JP2013541331A - マイクロ流体捕獲渦を使用して不均一溶液から細胞を単離する方法及びデバイス - Google Patents

Abstract

インレットとアウトレットに接続された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップを具える細胞を単離する方法であって、少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、そのチャネルに沿って配置した少なくとも一の拡張領域を具える。少なくとも一の拡張領域は、少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激に増大しており、流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内に渦を生成するように構成されている。少なくともいくつかが直径≧１０μｍである細胞集団を含む溶液をインレットに流す。細胞の一部が、少なくとも一の拡張領域内にできた渦の中に捕獲される。捕獲された細胞は、次いで、拡張領域から放出することができる。
【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１０年９月１４日に出願された米国暫定特許出願第６１／３８２，８４０号の優先権を主張する。優先権は３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づく。上述の特許出願は、ここに完全に記載されているものとして引用により組み込まれている。

技術分野
本発明が属する分野は、一般的に、細胞又は粒子の単離と選別を行うマイクロ流体デバイスおよび方法に関する。特に、本発明が属する分野は、マイクロ流体捕獲渦を使用して細胞又は粒子を不均一溶液から単離するマイクロ流体デバイスおよび方法に関する。

標準的な卓上遠心分離機は、生命科学の研究所で細胞生物学研究と医療診断における試料調整に普遍的に使用されている最も一般的な器具の一つである。典型的な調整手順では、細胞を標識化して洗浄するのに複数回の遠心分離ステップが必要であるが、診断と研究に時間と手間とコストがかかる。実際、アッセイ自体は非常に小型化され自動化されているが、これらのアッセイに必要なサンプル調整は将来的な自動化のキーターゲットとして認識されてきた。

遠心分離機は、遠心分離機を非常に広く使用する三つの臨界的サンプル調整ステップである、（ｉ）サイズ／密度による細胞分離、（ｉｉ）細胞濃縮、及び（ｉｉｉ）溶液交換、を行う。遠心分離機はこのような全く異なる機能を実行することができるため、小型化したプラットフォームでこれらの機能を実現することは困難であった。小型化したマイクロ流体によるアプローチは、これらの機能のうち一つか二つを実装することができることがある。例えば、サイズと密度による細胞分離は、物理的な障害物、外力、あるいは流体力を用いて、異なるアウトレットにおける回収用マイクロチャネル内の規定の場所に粒子を案内することによって行うことができる。これらの方法では、高分解能の細胞分離を提供できる一方で、典型的な回収液量が注入した液量と同じである。すなわち、有意な濃度が達成されない。この出力量が大きいと、大きな視野をスキャニングして対象の細胞を観察することが必要である下流側の細胞検出プラットフォームを邪魔したり、あるいは、回収した細胞を溶解させなくてはならない場合に、対象の生物分子を希釈してしまうことがある。したがって、ある濃縮方法を分離システムとインラインで用いて迅速な検出と分析を行うためには、液量を低減する必要がある。

マイクロ流体システムを用いて局所領域に粒子と細胞を濃縮させる技術には様々なものがある。これらの技術の内、機械的なトラップが最も一般的に使用されている方法である。この方法は粒子と細胞を物理的構造体に固定して、試薬を複数段階でかん流させて、溶液交換を介してオンチップで細胞アッセイを行うことができる。しかしながら、更に下流側で分析を行うために、必要に応じて粒子と細胞を放出することが重要になることがある。濃度と放出に成功しても、これらのトラップ−放出システムで固定された細胞は、トラップの中に無理に入り、より容量の大きいスループットで操作するときにダメージを受けることになり、これによって、濃縮ファクタが希少細胞濃度に、あるいは細胞溶液を希釈するのに必要なもの以下に制限される。したがって、伝統的な遠心分離器のすべての機能とフレキシビリティを概括する一般的な小型化ツールは、未だにできていない。

マイクロ流体構造内での渦の形成は、集束とフィルタレーションの強化に用いられてきた。例えば、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（Ｊａｅ−Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｉｔｕｏｕｓ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｅｒｔｉａｌ ｌｉｆｔ ｆｏｒｃｅ ａｎｄ ｖｏｒｔｉｃｉｔｙ ｖｉａ ｍｕｌｔｉ−ｏｒｉｆｉｃｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，９，９３９−９４８（２００９))は実験に使用するマイクロ流体デバイスを開示しており、これは、一連の突然拡張及び収縮するチャネルを用いて硬い微粒子を集束させる。所定の流速で、この拡張したチャネル内に渦が形成される。この膨張したチャネル内に形成された渦が、筒状ピンチ効果のような横方向の粒子の移動を誘発する。ある長さのマイクロチャネルに沿って一連のこれらの拡張したチャネルを設けることによって、剛体マイクロ粒子が徐々にマイクロチャネルの反対側に移動する（すなわち、集束して）ことができる。しかしながら、重要なことは、拡張したチャネルが粒子をトラップしないことである。代替的に、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．は、デバイスを通過する微粒子が連続的に集束する構造を開示している。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．では、小径（直径７μｍ）のポリスチレンマイクロスフェアが、マルチオリフィスマイクロチャネルを通過したが、これらの粒子の捕獲は観察されなかった。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．は、更に、大きいサイズの粒子は、渦が形成された拡張チャネル領域から離れる傾向にあることを観察した。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．は、また、最大慣性揚力値とするためにはサンプル中の粒子が硬い球形でなくてはならず、これはもともと一般的に変形可能な生体細胞と共に使用することに明らかに逆行している。構造的には、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．は、むしろ小さいサイズの拡張チャネルを開示しており、これは、上流側の収縮チャネルに対して約８０μｍ外側に拡張する。更に、拡張チャネルの長さも短く、２００μｍであると開示されている。

米国特許出願第２００８／０３１８３２４号（Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．）は、がん細胞の高スループットスクリーニング用バイオチップを開示している。このデバイスは、噴出フィルタレーションを使用して、体液サンプルから腫瘍細胞を分離するようにしている。噴出フィルタレーションとは、フローチャネル内部のフィルタレーション媒体又は形態学的特徴によって流体が分散するあるいは再分配されるフィルタレーション構造を意味する。Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．では、フィルタレーション媒体が細胞の幅より小さい幅を有する側壁開口である。一の実施例では、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．は、流れを遅くしたり早くしたりする拡張及び収縮ポイントを有する１−Ｄチャネルを開示している。Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．は、高速で流体が分離し、流体フローを動的に代えることによって、フィルタレーション動作に役立つ内部微小渦を形成することを開示している。しかしながら、この微小渦は、デバイスを通過する細胞をトラップしない。むしろ、チャネル部分を埋めている開口が、サイズの大きい細胞がそこを通過しないようにすることによって、サイズの大きい細胞を保持している。集中又はフィルタレーション媒体を助ける目的で渦を生成する構造が開示されているが、これらの構造は、その中の細胞を選択的に捕獲するように使用されていない。

本発明の一実施例では、細胞を分離する方法が、インレットとアウトレットに連結された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップを具えており、少なくとも一のマイクロ流体チャネルがその長さに沿って配置した少なくとも一の拡張領域を具え、この少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内で渦を生成するように構成された少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法の急激な増大を含む。細胞集団を含む溶液をインレットに流す。少なくともいくつかの細胞が、少なくとも一の拡張領域内にできた渦内にトラップされ、この少なくともいくつかの細胞の径は≧１０μｍである。捕獲された細胞は、少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通る溶液の流速を低くすることによって、複数の拡張領域から解放される。

