TW201623605A - 用於癌症診斷及預後之方法及系統 - Google Patents

Abstract

本發明提供製備及使用泡沫組合物之組合物及方法及該泡沫組合物在臨床應用中之效用。

Description

用於癌症診斷及預後之方法及系統 交叉參考

本申請案主張於2015年4月1日提出申請的美國臨時申請案第61/973,348號及於2015年4月4日提出申請的美國臨時申請案第61/975,699號之權益，該等申請案以引用方式併入本文中。

研究稀有細胞(例如循環腫瘤細胞(CTC))可有助於疾病之檢測、診斷及預後以及臨床護理及藥物發現。舉例而言，分離及分析循環腫瘤細胞可對於確定腫瘤之起源或理解腫瘤轉移之過程至關重要。稀有細胞可能因其在血液樣品中相對較低之豐度而難以捕獲。稀有細胞(如循環腫瘤細胞)可能較為脆弱。用於分離稀有細胞之眾多種技術(例如免疫磁力分離、基於細胞大小之過濾、抗體功能化微流體裝置、纖維光學陣列掃描技術、介電泳、被動細胞分選、陰性選擇、整體決策等份排序)可具有結果再現之檢測及/或變化低限。因此，業內需要分離呈與檢測癌症及其他疾病中之後續分子分析及臨床效用相容之格式之稀有細胞(例如CTC)的系統及方法。

本發明係關於用於分離所關注靶粒子之方法、組合物及系統，該等靶粒子係例如循環腫瘤細胞(CTC)、循環稀有細胞(CRC)、幹細胞(例如腫瘤幹細胞及骨髓幹細胞)、胎兒細胞、細菌、病毒、上皮細 胞、內皮細胞或諸如此類。經分離之靶細胞可為活細胞，且可用於活體外及活體內細胞培養及生長、細胞保存、檢測、分子分析及臨床應用。該系統及方法可有助於癌症診斷、預後及治療。

因此，在一個態樣中，提供一種方法。該方法包含：(a)使用微流體裝置，自源自個體之異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞，其中微流體裝置包含非結垢組合物且具有針對稀有細胞至少40%之捕獲效率；及(b)自微流體裝置釋放所捕獲之稀有細胞，同時使至少40%之所釋放稀有細胞維持活力。

在一些實施例中，該方法進一步包含分析所釋放之稀有細胞，由此評價個體中病況之存在、不存在、嚴重程度、轉移、起源組織。在一些實施例中，病況係癌症且異質細胞樣品係血液樣品。在一些實施例中，病況係良性疾病。在一些實施例中，稀有細胞係CTC。在一些實施例中，分析包含計數CTC、計數活CTC或對CTC實施分子分析測定。在一些實施例中，病況係癌症，且評價嚴重程度包含確定癌症時期。在一些實施例中，癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。在一些實施例中，該方法進一步包含在第二時間點重複步驟(a)及(b)。在一些實施例中，分析包含比較多個所釋放之活CTC與截止值。在一些實施例中，截止值係3個稀有細胞且血液樣品具有等於或至多6mL之體積。在一些實施例中，血液樣品具有等於至多2mL之體積。在一些實施例中，評價嚴重程度包含確定癌症時期，且其中癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。在一些實施例中，該方法進一步包含基於癌症時期選擇針對個體之藥物療法。在一些實施例中，評價確定發育不良或I期癌症之存在或不存在且在成像診斷之前進行。在一些實施例中，成像診斷包含超音波、CT、MRI、PET或觸診分析。在一些實施例中，病況係結腸疾病、GI疾病或卵巢/子宮內膜疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用 DAPI、抗CK20及抗CD45對所釋放之稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係乳房疾病或前列腺疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用抗PSA及抗PSMA對所釋放之稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係乳房疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用一或多種選自由抗CK7、抗HER2、抗ER及抗PR組成之群之標記物對所釋放之稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係肺疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用一或多種選自由抗CK7、抗TTF1及抗EGFR組成之群之標記物對所釋放之稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係癌症，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用抗廣譜CK或抗CK18對稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係微轉移。

在另一態樣中，提供評價個體中之癌症起源之方法。該方法包含：使用微流體裝置，自異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞；用抗體組對所富集之稀有細胞染色，其中抗體組包含兩種或更多種不同類型之抗體；及基於染色結果預測稀有細胞之癌症起源。

在一些實施例中，預測癌症起源包含1)確定癌細胞之存在，及2)確定癌症起源(若存在癌細胞)。在一些實施例中，抗體組包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、抗CK20、抗CDX-2、抗PSA或抗PSMA。在一些實施例中，癌症起源包含乳癌、肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、前列腺癌或其他起源之癌症。在一些實施例中，異質細胞樣品係體積等於或至多6mL之血液樣品。在一些實施例中，血液樣品具有等於或至多2mL之體積。在一些實施例中，該方法進一步包含基於癌症之進展選擇針對個體之藥物療法。

在另一態樣中，提供釋放捕獲於微流體表面上之靶細胞之方法。該方法包含：使空氣泡沫流動經過微流體表面，其中微流體表面包含脂質雙層且將靶細胞捕獲於脂質雙層之頂層上；及剝離頂層，由此釋放捕獲於頂層上之靶細胞。

在一些實施例中，以至少40%之效率及40%之活力釋放所捕獲之靶細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含1)用抗體組對靶細胞染色，及2)基於染色結果鑑別起源。在一些實施例中，抗體組包含以下中之至少兩者：抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。在一些實施例中，該方法進一步包含分析所釋放之靶細胞，由此評價個體中病況之存在、不存在、嚴重程度、轉移、起源組織。

在另一態樣中，提供釋放捕獲於包含非結垢組合物之微流體表面上之靶細胞的方法。該方法包含：影響非結垢組合物之狀態；及釋放靶細胞，其中靶細胞因非結垢組合物之狀態受影響而釋放。

在另一態樣中，提供評價個體中病況之存在、不存在或嚴重程度之方法。該方法包含：實施診斷測試，其中診斷測試具有曲線下面積為0.75或更大之ROC曲線。

在一些實施例中，病況係癌症。在一些實施例中，病況係I期或I期前癌症。在一些實施例中，該方法進一步包含基於ROC曲線比較血液樣品中之CTC細胞計數與截止值，由此評價病況之存在或不存在。

在另一態樣中，提供評價個體中病況之存在、不存在或嚴重程度之方法。該方法包含：使用微流體裝置，自體積等於或小於7mL之患者血液樣品選擇性地富集稀有細胞；及分析稀有細胞，由此評價個體中病況之存在或嚴重程度。

在一些實施例中，患者血液樣品具有等於或小於2mL之體積。在一些實施例中，病況係發育不良或I期癌症。在一些實施例中，分析稀有細胞包含比較患者血液樣品中之稀有細胞數與截止值，其中截止值係基於ROC曲線下面積為0.75或更大之測試來產生。在一些實施例中，稀有細胞係CTC且其中病況係癌症。

在另一態樣中，提供確定個體中發育不良或I期癌症之存在或不 存在之方法。該方法包含：使用微流體裝置，自源自個體之異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞；及測定所富集之稀有細胞數且比較個數值與截止值，由此確定個體中發育不良或I期癌症之存在或不存在。

在一些實施例中，稀有細胞係CTC。在一些實施例中，確定存在或不存在係在成像前進行。在一些實施例中，成像無法檢測或確定發育不良或I期癌症之存在或不存在。

在另一態樣中，提供評價個體中病況之存在或嚴重程度之方法。該方法包含：使用微流體裝置，自源自個體之異質細胞樣品以至少40%之捕獲效率選擇性地富集稀有細胞；自微流體裝置釋放稀有細胞，同時使至少40%之稀有細胞維持活力；及分析所釋放之稀有細胞，由此評價個體中病況之存在或嚴重程度。

在一些實施例中，利用由ROC曲線下面積界定之敏感性及特異性來評價病況之存在或嚴重程度，其中ROC曲線下面積為0.75或更大。在一些實施例中，病況係癌症。在一些實施例中，病況係良性疾病。在一些實施例中，稀有細胞係CTC。在一些實施例中，分析所釋放之稀有細胞涉及計數CTC、計數活CTC及對CTC實施分子分析測定。在一些實施例中，病況係癌症，且評價嚴重程度包含確定癌症時期。在一些實施例中，癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。在一些實施例中，該方法進一步包含1)基於曲線下面積產生截止值，及2)基於截止值確定病況之存在或嚴重程度。在一些實施例中，確定病況之存在或嚴重程度包含比較截止值與異質細胞樣品內所釋放之稀有細胞數。在一些實施例中，截止值係3個或更多個稀有細胞，且異質細胞樣品係體積等於或小於2mL之患者血液樣品。在一些實施例中，病況係癌症或疾病。在一些實施例中，評價嚴重程度包含確定癌症時期，且其中癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。在一些實施例中，異質細胞樣品係體積等於或小於2 mL之患者血液樣品。在一些實施例中，病況係結腸疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用DAPI、CK20及CD45對稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係乳房或前列腺疾病，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用抗PSA及/或抗PSMA對稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係癌症，且其中分析所釋放之稀有細胞包含用抗廣譜CK或抗CK18對稀有細胞染色。在一些實施例中，病況係微轉移。在一些實施例中，病況係癌症，且其中病況之存在係在無法藉由成像技術(包含CT、PET、超音波或MRI)檢測之時期確定。

在另一態樣中，提供評價個體中之癌症起源之方法。該方法包含：使用微流體裝置，自源自個體之異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞；自微流體裝置釋放稀有細胞；用抗體組對稀有細胞染色，其中抗體組包含兩種或更多種不同類型之抗體；及基於染色結果預測稀有細胞之癌症起源。

在一些實施例中，預測癌症起源包含1)確定癌細胞之存在，及2)確定癌症起源(若存在癌細胞)。在一些實施例中，抗體組包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、抗CK20、抗CDX-2、抗PSA或抗PSMA。在一些實施例中，癌症起源包含乳癌、肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、前列腺癌或其他起源之癌症。在一些實施例中，稀有細胞係以等於或小於2mL之量自患者之末梢血收集。

在另一態樣中，提供釋放捕獲於微流體表面上之靶細胞之方法。該方法包含：使包含氣泡之流體流動經過微流體表面，其中微流體表面包括脂質雙層及選擇性地結合靶細胞之結合部分，且其中結合部分偶合至脂質雙層之頂層；及剝離脂質雙層之頂層，由此剝離偶合至頂層之結合部分，從而釋放結合至結合部分之靶細胞。

在一些實施例中，結合部分以至少40%之效率結合靶細胞。在一些實施例中，靶細胞之釋放係以至少40%之效率釋放該等細胞。在一 些實施例中，所釋放之靶細胞具有至少40%之活力。在一些實施例中，該方法進一步包含確定靶細胞之起源。在一些實施例中，確定起源包含1)用抗體組對靶細胞染色，及2)基於染色結果鑑別起源。在一些實施例中，抗體組包含以下中之至少兩者：抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。

本發明之另一態樣提供體積大於1毫升之泡沫組合物，其中泡沫組合物包含氣泡，其中大於50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑，且其中泡沫組合物之大於80%之體積為空氣。在一些實施例中，大於60%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，大於70%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，大於80%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，大於90%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，泡沫組合物包含大於2毫升之體積。在一些實施例中，泡沫組合物包含大於3毫升之體積。在一些實施例中，泡沫組合物包含大於4毫升之體積。在一些實施例中，泡沫組合物包含大於5毫升之體積。在一些實施例中，泡沫組合物係等滲的。在一些實施例中，泡沫組合物包含牛血清白蛋白(BSA)。在一些實施例中，泡沫組合物包含細胞培養基。在一些實施例中，泡沫組合物包含與細胞培養物相容之含有蛋白質之溶液。在一些實施例中，泡沫組合物中液體對空氣之比率為至少1.5：1。在一些實施例中，泡沫組合物中液體對空氣之比率為至少2：1。在一些實施例中，泡沫組合物中液體對空氣之比率為至少3：1。在一些實施例中，泡沫組合物中液體對空氣之比率為至少4：1。在一些實施例中，泡沫組合物中液體對空氣之比率為至少5：1。在一些實施例中，泡沫組合物之大於90%之體積為空氣。在一些實施例中，泡沫組合物之大於95%之體積為空氣。

在一個態樣中，本發明提供自表面移除粒子之方法，其包含：使泡沫組合物流經表面，及自表面移除粒子，其中泡沫組合物包含氣泡，且其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，流動包含至少2.5mm/s之線速度。在一些實施例中，流動包含至多4mm/s之線速度。在一些實施例中，流動包含2.6mm/s至3.9mm/s之線速度。在一些實施例中，流動包含至少0.5mm/s之線速度。在一些實施例中，流動包含至多4mm/s之線速度。在一些實施例中，流動包含0.5mm/s至4mm/s之線速度。在一些實施例中，流動移除大於60%的非結垢組合物。在一些實施例中，流動移除大於70%之非結垢組合物。在一些實施例中，流動移除大於80%之非結垢組合物。在一些實施例中，流動移除大於90%之非結垢組合物。在一些實施例中，表面包含一系列微結構。在一些實施例中，表面包含非結垢組合物。在一些實施例中，非結垢組合物包含聚合物及結合部分。在一些實施例中，非結垢組合物包含脂質層及結合部分。在一些實施例中，結合部分非共價偶合至非結垢組合物。在一些實施例中，結合部分共價偶合至非結垢組合物。在一些實施例中，結合部分包埋於非結垢組合物中。在一些實施例中，結合部分偶合至表面。在一些實施例中，脂質層包含單層。在一些實施例中，脂質層包含雙層。在一些實施例中，脂質層包含脂質體。在一些實施例中，脂質層包含脂質單層、雙層或脂質體中之兩者或更多者。在一些實施例中，結合部分包含抗EpCAM抗體。在一些實施例中，結合部分包含抗HER2抗體。在一些實施例中，結合部分包含抗體。在一些實施例中，表面包含結合細胞。在一些實施例中，結合細胞係藉由泡沫組合物來移除。在一些實施例中，結合細胞藉由結合部分結合至表面。在一些實施例中，細胞係稀有細胞。在一些實施例中，細胞係循環腫瘤細胞。在一些實施例中，非結垢組合物防止結合至少50%之非靶粒子。在一些實施例中， 非結垢組合物防止結合至少60%之非靶粒子。在一些實施例中，非結垢組合物防止結合至少70%之非靶粒子。在一些實施例中，非結垢組合物防止結合至少80%之非靶粒子。在一些實施例中，非結垢組合物防止結合至少90%之非靶粒子。在一些實施例中，泡沫組合物係藉由產生泡沫組合物之方法來產生，該方法包含：以至少1.5：1之比率組合液體溶液與空氣；及將液體溶液及空氣渦旋至多30秒，由此產生氣泡，其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，泡沫組合物係藉由產生泡沫組合物之方法來產生，該方法包含：將溶液引入第一容器中，將該溶液轉移至第二容器中，其中第二容器包含空氣，且其中轉移係經由孔洞來進行；經由孔洞將該溶液自第二容器轉移至第一容器中；及產生泡沫，其中泡沫包含氣泡，且其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，泡沫組合物係藉由產生泡沫組合物之方法來產生，該方法包含：將溶液抽取通過膜，其中溶液包含至少1：1.5之空氣對液體比率，其中抽取產生氣泡，且其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，表面包含微流體通道。

在一個態樣中，本發明提供產生泡沫組合物之方法，其包含：以至少1.5：1之比率組合液體溶液與空氣，將液體溶液及空氣渦旋至多30秒，由此產生氣泡，其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，比率為至少2：1。在一些實施例中，比率為至少3：1。在一些實施例中，比率為至少4：1。在一些實施例中，比率為至少5：1。在一些實施例中，至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少60%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少70%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少80%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少90%之氣泡包含10微米至100微米之直 徑。

在一個態樣中，本發明提供產生泡沫組合物之方法，其包含：將溶液引入第一容器中，將該溶液轉移至第二容器中，其中第二容器包含空氣，且其中轉移係經由孔洞來進行；經由孔洞將該溶液自第二容器轉移至第一容器中；及產生泡沫，其中泡沫包含氣泡，且其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，重複該方法。在一些實施例中，將該方法重複至少5次。在一些實施例中，將該方法重複10次。在一些實施例中，容器包含注射器。在一些實施例中，孔洞包含至多2毫米之直徑。在一些實施例中，孔洞包含至多100微米之直徑。在一些實施例中，至少60%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少70%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少80%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少90%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，溶液對空氣之比率為至少1.5：1。在一些實施例中，溶液對空氣之比率為至少2：1。在一些實施例中，溶液對空氣之比率為至少3：1。在一些實施例中，溶液對空氣之比率為至少4：1。在一些實施例中，溶液對空氣之比率為至少5：1。

在一個態樣中，本發明提供產生泡沫組合物之方法，其包含：將溶液抽取通過膜，其中溶液包含至少1：1.5之空氣對液體比率，其中抽取產生氣泡，且其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，膜包含細孔膜。在一些實施例中，膜包含複數個孔。在一些實施例中，孔包含2毫米之直徑。在一些實施例中，膜包含氣石。在一些實施例中，比率為至少2：1。在一些實施例中，比率為至少3：1。在一些實施例中，比率為至少4：1。在一些實施例中，比率為至少5：1。在一些實施例中，至少60%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少70%之氣泡包含10微米至100微 米之直徑。在一些實施例中，至少80%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，至少90%之氣泡包含10微米至100微米之直徑。

在一個態樣中，本發明提供產生泡沫組合物之方法，其包含：泵送包含含有蛋白質之溶液之溶液，其中該泵送產生氣泡，且其中該等氣泡中之至少50%包含10微米至100微米之直徑。在一些實施例中，僅進行一次泵送。在一些實施例中，泵送混合該含有蛋白質之溶液與大氣。

本發明之另一態樣之特徵在於用於分離樣品中之靶細胞之細胞捕獲/釋放平臺。該平臺包含包括潤滑組合物之脂質偶聯物及特異性結合靶細胞之結合劑，且其中脂質偶聯物與結合劑係經由連接體來連接。在一些實施例中，脂質偶聯物固定在基板上。在一些實施例中，基板係平坦裝置。在某些實施例中，基板係微流體裝置。

本發明之另一態樣之特徵在於用於分離樣品中之靶細胞之方法。該方法包含以下步驟：(a)使樣品與包含潤滑組合物之脂質偶聯物及特異性結合靶細胞之結合劑接觸，且其中潤滑偶聯物及結合劑係經由連接體來連接；(b)洗滌掉未結合之細胞；及(c)釋放結合細胞，由此分離靶細胞。

本文所述之樣品可為體液、體液之稀釋物、全血、尿液、淋巴或腹水。在一些實施例中，樣品之體積小於9mL、小於6mL、小於4mL或小於3mL、小於2mL或小於1mL。在一些實施例中，樣品之體積為約8mL、約6mL、約4mL、約2mL或約1mL。

