨格消化。消化反応を以下のとおりセットアップする。

９４｜本出願人は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して消化反応物を精製した。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

９５｜本出願人は、消化したｐＵＣ１９骨格及びＳａｎｇｅｒアンプリコンを１：３のベクター：インサート比で以下のとおりライゲートした。

９６｜形質転換。本出願人は、細胞と共に供給されるプロトコルに従いＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理したプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。本出願人は迅速な形質転換のためＳｔｂｌ３を推奨する。簡潔に言えば、５ｕｌのステップ９５の産物を２０ｕｌの氷冷化学コンピテントＳｔｂｌ３細胞に添加し、氷上で１０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、直ちに氷に２分間戻し、１００ｕｌのＳＯＣ培地を添加し、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにプレーティングする。これを３７℃で一晩インキュベートする。

９７｜２日目：本出願人はプレートのコロニー成長を調べた。典型的には、陰性対照プレート（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵＣ１９のみのライゲーション、Ｓａｎｇｅｒアンプリコンインサート無し）にはコロニーがなく、ｐＵＣ１９−Ｓａｎｇｅｒアンプリコンクローニングプレートには数十個ないし数百個のコロニーがある。

９８｜３日目：本出願人は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキットを製造者の指示に従い使用して、一晩培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。

９９｜Ｓａｎｇｅｒシークエンシング。本出願人は、ｐＵＣ１９骨格からｐＵＣ１９−フォワードプライマーを使用してシークエンシングすることにより各コロニーの配列を確かめた。本出願人はシークエンシング結果を予想ゲノムＤＮＡ配列と照合し、Ｃａｓ９誘発性のＮＨＥＪ突然変異の存在を調べた。％編集効率＝（改変クローン数）／（総クローン数）。正確な改変効率を得るには、妥当な数のクローン（＞２４）を選ぶことが重要である。

微小欠失のための遺伝子型同定。タイミング・２〜３日ハンズオン；２〜３週間拡大
１００｜上記に記載したとおり、欠失させる領域を標的にするｓｇＲＮＡのペアを細胞にトランスフェクトした。

１０１｜トランスフェクション後２４時間で、クローン株を上記に記載したとおりＦＡＣＳ又は段階希釈によって単離する。

１０２｜細胞を２〜３週間拡大させる。

１０３｜本出願人は上記に記載したとおり１０ｕｌ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用してクローン株からＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを５０〜１００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるようにｄｄＨ２Ｏで標準化した。

１０４｜改変領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

注：欠失サイズが１ｋｂより大きい場合、Ｉｎ−Ｆｗｄプライマー及びＩｎ−Ｒｅｖプライマーを含む並行する一組のＰＣＲ反応をセットアップし、野生型アレルの存在についてスクリーニングする。

１０５｜逆位についてスクリーニングするため、ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

注：プライマーは、Ｏｕｔ−Ｆｗｄ＋Ｉｎ Ｆｗｄ、又はＯｕｔ−Ｒｅｖ＋Ｉｎ−Ｒｅｖのいずれかとしてペアにされる。

１０６｜本出願人は、各反応について１００〜２００ｎｇのステップ１０３の標準化ゲノムＤＮＡ鋳型を添加した。

１０７｜以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

１０８｜本出願人は２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１〜２％ゲル上で泳動させて産物を確認した。これらのＰＣＲ条件は多くのプライマーで機能するように設計されるが、一部のプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ_２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

ＨＤＲによる標的改変のための遺伝子型同定。タイミング・２〜３日、２〜３時間ハンズオン
１０９｜本出願人は上記に記載したとおりＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用してＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを１００〜２００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるようにＴＥで標準化した。

１１０｜改変領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

１１１｜本出願人は各反応について１００〜２００ｎｇのステップ１０９のゲノムＤＮＡ鋳型を添加し、以下のプログラムを実行した。

１１２｜本出願人は５ｕｌのＰＣＲ産物を０．８〜１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認した。プライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

１１３｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ反応物を精製した。

１１４｜ＨＤＲの例では、ＥＭＸ１遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が挿入される。これらの制限部位はＰＣＲアンプリコンの制限酵素消化により検出される。

ｉ．ＤＮＡを３７℃で１０分間消化する：
ｉｉ．本出願人は、ローディング色素を含む１０ｕｌの消化産物を、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上でキシレンシアノールバンドが移動してゲルの底に達するまで泳動させた。
ｉｉｉ．本出願人は１５分間揺り動かしながら１×ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素でゲルを染色した。
ｉｖ．上記でＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの節に記載したとおり切断産物をイメージングして定量化する。ＨＤＲ効率は以下の式により推定される：（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）（式中、ａは消化されなかったＨＤＲ ＰＣＲ産物の面積強度であり、ｂ及びｃはＨｉｎｄＩＩＩ切断断片の面積強度である）。

１１５｜或いは、ステップ１１３の精製ＰＣＲアンプリコンをクローニングし、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング又はＮＧＳを用いて遺伝子型を決定してもよい。

ディープシークエンシング及びオフターゲット分析・タイミング１〜２日
オンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツールは、同定された標的部位のそれぞれについて候補ゲノムオフターゲット部位を作成する。これらの部位でのオフターゲット分析は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、又は次世代ディープシークエンシングにより実施することができる。これらの部位の多くで改変率が低い又は検出不能である可能性を考えると、本出願人は、高感度及び高精度のためのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑプラットフォームによるディープシークエンシングを推奨する。プロトコルはシークエンシングプラットフォームによって異なり得る；ここで本出願人は、シークエンシングアダプターをつなぎ合わせるための融合ＰＣＲ方法について簡単に記載する。

１１６｜ディープシークエンシングプライマーを設計する。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プライマーは、典型的には１００〜２００ｂｐサイズ範囲の、より短いアンプリコン向けに設計される。プライマーはＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔを使用して手動で設計されてもよく、又はオンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツール（ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓにあるウェブサイト）で生成されてもよい。

１１７｜Ｃａｓ９標的細胞からゲノムＤＮＡを回収する。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔゲノムＤＮＡをｄｄＨ２Ｏで１００〜２００ｎｇ／ｕｌに標準化する。

１１８｜初期ライブラリ調製ＰＣＲ。ステップ１１６のＮＧＳプライマーを使用して初期ライブラリ調製ＰＣＲを調製する。

１１９｜各反応につき１００〜２００ｎｇの標準化したゲノムＤＮＡ鋳型を加える。

１２０｜２０回以下の増幅サイクルについて、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施する。

１２１｜２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認する。あらゆるゲノムＤＮＡ ＰＣＲと同様に、ＮＧＳプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ_２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

１２２｜ＰＣＲ反応物をＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、溶離液を２０ｎｇ／ｕｌに標準化する。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

１２３｜Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡサンプル調製キット。製造者のプロトコルに従い、各サンプルに対するユニークバーコードでＭｉｓｅｑシークエンシング準備ライブラリを作成する。

１２４｜シークエンシングデータを分析する。ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、又は単純な配列解析スクリプトなどのリードアラインメントプログラムにより、オフターゲット分析を実施し得る。

タイミング
ステップ１〜２ ｓｇＲＮＡオリゴ及びｓｓＯＤＮの設計及び合成：１〜５日、供給業者によって変動
ステップ３〜５ ＣＲＩＳＰＲプラスミド又はＰＣＲ発現カセットの構築：２時間〜３日
ステップ６〜５３ 細胞株へのトランスフェクション：３日（１時間のハンズオン時間）
ステップ５４〜７０ 任意選択のクローン株誘導：１〜３週間、細胞型によって変動
ステップ７１〜９１ ＳＵＲＶＥＹＯＲによるＮＨＥＪの機能検証：５〜６時間
ステップ９２〜１２４ Ｓａｎｇｅｒ法又は次世代ディープシークエンシングによる遺伝子型同定：２〜３日（３〜４時間のハンズオン時間）

考察
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは容易に多重化し得るため、いくつかの遺伝子の同時改変が促進され、かつ高効率で染色体微小欠失が媒介される。本出願人は２つのｓｇＲＮＡを使用することにより、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において最大６８％の効率でのヒトＧＲＩＮ２Ｂ及びＤＹＲＫ１Ａ遺伝子座の同時標的化を実証した。同様に、ｓｇＲＮＡのペアを使用することによりエクソンの切り出しなどの微小欠失を媒介することができ、これはクローンレベルでＰＣＲにより遺伝子型が同定され得る。エクソン接合部の正確な位置は異なり得ることに留意されたい。本出願人はまた、ｓｓＯＤＮ及びターゲティングベクターを使用したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞及びＨＵＥＳ９細胞におけるＣａｓ９の野生型及びニッカーゼ突然変異体の両方によるＨＤＲの媒介も実証した（図３０）。本出願人はＣａｓ９ニッカーゼを使用したＨＵＥＳ９細胞でのＨＤＲを検出できていないことに留意されたく、これはＨＵＥＳ９細胞における修復活性の低い効率又は潜在的な違いに起因し得る。これらの値は典型的であるが、所与のｓｇＲＮＡの切断効率にはいくらかのばらつきがあり、まれにある種のｓｇＲＮＡは、未だ解明されていない理由により機能しないこともある。本出願人は、各遺伝子座につき２つのｓｇＲＮＡを設計し、かつ意図される細胞型におけるそれらの効率を試験することを推奨する。

実施例２４：ＮＬＳ
Ｃａｓ９転写修飾因子：本出願人は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ系を、ＤＮＡ切断の域を越える機能が遂行され得る一般的なＤＮＡ結合システムに転換しようと試みた。例えば、１つ又は複数の機能ドメインを触媒的に不活性なＣａｓ９と融合することにより、本出願人は新規機能、例えば転写活性化／抑制、メチル化／脱メチル化、又はクロマチン改変を付与している。この目標を達成するため、本出願人は、ヌクレアーゼ活性に必須の２つの残基Ｄ１０及びＨ８４０をアラニンに変えることにより、触媒的に不活性なＣａｓ９突然変異体を作製した。これらの２つの残基を突然変異させることにより、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を消失させ、一方で標的ＤＮＡとの結合能は維持する。本出願人が自らの仮説を検証するため着目することに決めた機能ドメインは、転写活性化因子ＶＰ６４並びに転写リプレッサーＳＩＤ及びＫＲＡＢである。

Ｃａｓ９核局在：本出願人は、最も有効なＣａｓ９転写修飾因子が、転写に対してその最も大きい影響を及ぼし得るところである核に強力に局在し得るという仮説を立てた。さらに、細胞質内に残る任意のＣａｓ９が望ましくない効果を有する可能性がある。本出願人は、野生型Ｃａｓ９が核に局在せず、複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まないことを決定した（ＣＲＩＳＰＲ系が１つ以上のＮＬＳを有する必要はないが、有利には少なくとも１つ以上のＮＬＳを有する）。複数のＮＬＳ配列が必要であったため、Ｃａｓ９を核に入れるのが困難であることは妥当であったと共に、Ｃａｓ９と融合する任意のさらなるドメインが核局在を破壊する可能性があった。従って、本出願人は、異なるＮＬＳ配列（ｐＸＲＰ０２−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＥＧＦＰ、ｐＸＲＰ０４−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ、ｐＸＲＰ０６−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ＥＧＦＰ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ、ｐＸＲＰ０８−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ）を有する４つのＣａｓ９−ＶＰ６４−ＧＦＰ融合構築物を作製した。これらの構築物をヒトＥＦ１ａプロモーターの発現下にあるレンチ骨格にクローニングした。よりロバストなタンパク質発現のため、ＷＰＲＥエレメントもまた加えた。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間でイメージングした。融合タンパク質が融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方にＮＬＳ配列を有するとき、最良の核局在が得られる。観察された最も高い核局在は、４つのＮＬＳエレメントを有する構築物で起こった。

Ｃａｓ９に対するＮＬＳエレメントの影響をさらに確実に理解するため、本出願人は同じαインポーチンＮＬＳ配列を、０〜３個のタンデムリピートを見てＮ末端又はＣ末端のいずれかに付加することにより、１６個のＣａｓ９−ＧＦＰ融合物を作製した。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間でイメージングした。顕著なことに、ＮＬＳエレメントの数は核局在の程度と直接相関しない。Ｃ末端にＮＬＳを付加する方が、Ｎ末端への付加と比べて核局在により大きい影響を及ぼす。

Ｃａｓ９転写活性化因子：本出願人は、Ｓｏｘ２遺伝子座を標的にしてＲＴ−ｑＰＣＲで転写活性化を定量化することにより、Ｃａｓ９−ＶＰ６４タンパク質の機能試験を行った。Ｓｏｘ２のプロモーターに跨るように８個のＤＮＡ標的部位を選択した。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間で細胞から全ＲＮＡを抽出した。１ｕｇのＲＮＡを４０ｕｌ反応物でｃＤＮＡに逆転写した（ｑＳｃｒｉｐｔ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）。単一の２０ｕｌ ＴａｑＭａｎアッセイｑＰＣＲ反応に２ｕｌの反応産物を加えた。各実験は生物学的及び技術的トリプリケートで実施した。ＲＴ対照反応及び鋳型対照反応はいずれも増幅を示さなかった。強力な核局在を示さない構築物ｐＸＲＰ０２及びｐＸＲＰ０４は、活性化が起こらない。実に強力な核局在を示した構築物、ｐＸＲＰ０８については、中程度の活性化が観察された。ガイドＲＮＡＳｏｘ２．４及びＳｏｘ２．５の場合に統計的に有意な活性化が観察された。

実施例２５：Ｉｎ Ｖｉｖｏマウスデータ
材料及び試薬
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
１０× ＮＥ緩衝液 ４（ＮＥＢ、カタログ番号Ｂ７００４Ｓ）
ＢｓａＩ ＨＦ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３５３５Ｓ）
Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液、１０×（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｂ６４）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ０５９４）
ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＦ０６５１）
リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８−０１９）
トリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５４０００５４）
鉗子＃４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ１６８７７７−１ＥＡ）
鉗子＃５（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ６５２１−１ＥＡ）
１０× ハンクス平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４６４１−５００ＭＬ）
ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｐ４３３３）
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１１０３０４９）
Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７５０４０４４）
Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５０３００８１）
グルタミン酸塩（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＲＥＳ５０６３Ｇ−Ａ７）
β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０−１００ＭＬ）
ＨＡウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３７２４Ｓ）
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞イメージングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｒ３７６０１）
３０Ｇ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号ＮＡＮＯＦＩＬ）
定位固定装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ３（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号ＵＭＰ３−４）
スクロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７９０３）
塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ１０１６）
酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ０６３１）
トリス−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ５９４１）
ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ６７５８）
ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＮＰ４０）
フェニルメタンスルホニルフルオリド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７８８３０）
塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８２６６）
塩化カリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ９３３３）
β−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９４２２）
グリセロール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９０１２）
Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ４９４２）
ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｌｕ−ａｃｔ−細胞選別機（Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、米国）
ＤＮＡｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９５０４）

