JP2016520088A - Ｉｌ−２１抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＩＬ−２１に対する高い結合親和力を有しかつヒトＩＬ−２１を中和する改変された、ヒト化抗体、抗体を用いて自己免疫性状態などの、ＩＬ−２１の影響の拮抗作用または中和が保証される状態を治療する方法、抗体を組換え産生するための組成物および方法、ならびに抗体を含む医薬組成物に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＩＬ−２１に対する高い結合親和力を有しかつヒトＩＬ−２１を中和する改変された、ヒト化抗体、自己免疫性状態などの、ＩＬ−２１の影響の拮抗作用または中和が保証される状態を治療するために抗体を用いる方法、抗体を組換え産生するための組成物および方法、ならびに抗体を含む医薬組成物に関する。

特許文献１は、ヒトＩＬ−２１に結合して中和すると言われている遺伝子導入マウスから導かれたヒト抗体を開示している。特定の抗体は、クローン３６２．７８から導かれた物である。

非特許文献１は、クローン３６２．７８から導かれた抗体を含めた、ヒトＩｇＧ遺伝子導入マウスから導かれたヒト抗ヒトＩＬ−２１モノクローナル抗体のパネルの生成および初期特性評価について記述している。特許文献１、特許文献２およびＭａｕｒｅｒらの、すなわちＮＮ８８２８およびＮＮＣ１１４−０００６またはＮＮＣ−００００−０００６とも呼ばれる、「ｍＡｂ ３６２．７８」に記載されている抗ＩＬ−２１抗体の臨床研究が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびクローン病を有する患者において行われた。

特許文献３は、モノクローナル抗体３６２．７８（ＮＮＣ ０１１４−０００５）のＦａｂフラグメントとの複合体におけるヒトＩＬ−２１の結晶構造が（その抗体は以前に特許文献１において言及されている）、形成されてＸ線法を用いて分析されたことを述べている。

本明細書に開示される本発明は、上述の抗ＩＬ−２１抗体の代替手段を提供することを目指す。抗体は潜在的に、それらのために利用可能な治療がほとんど無く世界的な医学的必要性が残されている、例えば原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グレーブス病、１型糖尿病、ならびにその他の自己免疫性状態または疾患の治療に高度に適している。患者のための手当ての現在標準よりも安全なプロファイルを有するより効果的な治療の強い必要性がある。

国際公開第２０１０／０５５３６６号 米国特許出願公開第２０１３０３２３２５９（Ａ１）号 国際公開第２０１２／０９８１１３号

Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．ら著、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩＬ−２１ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，４ ＭＡｂｓ ６９（２０１２年）」

具体的には、本発明は、本明細書においてＡｂ３２７と呼ばれる抗体の改変およびヒト化された重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、重鎖および軽鎖可変ドメインとして有する抗体を提供する。

本発明は、以下の特性：１）ヒトＩＬ−２１およびカニクイザルＩＬ−２１に高親和力で結合する（ＫｉｎＥｘＡ溶液平衡結合によって３７℃において、それぞれ、Ｋ_Ｄ＝０．８±０．５ｘ１０^−１２Ｍおよび０．３±０．１ｘ１０^−１２Ｍ、）、２）マウスおよびラットＩＬ−２１にあまり大きくない親和力で結合する（ＫｉｎＥｘＡ溶液平衡結合によって３７℃において、それぞれ、Ｋ_Ｄ＝２．４±１．３ｘ１０^−７および２．３±０．２ｘ１０^−７Ｍ）、３）いかなる他のヒト共通γ鎖ファミリーメンバー（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５）にも実質的に結合しない、４）陽性の対照、ｈＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃコンストラクトより約６倍低いＩＣ５０を有する特定のｐａｎ−ＳＴＡＴ−ＩＭ９−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１活性を中和する（それぞれ、約４６．７ｐＭおよび−４１ｐＭ対約２７１ｐＭ）、５）ｉｎ ｖｉｔｒｏで約１．１５ｎＭのＩＣ５０で一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導増殖を中和する、６）ｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導形質細胞分化を中和する、７）ヒトＩＬ−２１を注入したマウスにおける脾臓（Ｂ細胞およびＴ細胞の亜集団を含む）において幾つかの細胞種の急速かつ一過的な膨張を有効に遮断する、ならびに／あるいは８）医薬品の製造、貯蔵、および治療的使用のために十分に安定である、のうちの１つまたは複数を有する抗体を提供する。

本発明の第１の態様に従って重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むヒトＩＬ−２１に結合する抗体であって、ＬＣＶＲが、ＣＤＲＬ１において配列番号７、ＣＤＲＬ２において配列番号８およびＣＤＲＬ３において配列番号９を含みかつＨＣＶＲが、ＣＤＲＨ１において配列番号１０、ＣＤＲＨ２において配列番号１１およびＣＤＲＨ３において配列番号１２を含む抗体を提供する。

好ましくは本発明による抗体は、重鎖が、配列番号１を有するＨＣＶＲを含みかつ軽鎖が、配列番号２を有するＬＣＶＲを含む、抗体重鎖および抗体軽鎖を含む。

本発明は、それぞれの重鎖が、そのアミノ酸配列が配列番号１の配列である、重鎖可変ドメインを含み、かつそれぞれの軽鎖が、そのアミノ酸配列が配列番号２の配列である、軽鎖可変ドメインを含む、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖を含むヒトＩＬ−２１に結合する抗体をさらに提供する。

好ましくは、それぞれの重鎖が、そのアミノ酸配列が配列番号１の配列である、重鎖可変ドメインを含み、かつそれぞれの軽鎖が、そのアミノ酸配列が配列番号２の配列である、軽鎖可変ドメインを含む、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる本発明抗体の抗体が提供される。

１つの特定の実施形態は、そのそれぞれの重鎖のアミノ酸配列が、配列番号３の配列でありかつそのそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４の配列である、ヒトＩＬ−２１に改変およびヒト化された抗体、Ａｂ３２７抗体である。

本発明は、本発明の抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供する。

本発明は、本発明の抗体を発現するために本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ分子も含む。具体的には、本発明の別の態様に従ってそのアミノ酸配列が配列番号３の配列である抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子が提供される。本発明は、その配列が配列番号５の配列であるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子も提供する。このポリヌクレオチド配列は、抗体重鎖に相当する。

本発明のさらなる態様に従ってそのアミノ酸配列が配列番号４の配列である抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子が提供される。本発明は、その配列が配列番号６の配列であるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子をさらに提供する。このポリヌクレオチド配列は、抗体軽鎖に相当する。

本発明のさらなる態様に従って、そのアミノ酸配列が配列番号３の配列である抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含みかつそのアミノ酸配列が配列番号４の配列である抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子が提供される。本発明は、その配列が配列番号５の配列であるポリヌクレオチドを含みかつその配列が配列番号６の配列であるポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子をさらに提供する。

本発明は、組み替え手段によって本発明の抗体を発現するための哺乳動物細胞を含む。具体的には、本発明は、上述の本発明のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を提供する。

本発明の別の態様は、抗体が、２つの抗体重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、２つの重鎖のそれぞれのアミノ配列が、配列番号３の配列でありかつ２つの軽鎖のそれぞれアミノ酸配列が、配列番号４の配列であり、かつプロセスが、ａ）抗体が発現するような条件下で、上で述べた通りの、本発明の哺乳動物細胞を培養すること、およびｂ）発現した抗体を回収することを含む、抗体を産生するためのプロセスを含む。本発明は、すぐ上で述べた通りの本発明のプロセスによって取得可能な抗体を含む。

本発明は、特に自己免疫性（ＡＩ）状態、特に原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病治療するための、抗体を用いる方法、抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、宿主細胞を形質転換するためおよび抗体を発現するためのヌクレオチドを含むベクター、抗体を発現するための宿主細胞、哺乳動物宿主系において組み換え発現のプロセスによって調製された抗体、ならびに抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む抗体の医薬組成物を調製する方法を含む。

抗体に関して想定される特定の使用は、ＡＩ状態、具体的には原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病などのＡＩ状態の治療である。本発明は、自己免疫性状態の治療、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病の治療、および特に原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）または全身性エリテマトーデスの治療における、療法における使用のための抗体を含む。本発明は、自己免疫性状態の治療における使用のため；原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病の治療における使用のため；原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）を治療するため；または全身性エリテマトーデスを治療するための薬物の製造のための本発明の抗体の使用を含む。具体的には、本発明は、自己免疫性状態；原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病；原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）、または全身性エリテマトーデスの治療のための薬物の製造における本発明の抗体の使用を含む。