本文所述之靶細胞包括(但不限於)腫瘤細胞、幹細胞、病原體、T細胞、心肌細胞、循環腫瘤細胞、循環上皮細胞及循環內皮細胞。

在一些實施例中，該方法進一步包含富集經分離之細胞。

經分離細胞保持活力。在一些實施例中，經分離細胞具有大於 95%、大於90%、大於80%、大於70%、大於60%、大於50%、大於40%或大於30%之細胞活力。在一些實施例中，至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約40%或至少約30%之經分離細胞具有活力。

本文所揭示之結合劑特異性結合靶細胞表面。在一些實施例中，靶細胞係上皮細胞，且結合劑係針對上皮細胞黏附分子膜蛋白之抗體(抗EpCAM)。在較佳實施例中，結合劑係抗EpAb 4-1。

本文所揭示之潤滑組合物係脂質部分、脂質混合物、脂質單層、脂質雙層、脂質體、脂質聚合物或聚乙二醇。在較佳實施例中，潤滑組合物係經支撐之脂質雙層(SLB)。

靶細胞係在不破壞該等細胞的情況下釋放，由此經分離細胞保持完整及活力。在一些實施例中，靶細胞係經由破壞脂質偶聯物來釋放。在一些實施例中，靶細胞係經由破壞潤滑組合物(例如SLB)來釋放。

在一些實施例中，步驟(b)中之洗滌藉由向潤滑組合物施加剪切應力來實施。在一些實施例中，剪切應力為約0.5達因(dyne)/cm²至約30達因/cm²。在一些實施例中，剪切應力為約0.5達因/cm²、約1達因/cm²、約2.5達因/cm²、約5達因/cm²、約7.5達因/cm²、約10達因/cm²、約12.5達因/cm²、約15達因/cm²、約20達因/cm²或約30達因/cm²。

在一些實施例中，步驟(c)中之釋放係藉由施加溫和掃除力來實施。溫和掃除力包括(但不限於)氣泡之剪切、空氣泡沫之剪切、乳化流體之剪切、超音波振動或油相。溫和掃除力提供與潤滑組合物之疏水性相互作用。

在一些實施例中，該方法進一步包含富集經分離之細胞。在一些實施例中，經分離細胞之富集為至少200倍、至少400倍、至少600 倍、至少800倍或至少1000倍。

在另一態樣中，本發明之特徵在於在活體外或活體內培養經分離細胞及使其生長之方法。該方法包括以下步驟：(a)根據本文所揭示之方法分離靶細胞，及(b)將經分離之細胞維持在可在活體內或活體外有效地培養活靶細胞及使其生長之條件下。

本發明之另一態樣之特徵在於保存活靶細胞之方法。該方法包括以下步驟：(a)根據本文所揭示之方法分離靶細胞，及(b)將經分離之細胞保存在適於長期儲存之條件下。

在另一態樣中，本發明之特徵在於對經分離之細胞實施分子分析之方法。該方法包括以下步驟：(a)根據本文所述之方法分離靶細胞，及(b)實施分子分析。

本發明之另一態樣之特徵在於檢測個體中之靶細胞之方法。該方法包括以下步驟：(a)根據本文所述之方法分離靶細胞；(b)藉由染色檢測靶細胞。個體患有或懷疑患有疾病/癌症。

本發明之另一態樣之特徵在於評價患有癌症之患者之癌症進展的方法。該方法包含以下步驟：(a)自患者分離循環腫瘤細胞(CTC)，及(b)對CTC實施一或多種細胞或分子分析以確定患者之癌症進展。

經分離之循環腫瘤細胞(CTC)實質上係純淨的。在一些實施例中，實質上純淨之CTC群包含不大於20%之非CTC細胞。在一些實施例中，實質上純淨之CTC群包含不大於10%之非CTC細胞。在一些實施例中，實質上純淨之CTC群包含不大於5%之非CTC細胞。

癌症之實例包括(但不限於)肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、皮膚癌、乳頭狀甲狀腺癌、結腸直腸癌、乳癌、淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、盆腔癌及睪九癌。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析包含形態分析、基 因組分析、表觀基因組分析、轉錄組分析、蛋白質體學分析或其任一組合。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析包含確定CTC中之一或多個DNA突變。

在一些實施例中，DNA突變包含插入、缺失、取代、移位、基因擴增或其任一組合。

在一些實施例中，DNA突變位於選自由以下組成之群之基因中：KRAS、APC、TP53、BRAF、PTEN、EGFR、ERCC1、RRM1、ELM4、HER2及ALK。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析包含確定癌症特異性基因在CTC中之蛋白質表現量。在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析包含確定癌症特異性基因在CTC中之RNA表現量。

在一些實施例中，該方法進一步包含藉由染色檢測一或多種癌症特異性標記物在CTC中之表現，及計數經染色之細胞。可基於癌症特異性CTC之分子分析及計數之組合結果來確定患者中腫瘤之時期及/或預後。

多種癌症特異性標記物為業內已知。在一些實施例中，癌症特異性標記物係細胞角蛋白、CDX1、CDH17、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1(MUC-1)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α胎兒蛋白(AFP)、肝細胞癌(HCC)、N-鈣黏蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人類平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)、RRM1或癌胚胎抗原(CEA)、CD44及p53、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、GloboH、CD133、CD24、CD44、CD90、ER或PR。

此外，本發明之特徵在於評價個體中疾病之存在及/或嚴重程度 之方法，該方法包含(a)自個體分離循環腫瘤細胞(CTC)；(b)藉由染色檢測一或多種癌症特異性標記物在CTC中之表現；(c)計數經染色之細胞；且其中經染色細胞之數量及/或與對照相比之數量變化指示疾病之存在及/或嚴重程度；由此，評價疾病之存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，該方法進一步包含對CTC實施一或多種細胞或分子分析，及基於疾病特異性CTC之分子分析及計數之組合結果確定疾病之存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，癌症係癌症。經染色細胞數增多指示癌症較差預後或轉移。

在一些實施例中，疾病係癌前病症。癌前病症之實例包括日光性角化症、巴雷斯特食道症(Barrett's esophagus)、萎縮性胃炎、先天性角化不良、缺鐵性吞嚥困難、扁平苔癬、口腔黏膜下纖維化、日光性彈力組織變性及子宮頸發育不良。

本發明之特徵亦在於檢測個體之結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之方法。該方法包括以下步驟：(a)自個體分離循環腫瘤細胞(CTC)；(b)藉由染色檢測一或多種選自由以下組成之群之標記物在CTC中之表現：DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、廣譜CK、TCN、SULT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC及IL-23a；(c)計數經染色之細胞；且其中經染色細胞之數量及/或與對照相比之數量變化指示結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，標記物包括CK20及選自由以下組成之群中之一或多者：DAPI、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、廣譜CK TCN、SULT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC及/或IL-23a。

在一些實施例中，標記物選自由以下組成之群：DAPI、CK20、 CD45及CEA。在一些實施例中，標記物選自由以下組成之群：DAPI、CK20及CD45。

在一些實施例中，結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之存在及/或嚴重程度係由在DAPI+/CK20+/CD45-之表現中經染色細胞之數量或數量變化來指示。

在一些實施例中，個體係患有或懷疑患有胃腸(GI)道疾病之人類患者。胃腸道疾病包括(但不限於)巴雷斯特食道症、胃潰瘍、胃炎、平滑肌瘤、息肉、克隆氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、胰臟炎、腺癌、黏液腺癌、類癌腫瘤、鱗狀細胞癌、淋巴瘤及肉瘤。

在一些實施例中，個體係患有結腸直腸癌(CRC)之人類患者。在某些實施例中，結腸直腸癌患者患有為0期、I期、II期、時期III及/或IV期結腸直腸癌之結腸直腸癌。

本發明一或多個實施例之細節闡釋於下文描述中。自以下圖式及若干實施例之詳細描述亦及隨附申請專利範圍將明瞭本發明之其他特徵或優點。

以引用方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同明確地及個別地指出將每一個別公開案、專利或專利申請案以引用方式併入一般。

105‧‧‧結合部分

110‧‧‧連接體

115‧‧‧非結垢組合物

120‧‧‧表面

125‧‧‧接觸

130‧‧‧所關注粒子

135‧‧‧流經

140‧‧‧氣泡

201‧‧‧本發明泡沫組合物

202‧‧‧空氣-液體界面

205‧‧‧通道

210‧‧‧連續液體界面

215‧‧‧氣泡

220‧‧‧通道

225‧‧‧液體

226‧‧‧空氣-液體界面

230‧‧‧空氣

301‧‧‧圓形玻璃毛細管

303‧‧‧液體

305‧‧‧氣泡

500‧‧‧微流體裝置

502‧‧‧聯結件

504‧‧‧頂板

506‧‧‧間隔件

508‧‧‧基底載玻片

901‧‧‧幾何結構

902‧‧‧性能

本發明之特徵具體闡釋於隨附申請專利範圍內。參考闡釋其中利用本發明原理之說明性實施例之下文詳細描述及其附圖將會更好地理解本發明之特徵及優點，在附圖中：圖1圖解說明本發明方法之實例性實施例。

圖2圖解說明本發明泡沫組合物之實例性實施例及空氣-液體界面。

圖3圖解說明毛細管微流體裝置。

圖4提供用於CTC檢測之決策樹。

圖5提供微流體裝置之分解視圖。

圖6圖解說明根據實施例在微流體通道中製備抗體系鏈SLB包膜所遵循之順序步驟。

圖7繪示用於產生本發明泡沫組合物之實例性裝置。

圖8繪示用於產生本發明泡沫組合物之實例性裝置。

圖9圖解說明6種不同的微流體通道設計(A至F)之幾何結構及性能。

圖10圖解說明微流體通道設計A及B之構築及尺寸。

圖11圖解說明微流體通道設計C及D之構築及尺寸。

圖12圖解說明微流體通道設計E及F之構築及尺寸。

圖13圖解說明經由增加緩衝液流速選擇性地增加流動通道中之剪切應力來純化。

圖14提供釋放過程之時移顯微照片。

圖15提供將自晶片釋放之細胞及所附接抗體及空氣泡沫一起收集至埃彭道夫管(Eppendorf tube)中。

圖16顯示所溶析CTC之培養及遺傳突變分析。

圖17圖解說明在小基板上收集之細胞。

圖18圖解說明覆蓋用於細胞鑑別之螢光影像之癌細胞。

圖19圖解說明針對CRC疾病TNM時期之CTC計數/2mL。

圖20圖解說明使用者、樣品、電腦與輸出之間之相互作用。

圖21顯示所有個體(自健康供體至具有0/I、II、III至IV之TNM時期之結腸直腸癌患者)的CTC計數/2mL末梢血。

圖22顯示藉由CTC之癌症診斷之敏感性及特異性。

圖23圖解說明根據癌症進展之平均CTC數量。

圖24圖解說明系統之簡單工作流程。

一般概述

本發明提供自非結垢組合物捕獲並移除粒子之組合物及方法。該等粒子可係所關注粒子，例如細胞，包括循環腫瘤細胞(CTC)、循環稀有細胞(CRC)、幹細胞(例如腫瘤幹細胞及骨髓幹細胞)、胎兒細胞、細菌、病毒、上皮細胞、內皮細胞或諸如此類。所關注粒子可流經可包含表面之通道。該表面可經所關注粒子可附接之結合部分包覆。該表面可包含非結垢組合物。非結垢組合物可指減少非特異性粒子結合之脂質組合物。換言之，非結垢組合物可藉由減少非特異性粒子與組合物之結合來富集所關注粒子之純度。當藉由結合部分及非結垢組合物捕獲所關注粒子時，其可藉由溫和掃除力或包含氣泡之泡沫組合物來移除。舉例而言，溫和掃除力可係氣泡之剪切、空氣泡沫之剪切、乳化流體之剪切、超音波振動或油相。泡沫組合物可移除所關注粒子、結合部分及/或非結垢組合物。

該方法之實例性實施例繪製於圖1中。表面120可包覆於非結垢組合物115中。非結垢組合物115可附接至連接體110。連接體110可偶聯至結合部分105。結合部分105可係抗體。表面120可與包含所關注粒子130之樣品接觸125。在一些情況下，所關注粒子130係細胞。在一些情況下，所關注粒子130係稀有細胞。所關注粒子130可結合至結合部分105。包含氣泡140之泡沫組合物可流經135表面120。氣泡140可自表面120移除非結垢組合物115以及任何結合細胞130。儘管圖1顯示氣泡140移除單一所關注粒子，但應理解該氣泡可移除複數個所關注粒子及/或非結垢組合物。

可進一步分析所關注粒子(例如，CTC)且將其用於諸如癌症診斷、預後及治療等臨床應用中。上文所提及之系統及方法可使得能夠 捕獲並釋放對構件敏感且與其相容之活CTC以確認疾病(例如，與後續分子分析相容)。舉例而言，本文所提供之系統及方法可容許捕獲並釋放活CTC，此容許在活體外研究或繁殖活癌細胞以使得能夠利用其他技術進行分析，來獲得可產生可行療法指導且可有益於治療研發之結果。在一些情況下，其他技術可包括全基因組分子分析以研究突變或後生變化。在一些情況下，其他技術可包括用於靶向癌症幹細胞之醫藥干預之路徑分析。儘管本文主要論述關於癌症之應用，但應理解本文所述之組合物及方法可用於與非癌病況相關之臨床應用中。舉例而言，臨床應用可能與息肉、良性疾病(例如發炎性腸病(IBD))、關節炎、結腸炎及諸如此類相關。舉例而言，在活躍時，CTC計數可能較高且檢測率較高。

表面

可用於選擇性捕獲並有效釋放所關注粒子(例如CTC)之本文裝置可包括一或多個表面。該等表面可為平面、彎曲、平坦、圓形、不規則形狀，及/或包含拓撲特徵(例如，微結構或奈米結構，例如奈米粒子、奈米線等)。該等表面可相同。該等表面可不同(例如，頂部表面可包含微結構，且底部表面可為平面)。

實例性表面可包括(但不限於)生物微機電表面(bioMEM)表面、微孔、載玻片、培養皿、細胞培養板、毛細管、管道、吸管尖及管。表面可係固體、液體及/或半固體。非結垢組合物可納入細胞培養皿、微流體通道、微流體晶片、過濾器、毛細管、管、珠粒、奈米粒子或諸如此類。表面可具有任何幾何結構(例如，表面可為平坦、傾斜、鋸齒狀、具有拓撲學)。

表面可包含微流體表面。表面可包含微流體通道。表面可係載玻片之表面、孔板或任何其他腔之內表面。

該表面可由固體材料製備。實例性表面材料可包括矽、玻璃、 羥基化聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、氧化鋁、塑膠、金屬、氧化鈦(TiO₂)、Au、Ag、Pt及諸如此類。

表面可包含通道。通道可包括經構形以捕獲所關注粒子(例如，細胞)之表面。通道可在經構形以自全血樣品捕獲所關注粒子之微流體裝置內形成。捕獲可由所關注粒子(例如，細胞)與通道表面上之結合部分的相互作用來調介。舉例而言，通道可包括經結合部分包覆之微結構。微結構可經配置以在通道內自全血樣品分離所關注粒子。此一通道可用於自患者之血液樣品捕獲所關注粒子，且可用於癌症生物研究及臨床癌症管控二者，包括癌症之檢測、診斷及監測。

通道可包含三個尺寸。通道之橫截面可定義為通道體積之兩個尺寸(例如，高度及寬度)。在一些實施例中，通道之寬度可約等於或大於10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、150μm、200μm、250μm或300μm。在一些實施例中，通道之高度可約等於或大於20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、120μm、140μm、160μm、180μm、200μm、250μm或300μm。第三尺寸可稱為通道之長度。

微流體通道可包含微結構。舉例而言，微結構可以2.5cm×7.5cm之總尺寸蝕刻至表面中。可在基板周圍留出2mm之邊緣用於黏合至底部表面以產生封閉室。舉例而言，經雕刻之矩形微結構可具有250μm之寬度至1000μm之長度以及可變高度(例如，50μm、80μm及100μm)。微結構可以鋸齒形或交錯圖案配置，其中第1排至第5排之特徵數為2、3、2及1且其間之間距為250μm。毗鄰特徵可間隔200μm。此交錯圖案可在通道之整個長度內重複，且該等特徵之更多列中之1至4者可在通道腔之整個長度內平行運行。微結構之高度、寬度或長度可為至少5微米、10微米、25微米、50微米、75微米、100微 米、250微米、500微米或更大。微結構之高度、寬度或長度可為至多100微米、500微米、250微米、100微米、75微米、50微米、25微米或10微米或更小。微結構之間之間距可為至少10微米、25微米、50微米、75微米、100微米、250微米、500微米或750微米或更大。微結構之間之間距可為至多1000微米、750微米、500微米、250微米、100微米、75微米、50微米或25微米或更小。

微結構可定向於人字形圖案中。人字形圖案可藉由形成其中每一微結構毗鄰另一微結構定位之人字形行來產生。列中之所有微結構可面向同一方向。在一些實施例中，每一微結構之間之距離為50微米。微結構可以任何距離彼此定位。行可包括任何數量之微結構。舉例而言，行可包含至少約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個微結構。行可包含至多約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個或更多個微結構。人字形圖案可進一步包括自入口至出口連續形成之多個微結構行。在一些實施例中，兩個毗鄰微結構行可以100微米分開。換言之，第二行之第一微結構可遠離第一行之最後一個微結構100微米定位。此圖案可自通道之入口至出口重複。

表面(例如微流體通道之表面)可產生一定體積或係體積之一部分。本文之表面可產生樣品所流經之一定體積。該體積可為至少約1微升、10微升、20微升、30微升、40微升、50微升、60微升、70微升、80微升、90微升、100微升、200微升或更大。另一選擇或另外，表面之體積可為至多約1微升、10微升、20微升、30微升、40微升、50微升、60微升、70微升、80微升、90微升、100微升、200微升或更大。

樣品內之所關注粒子與表面之黏附可沿每一微結構之平表面增加，此乃因在平表面之中心中形成滯留區，由此提供增加滯留時間及 /或增加與結合表面之化學相互作用之效率的滯留流動條件。在一些實施例中，表面可係通道內微結構之外表面或實質上垂直於生物樣品在微流體通道內之液流方向之表面的一部分。微結構可跨過微流體通道完全或部分延伸。

微流體裝置可包括提供入口與出口之間之流體連通之液流通道。該通道可包括至少一個經構形以結合所關注粒子(例如，利用結合部分功能化)之表面。表面可在通道內經構形以捕獲樣品中之所關注粒子之一或多個微結構上形成。通道可以與其他組份之組合形式納入以提供用於自樣品分離所關注分析物或粒子(例如，細胞)之系統。具有結合部分之通道或區域之體積可端視所用樣品之體積來選擇。通道之體積可大於樣品之大小。

