JP2015167480A

JP2015167480A - リグノセルロース含有バイオマスの酵素糖化処理方法

Info

Publication number: JP2015167480A
Application number: JP2014042365A
Authority: JP
Inventors: 敦古城; Atsushi Kojo
Original assignee: Oji Holdings Corp
Current assignee: Oji Holdings Corp
Priority date: 2014-03-05
Filing date: 2014-03-05
Publication date: 2015-09-28

Abstract

【課題】リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理する方法において、糖化処理後の未分解残渣（リグニン含有）に吸着した酵素を効率的に回収して長期間にわたって工程内で循環利用することを可能とする方法を提供する。
【解決手段】
リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理（又は併行糖化発酵処理）し、糖化処理（又は併行糖化発酵処理）した処理懸濁液を固液分離装置で固形分（残渣）と液体分に分離し、前記固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理する。リグノセルロース系原料にアルカリ処理を施す。
【選択図】図１

Description

本発明は、リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理する方法において、糖化処理で分解されなかった未分解残渣に吸着した酵素を回収して長期間にわたって循環利用することを可能とするリグノセルロース系バイオマスの酵素糖化処理方法に関する。

糖化に適した処理を施したリグノセルロース原料から糖を製造する技術は、この糖を微生物の発酵基質として用いることによりガソリンの代替燃料となるアルコールや、プラスチック原料となるコハク酸や乳酸などの化成品原料を製造することができることから、循環型社会の形成に有益な技術である。
植物系バイオマス中の多糖類から発酵基質となる単糖や小糖類を製造する方法は２つに大別できる。一つは鉱酸を用いて加水分解する酸糖化法であり、もう一つは酵素やその酵素を生産する微生物を用いて加水分解する酵素糖化法である。

酸糖化法は酵素糖化法に比べて技術的に完成されているが、リグノセルロース系バイオマスを原料とする方法の場合は、澱粉や廃糖蜜などを原料とする方法に比べて糖収率が低いことに加えて、処理工程から排出される廃酸の処理設備や、酸による腐食に耐え得る大型の設備が必要となること等が製品コストの増大原因となっていて実用化の大きな障壁となっている。

一方、酵素糖化法は、近年酵素の価格が下がってきていることと技術の進歩から、後処理まで含めた全体のコストで酸糖化法のコストに近づいてきてはいるが、酵素糖化法の全体コストに占める割合が高い酵素の価格は依然として高いことから、酵素糖化法の実用化のためには酵素にかかる費用の一層の低減が重要である。

酵素糖化法のコストを下げる技術としては、セルロース繊維への酵素のアクセスを容易にする前処理の方法の開発や、結晶性セルロースを効率よく糖化する方法の開発、更には酵素の効率的な回収、再利用方法の開発などが考えられる。

リグニンを除去していないリグノセルロース材料は、リグニンを除去したリグノセルロース材料と比べて酵素によって分解されにくく、糖化されずに樹脂、金属などの不純物と一緒に糖化液中に残渣として残る。一般に、この残渣はスクリーン、遠心分離等により分離し廃棄される。この残渣には酵素糖化法におけるコストの中で大きな比重を占めている酵素が多量に吸着されているため、反応液から分離した残渣をそのまま廃棄してしまうと高価な酵素も廃棄されてしまうという問題があった。

上記のような残渣中の酵素の回収手段として、残渣の洗浄が考えられる。しかし、酵素は、その分子内に有しているセルロースに特異的に吸着するセルロースバインディングドメイン（ＣＢＤ）等によりセルロースと強固に結合しているため、単なる水洗浄ではセルロースに吸着した酵素を十分に回収することは困難であった。
そこで、酵素の回収率の改善を目的として界面活性剤を添加して処理する方法（特許文献１参照）などが提案されている。しかし、界面活性剤処理法でも、酵素の回収率が十分であるとはいえず、また、薬品添加による酵素の失活や、処理工程付加に伴うコストアップ及び後の発酵段階における微生物への悪影響などが懸念されることなどから実用的ではない。