手順
ｉｎ ｖｉｖｏで脳において使用されるｇＲＮＡ多重体の構築
本出願人は、マウスＴＥＴ及びＤＮＭＴファミリーメンバーを標的にする単一のｇＲＮＡを設計し、ＰＣＲ増幅した（本明細書に記載されるとおり）。標的化効率をＮ２ａ細胞株で評価した（図３３）。ｉｎ ｖｉｖｏでいくつかの遺伝子の同時改変を達成するため、効率的なｇＲＮＡをＡＡＶパッケージングベクターに多重化した（図３４）。系の効率のさらなる分析を促進するため、本出願人は、ヒトシナプシンＩプロモーターの制御下にあるＧＦＰ−ＫＡＳＨドメイン融合タンパク質からなる発現カセットを系に加えた（図３４）。この改変により、ニューロン集団における系の効率のさらなる分析が可能になる（さらに詳細な手順は「核の選別及びｉｎ ｖｉｖｏ結果」の節にある）。

系の４つ全ての部分を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼを使用し、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、標的ゲノム配列の逆相補体である）

本出願人は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ戦略を用いて単一ステップ反応で系の全てのパーツを組み立てた（１：１分子比）。

Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応産物を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ及び以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。

ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ制限部位を使用してＡＡＶ骨格のＩＴＲ配列間にクローニングした。
ＰＣＲ産物消化：

ＡＡＶ骨格消化：

３７℃で２０分間インキュベートした後、ＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してサンプルを精製した。標準化したサンプルを１：３のベクター：インサート比で以下のとおりライゲートした。

細菌をライゲーション反応産物で形質転換した後、本出願人は、得られたクローンをＳａｎｇｅｒシークエンシングで確認した。

Ｃａｓ９構築物とのコトランスフェクション後に陽性ＤＮＡクローンをＮ２ａ細胞で試験した（図３５及び図３６）。

ＡＡＶ送達のための新しいＣａｓ９構築物の設計
ＡＡＶ送達系は、そのユニークな特徴にも関わらず、パッキングに限界がある−ｉｎ ｖｉｖｏでの発現カセットの送達を成功させるには、４．７ｋｂ未満のサイズでなければならない。ＳｐＣａｓ９発現カセットのサイズを小さくして送達を促進するため、本出願人はいくつかの変更を試験した：異なるプロモーター、より短いポリＡシグナル及び最後により小さいバージョンの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（図３７及び図３８）。試験した全てのプロモーターが、マウスＭｅｃｐ２（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ラットＭａｐ１ｂ及びトランケート型ラットＭａｐ１ｂ（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，１９９６）を含め、以前試験され、ニューロンにおいて活性であることが発表されたものである。代替的な合成ポリＡ配列は、同様に機能性であることが以前示されたものである（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。クローニングした全ての構築物を、リポフェクタミン２０００によるトランスフェクション後にＮ２ａ細胞で発現させ、ウエスタンブロッティング法で試験した（図３９）。

初代ニューロンでＡＡＶ多重系の試験
開発した系のニューロンにおける機能性を確認するため、本出願人はｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ニューロン培養物を使用する。Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｇｏｓｌｉｎ（Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｇｏｓｌｉｎ，１９８８）により既発表のプロトコルに従いマウス皮質ニューロンを調製した。

神経細胞は１６日目の胚から得られる。安楽死させた妊娠中の雌から胚を摘出し、断頭し、頭部を氷冷ＨＢＳＳに置く。次に頭蓋から鉗子（＃４及び＃５）で脳を摘出し、別の交換した氷冷ＨＢＳＳに移す。氷冷ＨＢＳＳで満たしたペトリ皿において実体顕微鏡及び＃５鉗子の助けを借りてさらなるステップを実施する。半球を互いに分離し、脳幹から髄膜を取り除く。次に海馬を極めて慎重に解剖し、氷冷ＨＢＳＳで満たした１５ｍｌの円錐管に入れる。海馬解剖後に残る皮質を、脳幹の残りの部分及び嗅球を取り除いた後に類似のプロトコルを用いたさらなる細胞単離に使用することができる。単離された海馬は１０ｍｌ氷冷ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳ中トリプシン（海馬当たり１０μｌ ２．５％トリプシンを添加した４ｍｌ ＨＢＳＳ）と共に３７℃で１５分間インキュベートして解離する。トリプシン処理後、海馬を３７℃に予熱したＨＢＳＳで３回極めて慎重に洗浄して痕跡量のトリプシンを取り除き、温ＨＢＳＳ中に解離する。本出願人は、通常、１ｍｌ ＨＢＳＳ中の１０〜１２個の胚から１ｍｌピペットチップを使用して細胞を解離し、解離した細胞を４ｍｌに至るまで希釈する。細胞を２５０細胞／ｍｍ２の密度でプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で最長３週間培養する。

ＨＢＳＳ
４３５ｍｌ Ｈ２Ｏ
５０ｍｌ １０×ハンクス平衡塩類溶液
１６．５ｍｌ ０．３Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３
５ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
ろ過（０．２μｍ）及び保存４℃
ニューロンプレーティング培地（１００ｍｌ）
９７ｍｌ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ
２ｍｌ Ｂ２７サプリメント
１ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
２５０μｌ グルタミン
１２５μｌ グルタミン酸

ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のろ過培地からの濃縮ＡＡＶ１／２ウイルス又はＡＡＶ１ウイルスを、培養下で４〜７日間ニューロンに形質導入し、送達された遺伝子を発現させるため形質導入後少なくとも１週間培養下に保つ。

系のＡＡＶ駆動発現
本出願人は、ＡＡＶ送達後のニューロン培養物におけるＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９の発現を、ウエスタンブロット法を用いて確認した（図４２）。形質導入後１週間でニューロンをβ−メルカプトエタノール含有ＮｕＰａｇｅ ＳＤＳローディング緩衝液に回収し、タンパク質を９５℃で５分間変性させた。サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＷＢタンパク質検出用のＰＶＤＦ膜に移した。ＨＡ抗体でＣａｓ９タンパク質を検出した。

ｇＲＮＡ多重ＡＡＶからのＳｙｎ−ＧＦＰ−ｋａｓｈの発現が蛍光顕微鏡法で確認された（図５０）。

毒性
ＣＲＩＳＰＲ系を含むＡＡＶの毒性を評価するため、本出願人はウイルス形質導入後１週間のニューロンの全体的な形態を調べた（図４５）。加えて、本出願人は、設計した系の潜在的毒性を、培養下の生細胞と死細胞との区別を可能にするＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞イメージングキットで調べた。これは、細胞内エステラーゼ活性の存在（非蛍光カルセインＡＭから強度に緑色の蛍光カルセインへの酵素変換により決定されるとおりの）に基づく。他方で、キットの赤色の細胞不透過性構成成分は、破損した膜を有する細胞に限り侵入し、ＤＮＡに結合して死細胞で蛍光を生じる。両方のフルオロフォアとも、生細胞では蛍光顕微鏡法で容易に可視化され得る。初代皮質ニューロンにおけるＣａｓ９タンパク質及び多重ｇＲＮＡ構築物のＡＡＶ駆動発現は十分な忍容性を有し、非毒性であった（図４３及び図４４）ことから、設計されたＡＡＶ系がｉｎ ｖｉｖｏ試験に好適であることを示している。

ウイルス産生
ＭｃＣｌｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１に記載される方法により濃縮ウイルスを作製した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において上清ウイルス産生が生じた。

脳手術
ウイルスベクター注入のため、１０〜１５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスをケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン用量及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン用量）で腹腔内注射により麻酔した。先制鎮痛薬（１ｍｇ／ｋｇ）としてブプレネックス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）の腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉａｌ）投与を使用した。動物を、耳内位置決めスタッド及びトゥースバーを使用してＫｏｐｆ定位固定装置に固定化し、固定された頭蓋を維持した。ハンドヘルドドリルを使用して、ブレグマの−３．０ｍｍ後方及び３．５ｍｍ側方に、海馬のＣＡ１野における注入用の穴（１〜２ｍｍ）を開けた。３０Ｇ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔシリンジを２．５ｍｍの深さで使用して、総容積１ｕｌのＡＡＶウイルス粒子の溶液を注入した。注入は「Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ３」注入ポンプにより０．５ｕｌ／分の流量でモニターして組織損傷を防いだ。注入が完了した時点で注射針をゆっくりと、０．５ｍｍ／分の速度で取り出す。注入後、６−０ Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合糸で皮膚を閉じた。動物を術後に１ｍＬの乳酸リンゲル液（皮下）で水分補給させ、歩行可能な回復に達するまで温度制御された（３７℃）環境に収容した。術後３週間で深麻酔により動物を安楽死させ、続いて核選別のため組織を摘出するか、又は免疫化学のため４％パラホルムアルデヒドを灌流させた。

核の選別及びｉｎ ｖｉｖｏ結果
本出願人は、標識した細胞核の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及び核タンパク質の下流処理のためｇＲＮＡ標的神経細胞核をＧＦＰで特異的に遺伝的にタグ標識する方法を設計した。そのために、本出願人の多重ターゲティングベクターが、ＧＦＰとマウス核膜タンパク質ドメインＫＡＳＨ（Ｓｔａｒｒ ＤＡ，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｙ）との間の融合タンパク質及び目的の特異的遺伝子座を標的にする３つのｇＲＮＡの両方を発現するように設計された（図３４）。ＧＦＰ−ＫＡＳＨはヒトシナプシンプロモーターの制御下で発現してニューロンを特異的に標識した。融合タンパク質ＧＦＰ−ＫＡＳＨのアミノ酸は以下であった。

脳へのＡＡＶ１／２媒介性送達後１週間でＧＦＰ−ＫＡＳＨのロバストな発現が観察された。標識された核のＦＡＣＳ及び下流処理のため、術後３週間で海馬を解剖し、勾配遠心ステップを用いて細胞核精製用に処理した。そのために、３２０ｍＭ スクロース、５ｍＭ ＣａＣｌ、３ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ４０、０．１ｍＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール中で２ｍｌ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ）を使用して組織をホモジナイズした。ホモジナイズ処理物を、２５％〜２９％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）勾配で製造者のプロトコルに従い３０分間３．５００ｒｐｍ、４℃で遠心した。核ペレットを、３４０ｍＭ スクロース、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、６５ｍＭ グリセロリン酸、５％グリセロール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール中に再懸濁し、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して細胞核を標識した（ＤＮＡに近赤外放射を提供する）。標識し精製した核を、Ａｒｉａ Ｆｌｕ−ａｃｔ細胞選別機及びＢＤＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳにより選別した。選別されたＧＦＰ＋核及びＧＦＰ−核を最終的に使用することにより、標的ゲノム領域のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析のためＤＮＡｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを精製した。同じ手法を、下流処理のための標的細胞からの核ＲＮＡ又はタンパク質の精製に容易に用いることができる。本出願人がこの手法で用いているのが２ベクター系（図３４）であることに起因して、脳のごく一部の細胞（多重ターゲティングベクター及びＣａｓ９コードベクターの両方を同時感染させた細胞）においてのみ効率的なＣａｓ９媒介性ＤＮＡ切断が起こることが予想された。ここに記載する方法は、本出願人が目的の３つのｇＲＮＡを発現する細胞集団からＤＮＡ、ＲＮＡ及び核タンパク質を特異的に精製することを可能にし、従ってＣａｓ９媒介性ＤＮＡ切断を起こすはずである。この方法を用いることにより、本出願人は、ごく一部の細胞においてのみ起こるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なＤＮＡ切断を可視化することができた。

本質的に、本出願人がここで示したものは、標的ｉｎ ｖｉｖｏ切断である。さらに本出願人は多重的手法を使用し、ここではいくつかの異なる配列が同時に、但し独立してターゲティングされる。提供される系は、脳の病的状態（遺伝子ノックアウト、例えばパーキンソン病）の研究に応用することができ、また脳におけるゲノム編集ツールのさらなる開発分野も切り開くことができる。ヌクレアーゼ活性を遺伝子転写制御因子又は後成的制御因子に置き換えることにより、病的状態のみならず、学習及び記憶形成のような生理学的過程における遺伝子調節及び脳の後成的変化の役割に関するあらゆる種類の科学的問題に答えることが可能になる。最後に、提供される技術は、霊長類のようなより複雑な哺乳類系において応用することができ、これにより現在の技術の限界を乗り越えることが可能となる。

実施例２６：ＡＡＶ産生系又はプロトコル
本明細書には、ハイスループットスクリーニング用途のために開発された、かつそれで特に上手く機能するＡＡＶ産生系又はプロトコルが提供され、しかしながらこれは、本発明においても同様により広い適用性を有する。内因性遺伝子発現の操作は、発現速度が、調節エレメント、ｍＲＮＡプロセシング、及び転写物の安定性を含めた多くの要因に依存するため、種々の難題を突きつける。この難題を解消するため、本出願人は、送達用のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターを開発した。ＡＡＶはｓｓＤＮＡベースのゲノムを有し、従って組換えを起こしにくい。

ＡＡＶ１／２（血清型ＡＡＶ１／２、すなわち、ハイブリッド又はモザイクＡＡＶ１／ＡＡ Ｖ２カプシドＡＡＶ）ヘパリン精製濃縮ウイルスプロトコル
培地：Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ
５００ｍｌボトルＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）
５０ｍｌ Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ（加熱不活性化）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）
５．５ｍｌ ＨＥＰＥＳ溶液（１Ｍ、ＧＩＢＣＯ）
細胞：低継代ＨＥＫ２９３ＦＴ（ウイルス産生時の継代数＜１０、ウイルス産生のために継代数２〜４の新しい細胞を解凍し、３〜５代成長させる）
トランスフェクション試薬：ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「Ｍａｘ」
５０ｍｌの滅菌超高純度Ｈ２０中に５０ｍｇのＰＥＩ「Ｍａｘ」を溶解させる
ｐＨを７．１に調整する
０．２２ｕｍのフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを−２０℃で凍結する（貯蔵のため、直ちに使用することもできる）。

細胞培養
Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ中で低継代ＨＥＫ２９３ＦＴを培養する
毎日１：２〜１：２．５で継代する
有利には細胞を８５％よりも高い集密度に至らせない。

Ｔ７５について
−フラスコ当たり１０ｍｌのＨＢＳＳ（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋、ＧＩＢＣＯ）＋１ｍｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ）を３７℃に温める（ウォーターバス）
培地を完全に吸引する
−１０ｍｌの温ＨＢＳＳを穏やかに添加する（培地を完全に洗い流すため）
−フラスコ当たり１ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加する
−フラスコをインキュベーター（３７℃）に１分間置く
−フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
−９ｍｌのＤ１０＋ＨＥＰＥＳ培地（３７℃）を添加する
−上下に５回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
−１：２〜１：２．５（Ｔ７５には１２ｍｌの培地）の比で分割する（細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない）
−十分な（大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの）細胞が存在するようになったら直ちにＴ２２５に移す。

ＡＡＶ産生（構築物当たり５＊１５ｃｍディッシュスケール）：
１０００万細胞を１５ｃｍディッシュ中２１．５ｍｌ培地にプレーティングする
３７℃で１８〜２２時間インキュベートする
８０％コンフルエンスでのトランスフェクションが理想的である。