ＥＬＩＳＡによるＡｂ３２７のヒトＩＬ−２１およびヒト共通ガンマ鎖受容体に結合する他のリガンドへの結合が示される。 Ａｂ３２７がｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導増殖を中和することが示される。 ＩＬ−２１抗体またはアイソタイプ対照抗体で４２日間処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植された重度免疫不全状態ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγ ｎｕｌｌ）におけるベースラインからの体重変化の平均パーセントである。矢印によって示された点において処置が行われた。記号：−■−Ａｂ３２７（１０ｍｇ／ｋｇ）、−−▼−−Ａｂ３２７（１ｍｇ／ｋｇ）、−−□−−、アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）、−●−移植無し。 ＩＬ−２１抗体またはアイソタイプ対照抗体で処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植された重度免疫不全状態ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγ ｎｕｌｌ）におけるベースラインからの体重変化の平均パーセントである。矢印によって示された点において処置が行われた。記号：−■−Ａｂ３２７（１０ｍｇ／ｋｇ）、−−□−−、アイソタイプ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）、−●−移植無し。 抗マウスＩＬ−２１抗体での処置がＮＯＤマウスの唾液腺におけるリンパ球浸潤を軽減したことが、ｍＲＮＡ分析によって示される。 抗マウスＩＬ−２１抗体での処置がＮＯＤマウスの唾液腺におけるリンパ球浸潤を軽減したことが、組織学的分析（リンパ球の略図が描れている）によって示される。 図７Ａおよび７Ｂは、代理抗体７２８が、ＮＯＤマウスにおける自己免疫性糖尿病発症を予防することが示される。処置は、７週齢（Ａ）で予防として開始または１３週齢（Ｂ）で前糖尿病期の間に開始した。糖尿病発生率は、２５０ｍｇ／ｄｌを超える２つの連続した読み取り値として１群ごとに計算されて１群当たりの糖尿病のマウスの割合として表示される（Ａ：ｍＩｇＧ１ ｎ＝１２；Ａｂ７２８ ｎ＝１２およびＢ：ｍＩｇＧ１ ｎ＝８；Ａｂ７２８ ｎ＝１１）。糖尿病発生率は、生存曲線データとして記録されログランク検定では異なる（Ａ：ｐ＝０．０００７およびＢ：ｐ＝０．００２）。

本発明の抗体の使用
インターロイキン（ＩＬ）−２１は、Ｔ細胞の種々の部分集合によって産生されてＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）と呼ばれる特異的な受容体および共通γ鎖サブユニットからなる複合受容体に結合する。ヒトＩＬ−２１は、ｉｎ ｖｉｖｏでは１６２−アミノ酸前駆体分子から産生される。成熟ヒトＩＬ−２１は、前駆体タンパク質の残基３０〜１６２（１３３アミノ酸）からなる。クラスＩサイトカインの典型である、ＩＬ−２１は、アップ−アップ−ダウン−ダウン（ｕｐ−ｕｐ−ｄｏｗｎ−ｄｏｗｎ）トポロジーに配置された４へリックス束構造を有する。前駆体１６２−アミノ酸タンパク質の番号付けを用いて、ヘリックスは、以下の残基、Ａへリックス：４１〜５６、Ｂへリックス：６９〜８４、Ｃへリックス：９２〜１０５、およびＤへリックス：１３５〜１４８からなると考えられる。この構造は、他の１型サイトカインファミリーメンバーの物と密接に関係し、最も注目すべきはＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＩＬ−１５である。

ＩＬ−２１が受容体複合体に結合するとそれに続く受容体活性化、シグナリングがＪａｋ−ＳＴＡＴシグナリング経路を通って発生する。ＩＬ−２１Ｒ鎖は、ＩＬ−２１に高親和力を有して結合して結合エネルギーの大部分を提供する。しかしながら、シグナリングのために共通γ鎖との相互作用が必要とされる。ＩＬ−２１とＩＬ−２１Ｒとの間の相互作用は、ＡおよびＣヘリックスに存在する残基によってならびにＩＬ−２１のＣへリックスの直後のＣＤループの小さい部分によって仲介される（Ｏ．Ｈａｍｍｉｎｇら、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＩＬ−２１Ｒ） Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ＩＬ−２１ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｈａｔ Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＷＳＸＷＳ Ｍｏｔｉｆ Ｉｓ Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｐａｒｔ ｏｆ ＩＬ−２１Ｒ、２８７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９４５４〜９４６０（２０１２年））。

ＩＬ−２１は、リンパ球増殖の刺激、ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＮＫ細胞の細胞毒性の促進、ならびにＢ細胞の形質細胞への分化などの、先天性および適応性免疫反応の両方に多面発現効果を有するクラスＩサイトカインである。ＩＬ−２１は、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞、特にＴｈ１７および濾胞性ヘルパーＴ細胞、ならびにナチュラルキラー細胞によって分泌される。ＩＬ−２１は、フィードフォワード機構によってＴｈ１７および濾胞性ヘルパーＴ細胞の発生の促進において重要な役割を果たす。さらには、ＩＬ−２１は、他のサイトカインと協働してＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞毒性を増加し抗原の存在下でのＣＤ８＋細胞の増殖を促進する。ＩＬ−２１は、Ｂ細胞による抗体産生にも影響を及ぼす。ＩＬ−２１は、Ｔ細胞の増殖を増大すること、Ｂ細胞の記憶細胞および最終分化形質細胞への分化を駆動すること、ならびにナチュラルキラー細胞の活性を増大することを含めた、種々の作用を有する。ある種のヒトの状態および疾患において、ＩＬ−２１の活性を遮断することは、望ましくあり得る。具体的には、ＩＬ−２１のその受容体への結合を遮断する抗体は、こうした状態および疾患を治療することにおいて望ましいであろう。

それらの特性を考えれば、本発明の抗体は、Ｔ細胞−Ｂ細胞相互作用、Ｔｈ１７細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、形質細胞および活性化ＣＤ８ならびにＮＫ細胞が支配的病原性役割を果たす自己免疫性状態または疾患の治療に潜在的に高度に適している。この分類にすぐに適合する疾患は、そのために利用可能な治療がほとんど無く世界的に大きな医学的必要性が残されている、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、シェーグレン症候群（ＳＳ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。他の潜在的な適応症には、グレーブス病および１型糖尿病が含まれる。

シェーグレン症候群は、ゆっくり進行する全身性自己免疫性疾患であり、人口の０．５〜１．０％に見られ、主として中年期女性に影響を及ぼすが、いかなる年齢ならびに男性および女性の両方においても発生し得る。原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）およびシェーグレン症候群（ＳＳ）は、外分泌腺、特に唾液腺および涙腺の慢性炎症によって特徴付けられる。ｐＳＳの主な特色は、口腔および目の乾燥（「乾燥症候群」）であり組織学的特徴は、口唇小唾液腺生検によって判定され得る、外分泌腺の局所リンパ球浸潤である。乾燥の特色は、生活の質に影響しかつ関係する粘膜における局所合併症を引き起こす。ひどい口渇は、不快かつ支障を来す状態である。しかしながら、腺外の徴候は、多くの患者において発生しかつほとんどどの器官にも関与し得る。現在はｐＳＳおよびＳＳを治療するための承認された疾患変更剤が無い。薬物療法は、症状に対処し支持療法を提供する。ｐＳＳおよびＳＳを有する患者のためにより安全なプロファイルを備えたより有効な療法が必要である。本発明の抗体を用いた薬理学的介在は、ｐＳＳおよびＳＳ病因に因果的に関係すると思われる調節不全の免疫系の幾つかの態様に影響する可能性があり、したがって患者に著しい臨床的利益を提供し得る。本療法は、慢性的（非特異的）免疫抑制剤の必要性も減少して、ｐＳＳおよびＳＳ患者のために生活の質の改善を提供し得る。

治療および投与
「治療」、「治療する」または「治療すること」および同類の語は、患者における既存の症状、状態、疾患、または障害の進行または重症度を抑制する、遅らせる、停止する、または後退させることを含む。「患者」と言う語は、ヒトを指す。「有効量」と言う語は、患者への単一または複数用量投与の際の、患者において所望の効果を提供する、本発明の抗体の量または用量を指す。有効量は、当業者としての、担当診断医または医療専門家によって既知の技術を用いることによっておよび観察結果によって容易に決定され得る。患者のための有効量の決定において、患者のサイズ、年齢、および全体的な健康；関与する特異的な疾患または障害；疾患、状態、または障害の重症度；個々の患者の反応；投与の仕方；投与された調製物の生物学的利用能特性；選択された用法；併用薬の使用；ならびに他の関係要因を含めた、幾つかの要因が考慮され得る。

本発明の抗体は、自己免疫性状態を治療するためにヒトへの非経口投与を対象とする。皮下および静脈内経路は、好ましい。抗体は、投与に先立って水性医薬品溶液に調合してよい。負荷静脈内用量を、医療専門家によって投与してよい。一般には、投与は、皮下注射によって行われ、患者または別の人物、例えば医療専門家のいずれかによって自己投与されることが予期される。皮下注射のために、自動注入器またはプレフィルドシリンジを用いてよい。用量は、固定−すなわち、全ての患者のために同質量の有効抗体−でもよくまたは体重（体質量）に基づいてもよい。体重（体質量）に基づくと、用量は、好ましくは患者の体重（体質量）のキログラム当たり抗体０．０１から３０ｍｇの範囲内になる。より好ましくは、用量は、患者の体重（体質量）のキログラム当たり抗体０．１から２０ｍｇの範囲内になる。投薬の頻度は、ヒトにおける実際の薬物動態学および薬力学に応じて、週に１回またはそれより少ない頻度であることが予期される。治療の期間は、多くの要因によって変わりかつ患者の診断専門医または治療する医療提供者によって、当技術分野における経験および技術に基づいて決定されるであろう。頻度および治療の期間は、適応症によって変わり得る。

本発明の抗体の構造
本発明の抗体は、全長ヒトＩｇＧ抗体のために典型的な三次および四次構造を有する。適した哺乳動物宿主細胞において生合成された場合、本発明の抗体は、重鎖が相互に結合しかつ重鎖のそれぞれに１つの軽鎖が結合した状態で、鎖が鎖内および鎖間ジスルフィド結合によって通常の方法で一緒に共有結合した、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる分子として分泌されるであろう。鎖内および鎖間ジスルフィド結合の位置は、良く知られている。