本発明の別の実施例では、分離した細胞周辺の溶液を交換する方法が、インレットとアウトレットに連結された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップを具え、この少なくとも一のマイクロ流体チャネルがその長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、この少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成された、少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激な増大を具えている。細胞集団を含む第１の溶液をインレットに流す。少なくとも一の拡張領域内にできた渦内に細胞の少なくとも一部がトラップされる。第１の溶液と異なる一またはそれ以上の溶液を、インレットに流す一方で、捕獲したセルを含む渦を連続的に維持する。

本発明の別の実施例では、サイズによって粒子又は細胞を捕獲する方法が、インレットとアウトレットに連結された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップを具え、この少なくとも一のマイクロ流体チャネルがその長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、この少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内で渦を生成するように構成された少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激な増大を具えている。複数の細胞又は粒子を含む溶液をインレットに流す。少なくとも一の拡張領域内にできた渦内に細胞又は粒子の少なくともいくつかがトラップされ、閾値を超えるサイズを有する細胞又は粒子が、渦内に実質的に捕獲され、閾値以下のサイズを有する細胞又は粒子は、実質的に渦を通過する。

本発明の別の実施例では、マイクロ流体デバイスが、少なくとも一のインレットとアウトレットに連結された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを含む基体を具え、この少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、少なくとも一のマイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、この少なくとも一の拡張領域が、少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において少なくとも８０μｍの急激な増大を具え、少なくとも一の拡張領域が流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内に渦を生成するように構成されている。

本発明の別の実施例では、マイクロ流体システムが、少なくとも一のインレットとアウトレットに連結された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを含む基体を具え、この少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、少なくとも一のマイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、この少なくとも一の拡張領域が、少なくとも一の拡張領域が流体の流れに応じて少なくとも一の拡張領域内に渦を生成するように構成されている少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激な増大を具えている。このシステムは、粒子又は細胞を含む少なくとも一のインレットへ流体を送り込むように構成された少なくとも一のポンプを具える。この少なくとも一のポンプにコンピュータが操作可能に接続されており、少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通過する流体の流速を調整する。

図１Ａは、一の実施例による細胞を単離するマイクロ流体システムを示す図である。図１Ｂは、別の実施例による細胞を単離するマイクロ流体システムを示す図である。図１Ｃは、単一の拡張領域を有するマイクロ流体チャネルを示す図である。図１Ｄ乃至１Ｇは、拡張領域の様々なジオメトリを示す図である。図１Ｈは、複数の拡張領域を有するマイクロ流体チャネルの平面図である。図１Ｉは、図１ＨのＡ−Ａ’ラインに沿った断面図である。図１Ｊは、本発明の別の態様による拡張領域を有するマイクロ流体チャネルを示す図である。 図２は、細胞を単離するマイクロ流体デバイスを示す図である。マイクロ流体デバイスに沿った異なるポイントにおける細胞サイズを変えるのに作用する力のグラフ表示も含まれる。 図３は、平行形状を有する細胞を単離する別のマイクロ流体デバイスを示す図である。 図４Ａは、より大きいがん細胞を捕獲する拡張領域を有するデバイスの一部を通過する血液細胞とがん細胞を示す図である。複数の拡張領域を含むデバイスの対応する顕微鏡画像がすぐ下に示されている。図４Ｂは、図４Ａのデバイスを通るリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のフラッシュを示す図であり、赤血球細胞（ＲＢＳｓ）は排出するが、がん細胞は拡張領域に残されている。複数の拡張領域を含むデバイスの対応する顕微鏡画像がすぐ下に示されている。図４Ｃ乃至４Ｆは、レイノルズ数（Ｒｃ）２７０で、図３に示すマイクロ流体デバイスを通過するＨｅＬａ細胞でスパイクされた血液サンプルを示す図である。図４Ｃは、ｔ＝０秒で撮影された画像を示す。図４Ｄは、ｔ＝９秒で撮影された画像を示す。図４Ｅは、ｔ＝１７秒で撮影された画像を示す。図４Ｆは、ｔ＝１８秒で撮影された画像を示す。ＨｅＬａ細胞は、拡張領域内にできた渦に捕獲されているところが見える。図４Ｇは、細胞凝集機能として、マイクロ流体デバイスの捕獲効率の比較を示す。 図５Ａは、様々な血液濃度における、マイクロ流体デバイスで達成した濃縮比（％）を示すグラフである。図５Ｂは、様々な血液濃度における、マイクロ流体デバイスで達成した純度（％）を示すグラフである。図５Ｃは、様々な血液濃度における、マイクロ流体デバイスで達成した捕獲効率（％）を示すグラフである。 図６Ａは、ＭＣＦ７細胞を含む溶液（溶液Ａ）を示す図であり、拡張領域内にできた渦に細胞が捕獲されている。図６Ｂは、ストレプトアビジンで被覆したマイクロスフェアを含む溶液Ｂで生じる第１の溶液交換を示す図である。図６Ｃは、ストレプトアビジンで被覆したマイクロスフェアとのＭＣＦ７の反応を示す図である。図６Ｄは、洗浄液として作用する溶液Ｃ（すなわち、ＰＢＳ）で行った第２の溶液交換を示す図である。図６Ｅは、図６Ａに対応するＭＣＦ７細胞の顕微鏡画像を示す図であり、細胞がマイクロ流体デバイスの拡張領域内にできた渦の中で周回している。左下は、矩形領域を拡大して示す図である。右下は、正方形領域を拡大して示す図である。図６Ｆは、図６Ｂに対応する顕微鏡画像を示す図である。左下は、矩形領域を拡大して示す図である。右下は、正方形領域を拡大して示す図である。図６Ｇは、図６Ｃに対応する顕微鏡画像を示す図である。左下は、矩形領域を拡大して示す図である。右下は、正方形領域を拡大して示す図である。図６Ｈは、図６Ｄに対応する顕微鏡画像を示す図である。左下は、矩形領域を拡大して示す図である。右下は、正方形領域を拡大して示す図である。 図７は、細胞サンプル、標識化剤、及び洗浄液の三つの異なる溶液に接続された三つのインレットを含む別の実施例によるマイクロ流体デバイスを示す図である。 図８Ａは、図７に示すデバイスで行われた、トラッピング、蛍光溶液交換、反応、及び洗浄の連続ステップを示す図である。 図９は、順次、流体渦の内部に捕獲され、パラホルムアルデヒドで固定され、透過して、抗サイトケラチン−ＰＥ＆ＤＡＰＩで標識化された細胞クラスタの蛍光画像を示す図である。 図１０は、マイクロ流体デバイスと、標準遠心分離について、時間を関数とした、細胞（ビオチニル化した抗ＥｐＣＡＭで被覆したＭＣＦ７細胞）ごとに結合させた複数のストレプタビジンで比較したマイクロビーズを示すグラフである。 図１１は、マイクロ流体デバイスと、標準遠心分離について、細胞ごとに結合させたビーズの数を関数とする、相対的に正規化した周波数を示すグラフである。