糖液からの酵素の回収法としては、限外濾過を用いた方法（特許文献２参照）、糖液に再度セルロースを添加して酵素を吸着回収する方法（特許文献３参照）などが提案されている。しかし、限外濾過法は微少な不純物がろ過膜につまり十分な処理速度及び酵素回収率が得られない問題があるし、セルロース添加による回収法では十分な酵素回収が困難であった。

吸着した酵素を剥離させる工程を経ずに、酵素が吸着しているリグノセルロース残渣を次回分の酵素糖化に再利用する方法が提案されている（特許文献４）。この方法では、残渣の蓄積は避けられないので反応効率が低下することが懸念される。また、ＣＢＨ（セロビオハイドラーゼ）等、ＣＢＤを有する酵素に関してはリグノセルロース残渣を次回分で再処理することで酵素の循環利用が可能であるが、ベータ−グルコシダーゼ等は上清中に遊離している場合もあるので、添加したセルラーゼの全てを循環利用することは困難である。

酵素のコストを低減する方法として、酵素を循環利用する方法が報告されている。Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．らの方法（非特許文献１）によると、酵素を大量（濾紙分解活性で基質１ｇに対して８０−１６０単位）に添加して古紙原料を酵素加水分解する主反応槽に、酵素加水分解液中の未反応古紙面から高剪断力で生成グルコースやセロビオース成分を除いて常に新しいセルロース繊維表面を露出させる高速遠心ポンプによる磨砕装置と、磨砕装置からの処理液から未反応原料と加水分解液を分離して未反応原料のみを主反応槽に循環する膜分離装置と、膜分離装置からの加水分解液から酵素と生成グルコース及びセロビオースを分離して酵素のみを主反応槽に循環する限外濾過装置とを有する循環ラインを設けた連続システムを想定してコストを予測している。このシステムにより、糖化率は２５時間で１００％であり、酵素の残存率は２４時間で９５％以上であるとされている。また、酵素が残渣に吸着されて失われること、残渣の酵素の吸着機能はｐＨを５〜７に高めることで低下可能な場合があること、温度を５℃に下げることで低減できるという報告もあることが記載されている。

酵素を回収再利用する方法として、蒸煮・爆砕処理したシラカンバ材を５％の濃度で糖化槽に加え、２万単位のセルラーゼを添加して、限外濾過により糖液と酵素液とを分離し、酵素を回収再利用しながら、８日間で２ｋｇのシラカンバ材から単糖類を６３０ｇ得ている方法も報告されており、この方法で酵素の使用量を２０％節約できたとされている（非特許文献２）。

リグノセルロース系原料への酵素の吸着を抑制する方法として、リグノセルロース系原料に水溶性塩類を添加する方法（特許文献５）、リグノセルロース系原料に炭酸カルシウムを添加する方法（特許文献６）が報告されている。しかし、リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理した後のリグニンを多く含む未分解残渣に吸着している酵素を効率的に回収する方法の開発が望まれている。

特開昭６３-８７９９４号公報特開昭６１-２３４７９０号公報特開昭５５-１４４８８５号公報特開２０１０-９８９５１号公報特許４９４７２２３特開２０１２-１００６１７号公報

Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｄ．，Ｒｏｔｈｒｏｃｋ，Ｄ．Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｂiｏｃｈｅｍ．Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４５／４６，ｐｐ．６４１−６５３（１９９４）Ｉｓｈiｈａｒａ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂiｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂiｏｅｎｇ．，３７，９４８−９５４（１９９１）

本発明の課題は、リグノセルロース系原料を酵素（セルラーゼ）で糖化処理する方法において、糖化処理で分解されなかった残渣（リグニン含有）に吸着した酵素を効率的に回収する方法を提供する。

本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理した後の固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理することにより、残渣に吸着している酵素を効率的に回収できることを見出し、下記発明を完成した。

（１）リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理し、糖化処理した処理懸濁液を固液分離装置で固形分（残渣）と液体分に分離し、前記固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理することを特徴とするリグノセルロース系原料の糖化処理方法。