それぞれの重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、重鎖可変ドメイン、ＩｇＧ ＣＨ１、ＩｇＧ ＣＨ２、およびＩｇＧ ＣＨ３ドメインの４つのドメインを含む。ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合または２つの重鎖を接合する結合を含む。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）ドメインの２つのドメインを含む。重鎖定常ドメインは、ヒトＩｇＧ４またはその変異形であることが好ましい。軽鎖定常ドメインは、ヒトｋａｐｐａであることが好ましい。可変領域はともに、ヒトＩＬ−２１に結合するおよびヒトＩＬ−２１活性を中和する機能特性を担っている。本発明の抗体の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１および配列番号２において提供される。本発明の抗体、Ａｂ３２７の定常ドメインは、配列番号３および配列番号４内に与えられる。配列番号３のＡｓｎ２９４におけるＮ−結合型グリコシル化部位は、グリコシル化されていてよい。

抗体の重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列は、そのＣ末端において適切なヒト重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）あるいは良く知られている突然変異または安定性を改善するためもしくはエフェクター機能を減少するための突然変異を有するヒト重鎖定常ドメインの構造的に類似した変異形に融合した、本発明の重鎖可変ドメイン、配列番号１からなる。安定性および／または減少したエフェクター機能に関係した突然変異を有するヒトＩｇＧ４定常ドメインの変異形は、好ましい。配列番号３は、Ａｂ３２７の重鎖のアミノ酸配列を提供する。

軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列は、そのＣ末端において適切なヒト軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）または構造的に類似したその変異形に融合した、本発明の軽鎖可変ドメイン、配列番号２からなる。ヒトｋａｐｐａ軽鎖定常ドメインは、好ましい。配列番号４は、Ａｂ３２７の軽鎖のアミノ酸配列を提供する。Ａｂ３２７を発現するために、配列番号５および配列番号６によって与えられるＤＮＡ配列が、それぞれ、ＨＣおよびＬＣのために使用され得る。

ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ３、およびＨ２は、Ｋａｂａｔ規則に従って割り当てられかつＣＤＲ Ｌ２、Ｈ１、およびＨ３は、Ｎｏｒｔｈ規則に従って割り当てられた。Ｋａｂａｔ ＥＡら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１〜３２４２（１９９１年）、Ｎｏｒｔｈ Ｂら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１１年２月１８日、４０６（２）：２２８〜２５６。

本発明の抗体の産生
本発明の抗体は、良く知られている方法によって生合成され、精製されて、投与のために調合され得る。適切な宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３またはＣＨＯは、２種のベクターが用いられる場合は所定のＨＣ：ＬＣベクター比を用いて、または重鎖および軽鎖の両方をコードする単一ベクター系を用いて抗体を分泌するための発現系で一過的または安定的にトランスフェクトされる。これらの一般的に使用される宿主細胞からの抗体の発現および分泌に適したベクターは、良く知られている。

抗体の発現および分泌に続いて、培地は細胞を除去するために浄化されて浄化された培地は多数の一般的に使用される技術のいずれかを用いて精製される。例えば、培地は、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）などの、緩衝液で平衡化したプロテインＡカラムに適用してよい。カラムは、非特異的な結合成分を除去するために洗われる。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（例えば０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．８から０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ２．５）によって溶離される。抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって、検出され次いでプールされる。さらなる精製は、意図する使用法に応じて、任意である。抗体は、一般的な技術を用いて濃縮および／または除菌ろ過してよい。抗体以外の他の物質、例えば宿主細胞および成長培地成分、ならびに抗体の可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、陽イオン交換、陰イオン交換、アフィニティー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含めた、一般的な技術によって有効に減少または除去してよい。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、典型的には９５％より高い。産生物は、４℃で貯蔵し−７０℃で凍結するかまたは凍結乾燥してよい。

本明細書に述べる調査において用いられるＡｂ３２７は、それぞれ、配列番号５および配列番号６のＤＮＡ配列を組み込まれた別個の重鎖および軽鎖発現ＤＮＡベクターの共トランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させたか、またはそれぞれ、重鎖および軽鎖をコードする、配列番号５および配列番号６の両方のＤＮＡ配列を組み込んだ単一ＤＮＡベクターのトランスフェクション後のＣＨＯ細胞において安定的に発現させた。５日間ＨＥＫ２９３培養または１４日間ＣＨＯバルク培養のいずれかから採取された培地が浄化されて得られた粗製上清はプロテインＡ クロマトグラフィーによって精製された。プロテインＡ樹脂に結合したＡｂ３２７は、低ｐＨ緩衝液を用いて溶離された。溶離された抗体は、ＨＥＫ２９３の一過的トランスフェクションから産生した物質については、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、またはＣＨＯの安定的トランスフェクションから産生した物質のための磨き上げるステップとしてマルチモーダル陰イオン交換クロマトグラフィー（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｃａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ（登録商標） ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてさらに精製された。Ａｂ３２７の最終純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳ分析によって評価された。内毒素レベルは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ分析を用いて＜１ＥＵ／ｍｇであると分かった。精製したＡｂ３２７は、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝食塩水）、ｐＨ７．２に４℃で貯蔵された。

本発明の抗体の医薬組成物
精製された抗体は、非経口投与、特に皮下または静脈内投与用のタンパク質および抗体を調合するために良く知られている方法に従って医薬組成物に調合してよい。抗体は、適切な薬学的に許容可能な賦形剤と共に凍結乾燥し、次いで後に使用に先立って水系希釈剤で戻してよい。あるいは、抗体は、水溶液中に調合して使用の前に最大１から３年間貯蔵してよい。いずれにしても、抗体の医薬組成物の貯蔵された形態および注入された形態は、薬学的に許容可能な賦形剤または抗体以外の原料である、賦形剤を含むことになりそうである。原料が薬学的に許容可能かどうかは、その安全性および有効性または医薬組成物の安全性、純度、および効力への影響による。原料が、それがヒトへの投与のための組成物において用いられない根拠となる安全性または有効性への（あるいは安全性、純度、または効力への）好ましくない影響を十分に有すると判断された場合、それは抗体の医薬組成物において用いられるために薬学的に許容可能ではない。

抗体の溶液組成物は、典型的には水系になり、水に加えて、賦形剤、例えば緩衝系、多重使用を対象とする場合は防腐剤、キレート剤、組成物の張性をヒト組織の近似張性に調節するための等張化剤、および／または可溶化剤もしくは安定剤もしくは薬剤、例えば洗浄剤、界面活性剤、あるいは同類の物などを含んでよい。溶液における長期間貯蔵のために適切に安定な調合物を達成することは、かなり挑戦的で有り得る。溶解性ならびに化学的および物理的安定性は、実験手順の設計（ｄｅｓｉｇｎ−ｏｆ−ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて例えば、ｐＨ、種々の賦形剤の含有（または非含有）、ならびに賦形剤の種類および濃度を変化させることにより改善され得る。薬物を調合することに関する一般的な情報の出典は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙである。Ｗ．Ｗａｎｇら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，９６ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１〜２６（２００７年）は、抗体の調合に有用な一般的出典である。

本発明の種々の好ましい特色および実施形態は、ここで添付図への参照と共に非限定的な実施例およびアッセイの方法によってのみ記述される。

実施例１
Ａｂ３２７を取得するための抗体発生、改変、およびヒト化
マウス抗ヒトＩＬ−２１抗体、１５Ｈ１２を、マウス足蹠免疫化および抗ＩＬ−２１可変領域のクローン化の後に単離した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、市販品で得られるヒトＩＬ−２１で標準免疫化手順を用いて免疫化した。最終非アジュバント増強（ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔ ｂｏｏｓｔ）後３から５日間で、リンパ節および／または脾臓を採取し、単個細胞浮遊液を生成した。抗原特異的な細胞を、標準の選別法によってビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｌｙａｔｅｄ）またはフルオロフォア標識したＩＬ−２１を用いて濃縮して、マウス可変ドメインのクローン化に先立って２週間フィーダー細胞と共培養した。抗体を、抗ＩＬ−２１捕捉ＥＬＩＳＡを用いて同定してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＩＬ−２１を遮断および中和し、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１に関して約５ｐＭのＫ_Ｄを有することを示した。Ｆａｂ抗体フラグメントをヤギ抗ヒトｋａｐｐａ抗体で捕捉し次いでビオチン標識ＩＬ−２１に結合する能力についてスクリーニングし、これを今度はアルカリホスファターゼ標識ニュートラアビジンによって検出した。

抗体を、さらにマウスおよびヒトＩＬ−２１の両方に結合するために最適化してマウス抗体１５Ｍ２を産出した。これを遂行するために単離した１５Ｈ１２のネズミＶＨおよびＶＬのＣＤＲを突然変異生成によって無作為化して得られた抗体をＥＬＩＳＡを用いてヒトおよびマウスＩＬ−２１への結合に関してスクリーニングした。親和力強化突然変異を、次いで１５Ｍ２を産出するために組み合わせて、これを次いでフレームワークライブラリ手法（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｌｉｂｒａｒｙ ａｐｐｒｏａｃｈ）を用いてヒト化した。フレームワークライブラリのために、１２種のヒトＶＨフレームワーク生殖系列遺伝子（１−２４、１−４６、１−６９、２−５、３−１５、３−２３、３−５３、３−７２、４−０４、４−３９、５−５１、および６−０１）および８種のヒトＶＬフレームワーク遺伝子（Ａ−１９、Ａ−２６、Ａ−２７、Ｂ−２、Ｂ−３、Ｌ−２、Ｌ−１２、およびＯ−２）を含有する１５Ｍ２のＣＤＲを、合成して重鎖および軽鎖ヒトＩｇＧ４発現ベクターにクローン化した。全９６重鎖および軽鎖の組み合わせの２９３ＨＥＫ一過的トランスフェクションの後に、プレート上に直接コートしたヒトＩＬ−２１への結合および抗ヒトｋａｐｐａ抗体での上清からヒトＩｇＧの捕捉の後の溶液中のビオチン化ＩＬ−２１への結合についてＥＬＩＳＡによって上清をアッセイした。発症性およびＥＬＩＳＡ活性を考慮して、抗体１５Ｍ２から導かれ、１−４６重鎖ヒトフレームワークおよびＯ２ヒト軽鎖フレームワークを利用するＣＤＲを有するヒト化抗体を、さらなる最適化のために選択した。そのヒトＩＬ−２１に関するＫ_Ｄは、約０．５ｐＭであった。