プレート当たり
２２ｍｌ培地（Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ）を予熱する。

ＤＮＡ混合物を含むチューブを調製する（ｅｎｄｏｆｒｅｅ ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡを使用）：
５．２ｕｇの目的のベクターのプラスミド
４．３５ｕｇのＡＡＶ血清型１プラスミド
４．３５ｕｇのＡＡＶ血清型２プラスミド
１０．４ｕｇのｐＤＦ６プラスミド（アデノウイルスヘルパー遺伝子） ボルテックスして混合する
４３４ｕＬのＤＭＥＭを添加する（無血清！）
１３０ｕｌのＰＥＩ溶液を添加する
５〜１０秒間ボルテックスする
ＤＮＡ／ＤＭＥＭ／ＰＥＩ混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
１５ｃｍディッシュ中の培地をＤＮＡ／ＤＭＥＭ／ＰＥＩ混合物に交換する
３７℃インキュベーターに戻す
４８時間インキュベートした後回収する（培地が過度に酸性にならないようにすること）。

ウイルス回収：
１．１５ｃｍディッシュから培地を慎重に吸引する（有利には細胞を押し退けない）
２．各プレートに２５ｍｌのＲＴ ＤＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、細胞スクレーパーで細胞を穏やかに剥がし取る。５０ｍｌチューブに懸濁液を収集する。
３．８００×ｇで１０分間細胞をペレット化する
４．上清を廃棄する
休題：必要に応じて細胞ペレットを−８０℃で凍結する
５．ペレットを１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス ｐＨ８．０中に再懸濁し、組織培養プレート当たり１０ｍｌを使用する
６．ｄＨ２Ｏ中に１０％デオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製する。これを０．５％の最終濃度で組織培養プレート当たり１．２５ｍｌ添加する。ベンゾナーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）ヌクレアーゼを５０単位／ｍｌの最終濃度となるように添加する。チューブを徹底的に混合する。
７．３７℃で１時間（ウォーターバス）インキュベートする
８．３０００×ｇで１５分間遠心することにより細胞残屑を除去する。新鮮な５０ｍｌチューブに移し、ヘパリンカラムの詰まりを防ぐため、全ての細胞残屑が除去されたことを確実にする。

ＡＡＶ１／２のヘパリンカラム精製：
１．蠕動ポンプを使用して、溶液が毎分１ｍｌでカラムを通って流れるようにＨｉＴｒａｐヘパリンカラムをセットアップする。ヘパリンカラム内に気泡が取り込まれないよう確実にすることが重要である。
２．蠕動ポンプを使用して、１０ｍｌの１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０でカラムを平衡化する。
３．ウイルスの結合：５０ｍｌウイルス溶液をカラムに加え、中を通って流れさせる。
４．洗浄ステップ１：カラムを２０ｍｌの１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で（蠕動ポンプを使用）。
５．洗浄ステップ２：３ｍｌ又は５ｍｌシリンジを使用して、１ｍｌの２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス、ｐＨ８．０、続いて１ｍｌの３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０でカラムの洗浄を続ける。
フロースルーは廃棄する。
（上記のウイルス溶液を５０分間流す間、種々の緩衝液でシリンジを調製する）
６．溶出 ５ｍｌシリンジ及び軽い圧力（＜１ｍｌ／分の流量）を使用して、以下を加えることによりカラムからウイルスを溶出させる：
１．５ｍｌの４００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０
３．０ｍｌの４５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０
１．５ｍｌの５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０
これらを１５ｍｌ遠心管に捕集する。

ＡＡＶ１／２の濃縮：
１．濃縮ステップ１：１００，０００分子量カットオフのＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ １５ｍｌ遠心フィルターユニットを使用して、溶出したウイルスを濃縮する。カラム溶出物を濃縮機にロードし、２０００×ｇで２分間遠心する（室温で。濃縮された容積を確認する−約５００μｌとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで１分間隔で遠心する。
２．緩衝液交換：１ｍｌの滅菌ＤＰＢＳをフィルターユニットに添加し、正しい容積（５００ｕｌ）に達するまで１分間隔で遠心する。
３．濃縮ステップ２：５００ｕｌの濃縮物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍｌ １００Ｋフィルターユニットに添加する。６０００ｇで２分間遠心する。濃縮された容積を確認する−約１００μｌとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで１分間隔で遠心する。
４．回収：フィルターインサートを反転させ、新鮮な収集チューブに挿入する。１０００ｇで２分間遠心する。
アリコートに分け、−８０℃で凍結する。
典型的には注入部位当たり１ｕｌが必要であり、従って少量のアリコート（例えば５ｕｌ）が推奨される（ウイルスの凍結融解を回避する）。
ｑＰＣＲを使用してＤＮａｓｅＩ耐性ＧＣ粒子力価を決定する（別個のプロトコルを参照）。

材料
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、０．５ｍｌ、１００Ｋ；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ；ＵＦＣ５１００２４
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、１５ｍｌ、１００Ｋ；ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ；ＵＦＣ９１００２４
Ｂｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅ１０１４
ＨｉＴｒａｐヘパリンカートリッジ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；５４８３６
デオキシコール酸ナトリウム；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｄ５６７０

ＡＡＶ１上清産生プロトコル
培地：Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ
５００ｍｌボトルＤＭＥＭ高グルコース＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
５０ｍｌのＨｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ（熱失活）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）
５．５ｍｌのＨＥＰＥＳ溶液（１Ｍ、ＧＩＢＣＯ）
細胞：低継代ＨＥＫ２９３ＦＴ（ウイルス産生時の継代数＜１０）
ウイルス産生には継代数２〜４の新しい細胞を解凍し、２〜５代成長させる
トランスフェクション試薬：ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）「Ｍａｘ」
５０ｍｌの滅菌超高純度Ｈ２Ｏ中に５０ｍｇのＰＥＩ「Ｍａｘ」を溶解させる
ｐＨを７．１に調整する
０．２２ｕｍフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを−２０℃で凍結する（保存のため、直ちに使用することもできる）。

細胞培養
Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ中で低継代ＨＥＫ２９３ＦＴを培養し、毎日１：２〜１：２．５で継代する
有利には細胞を８５％より高いコンフルエンシーに至らせる。

Ｔ７５について
−フラスコ当たり１０ｍｌのＨＢＳＳ（−Ｍｇ２＋、−Ｃａ２＋、ＧＩＢＣＯ）＋１ｍｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＧＩＢＣＯ）を３７℃に温める（ウォーターバス）
−培地を完全に吸引する
−１０ｍｌの温ＨＢＳＳを穏やかに添加する（培地を完全に洗い流すため）
−フラスコ当たり１ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加する
−フラスコをインキュベーター（３７℃）に１分間置く
−フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
−９ｍｌのＤ１０＋ＨＥＰＥＳ培地（３７℃）を添加する
−上下に５回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
−１：２〜１：２．５（Ｔ７５には１２ｍｌの培地）の比で分割する（細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない）
−十分な（大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの）細胞が存在するようになったら直ちにＴ２２５に移す。

ＡＡＶ産生（単一１５ｃｍディッシュスケール）
１０００万細胞を１５ｃｍディッシュ中２１．５ｍｌ培地にプレーティングする
３７℃で１８〜２２時間インキュベートする
プレート当たり８０％コンフルエンスでのトランスフェクションが理想的である
２２ｍｌ培地（Ｄ１０＋ＨＥＰＥＳ）を予熱する
ＤＮＡ混合物を含むチューブを調製する（ｅｎｄｏｆｒｅｅ ｍａｘｉｐｒｅｐ ＤＮＡを使用）：
５．２ｕｇの目的ベクターのプラスミド
８．７ｕｇのＡＡＶ血清型１プラスミド
１０．４ｕｇのＤＦ６プラスミド（アデノウイルスヘルパー遺伝子）
ボルテックスして混合する
４３４ｕＬのＤＭＥＭを添加する（無血清！）１３０ｕｌのＰＥＩ溶液を添加する
５〜１０秒間ボルテックスする
ＤＮＡ／ＤＭＥＭ／ＰＥＩ混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
１５ｃｍディッシュ中の培地をＤＮＡ／ＤＭＥＭ／ＰＥＩ混合物に交換する
３７℃インキュベーターに戻す
４８時間インキュベートした後回収する（有利には、培地が過度に酸性にならないよう監視する）。

ウイルス回収：
１５ｃｍディッシュから上清を取り出す
０．４５ｕｍフィルター（低タンパク質結合）でろ過し、アリコートに分け、−８０℃で凍結する
形質導入（２４ウェルフォーマット、５ＤＩＶでの初代ニューロン培養）
形質導入されるニューロンの各ウェル内の完全ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を新鮮なｎｅｕｒｏｂａｓａｌに交換する（通常、ウェルにつき５００ｕｌ中４００ｕｌが交換される）
３７℃のウォーターバスでＡＡＶ上清を解凍する
インキュベーターで３０分間平衡化させる
各ウェルに２５０ｕｌのＡＡＶ上清を添加する
３７℃で２４時間インキュベートする
培地／上清を取り出し、新鮮な完全ｎｅｕｒｏｂａｓａｌに交換する
４８時間後に発現が目に見え始め、感染後約６〜７日で飽和する
ＧＯＩを含むｐＡＡＶプラスミド用の構築物は、両方のＩＴＲＳを含めて４．８ｋｂを超えてはならない。

ヒトコドン最適化配列（すなわちヒトでの発現に最適化されている）配列の例：ＳａＣａｓ９を以下に提供する。

実施例２７：Ｃａｓ９ニッカーゼ及び２つのガイドＲＮＡを使用したオフターゲット切断の最小化
Ｃａｓ９は、ＲＮＡにガイドされるＤＮＡヌクレアーゼであり、２０ｂｐのＲＮＡガイドの助けによりゲノムにおける特定の位置にターゲティングされ得る。しかしながら、ガイド配列はガイド配列とＤＮＡ標的配列との間のいくらかのミスマッチを許容し得る。ガイドＲＮＡによってＣａｓ９が、ガイド配列と数塩基の違いを有するオフターゲット配列に標的化される場合、オフターゲット切断が起こる可能性があるためにこの柔軟性は望ましくない。全ての実験的応用（遺伝子ターゲティング、作物エンジニアリング、治療適用等）について、Ｃａｓ９媒介性遺伝子ターゲティングの特異性を向上させ、かつＣａｓ９によるオフターゲット改変の可能性を低下させることが可能であることが重要である。

本出願人は、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体を２つのガイドＲＮＡと組み合わせて使用して、オフターゲット改変なしにゲノム中の標的二本鎖切断を促進する方法を開発した。Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼから、その切断活性を無効にすることにより作成され、従ってＤＮＡ二重鎖の両鎖が切断される代わりに一方の鎖のみが切断される。Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの１つ以上のドメイン、例えばＲｕｖｃ１又はＨＮＨに突然変異を誘発することにより作成されてもよい。これらの突然変異には、限定はされないが、Ｃａｓ９触媒ドメインの突然変異が含まれてもよく、例えばＳｐＣａｓ９では、これらの突然変異はＤ１０位又はＨ８４０位にあり得る。これらの突然変異には、限定はされないが、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａが含まれ得るが、ニッカーゼは、他のＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣａｓ９オルソログにおける対応する位置に突然変異を誘発することにより作成されてもよい。本発明の最も好ましい実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異体は、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼである。

これの機能の仕方は、Ｃａｓ９ニッカーゼと組み合わせた各ガイドＲＮＡが二重鎖ＤＮＡ標的の標的一本鎖切断を誘導し得ることである。各ガイドＲＮＡが１つの鎖をニッキングするため、正味の結果は二本鎖切断となる。この方法でオフターゲット突然変異がなくなる理由は、両方のガイド配列に高度な類似性を有するオフターゲット部位を有する可能性が極めて低いためである（各ガイドにつき２０ｂｐ＋２ｂｐ（ＰＡＭ）＝２２ｂｐの特異性、及び２つのガイドは、任意のオフターゲット部位が４４ｂｐ近くの相同配列を有しなければならないことを意味する）。個々のガイドがオフターゲットを有し得る可能性はなおあるが、それらのオフターゲットはニッキングされるに過ぎず、それが突然変異誘発性のＮＨＥＪプロセスによって修復される可能性は低い。従ってＤＮＡ二本鎖ニッキングの多重化は、オフターゲットの突然変異誘発効果なしに標的ＤＮＡ二本鎖切断を導入する強力な方法を提供する。

本出願人は、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞と、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）ニッカーゼ並びに１つ以上のガイド用のＤＮＡ発現カセットをコードするプラスミドとのコトランスフェクションを含む実験を実施した。本出願人は、リポフェクタミン２０００を使用して細胞をトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間又は７２時間でトランスフェクト細胞を回収した。二重ニッキングにより誘導されるＮＨＥＪを、本明細書において先述したとおりＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイを使用して検出した（図５１、図５２及び図５３）。

本出願人はさらに、２つのガイドＲＮＡと組み合わせたときのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体による効率的な切断に関係するパラメータを特定しており、これらのパラメータには、限定はされないが、５’オーバーハングの長さが含まれる。少なくとも２６塩基対の５’オーバーハングについて効率的な切断が報告される。本発明の好ましい実施形態において、５’オーバーハングは少なくとも３０塩基対及びより好ましくは少なくとも３４塩基対である。最大２００塩基対のオーバーハングが切断に許容され得るが、１００塩基対未満の５’オーバーハングが好ましく、及び５０塩基対未満の５’オーバーハングが最も好ましい（図５４及び図５５）。

実施例２８：ＣＲＩＳＰＲ ＨＢＶ
ＣＲＩＳＰＲ系は、本明細書に記載されるように、Ｂ型肝炎ウイルスを標的化するために設計されており、図３６〜７２に示されている；そしてこの系は治療に効果があることが実証されている。