一或多個表面(例如，微流體通道之表面)可經構形以引導液流及/或流體內之所關注粒子通過微流體通道。舉例而言，通道之表面可為粗糙或光滑的。通道可包括粗糙表面。通道可包含具有可與所關注之期望分析物或粒子(例如，細胞)比較之大小之週期性振幅及/或頻率。在一些情況下，通道可由與微流體通道內之一或多個微結構之基底相對定位之具有波形或「鋸齒」形表面之壁來界定。鋸齒形表面可具有約1-100微米之高度及頻率。鋸齒形表面可與一或多個僅部分延伸跨過表面之微結構直接相對定位。可選擇通道尺寸以提供所關注粒子與微流體通道之表面結合之期望速率。

可選擇液流(例如，用於樣品流、緩衝液淨化等)之速率及壓力以提供與表面結合之期望速率。亦可選擇液流速度以提供結合至表面之所關注粒子之期望剪切應力。可操縱至少兩個變量以控制施加至通道之剪切應力：室之橫截面積及施加至室之流體壓力。可操縱其他要素以控制容許所關注期望粒子結合及防止不期望粒子(例如，通道中所用之結合部分及該結合部分之密度)結合所需之剪切應力的量。產生 適宜剪切力之幫浦與微流體通道之組合可產生單向剪切應力(即，可實質上不逆轉流之方向及/或存在實質上恆定之剪切應力)。可在樣品經過通道之時間期間維持單向或實質上恆定之剪切應力。

表面(例如，微流體通道)可經構形以最大化所關注粒子與通道內一或多個表面之結合，同時允許液流以期望速率通過通道。增加微結構之表面積可增加所關注粒子結合之面積，同時增加對經由通道自入口流至出口之樣品液流之抗性。

如本文所提及之微流體裝置可有效地分離所關注粒子(例如，稀有細胞、CTC、幹細胞等)。稀有細胞之釋放及回收可係分離稀有細胞之重要要素。舉例而言，當使用梯度溶析方法時，可能會破壞細胞膜，降解表面標記物且改變CTC之表型及功能資訊，此可限制細胞之下游分析。舉例而言，當使用流動誘導之細胞剝離時，斷裂抗體細胞表面抗原鍵之所需剪切應力(例如，50達因/cm²至200達因/cm²)可改變基因表現且可能導致細胞死亡。

功能化表面

表面(例如，微流體通道)可經非結垢組合物包覆。非結垢組合物可係防止結垢(例如，防止結合非特異性粒子(例如血清蛋白)，同時保留結合所關注粒子之能力)之組合物。非結垢組合物可用作潤滑表面，使得僅低流動剪切應力或低流速可用於本發明方法中。對於非結垢組合物，可能僅需要低流動剪切應力自非結垢層移除非特異性細胞或不期望組份。在一些情況下，非結垢行為可能與非結垢表面之表面水合、撓性及流動性相關。非結垢組合物可包含結合部分及/或連接體，如本文進一步所述。

非結垢組合物可包含脂質層或脂質偶聯物。脂質層可包含脂質單層、脂質雙層、經支撐之脂質雙層(SLB)或脂質多層、脂質體、多肽、聚電解質多層(PEM)、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、水凝膠聚合 物、細胞外基質蛋白、碳水化合物、聚合物刷、兩性離子材料、聚(羧基甜菜鹼)(pCB)、聚(磺基甜菜鹼)(pSB)、pDMAEMA及小有機化合物或其任一組合。可用於非結垢中之實例性脂質可包括(但不限於)1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物素基)(鈉鹽)(b-PE)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、二醯基甘油、磷脂、糖脂、固醇、磷脂醯膽鹼(PtdCho)、磷脂醯乙醇胺(PtdEtn)、磷脂醯肌醇(PtdIns)、磷脂醯絲胺酸(PtdSer)及磷酸神經鞘酯。

脂質層可具有橫向移動性。脂質層可為生物惰性的。脂質層可有效地抵抗非特異性蛋白質吸附及細胞黏附(例如，歸因於橫向移動性及生物惰性)。橫向移動性可容許脂質及蛋白質重組其在表面上之分佈。橫向移動性可容許蛋白質之組裝並增加靶細胞(所關注粒子)之結合親和力及特異性。

脂質分子在液體-固體界面上之移動性可使其能夠彼此連續交換位置。由於脂質分子之移動性，故一旦所關注粒子接近抗體修飾之脂質層，下伏流體脂質層即可容許抗體分子向所關注粒子遷移(例如，因活性招募或擴散所致)。因此，所關注粒子可更牢固地黏附在表面上。相反，當抗體功能化脂質集中於所關注粒子下方時，遠離靶細胞之非功能化脂質之濃度可增加，從而產生針對非特異性結合之較大抗性。藉由蛋白質及血球之減少的非特異性結合可減少在有限的結合空間中由非特異性結合事件產生之立體阻礙。

非結垢組合物可藉由產生較小力來幫助移除非特異性粒子。自非結垢組合物移除非特異性粒子所需之剪切應力可遠小於習用抗體包覆之表面之剪切應力，且可遠低於細胞在諸如在人類血管中觀察到之生理狀態下通常所經歷之剪切應力(例如，約15達因/cm²)。

在一些實施例中，非結垢組合物可係經支撐之脂質雙層(SLB)。SLB可包含脂質，例如1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(帽生物 素基)(鈉鹽)(b-PE)及1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)。SLB可具有蛋白質抗性。舉例而言，SLB可因在寬pH範圍內存在中性及兩性離子磷脂醯膽鹼頭基而具有蛋白質抗性。舉例而言，SLB可因親水脂質頭基與本體溶液之間形成水性薄膜而具有蛋白質抗性。

非結垢組合物可包含聚乙二醇(PEG)。PEG可包含至少約50道爾頓、100道爾頓、200道爾頓、500道爾頓、700道爾頓、1000道爾頓、5000道爾頓、10000道爾頓、15000道爾頓、50000道爾頓、75000道爾頓、100000道爾頓、150000道爾頓、200000道爾頓或250000道爾頓或更大之分子量。PEG可包含至多約50道爾頓、100道爾頓、200道爾頓、500道爾頓、700道爾頓、1000道爾頓、5000道爾頓、10000道爾頓、15000道爾頓、50000道爾頓、75000道爾頓、100000道爾頓、150000道爾頓、200000道爾頓或250000道爾頓或更大之分子量。PEG可包含100道爾頓至100,000道爾頓之分子量。

非結垢組合物可包含聚電解質多層(PEM)。PEM可指包含電解質之聚合物。實例性PEM可包括(但不限於)聚-L-離胺酸/聚-L-麩胺酸(PLL/PLGA)、聚-L-離胺酸/聚-L-天冬胺酸、聚(苯乙烯磺酸鈉)(PSS)、聚丙烯酸(PAA)、聚(乙基丙烯酸)(PEA)或其任一組合。

非結垢組合物可包含聚合物刷。聚合物刷可指可在一端附接至表面之聚合物。實例性聚合物刷可包括([2-(丙烯醯基氧基)乙基]三甲基氯化銨，TMA)/(丙烯酸2-羧基乙基酯，CAA)共聚物。

非結垢組合物可包含脂質、PEG、聚電解質多層或聚合物刷或其任一組合。

非結垢組合物可包含厚度。非結垢組合物之厚度可為至少約0.5奈米、1奈米、10奈米、25奈米、50奈米、75奈米、100奈米、200奈米、300奈米、400奈米、500奈米、600奈米、700奈米、800奈米、 900奈米、1000奈米、2000奈米、5000奈米、10000奈米、25000奈米、50000奈米、100000奈米、200000奈米、300000奈米、500000奈米、750000奈米、1000000奈米或更大。非結垢組合物之厚度可為至多約0.5奈米、1奈米、10奈米、25奈米、50奈米、75奈米、100奈米、200奈米、300奈米、400奈米、500奈米、600奈米、700奈米、800奈米、900奈米、1000奈米、2000奈米、5000奈米、10000奈米、25000奈米、50000奈米、100000奈米、200000奈米、300000奈米、500000奈米、750000奈米、1000000奈米或更大。

非結垢組合物可包含官能基。官能基可能夠直接共價及/或非共價附接至存在於結合部分中之官能基，或直接共價及/或非共價附接至為連接組合物之一部分之官能基。實例性官能基可包括(但不限於)羥基、胺基、羧酸基或酯基、硫酯基、醛基、環氧基或環氧乙烷基、聯胺基及硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體及正負電荷。官能基可附接至非結垢組合物之脂質。官能基可經選擇以與存在於連接體或結合部分中之官能基具有反應性。官能基可經選擇以結合至存在於連接體或結合部分中之結合對之第二成員。在一些實施例中，非結垢組合物可係固有地產生排斥非特異性血液組份之潤滑層且幫助結合部分移動以形成細胞捕獲平臺之經支撐之脂質雙層(SLB)。

非結垢組合物可共價附接至表面。非結垢組合物可非共價附接至表面。非結垢組合物可藉由以下各項與表面相互作用：氫鍵結、靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補DNA結合、磁力、凡得瓦(van der waals)相互作用、離子型相互作用及諸如此類。

非結垢組合物可結合所關注粒子，同時減少其他非特異性粒子之結合。非結垢組合物可結合小於1%、5%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%或50%或更大的非特異性粒子。

表面可包含結垢組合物。結垢組合物可包含引起所關注之非特異性粒子聚集及/或沈澱之組合物。

表面可為功能化表面。表面可使用例如以下各項來功能化：染料、有機光受體、抗原、抗體、聚合物、聚-D-離胺酸、尤其選自HfO₂、TiO₂、Ta₂O₅、ZrO₂及其混合物之氧化物、有機化合物及功能化奈米層。表面可使用非特異性結合部分(例如細胞外基質)及薄膜包覆來功能化。表面可藉由例如軟微影、UV照射及噴墨印刷來功能化。

在一些實施例中，非結垢組合物可包含矽烷官能化PEG，且表面可選自由以下組成之群：矽、玻璃、羥基化聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、氧化鋁、TiO₂及諸如此類。在一些實施例中，非結垢組合物可包含硫醇官能化化合物，且表面可選自由Au、Ag、Pt及諸如此類組成之群。

結合部分

表面可經經選擇以結合所關注粒子之結合部分包覆。結合部分可偶聯至表面。結合部分可偶聯至非結垢組合物(例如，非結垢組合物中之脂質)。

結合部分可包含可特異性結合所關注粒子之部分。舉例而言，結合部分可選擇性地結合至一或多種細胞，例如與以下疾病相關之上皮或贅瘤性細胞：急性淋巴母細胞性白血病、急性或慢性淋巴球性或粒細胞性腫瘤、急性類骨髓性白血病、急性前骨髓性白血病、腺癌、腺瘤、腎上腺癌、基底細胞癌、骨癌、腦癌、乳癌、支氣管癌、子宮頸發育不良、慢性骨髓性白血病、結腸癌、表皮樣癌、尤恩氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、膽囊癌、膽石腫瘤、巨細胞瘤、多形性神經膠母細胞瘤、毛樣細胞瘤、頭癌、增生、增生性角膜神經腫瘤、原位癌、 腸神經節瘤、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎癌、喉癌、平滑肌腫瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性類癌、惡性高鈣血症、惡性黑色素瘤、馬凡樣體型腫瘤(marfanoid habitus tumor)、髓質癌、轉移皮膚癌、黏膜神經瘤、漸進壞死性蕈狀肉芽腫、骨髓發育不良症候群、骨髓瘤、頸癌、神經組織癌、神經胚細胞瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰臟癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、真性多血症、原發性腦瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細胞瘤、皮膚癌、小細胞肺腫瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、甲狀腺癌、局部皮膚病灶、網狀細胞肉瘤或威廉氏腫瘤(Wilm's tumor)。實例性結合部分可包括肽、多肽、合成聚合物、分子印跡聚合物、細胞外基質蛋白、結合受體、抗體、DNA、RNA、抗原、適配體或對生物物質呈現高親和力之任何其他表面標記物。

結合部分可經由例如分子識別、化學親和力及/或幾何形狀識別結合至所關注粒子。

結合部分可包含抗體。抗體可包含針對各種上皮標記物、表面黏附分子及生長因子受體之抗體。抗體可係抗EpCAM膜蛋白抗體。抗EpCAM膜蛋白抗體可係EpAb4-1抗體，其包含表1中所顯示之具有SEQ ID No：1之重鏈序列及具有SEQ ID NO：2之輕鏈序列。在一些情況下，抗體可係抗EGFR、抗MUC-1、抗C-MET、抗HER-2、抗EphB4、抗CEA或抗ErbB2。如本文所用抗體可結合特異性細胞標記物或細胞表面抗原。標記物可包含EpCAM、EGFR、MUC-1、C-MET、HER-2、EphB4、CEA或ErbB2。在一些情況下，兩種或更多種不同類型之抗體可偶聯至表面及/或非結垢組合物。舉例而言，表面可經抗EpCAM及抗HER2二者包覆。

表1. EpAb4-1抗體之VH及VL結構域之胺基酸序列. 顯示VH及VL

結合部分可包含官能基。官能基可用於將結合部分附接至非結垢組合物及/或表面。官能基可用於共價或非共價附接結合部分。實例性官能基可包括(但不限於)：羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環氧基或環氧乙烷基、聯胺基、硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、DNA、RNA、配體、受體、抗原-抗體及正負電荷。

在一些實施例中，官能基包含生物素及鏈黴抗生物素蛋白或其衍生物。在一些實施例中，官能基包含1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基磺基琥珀醯亞胺(磺基-NHS)。在一些實施例中，官能基包含環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)酯(磺基-SMCC)。

在一些實施例中，微流體表面包含包括非共價結合至表面之脂質之非結垢組合物，且非結垢組合物藉由連接體附接至結合部分。

在一些實施例中，針對上皮細胞黏附分子之抗體(抗EpCAM，即 純系EpAb4-1)層可偶聯至SLB以選擇性地結合所關注粒子，諸如CTC。SLB之橫向流動性可使得蛋白質叢生且增強針對所關注粒子(例如，CTC)之結合親和力及特異性。另外，SLB中脂質分子之兩性離子性質可最小化非特異性蛋白質及/或細胞吸附，由此減少末梢血液對表面之結垢。

連接體

連接體可連結非結垢組合物與結合部分。連接體可將結合部分連結至表面。連接體可將非結垢組合物連結至表面。連接體可共價及/或非共價連結非結垢組合物與結合部分。兩種組合物之間之連接可藉由相互作用來形成，包含靜電相互作用、親水-親水相互作用、極性-極性相互作用、互補DNA結合、磁力或其組合。

實例性連接體可包括(但不限於)：金屬、塑膠、玻璃、矽晶圓、羥基化聚(3甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、羥基、胺基、羧酸或酯基、硫酯基、醛基、環氧基或環氧乙烷基、聯胺基硫醇基、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、DNA、RNA、配體、受體、抗原、抗體及正負電荷或其任一組合。舉例而言，連接體可包括矽烷、胺基丙基三乙氧基矽烷、胺基丙基三甲氧基矽烷、矽烷-PEG-NH2、矽烷-PEG-N3(PEG分子量為約1,000道爾頓至約30,000道爾頓)及矽烷-PEG生物素。在一些實施例中，可使用互補DNA片段來結合非結垢組合物與結合部分。該等片段附接至每一組合物且可在其長度範圍內部分或完全互補。DNA之適宜長度通常將為至少15個鹼基、20個鹼基、25個鹼基、35個鹼基、50個鹼基、100個鹼基或更多個鹼基長度。用於本發明中之DNA之實例係DNA鑷子。

連接體可包含可裂解連接體。實例性可裂解連接體可包括(但不限於)：可藉由紫外照射裂解之光敏官能基、可藉由電脈衝機制裂解之電敏官能基、可因不存在磁力裂解之鐵或磁性材料、可藉由斷裂靜 電相互作用裂解之聚電解質材料、可藉由雜交裂解之DNA、熱可解離基團及諸如此類。舉例而言，在釋放之前，可將照射、加熱、磁力、電力及諸如此類施加至含有可裂解連接體之表面。隨後，可溶析(例如，使用空氣泡沫之剪切)所關注粒子。

所關注粒子、樣品及個體

本發明提供捕獲所關注粒子。所關注粒子可係細胞。細胞可指真核細胞。真核細胞可源自大鼠、母牛、豬、狗、貓、小鼠、人類、靈長類動物、天竺鼠或倉鼠(例如，CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK細胞)。細胞可係來自組織之細胞、雜交瘤細胞、酵母細胞、病毒(例如，流行性感冒病毒、冠狀病毒)及/或昆蟲細胞。細胞可係源自轉基因動物或所培養組織之細胞。細胞可係原核細胞。原核細胞可係細菌、真菌、後生動物或古菌。細胞可指複數個細胞或本文所提及之任何細胞。

所關注粒子可指細胞之一部分。舉例而言，細胞可指細胞器(例如，高爾基複合物(golgi complex)、內質網、核)、細胞碎片(例如，細胞壁、肽聚糖層)及/或細胞之內容物(例如，核酸內容物、細胞質內容物)。

所關注粒子可係稀有細胞。實例性細胞可包括(但不限於)：稀有癌細胞、循環腫瘤細胞、循環腫瘤微栓子、血球、內皮細胞、源自內胚層之細胞、源自外胚層之細胞及源自中胚層之細胞或其任一組合。

所關注粒子可係樣品之一部分。樣品可包含複數個粒子，其中之僅一些係所關注粒子。粒子可指細胞、核酸、蛋白質、細胞結構、組織、器官、細胞分解產物及諸如此類。粒子可係結垢粒子。粒子可不與非結垢組合物結合。樣品可包含至少約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%或更多所關注粒子。樣品可包含至多約 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%或更多所關注粒子。

樣品可自個體獲得。個體可為人類。個體可為非人類。個體可為例如哺乳動物(例如，狗、貓、母牛、馬、靈長類動物、小鼠、大鼠、綿羊)。個體可為脊椎動物或無脊椎動物。個體可患有癌症疾病。個體可患有稀有細胞疾病。個體可患有稀有細胞疾病或癌症，且不顯示該疾病之症狀。個體可不知其患有癌症或稀有細胞疾病。

樣品可包含體液。實例性體液可包括(但不限於)血液、血清、血漿、鼻拭子或鼻咽洗液、唾液、尿液、胃液、脊髓液、眼淚、糞便、黏液、汗液、耳垢、油、腺體分泌物、大腦脊髓液、組織、精液、陰道液、間隙液(包括源自腫瘤組織之間隙液)、眼液、脊髓液、咽喉拭子、呼吸、毛髮、指甲、皮膚、生檢、胎盤流體、羊水、臍帶血、淋巴液、腔液、痰、膿、微生物相、胎糞、母乳及/或其他排泄物。