ヒト化抗体の分析は、軽鎖ＣＤＲ脱アミド部位（Ａｓｎ９２）および重鎖ＣＤＲ異性化部位（Ａｓｐ５５）を特定した。これらの化学分解ホットスポットを除去するために、重鎖Ａｓｐ５５Ｇｌｕおよび軽鎖Ａｓｎ９２Ｈｉｓ突然変異の両方を含む改変抗体を生成した。これらの突然変異は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１に関して約２ｐＭ Ｋ_Ｄまで、幾らかの親和力の損失をもたらした。親和力の損失は、Ａｓｐ５５Ｇｌｕ突然変異に起因することが判定された。結果として、Ａｓｐ５５残基は、軽鎖におけるＡｓｎ９２Ｈｉｓ突然変異と共に重鎖において維持された。合理的改変原理（Ｒａｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ）は、重鎖における近接Ｓｅｒ５６残基を改変することによる親和力最適化をさらに導いた。このことから、同時にＡｓｐ５５異性化を減少して親和力を改善したＳｅｒ５６Ｖａｌ突然変異を含有する改変抗体を選択した。最終抗体は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１の両方に対して約０．５ｐＭの親和力を有する。半抗体形成を防止し（Ｓ２２５Ｐ）かつエフェクター機能を減少する（Ｆ２３１Ａ／Ｌ２３２Ａ）ために点突然変異を有する、ヒトＩｇＧ４である定常領域を選択した。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＥｐｉｖａｘ解析は、認識できる免疫性ホットスポットは無いことを示した。最終改変されたヒト化抗体（「Ａｂ３２７」）に関する配列情報を、下表１に示す。

Ａｂ３２７の溶解性および安定性
溶解性および安定性に関連するＡｂ３２７の物理化学的特性を、１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６（Ｃ６）および１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ（Ｃ６Ｎ）調合物の両方において評価した。Ｃ６調合物に関して、溶解度は≧１２２．９ｍｇ／ｍＬでありＣ６Ｎ調合物における溶解度は≧１３０．９ｍｇ／ｍＬであった。１０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６調合物（Ｃ６ＮＴ）中の１００ｍｇ／ｍＬにおけるＡｂ３２７の粘度は、５．８ｃＰであると測定された。

１０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ６緩衝液中、２５℃で４週間後、化学的および物理的不均質性における変化は、Ａｂ３２７に関しては低く、分析陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって観察された主ピーク面積においては５％より少ない変化であった。同条件下で、＜０．５％高分子量（ＨＭＷ）凝集体成長を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で観察した。クエン酸塩、ｐＨ６の安定性試料は、４０℃で４週間後の細胞に基づくアッセイにおいて生物活性の損失を示さなかった。

抗体を、ＣＤＲ化学分解ホットスポットの特性評価のためのペプチドマッピングＬＣ−ＭＳによってＣ６において４℃、２５℃、および４０℃で４週間後に分析した。ＬＣ−ＭＳ分析は、４℃の対照試料と比較して４０℃における重鎖ＣＤＲ残基Ａｓｐ５５の有意な異性化は示さなかった。４℃の対照試料と比較して２５℃における４週間後の０．５％より大きい他の共通ＣＤＲ分解成長が特定され、６ＣＤＲ全てにわたって全体として合計で５％未満であった。

Ａｂ３２７の物理的安定性を、Ｃ６における１ｍｇ／ｍＬの急速凍結融解調査および５０ｍｇ／ｍＬの緩慢凍結融解調査で評価した。両方の調査の間、Ｔｗｅｅｎ８０の存在が、１０ミクロンサイズの粒子の形成を減少した。高濃度調査においては、１５０ｍＭのＮａＣｌ塩の存在が、ＨＭＷ凝集体形成を減少した。低濃度調査に関して、ＨＭＷ凝集体は、塩およびＴｗｅｅｎ８０の存在下で０．７％であった。結論として、これらの試験からＡｂ３２７は、粘度、溶解度、および安定性を含め、ヒト調査に進むために良好な溶液特性を有すると考えられる。

Ａｂ３２７の機能特性
ＥＬＩＳＡによるヒトＩＬ−２１および他のヒト共通ガンマ鎖受容体ファミリーメンバーへのＡｂ３２７の結合
本調査の目的は、共通ガンマ（γｃ）鎖受容体サイトカインの他のメンバーと比較したＡｂ３２７のヒトＩＬ−２１への結合特異性を測定することであった。サイトカイン受容体γｃ−鎖ファミリーは、６種のメンバー、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、およびＩＬ−２１からなる。このファミリーの全てのメンバーは、γｃサブユニットを含む受容体複合体を通してシグナルを送る。他のヒトγｃ鎖サイトカインファミリーメンバーに結合するＡｂ３２７の特異性を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。簡単に言えば、Ａｂ３２７を、ヤギ抗ヒトｋａｐｐａ ＩｇＧでコートしたＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した。１００ｎＭ〜７８０ｐＭから滴定したビオチンで標識したサイトカインを、次いでプレートに３７℃で１時間加えて、任意の結合したサイトカインをアルカリホスファターゼで標識したニュートラアビジンを用いて検出した。ＩＬ−２に対する市販のマウスモノクローナル抗体ならびにロバ抗ヤギＩｇＧで捕捉されたＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５に対するヤギポリクローナル抗体は、ビオチン標識サイトカインの結合およびニュートラアビジンでの検出後に陽性シグナルを与えた。しかしながら、Ａｂ３２７に関して検出可能なシグナルは、ヒトＩＬ−２１を除いて観察されなかった（ＥＬＩＳＡによって５６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）測定値として示されるＡｂ３２７の結合およびヒト共通ガンマ鎖受容体に結合する他のリガンドの結合を示す、下表２を参照。図１も参照）。これらの結果は、Ａｂ３２７が、ＩＬ−２１に特異的であり他のヒトγｃ鎖受容体ファミリーサイトカインに結合しないことを示す。

ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびウサギＩＬ−２１に対するＡｂ３２７の結合親和力
Ａｂ３２７は、ヒトＩＬ−２１に結合して中和する改変された、ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体である。本調査の目的は、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、およびウサギＩＬ−２１に対するＡｂ３２７の結合親和力を測定することであった（配列を下に示す）。これらの種々のＩＬ−２１種へのＡｂ３２７の見掛けの結合親和力（Ｋ_Ｄ）を、ＫｉｎＥｘＡ３０００計器を用いて３７℃で測定した。ＫｉｎＥｘＡ溶液平衡結合実験を、一定抗体濃度プロトコールおよびＩＬ−２１の２倍段階希釈を用いて行った。試料を、分析に先立って３７℃で６〜３６時間平衡させた。平衡試料中の遊離抗体を、Ｄｙｌｉｇｈｔ ６４９複合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル抗体を用いて検出した。得られた遊離抗体対抗原濃度パーセントデータを、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏソフトウェアを用いて「親和力、標準」結合モデルに適合させて、最高適合結合親和力値（Ｋ_Ｄ）を決定した。

標準偏差（ヒト、カニクイザル、マウス、およびラット）を合わせた３回の独立した実験からまたは単一測定（ウサギＩＬ−２１）からの平均Ｋ_Ｄを、下表３に概説する（Ａｂ３２７の見掛け溶液平衡結合親和力（Ｋ_Ｄ））。

Ａｂ３２７は、３７℃において、それぞれ、０．８±０．５ｘ１０^−１２Ｍおよび０．３±０．１ｘ１０^−１２Ｍの平均（ｎ＝３）親和力でヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１に結合した。Ａｂ３２７は、それぞれ、２．４±１．３ｘ１０^−７Ｍ、２．３±０．２ｘ１０^−７Ｍ、および＞２ｘ１０^−７Ｍの親和力でマウス、ラット、およびウサギＩＬ−２１に結合した。ウサギＩＬ−２１への結合は、マウスおよびラットＩＬ−２１の同等試料について観察されたものよりも少ない結合シグナルに基づいて概算した。これらの結果に基づいて、Ａｂ３２７は、ヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１に対してはおおよそピコモルレベルの親和力を有するが、マウス、ラット、およびウサギＩＬ−２１に対しては相対的に弱い親和力を有する。

Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＭ９ ｐａｎ−ＳＴＡＴ−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１を阻害した。
ＩＬ−２１は、ＪＡＫ−ファミリータンパク質チロシンキナーゼを活性化しこれはシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）のＩＬ−２１依存性活性化を仲介する。ＳＴＡＴ経路を活性化するＩＬ−２１の能力を、ＩＭ９細胞を用いて評価した。多発性骨髄腫を有する患者の血液から導かれたＥＢＶ−形質転換されたＢリンパ芽球様細胞株でありかつＩＬ−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）およびその共受容体（γｃ）を自然に発現する、ＩＭ９細胞を、ｐａｎ−ＳＴＡＴ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトで安定的にトランスフェクトした。ＩＭ９−ｐａｎＳＴＡＴ−ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる、本実験の目標は、Ａｂ３２７がＳＴＡＴのＩＬ−２１依存性活性化を阻害可能であるかどうかを判定することであった。