（２）前記糖化処理に発酵用微生物を添加して併行糖化発酵処理し、前記併行糖化発酵処理した処理懸濁液を固液分離装置で固形分（残渣）と液体分に分離し、前記固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理することを特徴とする（１）に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。

（３）前記オゾン処理が、前記固液分離装置で分離した残渣に吸着している酵素を遊離させる方法であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の糖化処理方法。

本発明により、糖化処理で分解されなかった未分解残渣に吸着した酵素を効率的に回収することができる。酵素糖化処理工程内における糖化酵素の循環率が長期にわたって高い水準に維持されるため、リグノセルロース原料の酵素糖化処理による糖類やエタノール等を工業的に生産することが可能となる。

本発明のリグノセルロースからのエタノールの製造方法を実施するための装置を示す図である。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

＜リグノセルロース系原料＞
本発明の方法で原料として使用するリグノセルロース系原料としては、木質系として、製紙用樹木、林地残材、間伐材等のチップ又は樹皮、木本性植物の切株から発生した萌芽、製材工場等から発生する鋸屑又はおがくず、街路樹の剪定枝葉、建築廃材等が挙げられ、草本系としてケナフ、稲藁、麦わら、コーンコブ、バガス等の農産廃棄物、油用作物やゴム等の工芸作物の残渣及び廃棄物（例えば、ＥＦＢ：ＥｍｐｔｙＦｒｕｉｔＢｕｎｃｈ）、草本系エネルギー作物のエリアンサス、ミスカンサスやネピアグラス等が挙げられる。
また、バイオマスとしては、木材由来の紙、古紙、パルプ、パルプスラッジ、スラッジ、下水汚泥等、食品廃棄物、等を原料として利用することができる。これらのバイオマスは、単独、あるいは複数を組み合わせて使用することができる。また、バイオマスは、乾燥固形物であっても、水分を含んだ固形物であっても、スラリーであっても用いることができる。

前記木質系のリグノセルロース系原料としては、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属植物、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）属植物、ポプラ属植物、アカシア（Ａｃａｃｉａ）属植物、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）属植物等が利用できるが、ユーカリ属植物、アカシア属、ヤナギ属植物が原料として大量に採取し易いため好ましい。木本性植物由来のリグノセルロース系原料の中では、林地残材（樹皮、枝葉を含む）、樹皮が好ましい。例えば、製紙原料用として一般に用いられるユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）属又はアカシア（Ａｃａｃｉａ）属等の樹種の樹皮は、製紙原料用の製材工場やチップ工場等から安定して大量に入手可能であるため、特に好適に用いられる。

＜機械的処理＞
本発明では、前記リグノセルロース原料に機械的処理を施すことができる。機械的処理としては、切断、裁断、破砕、磨砕等の任意の機械的手段が挙げられ、リグノセルロースを次工程の化学的処理工程で糖化され易い状態にすることである。使用する機械装置については特に限定されないが、例えば、切出し装置、一軸破砕機、二軸破砕機、ハンマークラッシャー、レファイナー、ニーダー、ボールミル等を用いることができる。

前記機械的処理の前工程又は後工程として、異物（石、ゴミ、金属、プラステック等のリグノセルロース以外の異物）を除去するための洗浄などによる異物除去工程を導入することもできる。
原料を洗浄する方法としては、例えば、原料に水を噴射して原料に混合されている異物を除く方法、あるいは、原料を水中に浸漬し異物を沈降させて取り除く方法等が挙げられる。また、メタルトラップ等の装置を用いて、異物を原料から分離する方法が挙げられる。
原料に異物が含まれていると、リファイナーのディスク（プレート）等の機械的処理で用いる装置の部品を破損させる可能性があるし、配管が詰まる等の製造工程内でトラブルを起こす等の問題が発生するため、異物除去工程を導入することが望ましい。

＜化学的処理＞
前記、機械的処理を施したリグノセルロース原料を次に化学的処理する。化学的処理で用いる化学薬品としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムから選ばれる１種以上のアルカリ薬品、又は、亜硫酸ナトリウムと前記アルカリ薬品の中から選ばれる１種以上のアルカリ薬品を含有する溶液に浸漬する化学的処理を含む前処理である。また、オゾン、二酸化塩素などの酸化剤による化学的処理も可能である。
化学的処理は、前記機械的処理と組み合わせてそれらの前処理の後処理として行うことが好適である。