泡沫組合物

表面上之非結垢層可向本文之裝置提供其他優點。舉例而言，非結垢層可容許溫和地釋放所捕獲之粒子(例如細胞)，而實質上不影響其活力。特定而言，本發明涵蓋使用溫和液體溶液或泡沫組合物(例如空氣形成組合物)釋放捕獲於本文所述表面上之細胞。

泡沫組合物可經由表面張力釋放所捕獲之粒子。舉例而言，當氣泡(例如，在泡沫組合物內)接觸所捕獲粒子時，在粒子表面上可形成空氣-液體界面，此產生垂直於表面之淨力且上拉所捕獲之粒子，從而使其釋放。對於捕獲於非結垢組合物(例如，脂質層)上之所關注粒子，除表面張力外之力可替代表面張力或與其一起幫助釋放所關注粒子。舉例而言，幫助釋放所關注粒子之力可係疏水-親水、疏水-疏水及/或親水-親水相互作用。舉例而言，對於脂質層，與氣泡接觸可將脂質層之疏水頭拉入氣泡之空氣相中，同時將脂質層之親水尾拉入 液相中，且所捕獲粒子可與沿氣泡拉取之脂質層一起釋放。除表面張力外或作為其替代之力可具有較小量或不同品質，使得所釋放細胞之活力較高。

本發明泡沫組合物可包含液體及空氣。液體及空氣可組合形成氣泡，由此製備泡沫。泡沫組合物可係具有空氣囊袋之液體。泡沫組合物可係具有空氣囊袋之液體之連續流。舉例而言，泡沫組合物可包含由液體圍繞之氣泡。泡沫組合物可係氣泡之連續序列。在一些情況下，泡沫組合物可不指後隨液體之氣泡。本發明泡沫組合物之實例性實施例繪示於圖2中。在一些實施例中，如201中所繪示，泡沫組合物可在表面內部，該表面可係通道205。泡沫組合物可包含可與氣泡215間雜排列之連續液體界面210。泡沫組合物可不同於如202中所繪示之空氣-液體界面。空氣-液體界面226可在空氣230之區段被表面(例如通道220)中之液體225阻擋時出現(例如，其中液體完全佔據空氣區段之間之體積)。在一些情況下，空氣-液體界面226之空氣230在流經表面220時可能無法壓縮且可捕集於表面220中(例如，當體積沿通道減小時或在通道內存在阻塞時)。在一些情況下，201之泡沫組合物之空氣215具有無法捕集於表面205中之大小。在一些情況下，201之泡沫組合物之氣泡215的直徑小於表面(例如，微流體通道205)之橫截面尺寸。在一些情況下，空氣-液體界面226之氣泡230之直徑的大小可能約等於表面之橫截面尺寸(例如，通道之橫截面尺寸)。

泡沫組合物之空氣可包含任何氣體。舉例而言，空氣可指氧、氮、二氧化碳、氫、氬及氦。空氣可係加壓空氣。

泡沫組合物之液體可為等滲的。泡沫組合物之液體可不為等滲的。泡沫組合物之液體可包含蛋白質。泡沫組合物之液體可包含任何含有蛋白質之等滲液體。泡沫組合物之液體可係與細胞培養物(例如，細胞培養基、達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、洛斯維公園紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)培養基(RPMI)、MEM、CMRL、布氏BMOC-3(Brinster’s BMOC-3)、格拉斯哥(Glasgow)、萊氏L-15(Leibovitz’s L-15))相容之液體。液體可包含牛血清白蛋白(BSA)。蛋白質之非限制性實例可包括胎牛血清(FBS)、小牛血清(NCS)、胺基酸(例如，L-麩醯胺酸)、白蛋白、運鐵蛋白、纖連蛋白、抑肽酶、酪蛋白、及胎球蛋白或其任一組合。在一些情況下，蛋白質及/或血清可包覆泡沫組合物氣泡之表面。在一些情況下，蛋白質及/或血清可抵消表面張力之效應且藉由防止空氣向外擴散(例如，藉由包覆氣泡之表面)來穩定氣泡。舉例而言，液體可係補充有10% FBS之DMEM及補充有10% FBS之RPMI。舉例而言，液體可係FBS(例如，5%)於PBS中之溶液。

液體可包含濃度為至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%或40%濃度之蛋白質。液體可包含濃度為至多1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%或40%濃度之蛋白質。液體可包含5%濃度之蛋白質。液體可包含於磷酸鹽緩衝鹽水中之5%濃度之BSA。

液體可包含蛋白質及緩衝液。實例性緩衝液可包括磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、硫酸銨、二羥乙甘胺酸、咪唑緩衝液、hepes、mops、mes、檸檬酸鉀、甲酸鉀、tris、磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉。在一些情況下，液體包含磷酸鹽緩衝鹽水。

用於液體中之蛋白質可係疏水蛋白質。可升高液體之溫度以幫助疏水蛋白質溶解於液體溶液中。液體之溫度可升高至4℃、25℃或37℃或更高。

液體可包含兩親性聚合物。兩親性聚合物可指具有疏水及親水區域二者之生物分子(例如，胺基酸聚合物)。兩親性分子之疏水及親水區域可參與靜電、極性-極性及極性-非極性相互作用。當兩親性聚 合物與空氣一起攪動時，聚合物可於水相中之膠束樣結構中重定向。兩親性聚合物之重定向可指重定向兩親性聚合物使得大部分聚合物面向同一方向(例如，疏水區域面向膠束之內部核心，且親水區域面向水溶液)。舉例而言，膠束樣結構可包含包括氣泡之內部核心及包括兩親性聚合物之外部核心。實例性兩親性分子可包括(但不限於)磷脂、膽固醇、糖脂、脂肪酸、膽汁酸、皂素、表面活性劑、洗滌劑、聚乙二醇、甘油及兩性離子。

液體可包含碳水化合物(例如，澱粉)。實例性碳水化合物可包括單糖、二糖、多糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、纖維素、甘油醛、核酸、DNA、RNA、乳糖及半乳糖。

液體可包含乳液。乳液可指兩種不可混溶液體之混合物。實例性乳液可包括油包水乳液、水包油乳液、水包水乳液、微乳液及奈米乳液。乳液可包含乳化劑。實例性乳化劑可包括洗滌劑(例如，Tween-20、Triton-X)、表面活性劑(例如，SDS)及卵磷脂。在一些實施例中，泡沫組合物之液體可包含蛋白質、碳水化合物、乳液或聚合物之任何組合。

液體可具有黏性。液體之黏度可比水之黏度大至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。液體之黏度可比水之黏度大至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。液體之黏度可比水之黏小至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。液體之黏度可比水之黏度小至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。液體之黏度可使泡沫組合物維持至少1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘或60分鐘。

在一些實施例中，泡沫組合物包含平衡泡沫之強度與弱點之分子。舉例而言，泡沫組合物可能夠延展至足以移動通過表面，使得泡 沫氣泡之形狀可能暫時變形(例如微流體通道，例如包含微結構)，但強至足以攜載所釋放之細胞，使得泡沫氣泡不會提前爆裂。

欲用於產生本發明泡沫組合物之液體之體積可為至少1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。欲用於產生本發明泡沫組合物之液體之體積可為至多1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。在一些情況下，欲用於產生本發明泡沫組合物之液體之體積係4毫升。在一些情況下，泡沫組合物之液體包含4毫升於PBS中之5% BSA。

欲用於產生本發明泡沫組合物之空氣之體積可為至少1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。欲用於產生本發明泡沫組合物之空氣之體積可為至多約1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。在一些情況下，欲用於產生本發明泡沫組合物之空氣之體積係2毫升。

液體及空氣可以不同量組合。舉例而言，液體對空氣之比率可為至少0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、3：1、4：1或5：1或更大。液體對空氣之比率可為至多0.5：1、1：1、1.5：1、2：1、3：1、4：1或5：1或更大。在一些情況下，液體對空氣之比率為2：1。液體之量可為空氣量之至少50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%或400%或更大。液體之量可為空氣量之至多50%、75%、100%、125%、150%、175%、200%、225%、250%、275%、300%、325%、350%、375%或400%或更大。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA及2mL空氣之混合物。

泡沫組合物可包含氣泡。泡沫組合物之氣泡之直徑可為至少1微 米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、170微米、180微米、190微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米或900微米或更大。泡沫組合物之氣泡之直徑可為至多1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、110微米、120微米、130微米、140微米、150微米、160微米、170微米、180微米、190微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米或900微米或更大。在一些情況下，泡沫組合物之氣泡包含20微米至500微米之直徑。在一些情況下，泡沫組合物之氣泡包含60微米之直徑。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，且包含約10微米至100微米之氣泡。

泡沫組合物之氣泡可具有小於微流體通道之橫截面尺寸之大小。泡沫組合物之氣泡可具有大於非結垢組合物高度之大小。

包含1微米至200微米直徑之氣泡之百分比可為至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。包含1微米至100微米直徑之氣泡之百分比可為至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。包含1微米至200微米直徑之氣泡之百分比可為至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。包含1微米至100微米直徑之氣泡之百分比可為至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。包含10微米至100微米直徑之氣泡之百分比可為至少50%、60%、70%、80%、90%或100%。包含10微米至100微米直徑之氣泡之百分比可為至多50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，及/或泡沫組合物之至少50%之氣泡具 有約10微米至100微米之直徑。

泡沫組合物之體積可為將流經泡沫組合物之表面(例如，通道)之體積的至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍或更大。泡沫組合物之體積可為將流經泡沫組合物之表面(例如，通道)之體積的至少50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%或1000%或更大。泡沫組合物之體積對將流經泡沫組合物之表面(例如，通道)之體積的比率可為至少1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1或10：1或更大。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑，及/或泡沫組合物之體積係將流經泡沫組合物之表面(例如，通道)之體積的至少5倍。

為液體之泡沫組合物之體積可發生變化。舉例而言，泡沫組合物之體積可包含至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之液體。泡沫組合物之體積可包含至多30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之液體。

泡沫組合物之體積可包含不同量之液體及空氣。舉例而言，泡沫組合物之體積中液體可為空氣之至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍。泡沫組合物之體積中液體可為空氣之至多2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍。泡沫組合物之體積中空氣可為液體之至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍。泡沫組合物之體積中空氣可為液體之至多2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍或更多倍。

泡沫組合物之體積可為至少0.5毫升、1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。泡沫組合物之體積可為至多0.5毫升、1毫升、2毫升、3毫升、4毫升、5毫 升、6毫升、7毫升、8毫升、9毫升或10毫升或更大。在一些情況下，泡沫體積為2毫升。在一些情況下，欲用於本發明方法中之泡沫體積為1.5毫升。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑，及/或泡沫組合物之體積為至少1.5毫升。

泡沫組合物之體積(例如，量)可實質上等於泡沫將流經之通道之體積。泡沫組合物之體積可係泡沫將流經之通道體積的至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍或70倍或更大。泡沫組合物之體積可係泡沫將流經之通道體積的至多5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍或70倍或更大。在一些情況下，泡沫組合物之體積係泡沫將流經之通道體積的35倍。在一些情況下，欲流動之泡沫組合物之體積係1.5毫升，且通道之體積係55微升。

泡沫組合物在製成泡沫後可於本發明方法中使用至少1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘或40分鐘或更長。泡沫組合物在製成泡沫後可於本發明方法使用至多1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘或40分鐘或更長。泡沫組合物在製成泡沫後可使用15分鐘。在一些情況下，氣泡之大小可隨時間聚結、斷裂或減小，由此降低泡沫組合物之有效性。在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑，泡沫組合物之體積為至少1.5毫升，及/或泡沫組合物之活性可持續15分鐘。

泡沫組合物可重複使用。泡沫組合物可重複使用至少1次、2次、3次、4次或5次。泡沫組合物可重複使用至多1次、2次、3次、4次或5次。泡沫組合物可不重複使用。泡沫組合物可新近製備用於每 一應用。

本發明泡沫組合物之緻密性可比用於製備泡沫組合物之液體小。泡沫組合物之緻密性可比用於製備泡沫組合物之液體小10%、20%、30%、40%或50%或更大。泡沫組合物可包含與液體不同之材料相。舉例而言，泡沫組合物可包含氣相(例如，氣泡)。泡沫組合物之氣體可係用於製備泡沫組合物之液體的50%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%、600%、650%、700%、750%、800%、850%、900%、950%或更大。

泡沫組合物可具有黏性。泡沫組合物之黏度可比水之黏度大至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。泡沫組合物之黏度可比水之黏度大至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。泡沫組合物之黏度可比水之黏度小至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。泡沫組合物之黏度可比水之黏度小至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。

製備泡沫組合物之方法

本發明泡沫組合物可使用例如本文所述方法中之任一或者多者來製備。在一些情況下，泡沫係在小於0℃、4℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃下製備。本發明泡沫組合物可在大於0℃、4℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃下製備。泡沬組合物可在0-4℃、0-18℃、0-37℃、4℃-18℃、4℃-18℃、15℃-25℃、18℃-22℃、18℃-25℃、18℃-37℃之溫度下製備。在一些情況下，本發明泡沬組合物係在18℃-22℃之溫度下製備。

在一些情況下，泡沫組合物包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL 空氣之混合物，泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑，泡沫組合物之體積為至少1.5毫升，及/或泡沫組合物係在18℃-22℃之溫度下製備。

渦旋

本發明提供用於製備本發明泡沫組合物之方法。用於製備泡沫組合物之方法可包含組合本發明液體與空氣及混合樣品。

混合可藉由例如渦旋、攪動、搖動、攪拌、磁力攪拌及振盪來實施。混合(例如，渦旋)可實施至少5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒或60秒或更長。混合(例如，渦旋)可實施至多5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒或60秒或更長。

在一些情況下，製備泡沫組合物之方法可包含將包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物渦旋30秒，其中泡沫組合物係在18℃-22℃之溫度下製備。

注射器

本發明泡沫組合物可經由中間閥在容器之間轉移本發明液體與空氣來製備。實例性容器可包括(但不限於)注射器、管、瓶、玻璃及桶。在一些情況下，容器係注射器。

將液體及空氣自一個容器(例如，注射器)轉移至另一容器(例如，注射器)可包含經由中間閥中之孔洞轉移液體及空氣。孔洞可用於產生泡沫組合物之氣泡。孔洞之直徑可為至少0.01毫米、0.05毫米、0.1毫米、0.5毫米、1毫米或更大。孔洞之直徑可為至多0.01毫米、0.1毫米、0.5毫米、1毫米、1.5毫米、2毫米或更大。孔洞可為0.2毫米。孔洞可具有產生直徑介於1微米與200微米之間之氣泡的大小。在一些情況下，製備泡沫組合物之方法可包含經由包含0.2毫米直徑之孔洞轉移4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物，且其 中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑。

在一些情況下，孔洞之開口越小，轉移期間之剪切壓力越大，由此產生較小氣泡。在一些情況下，孔洞之開口越小，經歷轉移可能需要之外部壓力越大。在一些情況下，孔洞越大，氣泡大小之變化越大。

容器之間之轉移可實施至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次或更多次。容器之間之轉移可實施至多1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次或更多次。

容器之間之轉移可實施至少1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒或10秒或更長。容器之間之轉移可實施至多1秒、2秒、3秒、4秒、5秒、6秒、7秒、8秒、9秒或10秒或更長。在一些情況下，製備泡沫組合物之方法可包含經由包含2毫米直徑之孔洞將4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物轉移至少10次，且其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑。

在一些情況下，用於轉移液體及空氣之容器係注射器。注射器可具有相同大小。注射器可具有不同大小。注射器可能夠容納至少1毫升、5毫升、10毫升、20毫升、25毫升或50毫升或更多。注射器可能夠容納至多1毫升、5毫升、10毫升、20毫升、25毫升或50毫升或更多。注射器可包含聯結埠。聯結埠可包含luer鎖。聯結埠可包含防滑尖。

注射器可藉由閥聯結至另一注射器。閥可係三通閥。閥可聯結至注射器之luer鎖。

第一注射器可包含液體及空氣二者。在一些情況下，第一及第二注射器二者皆包含液體及空氣。在一些情況下，第一注射器包含液 體且第二注射器包含空氣。

在一些情況下，第一注射器包含液體及空氣二者，且第二注射器為空。可藉由壓下第一注射器之活塞將第一注射器之內容物轉移至第二注射器。可藉由拉取第二注射器之活塞將第一注射器之內容物轉移至第二注射器，由此吸入第一注射器之液體。

轉移可在適於產生本發明泡沫組合物之壓力下實施。舉例而言，壓力可係成年人拇指推注射器之筒及/或活塞之壓力。用於轉移之壓力可係至少0.1兆帕(MPa)、0.2兆帕、0.3兆帕、0.4兆帕、0.5兆帕、1兆帕、1.5兆帕、2兆帕、2.5兆帕、3兆帕、3.5兆帕、4兆帕、4.5兆帕、5兆帕、5.5兆帕、6兆帕、6.5兆帕、7兆帕、7.5兆帕、8兆帕、8.5兆帕、9兆帕、9.5兆帕或10兆帕或更大。用於轉移之壓力可係至多0.1兆帕(MPa)、0.2兆帕、0.3兆帕、0.4兆帕、0.5兆帕、1兆帕、1.5兆帕、2兆帕、2.5兆帕、3兆帕、3.5兆帕、4兆帕、4.5兆帕、5兆帕、5.5兆帕、6兆帕、6.5兆帕、7兆帕、7.5兆帕、8兆帕、8.5兆帕、9兆帕、9.5兆帕或10兆帕或更大。

膜

本發明泡沫組合物可使用膜來製備。可將包含本發明液體及空氣之樣品抽取通過膜。實例性膜可包括(但不限於)空氣石、細孔膜、橡膠散氣膜、空氣盤及空氣管。液體及空氣可藉由注射器抽取通過膜。

膜可包含孔。孔之直徑可為至少1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米或100微米或更大。孔之直徑可為至多1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米或100微米或更大。孔可具有產生包含1微米至200微米直徑之氣泡之大小。孔可具有產生包含10微米至100微米直徑之氣泡之大小。在一些 情況下，製備泡沫組合物之方法可包含將包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之混合物抽取通過包含直徑為至少5微米之孔之膜，且其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑。

用於拉取液體及空氣混合物通過膜之壓力可為至少0.1kg/cm²、0.2kg/cm²、0.3kg/cm²、0.4kg/cm²、0.5kg/cm²、0.6kg/cm²、0.7kg/cm²、0.8kg/cm²、0.9kg/cm²或1kg/cm²或更大。用於拉取液體及空氣混合物通過膜之壓力可為至多0.1kg/cm²、0.2kg/cm²、0.3kg/cm²、0.4kg/cm²、0.5kg/cm²、0.6kg/cm²、0.7kg/cm²、0.8kg/cm²、0.9kg/cm²或1kg/cm²或更大。