ＩＭ９−ｐａｎＳＴＡＴ−ルシフェラーゼ細胞（ｐａｎ−ＳＴＡＴルシフェラーゼレポーターを有するＩＭ９細胞サブクローン１Ｂ１０／３Ｇ２）を、フラスコ内の培地（ｐａｎ−ＳＴＡＴ−ルシフェラーゼレポーターの選択のためにＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１Ｘｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ）において日常的に培養した。アッセイのために、細胞を、ＴＣ処理したプレートに５０，０００細胞／５０μＬ／ウェルで播種して３７℃で一晩インキュベーションした。次いで、細胞を、異なる種からの組み換えＩＬ−２１タンパク質の存在下でＡｂ３２７で処置した。０から６６７０ｐＭのＡｂ３２７の用量範囲を評価した（最終濃度は、Ａｂ３２７のＭＷ＝１５０ｋＤａに基づいた）。異なる種からの組み換えＩＬ−２１を、それぞれのウェルに６６．６７ｐＭの最終濃度（ＭＷ＝１５ｋＤａに基づく）まで加えた。ヒトＩＬ−２１Ｒ：Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃９９１−Ｒ２）を陽性の対照として用いかつヒトＩｇＧ４を陰性の対照として用いた。陽性および陰性の対照について用量範囲０から４７５２０ｐＭまでを評価した。試験は、三重に実行した。９６ウェルプレートを、組織培養インキュベーター内に４時間置いた（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ_２）。１００μＬ／ウェルのＯｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼ溶液を、アッセイに加えて停止させた。ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ３）を用いてプレートを読んだ。

結果を、ＩＣ５０（半数阻害濃度）として表わしてデータの４−パラメータシグモイド適合（Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔ）を用いて計算した。３回の独立した実験および標準偏差からの平均ＩＣ５０を、下表４において報告する。

試験した範囲内で、Ａｂ３２７は、用量依存的方法においてヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１誘導ＳＴＡＴ活性を完全に阻害した。Ａｂ３２７は４６．７±２．４のＩＣ５０を有するのに対して陽性の対照については２７１±１５．６であり、Ａｂ３２７による阻害は、陽性の対照（ｈＩＬ−２１Ｒ：Ｆｃ）で観察された阻害より大きかった。アイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ４）は、ｐａｎ−ＳＴＡＴ活性を阻害しなかった（データは示さず）。結論として、Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトおよびカニクイザルＩＬ−２１活性を有効に中和したが、マウス、ラット、またはウサギＩＬ−２１（上に示した配列）はこれらの条件下で中和しなかった（Ｎ．Ｎ．Ｄ．＝中和が検出されず）。

Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導増殖を中和した。
Ｂ細胞の主要な機能は、病原体を中和して取り除く抗体を産生することである。抗体産生Ｂ細胞は、胚中心（ＧＣ）反応中にナイーブＢ細胞から生成される。ＧＣは、Ｂ細胞が特異的な抗原に遭遇して成長、生存、選択、および分化に関する指令的シグナルを濾胞性ヘルパーＴ細胞から受け取った時に樹立される。これらのシグナルの間で、Ｂ細胞は、ＩＬ−２１が増殖、アイソタイプスイッチング、形質細胞分化、および抗体の分泌を促進することにおいて主要な要因である状態で、ＣＤ４０および非常に多くのサイトカインによって刺激される。目標は、Ａｂ３２７が、一次ヒトＢ細胞のＩＬ−２１誘導増殖を阻害可能であるかどうかを判定することであった。

５人の健康なドナーからのバフィーコートを、Ｉｎｄｉａｎａ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒから得た。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配分離によってバフィーコートから単離してＣＤ１９＋Ｂ細胞を、抗ＣＤ１９磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で陽性に選択した。回収した個体群の純度は、典型的には＞９０％であった。培養した細胞の増殖応答を評価するために、精製したＣＤ１９＋細胞を、９６ウェル平底培養プレートにおいて適切な刺激物質（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ含有１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）と共に５０万細胞／ｍＬ（１０万細胞／ウェル）で３７℃および５％ＣＯ_２で５日間培養した。単離したＢ細胞を、３．３３ｎＭにおけるヒトＩＬ−２１（ＭＷ＝１５ｋＤａに基づく）および２μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ４０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の組み合わせでインキュベーションした。Ａｂ３２７の用量範囲（０．１ｎＭから２６．７ｎＭ）、ヒトＩＬ−２１Ｒ：Ｆｃキメラ（０．１ｎＭから２１３．３ｎＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはヒトＩｇＧ４（０．１ｎＭから２６．７ｎＭ）を評価した。全ての刺激および処置は、培養開始において加えた。培養の５日後、［メチル−３Ｈ］チミジン取り込みを、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。

結果を、抗体が無い場合のＩＬ−２１仲介刺激を１００％として、最大増殖のパーセントとして表わした。Ａｂ３２７によって５０％のＩＬ−２１誘導応答が阻害された（ＩＣ５０）濃度を、データの４−パラメータシグモイド適合を用いて計算した。Ａｂ３２７は、用量依存的方法において一次ヒトＢ細胞のＩＬ−２１誘導増殖を阻害した。この阻害は、陽性の対照、ヒトＩＬ−２１Ｒ−Ｆｃコンストラクトで観察されたよりもずっと大きく、これは、用いられた最高濃度（２６．７ｎＭ）において、ＩＬ−２１誘導増殖を完全には阻害できなかった（図２参照）。Ａｂ３２７に関して計算されたＩＣ５０は、１．１５±０．２５ｎＭ（５回の独立した実験の平均±ＳＤ）であった。陰性の対照抗体（アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４）は、一次Ｂ細胞のＩＬ−２１誘導増殖を阻害しなかった。表５は、Ａｂ３２７が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導増殖を中和できることを示す。数値は、増殖性ヒトＢ細胞±ＳＤＥＶの割合を示す。結論として、Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで一次ヒトＢ細胞のＩＬ−２１誘導増殖を阻害した。

Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次ヒトＢ細胞のヒトＩＬ−２１誘導形質細胞分化を中和した。
形質芽球へのＢ細胞分化は、抗原およびＴ細胞によって提供されるシグナルの組込みによって調節される（ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用およびサイトカインの産生）。ヒトＢ細胞分化のために重要なサイトカインの１つは、活性化されたナイーブおよび記憶Ｂ細胞からの形質細胞生成および抗体分泌を誘導する、ＩＬ−２１である。ＩＬ−２１が活性化されたＢ細胞上のＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）発現を誘導し、ＩＬ−２の分化促進効果に対してこれらの細胞を感作し、それによってＩＬ−２とＩＬ−２１との間の協同相互作用を可能にして形質芽球生成および抗体分泌を増幅することが明らかになっている。目標は、Ａｂ３２７が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質細胞への一次ヒトＢ細胞のＩＬ−２１誘導分化を阻害可能であるかどうかを判定することであった。

バフィーコートは、上述の通りに得た。精製したＢ細胞を、９６ウェル平底培養プレートにおいて適切な刺激物質（ＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＢＳ含有１ｍＭピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）と共に７５万細胞／ｍＬ（１５万細胞／ウェル）で３７℃および５％ＣＯ_２で６日間培養した。単離したＢ細胞を、３．３３ｎＭヒトＩＬ−２１、１μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ４０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｈａｎｎａ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏ．）および／または２６．７ｎＭ Ａｂ３２７もしくは２６．７ｎＭのヒトＩｇＧ４抗体（陰性の対照）の組み合わせと共にインキュベーションした。培養の６日間後、細胞を染色緩衝液（２％ＦＢＳ／ＰＢＳ）で洗ってヒトＣＤ３８、ＩｇＤ、ＣＤ１９、ＣＤ２７（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）に対して特異的な抗体と共に４℃で４０分間インキュベーションした。ＦＣ−５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて５色フローサイトメトリー分析を行った。形質細胞を、高レベルのＣＤ３８および低レベルのＩｇＤを発現する細胞として特定した（下表６参照）。

ドナー間で大きいばらつきがあるので、下に示す結果は、ＩＬ−２１の追加によって誘導された形質細胞（ＣＤ３８高＋ＩｇＤ低細胞）の相対数の増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）として表わされ、ここで培地＋抗ＣＤ４０＋ＩＬ−２においてそれぞれのドナーから導かれた形質細胞の値は、１に等しく設定される。データを、５人の健康なドナーからの一次ヒトＢ細胞への効果に関する「増加倍数」として示す。

抗ＣＤ４０およびＩＬ−２の組み合わせで培養した新鮮なＢ細胞は、ＣＤ３８高／ＩｇＤ低形質細胞をほとんど含まなかった。対照的に、ＩＬ−２１の存在下での抗ＣＤ４０およびＩＬ−２を用いた精製Ｂ細胞の同時刺激は、形質細胞への実質的な分化をもたらした。陰性の対照抗体（アイソタイプｈＩｇＧ４）は、ＩＬ−２１活性を阻害できなかった。Ａｂ３２７は、一次ヒトＢ細胞のＩＬ−２１誘導形質細胞分化を阻害した（ｎ＝５ドナー、ｐ＝０．００８、不対ｔ検定Ａｂ３２７対ＩｇＧ４アイソタイプ抗体）。結論として、Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＩＬ−２１誘導形質細胞分化を阻害した。