この実施例に関連する図面は図３６〜図７２であり、図３６及び図５７はガイド設計を実証する。図３８は、１回目のＨｅｐＧ２．２．１５実験からのｑＰＣＲ結果を示す。図３９は、ヌクレアーゼ活性についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。クレアーゼ活性からの繰り返されるＤＳＢ形成による不完全なＮＨＥＪイベントの結果としてインデルが形成する。Ｃａｓ９標的化ゲノム遺伝子座について、多くの場合、１０〜３０％の割合のインデル形成が観察され、５０％に達することもある。図４０は、第１セットのＨｅｐＧ２．２．１５実験についての代表的なｓｕｒｖｅｙｏｒを示す。図４１は、初期データセットのノイズにより動機付けられた実験的設計のＨｅｐＧ２．２．１５ＨＢＶ定量化スキームを示す。図４２は、ソーティングベースの基準化を用いたＨｅｐＧ２．２．１５結果を示す。図４３は、２回目のＨｅｐＧ２．２．１５実験において保存ＨＢＶ配列を標的とするガイドを用いて観察された低レベルのインデルを示す。図４４は、ＨｅｐＧ２コトランスフェクション実験を示す。図４５は、コホート１についてのＨＤＤデータを示す。図４６は、コホート２についてのＨＤＤデータを示す。図４７はコホート２についてのＨＤＤデータを示す。図４８は、コホート２についてのＨＤＤデータを示す。図４９は、ＨＤＤの９日後のコホート２の肝臓分析を示す。図５０は、ＨＤＤの９日後のコホート２の肝臓分析を示す。図５１は、ＨＤＤ実験中に形成されたインデルが少ない／全くないことを示す。ガイド２１形成の予測バンドサイズ：２３５＋２７２＋５０７ｂｐ（未消化ＰＣＲ産物）。図５２は、ＨＤＤコホート３結果を示す：ＨＢｓＡｇ。図５３は、ＨＤＤコホート３結果を示す：ウイルス血症。図５４は、ＨＤＤコホート３結果を示す：肝臓中のＨＢＶ。図５５は、ＨＤＤコホート３結果を示す：ＧＡＰＤＨに対して基準化したルシフェラーゼ。図５６は、インデル形成が少ない／全くないにもかかわらず、ＨＢＶに対する効果がＣａｓ９ヌクレアーゼ活性に依存することを示す。図５７は、ＨＢＶの生活環及びＣＲＩＳＰＲ構築物の推定抗ＨＢＶ効果の略図と、いくつかの試験したガイドＲＮＡ構築物についてのＨＢＶゲノム機構及び標的配列の位置とを示す。図５８は、患者由来のウイルスゲノムの大多数の保存領域標的を標的化するガイドＲＮＡ、ＨｅｐＧ２トランスフェクション実験の概略図及び結果を示す。図５９は、水圧注入実験についての実験概略図及び結果を示す。図６０は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞内のＨＢＶの生活環、並びにＨｅｐＧ２．２．１５細胞内の持続するＣＲＩＳＰＲ発現のためのレンチウイルスベクター及び実験戦略の概略図を示す。図６１は、ＨＢＶ標的化ＣＲＩＳＰＲが、ＨＢＶ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９活性に依存するＨＢＶのＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを低減することを示す。図６２は、ＨＢＶ産物が長期ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ発現時に低減されることを示す。図６３は、ＨＢＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ構築物が、ウイルスＤＮＡのターゲティングの成功に依存するｃｃｃＤＮＡ及び全ＨＢＶ ＤＮＡレベルの大幅な漸進的な低下を引き起こすことを示す。図６４は、長期ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ発現時のＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡの低下が複数のガイドによって生じることを示す。図６５は、ＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットを示す。図６６は、ＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットを示す。図６７は、全ＨＢＶ ＤＮＡ及びエピソームＨＢＶ ＤＮＡにおけるインデル形成を検出するためのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを示す。図６８は、免疫蛍光法により決定する際に、コアＯＲＦに対して特異的にｇ１７によりターゲティングされると、コア染色の大幅な低減を実証する。図６９は、新規感染に関して、新規の感染実験の概略図を示す。図７０は、ＨＢｓＡｇ分泌、ｃｃｃＤＮＡコピー、５ｂｐミスマッチ対照に対するＨＢＶ３．５ｋｂ ＲＮＡのレベル、及び培地中のＨＢＶ ＤＮＡの力価を示す。図７１は、患者由来のウイルスモデルシステムにおけるＨＢＶのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性破壊を示す。図７２は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ結果を示す。

ＣＲＩＳＰＲ構築物の構築。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞株に組み込まれたＨＢＶゲノム中に存在する配列を標的とする２４のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９構築物を、これらの実験のために使用した（Ｓｅｌｌｓ ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ １９８７）。Ｔ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ Ｌ６０２０Ｌ）を用いて、標的配列に対応するオリゴをＢｂｓＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＦＤ１０１４）消化プラスミドＰＸ３３０ａ又はＢｓｍＢＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＦＤ０４５４）消化プラスミドＰＨＢＣ０１３にライゲートした（Ｈｓｕ ｅｔ．ａｌ．，“ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２７−８３２（２０１３）（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３））。ＰＸ３３０ａは、Ｈｓｕ ｅｔ．ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３）に記載される＋８５ガイドＲＮＡの発現を駆動するＵ６プロモーター、及びＣＢｈプロモーターにより駆動される化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０由来の哺乳類コドン最適化ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含有する。ＰＨＢＣ０１３は、ＰＸ３３０ａからのＵ６ガイドＲＮＡ発現系、及びＥＦＳプロモーターにより駆動されるＮＬＳ−Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙを含有する。ｐＨＫＯ＿０１５をＮｈｅＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ♯ＦＤ０９７４）及びＭｌｕＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃ＦＤ０５６４）で消化し、次にＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ，＃Ｅ２６１１Ｌ）と共にＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを用いてｍＣｈｅｒｒｙを挿入することによって、ＰＨＢＣ０１３をｐＨＫＯ＿０１５から作製した。赤色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙマーカーによりどの細胞がベクターによりトランスフェクトされたかを見ることが容易になる。構築物の説明については図５７Ｂを参照されたい。２組の対照構築物を作製した。スペーサーの３’末端に５塩基対のミスマッチを含有するがその他はＨＢＶを標的とするように設計された構築物と同一であるＰＸ３３０ａ又はＰＨＢＣ０１３に対してオリゴ中でライゲートすることによって、有望なガイドＲＮＡ分子に対するミスマッチガイドＲＮＡ対照構築物を作製した。ｐＨＢＣ０１３ガイドＲＮＡ含有構築物をＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩで消化し、次にＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙを用いてＰＣＲ増幅Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９挿入することによって、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａヌクレアーゼ死（ｄｅａｄ）対照構築物を作製した。Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を消失させるのに十分な突然変異である（Ｃｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８１９−８２３，Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ．ａｌ．“Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｎｏｖ ２０１１；３９（２１）：９２７５−９２８２．）。対照ベクターは依然としてｓｇＲＮＡを発現する。

ガイドＲＮＡ：利用可能なゲノム配列により、種々のゲノム領域が複数の株を越えて十分に保存されることが明らかになる。ａｙｗ血清型に従って番号付けされて、以下のゲノムの領域は十分に保存される。

ＨＢＶゲノムを標的化するために２４のガイドＲＮＡが設計された（図３６、５７）。これらには、ＨＢＶゲノム内で高度に保存される標的が含まれる。さらに、ガイド配列は、ヒトゲノム内の可能性のあるオフターゲット部位を最小限にするように、例えば、発表されたヒトゲノム配列における任意の他の配列に対して少なくとも２ミスマッチを含むように設計することができる。例えば、ガイドＧ６に対してヒトゲノムにおける最も近いマッチは、少なくとも３ヌクレオチド（２ヒット）又は４ヌクレオチド（４３ヒット）だけ異なる。

さらに、ＨＢＶゲノムは、ゲノム内に１６２のＮＧＧ ＰＡＭ（そのうち４１は保存トラクト（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒａｃｔｓ）内にある）及び１６０のＮＡＧ ＰＡＭ（３２は保存トラクト内にある）を含む。

加えて、標的配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに蓄積された利用可能な完全ＨＢＶゲノム配列（５０５２の完全に配列決定されたゲノム）に対して評価して、患者由来のウイルス単離物に対する被覆度を調べることができる。例えば、これらの配列の９１．２％がガイドＧ６に完全にマッチし、８７．３％がガイドＧ２１に完全にマッチする。

ガイドＲＮＡは、５’−Ｇ（Ｎ１９）−３’（ここで、ＮはＡＵＣ又はＧのいずれかである）の形態を有し、その標的配列は５’−Ｇ（Ｎ１９）−ＮＧＧ−３’（ここで、ＮはＡＴＣ又はＧのいずれかである）の形態を有した。ガイド１〜１２は、４つ全てのＯＲＦを標的とするように設計し、そしてガイド１３〜２４は、ＨＢＶ遺伝子型を越えて保存されるＨＢＶ配列に対して設計した（例えば、米国特許第８３５００２１号明細書を参照）。また、図３６、５７も参照されたい。従って、ガイド１〜１２については、標的モチーフ５’−Ｇ（Ｎ１９）−ＮＧＧ−３’はＨＢＶの４つのＯＲＦの全てに現れ、従って、ガイドＲＮＡは前記モチーフに従って結合する。同様に、ガイド１３〜２４について、標的モチーフ５’−Ｇ（Ｎ１９）−ＮＧＧ−３’はＨＢＶ遺伝子型を越えて保存され、従ってガイドＲＮＡは結合する。有利なガイド、Ｇ６、Ｇ１７、及びＧ２１は以下の配列を有する。
ガイド６ ５’−ｇｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇ−３’
ガイド１７ ５’−ｔａａａｇａａｔｔｔｇｇａｇｃｔａｃｔｇ−３’
ガイド２１ ５’−ｔｃｃｔｃｔｇｃｃｇａｔｃｃａｔａｃｔｇ−３’

ＣＲＩＳＰＲ複合体の作用の推定機構は、ＨＢＶ感染の間に産生されて何年間も核内に潜伏したままであり得るｃｃｃＤＮＡに関する。ｃｃｃＤＮＡは、設計したガイドＲＮＡへのハイブリダイゼーションの後に、Ｃａｓ９によって切断されると仮定される。従って、図３７は、ＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを決定するための手段を説明する。

ガイドＲＮＡを試験するための実験は、以下に記載されるように、人工的にＨＢＶに感染させたＨｅｐＧ２細胞か、又は過剰長さの線状二本鎖ＨＢＶ ＤＮＡセグメントがそのゲノムに組み込まれ、ＨＢＶ転写物、感染性ビリオン及びｃｃｃＤＮＡを構成的に産生するＨｅｐＧ２ ２．１５細胞のいずれかを使用した。

細胞及び試薬。ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を、長期培養のためにＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清／１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（保持培地）中に保持し、５〜７日毎に継代した。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１０も参照されたい。使用した全ての細胞は継代数４〜継代数８の間であった。処置の最大１週間前に、正確な細胞の定量化のために成長停止を促進させるために、そして肝臓分化を促進させ、ＨＢＶ複製及びｃｃｃＤＮＡ形成を増大するために、ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を２％のＤＭＳＯで処置した。

一過性トランスフェクション。実験ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞：ＨｅｐＧ２細胞を約３０％の集密度でプレーティングし、５０％の集密度まで成長させてから、図５７Ｂ（ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを含むレンチウイルス骨格）に示されるプラスミドでコトランスフェクトし、以前に記載されているように（Ｄｏｉｔｓｈ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．２００４）、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓ−ＩＴトランスフェクション試薬を用いて、１．３×長さのＷＴ ＨＢＶプラスミドをとして使用した。２４時間後に細胞を洗浄及び供給し、トランスフェクションの７２時間後に上清及び細胞ペレットをアッセイした。

トランスフェクション実験ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞。５０ｕｇ／ｍＬのコラーゲンＩ（Ｒａｔ ｔａｉｌコラーゲンＩ，ＢＤ）がコーティングされた標準組織培養プラスチック上に、ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を４０〜８０％の集密度でプレーティングした。播種の２４時間後に、選択されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ又は対照プラスミドＤＮＡを１：３の比率でＴｒａｎｓＩＴ ２０２０（Ｍｉｒｕｓ）トランスフェクション試薬とＯｐｔｉ−ＭＥＭ低減血清培地中で３０分間インキュベートすることにより、トランスフェクションポリプレックスを形成が形成された。ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を洗浄し、トランスフェクション混合物を２５０ｎｇＤＮＡ／１ｃｍ^２成長面積の用量で細胞に添加した。トランスフェクションを４８時間実行し、次に細胞を保持培地中で３回洗浄し、さらに２４時間培養した。最後に、細胞を回収し、標準プロトコルにより蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）のために調製し、Ｓｙｔｏｘ Ｂｌｕｅ色素を添加して死細胞を標識化した。ＦＡＣＳにより細胞を分析し、２つのグループ：ｍＣｈｅｒｒｙ＋（トランスフェクトの成功）及びｍＣｈｅｒｒｙ−（トランスフェクトの不成功）において各条件から所与の数及び単一の生細胞を捕集した（図４１）。これらの細胞を溶解緩衝液（ＤＮＡ定量化のため）又はＴｒｉｚｏｌ試薬（ＲＮＡ定量化のため）のいずれかの中に回収し、得られた物質を本出願人の標準アッセイにより分析した。

レンチウイルス産生：３：２：１の比率のｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏレンチウイルスベクター（図６０Ｂ）及び第２世代レンチウイルスパッケージング系（ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇ）により２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を洗浄し、トランスフェクションの４８〜９６時間から２４時間ごとに上清を捕集し、細胞片を遠心分離により除去した。レンチウイルスを超遠心分離により１６，６００×ｇで１．５時間濃縮し、Ｏｐｔｉｍｅｍ中４Ｃで一晩インキュベートし、次にＯｐｔｉｍｅｍ中に再懸濁させ、アリコートに分け、翌日使用前に−８０Ｃに凍結した。

レンチウイルスの形質導入：ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を５０％の集密度でプレーティングし、濃縮レンチウイルス（上記のように作製）を１のＭＯＩで播種した。レンチウイルスアリコートを標準ＨｅｐＧ２．２．１５培地と共に混合し、６ウェルプレートにおいて２．５ｍＬウェルで、細胞を洗浄し、そして６ウェルプレートにおいて２．５ｍＬウェルでレンチウイルス含有培地を添加し、２００ｘｇで１時間遠心分離してから、さらに２３時間インキュベートすることによって、形質導入を実施した。レンチウイルス添加の２４時間後に、細胞を３回洗浄し、標準培地＋２．５ｕｇ／ｍＬピューロマイシン中でインキュベートして、非形質導入細胞を除去した。ピューロマイシン選択を４８時間継続してから、細胞を３回洗浄し、標準培地中に保持した。次に、形質導入細胞を、８０％コンフルエンスに到達した時点で連続的に継代した；各継代において、細胞をカウントし、各条件について細胞ペレットを回収し、残りの細胞の一部を１０％のコンフルエンスで再播種した。レンチウイルス構築物を含む細胞は表現型的に正常に見え、培養下で少なくとも１０週間にわたって増殖異常を示さなかった。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏコトランスフェクション実験：コラーゲンをプレコートしたプレートにＨｅｐＧ２細胞を６０〜７０％コンフルエンスで播種した。播種の２４時間後に、それぞれ１：４の比率で、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ２０２０（ＭＩＲＵＳ）トランスフェクション試薬を用いて１．３ｘＨＢＶを対応するＣＲＩＳＰＲコード化構築物と共に細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８〜７２後に、培地を捕集し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＨＢｓＡｇについて分析した。同時に細胞を捕集し、ＴＲＩＺＯＬによりＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを用いてｃＤＮＡを合成した。ＨＢＶｐｇＲＮＡに対する特異的なプライマーを用いてＱ ＰＣＲを実行した。ヒトＲＰＳ１１ハウスキーピング遺伝子に対して基準化を行なった。

Ｉｎ ｖｉｖｏ水圧同時注入実験。以前に記載された（Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００５）ように、ＮＲＧマウスに、１．３ｘＨＢＶプラスミド（１５ｕｇ）をＣＲＩＰＳＲコード化（２０ｕｇ）及びホタルルシフェラーゼ（１０ｕｇ）コード化プラスミド（ｐＳＰＯＲＴ６−Ｆｌｕｃ）と共に動物体重の０．１５倍（ｍｌ単位）に等しい容積で流体力学的に注入した（ＨＤＤ）。動物に７〜９秒で尾静脈から注入し、続いて数日毎に採血した。採血の時点で、ＩＶＩＳ装置を用いて動物を可視化し、ルシフェラーゼ発現を定量化した。市販のＥＬＩＳＡキットを用いてＨＢｓＡｇについて、そしてＨＢＶ特異的プライマー及びプローブを含むＴａｑＭａｎマスターミックスを用いるＱ−ＰＣＲによって血清ＨＢＶ ＤＮＡ（ウイルス血症）について、血液を分析した。既知の濃度の２ｘＨＢＶプラスミドによる標準曲線に従って定量化を行なった。対応する日におけるルシフェラーゼ発現に対してＨＢｓＡｇ及びＤＮＡレベルを基準化した。ＨＤＤの４日又は９日後に、動物を屠殺し、肝臓を採取し、均質化の後ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを、以下についてＱＰＣＲにかけた：全ＨＢＶ ＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ（プラスミドＳａｆｅ ＤＮａｓｅによるＤＮＡの処置の後、ｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーを用いて）、ＧＡＰＤＨ及びルシフェラーゼ。