泵送

在一些情況下，泡沫組合物可藉由泵送機制來產生。泵送機制可僅實施一次以產生本發明之泡沫。該方法可包括泵送液體溶液，其中在泵送期間使溶液與空氣混合。液體及空氣之混合溶液可經由噴嘴泵送。噴嘴可包含至多0.001毫米、0.005毫米、0.01毫米、0.05毫米、0.1毫米、0.5毫米或1毫米或更大之直徑。

毛細管微流體

在一些情況下，泡沫組合物可藉由毛細管微流體裝置來產生。圖3圖解說明根據實施例之毛細管微流體裝置。舉例而言，圓形玻璃毛細管301可經加熱及拉取以形成一端孔口中之錐形幾何結構。可使空氣流通過錐形孔口流入液體303(例如，培養基)之罐中以形成氣泡305及泡沫組合物。氣泡之體積可藉由調節空氣流之流速來控制。舉例而言，當空氣流之流速較低時，可產生單分散空氣降。舉例而言，當空氣流之流速超出某一臨限值時，可形成空氣噴流且可在下游形成空氣降。

方法

本發明提供用於捕獲及釋放所關注粒子(例如，循環腫瘤細胞、循環稀有細胞(CRC)、循環幹細胞(例如腫瘤幹細胞及骨髓幹細胞)、胎兒細胞、細菌、病毒、上皮細胞、內皮細胞或諸如此類)之方法。所關注粒子可捕獲於表面上。該表面可包覆於非結垢組合物中。非結垢組合物可包含特異性結合至所關注粒子之結合部分。

捕獲

為捕獲所關注粒子，可使包含所關注粒子之樣品流經表面。在包覆有非結垢層之表面上樣品之流速可包含至少0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。流速可包含至多0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。流速可包含0.5mm/s至4mm/s之線速度。流速可包含2.5mm/s至4mm/s之線速度。流速可係其中至少50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子結合至結合部分之速率。流速可係其中至多50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子結合至結合部分之速率。流速可係不會損壞所關注粒子之速率。

表面可自樣品捕獲至少50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子。表面可自樣品捕獲至多50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子。表面可捕獲至少5個、10個、25個、50個、100個、200個、300個、400個、500個、1000個、1500個、2000個或2500個所關注粒子/毫升樣品。表面可捕獲至多5個、10個、25個、50個、100個、200個、300個、400個、500個、1000個、1500個、2000個或 2500個所關注粒子/毫升樣品。總之，本文之微流體裝置及表面可具有針對所關注粒子(例如，稀有細胞、CTC等)至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之捕獲效率。所關注細胞之捕獲效率可藉由定義為(經確認捕獲的稀有細胞數)/(流經裝置或毗鄰表面之實際稀有細胞數)×100%來定義。

藉由洗滌純化

可藉由移除樣品之所關注非特異性粒子及/或其他組份來進一步純化表面。所關注粒子可藉由移除非結垢組合物之表面上之非特異性粒子(例如，細胞)及其他不期望組份來純化。非結垢組合物可具有針對非特異性粒子及其他不期望組份較低之親和力。舉例而言，用約0.8達因/cm²至約50達因/cm²之低流動緩衝溶液沖洗脂質偶聯物可足以移除非結垢組合上之非特異性粒子及其他不期望組份。

純化可藉由使洗滌緩衝液流經表面來實施。洗滌緩衝液之流速可包含至少0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。洗滌緩衝液之流速可包含至多0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。洗滌緩衝液之流速可包含0.5mm/s至4mm/s之線速度。洗滌緩衝液之流速可包含2.5mm/s至4mm/s之線速度。洗滌緩衝液之流速可係其中至少50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子保持與結合部分之結合之速率。洗滌緩衝液之流速可係其中至多50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子保持與結合部分結合之速率。洗滌緩衝液之流速可係不會損壞所關 注粒子之速率。損壞可指所關注粒子之形態變化、所關注粒子降解、所關注粒子之活力變化、所關注粒子溶解及/或所關注粒子之基因表現(例如，代謝)變化。

洗滌緩衝液之流動(即，沖洗)可移除至少40、50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注非特異性粒子。洗滌緩衝液之流動(即，沖洗)可移除至多40、50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注非特異性粒子。洗滌緩衝液之流動可自表面之非結垢組合物吸取至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或15%或更多所關注粒子。洗滌緩衝液之流動可自表面之非結垢組合物吸取至多1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或15%或更多所關注粒子。

釋放

本發明方法提供用於收集所關注粒子之釋放方法，其中所釋放之所關注粒子具有活力。所關注粒子之釋放可藉由使本發明泡沫組合物流經表面(例如，包含非結垢層、連接體及/或結合部分之表面)來實施。所關注粒子之釋放可經由溫和掃除力來實施。如本文所用之溫和掃除力可指氣泡之剪切、空氣泡沫之剪切、乳化流體之剪切、超音波振動或油相。在一些情況下，可使包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之泡沫組合物(其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑)以0.5-4mm/s之流速流經表面以釋放所關注粒子。

泡沫組合物之流速可包含至少0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。泡沫組合物之流速可包含至多0.1mm/s、0.2mm/s、0.3mm/s、0.4 mm/s、0.5mm/s、1mm/s、1.5mm/s、2mm/s、2.5mm/s、3mm/s、3.5mm/s、4mm/s、4.5mm/s、5mm/s、5.5mm/s、6mm/s、6.5mm/s、7mm/s、8mm/s、9mm/s、10mm/s或更大之線速度。泡沫組合物之流速可包含0.5mm/s至4mm/s之線速度。泡沫組合物之流速可包含2.5mm/s至4mm/s之線速度。泡沫組合物之流速可係其中至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%之所關注粒子保持與結合部分結合之速率。洗滌緩衝液之流速可係其中至多1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%之所關注粒子保持與結合部分結合之速率。泡沫組合物之流速可係不會損壞所關注粒子之速率。損壞可指所關注粒子之形態變化、所關注粒子降解、所關注粒子之活力變化、所關注粒子溶解及/或所關注粒子之基因表現(例如，代謝)變化。可使泡沫組合物流經表面達約或大於1分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、8分鐘、10分鐘、12分鐘、14分鐘、16分鐘、18分鐘、20分鐘、25分鐘或30分鐘。

泡沫組合物(例如，泡沫組合物之氣泡)可自表面移除非結垢組合物及/或結合部分。泡沫組合物可自表面移除至少50%、60%、70%、80%、90%或100%之非結垢組合物及/或結合部分。泡沫組合物可自表面移除至多50%、60%、70%、80%、90%或100%之非結垢組合物及/或結合部分。在一些情況下，泡沫組合物移除至少70%之非結垢組合物及/或結合部分。在一些情況下，使包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之泡沫組合物(其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑)以0.5-4mm/s之流速流經表面可自表面移除所關注非結垢組合物、結合部分、連接體及/或粒子中的至少50%。

可在收集裝置中收集由本發明泡沫組合物釋放之所關注粒子。在一些實施例中，收集裝置可用作濃縮所關注粒子之濃縮裝置。在一 些實施例中，收集裝置可包含膜。在一些實施例中，膜可包含直徑為約或小於0.5μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm或5μm之孔。基於膜孔大小，可在收集裝置內之區域(例如，膜)中收集所關注粒子。舉例而言，可基於大小分離在膜上收集大小大於膜之孔大小的所關注粒子。例如對於孔大小為2μm之膜，可在膜上收集所有細胞，包括癌細胞及WBC。可在收集裝置之與所關注粒子側相對之側(例如，膜)上提供負壓。負壓可確保非特異性粒子或氣泡(例如，泡沫)經過膜上之孔而不產生膜堵塞或意外的碎片。負壓之量應不會影響細胞之活力。在一些實施例中，可在大約或大於10mm²、20mm²、30mm²、40mm²、50mm²、60mm²、70mm²、80mm²、90mm²、100mm²、120mm²、140mm²、160mm²、180mm²、200mm²或更大之區域中收集細胞。收集後，可將膜移除並安裝於顯微鏡載玻片上。收集後，可使膜成像(例如，在顯微鏡下螢光成像)。藉由將所關注粒子收集至收集裝置之較小區域(例如，膜)，可有效地評估本文方法及系統之性能。藉由將所關注粒子收集至收集裝置之較小區域(例如，膜)，可限制離焦影像。

由本發明泡沫組合物釋放之所關注粒子可具有活力。由本發明泡沫組合物釋放之所關注粒子可不具活力。由泡沫組合物釋放之至少50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子可具有活力。由泡沫組合物釋放之至多50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子可具有活力。活力可藉由形態之變化(例如、溶解)、基因表現之變化(例如、半胱天冬酶活性)、基因活性之變化(某些細胞路徑之停止)及細胞功能之變化(例如、缺乏運動性)來確定。在一些情況下、所釋放細胞可用於下游過程、例如ELISA、免疫分析、培養及核酸測序。若所釋放細胞無法在下游分析中充分地起作用，則細胞可稱為不具活力的。在一些情況下，可使包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL 空氣之泡沫組合物(其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑)以0.5-4mm/s之流速流經表面(例如，包含非結垢組合物及結合部分)以釋放所關注粒子來釋放結合至表面之細胞，其中至少50%之所釋放細胞為活細胞。

所釋放之所關注粒子的至少50%、60%、70%、80%、90%或100%可不含所關注非特異性粒子。所釋放之所關注粒子的至多50%、60%、70%、80%、90%或100%可不含所關注非特異性粒子。所關注非特異性粒子可係不為所關注粒子之任何細胞粒子。舉例而言，所關注非特異性粒子可包括白血球、紅血球、血清蛋白、血清核酸及循環上皮細胞。所關注非特異性粒子可指無法特異性結合至用於本發明微流體晶片中之結合部分之粒子。換言之，所關注非特異性粒子可指不會表現特異性針對結合部分之抗原/受體之細胞。在一些情況下，使包含4毫升於PBS中之5% BSA、2mL空氣之泡沫組合物(其中泡沫組合物之至少50%之氣泡具有約10微米至100微米之直徑)以0.5-4mm/s之流速流經表面可自表面移除至少50%之非結垢組合物，及/或釋放至少50%的不含所關注非特異性粒子之所關注粒子。

在一些情況下，細胞群可自表面(例如微流體通道之表面，例如非結垢組合物之表面)釋放。細胞群可包含至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、100個、1000個、10000個、100000個或1000000個或更多個細胞。細胞群可包含至多1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、100個、1000個、10000個、100000個或1000000個或更多個細胞。細胞群可以至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之效率自表面釋放。細胞群可以至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之效率自表面釋放。換言之，細胞群中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99% 或100%之細胞可由本發明泡沫組合物釋放。細胞群中至多50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之細胞可由本發明泡沫組合物釋放。

細胞群之細胞可為活細胞。細胞群中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之細胞可為活細胞。細胞群中至多50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%之細胞可為活細胞。

細胞群可包含複數個所關注粒子。細胞群可包含至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子。細胞群可包含至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之所關注粒子。細胞群可包含複數個非所關注粒子。細胞群可包含至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之非所關注粒子。細胞群可包含至多20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之非所關注粒子。

本發明泡沫組合物之氣泡可藉由與非結垢組合物相互作用來移除非結垢組合物。氣泡之空氣-液體相互作用可具有疏水性。其可與非結垢組合物之疏水性部分相互作用。當非結垢組合物之疏水性部分包含脂質雙層之疏水尾時，氣泡可與脂質雙層之疏水尾相互作用且破壞該雙層，由此自表面移去非結垢組合物。

在一些情況下，當氣泡與脂質雙層相互作用時、其可產生固體-液體-空氣接觸線(例如、空氣、液體與細胞之間之接觸)。細胞上之氣泡接觸角及氣泡之液體-空氣界面之表面張力的組合可係將細胞拉離表面之驅動力。若氣泡之空氣-液體界面針對細胞之張力過強，則其可損壞細胞。若表面張力過弱，則可能無法自表面移除細胞。表面張力可由泡沫組合物之組份來控制。

泡沫組合物與表面(例如，細胞)之相互作用可重組表面及/或非 結垢組合物(例如，分子變化)。舉例而言，在與泡沫組合物之氣泡相互作用後，包含包括脂質雙層之非結垢組合物之表面可被破壞成單層及/或個別脂質分子。

經分離細胞(例如循環腫瘤細胞CTC)實質上可為純淨的。如本文所用術語「實質上純淨之CTC群」可指其中至少約40%、50%、60%、70%、80%或90%之細胞為CTC之細胞群。在一些實施例中，實質上純淨之CTC群可含有不大於約30%、不大於約25%、不大於約20%、不大於約15%、不大於約10%、不大於約5%、不大於約4%、不大於約3%、不大於約2%、不大於約1%、不大於約0.5%之非CTC。在一些實施例中，實質上純淨之CTC群中至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之細胞可為CTC。

在一些實施例中，脂質層可係抗EpCAM-SLB，且脂質層可納入具有經設計以增強混沌混合之蝕刻圖案之微流體晶片中。藉由控制液流參數，可捕獲諸如CTC等靶細胞。隨後可增加緩衝液之流速，使得移除任何非特異性吸附之血球，而不置換任一結合的CTC。經純化CTC可自裝置經由破壞SLB組裝(而非細胞膜或蛋白質結合位點)藉由溫和地掃除空氣泡沫來溶析。CTC可溫和地釋放以保持活力並適於下游分子分析或培養。

組合物

本發明組合物可包含所釋放之所關注粒子(例如，所釋放之稀有細胞)。所釋放之所關注粒子可指藉由本發明方法(例如，使泡沫及氣泡流經包含非結垢層之表面)釋放之細胞。在一些情況下，在釋放步驟期間，非結垢組合物、結合部分、連接體及所關注粒子或其任一組合係一起釋放。在一些情況下，在釋放步驟期間，非結垢組合物與所關注粒子係一起釋放。

本發明組合物可包含所釋放之細胞、非結垢層及來自泡沫組合物之氣泡。氣泡可包含所釋放之細胞及非結垢層。換言之，氣泡可部分地包裹非結垢層之脂質。

細胞培養

可使所釋放細胞經歷細胞培養。如本文所用之細胞培養可意指細胞之生長、維持、轉染或繁殖。細胞培養可在培養基中進行。如本文所用之培養基可意指用於提供營養素(例如，維生素、胺基酸、必需營養素、鹽及諸如此類)及性質(例如，相似性、緩衝)以維持活細胞(或組織中之活細胞)且支持其生長之液體溶液。

細胞保存

可使所釋放或培養之細胞經歷細胞保存。細胞之高活力儲存可在臨床醫學及生物醫藥研發中至關重要。低溫保存通常可用於細胞之可靠長期穩定。經分離細胞可儲存在低溫保存下以供長期儲存。

分析

所收集細胞可藉由任何方式來檢測及計數，例如光學(例如，目視檢驗)、自動化計數、基於顯微術之檢測、FACS及電檢測(例如，Coulter計數器)。對使用本發明方法分離之細胞或其他所關注粒子計數可用於診斷疾病、監測疾病之進展及監測或確定治療之效能。對所關注粒子(例如，細胞)計數可用於非醫學應用中。舉例而言，對所關注粒子計數可用於確定環境樣品(例如，水、空氣及土壤)、醫藥、食品或化妝品中污染物之量、存在或類型。

可量測藉由本發明方法收集之所關注細胞及/或粒子或其部分之一或多種性質。可量測之生物性質之實例可包括mRNA表現、蛋白質表現及DNA量化。可對藉由本發明方法分離之所關注粒子進行測序。測序可用於確定某些序列特徵(例如，多型性及染色體異常)。

可採用溶解來分析所關注粒子(例如，細胞)。溶解可在所關注粒 子結合至非結垢組合物的同時進行。可在非特異性保留之粒子存在下分析所關注粒子。

可自由非結垢組合物之結合部分捕獲之所關注粒子(例如，細胞)獲得遺傳資訊。該遺傳資訊可包括具體基因組DNA、cDNA或mRNA序列之鑑別或計數；細胞表面標記物之鑑別或計數；及蛋白質或其他細胞內含量之鑑別或計數，此指示具體腫瘤之類型或存在。可分析細胞以確定起源組織、疾病之時期或嚴重程度或對具體治療之敏感性。

可分析藉由本發明方法收集之所關注粒子之指示癌症幹細胞之標記物的存在。該等標記物之實例可包括C-MET、EpCAM、MUC-1、EGFR、CD133、CD44、CD24、上皮特異性抗原(ESA)、Nanog、BMI1、DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CK8、CK18、CK19、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、廣譜CK、TCN、SULT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC、IL-23、CD45及諸如此類。

可使用識別細胞群內之特定細胞類型之抗體(例如單株抗體)來實施細胞染色。抗體可經螢光化合物直接標記或使用例如經螢光標記之識別第一抗體之第二抗體間接標記。可使用抗體組以多標記物成像方式分析細胞群。舉例而言，不同抗體可經不同色彩標記且隨後在流式細胞儀中成像及/或分析。在一些情況下，多標記物成像方式可增加CTC檢測之靈敏度且幫助鑑別表現具體治療靶之CTC亞群。抗體組可包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、12種、15種、20種或更多種不同類型之抗體。舉例而言，抗體組可包含對應於標記物廣譜CK、CK18、CK7、TTF-1、CK20、CDX2、PSA及PSMA之抗體。舉例而言，抗體組可包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。

使用抗體組對細胞群染色可涉及多個操縱性步驟。舉例而言，1)可自群製備一系列樣品；2)可使來自組之一種抗體與每一樣品組合，並可培育所得混合物以使得抗體可結合至樣品中抗體識別之細胞；3)可實施細胞之一或多次洗滌以移除任何未結合之抗體。在一些情況下，若第一抗體尚未經螢光化合物直接標記，則可能需要使用其他抗體或試劑之額外培育及額外洗滌來標記結合至細胞之未偶聯之一級抗體。

細胞染色後可進行流式細胞術分析以確定相對於群中總細胞數之經染色細胞數。可使用市售設備(例如由諸如Coulter Electronics,Hialeah,Fla.及Becton-Dickinson,Mountain View,Calif.等公司製造之設備)來實施分析之細胞分選及計數步驟。

臨床應用

CTC之表徵可提供頗具價值之資訊用於治療患者且有助於個別化治療策略。舉例而言，可使用可檢測CTC之數量及/或數量之變化來預測患者結果及對療法之反應。舉例而言，可使用CTC來鑑別腫瘤細胞中影響療法決策之遺傳改變。在一些情況下，檢測、量化或評估患者血流內CTC之分子特徵之能力可容許遺傳操縱細胞特徵及/或在CTC去往轉移位點期間改變細胞行為且因此改變患者結果。例如經由基因組、表觀基因組、轉錄組及/或蛋白質體方法之CTC之其他分析可幫助臨床醫師實時理解腫瘤生物學。在一些情況下，可使用CTC來研究癌細胞對治療壓力之反應，及發現癌症之新穎生物標記物及藥物靶。