Ａｂ３２７は、マウスにおけるヒトＩＬ−２１活性を中和した。
マウスへのＩＬ−２１の注入は、特異的なマーカーを用いて明確に特定された（Ｂ細胞およびＴ細胞の亜集団を含めた）脾臓における幾つかの細胞種の急速かつ一過的膨張に繋がる。本実験の目標は、Ａｂ３２７が、マウスにおけるヒトＩＬ−２１の生物活性を阻害可能であるかどうかを調査することであった。

８から１０週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ６マウス（群当たりｎ＝５）に、Ａｂ３２７（１ｍｇ／マウス）またはアイソタイプ（ｈＩｇＧ４、１ｍｇ／マウス）対照抗体のいずれかを１日目に腹腔内に注入（ｉ．ｐ．）した。２および３日目にマウスは、１日当たり１マウス当たり５０μｇの組み換えヒトＩＬ−２１またはＰＢＳのｉ．ｐ．注入を受けた。４日目に、脾臓細胞の細胞懸濁液を調製して赤血球を溶解させた後に細胞の総数を測定した。ＩＬ−２１応答性細胞の相対的割合を、細胞表面マーカーＧｒ−１およびＳｃａ−１を用いてフローサイトメトリーによって測定した。脾臓当たりのＩＬ−２１応答性細胞の総数を、ＩＬ−２１−応答性細胞（Ｇｒ−１ｌｏｗＳｃａ−１＋細胞）の割合に脾臓中の細胞の総数を掛けることによって計算した。

下表７における結果は、５匹のマウスそれぞれの脾臓中のＩＬ−２１応答性細胞の総数（ｘ１０^６）として示される。

ヒトＩＬ−２１の注入は、ＩＬ−２１応答性細胞の増加をもたらした。Ａｂ３２７の存在は、陰性の対照抗体を受けた動物と比較してそれらの細胞の数を減少させた（ｐ＜０．０００１、不対ｔ検定Ａｂ３２７＋ＩＬ−２１対ＩｇＧ４＋ＩＬ−２１およびＩｇＧ４＋ＰＢＳ対ＩｇＧ４＋ＩＬ−２１）。それぞれの群内のＡｂ３２７および陰性の対照抗体への暴露を、定量的ＥＬＩＳＡによって確認した。Ａｂ３２７が、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＩＬ−２１の生物活性を有効に中和したと結論づけられる。

Ａｂ３２７は、ＮＧＳマウスにおけるヒトＴ細胞活性化のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける有効性を実証した。
ヒトＩＬ−２１を中和することが、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が重度免疫不全状態ＮＳＧマウスに移植されたヒトＴ細胞活性化モデルにおける疾患の進行を妨げることは、以前示されている（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγ ｎｕｌｌ；Ｈｉｐｐｅｎ ＫＬら、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＩＬ−２１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ ＧＶＨＤ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ ２０１２；１１９：６１９）。ＮＳＧマウスは、Ｔ、ＢおよびＮＫ細胞が欠乏しかつマクロファージおよび樹状細胞の機能も減少している。ヒトＰＢＭＣの移植は、明白なヒトＴ細胞活性化ならびにマウスの皮膚、肝臓、腸、肺および腎臓へのそれらの浸潤をもたらす。これは、最終的に死に繋がる消耗症候群が伴う（Ｈｉｐｐｅｎ、２０１２）。本モデルの利点は、疾患がヒト免疫細胞およびヒトサイトカインによって駆動され、したがってｉｎ ｖｉｖｏで他の種への交差反応性が無い抗体の呼びかけ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にすることである。本調査の目的は、予防方式（移植時に投与開始）または治療方式（移植後２１日で投与開始）で投与した場合のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性およびヒトＴ細胞活性化モデルにおけるＡｂ３２７の疾患変更活性を実証することである。

移植に先立って、雌ＮＳＧマウスを、体重のベースライン測定に基づく群に分けた（ｎ＝１０／群）。０日目に、マウスにＳａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋから得たバフィーコートから単離した１０^７ヒトＰＢＭＣを静脈内注入した。予防方式のために（図３）、マウスに１または１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３２７あるいは１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を移植時およびその後毎週１回皮下投薬した。体重を測定して一般外貌および健康状態を週に２〜３回観測した。１９日目に、尾切断によって血液を取得してフローサイトメトリーによりヒトＣＤ４５＋細胞の移植について分析した。治療方式のために（図４）、いかなる処置も受けていない動物を、フローサイトメトリーデータおよび体重に基づいて一致したコホート群に再割り当てした。移植後２１日目に、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのＡｂ３２７または１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を、次いでその後毎週１回皮下投薬した。４匹の非移植マウスが、「非処置対照または非移植」マウスとして含まれた。体重変化を、ベースライン体重の割合として計算した（（ｘ）日目体重／０日目体重＊１００）。結果を、ベースラインからの経時的な体重変化パーセントとして示す。

予防方式については、ヒトアイソタイプ対照抗体で処置したマウス（図３参照、白四角（ｏｐｅｎ ｓｑｕａｒｅ））は、早くも細胞移入後２０日で消耗性表現型を発症した。移入後４５日目に、ベースラインからのアイソタイプ対照群における平均体重減少は１０％より大きくかつマウスの大半が危険状態にあり、したがって調査を終了した。移植の日に開始した１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３２７での処置（図３、黒四角（ｃｌｏｓｅｄ ｓｑｕａｒｅ））（予防方式）は、消耗性表現型を完全に消した。マウスは、非移植マウスと同等に体重が増え続けた。それらの体重は、アイソタイプ対照群とは統計的に有意に異なった（ｐ＝０．０００８４６およびｐ＜０．００１それぞれ、Ａｂ３２７対アイソタイプおよび非移植マウス対アイソタイプ、二元ＡＮＯＶＡ、反復測定）。Ａｂ３２７の用量１ｍｇ／ｋｇ／週（図３、黒三角（ｃｌｏｓｅｄ ｔｒｉａｎｇｌｅ））は、体重減少の進行が遅く見えることから、部分的な効果を有する。しかしながら、この群におけるマウスの体重は、実質的にアイソタイプ対照と異ならなかった。表８は、ＩＬ−２１抗体またはアイソタイプ対照抗体で４５日間処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植された重度免疫不全状態ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγ ｎｕｌｌ）におけるベースラインからの体重変化の平均±ＳＤＥＶパーセントを示す。処置は、ＰＢＭＣの移植と同時に開始した。Ａｂ３２７ １０ｍｇ／ｋｇ群とアイソタイプ対照群との間に有意差が有った。

上述の通り、ヒトＰＢＭＣ投与は、移植後約２０日で始まる消耗性疾患をもたらした。ヒトＩＬ−２１の遮断が進行中の疾患の悪化を停止可能かどうかを調査するために（治療方式）、マウスを、１０ｍｇ／ｋｇ／週のＡｂ３２７またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照で移植後２１日目開始で処置した。図４に示すように、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体（白四角）を投薬したマウスは、体重減少し続ける。一方で、疾患の発症後開始した（移植後２１日間、図４、黒四角）、Ａｂ３２７処置は、消耗性表現型を弱めることにおいて効果的であった。この群における平均体重は、統計的に有意にアイソタイプ対照群と異なった（ｐ＝０．０４２、二元ＡＮＯＶＡ、反復測定）。体重減少および疾患の重症度における相違は、マウスへのヒト細胞の移植における相違が原因ではなかった。調査の終わりにおいて末梢性ヒトＣＤ４５＋細胞数ならび脾臓におけるにヒト細胞は、アイソタイプ対照処置動物と比較してＡｂ３２７処置マウスにおいてわずかに高かった。要約すれば、Ａｂ３２７は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞活性化の異種モデルにおける有効性および疾患変更活性を実証した。表９は、ＩＬ−２１抗体またはアイソタイプ対照抗体で処置したヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植した重度免疫不全状態ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ ＩＬ−２Ｒγ ｎｕｌｌ）における２１日目からの体重変化の平均±ＳＤＥＶパーセントを示す。処置は、２１日目に開始した。Ａｂ３２７ １０ｍｇ／ｋｇ群とアイソタイプ対照群との間に有意差が有った。

Ａｂ３２７の薬物動態
Ａｂ３２７の薬物動態を、雄カニクイザルにおける３ｍｇ／ｋｇ用量の単一静脈内または皮下後に特徴付けした。血清試料を、投与１００８時間後（６週間）に達するまで収集した。２つのＥＬＩＳＡ法（総ヒトＩｇＧまたは抗原捕捉）を用いて抗体を定量化した後に濃度−時間プロファイルを生成した。総ヒトＩｇＧ法は、抗ＩＬ−２１抗体の濃度を測定するためにＥＬＩＳＡ様式を利用する。標準、対照および試験試料を、マイクロタイタープレート上に固定化されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ（コーティングＡｂ）と共にインキュベーションした。インキュベーション後、マウス抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を、ウェルに加えた。非結合酵素を洗い流したら、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標） ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液を、ウェルに加えた。酸性溶液の添加によって発色を止めて４５０ｎｍにおいて波長補正を６５０ｎｍに設定して光学密度を測定した。

抗原捕捉法は、抗ＩＬ−２１抗体の濃度を測定するためにＥＬＩＳＡ様式を利用する。標準、対照および試験試料を、ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート上に固定化されたヒトＩＬ−２１−ビオチンでインキュベーションした。インキュベーション後、マウス抗ヒトＩｇＧ４−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を、ウェルに加えた。非結合酵素を洗い流したら、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（登録商標） ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）基質溶液を、ウェルに加えた。酸性溶液の添加によって発色を止めて４５０ｎｍにおいて波長補正を６５０ｎｍに設定して光学密度を測定した。アッセイ範囲は、５〜５００ｎｇ／ｍＬであった。