図１Ａは、サイズの異なる細胞１２を含む不均一溶液から細胞１２を単離するマイクロ流体デバイス１０を示す。マイクロ流体デバイス１０は、細胞１２を単離するために使用するように図１Ａに示されているが、マイクロ流体デバイス１０は、粒子（図示せず）の分離に関連して使用することができると解するべきである。したがって、ここでの用語「細胞」の使用は、粒子に置き換えることができる。図１Ａに見られるように、マイクロ流体デバイス１０は、インレット１８とアウトレット２０に接続したマイクロ流体チャネル１６を含む基板１４を具える。マイクロ流体チャネル１６の寸法は、様々である。一例として、マイクロ流体チャネルは幅５０μｍ、高さ７０μｍである。マイクロ流体チャネル１６の幅の典型的な寸法は、２０μｍ乃至２００μｍの範囲である。マイクロ流体チャネル１６の高さの典型的な寸法は、２０μｍ乃至５００μｍの範囲である。長さも様々であるが、一般的に長さ数センチメートル（例えば、４．５ｃｍ）である。基板１４は、マイクロ流体デバイスに使用される従来の材料でできている。これらの材料には、ガラス、シリコン、あるいはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）がある。ＰＤＭＳでは、マイクロ流体デバイス１０を作るのにソフトリソグラフィ技術を用いることができる。ＰＤＭＳの実施例では、モールド作成用に、４インチのシリコンウエファを厚さ７０μｍのネガティブフォトレジスト（ＫＭＰＲ １０５０、Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ）でスピンコートし、設計されたＣｒ−フォトマスクを介して紫外線に露出させ、現像する。ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４， Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、予め準備したモールドに入れて、脱気した。焼成したＰＤＭＳ鋳造物を、モールドから外して、ピン万力（ピン万力セットＡ、Ｔｅｃｈｉｎｉｃａｌ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）でインレット１８とアウトレット２０をあけた。パンチで穴をあけたＰＤＭＳ層を、ＰＤＭＳとスライドグラス表面をともにエアプラズマ（Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｎｅｒ，Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ）にかけて、スライドグラスに接続し、デバイスを封入した。

図１Ａの実施例では、インレット１８は実際は、インレット１８’とインレット１８”の二つのインレットを含む。第１のインレット１８’を用いて、不均一な細胞集団１２を含む溶液を導入する。第２のインレット１８”は、第２の別の溶液を導入するのに使用できる。以下により詳細に説明するように、第２のインレット１８”は、洗浄液、標識（例えば、蛍光ラベル、抗体、核酸染料、蛍光発生基質）、あるいはその他の化学物質（例えば、固定剤あるいは透過剤）をマイクロ流体チャネル１６に導入するのに使用できる。

図１Ａに見られるように、インレット１８’、１８”は、それぞれポンプ２２、２４に連結されている。各ポンプ２２、２４を用いて、設定した流速で各溶液をマイクロ流体デバイス１０に送達することができる。当業者に知られているどのようなタイプのポンプでも本発明に関連して使用することができる。このようなポンプには、限定するものではなく、シリンジポンプ、圧搾空気に作用して流体をくみ上げるポンプ、蠕動ポンプ又は容積型ポンプなどがある。図１Ａは、マイクロ流体デバイス１０と共に使用するシリンジポンプ２２、２４を示している。例えば、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＰＨＤ２０００シリンジポンプを用いて、１０μｌ／分乃至４．５ｍｌ／分の範囲の全流速を維持することができる。通常は、ポンプ２２、２４の設定は、マイクロ流体デバイス１０を通る流速が１００μｌ／分になるように設定する。

図１Ａは、システム１００の一部として、マイクロ流体デバイス１０を制御するのに使用できるコンピュータ４０を示す。コンピュータ４０は、通常、その中に少なくとも一のプロセッサ４２を具えており、コンピュータ４０内にある、あるいはコンピュータ４０に保存されているソフトウエアを実行する。コンピュータ４０はまた、マイクロ流体デバイス１０の様々なパラメータを表示するのに使用できるモニタ４４を具えている。これらのパラメータには、例えば、ポンプ２２、２４の流速、ポンプ２２、２４に含まれる流体の体積、及びその他の操作データがある。コンピュータ４０は、好ましくは、ポンプ２２、２４に、コンピュータ４０がポンプ４の個々の流速又は操作状態を調整できるように、接続されている。コンピュータ４０は、あらかじめ設定したアルゴリズム又はコンピュータ４０に保存している指示セットを用いて、ポンプ２２、２４を自動的に制御することができる。代替的に、ポンプ２２、２４の制御を、通常コンピュータとともに使用されるインターフェースデバイス（例えば、キーボード、マウス、その他）を用いて手動で調整できる。

溶液交換操作中に、コンピュータ４０によって、所望の溶液の流れをマイクロ流体デバイス１０で確実に維持することができる。例えば、一のポンプ２２が遅くなるか、止まってしまったときに、第２のポンプ２４の流速を上げて、所望の流速を確実に維持する。

図１Ｂは、圧力駆動ポンプシステム４６を使用する代替のシステム２００を示す。ポンプシステム４６は、第１の流体５２（例えば、洗浄液）と第２の流体５４（例えば、血液）をデバイス１０に送り込むのに、レギュレータ５０とともに、圧力ガス源４８を使用している。このシステム２００では、液体用バルブ５６、５８が、デバイス１０のインレットとアウトレットにそれぞれ設けられている。コンピュータ４０は、圧力駆動ポンプシステム４６と液体用バルブ５６、５８を制御するように構成されている。例えば、バルブ５６を用いて、第１の流体５２又は第２の流体５４のデバイス１０への流れを開閉することができる。バルブ５８は、廃液容器６０と、例えば、９６ウエルプレートを具える回収デバイス６２の間のアウトレットの流れを切り替えるのに使用することができる。

図１Ａに見られるように、マイクロ流体チャネル１６は、マイクロ流体チャネル１６の長さに沿って選択されたポイントに位置する複数の拡張領域３０を具える。拡張領域３０は、マイクロ流体チャネル１６の幅が急激に増大し、これは、所定の閾値流速であるいはこの流速以上で各拡張領域３０内に渦を形成させる、分離した境界層を作る。拡張領域３０内にできた渦であり、これがマイクロ流体デバイス１０を通って移動する不均一な細胞１２の溶液から細胞亜集団１２を捕捉する。しかしながら、これらの渦は、慣性を用いて湾曲させたチャネルフローにできるＤｅａｎ渦（Ｊ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｖｏｒｔｅｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ＤＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｌａｂ Ｃｈｉｐ，２０１０，１０，２０５７−２０６１（２０１０））や、非対称的に構成されたマイクロチャネルによって形成された渦（Ｓｔｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｍｉｃｒｏｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ−Ｃｈｉｐ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７（４３）：１８３９２−７（２０１０)) など流れ方向にできた渦と異なる。以下により詳細に説明するように、所定の閾値あるいはカットオフサイズ（マイクロ流体デバイス１０の流速とジオメトリによる）以上の細胞１２は、拡張領域３０に入り、再循環している渦の中に捕捉又は捕獲される。この閾値サイズより小さい細胞１２は捕捉されることなく、マイクロ流体デバイス１０の下流側へ流れてゆく。一般的に、最も有効な捕獲は、直径１５μｍより大きい細胞１２に対して生じる。１０μｍより小さい径では、捕獲効率は低い（例えば５％）。したがって、意味のある捕獲を行うには、捕獲する細胞１２の径が≧１０μｍでなくてはならない。拡張領域３０のジオメトリはさまざまである。例えば、拡張領域３０は、図１Ａに示すように矩形でもよいが、図１Ｃ乃至１Ｇに示すように正方形、三角形、多角形、あるいは半円形プロファイルであってもよい。矩形型の拡張領域３０では、主マイクロ流体チャネル１６に平行な方向にある拡張領域３０の長手側で捕獲能力がより良好である。一般的に、拡張領域３０の主壁３１（図１Ｃに示す）は、上流側マイクロ流体チャネル１６の流れ方向に対して４５°またはそれ以上の角度がついている。