化学的処理で使用する化学薬品の添加量は、状況に応じて任意に調整可能であるが、薬品コスト低下の面から、またセルロースの溶出・過分解による収率低下防止の面から、リグノセルロース系原料の絶乾１００質量部に対して５０質量部以下であることが望ましい。化学的処理における薬品の水溶液への浸漬時間及び処理温度は、使用する原料や薬品によって任意に設定可能であるが、処理時間２０〜１２０分、処理温度８０〜２３０℃が好ましい。処理条件を厳しくすることで、原料中のセルロースの液側への溶出又は過分解が起こる場合もあるため、処理時間は９０分以下、処理温度は２００℃以下であることが好ましい。

（磨砕処理）
本発明では、前記化学的処理により得られたリグノセルロース原料を磨砕処理することが望ましい。磨砕処理で用いる磨砕処理装置としては、レファイナー、ボールミル等が挙げられる。レファイナーを用いる場合、レファイナーのディスク（プレート）のクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲で磨砕することが好ましく、０．１〜１．０ｍｍの範囲で磨砕することがさらに好ましい。使用するレファイナーとしては、シングルディスクレファイナー、ダブルディスクレファイナー等を使用することができ相対するディスクのクリアランスを０．１〜２．０ｍｍの範囲に設定できるレファイナーであれば特に制限なく使用することができる。ディスクのクリアランスが２．０ｍｍを超えると糖化または併行糖化発酵で得られる糖収率が添加するため好ましくない。一方、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーで磨砕処理した後の加水分解物（固形分）の収率が低下するため好ましくない。また、ディスクのクリアランスが０．１ｍｍより低いとレファイナーの運転に要する電気消費量が増大するため好ましくない。

レファイナーのディスク（プレート）の材質、ディスクの型、ディスク面の刃の型、ディスク面に対する刃の方向等のディスクの形状については効果が得られる材質、形状であれば、特に制限なく使用することができる。

前記の磨砕処理が施されたリグノセルロース系原料を水溶液と固形分に固液分離し、固形分を糖化または併行糖化発酵の原料として用いることができる。固液分離する方法としては、例えば、スクリュープレス等を用いて水溶液と固形分に分離することができ、水溶液と固形分に分離することができる装置であれば制限なく使用することができる。

前記の固形分離後の原料を用いて糖化または併行糖化発酵を行う前に殺菌処理を行うことが好ましい。リグノセルロース系バイオマス原料中に雑菌が混入していると、酵素による糖化を行う際に雑菌が糖を消費して生成物の収量が低下してしまうという問題が発生する。
殺菌処理は、酸やアルカリなど、菌の生育困難なｐＨに原料を晒す方法でも良いが、高温下で処理する方法でも良く、両方を組み合わせても良い。酸、アルカリ処理後の原料については、中性付近、もしくは、糖化及び／又は糖化発酵工程に適したｐＨに調整した後に原料として使用することが好ましい。また、高温殺菌した場合も、室温もしくは糖化発酵工程に適した温度まで降温させてから原料として使用することが好ましい。このように、温度やｐＨを調整してから原料を送り出すことで、好適ｐＨ、好適温度外に酵素が晒されて、失活することを防ぐことができる。

前記前処理が施されているリグノセルロース原料が、糖化工程又は一次併行糖化発酵工程へ供給される。

＜糖化工程＞
酵素糖化反応に適した前処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、糖化工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素（セルラーゼ、ヘミセルラーゼ）により糖化（セルロース→グルコース、ヘミセルロース→グルコース、キシロース）される。

＜併行糖化発酵工程＞
酵素糖化反応に適した前処理が施されたリグノセルロース系原料は、適量の水と酵素と混合されて原料懸濁液とされ、さらに酵母等の微生物と混合されて併行糖化発酵工程へ供給される。リグノセルロース系原料は酵素により糖化され、生成された糖類が発酵微生物（酵母など）によりエタノールに発酵される。

