JP2015096494A - 生体内酸化還元状態改善剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 プロテアソーム活性阻害条件下における生体内酸化還元状態改善剤（レドックスモジュレーター）を提供すること。
【解決手段】 セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有することによりプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤および該改善方法。生体内の酸化還元状態の改善が、ミトコンドリア内部活性酸素種を減少させることである、またはミトコンドリア活性を維持することである。
【選択図】図４

Description

本発明は、生体内酸化還元状態改善剤（レドックスモジュレーター）に関する。より詳細には、プロテアソーム活性低下条件下におけるセサミン類による生体内酸化還元状態の改善に関するものであり、プロテアソーム活性低下でのミトコンドリア活性維持機能により、細胞に生存活性を付与することで、老化やアルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化などの進行抑制に有用である生体内酸化還元状態改善剤（レドックスモジュレーター）に関する。

最近、活性酸素による生体内の細胞や組織で見られる様々な傷害が注目されている。活性酸素は非常に反応性が高く、生体の様々な成分や組織を破壊することにより、脳卒中、心筋梗塞、白内障、リウマチ、癌、胃潰瘍、皮膚におけるしわやしみなどの様々な疾患に関与していることが明らかになってきている。活性酸素が増加する要因としては、加齢、紫外線暴露、精神的ストレスなどが知られ、活性酸素が増加すると、生体内に酸化されたタンパク質、いわゆる異常タンパク質が蓄積して様々な疾患を引き起こすとされている。これまでに、活性酸素による酸化障害を防ぐために、抗酸化物質を摂取することにより生体内の活性酸素を減少させてタンパク質の酸化を抑制するという試みがなされてきた。代表的な抗酸化物質としてトコフェロール類、カロテノイド類、フラボノイド類、ごまリグナンなどが知られており、これらのいくつかは食品や化粧品に配合されて利用されている。

例えば、天然物由来の成分を有効成分とすることにより安全性に懸念がなく、肌荒れの改善や皮膚の老化防止に優れた効果を発揮する食品材料、化粧料、医療材料として、ゴマ種子に含有される抗酸化剤であるセサミン、セサモリン、エピセサミン、セサモール、セサミノール、セサモリノールなどを含むゴマリグナン類と飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸と酵素との有効成分を含有するゴマ抽出物が提案されている（特許文献１）。また、抗酸化作用、抗高血圧作用、抗炎症作用などの生理活性が公知であるセサミン類とガンマーオリザノールとを含有する組成物からなるセサミンの生理活性を高めた食品組成物（特許文献２）や、セサミン類を包接化合物により包接またはリポソームに内包することによりセサミン類が有する各種生理活性を飛躍的に高めた、セサミン類の複合体が提案されている（特許文献３）。

また、異常タンパク質の生体内での蓄積は、活性酸素の酸化作用や年齢とともに増加し、アルツハイマー病、パーキンソン病などの神経変性疾患に共通した発病機構に関与することが明らかになってきた。生体内における異常タンパク質の蓄積に起因する疾病の予防および改善が大きな課題となっているが、異常タンパク質の蓄積防御に関しては、酸化ストレスにより生体内に発生した活性酸素を抗酸化物質の摂取により消去してタンパク質の酸化を抑制するという試みがなされている。

生体内の異常タンパク質を除去する酵素としてプロテアソームが知られている。プロテアソームは複雑な分子構成をした巨大な多成分複合体からなり異常タンパク質の除去を行い、タンパク質の品質管理の役割を担うとともに、紫外線や酸化などにより、変異や障害を受けたタンパク質を除去することに密接に関係している。例えば、生体内のプロテアソームの異常が発症した場合には、その活性を促進し、種々の疾病を予防および改善する組成物が提案されている。例えば、マンネンタケの抽出物を含むプロテアソーム活性促進剤（特許文献４）、プロテアソーム活性促進作用をもつ大豆サポニンを含む異常タンパク質除去剤（特許文献５）や、プロテアソーム活性促進作用をもつケールおよび／またはその抽出物を含む異常タンパク質除去剤（特許文献６）が提案されている。

従来、ゴマ油、ゴマ種子やゴマ粕からセサミン類を分離する方法としては、例えば、ゴマ油とは実質的に非混和性であり、かつセサミン類を抽出、溶解することができる種々の有機溶剤（アセトン、メチルエチルケトン、ジエチルケトン、メタノール、エタノール等）を用いて、抽出、濃縮し、溶剤画分から溶剤を蒸発除去してセサミン類を得る方法（抽出分離法）などが知られている（特許文献７、８）。また、ゴマ油を減圧下に水蒸気蒸留して得られるセサミン類を含有する留出物、例えばゴマ油の精製（脱臭）工程で生じる脱臭留出物である脱臭スカムなどからセサミン等を分離する方法も種々知られている。例えば、特許文献９にはセサミン類を分離製造する方法において、ゴマ油製造の脱臭工程で生じる脱臭スカムを静置し、その上層の液状部分を除いて得た固形部を原料とし、原料に一種類の溶剤による温度の異なる二回以上の処理だけからなる洗浄・精製工程を施してセサミン類を分離製造すること、温度の異なる二回以上の処理が、少なくとも常温で行う一回目の処理と、５０℃以上の温度で行う二回目の処理からなること、および上記溶剤は、エタノールが９０容量％以上のエタノールであることを特徴とする方法が開示されている。