図１Ｃは、上流側マイクロ流体チャネル１６に沿った単一の拡張領域３０を示している。上述したように、立ち上がりの壁３１は、図１Ｃに破線Ａで示す流れの軸に対して４５°又はそれ以上角度がついている。これに関して、拡張領域３０は、断面寸法（例えば、幅と高さ）が、マイクロ流体チャネル１６のすぐ上流側部分における断面寸法に比して、急激に増大している。図１Ｃの実施例では、立ち上がり壁３１は、ちょうど９０°より小さい角度がついており、最小限４５°の閾値を大きく超えている。拡張領域３０はまた、立ち下がり壁３３を有している。立ち下がり壁３３は、流れ方向Ａに対して角度がついていてもよい。一般的に、立ち下がり壁３３の角度は重要でなく、どのような角度であってもよい。例えば、一の実施例では、立ち下がり壁３３の角度が小さく、立ち下がり壁３３を、マイクロ流体チャネル１６の幅に対して徐々にテーパさせるようにしてもよい。さらに別の代替例では、立ち下がり壁３３がなく、拡張部分がマイクロ流体チャネル１６の元の寸法に戻らない。

図１Ｊに示す別の実施例では、拡張領域３０は、湾曲した立ち上がり壁３１を具える。この点で、立ち上がり壁３１は、始めに、マイクロ流体チャネル１６の上流側から徐々に開いてゆき、立ち上がり壁３１の長さに沿って大きく開いている。この実施例では、立ち上がり壁３１の様々なポイントに沿ってひかれた接線が、流れＡの軸に比べてかなり異なる角度を有する。例えば、立ち上がり壁３１の開始部分近傍では、角度θ_１が小さく、４５°より小さい。しかし、立ち上がり壁３１の終端付近では、角度θ_２が急であり、４５°以上である。図１Ｊに示すもののように湾曲したあるいは不連続的な拡張領域３０の場合、立ち上がり壁３１の全長に沿って、流れＡの軸に対する平均角度を表すθ_ＡＶＥが、４５°より大きくなくてはならない（θ_ＡＶＥ＞４５°）。

図１Ｈは、マイクロ流体チャネル１６の長さに沿って設けた複数の拡張領域３０の平面図である。図１Ｉは、図１ＨのＡ−Ａ’線に沿った断面図である。図１Ｈと１Ｉともに、マイクロ流体チャネル１６と拡張領域３０の様々な寸法を示す。上述したように、マイクロ流体チャネル１６の幅（ｗ）の典型的な寸法は、２０μｍ乃至２００μｍの範囲である。マイクロ流体チャネル１６の高さ（ｈ）の典型的な寸法は、２０μｍ乃至５００μｍの範囲である。拡張領域３０は、８０μｍ乃至８００μｍの範囲であが、少なくとも８０μｍでなくてはならない距離（ｘ）を延在している。拡張領域３０は、２００μｍ乃至２ｍｍの範囲である距離（ｙ）を延在している。隣接する拡張領域３０は、典型的には２０μｍを超える距離（ｚ）だけ分かれている。いくつかの実施例では、単一の拡張領域３０があり、ここでは隣接する拡張領域３０がない。マイクロ流体チャネル１６の断面プロファイルは、ほぼ矩形、台形、あるいは正方形である。マイクロ加工プロセスは、若干台形の断面を作るか、あるいは若干丸みを帯びたコーナーを作る。チャネル１６は、円形又は半円形の断面を有していてもよいが、現在のマイクロ加工技術はこれらのジオメトリを製造しない。ここに述べた方法とデバイスは、これらの変形例に及ぶ。

図１Ａに戻ると、拡張領域３０は、マイクロ流体チャネル１６の反対側に設けることができる。これによって、単一のマイクロ流体チャネル１６がより大きい捕獲能力を有するようになる。更に、以下により詳細に説明するように、この構成によって、多数のチャネル１６が平行構造に整列している場合、拡張領域３０の千鳥配列が可能になる。すなわち拡張領域３０が互いにオフセットして、図３に見られるように隣接するマイクロ流体チャネル１６の拡張領域３０と交互になるので、隣接するマイクロ流体チャネル１６を密に詰めることができる。更に、図１Ａを参照すると、より大きいサイズの細胞１２が拡張領域３０で捕獲される一方、より小さいサイズの細胞１２は捕獲されず、マイクロ流体チャネル１６を下流側に流れて、アウトレット２０から出てゆく。より大きいサイズの細胞１２（拡張領域３０に示されている細胞）は、拡張領域３０内に作られた渦流内に捕獲される。より小さいサイズの細胞１２は、そのサイズが小さいため、渦流内に捕獲されず、拡張領域３０の外へ出てゆく。したがって、より小さいサイズの細胞１２は、拡張領域３０の渦で捕獲されることなく、マイクロ流体チャネル１６の下流側へ流れ続ける。

図２は、サイズの異なる細胞１２を含む不均一溶液から細胞１２を単離するデバイス１０、並びにマイクロ流体チャネル１６と拡張領域３０内の対応する流れを示す。図２は、マイクロ流体チャネル１６と拡張領域３０の、Ａ、Ｂ、Ｃで特定される三つの領域を拡大して示す図である。図Ａに見られるように、サイズの異なる不均一な細胞集団１２が、シリンジポンプ２２、２４のうちの一方を介してデバイスに送り込まれる。他方のシリンジポンプは、洗浄液あるいはＰＢＳなどのその他の溶液を含んでいてもよい。まず、図Ａに示すように、細胞１２はｙ方向にランダムに分散される。細胞１２に、二つの対抗する力、すなわち、細胞１２をマイクロ流体チャネル１６の壁に向かって移動させるよう細胞に作用するせん断勾配揚力（Ｆ_Ｌせん断勾配）と、マイクロ流体チャネル１６の壁から細胞１２を遠ざけるウォール効果揚力（Ｆ_Ｌウォール効果）がかかる。

断面が矩形のまっすぐなマイクロ流体チャネル１６を用いることで、流れている細胞１２の動的均衡位置によって、図２の図Ｂに示すように、動的水平方向均衡位置Ｘ_ｅｑと、均一な細胞速度になる。ここで、Ｘ_ｅｑは、細胞１２の中心とマイクロ流体チャネル１６の壁との間の距離として定義される。細胞１２が拡張領域３０に進むと（図２においては、二つの相対する拡張領域３０がある）、より大きいＦ_Ｌせん断勾配がかかっているより大きい細胞１２が、渦の中心に向かって押されて捕獲され、一方で、より小さい細胞１２は拡張領域３０の外にチャネル内へ流されて、アウトレット２０へと下流へ流れ続ける。一般的に、Ｆ_Ｌせん断勾配力は、細胞径（ａ）の三乗に対応しており、より大きい細胞１２にはより大きいＦ_Ｌせん断勾配力がかかる。サイズに応じた水平方向の移動が、細胞１２を、細胞１２が分離されて残り、その周辺を回る渦の中心に向けて分離下境界線（区分線）を超えて流線の向こう側に駆動する。これによって、切り捨てサイズ以下のサイズを選択する捕獲が可能となり、細胞は区分線を越えて、フォーカスされた流れに残るのに十分な速度で移動せず、アウトレット２０から流れ出る。

図３は、細胞１２を単離するマイクロ流体デバイス１０の別の実施例を示す図である。このデバイスはインレット１８とアウトレット２０に連結された複数のチャネル１６を具える。図３は、８つの独立したチャネル１６を示しており、これらのチャネルは互いにほぼ平行に配置されている。各マイクロ流体チャネル１６は、１０個の独立した拡張領域３０を有する。もちろん、使用するチャネル１６の数はいくつでもよいと解するべきである。同じことが、単一のマイクロ流体チャネル１６に沿って設けた拡張領域３０の数にも言える。単一のマイクロ流体チャネル１６に沿って設けた隣接する拡張領域３０間のスペースは、様々であるが、１ｍｍのスペースが機能することが分かっている。追加のチャネル１６を加えて、大規模なパラレルデバイス１０を作ってもよい。チャネル１６は、互いに千鳥配置されている隣接するチャネル１６の拡張領域３０に対してまっすぐである。この設計により、隣接するチャネル１６を互いに密に配置することが可能となり、これによって、マイクロ流体デバイス１０の全体的な設置面積が小さくなる。図３は、二次元レイアウトされたチャネル１６のアレイを示しているが、このチャネル１６のアレイは三次元レイアウトにしてもよい。三次元構造により、スループットを上げることができる。