ｐｇＲＮＡ及びｃｃｃＤＮＡに対する効果。設計したガイドＲＮＡを、ＨＢＶプレゲノムｍＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）及び共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）（これらはいずれもＨＢＶの生活環の本質的な部分である）に対するその効果について研究した。

培地上清中に分泌されるＢ型肝炎表面抗原の検出：１００ｕｌの培地を、マウスモノクローナル抗ＨＢｓＡｇ抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＧＳ ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ ３．０，Ｃａｔ．Ｎｏ．３２５９１）に負荷させた。製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡプロトコルを行った。ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｍｅｇａ装置（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いてプレートを読み取った。

Ｂ型肝炎ｅ抗原ＥＬＩＳＡ：製造業者の説明書に従って、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）化学発光イムノアッセイキット（Ａｕｔｏｂｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ，Ｃａｔ Ｎｏ．ＣＬ０３１２−２）を用いて、ＨＢＶＥ抗原ＥＬＩＳＡを実施した。

ＨＢＶコア抗原の免疫染色：チャンバー付カバーガラス（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）上で細胞を成長させ、ＰＢＳで洗浄し、そして４％パラホルムアルデヒドにより固定した。細胞を再度洗浄し（３ｘＰＢＳ）、ＰＢＳ中１００ｍＭのグリシン溶液で処理した。ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００による透過処理の後、Ｉｍａｇｅ−ｉＴ^ＴＭＦＸシグナルエンハンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。細胞をＰＢＳ／１０％ヤギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｅａｒｃｈ）／１％ＢＳＡ中にブロックした。ＨＢＶコア染色は、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に１：１０００で希釈したポリクローナルウサギ抗ＨＢＶコア抗体（Ｄａｋｏ，ＣＡ）を用いる（４℃で１８時間）ことにより達成した。二次抗体として、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中に１：２０００で希釈した、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識化したヤギ抗ウサギ標識を使用した。核染色は、ＤＡＰＩ処置を用いて達成した。画像収集は、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡において実施し、画像分析は、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて行なった。

ＨＢＶ ＤＮＡ定量化：２１日目及び３６日目にＨＢＶゲノムＤＮＡを定量化した。以前に記載されたように（Ｙａｎ Ｈ ｅｔ ａｌ，“Ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ Ｄ ｖｉｒｕｓ，ｅＬｉｆｅ ２０１２ Ｎｏｖ １３；１：ｅ０００４９．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０００４９（２０１２））、ｃｃｃＤＮＡの定量化のために、細胞からのＤＮＡを、プラスミド−Ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）により一晩消化させた。７０℃で３０分間の酵素不活性化の後、Ｇｌｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅ−ｓ１ ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｐａｉａ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ，”．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３；７７（１７）：９５１１−９５２１により以前に記載されたように、ｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーを用いてＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを行った。ｃｃｃＤＮＡ増幅のために使用したプライマー：５’ＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＦ３’（センス）５’ＡＧＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＣ３’（アンチセンス）。定量化のために、２ｘＨＢＶプラスミドの濃度を低下させて得られた標準曲線を使用した。また、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ Ｎｏ ４３０４４３７）、並びに以下のプライマー及びプローブ：５’ＣＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧ３’（センス）、５’ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＴＧＴＡＡＧＡＣＣＴＴ３’（アンチセンス）、５−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＣＡ／ＺＥＮ／ＣＴＴ ＣＧＣＴＴＣ ＡＣＣＴＣＴ ＧＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３（プローブ）を用いてＨＢＶ ＤＮＡについてのＰＣＲも行った。ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰＣＲ装置を用いて実行した。１０^９〜１０^１コピーの濃度範囲の２ｘＨＢＶプラスミドで構成される標準曲線を用いることによって定量化を行った。

ｃｃｃＤＮＡ抽出及び分析。細胞から抽出したＤＮＡに、以前に記載された（Ｙａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）ように、プラスミド−ｓａｆｅ ＤＮａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によるＯＮ消化を行った。７０℃で３０分間の酵素不活性化の後、以前に記載されたプロトコル（Ｙａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）に従ってＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を使用し、そしてＧｌｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）によって以前に記載されたｃｃｃＤＮＡ特異的プライマーを用いて、ＤＮＡにリアルタイムＰＣＲを行った。ｃｃｃＤＮＡ増幅のために使用したプライマー：
５’ＴＧＣＡＣＴＴＣＧＣＴＴＣＡＣＣＴＦ３’（センス）
５’ＡＧＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＣ３’（アンチセンス）。

定量化のために、２ｘＨＢＶプラスミドの濃度を低下させて得られた標準曲線を使用した。Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ ＰＣＲ装置を用いてＰＣＲを実施した。

ＨＢＶｍＲＮＡ定量化：全ＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出により単離した。ＤＮａｓｅＩ処置を行った後、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いてＲＮＡを定量化し，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、以前に記載された（Ｙａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）特異的プライマーを用いて、３．５ｋｂＲＮＡ又は全ＨＢＶ ＲＮＡの定量的ＰＣＲを実行した。各反応において、ＲＴ陰性対照を包含させて、ＤＮＡのキャリーオーバーを除外した。

ＨＢＶ複製中間体のサザンブロット分析：全ＤＮＡ又はＨｉｒｔ’ｓ抽出物（低ＭＷ ＤＮＡ）を２９日目に０．８％アガロース−ＴＡＥゲルにかけた後、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に対して変性及びサザンブロッティングを行った。^３２ＰランダムプライムドＨＢＶプローブと共に、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ Ｎｏ ３００３８５）を用いて、ハイブリダイゼーションによりウイルスＤＮＡを検出した。インキュベーション及び洗浄の後、ホスホイメージャーにより膜を可視化し、後でフィルムに露光した。

Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ：Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ（ＮＥＢ）又はＨｅｒｕｃｌａｓｅ ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ポリメラーゼ及び以下に記載されるプライマーを用いるＰＣＲにより標的遺伝子座を増幅した。Ｑｉａｇｅｎキットを用いてＰＣＲ産物をゲル又はＰＣＲ精製し、製造業者の説明書に従ってＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）を行った。Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）において記載されるようにｓｕｒｖｅｙｏｒのインデル率を計算した。

Ｓｕｒｖｅｙｏｒプライマー。
ガイド６−Ｆ：ＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＧＣＴＧ
ガイド６−Ｒ：ＡＧＴＣＡＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＡＧ
ガイド１７−Ｆ１：ＴＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＧＧＣＴＧ
ガイド１７−Ｒ１：ＡＧＧＧＧＣＡＴＴＴＧＧＴＧＧＴＣ
ガイド１７−Ｆ２：ＡＡＡＴＴＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＣＣＡＧＣ
ガイド１７−Ｒ２：ＡＧＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＣ
ガイド２１−Ｆ１：ＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＣＧＴＴＡＡＴＧＣＣＣ
ガイド２１−Ｒ１：ＧＴＣＣＧＣＧＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧＴＧ
ガイド２１−Ｆ２：ＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣＣＣＧＴＴＧＣＣＣ
ガイド２１−Ｒ２：ＡＧＡＧＡＧＴＣＣＣＡＡＧＣＧＡＣＣＣＣ

図５７Ａに関して、図はＨＢＶの生活環を示す、ウイルスを標的化するＣａｓ９／ｓｇＲＮＡが推定的に作用する場合が示される。ＨＢＶ感染から生じるｃｃｃＤＮＡは、ｓｇＲＮＡが保存ＨＢＶ標的部位に結合した後に、Ｃａｓ９によって切断される。図５７Ａは、も示す。プラスミドが、トランスフェクトが成功した細胞を次に蛍光選別するためのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質と共にＨＢＶ標的ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質の両方をコードする。図５７Ｂに関して、標的は、種々のＨＢＶ血清方の中でも極めて高い配列保存領域と、ヒトゲノムに対するその低い相同性とに基づいて選択された（図５８Ａを参照）。ガイドＲＮＡはゲノムのいくつかの異なる領域を標的とし、異なるＯＲＦ及び転写制御エレメントがヒットされる。

ＨｅｐＧ２細胞を１．３ｘＷＴ ＨＢＶ及びＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ／ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドによりコトランスフェクトし、ＨＢＶ複製を７２時間進行させた（図５８Ｂに示される概略図を参照）。次に、上清を捕集し、ＲＮＡ抽出のために細胞を溶解させた。（図５８Ｃ）対照ガイドＲＮＡ（非標的化ガイドＲＮＡ）又は種々のＨＢＶ標的化ガイドＲＮＡのいずれかによる分泌されるＨＢｓＡｇについてのＥＬＩＳＡ。（図５８Ｄ）非標的化ガイドＲＮＡとＨＢＶ標的化ガイドＲＮＡとの間の、３．５ｋｂＨＢＶプレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）レベルの倍数変化。図は、ＥＬＩＳＡを用いて定量化されたＨＢｓＡｇのレベルを示し、ガイド１７及び２１が最良の低下を示した。また図は、ｐｇＲＮＡのレベルも示し、これらはガイド１３〜２１の全てを用いたときにより低かったが、１７及び２１について最も印象的な結果がこの場合も見られた。ガイド６の強力な切断挙動を示す早期の予備データと共に、これらの２つのアッセイの結果に基づいて、さらなる研究のためにガイド６、１７、及び２１を選択した。

本出願人は次に、初代肝細胞において抗ＨＢＶ構築物が適切に機能することを保証するために、ｉｎ ｖｉｖｏのＣａｓ９の抗ウイルス効果を評価しようとした。これを行うために、水圧注入（ＨＤＩ）によりＨＢＶ及びＣａｓ９／ｇＲＮＡプラスミドが免疫不全マウス（ＮＲＧ）の肝臓に導入されたＨＢＶのマウスモデルを使用した（Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２００５）（図５９Ａ）。このモデルにおいてＣａｓ９及びｇ２１を発現する動物は、Ｃａｓ９及び突然変異ｇＲＮＡ（ｇ２１Ｍ；３’５ｂｐミスマッチ）を発現する対照と比較して、注射の４日後のＨＢｓＡｇ分泌の低下及びウイルス血症の４倍の低下（図５９Ｂ及び５９Ｃ）によって反映される、ＨＢＶ発現の漸進的な抑制を示した。

本出願人は、ＨＢＶ生活環をより確実に再現するモデルを用いて、ＨＢＶの阻害における持続性Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ発現の効力を評価した。これらの研究のために、機能性ＨＢＶ組込み型及びｃｃｃＤＮＡの両方を保有し、感染性ビリオンを構成的に産生するＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞株を使用した（図６０Ａを参照）。図６０は、（ａ）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞内のＨＢＶ生活環を示す。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞はゲノム的に組込まれた線状１．３ｘ ＷＴ ＨＢＶ配列を含有し、これから、転写とその後の翻訳（タンパク質）又は逆転写及び核の再輸入（ｃｃｃＤＮＡ）によって、ウイルスタンパク質及びｃｃｃＤＮＡが構成的に産生される。このシステムにおける持続性のＨＢＶ産生は、ウイルスＤＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の長期の抗ＨＢＶ効果のアッセイを可能にし；（ｂ）ＨｅｐＧ２．２．１５細胞内の持続性ＣＲＩＳＰＲ発現のためのレンチウイルスベクター及び実験戦略の概略図。レンチウイルスの形質導入と、その後の、Ｃａｓ９及び各ガイドＲＮＡを組み込んだ安定系統の選択とを可能にするために、ＨＢＶ標的化ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、及びピューロマイシン耐性エレメントをコードする濃縮レンチウイルスストックを作製した。ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞を、Ｃａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ又はヌクレアーゼ欠損（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ「死」）Ｃａｓ９−２Ａ−Ｐｕｒｏ及びガイド６、１７、又は２１のいずれか、又は３つの異なる非標的化配列のうちの１つをコードする濃縮レンチウイルスにより形質導入し、その後、ピューロマイシン選択を行い、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を安定して発現するＨｅｐＧ２ ２．１５系統を得た。図６１は、ガイド６、１７、及び２１が、ＨＢＶへの正確なターゲティングと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性とに依存する形で、全ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを大幅に低減することを示す。形質導入の２９及び３６日後からの結果を比較すると、本出願人は、他の細胞系におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓのレンチウイルス形質導入空の結果と一致して、ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡのレベルが時間と共に減少し続けることが分かる。また、図は、「死（ｄｅａｄ）」Ｃａｓ９が２１又は３６日目にＨＢＶゲノムＤＮＡの量に対して与える影響は小さい（約５０コピー／細胞）が、活性Ｃａｓ９と組み合わせたガイド６、１７及び２１はＤＮＡを２１日目に１０コピー／細胞よりも少ない値まで低減し、３６日目にはさらに少ないコピー数まで低減したことも示す。従って、Ｃａｓ９系は、ＨＢＶへの正確なターゲティングと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性とに依存する形で、全ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡを大幅に減少させた。さらに、ｃｃｃＤＮＡについても同様の効果が見られ、ガイド２１を用いると３６日目にほとんど検出できなかった（細胞当たり平均して１コピーよりもはるかに少ない）。

別の対照実験において、細胞は、ウイルス適合性に対するＣａｓ９のヌクレアーゼ非依存性効果について検査するためにｇＲＮＡ及びヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ；死Ｃａｓ９）を含有する構築物によって、あるいはガイド配列非依存性効果について検査するために突然変異ｇＲＮＡ（ｇＸＭ）を含むＷＴ Ｃａｓ９を含有する構築物によっても形質導入した。Ｃａｓ９／ｇＲＮＡは、ＨＢＶ ＤＮＡ放出（種々のｇＲＮＡにわたって７７〜９５％の低下）、ＨＢｅＡｇ分泌、及びウイルスｍＲＮＡ産生（５０％よりも多い）のロバストな抑制を生じた（図６２）。ＭＯＲＥ

本出願人は次に、主にｃｃｃＤＮＡで構成される非組込みウイルス形態の存在量に対するＣａｓ９媒介性切断の効果を分析した。ｑＰＣＲは全ＨＢＶ ＤＮＡ及びｃｃｃＤＮＡにおけるロバストな低下を示し、後者は、形質導入後に、２１日目の７１＋／−７％の低下から、３６日目の９２＋／−４％の低下まで進行した（図６３及び６４）。