セサミノール配糖体の製造については、セサミノール配糖体を含有するゴマ由来の原料と水を混合してこれを耐圧容器に投入し、１００〜１５５℃の温度範囲で５〜６０分間保持することを特徴とするセサミノール配糖体を含有する水熱処理抽出物を製造する方法が提案されており、セサミノール配糖体を効率よく経済的に抽出することができる（特許文献１０）。また、セサミノール３配糖体を高濃度で含有しており且つ油分を適量の割合で含有していて、しかも食品として優れた色調、香味及び食感を有する、新規の胡麻種子由来の食品材料も提案されている（特許文献１１）。

特開２０１０−１２６７号公報 特開２０１０−１７８７６３号公報 特開２０１０−２４２４０号公報 特開２００２−２９９９６号公報 特願２００２−１７９５９２公報 特開２００４−９１３９８号公報 特公平７−２５７６４号公報 特開平３−２７３１９号公報 特許第４８６３５３２号公報 特開２０１４−９７９３２号公報 特開平１０−２３４３４２号公報

Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ａｇｒｉｃ. Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ. (２００３)５１, ｐｐ.１６６６-１６７０ Ｉｄｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ Ａｃｔａ (２００１) １５３４,ｐｐ.１-１３ Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ., Ｊ. ｏｆ ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ (１９９１)３２,ｐｐ.６２９-６３８ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｉａｎｎｉ ａｎｄ Ｇｏｎｏｓ ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ(２００８)６０.ｐｐ.６５１-６５５ 並木満夫 ・小林貞作編「ゴマの科学」朝倉書店、１９８９年１０月１０日発行、６２頁、１６０頁 並木満夫編「ゴマ―その科学と機能性」丸善(株)、丸善出版(株)、１９９８年１１月１日発行、２６頁

摂食による細胞内酸化還元状態の変化が生体に多様な影響を及ぼすことは現象論として多く報告されている。古来よりごまの持つ健康増進効果は広く知られており、近年の研究からごまリグナンの持つ高い生理活性が報告されてきた。その主なものとしては、生化学的なアッセイによるラジカルの消去活性（非特許文献１）の発見、また個体レベルで見出されたコレステロールを含む脂質代謝の調節（非特許文献２、３）などがあげられる。
本発明者らは、老化などに伴う細胞レベルでの変化として、プロテアソーム活性の低下に着目している（非特許文献４）。プロテアソームは細胞内の変性タンパク質などを分解するタンパク質分解酵素複合体であり、異常タンパク質蓄積を抑制する重要な機構のひとつである。これまでに本発明者らは、蛍光レドックスセンサータンパク質レドックスフロールを用い培養細胞株を対象とした実験において、プロテアソーム阻害剤添加、すなわちプロテアソームの能力低下が細胞内酸化を引き起こすことを検出していた。本結果が細胞老化などを模しているものとみなすと、その際の細胞内酸化を抑制する効果を持つ化合物を探索することで、抗老化作用を持つ新たな成分の発見に資すると考え、プロテアソーム能の低下した細胞内での抗酸化作用を発揮する化合物を見出すことを目標として研究、開発を開始することとした。
すなわち、本発明の目的は、生体内酸化還元状態改善剤（レドックスモジュレーター）を提供することである。より詳細には、プロテアソーム活性低下条件下における生体内酸化還元状態の改善を目的としており、プロテアソーム活性低下でのミトコンドリア活性維持機能により、細胞に生存活性を付与することができる物質を提供しようとしている。プロテアソームが阻害されて発症する疾病としては、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化などが知られており、本発明によりこれらの疾病による症状の緩和を図る物質を提供しようとしている。

本発明は、１）ごまリグナン、特にセサミンの持つプロテアソーム阻害条件下での抗酸化作用を見出し、活性酸素種の発生源として知られるミトコンドリア状態に与える影響も含めて、セサミンが持つ生理的な効果を検定した結果を根拠とする。また、２）ごま油製造過程の各段階での産物、副生成物からの熱水抽出サンプルのうち、特にごま１次圧搾粕からの抽出サンプルもまた、プロテアソーム阻害時の酸化抑制効果や生理活性を持つことを見出した。
プロテアソームが阻害された生体内では異常たんぱく質の分解が停止されることにより異常たんぱく質が蓄積する。異常たんぱく質の蓄積は、老化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患の共通した発病機構であるとされている。プロテアソームの阻害下においては、細胞内酸化がさらに引き起こされることとなる。本発明者らは、プロテアソーム阻害下における細胞内酸化を防止することができる物質を見出すことを目標にして鋭意努力することにより、まず、セサミン、エピセサミンおよびセサミノールからなるごまリグナンによるプロテアソーム阻害下における酸化防止作用を見出した。
セサミン、エピセサミン、セサミノール、セサモリン、セサモ−ル、セサミノール配糖体などのごまリグナン類は抗酸化剤として知られている物質ではあるが、抗酸化剤として知られているごまリグナンの中でも、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体がプロテアソーム阻害下に細胞内酸化を抑制することを見出し本発明に到達したのである。