図３のデバイスでは、マイクロ流体チャネル１６が、幅５０μｍ、高さ７０μｍの、矩形の高アスペクト比を持つチャネルである。インレット１８は、細胞１２を含むサンプル用の第１のインレット１８’と、ＰＢＳ又はその他の洗浄溶液を含む第２のインレット１８”を具える。デュアルインレット１８’、１８”構成は、マイクロ流体デバイス１０内で容易かつ迅速な溶液交換が可能となり、例えば、捕獲されなかった細胞１２を洗い流し、回収したサンプルの最終的な濃縮比と純度を強化する手段を提供する。マイクロ流体デバイス１０の長さは数センチメートルである。拡張領域３０は、所定のコンパクトな設置面積に最大数の拡張領域３０を配置するために、交互になったパターンにおかれている。図３に示すデバイスでは、拡張領域が、４００μｍ×４００μｍの寸法を有する正方形である。

細胞１２が拡張領域３０に捕獲されると、渦のサイズを小さくしてゆき、最後になくすことで細胞１２は拡張領域３０から放出される。これは、入力流速を低減する（例えば、ポンプ２２、２４の流速を低減する）ことによって行われる。低減させた流速が、渦のサイズを小さくして、そこに捕獲されている細胞１２をマイクロ流体チャネル１６の流れの中に放出させ、デバイスのアウトレット２０へ運ぶ。図３に示すデバイスでは約４ｍｌ／分の流速が、最も良いことが分かっている。代替的に、流速を急にほぼゼロになるまで小さくして、マイクロ流体デバイス１０を流れる流体の流れを止めるようにしてもよい。この代替例では、オフチップではなく、オンチップで細胞１２を回収することができる。

実施例１：稀ながん細胞の血液からの濃縮
図３のマイクロ流体デバイス１０を、正常な人の血液細胞（直径２乃至１５μｍ）からがん細胞（直径２０μｍ）を分離して集中させるのに適用し、高スループットでサイズベースの濃縮及び集中させる有用性を示した。血液から濃縮及び集中させたがん細胞は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣｓ）が患者の状態に関する情報をリアルタイムで提供することができ、がん治療をモニタリングできるので、臨床診断に特に重要である。生存ＣＴＣｓを血液から迅速、有効、かつ標識のないアプローチで単離することは、依然として技術的に非常に難しい。ＣＴＣｓは、１０億の血液細胞につき一の細胞というほど低い割合の稀な事象である。現在の戦略は、診断用のＣＴＣｓの計数に注目が集まっているが、研究目的で生存ＣＴＣｓのより大きいサンプルを集めることが緊急目的である。このことは、大きな血液体積をより高いスループットで処理し、修飾した基質又は磁気ビーズに目的の細胞をつけることなく濃縮することが必要であり、更なる分析又は培養のために、捕捉した細胞を個々に選択するアドバンテージを提供している。

このデバイス１０は、稀な細胞を、ｍＬ／分の範囲で液体体積を処理し、サイズと密度をベースにした分離を行って目的の細胞を濃縮し、捕獲した細胞をより小さい濃縮した体積にして放出する、大規模な平行デバイスで濃縮するという要望に取り組むものである。稀な細胞濃縮を示すために、希釈したヒトの血液中にスパイクさせた蛍光ラベルを行った乳がん細胞（ＭＣＦ−７）を、図３に示すデバイスと同様のデバイス１０に、４．４ｍＬ／分の速度で注入した。ＭＣＦ７の乳がん細胞を、１０％のＦＢＳと、１％の牛のインスリンと、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで補填したＤＭＥＭを含む媒体で培養し、使用する前にトリプシン処理を行って再度懸濁させた。血液は、健康な人間のポランティアから、訓練された外科医が回収し、実験用にＰＢＳ中で５乃至２０％に希釈した。

これらの高い流速では、上流側渦タンクにチャネルの変形が見られたが、周囲圧力により近いところで作動する下流側の渦チャンバは変形しないことを考えると、捕獲は影響を受けない。より高い操作流速は、むしろ結合強度によって制限を受ける。

単細胞と２−４細胞クラスタに含まれるクラスタ細胞としてのスパイクＭＣＦ−７細胞は、臨床サンプルに有意なレベルで存在していることが示されていた。血液細胞とがん細胞が、図４Ａの上側パネルにある単一の拡張領域３０の図に示すように、注入ステップの間に渦の中に入り周回するのが観察された。図４Ａの下側パネルは、拡張領域３０中に含まれる赤血球細胞と共に捕獲されたがん細胞を示す顕微鏡画像である。赤血球細胞は、希釈サンプルを用いた実験では同じサイズの粒子が渦の中へ移動しなかった場合でも、渦に入ることが観察された。同様に、高い細胞濃度は、細胞間に衝突と流体力学的攪乱を誘発し、クロスストリームの移動と渦へ入ることを引き起こす。

更に、各拡張領域３０が維持される細胞の最大容量がある。渦が拡張領域３０全体を占めた後、最大で〜４０単細胞ＭＣＦ７をより高い流速範囲以上で維持することができる。ほとんどのスパイク実験条件は、この最大値以下に保たれた。溶液が完全に処理されると、渦で捕獲した細胞を、渦をこわすことなくＰＢＳで洗浄した。このことは、図４Ｂの上側パネルに示されている。図４Ｂの下側パネルは、より小さく密度の高いＲＢＣｓを除去するために、ＰＢＳ洗浄溶液を導入した後も捕獲されたがん細胞を示す顕微鏡画像である。興味深いことに、最初に渦に入った血液細胞は安定的に捕獲されずトラップからシステムの外にまたすぐに出てしまい、周回しているより大きい安定的に捕獲されたがん細胞を残すことが観察された。赤血球細胞と白血球細胞は、両方ともより密度が高く及び／又はサイズがより小さいため、安定した周回を形成できない。洗浄した細胞は、特性評価と計数用に、９６−ウエル−プレートのうちの一のウエルに放出した。

マイクロ流体デバイス１０は、目標細胞濃度、濃縮、及び純度の重要な数値指標を定量化する場合に、良好に機能する。〜５００がん細胞でスパイクした５％ｖ／ｖの血液（例えば、０．５ｍＬの全血、または、〜２５億の血液細胞）の１０ｍＬ容量の血液細胞（ｎ≧６サンプル）を、比較的少量の血液細胞コンタミネーションで、＜３分間、２００ｍＬより少ない最終容量へ濃縮した（２０倍の容量濃縮）。これは、図５Ａに見られるように、３．４百万の濃縮比（出力溶液中の混入血液細胞に対する目標がん細胞の比を、入力溶液中の同じ比で除したもの）に該当する。この高い濃縮レベルによって、２００ｍＬの最終容量にいて高純度のがん細胞を導出する：図５Ｂに見られるように、〜４０％（平均で、１０２±２１のがん細胞、及び２２１±１５５の血液細胞）である。マイクロ流体デバイス１０とサンプルで処理したスパイクがん細胞（ｎ＝３）がない血液サンプルがウエルに回収され、これは７７２±２８３の赤血球細胞と、４±１ＣＤ４５＋の赤血球細胞を有することが分かった。これは、スパイク血液サンプルを用いてマイクロウエルに見られる血液細胞混入量と同じである。達成した濃縮レベルは、百万乃至一千万の濃縮を報告している目標細胞を分離する分子親和性ベース及びフィルターベースのアプローチと比較できる。処理したサンプルの純度は、９．２乃至１４．０％のスパイクがん細胞の純度を報告している親和性ベースのアプローチに比較して、高い。処理したサンプル中の血液の希釈を少なくすることで細胞処理スループットが上がるが、スパイク細胞の捕獲効率は下がる。図５Ｃに示すように、血液濃度が高くなり、捕獲効率が下がり、１０乃至２０％のスパイクがん細胞が回収された。より高い血液濃度によって、流体渦のサイズと位置を変化させる流体粘度がより高くなり、捕獲効率が下がる。