糖化工程又は併行糖化発酵工程で用いるリグノセルロース系原料の懸濁濃度は、１〜３０質量％であることが好ましい。１質量％未満であると、最終的に生産物の濃度が低すぎて生産物の濃縮のコストが高くなるという問題が発生する。また、３０質量％を超えて高濃度となるにしたがって原料の攪拌が困難になり、生産性が低下するという問題が発生する。

糖化工程又は併行糖化発酵で使用するセルロース分解酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータグルコシダーゼ活性を有する、所謂セルラーゼと総称される酵素である。
各セルロース分解酵素は、夫々の活性を有する酵素を適宜の量で添加しても良いが、市販されているセルラーゼ製剤は、上記の各種のセルラーゼ活性を有すると同時に、ヘミセルラーゼ活性も有しているものが多いので市販のセルラーゼ製剤を用いれば良い。

市販のセルラーゼ製剤としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ファネロケエテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）属、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）属、フーミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに由来するセルラーゼ製剤がある。このようなセルラーゼ製剤の市販品としては、全て商品名で、例えば、セルロイシンＴ２（エイチピィアイ社製）、メイセラーゼ（明治製菓社製）、ノボザイム１８８（ノボザイム社製）、マルティフェクトＣＸ１０Ｌ（ジェネンコア社製）、ＧＣ２２０（ジェネンコア社製）等が挙げられる。
原料固形分１００質量部に対するセルラーゼ製剤の使用量は、０．５〜１００質量部が好ましく、１〜５０質量部が特に好ましい。

糖化工程又は併行糖化発酵工程での反応液のｐＨは３．５〜１０．０の範囲に維持することが好ましく、４．０〜７．５の範囲に維持することがより好ましい。

糖化工程または併行糖化発酵工程での反応液の温度は、酵素の至適温度の範囲内であれば特に制限はなく、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がさらに好ましい。反応は、連続式が好ましいが、セミバッチ式、バッチ式でも良い。反応時間は、酵素濃度によっても異なるが、バッチ式の場合は１０〜２４０時間、さらに好ましくは１５〜１６０時間である。連続式の場合も、平均滞留時間が、１０〜１５０時間、さらに好ましくは１５〜１００時間である。

＜発酵工程＞
糖化工程と発酵工程を別の反応槽で行う場合は、前記糖化工程後の処理液は、発酵工程へ移送し発酵微生物を用いて発酵を行う。

発酵工程、又は併行糖化発酵工程では、糖類（六炭糖、五炭糖）が発酵できる発酵微生物を用いる。発酵微生物としては、サッカロマイセス・セラビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、キャンディダ・シハタエ（Ｃａｎｄｉｄａｓｈｉｈａｔａｅ）、パチソレン・タノフィルス（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓsａｔｃｈｅｎｋｉa ｏｒｉｅｎｔaｌｉｓ）等の酵母やザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓｍｏｂｉｌｉｓ）等の細菌が挙げられる。また、遺伝子組換技術を用いて作製した遺伝子組換微生物（酵母、細菌等）を用いることもできる。遺伝子組換微生物としては、六炭糖と五炭糖を同時に発酵できる微生物を特に制限なく用いることができる。

微生物は固定化しておいても良い。微生物を固定化しておくと、次工程で微生物を分離して再回収する工程を省くことができるため、少なくとも回収工程に要する負担を軽減することができ、微生物のロスが軽減できるというメリットがある。また、凝集性のある微生物を選択することにより微生物の回収を容易にすることができる。

＜第一固液分離工程＞
前記併行糖化発酵工程又は発酵工程から排出された培養液は、固液分離装置へ移送し液体分（濾液）と固形分（残渣）に分離する。固液分離を行う装置としては、スクリュープレス、スクリーン、フィルタープレス、ベルトプレス、ロータリープレス等を用いることができる。スクリーンとしては、振動装置が付加された振動スクリーンなどを用いることができる。固液分離で用いるメッシュサイズは、１．２５〜６００メッシュが好ましく、６０〜６００メッシュがさらに好ましい。