本発明は以下の（１）ないし（４）のプロテアソーム阻害条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤を要旨とする。
（１）セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有することを特徴とするプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤。
（２）生体内の酸化還元状態の改善が、ミトコンドリア内活性酸素種を減少させることである上記の（１）に記載の生体内酸化還元状態改善剤。
（３）生体内の酸化還元状態の改善が、ミトコンドリア活性を維持することである上記の（１）に記載の生体内酸化還元状態改善剤。
（４）生体内の酸化還元状態の改善が、細胞生存活性を上昇させることである上記の（１）に記載の生体内酸化還元状態改善剤。

また、本発明は以下の（５）のプロテアソーム活性低下条件下にある生体内酸化還元状態を改善するための医薬品組成物を要旨とする。
（５）上記の（１）ないし（４）のいずれかに記載の生体内酸化還元状態改善剤または薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内酸化還元状態を改善するための医薬品組成物。

本発明により、プロテアソーム阻害条件下（プロテアソーム活性低下条件下）にある生体内の酸化還元状態改善剤を提供することができる。本発明のプロテアソーム阻害条件下（プロテアソーム活性低下条件下）にある生体内の酸化還元状態改善剤により、プロテアソーム活性が低下した生体内で、酸化作用によって異常たんぱく質が蓄積することで生起される症状を抑えることができる。例えば、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化など蛋白質分解異常による疾病の予防または治療に効果が期待できる。プロテアソーム活性が低下した生体内での抗酸化作用に加え、ミトコンドリア内活性酸素種の低減効果、ミトコンドリア膜電位の維持効果を発揮することが可能となる。これらにより、細胞に生存活性の上昇などの効果を付与することができる。すなわち、本発明により、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内酸化還元状態を改善するための医薬品組成物を提供することができる。

プロテアソーム阻害時における、セサミンおよびその類縁体化合物の細胞内酸化抑制効果を示す。 プロテアソーム阻害条件でセサミンがもたらすミトコンドリア内活性酸素種の低減効果を示す。 プロテアソーム阻害条件での、セサミンがもたらすミトコンドリア膜電位の維持効果を示す。 プロテアソーム阻害条件での細胞生存活性に与えるセサミンの効果を示す。 ＸＡＤ-２０００カラムによるごま圧搾粕熱抽出物の各画分の示すプロテアソーム阻害時の生理活性を示す。図中、Ｎｏｎｅ：培地のみ、ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ：ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ ０．５μＭ セサミノール３配糖体によるプロテアソーム阻害時の生理活性を示す。図中、Ｎｏｎｅ：培地のみ、ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ：ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ ０．５μＭ、ＳＧ：セサミノールトリグリセリド 数字（２．５、５、１０）は全て添加濃度（μＭ）を示す。

本発明は、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有させたことを特徴とする老化などを模したプロテアソーム阻害条件下（すなわち、プロテアソーム活性低下条件下、プロテアソーム能の低下した条件下）にある生体内の酸化還元状態改善剤、および生体内酸化還元状態を改善するための医薬品組成物に関し、ミトコンドリア内活性酸素種の低減、ミトコンドリア活性の維持、細胞生存活性の上昇などの効果を奏するものである。

プロテアソームが阻害された生体内では異常たんぱく質の分解が停止されることにより異常たんぱく質が蓄積する。異常たんぱく質の蓄積は、老化、パーキンソン病、アルツハイマー病などの神経変性疾患の共通した発病機構であるとされている。また、プロテアソームの阻害下においては、細胞内酸化がさらに引き起こされることとなる。本発明者らは、プロテアソーム阻害剤を添加してプロテアソーム阻害条件下をつくって実験をした。プロテアソーム阻害条件下、すなわちプロテアソーム活性低下条件下、またはプロテアソーム能の低下した条件下が細胞老化を模しているものとみなして、プロテアソーム阻害下における細胞内酸化を防止することができる物質を見出すことを目標にして鋭意努力することにより、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体からなるごまリグナンによるプロテアソーム阻害下における酸化防止作用を見出した。
セサミン、エピセサミン、セサミノール、セサミノール配糖体、セサモリン、セサモールなどのごまリグナン類は抗酸化剤として知られている物質ではあるが、抗酸化剤として知られているごまリグナンの中でも、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体がプロテアソーム阻害下に細胞内酸化を抑制することを見出し本発明に到達したのである。