この高い血液濃度での比較的低い捕獲効率は、この技術を１乃至１０細胞／ｍＬで生じる超稀な細胞を単離するのに有効なものにするためには、高容量の血液を処理しなければならない（１０ｍＬ又はそれ以上）ことを示唆している。しかしながら、ここに述べたマイクロ流体デバイス１０の高いスループット（２ｃｍ^２のチップに対して〜５ｍＬ／分の希釈血液）は、妥当な時間（＜３０分）内で大容量の操作を行いうることを示している。

マイクロ流体デバイス１０に捕捉した細胞は、高い生存レベルを維持した。蛍光生／死アッセイで測定したところ、デバイスを通って細胞を注入した後の細胞の生存には有意な変化は見られなかった（９０．１％ ｖｓ ９０．３％初期）。生存細胞は、いくつかのサンプル調整アプリケーションに重要である。マイクロ流体デバイス１０で捕捉して放出した細胞は、免疫染色などの標準的な分子アッセイに使用できる。この結果、標識のないスパイク血液サンプルがマイクロ流体デバイス１０で濃縮された。次いで、がん細胞は放出され、マイクロウエルで標識した。染色したがん細胞は、サイトケラチン−ＰＥとＤＡＰＩに対してポジティブであり、ＣＤ４５に対してネガティブである。この一のデバイスで濃縮するが、細胞を更なる処理用に小容量に移す能力は、稀な単細胞の分析に大きなアドバンテージを提供する。

図４Ｃ乃至４Ｆは、レイノルド数（Ｒｃ）２７０で、図３のマイクロ流体デバイス１０を用いて、ＨｅＬａ細胞でスパイクした血液サンプルを同様に濃縮した結果を示す。マイクロ流体デバイス１０は、ＨｅＬａ細胞が拡張領域３０で捕捉されると、ＰＢＳ洗浄液で洗浄する。捕獲したＨｅＬａ細胞は、流速をＲ_Ｃ＝５に下げることによって拡張領域３０から放出させた。図４Ｇは、細胞濃度に応じたマイクロ流体デバイス１０の捕獲効率の比較を示す。細胞数は、マイクロ流体デバイス１０を通して処理したスパイクＨｅＬａ細胞の数を表す。

実施例２：細胞標識と溶液交換
マイクロ流体デバイス１０は、特定分子のマーカーとして細胞を効果的に標識するのに使用することもできる。伝統的な遠心分離機では、一連の標識化及び洗浄ステップを介して細胞サンプルを特定のマーカーとして標識している。これは、標識化試薬を用いて遠心分離管で細胞をインキュベートするステップと、この細胞を卓上遠心分離機でペレットに濃縮するステップと、手動吸引によって非結合標識化試薬を含む上澄み層を除去するステップと、細胞を新しい媒体に手動で再懸濁させるステップを含む。これらの操作は、流体渦内に細胞を捕獲することによってマイクロ流体デバイス１０内で行われ、連続して、捕獲されて周回する細胞を標識化試薬に露出させ、更に、ＰＢＳ洗浄溶液で洗浄する。標識化細胞は、次いで流速を下げることによって、回収バイアルに小容量で放出された。

図６Ａ乃至６Ｄは、それぞれ、捕獲（図６Ａ）、第１の溶液交換（図６Ｂ），反応（図６Ｃ）、及び第２の溶液交換（図６Ｄ）を示す。図６Ｅ乃至６Ｈは、それぞれ、マイクロ流体デバイス１０に注入したビオチニル化したＥｐＣＡＭでインキュベートした実際のＭＣＦ７細胞の図６Ａ乃至６Ｄに対応する顕微鏡画像である。図６Ｅに示すように、細胞が渦に捕獲され、一定の回転及び周回動作を行っている。図６Ｆは、ストレプタビジンで被覆したマイクロスフェアを用いた第１の溶液交換を示す。ストレプタビジンで被覆したマイクロスフェアは、拡張領域３０に入る。図６Ｇは、ストレプタビジンで被覆したマイクロスフェアのＭＣＦ７細胞との連続的な反応を示す。図６Ｈは、第２の溶液（すなわち、ＰＢＳ洗浄液）との溶液交換を示す。ＰＢＳ洗浄液は、非結合マイクロスフェア（矢印Ａ）を除去する。洗浄が完了した後、マイクロ流体デバイス１０の流速を下げることで細胞が渦トラップから放出され、特徴化を行うために９６ウエルプレートに回収される。図６Ｈの矢印Ｂは、２分以上で次第に細胞に結合した粒子を指している。

流体渦の中の適所に細胞を安定して保持する能力によって、標識化剤と洗浄溶液との複数の溶液交換を自動化できるフォーマットで行うことが可能である。追加の新しい溶液は、各々、完全に交換するには約１００ｍｓかかる。同じ標識化反応は、従来の遠心分離ベースのプロセスでは３回の洗浄ステップを含む６回の遠心分離ステップが必要であり、＞３０分のサンプル調整時間（標識化試薬でのインキュベーション時間を除く）を要する。各遠心分離及び洗浄ステップは、潜在的に一部の細胞が失われ、５乃至１０分を要する。

高速標識化は、常にリフレッシュした環境の分子標識に露出させるように流体渦の中で回転し周回している細胞によって支援される。換言すると、渦中の標識化試薬の強い還流によって、細胞表面近くに試薬の非常に小さな空乏化した領域ができ、細胞表面により多くの試薬を強い勾配で引き寄せる。この高速標識は、細胞表面上のストレプタビジンで被覆したマイクロスフェアのビオチニル化した抗ＥｐＣＡＭ抗体への結合（図６Ａ乃至６Ｈ）を調べることによって観察した。マイクロ流体デバイス１０中の細胞が、同数のマイクロビーズを５分で蓄積し、標準プロトコルで調整した細胞は３０分で蓄積することがわかった。更に、３０分後、マイクロ流体デバイス１０で標識した細胞は、標準的な方法に比べて細胞あたりに結合したマイクロビーズの数が平均で２倍であった。