＜オゾン処理＞
本発明では、前記固液分離装置で分離した残渣をオゾン処理する。オゾン処理の方法としては一般に用いられるオゾン発生装置等によりオゾンを製造し、水溶液に懸濁した状態の残渣懸濁液にオゾンを吹き込む。残渣懸濁液の固形分濃度は、１〜３０質量％が好ましく、５〜２０質量％がさらに好ましい。残渣懸濁液中のオゾン濃度は、１〜３００ｍｇ／Ｌが好ましく、２０〜２００ｍｇ／Ｌがさらに好ましい。オゾン処理中の残渣懸濁液を攪拌することが残渣とオゾンの接触が良くなるため望ましい。固形分濃度が３０質量％を超えると残渣の攪拌が困難になるため好ましくない。上記の方法で糖化（又は併行糖化発酵）処理後の未分解残渣（リグニン含有）にオゾン処理を行うことにより、未分解残渣に吸着している酵素が遊離されて酵素を効率的に回収することができる。オゾン処理により、未分解残渣に含まれるリグニンが酸化し帯電することにより残渣に吸着している酵素と反発し合い酵素が遊離される。
オゾン処理した後の残渣懸濁液は、酵素を含有する水溶液の状態で糖化工程又は併行糖化発酵工程へ循環させて糖化又は糖化発酵の原料として用いることもできる。残渣懸濁液を第二固液分離工程で固液分離装置により固形分（残渣）と液体分（酵素含有）に分離し、固形分と液体分を別々に糖化工程又は併行糖化発酵工程へ循環させることもできるし、液体分のみを糖化工程又は併行糖化発酵工程へ循環させても良い。

第一固液分離工程で分離された液体分（濾液）は蒸留工程へ移送される。

＜エタノール蒸留工程＞
併行糖化発酵工程、又は発酵工程から排出された培養液は、蒸留工程で減圧蒸留装置等のエタノール分離装置により発酵生成物（エタノール等）を蒸留分離することができる。減圧下では低い温度で発酵生成物を分離できるため、酵素の失活を防ぐことができる。減圧蒸留装置としては、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどを用いることができる。
蒸留温度は２５〜６０℃が好ましい。２５℃未満であると、生成物の蒸留に時間がかかって生産性が低下する。また、６０℃より高いと、酵素が熱変性して失活してしまい、新たに追加する酵素量が増加するため経済性が悪くなる。
蒸留後の蒸留残渣留分中に残る発酵生成物濃度は０．１質量％以下であることが好ましい。このような濃度にすることによって、後段の固液分離工程において固形物とともに排出される発酵生成物量を低減することができ、収率を向上させることができる。

蒸留後の発酵生成物（エタノール等）を分離した後の蒸留残液は、固液分離装置により残渣と液体分に分離することができる。分離された残渣には、酵素、リグニン、発酵微生物が含まれている。残渣に吸着している酵素を遊離させて回収し、再利用することもできる。リグニンは、燃焼原料として回収しエネルギーとして利用することもできるし、リグニンを回収し有効利用することもできる。発酵微生物（酵母など）を残渣から分離して、糖化又は併行糖化発酵工程で再利用することもできる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［実施例１］
図１に示す製造フローで実施した。
［前処理］
チップ状のユーカリ・グロブラスの林地残材（樹皮７０％、枝葉３０％）を２０ｍｍの丸孔スクリーンを取り付けた一軸破砕機（西邦機工社製、ＳＣ−１５）で破砕し原料として用いた。
［化学的処理］
上記原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して９７％亜硫酸ナトリウム２００ｇ及び水酸化ナトリウム１０ｇを添加後、水を添加し水溶液の容量を８Ｌに調製した。前記原料懸濁液を混合後、１２０℃で１時間加熱した。加熱処理後の原料懸濁液をレファイナー（熊谷理器工業製、ＫＲＫ高濃度ディスクレファイナー）でディスク（プレート）のクリアランスを１．０ｍｍに設定し磨砕した。次に６０メッシュ（２５０μm）のスクリーンを用いて磨砕処理後の原料懸濁液を固液分離（脱水）することにより溶液の電気伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の固形分を原料として併行糖化発酵を行った。