［プロテアソーム］
プロテアソーム（ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ) はタンパク質分解を行う巨大な酵素複合体であり、真核微生物の細胞において細胞質および核内のいずれにも分布している。ユビキチンにより標識されたタンパク質をプロテアソームで分解する系はユビキチン−プロテアソームシステムと呼ばれ、細胞周期、細胞周期制御、免疫応答、シグナル伝達といった細胞中の様々な働きに関わる機構である。プロテアソームは目的蛋白質を特異的に分解し、細胞内から除去するものである。このたんぱく質分解系は、代謝、細胞周期、ストレス応答、小胞体の品質管理、神経機能、免疫応答など重要な生命現象に普遍的に関わっている。そのため、プロテアソーム異常によって適切な分解が破綻するとタンパクの過剰または過少が発生して多様な神経障害あるいは個体の異常を生じる。
プロテアソーム異常によって適切な分解が破綻するとたんぱく質の過剰が発生してその結果異常たんぱく質が蓄積され、多用な細胞障害、個体の異常を生じることで、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化などが発症することが知られている。

本発明で使用するごまリグナンとしては、セサミン、エピセサミン、セサミノール、セサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンである。「ごまリグナン」には、セサミンやセサモリン、セサミノールなど、いろいろな種類がある（非特許文献５の１６０頁参照）。ごま油中にセサミンは０．３４０〜１１．３％含まれている（非特許文献５の６２頁参照）。ごま脱脂粕中にセサミノール配糖体は０，８６８％含まれている（非特許文献６の２６頁の表２．１参照）。セサミノール配糖体はセサミノールに糖の分子がついたものであり、体内に入ると腸内細菌の働きにより、セサミノールに変換する。そして、腸管から吸収される。セサミノール配糖体は、ゴマ科植物の抽出物から単離されるが、ゴマ以外の植物体、例えば、ゴマと同じゴマ科の植物やコショウ科、ミカン科、ゴマノハグサ科、ウマノスズクサ科、モクセイ科、ウコギ科等の植物にも存在する可能性がある。これら抽出原料の中でも、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ．）は入手が容易であり、ゴマ種子は、古来から洗いゴマ、煎りゴマ、すりゴマ、練りゴマ等のゴマ種子そのものを食用として利用されている他、ゴマ油としても広く利用されている。また、ゴマはセサミノール配糖体の抽出とその後の精製が容易であるなど、有利な性質を備えているので、抽出原料として最も好ましい。抽出原料であるゴマは、その種類及び産地の如何を問わず、種子、地上部、地下部のいずれをも使用することができる。前記抽出原料は、抽出効率を向上させる観点から適当な大きさに粉砕してから、必要に応じてヘキサン等により脱脂し、この脱脂した抽出原料を水又は親水性有機溶媒及びこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点程度の温度で抽出処理する。なお、抽出によらずセサミノール配糖体含有エキスを得る方法として、新鮮な植物体を原料にして搾汁する方法を採用することもできる。
実施例で用いたセサミノール配糖体は以下の方法で製造したが、その方法に限定されるものではない。ごま圧搾粕と水を混合し、１００±５℃のオイルバスで５〜６０分間保持し、その後、そのごま圧搾粕水溶液をろ過し、ごま圧搾粕の熱水抽出物をろ液として得た。この熱水抽出物を凍結乾燥し、吸着性樹脂カラムを用いて、カラムを蒸留水、２０％、６０％、９９％のメタノールの順にて溶出し、最後にアセトンで溶出した。各画分の液体を凍結乾燥で除去し、ＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁してＭＴＴアッセイ（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｎｅ Ｂｒｏｍｉｄｅ法）に供した。水量、温度、時間によって、セサミノール配糖体の抽出量は変わるが、抽出は可能である。

本発明は、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善する必要のある動物にプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善する方法を提供することができる。プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善するには、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善する必要のある動物に、非経口または腸内経路により有効量のセサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有するプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤を投与して行う。
そして、以下の段階（ア）および（イ）を含むことを特徴とする。
記
（ア）セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを摂取させる段階、
（イ）プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態において検出可能な
（ａ）プロテアソーム活性低下条件下の細胞内レドックスフロールの示すＦＲＥＴ値、
（ｂ）プロテアソーム活性低下条件下のミトコンドリア内活性酸素種レベル、
（ｃ）プロテアソーム活性低下条件下のミトコンドリア電位、または
（ｄ）プロテアソーム活性低下条件下での細胞生存活性値
により、細胞内レドックスを正常に回復させたことを確認する段階。
前記動物が哺乳類であり、好ましくはヒトである。

また、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有するプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤を、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンの含有量として３から６０ｍｇ／日の割合で摂取させることを特徴とする。

さらにまた、本発明により、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善用飲食物を提供することができる。すなわち、上記のプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤を、セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンの含有量として食品に０．０１〜１００重量％の範囲で含む、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善のためにセサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンの1日用量を３から６０ｍｇ／日として継続して摂取させるための、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善用飲食物として提供することができる。

［蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）］
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を利用し生体内の反応を可視化するFRET プローブ群を利用してプロテアソーム阻害下における細胞内の抗酸化作用を定量的に検討した結果に基づいている。
細胞外からシグナルが入力されると多数の分子が相互作用するが、その相互作用は、時間的、空間的に様々に変化する。そして、それら多様な相互作用は、細胞の分化、細胞骨格の再構成、遺伝子発現、といった生命現象として最終的に出力される。こうした細胞内シグナル伝達に関わる分子の同定や機能解析は従来、遺伝学的、生化学的、分子生物学的手法によって行われてきた。これら既存の手法は目的の分子のシグナルカスケードにおける位置や、試験管内での酵素活性を知るには有効であるが、“細胞内のどの部位で、いつ”という時空間的な情報を知ることはできなかった。この問題を解決するために、近年開発された蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し生体内の反応を可視化したものであり、本発明の実施例において抗酸化性作用の測定に採用した。

次に、プロテアソーム阻害条件でのセサミンなどによる抗酸化作用を実証するにあたり行った実験方法を示す。使用した主な物質は、セサミンなどの物質のほかは、プロテアソーム阻害剤としてボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、溶媒としてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、抗酸化剤（ポジティブコントロール用）としてレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ)、ミトコンドリア電子伝達系阻害物質としてロテノン（ｒｏｔｅｎｏｎｅ）である。

［実験方法１］
プロテアソーム阻害時の細胞内レドックスフロールの示すＦＲＥＴ値の定量化は以下の方法により行った。
１． トリプシン処理したレドックスフロール発現ＣＨＯ細胞を直径３．５ｃｍのガラスボト ムカルチャーディッシュに移し、ウシ血清（１０％）含有Ｆ−１２培地で、ＣＯ_２インキュペーター（３７℃、ＣＯ_２濃度：７％）内で面積比７０％となるまで培養した。
２． ボルテゾミブ（１μＭ）添加と同時に、セサミン、またはその類似化合物（いずれもＤＭＳＯで１０ｍＭとなるよう溶解したものをストック溶液として−８０℃保存）を終濃度で１０μＭ となるよう対象細胞株の培養液（Ｆ−１２培地）に加え、ＣＯ_２インキュベーターにて３７で、８時間静置した。
３． データ取得はオリンパス社製蛍光顕微鏡ＩＸ７０、およびフォトメトリクス社製ＣｏｏｌＳｎａｐ ＨＱ２ ＣＣＤカメラにて、細胞内発現レドックスフロールからの蛍光シグナルをＣＦＰフィルター、ＦＲＥＴフィルターを通して収得した。シグナルの取得はサンプルごとに３視野を選んで行った。
４． 得られた観察像１視野につき、少なくとも４０の細胞内に位置する点を選択し、それぞれの点でのＣＦＰ強度、ＦＲＥＴ強度をモレキュラーデバイス社製メタモルフ７．０ソフトウェアの領域測定プログラムを用いて測定した。また細胞のない部分の強度も、バックグラウンドとして測定した。抽出強度値からバックグラウンド数値を差し引いた後、ＦＲＥＴ強度の数値をＣＦＰ強度の数値で割ったものをＦＲＥＴ比として算出した。

［実験方法２］
プロテアソーム阻害時のミトコンドリア内活性酸素種レベルの可視化は以下の方法により行った。
１． ２×１０^５のＣＨＯ−ＫＩ細胞を直径３．５ｃｍのガラスボトムカルチャーディッシュに移し、ウシ血清（１０％）含有Ｆ−１２培地で、ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した。
２． ボルテゾミブ（１μＭ）添加と同時に、セサミン（１０μＭ）またはレスベラトロール（１０μＭ）を添加し、さらに８時間培養した。
３． 培地を除去し、５μＭ ＭｉｔｏＳＯＸ^ＴＲ Ｒｅｄ（モレキュラープローブス社製）を２μｌディッシュに加え３７℃で１０分静置した。
４． 添加液除去後、ハンクス平衡塩溶液（ライフテクノロジーズ社製）で２回洗浄した。
５． ディッシュに新しいハンクス平衡塩溶液を２ｍＬ加え、カールツァイス社製共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡを用い、観察像を得た。

［実験方法３］
プロテアソーム阻害時のミトコンドリア電位の検知は以下の方法により行った。
１． ２×Ｉ０^５のＣＨＯ−ＫＩ細胞を直径３．５ｃｍのガラスボトムカルチャーディッシュに移し、ウシ血清（１０％）含有Ｆ−１２培地で、ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間培養した。
２． ボルテゾミブ（１μＭ）添加と同時に、セサミン（１０μＭ）またはレスベラトロール（１０μＭ）を添加し、さらに８時間培養した。
３． 培地を除去後、３７℃に予熱した４００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ^ＴＭ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（モレキュラープローブス社製）染色液を加え、３７℃で２０−３０分静置した。
４． 染色液を除去後、予熱したウシ血清（１０％）含有Ｆ−１２培地を加え、カールツァイス社製共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡを用い、観察像を得た。
５． 各細胞における蛍光強度をIｍａｇｅＪソフトウェアを用いて算出した。