実施例３：シーケンシャル操作：標識化に続いて行う稀な細胞の濃縮
遠心分離機で行うことができる複数のシーケンシャルのサンプル調整ステップ（例えば、捕獲、蛍光溶液交換、反応及び洗浄）を、図７に示すマイクロ流体デバイス１０を用いて成功裏に行った。この実施例では、マイクロ流体デバイス１０が、三つのインレット１８’、１８”、および１８’’’を具える。一のインレット１８’は、細胞サンプルを送達するのに使用されるシリンジポンプ２２に接続されている。第２のシリンジポンプ２４は、蛍光剤を送達するのに使用される。第３のシリンジポンプ２６は、洗浄液（ＰＢＳ）を送達するのに使用される。サイズベースの血液からのがん細胞の捕獲、シーケンシャルな蛍光標識、及び、放出した細胞の分析を＜１時間で行った。希釈したがん細胞でスパイクしたヒトの血液（１０ｍＬ）をマイクロ流体デバイス１０に〜３分間注入し、がん細胞を濃縮した。次いで、捕獲された細胞を、固定剤（パラホルムアルデヒド）と透過剤で調整し、蛍光抗体（抗サイトケラチンＰＥ＆ＤＡＰＩ）で２０分間染色した。捕獲、第１の溶液交換、反応、第２の溶液交換のシーケンスは、図８Ａ乃至８Ｄに示す。次いで、細胞をＰＢＳで＜１分間洗浄し、特徴化を行うために９６−ウエルプレートに回収した。回収した細胞は、サイトケラチンとＤＡＰＩに対してはポジティブであり、流体渦内部にシーケンシャルに捕獲され、パラホルムアルデヒドで固定され、透視化され、抗サイトケラチン−ＰＥ＆ＤＡＰＩで標識化した細胞クラスタの蛍光画像を示す図９に見られるように、シーケンシャルなサンプル調整が成功したことがわかる。図１０Ａに示すように、ビオチニル化した抗サイトケラチン−ＥｐＣＡＭで被覆したＭＣＦ７細胞は、ストレプタビジン結合マイクロビーズでの３０分後の標準オフチッププロトコルと同じレベルで、＜５分以内で被覆した。図１１Ａは、３０分後の細胞集団の上にマイクロビーズを用いた均一な標識を示す。更に、マイクロ流体デバイス１０（遠心分離−オンチップ）により、細胞あたりより多数のビーズが結合した。この結果、単一の簡単なプラットフォームでの細胞分析に必要なすべてのサンプル調整プロセスへの完全なルートが示された。

ここに述べたデバイス１０と方法は、安価で迅速な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の分析に有益である。ＣＴＣの検出と計数は、乳がんの状況と予後をモニタする価値のある有望な診断ツールである。ＣＴＣは、血流を介して拡散する腫瘍由来の細胞であり、腫瘍の悪性度を反映することができる。ＣＴＣは１０億個の細胞あたり１個というほど低い割合で生じる稀な事象である。したがって、ＣＴＣの単離は、有意な技術的チャレンジを提供する。ここに述べたデバイス１０と方法は、ＣＴＣと血液細胞間の細胞サイズ差（ＣＴＣは、ＲＢＣより２−４倍大きい）を利用して、生きたＣＴＣを全血から標識をしない方法で単離できる。デバイス１０と方法のその他の潜在的アプリケーションには、母体血液細胞から胎児細胞を単離する工程を含む出生前診断がある。対象となる胎児細胞を、標識化することなく、あるいは外付けの大きな機械を使うことなく単離することができる。

マイクロ流体デバイス１０は、ＣＴＣの単離に特定のアプリケーションを有するが、その他のアプリケーションに、サンプルから得た細胞１２の濃縮がある。例えば、拡張領域３０で捕獲できるサイズを有する目標の細胞１２を捕捉して、サンプル中に濃縮した形で放出される。例えば、尿、胸膜液、腹腔洗浄液などの生物学的源の流体に含まれる細胞１２をマイクロ流体デバイス１０に流して、ここに含まれる細胞１２を濃縮することができる。この点に関して、マイクロ流体デバイス１０は、細胞１２の濃縮に非常に適している。例えば、容積ベースでは、マイクロ流体デバイス１０は、細胞１２を、最初の溶液中の細胞１２の濃度の１０倍又は２０倍以上に濃縮することができる。

実施例を示して説明したが、ここに開示した本発明の概念の範囲から外れることなく、様々な変形例が考えられる。例えば、ここにはいくつかの実施例が説明されているが、様々な態様あるいは要素がその他の個別の実施例と交換可能であることは自明である。本発明は、したがって、特許請求の範囲の記載及びその均等物以外によっては限定されるものではない。

Claims (71)