本文所述之系統及方法可用於評價有利或不利的存活，且可有助於防止可在預後有利時產生有害副效應之不必要療法。因此，本發明可用於眾多種癌症中之任一者之預後，該等癌症包括(但不限於)實體腫瘤及白血病，包括所強調的癌症：胺前體攝取與脫羧細胞瘤(apudoma)、迷芽瘤、鰓瘤、惡性類癌症候群、類癌心臟病、癌(即沃 克癌(Walker carcinoma)、基底細胞癌、嗜鹼性鱗狀癌、布朗-皮西二氏上皮癌(Brown-Pearce carcinoma)、導管癌、艾利希氏腫瘤(Ehrlich tumor)、Krebs 2癌、莫克爾氏細胞癌(merkel cell carcinoma)、黏液癌、非小細胞肺癌、燕麥細胞癌、乳頭狀癌、硬癌、支氣管癌、支氣管原癌、鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、組織細胞病症、白血病(即B細胞白血病、混合細胞白血病、裸細胞白血病、T細胞白血病、T細胞慢性白血病、HTLV-II相關之白血病、淋巴球性急性白血病、淋巴球性慢性白血病、肥大細胞白血病及類骨髓性白血病)、惡性組織球血症、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、免疫增殖性小腸疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、漿細胞瘤、網狀內皮增殖病、黑色素瘤、軟骨胚細胞瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、巨細胞瘤、組織細胞瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、間皮瘤、黏液瘤、黏液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤恩氏肉瘤、滑膜瘤、腺纖維瘤、腺淋巴瘤、癌肉瘤、脊索瘤、顱咽管瘤、惡性胚胎瘤、缺陷瘤、間葉瘤、中腎瘤、肌肉瘤、成釉細胞瘤、惡質瘤、齒瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋養細胞瘤、腺癌、腺瘤、膽管瘤、膽硬脂瘤、圓柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、粒狀細胞瘤、半陰陽胚細胞瘤、肝癌、汗腺瘤、胰島細胞瘤、萊迪希細胞瘤(leydig cell tumor)、乳頭狀瘤、塞特利細胞瘤(sertoli cell tumor)、濾泡膜細胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、肌母細胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、室管膜瘤、神經節瘤、神經膠質瘤、髓母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、神經鞘瘤、神經胚細胞瘤、神經細胞瘤、神經纖維瘤、神經瘤、副神經節瘤、非嗜鉻性副神經節瘤、血管角化瘤、嗜酸性球增多性血管淋巴結樣增生癥、硬化性血管瘤、血管瘤病、脈絡球血管瘤、血管內皮瘤、血管瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴血管肉瘤、松果體瘤、癌肉瘤、軟骨肉瘤、葉狀囊性肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性肉瘤、脂肪肉 瘤、淋巴血管肉瘤、肌肉瘤、黏液肉瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤(即尤恩氏實驗肉瘤、卡波西氏肉瘤及肥大細胞)、贅瘤(即骨贅瘤、乳房贅瘤、消化系統贅瘤、結腸直腸贅瘤、肝贅瘤、胰臟贅瘤、垂體贅瘤、睪丸贅瘤、眶贅瘤、頭頸贅瘤、中樞神經系統贅瘤、聽神經贅瘤、骨盆贅瘤、呼吸道贅瘤及泌尿生殖贅瘤)、神經纖維瘤病及子宮頸發育不良。

使用本文所述之系統及方法之分析所需之血液的體積可大致等於或小於25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。使用本文所述之系統及方法之分析所需之血液的體積可等於或至多為25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。

用於鑑別CTC來源或癌症之起源組織之方法

在所關注粒子(例如，CTC)上存在某些標記物可指示CTC之來源或起源或癌症之起源組織。舉例而言，CK18可在單層上皮、導管上皮及假複層上皮中極大地表現，其係可用於癌之標記物。舉例而言，CK18可基於在乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌及胰臟癌中之表現用作癌檢測標記物。舉例而言，CK7之存在可用作源自乳房、肺或胰臟之CTC之代表。舉例而言，CK7可用作鑑別源自乳房、肺或胰臟癌之CTC之代表。舉例而言，TTF-1之存在可用作源自肺、甲狀腺或間腦之CTC之代表。舉例而言，TTF-1之存在可用作源自肺癌、甲狀腺癌或間腦症候群之CTC之代表。舉例而言，可使用與抗CDX-2混合 之抗CK20來檢測源自結腸之CTC。舉例而言，可使用與抗CDX-2混合之抗CK20來檢測源自結腸直腸癌之CTC。舉例而言，可使用與抗PSMA混合之抗PSA來檢測源自前列腺之CTC。舉例而言，可使用與抗PSMA混合之抗PSA來檢測源自前列腺癌之CTC。在一些情況下，組合CK20及CK8/18/19可顯著增加CTC檢測率。

用於CTC檢測之多標記物分析可用於臨床應用。舉例而言，可使用抗體組以多標記物成像方式來分析細胞群。抗體組可包含1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、12種、15種、20種或更多種不同類型之抗體。舉例而言，抗體組可包含對應於標記物廣譜CK、CK18、CK7、TTF-1、CK20、CDX2、PSA及PSMA之抗體。舉例而言，抗體組可包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。使用多標記物之CTC檢測分析不盡可應用於不同類型之癌症以建立臨床關聯，且亦可使CTC作為健康個體癌症篩選或早期癌症患者、甚至未知主要癌症來源之個體之早期檢測工具。

圖4提供根據實施例用於CTC檢測之決策樹。舉例而言，抗體組可包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。可使用抗廣譜CK及/或抗CK18來分析CTC作為第一步驟401(例如，鑑別癌細胞)。在第二步驟403中，可使用抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20及與抗PSMA混合之抗PSA來分析CTC。舉例而言，對CK7呈陽性之CTC可指示源自乳房、肺或胰臟之CTC。舉例而言，對CK7呈陽性之CTC可指示乳癌、肺癌或胰臟癌。舉例而言，對TTF-1呈陽性之CTC可指示源自肺、甲狀腺或間腦之CTC。舉例而言，對TTF-1呈陽性之CTC可指示肺癌、甲狀腺癌或間腦症候群。舉例而言，對與抗CDX-2混合之抗CK20呈陽性之CTC可指示源自結腸之CTC。舉例而言，對與抗CDX-2混合之 抗CK20呈陽性之CTC可指示結腸直腸癌。舉例而言，對與抗PSMA混合之抗PSA呈陽性之CTC可指示源自前列腺之CTC。舉例而言，對與抗PSMA混合之抗PSA呈陽性之CTC可指示前列腺癌。可預測患癌率或癌症之可能性。舉例而言，藉由使用抗體組，若存在對不同抗體呈陽性染色之細胞，則可預測細胞起源或癌症起源之可能性。舉例而言，預測率可計算為每一標記物之染色效率*癌症盛行率*100%。在一些實施例中，乳癌、結腸直腸癌、前列腺癌及/或肺癌之機率可經預測大致等於或大於1%、5%、15%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。

評價疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度之分子分析

本文所述之靶細胞可係循環腫瘤細胞CTC。本發明基於對CTC之分子分析提供用於評價患有癌症之患者之疾病進展(例如，癌症進展)的系統及方法。舉例而言，用於評價患者之癌症進展之方法可包含：1)根據本文所述之方法分離來自患者之循環腫瘤細胞(CTC)；及2)對CTC實施一或多種細胞或分子分析以確定患者之癌症進展。

在一些實施例中，癌症選自由以下組成之群：肺癌、食道癌、膀胱癌、胃癌、結腸癌、皮膚癌、乳頭狀甲狀腺癌、結腸直腸癌、乳癌、淋巴瘤、胰臟癌、前列腺癌、卵巢癌、盆腔癌及睪九癌。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析包含形態分析、基因組分析、表觀基因組分析、轉錄組分析、蛋白質體學分析或其任一組合。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析可包含確定CTC中之一或多個DNA突變。在某些實施例中，DNA突變可包含插入、缺失、取代、移位、基因擴增或其任一組合。在某些實施例中，DNA突變位於選自由以下組成之群之基因中：KRAS、APC、TP53、 BRAF、PTEN、EGFR、ERCC1、RRM1、ELM4、HER2及ALK。

在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析可包含確定癌症特異性基因在CTC中之蛋白質表現量。在一些實施例中，一或多種細胞或分子分析可包含確定癌症特異性基因在CTC中之RNA表現量。

在一些實施例中，癌症特異性基因係細胞角蛋白、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1(MUC-1)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α胎兒蛋白(AFP)、肝細胞癌(HCC)、N-鈣黏蛋白、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人類平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)、RRM1或癌胚胎抗原(CEA)。

在一些實施例中，用於評價患者之癌症進展之方法可進一步包含藉由染色檢測一或多種癌症特異性標記物在CTC中之表現，及計數經染色之細胞。可基於癌症特異性CTC之分子分析及計數之組合結果來確定患者中腫瘤之時期及/或預後。

可使用癌症特異性標記物。該等標記物可包括(1)在疾病中升高之標記物，例如在睪九癌及滋養細胞疾病中升高之人類絨毛膜促性腺激素(hCG)，及在肝細胞癌(HCC)中升高之α胎兒蛋白(AFP)，(2)在疾病中以定性方式改變之mRNA或蛋白質標記物，例如膀胱癌中之CD44之mRNA剪接變體以及肺癌及結腸直腸癌中之p53蛋白之突變，(3)通常在特定組織、器官或器官系統中表現、但在不適當身體隔室中出現之蛋白質標記物。實例包括前列腺特異性抗原(PSA)及癌胚胎抗原(CEA)。CEA濃度在許多經診斷患有結腸疾病(包括發炎性腸病及結腸腺癌)之患者之血液、血漿或血清中顯著升高，且用作結腸直腸疾病之指標。在一些情況下，標記物可包含DAPI、細胞角蛋白(例如，CK7、CK18、CK19、CK20等)、CD45、CDH17、CDX2、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、廣譜CK、TCN、SULT2B1、ALDOB、 COL11A1、PI3、CCL20、HER2及諸如此類。在一些情況下，癌症特異性標記物可係細胞角蛋白、CDX1、CDH17、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、黏蛋白-1(MUC-1)、人類表皮生長因子受體2(HER2)、絨毛膜促性腺激素(hCG)、α胎兒蛋白(AFP)、肝細胞癌(HCC)、N-鈣黏蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)、ERCC1、雄激素受體(AR)、人類平衡型核苷轉運蛋白1(hENT1)、RRM1或癌胚胎抗原(CEA)、CD44及p53、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、GD2、GM2、GM1、GD1a、GT1b、A2B5、Tf、Tn、Globo H、CD133、CD24、CD44、CD90、ER或PR。

在一些情況下，特定癌症可表現特定標記物。舉例而言，可藉由用抗CK7、抗HER2、抗ER及抗PR對稀有細胞(例如，CTC)染色並分析結果來評價乳房疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。在一些情況下，可藉由用一或多種選自由抗CK7、抗HER2、抗ER及抗PR組成之群之抗體對稀有細胞(例如，CTC)染色並分析結果來評價乳房疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。在一些情況下，可使用所有四種抗體對稀有細胞染色。舉例而言，可藉由用DAPI、抗CK20及抗CD45對稀有細胞(例如，CTC)染色、分析結果來評價結腸疾病、GI疾病及/或卵巢疾病/子宮內膜疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。舉例而言，可藉由用抗PSA及抗PSMA對稀有細胞(例如，CTC)染色並分析結果來評價乳房或前列腺疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。舉例而言，可藉由用抗CK7、抗TTF1及抗EGFR對稀有細胞(例如，CTC)染色並分析結果來評價肺疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。在一些情況下，可藉由用一或多種選自由抗CK7、抗TTF1及抗EGFR組成之群之抗體對稀有細胞(例如，CTC)染色並分析結果來評價肺疾病之存在、不存在、進展及/或嚴重程度。在一些情況下，可使用所有三種抗體對稀有細胞染色。

在一些實施例中，患者之癌症存在、癌症進展或腫瘤生長可能與CTC負荷(例如，CTC計數、CTC量等)相關。例如在個體內，當腫瘤體積大於預定量時，CTC負荷與腫瘤生長可能相關。腫瘤體積之預定量可大致為或大於10mm³、20mm³、30mm³、40mm³、50mm³、60mm³、70mm³、80mm³、90mm³、100mm³、200mm³、300mm³、400mm³、500mm³。

在一些實施例中，可基於在樣品中所發現CTC數量之CTC截止值來預測癌症存在或進展。如本文所用之癌症存在或進展可包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症、轉移、微轉移、息肉及諸如此類。用於檢測癌症存在或進展所需之血液之體積可大致等於或小於25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。用於檢測癌症存在或進展所需之血液之體積可等於或至多為25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中之CTC截止值可為約或大於1個CTC、2個CTC、3個CTC、4個CTC、5個CTC、6個CTC、7個CTC、8個CTC、9個CTC、10個CTC、15個CTC、20個CTC、25個CTC、30個CTC、40個CTC、50個CTC、60個CTC、80個CTC、100個CTC、120個CTC、140個CTC、160個CTC、180個CTC、200個CTC、250個CTC或300個CTC。舉例而言，在2mL末梢血液樣品中檢測到3個或更多個CTC可預測具有如圖22中所顯示之臨床上可接受之特異性及敏感性的結腸直腸(CRC)癌。舉例而言，在至多6mL血液樣品中檢測到3個或更多個 CTC可預測具有臨床上可接受之特異性及敏感性之癌症。在一些實施例中，癌症進展可藉由不同時期來界定。舉例而言，該等時期可包含正常/增生性息肉、腺瘤/發育不良息肉、0/1期、2期、3期或4期。可基於具有臨床上可接受之敏感性及特異性之特定CTC截止值來預測癌症進展之每一不同時期。在一些情況下，可在成像診斷之前評價或確定疾病之存在。舉例而言，使用本文所提及之方法及系統，癌症之診斷或預後可出現在藉由成像技術無法檢測或無法確定之時期。癌症之診斷可基於具有臨床上可接受之敏感性及特異性之特定CTC截止值來預測。敏感性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。特異性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。敏感性及特異性可由接受者操作特徵(ROC)曲線下面積來界定。ROC曲線下面積可為約或大於0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。癌症之陽性檢測率(對應於不同時期)可為約或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一些實施例中，癌症可係腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌、卵巢癌及前列腺癌。

在一些實施例中，可基於CTC截止值或在樣品中檢測到之CTC來預測血行性擴散轉移。用於檢測樣品中之CTC所需之血液的體積可大致等於或小於25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。用於檢測樣品中之CTC所需之血液的體積可等於或至多為25μL、50μL、75μL、100μL、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5 mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中之CTC截止值可為約或大於1個CTC、2個CTC、3個CTC、4個CTC、5個CTC、6個CTC、7個CTC、8個CTC、9個CTC、10個CTC、15個CTC、20個CTC、25個CTC、30個CTC、40個CTC、50個CTC、60個CTC、80個CTC、100個CTC、120個CTC、140個CTC、160個CTC、180個CTC、200個CTC、250個CTC或300個CTC。舉例而言，在5mL末梢血液樣品中檢測到6個或更多個CTC可預測具有臨床上可接受之特異性及敏感性之血行性擴散轉移(例如，肝轉移)。舉例而言，患有壺腹周圍惡性腫瘤之患者之門靜脈血液的高CTC計數可係手術後1年內之肝轉移之重要預測因子。敏感性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。特異性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。敏感性及特異性可由接受者操作特徵(ROC)曲線下面積來界定。ROC曲線下面積可為約或大於0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。血行性擴散轉移之陽性檢測率可為約或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

在一些實施例中，良性疾病可基於CTC截止值或在樣品中檢測到之CTC來預測。用於檢測樣品中之CTC所需之血液的體積可大致等於或小於25μL、50μL、75μL、100μL、、0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL、5.5mL、6mL、6.5mL、7mL、7.5mL或8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL或16mL。樣品中之CTC截止值可為約或大於1個CTC、2個CTC、3個CTC、4個CTC、5個CTC、6個CTC、7個CTC、8個CTC、9個CTC、10個CTC、15個CTC、20個CTC、25個CTC、30個CTC、40個CTC、50個CTC、60個CTC、80個CTC、100個 CTC、120個CTC、140個CTC、160個CTC、180個CTC、200個CTC、250個CTC或300個CTC。舉例而言，在2mL末梢血液樣品中檢測到3個或更多個CTC可預測具有臨床上可接受之特異性及敏感性之良性結腸疾病。舉例而言，在2mL末梢血液樣品中檢測到3個或更多個CTC可預測具有臨床上可接受之特異性及敏感性之息肉。敏感性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。特異性可為約或大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。敏感性及特異性可由接受者操作特徵(ROC)曲線下面積來界定。ROC曲線下面積可為約或大於0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。良性疾病之陽性檢測率可為約或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。

CTC檢測可能受臨床病況影響。舉例而言，CTC檢測可能在患有腸阻塞、先前息肉切除之患者、患有失血、血塞及/或穿孔之患者中升高或降低。可將多種因素考慮在內以增加本文所提及疾病或轉移之特異性、敏感性及/或陽性檢測率。該等因素可包括(但不限於)年齡、性別、腫瘤位置、CEA升高、腸阻塞藉由腫瘤、腫瘤大小、大體類型(例如，息肉狀、潰瘍性、浸潤性)、T歸類、N類別、組織學分化(高、中等)及諸如此類。基於疾病(例如，癌症)之存在、不存在、進展及/或嚴重程度，可選擇藥物療法或方案。

用於評價疾病之存在、不存在及/或嚴重程度之方法

本發明可進一步提供用於評價個體中疾病之存在及/或嚴重程度之方法。舉例而言，用於評價個體中疾病之存在及/或嚴重程度之方法可包含：1)根據本文所述之方法自患者分離循環腫瘤細胞(CTC)；2)藉由染色檢測一或多種疾病特異性標記物在CTC中之表現；3)計數經染色之細胞；且其中經染色細胞數與對照相比之變化係疾病存在及/或嚴重程度之特徵；由此，評價疾病之存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，疾病之存在及/或嚴重程度可基於疾病特異性CTC之分子分析及計數之組合結果來確定。

在一些實施例中，疾病之存在及/或嚴重程度可基於一或多種皆經單獨加權之因素之組合來確定，以提供疾病之存在及/或嚴重程度之單一矩陣值。可將多種因素考慮在內以增加疾病之存在、不存在及/或嚴重程度之特異性、敏感性及/或陽性檢測率。若利用兩種或更多種因素來確定(例如，疾病之存在、不存在及/或嚴重程度)，則可加權並組合每一因素之量。因此，值可藉由以下各項來提供：(a)使用預定係數將每一因素之確定量加權，及(b)組合加權量以提供值。組合步驟可藉由正加或平均化(例如，同等加權)或藉由不同預定係數來實施。該等因素可包括：CTC之數量、CTC之分子特徵(某些突變之存在或不存在、基因表現、拷貝數變化等)、個體之年齡、個體之性別、疾病之遺傳、位置、家族史、先前病史、先前治療或其缺乏。可在提出存在之可能性及/或嚴重程度之最終展示/結果時對每一上述因素進行評價及加權。