［実験方法４］
プロテアソーム阻害時のＭＴＴ[３-(４,５-ｄｉ-ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ-２-ｙｌ)-２,５-ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ]を用いた細胞活性測定は以下の方法により行った。
１． ９６穴（ウェル）マイクロプレートに各ウェル１００μＬのウシ血清含有Ｆ−１２培地を加え、そこでＣＨＯ−Ｋ１細胞を面積比（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で７０％となるまでＣＯ_２インキュベーター（３７℃、ＣＯ_２濃度：７％）内で培養した。
２． ボルテゾミブ（ジメチルスルフォキシド溶液）を終濃度で１μＭとなるように細胞培養液に加えた。同時にセサミンまたはレスベラトロール（ＤＭＳＯ溶液）を終濃度１０μＭとなるよう加えるサンプルを作成した。
３． ＣＯ_２インキュベーターにおいて８時間培養した。
４． ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１０μＬずつ加えＣＯ_２チャンバー内で４時間静置した。
５． 溶解用バッファー（イソプロパノールに０．０４規定の塩酸を加えたもの）を１００μＬ加え、ビペッティングによりけん濁した。
６． マイクロプレートをシールし、室温で４時間静置した。
７． マイクロプレートリーダーにより、各ウェルの５７０ｎｍの吸光度を測定した。
ボルテゾミブ、抽出物を全く加えなかったサンプル（コントロール）の吸光度を１００％として相対値を算出した。

プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤、医薬品組成物または飲食物に添加する本発明のセサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンの割合は、その機能を有する限り特に制限されないが、通常０．０１〜１００重量％の範囲から適宜選択することができる。なお、該飲食物または医薬品組成物に含有するセサミン、エピセサミンおよびセサミノールから選ばれる少なくとも１種のごまリグナンの含有量としては、一回の経口摂取当たり、０．５〜１００ｍｇ、好ましくは１〜６０ｍｇ、より好ましくは３〜６０ｍｇである。

本発明のごまリグナンを医薬品（医薬品組成物）として用いる場合、投与形態は、経口投与または非経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよく、例えば注射液、輪液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等を挙げることができる。
これら各種製剤は、常法に従って目的に応じて主薬に賦形剤、結合剤、防腐剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また外用剤としては基剤としてワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴール等を用い、通常の方法によって軟膏剤、クリーム剤等を調製することができる。
またその投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重等）により異なるが、通常、成人に対して経口投与の場合、本発明のごまリグナンの総量として、１日あたり、０．５〜１００ｍｇ、好ましくは１〜６０ｍｇ、より好ましくは３〜６０ｍｇ、１回あるいは複数回に分けて投与することができる。

本発明のごまリグナンを飲食物として用いる場合、その形態は、上記医薬製剤の形態でもよく、また固形、あるいは液状の食品ないしは嗜好品、例えばパン、めん類、ごはん、菓子類（ビスケット、ケーキ、キャンデー、チョコレート、和菓子）、豆腐およびその加工品などの農産食品、清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、味噌などの発酵食品、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリン、ショートニング、食用油脂などの油脂食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージなどの畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺんなどの水産食品、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料等の加工形態であってもよい。動物飼料又はペットフードとしても利用可能である。
また健康食品、機能性食品として用いる場合は、その形態は、上記医薬製剤や飲食物の形態でもよいが、例えば蛋白質（蛋白質源としてはアミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン等の蛋白質が最も広く使用されるが、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物等の他、アミノ酸単体の混合物も使用される）、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等が配合された自然流動食、半消化態栄養食および成分栄養食や、ドリンク剤等の加工形態であってもよい。
健康飲食品として用いられる場合、例えば、乾燥食品、サプリメント、清涼飲料水、ミネラルウォター、アルコール飲料等に配合することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の飲食物は、本発明のごまリグナンを実質的に含有しない食品原料に、本発明のごまリグナンを所要量、加えて、一般の製造法により加工製造することができる。本発明のごまリグナンを実質的に含有しない飲食物とは、例えば胡麻等を原料としていない飲食物が挙げられるが、胡麻等を原料とする飲食物であっても、最終形態の飲食品における本発明のごまリグナンの含有量が極微量であって、その飲食物の１日摂取量あたり、本発明のごまリグナンの総含有量が０．１ｍｇ未満、好ましくは０．８ｍｇ以下のもの、あるいはその飲食物の１日摂取量あたり、本発明のごまリグナンが０．１ｍｇ未満、好ましくは０．８ｍｇ以下のものは、本発明のごまリグナンを実質的に含有しない飲食物に含まれる。本発明のごまリグナンの配合量は剤形、食品の形態性状により異なるが、一般には０．００１〜５０％が好ましいが特に限定されるものではない。また健康食品、機能性食品としての摂取は、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善するのに用いられ、医師の食事箋に基づく栄養士の管理の下に、病院給食の調理の際に本発明のごまリグナンを実質的に含有しない任意の食品に、本発明のごまリグナンを加え、その場で調整した機能性食品の形態で患者に与えることもできる。本発明の飲食物は、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態を改善するのを目的として、目安として１日あたり本発明のごまリグナンが３ｍｇ〜６０ｍｇの範囲で経口摂取されることが望ましい。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。