1. 細胞を単離する方法において：
   インレットとアウトレットに接続された少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスであって、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルが当該チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて前記少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成された、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激に増大する部分を具える、マイクロ流体デバイスを提供するステップと；
   細胞集団を含む溶液を前記インレットに流すステップと；
   前記少なくとも一の拡張領域内にできた渦の中の少なくともいくつかの細胞であって、その径が１０μｍを超えるいくつかの細胞を捕獲するステップと；
   前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通る溶液の流速を下げることによって、前記複数の拡張領域から前記捕獲した細胞を放出するステップと；
   を具えることを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法において、前記インレットに流れる溶液が均質な細胞集団を含むことを特徴とする方法。
3. 請求項１に記載の方法において、前記インレットに流れる溶液が不均質な細胞集団を含むことを特徴とする方法。
4. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、流れの軸に対して少なくとも４５°を成して延在する立ち上がり壁を具えることを特徴とする方法。
5. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、矩形、正方形、三角形、多角形、または半円形のプロファイルを有することを特徴とする方法。
6. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法が急激に減少する部分を具えることを特徴とする方法。
7. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法が実質的に減少しないことを特徴とする方法。
8. 請求項１に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法が徐々に減少する部分を具えることを特徴とする方法。
9. 請求項１に記載の方法において、前記放出された細胞が前記アウトレットで回収されることを特徴とする方法。
10. 請求項１に記載の方法において、直径が１５μｍより大きい細胞が前記渦の中に捕獲されることを特徴とする方法。
11. 請求項１に記載の方法において、前記捕獲された細胞ががん細胞を含むことを特徴とする方法。
12. 請求項１に記載の方法において、前記捕獲された細胞を放出するステップが、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通る溶液の流速をほぼゼロに下げるステップと、洗浄溶液を流し始めるステップと、を具えることを特徴とする方法。
13. 請求項３に記載の方法において、前記不均質細胞集団が、がん細胞を含む集団を具え、当該がん細胞が前記渦の中に捕獲されることを特徴とする方法。
14. 請求項４に記載の方法において、不均質細胞集団を含む溶液が、尿、胸膜液、及び腹膜洗浄液の一つを含むことを特徴とする方法。
15. 請求項１に記載の方法において、前記マイクロ流体デバイスが、前記インレット及び前記アウトレットに接続された複数のマイクロ流体チャネルを具えることを特徴とする方法。
16. 請求項１に記載の方法において、前記複数のマイクロ流体チャネルが、二次元アレイに配置されていることを特徴とする方法。
17. 請求項１に記載の方法において、前記複数のマイクロ流体チャネルが、三次元アレイに配置されていることを特徴とする方法。
18. 単離した細胞周辺の溶液を交換する方法において：
    インレットとアウトレットに接続した少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、当該少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、当該チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて前記少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成された、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激に増大する部分を具える、マイクロ流体デバイスを提供するステップと；
    前記インレットに細胞集団を含む第１の溶液を流すステップと；
    前記少なくとも一の拡張領域内に生じた前記渦の中に前記細胞の少なくとも一部を捕獲するステップと；
    前記捕獲した細胞を含む前記渦を連続的に維持しながら、前記インレットに前記第１の溶液と異なる一またはそれ以上の溶液を流すステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
19. 請求項１８に記載の方法が更に、前記捕獲した細胞を、前記一またはそれ以上の溶液に露出させたのちに前記少なくとも一の拡張領域内から放出するステップを具えることを特徴とする方法。
20. 請求項１９に記載の方法において、前記捕獲した細胞を放出するステップが、前記マイクロ流体デバイスを通る流体の流れを低減するステップを具えることを特徴とする方法。
21. 請求項１８に記載の方法が更に、前記マイクロ流体デバイスを通る流体の流速を実質的にゼロに急激に低減するステップを具えることを特徴とする方法。
22. 請求項１８に記載の方法において、前記一またはそれ以上の溶液が、蛍光標識、抗体、核酸染料、及び蛍光発生基質からなる群から選択された標識を含む溶液を具えることを特徴とする方法。
23. 請求項１８に記載の方法において、前記一またはそれ以上の溶液が、固定剤を含むことを特徴とする方法。
24. 請求項１８に記載の方法において、前記一またはそれ以上の溶液が透過剤を含むことを特徴とする方法。
25. 請求項１９に記載の方法が更に、前記一またはそれ以上の溶液を流した後であって、前記捕獲した細胞を放出する前に、前記インレットに洗浄液を流すことを特徴とする方法。
26. 請求項１８に記載の方法が更に、前記捕獲した細胞を回収するステップを具えることを特徴とする方法。
27. 請求項２６に記載の方法において、前記捕獲した細胞が、前記第１の溶液中の細胞の体積濃度の１０倍以上の体積濃度を有することを特徴とする方法。
28. サイズによって粒子又は細胞を捕獲する方法において：
    インレットとアウトレットに接続した少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有するマイクロ流体デバイスを提供するステップであって、当該少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、当該チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて前記少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成された、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激に増大する部分を具える、マイクロ流体デバイスを提供するステップと；
    前記インレットに複数の細胞又は粒子を含む溶液を流すステップと；
    前記少なくとも一の拡張領域内に生じた前記渦の中に前記細胞又は粒子の少なくとも一部を捕獲するステップであって、閾値を超えるサイズを有する前記細胞又は粒子が前記渦の中に実質的に捕獲され、閾値以下のサイズを有する前記細胞又は粒子が前記渦を実質的に通過する、ステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
29. 請求項２８に記載の方法が更に、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通る溶液の流速を低減させることによって前記少なくとも一の拡張領域から前記捕獲した細胞又は粒子を放出するステップを具えることを特徴とする方法。
30. 請求項２８に記載の方法が更に、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを流れる溶液の流速を実質的にゼロに急激に低減するステップを具えることを特徴とする方法。
31. 請求項２８に記載の方法において、前記閾値が直径１５μｍであることを特徴とする方法。
32. 請求項２８に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、流れの軸に対して少なくとも４５°で延在する立ち上がり壁を具えることを特徴とする方法。
33. 請求項２８に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、矩形、正方形、三角形、多角形、あるいは半円形のプロファイルを有することを特徴とする方法。
34. 請求項２８に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、急激に減少する部分を具えることを特徴とする方法。
35. 請求項２８に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、実質的に減少していないことを特徴とする方法。
36. 請求項２８に記載の方法において、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、徐々に減少していることを特徴とする方法。
37. マイクロ流体デバイスにおいて、
    少なくとも一のインレットとアウトレットに接続した少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有する基体であって、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、当該マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において少なくとも８０μｍの急激に増大する部分を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて前記少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成されている、基体を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
38. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が２００μｍ乃至２ｍｍの長さであることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
39. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスが更に、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通って流れるように構成された粒子源を具え、当該粒子源が直径≧１０μｍの粒子を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
40. 請求項３９に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記粒子源が直径≧１５μｍの粒子を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
41. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスが更に、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された複数の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
42. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスが更に、複数のマイクロ流体チャネルを具え、当該複数のマイクロ流体チャネルの各々が、少なくとも一の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
43. 請求項４０に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルの各々が、複数の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
44. 請求項４１及び４２に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、隣接するマイクロ流体チャネルが互いに千鳥配置されていることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
45. 請求項４２及び４３に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルが二次元アレイに配置されていることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
46. 請求項４２及び４３に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルが三次元アレイに配置されていることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
47. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記流れの軸に対して少なくとも４５°の角度で延在する立ち上がり壁を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
48. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、矩形、正方形、三角形、多角形、あるいは半円形のプロファイルを有することを特徴とするマイクロ流体デバイス。
49. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、急激に減少する部分を具えることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
50. 請求項３７に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、実質的に減少していないことを特徴とするマイクロ流体デバイス。
51. 請求項３７記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、徐々に減少していることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
52. 請求項３９に記載のマイクロ流体デバイスにおいて、前記粒子が細胞を含むことを特徴とするマイクロ流体デバイス。
53. マイクロ流体システムにおいて：
    少なくとも一のインレットとアウトレットに接続した少なくとも一のマイクロ流体チャネルを有する基体であって、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルが、当該マイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された少なくとも一の拡張領域を具え、前記少なくとも一の拡張領域が、流体の流れに応じて前記少なくとも一の拡張領域内に渦を発生させるように構成されており、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において急激に増大する部分を具える、基体と；
    粒子又は細胞を含む流体を前記少なくとも一のインレットにくみ上げるように構成された少なくとも一のポンプと；
    前記少なくとも一のポンプに動作可能に接続され、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルを通過する流体の流速を調整するように構成されたコンピュータと；
    を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
54. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一のポンプが、シリンジポンプ、空気圧力ポンプ、ぜん動ポンプ、及び容積型ポンプのうちの少なくとも一つを具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
55. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムが更に、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの長さに沿って配置された複数の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
56. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムが更に、複数のマイクロ流体チャネルを具え、当該複数のマイクロ流体チャネルの各々が少なくとも一の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
57. 請求項５６に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルの各々が複数の拡張領域を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
58. 請求項５６及び５７に記載のマイクロ流体システムにおいて、隣接するマイクロ流体チャネルが互いに千鳥配置されていることを特徴とするマイクロ流体システム。
59. 請求項５６及び５７に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルが二次元アレイに配置されていることを特徴とするマイクロ流体システム。
60. 請求項５６及び５７に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記複数のマイクロ流体チャネルが三次元アレイに配置されていることを特徴とするマイクロ流体システム。
61. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記拡張領域が前記流れの軸に対して少なくとも４５°の角度で延在する立ち上がり壁を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
62. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、矩形、正方形、三角形、多角形、あるいは半円形のプロファイルを有することを特徴とするマイクロ流体システム。
63. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、急激に減少する部分を具えることを特徴とするマイクロ流体システム。
64. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、実質的に減少していないことを特徴とするマイクロ流体デバイス。
65. 請求項５３記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの断面寸法において、徐々に減少していることを特徴とするマイクロ流体システム。
66. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルの幅が２０μｍ乃至２００μｍの範囲内であることを特徴とするマイクロ流体システム。
67. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体チャネルから、８０μｍ乃至８００μｍの範囲の距離だけ離れて延在していることを特徴とするマイクロ流体システム。
68. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムにおいて、前記少なくとも一の拡張領域が、前記少なくとも一のマイクロ流体の長さに沿って、２００μｍ乃至２ｍｍの範囲の距離延在していることを特徴とするマイクロ流体システム。
69. 請求項５８に記載のマイクロ流体システムにおいて、隣接する拡張領域が、２０μｍより大きい距離だけ離れていることを特徴とするマイクロ流体システム。
70. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムが更に、前記少なくとも一のインレットの上流側に配置した一またはそれ以上のバルブを具え、当該一またはそれ以上のバルブが前記コンピュータで制御されるように構成されていることを特徴とするマイクロ流体システム。
71. 請求項５３に記載のマイクロ流体システムが更に、前記アウトレットの下流側に配置した一またはそれ以上のバルブを具え、当該一またはそれ以上のバルブが前記コンピュータで制御されるように構成されていることを特徴とするマイクロ流体システム。

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