關於一或多種因素、其權重或值(例如，經由組合步驟確定)之資訊可以電腦可讀形式儲存。最終展示/結果可通過電腦可讀媒體及/或電腦系統。此一電腦系統通常包含主要子系統，例如中央處理器、系統記憶體(通常RAM)、輸入/輸出(I/O)控制器、外部裝置(例如經由顯示配接器之顯示螢幕、串聯埠、鍵盤、經由儲存器接口之固定磁碟驅動器及經操作以接受軟磁碟之軟碟驅動器，及經操作以接受CD-ROM之CD-ROM(或DVD-ROM)裝置)。可聯結許多其他裝置，例如經由串聯埠聯結之網路介面。

電腦系統亦可連接至網路，包含複數個經由數據鏈連接之計算裝置，例如以太網電纜(同軸電纜或10BaseT)、電話線、ISDN線、無線網路、光學纖維或其他適宜信號傳輸介質，藉此至少一個網路裝置 (例如，電腦、磁碟陣列等)包含磁域(例如，磁碟)及/或電荷域(例如，DRAM單元陣列)之模式，其構成編碼自本發明分析獲取之數據的位元模式。

電腦系統可包含用於解釋評估疾病之存在、不存在及/或嚴重程度之研究的結果之代碼。因此，在實例性實施例中，將結果提供至中央處理器執行確定患有結腸直腸癌之患者之可能性的電腦程式之電腦。圖20圖解說明使用者、樣品、電腦與輸出之間之相互作用。舉例而言，使用者可係患者。樣品可係患者血液樣品。患者血液樣品可包含可使用本文所提及方法分析之稀有細胞(例如，CTC細胞)。該分析可進一步包含利用代碼來解釋研究之結果。研究結果之分析、代碼或解釋可傳送(例如，經由電腦至電腦終端、經由電腦終端上之數據、經由聯結至網際網路之數據機等)及/或輸出至接受方。

本發明亦提供例如上文所述電腦系統之用途，其包含：(1)電腦；(2)編碼藉由本發明方法獲得之測試結果之儲存位元模式，其可儲存在電腦中；(3)及視情況(4a)用於選擇針對患有疾病之患者之藥物療法之程式，或(4b)用於預測患有癌症之患者之陽性預後之可能性的程式。

在一些實施例中，疾病可係癌症。經染色細胞之數量增加可指示癌症或轉移。癌症之實例包括(但不限於)腦癌、肺癌、乳癌、口腔癌、食道癌、胃癌、肝癌、膽管癌、胰臟癌、結腸癌、腎癌、子宮頸癌症、卵巢癌症及前列腺癌。

在一些實施例中，疾病係癌前病症。癌前病症之實例包括日光性角化症、巴雷斯特食道症、萎縮性胃炎、先天性角化不良、缺鐵性吞嚥困難、扁平苔癬、口腔黏膜下纖維化、日光性彈力組織變性及子宮頸發育不良。

可藉助如本文所揭示之稀有細胞(例如，CTC細胞)來評價疾病之 存在(例如，癌症或贅瘤之診斷)及/或嚴重程度。在一些情況下，CTC細胞可用作疾病或疾病嚴重程度之標記物。在一些情況下，CTC細胞可在任何成像技術(例如，CT掃描、超音波、PET、MRI及諸如此類)能夠檢測疾病之存在之前用作疾病之標記物(例如，癌症或贅瘤)。舉例而言，血液樣品(例如，末梢血液樣品)之CTC計數可用作疾病存在及/或疾病嚴重程度之標記物(例如，藉由與截止值進行比較)。

用於檢測結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之方法

本發明可提供用於檢測人類患者之結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之方法。舉例而言，用於檢測人類患者之結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之方法可包含：1)自個體分離循環腫瘤細胞(CTC)；2)藉由染色檢測一或多種選自由以下組成之群之標記物在CTC中之表現：DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CEA、廣譜CK、TCN、SULT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC及IL-23a；3)計數經染色之細胞；且其中經染色細胞之數量及/或與對照相比之數量變化指示結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之存在及/或嚴重程度。舉例而言，用於檢測人類患者之結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之方法可包含：1)自個體分離循環腫瘤細胞(CTC)；2)藉由染色檢測一或多種包含以下各項之標記物在CTC中之表現：DAPI、CK20、CD45、CDH17、CDX2、CK7、CK8、CK18、CK19、TTF-1、CDX2、PSA、PSMA、CEA、廣譜CK、TCN、SULT2B1、ALDOB、COL11A1、PI3、CCL20、MTHFD11、IL-1b、SRPX2、SLC04A1、TESC及IL-23a；3)計數經染色之細胞；且其中經染色細胞之數量及/或與對照相比之數量變化指示結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，可基於經染色CTC之分子分析及計數之組合結果來確定患者中結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之存在及/或嚴重程度。 確定樣品中經染色細胞之數量且與對照進行比較，對照為例如來自已知患有癌症之個體或個體之群(陽性對照)的樣品或來自已知未患癌症之個體或個體之群(正常、無疾病或陰性對照)的樣品。

在一些實施例中，檢測可基於DAPI+/CK20+/CD45-在CTC中之表現來實施。舉例而言，假設對照為針對已知未患結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病之個體之群(正常、無疾病或陰性對照)建立之DAPI+/CK20+/CD45-表現之標準範圍，高於表現DAPI+/CK20+/CD45-之細胞之正常百分比可指示結腸直腸癌或胃腸(GI)道疾病的存在及/或嚴重程度。

在一些實施例中，人類患者可患有或懷疑患有結腸直腸癌。在一些實施例中，結腸直腸癌患者患有為0期、I期、II期、III期及/或IV期結腸直腸癌之結腸直腸癌。

在一些實施例中，人類患者患有或懷疑患有胃腸(GI)道疾病。在某些實施例中，胃腸道疾病係巴雷斯特食道症、胃潰瘍、胃炎、平滑肌瘤、息肉、克隆氏病、潰瘍性結腸炎、胰臟炎、腺癌、黏液腺癌、類癌腫瘤、鱗狀細胞癌、淋巴瘤及肉瘤。

用於監測治療方案之效能之方法

本發明可提供用於監測治療方案之效能之方法。例如，用於監測治療方案之效能之方法可包含：1)根據本文所述之方法自患者分離循環腫瘤細胞(CTC)；2)藉由染色檢測一或多種疾病特異性標記物在CTC中之表現；3)計數經染色之細胞；且其中基於經染色細胞之數量來確定治療方案之效能。

如本文所用之術語「樣品」可包括任何化學樣品或生物樣品。化學樣品可指任何化學混合物或化學化合物。生物樣品可包括(但不限於)細胞培養物或其提取物；自動物(例如哺乳動物)獲得之生檢材料或其提取物；及血液、唾液、尿液、糞便、精液、眼淚或其他體液或 其提取物。舉例而言，術語「生物樣品」可指自任何活生物體獲得、由其排泄或分泌之任何固體或流體樣品，該活生物體包括單細胞微生物(例如細菌及酵母)及多細胞生物體(例如植物及動物，例如脊椎動物或哺乳動物，且具體而言健康或受欲診斷或研究之病況或疾病侵襲之表觀上健康之人類個體或人類患者)。生物樣品可呈任何形式，包括固體材料，例如組織、細胞、細胞糰粒、細胞提取物、細胞均質物或細胞部分；或生檢或生物流體。生物流體可自任何位點獲得(例如血液、唾液(或含有頰黏膜細胞之漱口劑)、眼淚、血漿、血清、尿液、膽汁、腦脊髓液、羊水、腹膜液及胸膜液或來自其之細胞、眼房液或玻璃體或任何身體分泌物)、滲出液、滲出物(例如自膿瘍或任何其他感染或發炎位點獲得之流體)或自關節(例如正常關節或受諸如類風濕性關節炎、骨關節炎、痛風或膿毒性關節炎等疾病侵襲之關節)獲得之流體。生物樣品可自任何器官或組織獲得(包括生檢或剖檢樣本)或可包含細胞(不論原代細胞抑或經培養細胞)或由任何細胞、組織或器官條件化之培養基。生物樣品亦可包括組織之切片，例如出於組織學目的採集之冷凍切片。生物樣品亦包括藉由細胞或組織均質物之部分或完全分級分離產生之生物分子之混合物，包括蛋白質、脂質、碳水化合物及核酸。儘管該樣品較佳取自人類個體，但生物樣品可來自任何動物、植物、細菌、病毒、酵母等。如本文所用之動物可指處於任何發育時期之人類以及非人類動物，包括例如哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類、蟲類及單細胞動物。細胞培養物及活組織樣品可視為多種動物。在一些實施例中，非人類動物係哺乳動物(例如，齧齒類動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬)。動物可係轉基因動物或人類純系。若需要，可使生物樣品經受初步處理，包括初步分離技術。

如本文所用之術語「個體」可指哺乳動物。哺乳動物可係人 類、非人類靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或母牛，但不限於該等實例。除人類外之哺乳動物可有利地用作代表疾病、疾病前期或疾病前期病況之動物模型之個體。個體可為雄性或雌性。個體可為先前已經診斷或鑑別具有健康狀態(例如，疾病、疾病前期或疾病前期病況)、及視情況已經歷或正經歷針對健康狀態之治療性干預者。另一選擇為，個體亦可係先前尚未經診斷具有給定健康狀態者。舉例而言，個體可為展現疾病、疾病前期或疾病前期病況之一或多個風險因子者或並不展現疾病風險因子之個體或對疾病、疾病前期或疾病前期病況具有症狀之個體。個體亦可為患有或具有罹患疾病、疾病前期或疾病前期病況之風險者。

如本文所用之術語「病況」、「疾病」及「病症」可互換使用。病況可係血液病況、發炎病況、缺血性病況、贅瘤性病況、感染、創傷、子宮內膜異位症或腎衰竭。贅瘤性病況可選自由以下組成之群：急性淋巴母細胞性白血病、急性或慢性淋巴球性或粒細胞性腫瘤、急性類骨髓性白血病、急性前骨髓性白血病、腺癌、腺瘤、腎上腺癌、基底細胞癌、骨癌、腦癌、乳癌、支氣管癌、子宮頸發育不良、慢性骨髓性白血病、結腸癌、表皮樣癌、尤恩氏肉瘤、膽囊癌、膽石腫瘤、巨細胞瘤、多形性神經膠母細胞瘤、毛樣細胞瘤、頭癌、增生、增生性角膜神經腫瘤、原位癌、腸神經節瘤、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、喉癌、平滑肌腫瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、惡性類癌、惡性高鈣血症、惡性黑色素瘤、馬凡樣體型腫瘤、髓質癌、轉移皮膚癌、黏膜神經瘤、漸進壞死性蕈狀肉芽腫、骨髓發育不良症候群、骨髓瘤、頸癌、神經組織癌症、神經胚細胞瘤、成骨性肉瘤、骨肉瘤、卵巢腫瘤、胰臟癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、真性多血症、原發性腦瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、精原細胞瘤、皮膚癌、小細胞肺腫瘤、軟組織肉瘤、鱗狀細胞 癌、胃癌、甲狀腺癌、局部皮膚病灶、網狀細胞肉瘤或威廉氏腫瘤。

如本文所用術語「約」可指在隨後所提及值之+/- 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%內之量。舉例而言，11mL血液之樣品亦可稱為等於約10mL之血液之樣品。

倘若提供值之範圍，則應理解，亦明確揭示該範圍之上限與下限間之每一居間值，除非上下文另有明確指示，否則精確至下限單位之十分之一。本發明內涵蓋所述範圍內之任一所述值或居間值與該所述範圍內之任一其他所述值或居間值間的每一較小範圍。在該範圍中可獨立地包括或不包括該等較小範圍之上限及下限，且任一限值、無限值或兩個限值包括於該等較小範圍中之每一範圍亦涵蓋於本發明內，任何在所述範圍中明確排除之限值仍被排除。倘若所述範圍包括限值中之一者或二者，則本發明中亦包括排除彼等所包括限值中之任一者或二者的範圍。

呈現以下實例以更全面地說明本發明之較佳實施例。然而，決不應將該等實例視為限制本發明之寬範疇。

實例 實例1：微通道製造及表面修飾

使用雷射微加工技術製造微流體裝置以具有藉由U形微通道聯結之一個入口及出口。圖5提供根據實施例之微流體裝置500之分解視圖。微流體裝置可包含聯結件502、頂板504、間隔件506及基底載玻片508。該裝置之構築起始於具有兩個鑽孔、入口及出口之PMMA頂板之製造。U形切入間隔件中，其在兩側雙塗覆有丙烯酸黏著劑以在一側黏合至PMMA頂板且在另一側黏合至標準蓋玻片，以形成微流體通道。PMMA聯結件黏合至PMMA頂板。微通道為約110mm長、5.5mm寬及0.06mm高。為破壞流線、然後破壞主導基於微流體之裝置中之流動條件之層流的細胞且增加細胞表面相互作用之次數，使用平均 高度為約0.05mm、平均寬度為約0.25mm且平均長度為約1mm之線槽將微通道之上表面圖案化。

圖6圖解說明根據實施例在微流體通道中製備抗體系鏈SLB包膜所遵循之順序步驟。在步驟602中，將由POPC/b-PE(95/5mol/mol、90/10mol/mol、85/15mol/mol及80/20mol/mol)組成之0.2mg/ml脂質囊泡填充於微流體通道中且培育1h以形成完整脂質雙層包膜，然後用含有150mM NaCl之10mM磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.2)沖洗以移除過量囊泡及未結合之脂質。在步驟604中，使中性親和素(NA)之0.1mg/ml溶液流至SLB-bPE包覆之微通道上且培育1h，然後用PBS緩衝液沖洗以移除過量NA。在步驟606中，引入b-抗EpCAM之0.05mg/ml溶液以與SA-SLB-bPE固定之表面偶聯1h，然後用PBS緩衝液沖洗以移除過量b-抗EpCAM。

實例2：使用注射器產生泡沫組合物

藉由聯結含有磷酸鹽緩衝鹽水中之5% BSA及2mL空氣之4mL 2：1混合物的5mL第一注射器(參見圖7)與第二空注射器來製備泡沫組合物。兩個注射器係藉由三通閥來聯結。封阻閥之不使用之第三孔口以在兩個注射器之間產生連續流動路徑。壓下包含混合物之第一注射器之活塞，迫使第一注射器之內容物進入第二注射器中。然後壓下第二注射器之活塞一迫使內容物返回至第一注射器中。將該過程重複10次，且每一壓下花費不到5秒。該過程產生至少1.5毫升泡沫組合物，其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑(參見圖8)。

實例3：使用膜產生泡沫組合物

將細孔膜置於包含磷酸鹽緩衝鹽水中之5% BSA及2mL空氣之4mL 2：1混合物之容器上。膜包含直徑為10微米之孔。將容器之上側朝下，使得容器中之液體不會露出且不會經由細孔膜滴落。將5mL注射器之尖端置於膜上。拉取注射器之活塞，由此產生力來拉取液體自 容器通過膜。然後經由膜將注射器中之液體轉移回至容器中，藉由用壓力壓下注射器之活塞使得液體通過膜。將該過程重複5次。自容器之開口移除膜且收集泡沫組合物。

實例4：藉由渦旋產生泡沫組合物

將磷酸鹽緩衝鹽水中之5% BSA及空氣之4mL 2：1混合物添加至10mL尖底管中。在渦旋儀上在最高速度設定下將尖底管渦旋20秒。將泡沫自尖底管移除且注射至已與包含稀有循環腫瘤細胞之樣品接觸之微流體晶片中，其中稀有循環細胞已結合至晶片上之結合部分。使泡沫組合物以3mm/s流入晶片中。使稀有循環腫瘤細胞自微流體晶片釋放且與泡沫一起收集。對來自稀有循環腫瘤細胞之核酸進行測序。

實例5：使用泡沫組合物自非結垢組合物釋放細胞

使包含循環腫瘤細胞之樣品與表面接觸。該表面包含非結垢組合物。非結垢組合物包含脂質雙層及結合部分。將非結垢組合物之脂質非共價附接至微流體通道之表面(例如，經由凡得瓦相互作用)。脂質之末端包含生物素部分。結合部分包含鏈黴抗生物素蛋白部分。生物素部分及鏈黴抗生物素蛋白部分結合在一起，由此將脂質連接至結合部分。結合部分係抗EpCAM抗體。使樣品以0.5mm/s至4mm/s之流速流經表面。樣品之循環腫瘤細胞結合至結合部分。藉由使包含磷酸鹽緩衝鹽水之洗滌緩衝液流經非結垢組合物來純化非結垢組合物之表面。洗滌緩衝液會移除非特異性結合之細胞，但不會破壞循環腫瘤細胞之結合。使包含磷酸鹽緩衝鹽水中之5% BSA及氣泡之1.5毫升泡沫組合物(其中至少50%之氣泡包含10微米至100微米之直徑)流經非結垢組合物。泡沫組合物之氣泡與非結垢組合物之脂質相互作用以自表面移除脂質。脂質係藉由剪切力與泡沫組合物之兩親性之組合自氣泡與非結垢組合物之間之空氣-液體界面移除。剪切力使脂質雙層之內側朝外，由此使脂質鬆散，因此容易地將其剝離。附接至非結垢組合物 之結合部分之循環腫瘤細胞亦與脂質一起移除。剪切力強至足以移除循環腫瘤細胞，但不損壞該等細胞。所釋放之細胞為活細胞。以此方式，使用藉由泡沫組合物之釋放方法收集循環腫瘤細胞。

實例6：細胞捕獲及純化

在37℃與5% CO₂氣氛下在加濕培育器中，使人類結腸直腸癌細胞系HCT 116維持且生長於補充有10%胎牛血清(FBS)及1%抗生素/抗黴菌劑(100U/ml青黴素鈉、100 lg/ml鏈黴素及0.25 lg/ml兩性黴素(amphotericin)B；Gibco-RBL life Technologies,Paisley,UK)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM)(Gibco-RBL life Technologies,Paisley,UK)中。在約90%鋪滿時，用CellTracker綠CMFDA或CellTracker紅CMTPX(Invitrogen,CA,USA)將細胞預染色1h，且然後使用含有0.1%乙二胺-四乙酸(EDTA)之0.2%胰蛋白酶(Sigma Aldrich,St.Louis,USA)將細胞重懸浮於相同培養基中用於後續實驗。