［併行糖化発酵］
予め、液体培地（グルコース３０ｇ／Ｌ、ポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）５０Ｌで酵母としてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（市販酵母、商品名：商品名：Ｍａｕｒｉｖｉｎ: ＭａｕｒｉＹｅａｓｔＡｕｓｔｒａｌｉａＰｔｙＬｉｍｉｔｅｄ）を３０℃で２４時間培養した。
図１に示す糖化発酵槽ＢＲ１にポリペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌとなるように各々を添加後，水を添加し最終容量を０．８ｍ^３に調整した。酵母菌体を含む培養液を糖化発酵槽ＢＲ１に添加し２４時間培養した。酵母の密度が、１ｘ１０^８／ｍｌに増殖した時点で、市販セルラーゼ溶液（マルティフェクトＣＸ１０Ｌ、ジェネンコア社製）５０Ｌ、及び原料１００ｋｇ（乾燥重量）を糖化発酵槽ＢＲ１に添加した。次に、糖化発酵槽ＢＲ１に水を添加し培養液の最終容量を１ｍ^３に調製した。培養液のｐＨを５．０に調整し３０℃で併行糖化発酵を開始した。糖化発酵槽ＢＲ１内での培養液の滞留時間（原料懸濁液が糖化発酵槽ＢＲ１を通過する時間：糖化発酵槽ＢＲ１の容量／流速）を２０時間に設定し糖化発酵行った。すなわち、糖化発酵を開始した時点から、固形分濃度（乾燥重量当たり）が１０質量％の原料懸濁液（原料を水に懸濁）を流速５０Ｌ／ｈで糖化発酵槽ＢＲ１の原料供給口１から連続的に添加した。一方、原料供給開始と同時に糖化発酵槽ＢＲ１の培養液排出口２より原料懸濁液を５０Ｌ／ｈで排出し、固液分離工程へ移送した。また、前記セルラーゼ溶液を２．５Ｌ／ｈで糖化発酵槽ＢＲ１に連続的に添加した。尚、連続運転中に培養液が減少した場合、自動的に培地を添加することにより培養液の最終容量を１ｍ^３に維持した。培養中の培養液のｐＨを５．０に維持した。

［固液分離］
前記一次併行糖化発酵工程から排出された原料懸濁液を、固液分離装置Ｓ：スクリュープレス（富国工業株式会社製ＳＨＸ−２００ｘ１５００Ｌ、スクリーンサイズ１．２ｍｍ（１４メッシュ））で固液分離して固形分と液体分（濾液）を分離した。固形分については前記併行糖化発酵工程へ供給し糖化の原料として再利用した。一方、液体分については、蒸留工程へ移送した。

［エタノール蒸留］
前記固液分離で分離した液体分を減圧蒸留装置ＥＶ（エバポールＣＥＰ−１、大川原製作所）で蒸留温度：４０℃、加熱温度：８０℃、供給液量：９５Ｌ／ｈの条件でエタノールを含む水溶液と濃縮液に分離した。

［残渣分離］
減圧蒸留装置ＥＶから分離された濃縮液をデカンタ式遠心機（ＩＨＩ製、ＨＳ−２０４Ｌ形）で回転数４５００rpm、差速５．０rpmで運転し、固形分（残渣Ａ）と液体分（濾液）に分離した。液体分はライン７を経由して糖化発酵槽ＢＲ１へ移送した。

［残渣のオゾン処理］
前記で分離した残渣Ａを水に懸濁し１０質量％濃度の残渣懸濁液を調製した。オゾン発生装置により製造したオゾンを原料懸濁液に吹き込み、原料懸濁液に含まれるオゾン濃度が１００ｍｇ／Ｌになるようにし３０分間処理した。次に４００メッシュ（３２μm）のスクリーンを用いて残渣懸濁液を固液分離により固形分（残渣Ｂ）と液体分に分離することにより溶液の電気伝導度が３０μＳ／ｃｍになるまで水で洗浄した。固液分離後の残渣Ｂを原料として下記の方法で酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。結果を表１に示す。

［酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験］
原料（残渣Ｂ）の最終濃度５質量％、ＣＳＬ（コーンスティープリカー）を最終濃度１質量％、硫酸アンモニウムを最終濃度０．５質量％、となるように調製した水溶液にセルラーゼ１０ｍｌ（商品名、ＧＣ２２０：ジェネンコア社製）を添加した。３０℃、１２０ｒｐｍの攪拌下で糖化反応を行い、２４時間後の反応液１ｍｌを回収し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した上清の酵素活性を測定した。

酵素回収で最も重要とされるベータ−グルコシダーゼの活性を指標にして回収率を算出した。活性測定は以下に示す方法で行った。結果を表１に示す。
（ベータ−グルコシダーゼ活性）
ベータ−グルコシダーゼ活性の測定は、１．２５ｍＭ４−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｒｉｆｅｒｙｌ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅを含む１２５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１６μｌに、酵素液４ｕｌ加え、３７℃、１０分間反応を行った後、５００ｍＭｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１００μｌを添加して反応を停止させ、３５０ｎｍの励起光での４６０ｎｍの蛍光強度を測定することで行った。酵素回収率は以下の計算式から求めた。
酵素回収率（％）＝（上清の酵素活性／添加した酵素活性）ｘ１００

［実施例２］
実施例１（[化学的処理]）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して水酸化カルシウム２００ｇを添加し化学的処理を行った以外は全て実施例１と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［実施例３］
実施例１（[化学的処理]）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して水酸化ナトリウム２００ｇを添加し化学的処理を行った以外は全て実施例１と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［実施例４］
実施例１（[化学的処理]）において、原料１ｋｇ（絶乾重量）に対して水酸化ナトリウム１００ｇを添加し化学的処理を行った以外は全て実施例１と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［比較例１］
実施例１において、残渣Ａのオゾン処理を行わない試験を比較例１とした。尚、実施例１で調製した残渣Ａを用いて酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。それ以外の操作は全て実施例１と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［比較例２］
実施例２において、残渣Ａのオゾン処理を行わない試験を比較例２とした。尚、実施例２で調製した残渣Ａを用いて酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。それ以外の操作は全て実施例２と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［比較例３］
実施例３において、残渣Ａのオゾン処理を行わない試験を比較例３とした。尚、実施例３で調製した残渣Ａを用いて酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。それ以外の操作は全て実施例３と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

［比較例４］
実施例４において、残渣Ａのオゾン処理を行わない試験を比較例４とした。尚、実施例４で調製した残渣Ａを用いて酵素（セルラーゼ）吸着抑制試験を実施した。それ以外の操作は全て実施例４と同様の方法で試験した。結果を表１に示す。

表１に示すように、糖化処理で分解されなかった未分解残渣をオゾン処理した試験では未分解残渣に吸着している酵素が遊離された。

１：原料供給口
２：併行糖化発酵槽排出口
３：固形分移送ライン
４：液体分移送ライン
５：蒸留後濃縮液移送ライン
６：残渣排出ライン
７：液体分循環ライン
ＢＲ１：併行糖化発酵槽
Ｓ：固液分離装置
ＥＶ：減圧蒸留装置
Ｃ：残渣分離装置

Claims

リグノセルロース系原料を酵素で糖化処理し、糖化処理した処理懸濁液を固液分離装置で固形分（残渣）と液体分に分離し、前記固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理することを特徴とするリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
前記糖化処理に発酵用微生物を添加して併行糖化発酵処理し、前記併行糖化発酵処理した処理懸濁液を固液分離装置で固形分（残渣）と液体分に分離し、前記固液分離装置で分離された残渣をオゾン処理することを特徴とする請求項１に記載のリグノセルロース系原料の糖化処理方法。
前記オゾン処理が、前記固液分離装置で分離した残渣に吸着している酵素を遊離させる方法であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の糖化処理方法。