薬物動態学的結果（平均）を、下表１０および下表１１に示す。各群における動物の数は、２であった。

略号＝ｔ１／２ − 半減期、ＡＵＣ０−ｔ − ０から最後の測定可能濃度までの曲線の下の領域、ＡＵＣ０−ｉｎｆ − ０から無限大までの曲線の下の領域、外挿ＡＵＣ％ − 最後の測定可能濃度から無限大までの外挿に起因するＡＵＣ０−ｉｎｆの割合、ＣＬｓｓ − 全身クリアランスの概算、Ｖｓｓ − 定常状態における分布の大きさの概算。＊終末相半減期は、７２〜１６８時間の間で計算した。

略号＝ｔ１／２ − 半減期、Ｔｍａｘ − 最大濃度における時間、Ｃｍａｘ − 最大濃度、ＡＵＣ０−ｔ − ０から最後の測定可能濃度までの曲線の下の領域、ＡＵＣ０−ｉｎｆ − ０から無限大までの曲線の下の領域、外挿ＡＵＣ％ − 最後の測定可能濃度から無限大までの外挿に起因するＡＵＣ０−ＩＮＦの割合、ＣＬｓｓ／Ｆ − クリアランス／生物学的利用能、Ｆ％ − 平均３ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．用量を参照として用いる生物学的利用能＝（ＡＵＣ０−ｉｎｆ ｓ．ｃ．／ＡＵＣ０−ｉｎｆ ｉ．ｖ．）／（Ｄｏｓｅ−ｉｖ／Ｄｏｓｅ−ｓ．ｃ．）＊１００。＊終末相半減期は、９６〜３３６時間の間で計算した。

雄カニクイザルへのＡｂ３２７の単一静脈内または皮下投与後、濃度−時間プロファイルは、抗薬剤抗体（ＡＤＡ）形成の示唆的でありかつＡＤＡは、４／４のサルにおいて確認した。平均終末相半減期は１０５〜２４９時間でありＡＤＡの著しい影響を回避するために７２〜１６８時間の間の傾斜から計算した。平均クリアランスは、０．２〜０．４ｍｌ／ｈ／ｋｇの典型的なモノクローナル抗体クリアランス範囲のちょうど外になる０．４３〜０．４８ｍｌ／ｈ／ｋｇであった。

皮下投与後、生物学的利用能は、モノクローナル抗体（５０〜１００％）の典型的範囲に入る７２〜７４％であった。ＡＤＡ形成にもかかわらず、サルにおけるＡｂ３２７の薬物動態は、クリアランスが正常よりわずかに高い状態で可溶性リガンドに結合するモノクローナル抗体について予想されるものと比較的類似していた。

これらの調査に基づいて、Ａｂ３２７は、ヒト化ＩｇＧ４抗体について予想される範囲内のヒトにおける薬物動態を有するであろうと結論づけられる。予測されたヒトクリアランスは、サルクリアランスの相対成長率に基づいて０．３ｍＬ／ｈｒ／ｋｇ（７０ｋｇのヒトにおいて０．０２Ｌ／ｈ）であり生物学的利用能は、ヒトにおいて５０〜７５％であると予測された。

抗マウスＩＬ−２１抗体での処置は、ＮＯＤマウスの唾液腺におけるリンパ球浸潤を軽減した。
Ａｂ３２７は、齧歯類ＩＬ−２１を中和しないので、前臨床疾患モデルにおいて使用するための代用分子を発症させた。抗体Ａｂ７２８は、マウスＩＬ−２１に特異的に結合するネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体である。Ａｂ７２８へのネズミＩＬ−２１の結合親和力は、１ｐＭである。Ａｂ７２８は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイにおいてネズミＩＬ−２１を完全に中和することが可能であった。

非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは、唾液腺におけるリンパ球浸潤を自然発生的に発症するのでシェーグレン症候群のモデルとして広く用いられている。先行研究は、ＩＬ−２１ ｓｈＲＮＡレンチウイルスでのＮＯＤマウスの顎下腺におけるＩＬ−２１レベルの局所的抑制が、シェーグレン症候群様症状の発症を阻害し得ることを示した（Ｌｉｕ Ｈら、Ｌｏｃａｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−２１ ｉｎ ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄｓ ｒｅｔａｒｄｓ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｅｄ ２０１２；４１：７２８）。本実験の目標は、Ａｂ３２７の代理の、Ａｂ７２８の全身投与が、ＮＯＤマウスにおけるシェーグレン症候群発症を予防するまたは弱めることが可能であるかどうかを調査することであった。

雌ＮＯＤマウスを、７週齢で開始してＡｂ７２８またはアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１で処置した（２０ｍｇ／ｋｇ／週）。マウスを、１８週齢でと殺して唾液腺を採取した。唾液腺の一部分を１．６％ＰＦＡ２０％スクロースで４℃で一晩固定し、ＯＣＴに埋め込んで免疫蛍光法による分析まで−８０℃で貯蔵した。別の部分を、ｍＲＮＡ調査用に液体窒素中で冷凍した。

ＮＯＤマウスにおいて、顎下唾液腺および涙腺における病巣性炎は、約８週齢から先へ発症する。病巣は、ＴおよびＢ細胞の存在と共に、一部のヒト唾液腺において見つかる浸潤物を有する構造および細胞構成と同等に見える。抗ＩＬ−２１処置がＮＯＤ唾液腺におけるリンパ球浸潤を軽減したかどうかを調査するために、免疫蛍光染色を行った。簡単に言えば、８μｍの冷凍した唾液腺の断片を、ＰＢＳで洗い次いで精製した一次抗体と共に室温で１時間インキュベーションし、その後適切な標識をした二次抗体と共に３０分間インキュベーションした。一次抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＣＤ３（Ｔ細胞）および抗Ｂ２２０（Ｂ細胞）であった。二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ラットＩｇＧおよびＤｙＬｉｇｈｔ ５９４ヤギ抗アルメニアンハムスターであった。ＤＡＰＩを用いて細胞の核を特定した。

ｍＩｇＧ１対照抗体で処置したＮＯＤマウスは、シェーグレン症候群患者において見られるリンパ球病巣に似ている高度に組織化されたＴおよびＢリンパ球（図６）と共に管周囲の凝集体として配置された典型的なリンパ単球浸潤の存在を示した。Ａｂ７２８処置は、観察された病巣の数だけでなくサイズも効果的に減少した。

シェーグレン症候群におけるリンパ系集合体の発症は、胚中心構造内へのＢ細胞およびＣＤ４＋ Ｔ濾胞性ヘルパー（ＴＦＨ）細胞の再循環および位置決定を調節する、リンパ系ケモカインＣＸＣＬ１３およびその同系の受容体ＣＸＣＲ５の異所性産生によって調節されると考えられる。ＩＬ−２１は、ＴＦＨおよび胚中心構造の維持に関与することが示されている。ＩＬ−２１は、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球の活性化も制御し、これはパーフォリンおよびグランザイムによって標的細胞を破壊すると考えられる。抗ＩＬ−２１処置がこれらのマーカーの発現を減少するかどうかを調査するために、Ｔｒｉｚｏｌにおける均質化によって冷凍した唾液腺から全ＲＮＡを単離した後ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を用いた。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおける分光光度吸収から決定した。ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。全ての反応は、アッセイしたｍＲＮＡの相対的存在量を決定するために三重に実行した。ＩＬ−２１（Ｍｍ００５１７６４０＿ｍ１）、ＣＸＣＲ５（Ｍｍ００４３２０８６＿ｍ１）、ＣＸＣＬ１３（Ｍｍ０４２１４１８５＿ｓ１）、ＣＣＲ９ （Ｍｍ０２６２００３０＿ｓ１）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（Ｍｍ００４４２８３４＿ｍ１）およびＣＤ８（Ｍｍ０１１８２１０７＿ｇ１）用のプライマープローブセットは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから取得した。ＧｕｓＢ（Ｍｍ００４４６９５６＿ｍ１）は、遺伝子発現レベルにおけるばらつきを正規化するために内因性対照として測定した。発現データを、Ｄｅｌｔａ Ｃｔ法を用いて分析した。個々のＣｔ値を、三重測定の平均として計算した。

ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−２１、ＣＤ８およびＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ｍＲＮＡ転写は、ｍＩｇＧ１対照抗体処置マウスと比較して、Ａｂ７２８処置マウスにおいて統計的に有意に下向き調節された。図５は、マウスの唾液腺におけるｍＲＮＡ分析を示す。処置が、疾患に関与したタンパク質の発現を調節することが分かる。要約すれば、抗マウスＩＬ−２１抗体（Ａｂ７２８）の投与が、唾液腺内へのリンパ球浸潤を減少しかつＮＯＤマウスのＳＳ様症状の発症を遅らせた。

抗ｍＩＬ−２１（Ａｂ７２８）処置は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病を予防する。
Ａｂ７２８は、マウスＩＬ−２１に特異的に結合するネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体である。代用Ａｂ７２８へのネズミＩＬ−２１の結合親和力は、１ｐＭである。Ａｂ７２８は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイにおいてネズミＩＬ−２１を完全に中和することが可能であった。