［プロテアソーム阻害時における、セサミンおよびその類縁体化合物の細胞内酸化抑制効果］
本実施例では、プロテアソーム阻害時における、セサミンおよびその類縁体化合物の細胞内酸化抑制効果を検討し次の結果を得た。
セサミンの抗酸化活性が老化などを模したプロテアソーム阻害条件でも見られるものであるかどうかを調べるため、レドックスフロール発現細胞に対し、プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Ｂｏｒｔ）と、セサミンやその類似化合物の共添加を行い、細胞内レドックス状態を可視化した。本実験のボジティブコントロールとして、同じく抗老化・抗酸化作用の報告されているレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｏｒｏｌ）を用いた。
結果を図1に示す。ボルテゾミブ単独添加時には、レドックスフロールの示すＦＲＥＴ効率が低下し、可視化した場合に細胞内部が暖色系(赤〜橙)から寒色系(緑〜青)で表示される（図面では白黒で表示している。）、これはボルテゾミブ添加時の細胞内酸化を示している。このような条件下セサミン（Ｓｅｓａｍｉｎ）は１０μＭの濃度で同濃度のレスベラトロールと同等かより高い酸化抑制効果を示すことが分かった(図１Ａ、Ｂ)。
セサミンの類縁体化合物に関して同様の実験を行うと、エピセサミン（Ｅｐｉｓｅｓａｍｉｎ）やセサミノール（Ｓｅｓａｍｉｎｏｌ）では同様の酸化抑制効果が見られたが、セサモリン（Ｓｅｓａｍｏｌｉｎ）、セサモール（Ｓｅｓａｍｏｌ）ではその効果は見られなかった(図１Ｃ)。

図１は、プロテアソーム阻害時の、セサミンおよびその類縁体化合物が持つ酸化抑制効果を示す。
（Ａ）は、細胞内発現レドックスフロールによる細胞内レドックス状態の可視化したものであり、レドックスフロールの示すＦＲＥＴ効率に従ってインデックスの通り色分けされる（図面では白黒で示している）。
ＤＭＳＯ：溶媒のみ添加。
Ｂｏｒｔ：ボルテゾミブ（プロテアソーム阻害剤）１μＭ添加。
Ｒｅｓｖｅｒａｔｏｒｏｌ（レスベラトロール）、Ｓｅｓａｍｉｎ（セサミン）はどちらも１０μＭ添加。
（Ｂ）は、レドックスフロールの示すＦＲＥＴ効率を定量化したものであり、バーは標準誤差を示す。
（Ｃ）は、セサミン類縁体化合物によるプロテアソーム阻害峙の酸化抑制効果を示す。バーは標準誤差を示す。

[プロテアソーム阻害条件でセサミンがもたらすミトコンドリア内活性酸素種の低減効果の可視化]
本実施例は、プロテアソーム阻害条件でセサミンがもたらすミトコンドリア内活性酸素種の低減効果を検討し次の結果を得た。
一般に細胞内酸化は細胞内小器官のひとつミトコンドリア由来の活性酸素種(ＲＯＳ)によるところが大きいと考えられている。セサミンが細胞内酸化を抑制するメカニズムにミトコンドリア由来の活性酸素種が関与しているのかどうかを調べるため、プロテアソーム阻害細胞に対し、ＭｉｔｏＳＯＸ^ＴＭ Ｒｅｄ 試薬による染色を行った。本色素はミトコンドリア内部の活性酸素種、特にスーパーペーオキシドの濃度に依存してミトコンドリアヘ局在するものである。
結果を図２に示す。ボルテゾミブ添加はミトコンドリア電子伝達系の阻害物質であるロテノン添加と同様に、ミトコンドリア内の活性酸素種量を上昇させることが分かった。この条件でセサミンを共添加すると本色素のミトコンドリア局在は減弱し、ミトコンドリア内活性酸素種量は減少した。その効果はレスベラトロールと同程度であった。
ロテノン（ミトコンドリア電子伝達系阻害物質）（Ｒｏｔｅｎｏｎｅ）は１μＭの添加濃度とし、他の物質は実施例１と同一濃度とした。

[プロテアソーム阻害条件での、セサミンのミトコンドリア活性維持効果]
本実施例では、プロテアソーム阻害条件での、セサミンのミトコンドリア活性維持について試験を行い次の結果を得た。
セサミンによるプロテアソーム阻害時のミトコンドリア内活性酸素種の減少効果がミトコンドリア自身の機能性の維持につながっているかを調べるため、ミトコンドリア内電子伝達系がプロトン排出することで作り出すミトコンドリア膜電位をその機能の指標とした。ミトコンドリア膜電位の可視化のため、本電位に依存してミトコンドリア局在を示すＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ^ＴＭ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓによる細胞染色を行った。
結果を図３に示す。ボルテゾミブ単独添加により本色素での染色は弱くなり、ミトコンドリア膜定位の低下すなわちその機能低下が起こっていることが分かった。一方でセサミンの共添加時には、ボルテゾミブ単独添加峙よりも本色素染色強度が上昇したことから、セサミンがミトコンドリアの機能維持をもたらしていることが分かった。この効果は同濃度のレスベラトロールと同程度であった。