これらの結果は、サザンブロットにより形質導入細胞から低分子量ＤＮＡを直接分析することによって確認した（図６５）。ｃｃｃＤＮＡ及びその除タンパク質弛緩環状（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎａｔｅｄ ｒｅｌａｘｅｄ ｃｉｒｃｕｌａｒ）形態（ｄｐＲＣ ＤＮＡ）前駆体は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ形質導入細胞において大幅に激減していた。対照的に、全ＨＢＶ ＤＮＡを分析すると、組込まれたＨＢＶ ＤＮＡのレベルの有意な低下は検出されなかった（図６６）。図６５の形質導入の２９日後のＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットは、全ＤＮＡに対する標準ＤＮＡ抽出を用いて、あるいは低分子量の非染色体ＤＮＡついて特異的に濃縮するための改変Ｈｉｒｔ’ｓ抽出を用いて、２９ｄｐｔにＨｅｐＧ２ ２．１５細胞株から回収されたＤＮＡにおいて実施されたサザンブロットの結果である。Ｈｉｒｔ’ｓ抽出の場合、ｍｔＤＮＡは抽出手順を通して持続するはずなので負荷対照として全ＤＮＡ及びｍｔＤＮＡの両方が示される。オンターゲットのヌクレアーゼコンピテントなレーンにはＨＢＶ ＤＮＡがほぼ完全に存在しないことに注意されたい。図６５は、高暴露又は低暴露のいずれでも、ＨＢＶのｒｃＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ形態は、ガイド６又は２１を用いると本質的に検出できず、１７を用いると（ｒｃＤＮＡを除いて）かろうじて検出可能であることを示す。次に、３６日目に、線状ｄｓＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ及びｓｓＤＮＡは１７及び２１を用いると本質的に検出できないが、組込まれたＨＢＶ ＤＮＡのレベルは影響を受けないままである（何故なら、組込まれたＤＮＡのＣａｓ９媒介性切断は、ＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復及び組込まれたＨＢＶ ＤＮＡの維持もたらすはず（潜在的に突然変異形態であるが）だからである）。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡにおける（さらに細胞株系における）この低下の程度は、非常に有利に、ｃｃｃＤＮＡ標的化ＨＢＶ治療法に関して利用可能な文献に匹敵する。

図６６の形質導入の３６日後のＨＢＶ ＤＮＡのサザンブロットは、形質導入の３６日後に実施され、特に、組込まれたＨＢＶ ＤＮＡにおける差動効果を、中間体ＨＢＶ形態及びｃｃｃＤＮＡに対して調べるサザンブロットの結果である。オンターゲットのヌクレアーゼコンピテントなガイドは線状ｄｓＤＮＡ、ｃｃｃＤＮＡ、及びｓｓＤＮＡのレベル大幅に低減するが、組込まれたＨＢＶ ＤＮＡのレベルは影響を受けないままであるに注意されたい（何故なら、組込まれたＤＮＡのＣａｓ９媒介性切断は、ＮＨＥＪ媒介性ＤＮＡ修復及び組込まれたＨＢＶ ＤＮＡの維持もたらすはず（潜在的に突然変異形態であるが）だからである）。ＨＢＶｃｃｃＤＮＡにおけるこの低下の程度は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ｃｃｃＤＮＡ標的化ＨＢＶ治療法であり得ることを実証する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のゲノム標的と同様に、ウイルスＤＮＡが切断され、エラープローンＮＨＥＪによって修復されるかどうかを直接決定するために、ＣＲＩＳＰＲ形質導入ＨｅｐＧ２ ２．１５細胞からのＤＮＡ抽出物においてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実施した。その結果は図６７に示される。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイは、この系のＨＢＶ ＤＮＡにおけるインデル形成を評価するために実施した。Ｃａｓ９媒介性切断の間接的な尺度であるインデル形成についての全ＨＢＶ ＤＮＡ形態の分析により、高レベルの切断が明らかにされた（図６７、上部パネル）。非環状組込みＨＢＶ ＤＮＡを破壊するためのＤＮＡｓｅ処置の後に細胞から増幅させたｃｃｃＤＮＡでは、より低いレベルが見られた（ガイド２１、１７及び６に対してそれぞれ、０％対３２％、６２％対８８％及び２１％対６６％）（図６７、下部パネル）。

ｇ１７により標的化されるコアＯＲＦにおける高レベルのインデル形成と一致して、ＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃ）の免疫染色は、対照と比較して、ｇ１７発現細胞におけるＨＢｃレベルのロバストな低下を明らかにした（図６８）。

新規感染の状況におけるＣａｓ９処置を評価するために、本出願人は、ＨＢＶによる感染に許容的である、ＨＢＶ受容体ＮＴＣＰを過剰発現するＨｅｐＧ２細胞（Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ）（Ｙａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．２０１２）を使用した。ｇ１７は、ＨｅｐＧ２．２．１５実験でｃｃｃＤＮＡにおいて最高レベルのインデル形成を示したので、これらの細胞をＣａｓ９／ｇ１７、Ｃａｓ９／ｇ１７Ｍ、又は死Ｃａｓ９／ｇ１７レンチウイルスにより形質導入し、ＨＢＶ産生ＨｅｐＧ２．２．１５細胞と共に同時培養し、ピューロマイシンにより選択して、非形質導入Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ及び汚染ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を排除した（図６９、左側）。あるいは、Ｈｅｐ−ＮＴＣＰ細胞をピューロマイシンにより選択した後、形質導入を行い、続いてＨＢＶ陽性患者血清で感染させた（図６９、右側）。形質導入Ｈｅｐ−ＮＴＣＰを細胞培養産生ウイルスにより感染させた場合、Ｃａｓ９／ｇ１７は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ ＤＮＡ分泌、並びに３．５ｋｂＲＮＡ及びｃｃｃＤＮＡレベルにおける低下により反映されるように、対照と比べて増殖性のＨＢＶ感染を大幅に抑制した（図７０）；この知見は、患者由来のウイルスによる感染の後に確認された（図７１）。ＨｅｐＧ２．２．１５由来のウイルスにより新規に感染させた細胞からのＤＮＡを用いて実施したＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイでは、ＨＢＶエピソームＤＮＡの直接切断が確認された（図７２）。突然変異ｇ１７Ｍではマイナーな切断も検出されたが、これは、ＤＮＡバルジ含有ガイドＲＮＡによる低レベルの切断に起因する可能性が最も高い（Ｌｉｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．２０１４）。この知見は、Ｃａｓ９がウイルスのエピソーム形態を標的として、ｃｃｃＤＮＡを直接標的化することによって抗ＨＢＶ効果を発揮することできるという直接的な証拠を提供する。

これらの実験は、構成的に発現する細胞又はＨＢＶ ＤＮＡにより新規にトランスフェクトされた細胞のいずれかにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物の発現によって、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡの排除が媒介され得ることを示す。慢性的にＨＢＶに感染した肝臓ではｃｃｃＤＮＡ＋肝細胞の割合が高いことを考えると、最適なＨＢＶ標的配列を包含するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を高効率の肝臓特異的ベクター、例えばアデノ随伴ウイルスサブタイプ８（ＡＡＶ８）などにパッケージングするのが適適切であろう（Ｓａｎｄｓ ＭＳ，“ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｉｖｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；８０７：１４１−５７．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−３７０−７＿６）。さらに、特異性又はターゲティングを強制し、ｉｎ ｖｉｖｏのＣａｓ９発現を改善するために、肝細胞特異的転写制御領域を含むことが望ましいであろう（Ｍｉａｏ ＣＨ ｅｔ ａｌ，“Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ，ａｎ ｉｎｔｒｏｎ，ａｎｄ ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，”Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０００ Ｊｕｎ；１（６）：５２２−３２）。投薬計画は、ＡＡＶベクターを用いて行なわれた１００＋の臨床治験から得られた情報を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ発現、及び抗ＡＡＶ免疫応答の防止の両方に対して最適化され得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｅｄｉａ．ｃｏｍ／ｗｉｌｅｙ／ｖｅｃｔｏｒｓ．ｐｈｐ）。抗ＨＢＶ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＡＡＶベクターへの組み込みは依然として進行中であるが、他のベクタータイプ、例えばγ−レトロウイルスなどの最近の遺伝子治療の成功（Ａｉｕｔｉ Ａ ｅｔ ａｌ，“Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４１ ｎｏ．６１４８，２０１３；Ｂｉｆｆｉ Ａ ｅｔ ａｌ，“Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｂｅｎｅｆｉｔｓ Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ Ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．３４１ ｎｏ．６１４８，２０１３）はヒトの投与に対してさらに多くのベクターの可能性を切り開き、感染した肝細胞からＨＢＶを切除するためにＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子療法を用いる快適性のレベルの増大を提供する。

さらに、これらの実験は、ＨＢＶ、特にＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを標的とし、その存在を低減するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を治療的に使用可能であることを示す。

本明細書に記載及び説明されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び構築物を用いた、患者由来の肝細胞（初代ヒト肝細胞又はｉＰＳ由来の肝細胞のいずれか）における新規のＨＢＶ感染では、特にこれらの系における感染は患者血漿由来のウイルスによって行われるので、同様の治療的に有意な結果が得られる。

ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのＣａｓ９切断はｙ−Ｈ２ＡＸを生じ、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのＣａｓ９切断はＤＮＡを直線化し、これは、Ｃａｓ９による直線化の後に修復されないままであり、潜在的に分解され得る。

Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，ｅＬｉｆｅ（２０１２）では、最近発見されたＨＢＶの受容体であるタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）への結合に関与するＨＢＶのＰｒｅＳ１タンパク質中の特定の２−４８ａａ配列が同定された。この領域に対するｓｇＲＮＡのターゲティングはインデル形成を生じることができ、この領域の突然変異は新しい肝細胞に結合及び侵入することができないビリオンの産生を引き起こし、全てのｃｃｃＤＮＡを排除できない場合でもウイルス排除の別の機構を導き得る。

さらに、本明細書の結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び後成的修飾因子薬物の同時投与をもたらす：ＨＢＶｃｃｃＤＮＡ「ミニ染色体」は非常に高密度に充填されたヌクレオソーム関連構造であり、ＨＢＶ ＤＮＡは、ヒストンタンパク質及びＨＢＶコアタンパク質（ＨＢｃ）のまわりにきつく巻き付けられ、標準的な染色体スペーシングよりもさらに短いヌクレオソームスペーシングを生じる。ＨＢＶ転写は関連のヒストンにおける後成的なマークによって調節され、これはいくつかの宿主細胞転写因子の補充をもたらし、ｃｃｃＤＮＡミニ染色体の後成的改変は、ＨＢＶ ＲＮＡの転写を低減する見込み、そしてｃｃｃＤＮＡ分解をもたらす見込みもいくらか示している（例えば、ＩＦＮ−αのｃｃｃＤＮＡ分解能力は、ｃｃｃＤＮＡにおける後成的変化の誘導に関連し得る）。ｃｃｃＤＮＡにターゲティングするＣａｓ９は、おそらく少なくとも部分的にｃｃｃＤＮＡ構造に依存するので、後成的修飾因子（例えば、クラスＩ及びクラスＩＩＩＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、バルプロ酸、及びニコチンアミド（ＮＡＭ）、及びＩ型インターフェロン）との同時処置は、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡにおけるＣａｓ９占有率を高めるために価値ある戦略であり得る。本発明は、後成的修飾因子薬物；又はＨＢＶを処置するために現在使用されている他の薬物などと共に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を投与することを包含する。当業者は、現在使用されているこのような薬物の用量及び製剤を、本明細書に記載される用量及び製剤のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と組み合わせてＨＢＶを処置するために使用することができる。

実施例２９：他のウイルス
同じアプローチを用いて他のウイルス、特にＤＮＡウイルス（通常ｄｓＤＮＡウイルス）も標的とすることができる。例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、並びに宿主哺乳類のゲノムに組み込まれる、及び／又は潜伏環状エピソーム形態を有する任意の他のウイルス。本発明のＣＲＩＳＰＲ系は、潜伏ウイルスを保持する細胞型、例えば、ＥＢＶについてはＢ細胞又は上皮細胞、ＨＳＶ及びＶＺＶについてはニューロン、ＨＰＶについては上皮細胞などに対して標的化され得る。

ＨＳＶ１／２は、エピソーム形態においてニューロン内で安定した潜伏感染期を形成し、潜伏ＤＮＡは（ＨＢＶと同様に）ヌクレオソーム及び他の転写制御機構と複合体を形成する。ニューロンを効率的に標的とするＡＡＶサブタイプ（ＡＡＶ２）が存在し、これは、良好な標的である。ＨＰＶは、基底ケラチノサイトにおけるにおいて低コピー数のエピソームＤＮＡ形態を有し、分化としての複製の活性化は扁平上皮層内で生じる；これらの細胞の標的化は、粘膜部位がに到達可能なので比較的容易であり、本明細書で議論されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用いることによって、検出後早期に行えばウイルス伝播を停止し得る。植物ウイルスも適切な標的である。従って、ＨＢＶに関する本明細書における研究は、他の哺乳類又はヒトウイルス及び植物ウイルスに容易に拡張可能である。