ヒトＩ型糖尿病は、膵臓のランゲルハンスの島におけるインシュリン産生ベータ細胞の自己反応性の破壊に起因する自己免疫性疾患であり、これは次のインシュリン産生の損失に繋がる。マウスの非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）株は、類似疾患を発症して自己免疫反応の開始および伝播に関与する機序を調査するためのモデル系としても役立つ。組織学的調査は、雄および雌マウスの両方が島を取り囲む単核性浸潤（膵島周囲炎）を実証し始める時、約３から４週齢までに免疫細胞浸潤物が島においてほとんど見られないことを示している。これらの浸潤物は進行して島を侵し（膵島炎）その後約１２週齢において高血糖症および末期の糖尿病が始まる。

先行研究は、ＮＯＤマウスにおけるＩＬ−２１シグナリングの欠失が、疾患発症のほぼ完全な抑止に繋がることを示した（Ｓｐｏｌｓｋｉ Ｒら、ＩＬ−２１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ＮＯＤ ｍｏｕｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００８；１０５：１４０２８、２００８）。本実験の目的は、Ａｂ７２８の全身投与は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症を予防するまたは弱めることが可能であるかどうかを調査することであった。

雌ＮＯＤマウスを、Ａｂ７２８またはアイソタイプ対照ｍＩｇＧ１（２０ｍｇ／ｋｇ／週）で疾患のプロセスにおける異なる期間で処置した。マウスの一群は７週齢で処置を開始して（予防調査、図７Ａ）動物の別の群は１３週齢で処置を開始した（後期前臨床段階、図７Ｂ）。両方の状況において、マウスが３７週齢になるまで糖尿病発症についてマウスを追跡検査した。糖尿病の発症を追跡するために、血液グルコースレベルを毎週観測して２つの連続した測定において血液グルコースが２５０ｍｇ／ｄｌを超えた場合は動物を糖尿病とみなした。Ａｂ７２８への暴露は、定量的ＥＬＩＳＡによって確認した。

ｍＩｇＧ１対照抗体で処置したＮＯＤマウスは、それらが１３〜１５週齢の間の場合に糖尿病を発症し始めて７５％のマウスが３７週齢までに顕性糖尿病に進行した（予防については１２匹中９匹のマウスおよび後期前臨床段階については８匹中６匹のマウス、図７Ａおよび図７Ｂ参照）。対照的に、抗ＩＬ−２１処置は、糖尿病進行を有意に遅らせた。１２匹中１匹のマウスのみ（８％、図７Ａ、ｐ＝０．０００７）７週齢で処置を開始した時に糖尿病を発症してかつ１１匹中１匹のマウスのみ（９％、図７Ｂ、ｐ＝０．００２）後期前臨床段階の間に処置を開始した時に顕性糖尿病に進行した。

要約すれば、抗マウスＩＬ−２１抗体（Ａｂ７２８）の投与は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症を効果的に予防した。

配列

以下の配列を、実施例およびアッセイにおいて用いた。
ヒトＩＬ−２１−ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースエントリー＃Ｑ９ＨＢＥ４
ＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤＩＶＤＱＬＫＮＹＶＮＤＬＶＰＥＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＶＳＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥＫＫＰＰＫＥＦＬＥＲＦＫＳＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳＳＲＴＨＧＳＥＤＳ（配列番号１３）
カニクイザルＩＬ−２１−−配列は組織内でクローン化、公開データベースでは利用不可
ＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤＩＶＤＱＬＫＮＹＶＮＤＬＤＰＥＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＩＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＬＳＩＫＫＬＫＲＫＳＰＳＴＧＡＥＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥＫＫＰＰＫＥＦＬＥＲＦＫＳＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳＳＲＴＨＧＳＥＤＳ（配列番号１４）
マウスＩＬ−２１−ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ ｅｎｔｒｙ＃Ｑ９ＥＳ１７
ＨＫＳＳＰＱＧＰＤＲＬＬＩＲＬＲＨＬＩＤＩＶＥＱＬＫＩＹＥＮＤＬＤＰＥＬＬＳＡＰＱＤＶＫＧＨＣＥＨＡＡＦＡＣＦＱＫＡＫＬＫＰＳＮＰＧＮＮＫＴＦＩＩＤＬＶＡＱＬＲＲＲＬＰＡＲＲＧＧＫＫＱＫＨＩＡＫＣＰＳＣＤＳＹＥＫＲＴＰＫＥＦＬＥＲＬＫＷＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳ（配列番号１５）
ラットＩＬ−２１−ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ ｅｎｔｒｙ＃Ａ３ＱＰＢ９
ＨＫＳＳＰＱＲＰＤＨＬＬＩＲＬＲＨＬＭＤＩＶＥＱＬＫＩＹＥＮＤＬＤＰＥＬＬＴＡＰＱＤＶＫＧＱＣＥＨＥＡＦＡＣＦＱＫＡＫＬＫＰＳＮＴＧＮＮＫＴＦＩＮＤＬＬＡＱＬＲＲＲＬＰＡＫＲＴＧＮＫＱＲＨＭＡＫＣＰＳＣＤＬＹＥＫＫＴＰＫＥＦＬＥＲＬＫＷＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳ（配列番号１６）
ウサギＩＬ−２１−（市販試薬−Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃７２７４−ＲＢ／ＣＦ）
ＨＫＳＳＳＫＧＱＤＲＹＭＩＲＭＨＱＬＬＤＩＶＤＱＬＱＳＤＶＮＤＬＤＰＤＦＬＰＡＰＱＤＶＱＫＧＣＥＱＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＰＡＮＡＧＤＮＧＫＲＩＳＳＬＩＫＱＬＫＲＫＬＰＳＴＫＳＫＫＴＱＫＨＲＰＴＣＰＳＣＹＳＹＥＫＫＮＬＫＥＦＬＥＲＬＫＳＬＩＱＫＭＩＨＱＨＬＬＥＨＬＲ（配列番号１７）

Claims (24)

1. 重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含むヒトＩＬ−２１に結合する抗体であって、前記ＬＣＶＲが、ＣＤＲＬ１において配列番号７、ＣＤＲＬ２において配列番号８およびＣＤＲＬ３において配列番号９を含みかつ前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲＨ１において配列番号１０、ＣＤＲＨ２において配列番号１１およびＣＤＲＨ３において配列番号１２を含む、抗体。
2. 抗体重鎖および抗体軽鎖を含む請求項１に記載の抗体であって、前記重鎖が、配列番号１を有するＨＣＶＲを含みかつ前記軽鎖が、配列番号２を有するＬＣＶＲを含む、抗体。
3. ２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる請求項１または請求項２に記載の抗体であって、それぞれの重鎖は、アミノ酸配列が配列番号１の配列である、重鎖可変ドメインを含み、かつそれぞれの軽鎖は、アミノ酸配列が配列番号２の配列である、軽鎖可変ドメインを含む、抗体。
4. それぞれの重鎖のアミノ酸配列が配列番号３の配列でありかつそれぞれの軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４の配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体。
5. アミノ酸配列が配列番号３の配列である抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子。
6. 前記抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの配列が、配列番号５の配列である、請求項５に記載のＤＮＡ分子。
7. アミノ酸配列が配列番号４の配列である抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ分子。
8. 前記抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの配列が、配列番号６の配列である、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
9. アミノ酸配列が配列番号３の配列である抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドを含みかつアミノ酸配列が配列番号４の配列である抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ分子。
10. 前記抗体重鎖をコードするポリヌクレオチドの配列が、配列番号５の配列でありかつ前記抗体軽鎖をコードするポリヌクレオチドの配列が、配列番号６の配列である、請求項９に記載のＤＮＡ分子。
11. 請求項５または請求項６に記載のＤＮＡ分子および請求項７または請求項９に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、２つの抗体重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を発現する能力を有し、前記２つの重鎖のそれぞれのアミノ配列が配列番号３の配列でありかつ前記２つの軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列が配列番号４の配列である、形質転換された哺乳動物細胞。
12. 請求項９または請求項１０に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、２つの抗体重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体を発現する能力を有し、前記２つの重鎖のそれぞれのアミノ配列が配列番号３の配列でありかつ前記２つの軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列が配列番号４の配列である、形質転換された哺乳動物細胞。
13. 抗体を産生するためのプロセスであって、抗体が、２つの抗体重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含み、前記２つの重鎖のそれぞれのアミノ配列が配列番号３の配列でありかつ前記２つの軽鎖のそれぞれのアミノ酸配列が配列番号４の配列であり、かつ、
    ａ．請求項１１に記載の哺乳動物細胞または請求項１２に記載の哺乳動物細胞を、前記抗体が発現されるような条件下で培養するステップと、
    ｂ．前記発現した抗体を回収するステップと
    を含む、プロセス。
14. 請求項１３に記載のプロセスによって取得可能な抗体。
15. 請求項１から４または１４のいずれか一項に記載の抗体の有効量を患者に投与するステップを含む、患者における自己免疫性状態を治療する方法。
16. 前記自己免疫性状態は、原発性シェーグレン症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記自己免疫性状態は、原発性シェーグレン症候群またはシェーグレン症候群である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記自己免疫性状態は、全身性エリテマトーデスである、請求項１６に記載の方法。
19. 療法における使用のための、請求項１から４または１４のいずれか一項に記載の抗体。
20. 自己免疫性状態の治療における使用のための、請求項１９に記載の抗体。
21. 原発性シェーグレン症候群、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、グレーブス病、または１型糖尿病の治療における使用のための、請求項１９に記載の抗体。
22. 原発性シェーグレン症候群またはシェーグレン症候群の治療における使用のための、請求項１９に記載の抗体。
23. 全身性エリテマトーデスの治療における使用のための、請求項１９に記載の抗体。
24. 請求項１、２、または１２のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。

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