本実施例では、プロテアソーム阻害条件での細胞生存活性に与えるセサミンの効果について試験を行った。
上記までの結果でセサミンが細胞内酸化を抑制し、ミトコンドリア機能の維持に寄与することがわかったので、これらの効果が細胞の生存活性に影響を与えるかどうかを調べた。方法としては、生存細胞内の還元化酵素によるＭＴＴ変換活性を測定する、ＭＴＴアッセイを用いた結果を図４に示す。ボルテゾミブによる細胞(生存)活性の低下は、セサミンの共添加により有意に抑制されることが分かった。このことから、セサミンの酸化抑制効果に対応した細胞活性上昇が明らかとなった。

[セサミノール配糖体の生理活性検定]
・実験方法
１．ごま圧搾粕熱水抽出物からのセサミノール配糖体濃縮画分の所得と解析
ごま圧搾粕１００ｇと水５７０ｍｌを混合し、１０３℃のオイルバスで６０分間加熱還流した。６０分後、そのごま圧搾粕水溶液をろ過し、ごま圧搾粕の熱水抽出物をろ液として得た。この熱水抽出物を凍結乾燥し、吸着性樹脂であるＸＡＤ-２０００カラムを用いて、カラムを蒸留水、２０％、６０％、９９％のメタノールの順にて溶出し、最後にアセトンで溶出した。各画分の液体を凍結乾燥で除去し、ＰＢＳに懸濁してＭＴＴアッセイに供する試料を得た。
２．精製セサミノール配糖体を用いた解析
市販のセサミノールトリグリコシドをＰＢＳに溶解し、上記と同様のＭＴＴアッセイに供した。

[実験結果と考察]
１．ごま圧搾粕熱水抽出物からのセサミノール配糖体濃縮画分の所得と解析
吸着性樹脂であるＸＡＤ-２０００カラムを用いて、ごま圧搾粕熱水抽出物からリグナンの一種であるセサミノール３配糖体が濃縮できることが明らかとなった。セサミノール３配糖体がプロテアソーム阻害時に生理活性を示すかどうかを明らかにするため、ＸＡＤ-２０００を用いた吸着、溶出の各ステップの画分を上記（・実験方法 １．）の実験と同様にプロテアソーム阻害剤であるＢｏｒｔｅｚｏｍｉｂと共に加えた後、ＭＴＴアッセイにより細胞活性を検定した。結果、セサミノール３配糖体の濃縮された６０％、９９％メタノール溶出画分が細胞の生存率を上昇させることが分かった（図５）。
２．精製セサミノール３配糖体を用いた解析
セサミノール配糖体の生理活性をさらに明確にするために、精製セサミノール３配糖体をＰＢＳに溶解し、プロテアソーム阻害時に上述のセサミンと同程度の濃度（μＭオーダー）で添加して細胞活性に与える影響を調べた。結果、セサミノール３配糖体は１０μＭで有意な生存率の上昇をもたらしたことから、その生理活性が明らかとなった（図６）。

本発明は、ごまリグナン、特にセサミンの持つ老化などを模したプロテアソーム阻害条件下での抗酸化作用を見出し、活性酸素種の発生源として知られるミトコンドリア状態に与える影響も含めて、セサミンが持つ生理的な効果を明らかにした。プロテアソーム活性が低下して発症する疾病としては、老化、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病、トリプレットリピート病、筋萎縮性側索硬化症、白内障、動脈硬化、糖尿病性腎症、皮膚の光老化などが知られており、本発明により明らかとなった摂取した抗酸化剤のミトコンドリア活性維持機能により細胞に生存活性を付与し、これらの疾病による症状の緩和を図ることが期待される。

Claims (5)

1. セサミン、エピセサミン、セサミノールおよびセサミノール配糖体から選ばれる少なくとも１種のごまリグナンを含有することを特徴とするプロテアソーム活性低下条件下にある生体内の酸化還元状態改善剤。
2. 生体内の酸化還元状態の改善が、ミトコンドリア内活性酸素種を減少させることである請求項１に記載の生体内酸化還元状態改善剤。
3. 生体内の酸化還元状態の改善が、ミトコンドリア活性を維持することである請求項１に記載の生体内酸化還元状態改善剤。
4. 生体内の酸化還元状態の改善が、細胞生存活性を上昇させることである請求項１に記載の生体内酸化還元状態改善剤。
5. 請求項１ないし４のいずれかに記載の生体内酸化還元状態改善剤または薬学的に許容可能な塩および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、プロテアソーム活性低下条件下にある生体内酸化還元状態を改善するための医薬品組成物。