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Ｇａｒｎｅａｕ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｌｅａｖｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ４６８，６７−７１（２０１０）．
Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆Ｓｉｋｓｎｙｓ，Ｖ．Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０９，Ｅ２５７９−２５８６（２０１２）．
Ｇｅｕｒｔｓ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｒａｔｓ ｖｉａ Ｅｍｂｒｙｏ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５，４３３−４３３（２００９）．
Ｇｌｅｂｅ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅ−Ｓ１ Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｐａｉａ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７，９５１１−９５２１（２００３）．
Ｇｒａｙ ＳＪ，Ｆｏｔｉ ＳＢ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＪＷ，Ｂａｃｈａｂｏｉｎａ Ｌ，Ｔａｙｌｏｒ−Ｂｌａｋｅ Ｂ，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｊ，Ｅｈｌｅｒｓ ＭＤ，Ｚｙｌｋａ ＭＪ，ＭｃＣｏｗｎ ＴＪ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ．Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３−５３．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．２４５．
Ｇｕｓｃｈｉｎ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９，２４７−２５６（２０１０）．
Ｈａｓｔｙ，Ｐ．，Ｒｉｖｅｒａ−Ｐｅｒｅｚ，Ｊ．＆ Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１，５５８６−５５９１（１９９１）．
Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｐ．＆ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｒ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ，ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７，１６７−１７０（２０１０）．
Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３，６０３−６１０（２０１２）．
Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２２７−２２９（２０１３）．
Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ，Ｄ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．＆ Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１，２３３−２３９（２０１３）．
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−８２１（２０１２）．
Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ｅＬｉｆｅ ２，ｅ００４７１（２０１３）．
Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｂｏｒｎｅ ＧＡＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ Ｉ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２００７ Ｊｕｎ ２３；３６９（９５７９）：２０９７−１０５．
Ｌｅｖｉｔｔ Ｎ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｄ．Ｇｉｌ Ａ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ｎ．Ｊ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙ（Ａ）ｓｉｔｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９８９；３：１０１９−１０２５．
Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ｓｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｔｏ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｓ ｂｙ ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９２，３３６−３５０（２００５）．
Ｌｉｎ Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍｓ ｈａｖｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２，７４７３−７４８５（２０１４）．
Ｌｉｕ Ｄ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｉ．Ｔｗｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄｉｒｅｃｔ ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ｂ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６ Ａｕｇ １５；１６（１６）：５０２６−３６．
Ｌｏｐｅｓ，Ｖ．Ｓ．，ｅｔｃ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｌａｒｇｅ ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃａｉｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１３ Ｊａｎ ２４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ ２０１３．３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅ ｎｏｖｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）ｈｙｂｒｉｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｒｅａｔｅｓ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８，２６２３−２６２８（２０１１）．
Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９，４６７−４７７（２０１１）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
ＭｃＣｌｕｒｅ Ｃ，Ｃｏｌｅ ＫＬ，Ｗｕｌｆｆ Ｐ，Ｋｌｕｇｍａｎｎ Ｍ，Ｍｕｒｒａｙ ＡＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１１ Ｎｏｖ ２７；（５７）：ｅ３３４８．ｄｏｉ：１０．３７９１／３３４８．
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｕｄ“Ｄｉｅ ｋｉｎｅｔｉｋ ｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｉｎｗｉｒｋｕｎｇ．”．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｚ（１９１３）．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，７７８−７８５（２００７）．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４３−１４８（２０１１）．
Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０１（２００９）．Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ．＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６３（２００３）．
Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９２８３−９２９３（２０１１）．
Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ Ｄｅｃ ２２；３６５（２５）：２３５７−６５．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１１０８０４６．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｄｅｃ １０．
Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｔ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７５，１７６−１８１（２０１２）．
Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，８０８−８１６（２００８）．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３−１１８３（２０１３）．
ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）
Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）．
Ｓａｌｅｈ−Ｇｏｈａｒｉ，Ｎ．＆ Ｈｅｌｌｅｄａｙ，Ｔ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｐａｉｒｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２，３６８３−３６８８（２００４）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７−６９（２０１１）．
Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ７，１７１−１９２（２０１２）．
Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５−９２８２（２０１１）．
Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３，７２０−７２３（２０１３）．
Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．，Ｇｒｅｇｇ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｏｇｇｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｏｒａｌｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ．＆ Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｒ．Ｓ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｌｏｃｕｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３１７，２３０−２３４（１９８５）．
Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ａｔ ｔｗｏ ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ １４６，３１８−３３１（２０１１）．
Ｔａｋａｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍＲＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌｅｃ ４０，７５９−７６５（２０１０）．
Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６．
Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ．＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ４４，４１９−４２８（１９８６）．
Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０，４４６−４４８（２００２）．
Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｓ．＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１，６３６−６４６（２０１０）．
Ｖａｌｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７，３８４２７−３８４３２（２０１２）．
Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５３，９１０−９１８（２０１３）．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｅｍｉｍｅｔａｂｏｌｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ａｎｄ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３（２０１２）．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｔｈｅ ｌａｗ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｊ Ａｍ Ｓｔａｔ Ａｓｓｏｃ ２２，２０９−２１２（１９２７）．
Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＺＦＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，３０７（２０１１）．
Ｗｕ，Ｓ．，Ｙｉｎｇ，Ｇ．Ｘ．，Ｗｕ，Ｑ．＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３，１０５６−１０７６（２００８）．
Ｙａｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ Ｄ ｖｉｒｕｓ．ｅＬｉｆｅ １，（２０１２）．
Ｚｈａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４９−１５３（２０１１）．

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、当業者には、このような実施形態が単なる例として示されることは明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく様々なバリエーション、変形形態、及び置換形態にすぐに想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な変更形態を本発明の実施に利用できることを理解されたい。

Claims (116)

1. 目的のゲノム遺伝子座における標的Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）配列の操作による生物又は非ヒト生物の改変方法であって、
   Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
   （ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
   （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
   （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
   を含むポリヌクレオチド配列、並びに
   ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を任意選択で含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
   ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
   を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は
   （Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
   （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
   を含むポリヌクレオチド、
   ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
   ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
   ［転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
   を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物
   を送達するステップを含む方法。
2. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又は前記ｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又は前記ｔｒａｃｒ配列をコードするポリヌクレオチドがＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ポリヌクレオチドが、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法であって、その発現のために組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、前記組成物が、
   （Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
   （ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
   （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
   （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
   を含むポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、並びに
   ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を任意選択で含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント
   ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
   構成成分Ｉ及びＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
   を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は
   （Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
   （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
   に機能的に連結された第１の調節エレメント、
   ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びに
   ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント
   ［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
   を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物
   を含む、方法。
6. 前記ウイルスベクターの１つ又は複数が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される、請求項５に記載の方法。
7. それを必要としている対象又は非ヒト対象において、目的のゲノム遺伝子座の標的ＨＢＶ配列の欠損により引き起こされる病態を処置又は阻害する方法であって、前記標的ＨＢＶ配列の操作による前記対象又は非ヒト対象の改変を含み、前記病態が、
   その発現のために組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含むＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
   を含む処置の提供を含む前記標的ＨＢＶ配列の操作による処置又は阻害に対して感受性であり、前記標的ＨＢＶ配列が発現時に前記組成物によって操作され、前記組成物が、
   （Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
   （ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
   （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
   （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
   を含むポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、並びに
   ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント
   ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
   構成成分Ｉ及びＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
   を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は
   （Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
   （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
   に機能的に連結された第１の調節エレメント、
   ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、及び
   ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント
   ［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
   前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］
   を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物
   を含む、方法。
8. 前記方法がｉｎ ｖｉｔｒｏ、及び／又はｅｘ ｖｉｖｏで実行される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 発現を誘導するステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記生物又は対象が真核生物、好ましくは非ヒト真核生物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記生物又は対象が非ヒト真核生物である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記生物又は対象が哺乳類又は非ヒト哺乳類である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記ウイルスベクターがＡＡＶ又はレンチウイルスベクターである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ガイド配列の発現がＴ７プロモーターの制御下にあり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によって駆動される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを細胞に送達するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素の送達方法。
17. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを前記細胞に送達することによって、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド又は酵素コード配列が細胞に送達される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ＡＡＶ又はレンチウイルスをコードする核酸分子を含有するか、又はこれらから本質的になるプラスミドをＡＡＶ感染又はレンチウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップと、ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに不可欠なＡＡＶ ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ及び／又はヘルパー核酸分子を供給するステップとを含む、請求項７に記載のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターの調製方法。
19. 前記ＡＡＶ又はレンチウイルスをコードする核酸分子を含有するか、又は本質的にこれらからなるプラスミドをＡＡＶ感染又はレンチウイルス感染細胞にトランスフェクトするステップと、ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに不可欠なＡＡＶ ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐ及び／又はヘルパー核酸分子を供給するステップとを含む、請求項７に記載の方法において使用するためのＡＡＶ又はレンチウイルスベクターの調製方法。
20. ＡＡＶ又はレンチウイルスの複製及びパッケージングに不可欠な前記ＡＡＶ又はレンチウイルスｒｅｐ及び／又はｃａｐが、ヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスにより前記細胞をトランスフェクトすることによって供給される、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記ヘルパーウイルスがポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス又はバキュロウイルスである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記細胞が昆虫細胞であり、前記ヘルパーウイルス（存在する場合）がバキュロウイルスである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記標的ＨＢＶ配列が、５’−ＮＲＧ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドである）によってその３’末端で隣接されるか、又は前記５’−ＮＲＧに後続され、そして前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（あるいは、これらに由来する）、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
26. 医薬又は治療において使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
27. 目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の操作による生物又は非ヒト生物の改変方法において、あるいは目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の欠損によって引き起こされる病態の処置又は阻害方法において使用するための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
28. ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子又はゲノム編集における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
29. ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子又はゲノム編集のための薬剤の調製における、あるいは目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の操作による生物又は非ヒト生物の改変方法において使用するため、あるいは目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の欠損によって引き起こされる病態の処置又は阻害方法における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
30. 医薬又は治療において使用するため；あるいは目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の操作による生物又は非ヒト生物の改変方法において使用するため；あるいは目的のゲノム遺伝子座における標的ＨＢＶ配列の欠損によって引き起こされる病態の処置又は阻害方法において使用するため；あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子又はゲノム編集において使用するための、
    Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列
    を含むポリヌクレオチド配列、並びに
    ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を任意選択で含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
    ［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的ＨＢＶ配列との配列特異的結合を誘導し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］を含む組成物、又は
    （Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    を含むポリヌクレオチド、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
    ［転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）配列との配列特異的結合を誘導し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）前記標的ＨＢＶ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］を含む組成物。
31. 前記ポリヌクレオチドが１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項３０に記載の組成物。
32. 前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡがキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
33. 前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、複数のキメラ及び／又は複数のマルチガイド配列及び単一のｔｒａｃｒ配列をさらに含む多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
34. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列の位置において一方又は両方の鎖の切断を誘導するヌクレアーゼである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
35. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
36. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、１つ以上の突然変異Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａを含む、請求項３５に記載の方法、使用又は組成物。
37. 前記１つ以上の突然変異が前記ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１ドメイン内にある、請求項３５に記載の方法、使用又は組成物。
38. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、前記標的配列の位置における切断を誘導するニッカーゼである、請求項３４に記載の方法、使用又は組成物。
39. 前記ニッカーゼが二重ニッカーゼである、請求項３８に記載の方法、使用又は組成物。
40. 少なくとも２つ以上のＮＬＳをさらに含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
41. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が触媒ドメイン内に１つ以上の突然変異を有し、転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、前記酵素が機能ドメインをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法、使用又は組成物。
42. 前記機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項４１に記載の方法、使用又は組成物。
43. 前記転写活性化ドメインがＶＰ６４である、請求項４２に記載の方法、使用又は組成物。
44. 細胞内の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１及び第２の標的配列の操作によりオフターゲット改変を最小限にすることをさらに含む方法であって、
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
    （ａ）前記第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
    （ｂ）第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、
    （ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列、
    （ｄ）前記第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
    （ｅ）第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｆ）第２のｔｒａｃｒ配列
    を含み、任意選択で、前記第１のｔｒａｃｒ配列と前記第２のガイド配列との間にリンカー配列が存在し、それにより前記第１のガイド配列及び前記第２のガイド配列がタンデムであるポリヌクレオチド配列、並びに
    ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
    ［（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）は５’から３’への方向に並び、前記ポリヌクレオチド配列は、前記第１のｔｒａｃｒ配列と前記第２のガイド配列との間のリンカー配列を含み、それにより前記第１のガイド配列及び前記第２のガイド配列がタンデムであり、転写されると前記第１及び前記第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が、前記第１及び第２のｔｒａｃｒ配列にそれぞれハイブリダイズし、かつ前記第１及び前記第２のガイド配列が、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と前記第１及び第２の標的配列との配列特異的結合をそれぞれ誘導する］
    又は
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント
    ［構成成分Ｉ及びＩＩは前記系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると前記第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記第１及び前記第２のガイド配列が、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と前記第１及び第２の標的配列との配列特異的結合をそれぞれ誘導する］
    を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み
    前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記第１の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記第１のガイド配列、及び（２）前記第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記第２の標的配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記第２のガイド配列、及び（２）前記第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするか又はハイブリダイズ可能な前記第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成した前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、
    前記第１のガイド配列が前記第１の標的配列の近傍で前記ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、前記第２のガイド配列が前記第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより、オフターゲット改変を最小限にすることによって前記生物又は前記非ヒト生物を改変する、請求項１〜２５又は３２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 真核細胞への送達のための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系であって、
    前記ベクターが、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；（ｉｉ）前記細胞内のウイルスゲノム中の標的配列にハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ；及び（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列；及び（ｉｖ）ｔｒａｃｒ配列をコードし、
    前記細胞内で発現されると、前記ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（ａ）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｂ）前記ガイドＲＮＡが前記ウイルスゲノム内のその標的配列にハイブリダイズできるように、前記ガイドＲＮＡに結合したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
46. 前記ウイルスゲノムが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）又は植物ウイルスである、請求項４５に記載の系。
47. 前記ウイルスゲノムがＨＢＶである、請求項４６に記載の系。
48. それを必要としている個体においてウイルス感染を処置する方法であって、請求項４５に記載の系の有効量を投与するステップを含む方法。
49. 前記ウイルス感染がＨＢＶである、請求項４８に記載の方法。
50. 付加的なＨＢＶ処置を施すステップを含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記付加的な処置が後成的修飾因子を含む、請求項５０に記載の方法。
52. 個体のウイルス感染の処置における、あるいはウイルス感染処置のための薬剤又は医薬組成物又は処置計画の処方における、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の系の使用。
53. 真核生物の細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによる、前記細胞の改変方法であって、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体を形成することができる外因性組成物を細胞内に導入するステップを含み、前記組成物が、
    （Ａ）（ｉ）転写されると、操作すべき前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
    （ｉｉ）前記ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
    （ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部が前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
    を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列と、
    （Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が前記細胞内のＲＮＡとして存在し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が前記細胞内のタンパク質として存在する場合に、
    （ｉ）前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
    （ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
    （ｉｉｉ）前記ガイド配列が前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、前記標的ウイルス核酸の前記少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が前記複合体の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される、方法。
54. 真核生物の細胞内に導入されたときに、少なくとも１つのクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体を形成することができる外因性組成物であって、前記複合体が、前記細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸を操作することによって前記細胞を改変することができ、前記組成物が、
    （Ａ）（ｉ）転写されると、操作すべき前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
    （ｉｉ）前記ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
    （ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、転写されるとその全て又は一部が前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
    を含む、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系ポリヌクレオチド配列と、
    （Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチドと
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が前記細胞内のＲＮＡとして存在し、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が前記細胞内のタンパク質として存在する場合に、
    （ｉ）前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
    （ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
    （ｉｉｉ）前記ガイド配列が前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、前記標的ウイルス核酸の前記少なくとも１つの配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が前記複合体の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される、組成物。
55. 真核生物の細胞内に導入されたときに前記細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって前記細胞を改変することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）複合体であって、前記複合体が、
    （Ａ）（ｉ）操作すべき前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列；
    （ｉｉ）前記ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列；及び
    （ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部が前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列
    を含む、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列と、
    （Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と
    を含み、
    前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が前記細胞内に存在する場合に、
    （ｉ）前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
    （ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が形成され、そして
    （ｉｉｉ）前記ガイド配列が前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、前記標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が前記複合体の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体。
56. 真核生物の細胞内に導入されたときにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成することができる、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）
    であって、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が、前記細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって前記細胞を改変することができ、前記ｃｈｉＲＮＡが、
    （ｉ）操作すべき前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列と、
    （ｉｉ）前記ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列と、
    （ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部が前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列と
    を含み、
    前記ｃｈｉＲＮＡ及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が前記細胞内に存在する場合に、
    ａ）前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
    ｂ）前記ｃｈｉＲＮＡが前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し、
    ｃ）前記ガイド配列が前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と、前記標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が前記複合体の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子。
57. クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ）系キメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）をコードする配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド分子であって、前記ｃｈｉＲＮＡが真核生物の細胞内に導入されたときに、前記ｃｈｉＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従ってＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を形成することができ、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体が、前記細胞内の標的ウイルス核酸を操作することによって前記細胞を改変することができ、前記ｃｈｉＲＮＡが、
    （ｉ）操作すべき前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能なガイド配列と、
    （ｉｉ）前記ガイド配列に連結したトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒ）ｍａｔｅ配列と、
    （ｉｉｉ）ｔｒａｃｒ配列であって、その全て又は一部が前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列にハイブリダイズ可能であるｔｒａｃｒ配列と
    を含み、そして
    前記ｃｈｉＲＮＡ及び前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が前記細胞内に存在する場合に、
    ａ）前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列又はその一部にハイブリダイズし、
    ｂ）前記ｃｈｉＲＮＡが前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素と関連し、従って、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し、
    ｃ）前記ガイド配列が前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズし、それにより、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と前記標的ウイルス核酸の配列との配列特異的結合を誘導し、その結果、前記標的ウイルス核酸の前記配列が前記複合体の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素によって操作される、ＤＮＡポリヌクレオチド分子。
58. 前記外因性組成物の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、（ａ）ＲＮＡ又は（ｂ）ＤＮＡのいずれかを含むポリヌクレオチド配列として提供され、前記ポリヌクレオチド配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするＲＮＡの発現を誘導することができる調節エレメントに機能的に連結される、請求項５３に記載の方法又は請求項５４に記載の組成物。
59. 前記外因性組成物の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列のいずれかが（ａ）ＲＮＡ又は（ｂ）ＤＮＡのいずれかを含み、前記ポリヌクレオチド配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列の発現を誘導することができる１つ以上の調節エレメントに機能的に連結される、請求項５３に記載の方法又は請求項５４に記載の組成物。
60. 前記外因性組成物の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列のそれぞれがＲＮＡからなり、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列が、前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及び前記ｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む、請求項５９に記載の方法又は組成物。
61. 前記外因性組成物の前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列のそれぞれが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されてその発現を誘導することができる少なくとも１つの調節エレメントをさらに含むＤＮＡポリヌクレオチド配列として提供され、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及び前記ｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡポリヌクレオチド分子（ｃｈｉＲＮＡ）を含む、請求項５９に記載の方法又は組成物。
62. 前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及び前記ｔｒａｃｒ配列のそれぞれが５’から３’への方向に並ぶか、あるいは前記ガイド配列、前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及び前記ｔｒａｃｒ配列のそれぞれが３’から５’への方向に並ぶ、請求項５９〜６１のいずれか一項に記載の方法若しくは組成物、請求項５５に記載の複合体、請求項５６に記載のｃｈｉＲＮＡ、又は請求項５７に記載のＤＮＡポリヌクレオチド分子。
63. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、及び／又は（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が１つ以上の組換えウイルスベクター内に含まれる、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
64. （ａ）のポリヌクレオチド配列が（ｂ）のポリヌクレオチド配列と同じ又は異なる組換えウイルスベクターに位置する、請求項６９に記載の方法又は組成物。
65. 前記ｃｈｉＲＮＡ又は前記ＤＮＡポリヌクレオチド分子が組換えウイルスベクター内に含まれる、請求項５６に記載のｃｈｉＲＮＡ又は請求項５７に記載のＤＮＡポリヌクレオチド分子。
66. 前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、任意選択で、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＡＡＶ８ベクターなど）、又はポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスなど）である、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法、組成物、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド。
67. （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、及び／又は（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞又は遺伝子銃によって前記生物の細胞に送達される、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
68. 前記ｔｒａｃｒ配列が３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド、又は５０以上のヌクレオチド長である、請求項５３〜６７のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
69. 前記ｔｒａｃｒ配列と前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と間のハイブリダイゼーションが、二次構造、好ましくはヘアピンを有する転写物を生じる、請求項５３〜６８のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
70. 前記ｔｒａｃｒ配列が、二次構造、好ましくはヘアピンを形成することができる１つ以上の領域を含む、請求項６９に記載の方法又は組成物。
71. 前記ｔｒａｃｒ配列が、１つ以上のヘアピン、２つ以上のヘアピン、３つ以上のヘアピン、４つ以上のヘアピン、５つ以上のヘアピン、又は最大で５つのヘアピンを含む、請求項７０に記載の方法又は組成物。
72. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ９酵素又は生物学的に活性なその断片若しくは誘導体、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９酵素又は生物学的に活性なその断片若しくは誘導体、あるいは黄色ブドウ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素又は生物学的に活性なその断片又は誘導体である、請求項５３〜７１のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
73. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、前記生物の細胞の核において前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の蓄積を検出可能な量まで駆動することができる１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項５３〜７２のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
74. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳ、４つ以上のＮＬＳ、５つ以上のＮＬＳ、６つ以上のＮＬＳ、７つ以上のＮＬＳ、８つ以上のＮＬＳ、９つ以上のＮＬＳ、又は１０以上のＮＬＳを含む、請求項７３に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
75. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素のアミノ末端若しくはその近傍の少なくとも１つのＮＬＳ、及び／又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素のカルボキシ末端若しくはその近傍の少なくとも１つのＮＬＳを含む、請求項７３又は７４に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
76. 前記細胞内のＲＮＡとして存在する場合に、前記ガイド配列が、前記生物のゲノムに組み込まれていないエピソーム核酸分子内に含まれる前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能であり、前記操作が前記エピソームウイルス核酸分子の操作であり、好ましくは、前記エピソーム核酸分子が二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子である、請求項５３〜７５のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
77. 前記エピソームウイルス核酸分子が共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）である、請求項７６に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
78. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、前記生物の細胞内のエピソームウイルス核酸分子の量を、前記複合体を提供しない場合の前記生物の細胞内のエピソームウイルス核酸分子の量と比較して低減することができる、請求項７６又は７７に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
79. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が前記エピソーム核酸分子を操作して、前記エピソーム核酸分子の分解を促進することができる、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
80. 前記細胞内のＲＮＡとして存在する場合に、前記ガイド配列が、前記生物のゲノムに組み込まれた前記標的ウイルス核酸の配列にハイブリダイズ可能であり、前記操作が、前記組み込まれた標的核酸の操作である、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
81. 前記細胞内で形成されたときに、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が前記組み込まれた核酸を操作して、前記生物のゲノムからの前記標的ウイルス核酸の全て又は一部の切除を促進することができる、請求項８０に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
82. 請求項５４〜６６又は請求項６８〜８１のいずれか一項に記載の組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子の、真核生物の細胞内の少なくとも１つの標的ウイルス核酸の操作における使用。
83. 前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸が、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドｃｃｃＤＮＡ分子及び／又は前記生物のゲノム内に組み込まれたウイルスＤＮＡ内に含まれ、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体による前記少なくとも１つの標的ウイルス核酸の操作が、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡの切断を含む、請求項５３〜８２のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
84. 前記切断が、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡ内に導入された１つ以上の二本鎖切断、任意選択で少なくとも２つの二本鎖切断を含む、請求項８３に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
85. 前記切断が、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡ内に導入された１つ以上の一本鎖切断、任意選択で少なくとも２つの一本鎖切断によるものである、請求項８３に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
86. 前記１つ以上の二本鎖切断、あるいは前記１つ以上の一本鎖切断が、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列における１つ以上の挿入及び欠失突然変異（ＩＮＤＥＬ）の形成をもたらす、請求項８４又は８５に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
87. 前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は前記生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の切断が、前記ｃｃｃＤＮＡからのウイルスポリヌクレオチド配列の切除をもたらし、それによりウイルス感染が低減されるか、あるいは前記生物のゲノムからのウイルスＤＮＡ配列の切除をもたらし、それによりウイルス感染が低減される、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
88. 前記組成物が少なくとも２つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分を含み、各タイプの複合体が、前記標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み、前記切断が、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ内及び／又は前記生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡ内若しくはそれに隣接して導入された少なくとも２つの二本鎖切断による、前記ウイルスＤＮＡの第１及び第２の鎖の切断であり、
    第１の二本鎖切断が第１の標的配列の操作により前記ＤＮＡの第１の位置において導入され、第２の二本鎖切断が第２の標的配列の操作により前記ＤＮＡの第２の位置において導入され、
    第１及び第２の二本鎖切断が導入されると、第１の二本鎖切断と第２の二本鎖切断との間のウイルス配列が、ｃｃｃＤＮＡ及び／又は前記生物のゲノムＤＮＡから切除される、
    請求項８７に記載の方法又は組成物。
89. 前記組成物が少なくとも４つのタイプのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分を含み、各タイプの複合体が、前記標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含み、前記切断が、前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ内に導入された、及び／又は前記生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡ内若しくはそれに隣接して導入された少なくとも２対の一本鎖切断によるものであり、
    第１の対の一本鎖切断を導入するために、第１の標的配列を操作して第１のニックを形成することにより第１の一本鎖切断がＤＮＡの第１の鎖内に導入され、第２の標的配列を操作して第２のニックを形成することにより第２の一本鎖切断がＤＮＡの反対の鎖内に導入され、
    第２の対の一本鎖切断を導入するために、第３の標的配列を操作して第３のニックを形成することにより第３の一本鎖切断が前記ＤＮＡの第１の鎖内に導入され、第４の標的配列を操作して第４のニックを形成することにより第４の一本鎖切断が前記ＤＮＡの反対の鎖内に導入され、
    第１及び第２の対の一本鎖切断が導入されると、第１の対と第２の対の一本鎖切断の間のウイルス配列が、ｃｃｃＤＮＡ及び／又は前記生物のゲノムＤＮＡから切除される、
    請求項８７に記載の方法又は組成物。
90. 前記第１及び第２のニックが少なくとも１つの塩基対によって互いに対してオフセットされ、従って第１のオーバーハングが作成され、前記第３及び第４のニックが少なくとも１つの塩基対によって互いに対してオフセットされ、従って第２のオーバーハングが作成される、請求項８９に記載の方法又は組成物。
91. ウイルス配列の切除に続いて、切断された前記ＤＮＡの第１の鎖の末端が共に連結され、切断された前記ＤＮＡの第２の鎖が共に連結され、従って壊れていない第１及び第２の鎖が再形成される、請求項８８、８９又は９０のいずれか一項に記載の組成物。
92. 前記一本鎖切断が、Ｃａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼドメイン又はＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの触媒不活性化をもたらす置換を含む改変Ｃａｓ９酵素であるニッカーゼ酵素によってＤＮＡ内に導入され；任意選択で、前記置換がＳｐＣａｓ９のＤ１０位における置換であり、好ましくは、ＳｐＣａｓ９関連酵素のＤ１０Ａ置換又はＤ１０位に対応する残基の置換であるか、あるいは前記置換がＳｐＣａｓ９のＨ８４０位における置換であり、好ましくは、ＳｐＣａｓ９関連酵素のＨ８４０Ａ置換又はＨ８４０位に対応する残基の置換である、請求項８５〜８７、８９、９０又は９１のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
93. 前記標的ウイルス核酸がｃｃｃＤＮＡ及び／又は前記生物のゲノムに組み込まれたウイルスＤＮＡであり、前記操作が、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列内への又はそれに隣接した１つ以上のヌクレオチドの挿入、ウイルスｃｃｃＤＮＡ又は組み込まれたウイルスＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドの欠失、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の転座、ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の転写の抑制、及び／又はウイルスｃｃｃＤＮＡ配列又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の不活性化を含む、請求項５３〜８２のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
94. 前記ウイルスｃｃｃＤＮＡ配列及び／又は組み込まれたウイルスＤＮＡ配列の転写の抑制が、１つ以上の転写リプレッサードメインに融合されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によってもたらされ、任意選択で、前記１つ以上の転写リプレッサードメインがＫＲＡＢ、ＳＩＤ及び／又はＳＩＤ４Ｘを含み、好ましくは前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９酵素である、請求項９２に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
95. ウイルスｃｃｃＤＮＡ又は組み込まれたウイルスＤＮＡのヌクレオチド配列の前記操作が、１つ以上のウイルスオープンリーディングフレームの破壊、ウイルスｍＲＮＡ発現の破壊及び／又は機能性ビリオンの産生の阻害をもたらす、請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
96. 前記ウイルスｃｃｃＤＮＡの操作が、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が存在しない場合のレベルと比較して、ウイルスｒｃＤＮＡ、ウイルスｃｃｃＤＮＡ及びウイルスｓｓＤＮＡの１つ以上のレベルの低下をもたらす、請求項８３〜９３のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
97. 前記操作の効果が新しいビリオンの産生の阻害を含む、請求項８３〜９５のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
98. 前記改変の効果が、前記生物からウイルス配列を除去し、それによりウイルス感染を低減することを含む、請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
99. 前記組成物が１つ以上の付加的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の構成成分をさらに含み、各タイプの複合体が、前記細胞内の前記標的核酸の異なる配列にハイブリダイズ可能な異なるガイド配列を含む、請求項５３、５４、５８〜８７及び９３〜９８のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
100. 前記標的ウイルス核酸がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）核酸であり、好ましくは前記細胞がタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）を発現するか、あるいは前記細胞が肝細胞、好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細胞又はヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５又はＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞である、請求項５３〜９９のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
101. 前記ガイド配列が、ＨＢＶ あＯＲＦ Ｓ、ＯＲＦ Ｃ、ＯＲＦ Ｐ、又はＯＲＦ Ｘ、好ましくはＯＲＦ Ｃの標的ウイルス核酸とハイブリダイズ可能である、請求項１００に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
102. 前記ガイド配列の配列が、５’−ｇｇｇｃｇｃａｃｃｔｃｔｃｔｔｔａｃｇ−３’、５’−ｃｃｔｃｔｇｃｃｇａｔｃｃａｔａｃｔｇ−３’又は５’−ｔａａａｇａａｔｔｔｇｇａｇｃｔａｃｔｇ−３’を含む、請求項１００又は１０１に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
103. 前記標的ウイルス核酸が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）核酸、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）核酸又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）核酸である、請求項５３〜９９のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
104. 前記操作がｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで実施される、請求項５３〜１０３のいずれか一項に記載の方法、組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ、ＤＮＡポリヌクレオチド分子又は使用。
105. 薬剤として使用するための、請求項５４〜６６及び６８〜９９のいずれか一項に記載の組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
106. ウイルス感染の処置において使用するための、請求項５４〜６６及び６８〜９９のいずれか一項に記載の組成物、複合体又はｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
107. 前記ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる、請求項１０６に記載の使用のための組成物、複合体又はｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
108. 前記ウイルス感染が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によって引き起こされる、請求項１０６に記載の使用のための組成物、複合体又はｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
109. 前記生物が哺乳類である、請求項１０４〜１０８のいずれか一項に記載の使用のための組成物、複合体又はｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
110. 前記哺乳類がヒトである、請求項１０９に記載の使用のための組成物、複合体又はｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡポリヌクレオチド分子。
111. 請求項５４〜６６又は６８〜９９のいずれか一項に記載の組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡの、薬剤の製造における使用。
112. 請求項５４〜６６又は６８〜９９のいずれか一項に記載の組成物、複合体、ｃｈｉＲＮＡ又はＤＮＡの、ウイルス感染の処置のための薬剤の製造における使用。
113. 前記ウイルス感染がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）によって引き起こされる、請求項１１２に記載の使用。
114. 前記ウイルス感染が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）又は水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によって引き起こされる、請求項１１２に記載の使用。
115. 前記生物が哺乳類である、請求項１１１〜１１４のいずれか一項に記載の使用。
116. 前記哺乳類がヒトである、請求項１１５に記載の使用。