在EDTA管中，將300至2000個經CellTracker綠預染色之HCT116細胞摻入自健康個體收集之1mL全血中。充分混合後，使細胞-血液混合物流經功能化微通道。此後，用0.5mL磷酸鹽緩衝溶液(PBS)、然後用0.3mL Hoechst溶液(1μg/mL於PBS中)洗滌微通道以對細胞核中之DNA染色。對通道進行螢光顯微拍照以計數結合至通道表面之總細胞數。對CellTracker及Hoechst染料呈雙陽性之細胞鑑別為HCT116細胞，且僅單陽性DAPI細胞鑑別為非特異性結合之細胞，例如白血球(WBC)。圖9圖解說明根據實施例6種不同微流體通道設計(A至F)之幾何結構901及性能902。圖10圖解說明根據實施例之微流體通道設計A及B之構築及尺寸。圖11圖解說明根據實施例之微流體通道設計C及D之構築及尺寸。圖12圖解說明根據實施例之微流體通道設計E及F之構築及尺寸。在相同線速度下具有簡單圖案之平直通道中，捕獲性能(定義為晶片上結合之HCT116細胞數對發送至晶片之細胞數的比率)極 低，此乃因有限的滯留時間及非混合流動模式。A型晶片捕獲性能=1.2±0.6%，且B型晶片性能=4.5±2.2%。當微圖案之數量增加以產生有效混合時，捕獲效率實質上增加：C型晶片=17.9±3.0%，且D型晶片=33.5±6.6%。進一步倍增通道長度僅使效率稍微增加至37.0±10.5%(E型)，而4個平行通道使效率增加至93.7±8.9%(F型)。除非另有說明，否則將F型晶片用於剩餘實驗。

所捕獲細胞之純化係藉由增加PBS緩衝液沖洗之流速來實現。隨著PBS之流速增加，剩餘WBC之百分比顯著減小。移除80%-100% WBC、同時保留95%+ HCT116之所誘導剪切應力僅需要約4-8達因/cm²(對應於約5-10mL/h之流速，圖13)。圖13圖解說明經由增加緩衝液流速選擇性地增加流動通道中之剪切應力來純化。保留靶HCT116細胞，同時剪切應力恰好大至足以沖洗掉非靶WBC。圖中顯示細胞剝離率(%，Y軸)對流速[或線速度](下X軸)及相應剪切應力(上X軸)。通常使流速維持在灰色區以下以避免所捕獲CTC之任何潛在損失。*：P<0.05；**：P<0.01

純化靶細胞所需之剪切應力實質上低於基於習用抗體矽化表面之先前細胞剝離研究中所報導的剪切應力密切認為低至足以具有最小或對細胞活力或蛋白質表現無影響。相反地，約80%之HCT116即使在50mL/h下仍因強抗體-抗原結合而保持結合。對於臨床樣品，可選擇甚至4mL/h之較小流速來避免CTC之任何潛在損失。

實例7：所捕獲活細胞之釋放

自微流體晶片釋放活CTC係使得能夠進行方便的細胞保存、下游分子分析及細胞培養之關鍵步驟。先前嘗試對剝離細胞使用酶促裂解、化學或機械力已顯示因抗體-抗原連接斷裂或膜破裂所致之部分釋放或不可避免的細胞死亡。SLB係在水-固體界面處藉由脂質分子長烴鏈之向內疏水-疏水相互作用及向外親水頭基與水或親水氧化矽 表面(即玻璃)之相互作用穩定之脂質分子組裝。SLB組裝可藉由引入與氣泡一樣簡單之疏水組份來分解。提供藉由向微流體注射連續空氣泡沫來溫和地釋放黏著性CTC而不破壞抗體-抗原鍵之策略。泡沫溶液係藉由空氣及細胞培養基之混合物(1：2體積比)且溫和地渦旋1分鐘以產生泡沫來產生。時移實驗之顯微照片顯示在數秒內所捕獲之HCT116細胞在掃除其上之空氣-泡沫後釋放(圖14，基於晶片E)。圖14提供釋放過程之時移顯微照片。在t=10.500min時，預染色HCT116細胞(用數字標記之綠點)捕獲於表面上。3個箭頭指向現有小氣泡。在t=10.504min時，在入射氣泡之空氣相流經該區域時，將該等細胞覆蓋於該空氣相內。箭頭指向此引入大氣泡之邊界。在t=10.550min時，細胞自附接位點釋放且由流出氣泡掃除掉。箭頭指向微少夾帶空氣及所引入之較大氣泡之界面邊界反射之螢光。在3個重複中使用250μL泡沫溶液之平均釋放效率係99.7%，如表2中所顯示。

圖15顯示所溶析細胞由脂質包裹，此指示藉助空氣經由剝除SLB之細胞釋放。將自晶片釋放之細胞及所附接抗體及空氣泡沫一起收集至埃彭道夫管中。另一選擇為，可將所溶析細胞收集至平坦多孔膜(顯示直徑10mm)中用於免疫螢光染色及計數。在細胞溶析後立即實施活/死分析(Life Technologies)；結果顯示86%之溶析CTC保持活力，此與來自通常包覆之抗EpCAM矽化晶片之0%活力不同。

實例8：活細胞之培養及維持

為確定經分離之細胞是否可在活體外培養，收集自來自臨床樣品i之CTC釋放之空氣泡沫且將其接種於96孔組織培養板中，在37℃下在5% CO₂下培育。如圖16中所顯示，在第7天時自III期患者分離之癌細胞集合並附接至板之底部，且在第9天時擴散開。免疫螢光染色顯示DAPI(藍色)及CK20(紅色)陽性。為證明該等細胞具有再附接之傾向，在第9天時將其用0.1%胰蛋白酶處理且再接種於96孔板中。1天後，該等細胞(第10天)以約25μm之表觀細胞大小牢固地再附接至基板。觀察到CTC活力之維持。

實例9：分子分析

為檢測遺傳突變，直接自所溶析之細胞提取DNA來實施P53、腺瘤息肉病(APC)及K-ras突變中之7個高頻率癌症熱點之castPCR，如表3中所顯示。

3個健康供體之結果皆為陰性(△Ct>9.96)；在10個隨機選擇之CRC患者中，2個樣品對TP53 R248Q呈陽性(△Ct<9.96)且3個對APC1556fs*3呈陽性。

實例10：臨床樣品之高通量分析

易於自微流體裝置釋放細胞之重要優點在於，可在小平坦基板上收集細胞並染色。作為在3維複雜微流體通道內之晶片內檢驗之替代，使CTC在顯著較小區域(約10mm直徑)上成像使得能夠容易地再定位所關注細胞，且使成像及檢驗時間自6h顯著縮短至<0.5h(圖17)。因此，臨床樣品分析之高通量變得可行。

實例11：結腸直腸癌之所有時期中之CTC之分析

CTC在血液中相當稀有。此時FDA批準用於檢測及分離CTC之唯一分析係來自Veridex之CellSearch®分析。在大部分患者中，CellSearch®分析發現每7.5ml血液中小於5個CTC。儘管CellSearch分析結果展示患者樣品中之CTC計數作為預後標記物之臨床效用，但此效用僅適用於晚期癌症，而不適用於癌症檢測之所有時期。

本文所揭示之裝置可用於檢測癌症之所有時期。藉由檢測來自結所有時期之腸直腸癌患者之CTC來說明實例。將110個具有0/I期(n=20)、II期(n=29)、III期(n=46)及IV期(n=15)且未經先前癌症療法之CRC患者及未患結腸疾病之供體陰性對照(由結腸鏡檢查確認，n=28)納入雙盲前瞻性研究中。

自CRC患者獲得人類外周血。在CTC捕獲及純化後，使用空氣泡沫掃除將所捕獲之CTC釋放至小膜(約2μm)孔大小上以排出過量染色溶液，其中實施免疫螢光染色來鑑別及計數所釋放之細胞(圖18)。選擇針對細胞角蛋白20(CK20)之單株抗體作為陽性染色標記物，此乃因其比廣譜CK更具結腸直腸特異性。如圖19中所顯示，定義為DAPI+/CK20+/CD45-細胞之患者CTC隨患者疾病時期之進展而增加。 在28個健康供體中，DAPI+/CK20+/CD45-細胞之範圍為0至3。健康、0/I期、II期、III期及IV期中之DAPI+/CK20+/CD45-細胞之中值數分別為0、2、4、7及36。IV期之CTC計數之分佈較為廣泛，其中最高細胞計數超過1000；每一臨床時期之平均及標準偏差顯示於圖19中。每一臨床時期之平均值係如圖23中所顯示來繪製。

實例12：CTC數量與結腸直腸癌及胃腸(GI)道疾病之關聯

為評估CTC數量與結腸直腸癌(CRC)及胃腸(GI)道疾病之關聯，檢查在手術前自120個患有原發性CRC之病例獲得之末梢血液中的CTC。隨機選擇60個無先前癌症病史之病例來實施CTC，然後進行結腸鏡檢查作為對照。在120個癌症患者中，對於進一步分析，將在CTC檢查前已接受手術前同步化學療法及放射性療法、單獨化學療法或放射性療法之10個患者(4個病例為IV期且6個病例為I期至III期)排除在外。

對照組之歸類基本上係根據結腸鏡檢查發現。在對正常結腸進行歸類時，將在CTC檢查後接受手術之三個患有消化性疾病之患者及一個患有子宮內膜息肉之患者(在CTC檢查之前亦具有3年前耳下腺卡索曼氏病(Castleman’s disease)之手術史)歸類為稱為「具有其他位點黏膜病灶」之子類。根據息肉存在與否對患病結腸之兩個子類進行歸類。然而，兩個患有息肉及潰瘍性結腸炎之病例歸類為潰瘍組。在CTC檢查後，一個患有憩室病之病例亦患有原位子宮頸癌且接受手術切除。在CTC檢查後，一個患有盲腸局部重度發育不良腺瘤之病例亦患有卵巢透明細胞癌(病理期T2N0)，且使其接受兩種腫瘤之手術切除。為更精確地評估循環腫瘤細胞存在與結腸贅瘤進展之關聯，將屬具有其他位點黏膜病灶之正常結腸及具有其他黏膜病灶之患病結腸的子類之患者排除在外以供進一步分析。總之，161個病例(110個癌症病例及51個對照病例)入選結腸直腸贅瘤之CTC與進展之間的關係之 分析。TNM時期之病理歸類係根據AJCC第7版。6個IV期癌症病例未接受手術干預。一個0期(Tis)病例僅接受內視鏡黏膜切除。所有其他病例接受腫瘤之治癒性或期望治癒性切除。根據圖表記錄對患者之所有臨床病理參數進行歸類。

使用用於Windows(12.0版，SPSS公司，Chicago,IL)之SPSS來實施統計學分析。使用兩個獨立樣品T測試來比較每一組之平均值。使用Anova分析來比較同一參數之亞組之間的平均值及線性。使用線性迴歸測試來測試各組之間之線性相關。使用皮爾森氏卡方測試(Pearson’s chi-square test)來分析各組之間之大於截止值之陽性率之發病率差異。所有P值皆為雙邊；小於0.05之P值指示統計學顯著性。

1)在每一歸類中CTC數量之分佈

對照組之平均年齡為50.6±13.5歲(介於25歲至76歲範圍內)，且比癌症組之62.0±11.5歲(介於34歲至87歲範圍內)顯著年輕(P<0.001)。對照組及癌症組之雌性/雄性之比率分別為28/25及62/48，且兩組之間不存在統計學顯著性。

如表4中所概述，癌症組及患病結腸組之CTC數量之平均值顯著高於正常組之CTC數量的平均值(P<0.01)。癌症組之CTC之平均值亦顯著高於患病組之CTC的平均值(P=0.01)。在癌症組中，在CTC檢查前已接受治療之患者中所檢測到之CTC數量低於在彼等未接受治療之患者中所檢測到之CTC數量。

2)CTC數量與臨床病理特徵之間之關係

總之，在CTC測試前未經治療之110個CRC病例參與此分析。平均CTC數量自T1腫瘤歸類逐漸增加至T4腫瘤歸類(Anova分析，P=0.022)，尤其T4之平均CTC數量顯著高於其他T歸類(t測試，P<0.01)。平均CTC數量亦隨腫瘤大小及淋巴結轉移之進展一起逐漸增加(Anova測試，P<0.05)。N2之平均CTC值顯著高於N0或N1歸類之平均CTC值(t測試，P<0.01)。大於5cm之腫瘤大小之平均CTC值亦顯著高於小於5cm之腫瘤大小之平均CTC值(t測試，P<0.01)。M1之平均CTC值顯著高於M0歸類之平均CTC值(t測試，P<0.01)。該等結果揭露血液中CTC數量之增加與腫瘤進展(稱為TNM時期)及腫瘤大小高度相 關。CEA升高(>5)之平均CTC值高於無CEA升高之平均CTC值，但不存在統計學顯著性(t測試，P=0.076)。較差分化之腫瘤之平均CTC值顯著高於充分或中等分化腫瘤之平均CTC值(t測試，P<0.01)。在充分分化組與中等分化組之間不存在CTC值之差異。在不同性別、年齡及腫瘤位置組之間不存在CTC存在之差異。

3)IV期癌症不同轉移類型中之CTC存在

在19個IV期病例中，4個病例在CTC測試之前已接受治療。儘管在經治療患者中所檢測到之CTC數量低於在未經治療之患者中所檢測到之CTC數量，但兩組之間不存在統計學顯著性。在CTC測試之前未經治療之15個病例中，所檢測到之肝及肺轉移之CTC數量高於腹膜侵入及中央淋巴結轉移之CTC數量(t測試，P=0.076)，如表6中所概述。此意味著CTC之存在具有血行性擴散轉移多於腹膜接種或淋巴途徑轉移之傾向。存在未經先前治療之2個病例，其原發性腫瘤中存在K-ras突變。一個患有肝及肺轉移之病例無法檢測到CTC之存在。另一個患有中央淋巴結轉移之病例具有2個CTC。在CTC測試之前未經治療之其他患者具有野生型K-ras。因此，難以確定CTC檢測是否與K-ras突變相關。

可觀察到血行性擴散轉移具有多於腹膜或LN轉移之CTC數量。患有肝及肺轉移之一個病例患有具有腹內侵入之子宮頸癌且具有K-ras突變及較差腫瘤分化。肝轉移組中之一個病例(D-結腸癌)具有3個CTC，恰好等於截止值且CEA=1.1。在患有IV期之19個病例中，13個病例經歷原發性及轉移性腫瘤之姑息性切除。

N2之CTC顯著高於N0及N1組。

作為比較，廣泛使用之Veridex CellSearch CTC計數系統展示在50個IV期CRC患者之僅25%中≧3個CTC/7.5mL血液之檢測敏感性(定義為DAPI+/廣譜CK+/CD45-)。平臺顯示使用≧3個CTC(DAPI+/CK20+/CD45-)/2mL血液作為截止，80%、67%、66%及30%之CRC IV期、III期、II期及I/0期呈陽性，相反地，僅28個健康供體中僅1者(4%)具有3個CTC(其餘具有0-2個CTC)。使用此敏感性及特 異性值，顯示可在早期檢測到CTC，且該量與疾病進展相關。

典型1mL血液樣品含有約6.6×10⁶個有核WBC，且SLB包覆之微流體系統平均消除99.9962%。當前，由於在4mL/h之流速下溫和洗滌，約500-2000個WBC與CTC一起溶析，及流體裝置及管道中之怠體積。然而，此CTC純度值足以促進分子分析用於致癌基因鑑別(0.1%純度用於cast PCR)且可能提供使用經適當選擇之療法進行早期干預之益處。如圖24中所顯示，本發明系統之簡單工作流程以連續平行過程經濟地實施捕獲、純化及釋放。將等分成4等份之8mL血液樣品平行進給至4個晶片中。所有晶片經過細胞捕獲、純化，且然後將細胞釋放用於許多下游應用中之一者，包括IF染色、細胞計數、PCR熱點分析、細胞培養及/或冷凍庫存。該平臺同時提供用於CTC研究之完全溶液用於成像、分子分析、細胞培養及保存，僅需要8mL血液。此開創了CTC在癌症篩選、監測、分子剖析及藥物選擇中之常規臨床效用之機會。

實例13：預測手術後之早期肝轉移

自2012年7月4日至2012年11月1日，在長庚紀念醫院(Chang Gung Memorial Hospital),Linkou Campus招募在結腸鏡檢查後隨機選擇之110個患有原發性CRC之患者及50個無先前已知癌症病史之健康供體。在抽血及CTC計數後前瞻性研究為雙盲的。所有110個癌症患者在抽血時尚未接受任何先前治療。對非轉移性CRC患者之臨床狀況進行隨訪直至2014年11月，包括每3個月之連續血清CEA量測、每12個月之腹部超音波或CT掃描、胸部X射線及結腸鏡檢查或因臨床症狀或CEA升高而懷疑轉移之時間。

對照組之歸類係基於結腸鏡檢查發現及圖表記錄。TNM時期之病理歸類係基於AJCC第7版。除一個未經手術切除之病例外，所有其他非轉移性病例皆已接受腫瘤之治癒性或期望治癒性切除。根據圖表 記錄對患者之所有臨床病理參數進行歸類。已在檢查之前自所有病例獲得經IRB批準之知情同意書(長庚紀念醫院之倫理委員會(Ethic Committee of Chang Gung Memorial Hospital)之第100-4274B號及中國科學院(Academia Sinica)之AS-IRB01-11056)。

使用CMx平臺來進行CTC分離及富集。此方法之程序如下文中所簡要闡述。首先，將來自供體之約7-9mL末梢血液樣品抽取且收集至含有抗凝劑EDTA(BD Biosciences)之10ml Vacutainer管中，然後以1.5mL/h之流速將2mL血液輸注至抗EpCAM-SLB包覆之晶片中。完成血液輸注後，使用PBS緩衝液洗滌掉鬆散結合之細胞；隨後，將空氣泡沫輸注至晶片以分解SLB，然後溶析所捕獲之細胞。用DAPI、CK20及CD45對所釋放之細胞染色。具有細胞形態且直徑在7-25μm內、在細胞質中呈CK20陽性、在核中呈DAPI陽性及CD45陰性染色之圓形粒子定義為CTC，且在Leica DM-IRE2(自動化倒置顯微鏡及活細胞系統)及Leica AF 6000(高級螢光成像系統)之顯微術下計數。至少兩個受過培訓的操作者獨立地評價細胞影像，且基於共有對CTC計數。

使用用於Windows(12.0版，SPSS公司，Chicago,IL)之SPSS實施統計學分析。使用兩個獨立樣品T測試及Anova分析來比較不同組之間之平均值及線性。使用線性迴歸測試來測試各組之間之線性相關。使用皮爾森卡方測試來分析各組之間之陽性率之發病率的差異。藉由卡本-麥爾(Kaplan-Meier)方法及對數秩測試實施存活率分析。使用Cox迴歸模型來實施預後因子之多變量分析。所有P值皆為雙邊；小於0.05之P值指示統計學顯著性。

實例14：微流體晶片製備

常見微流體晶片之製造係如下文所闡述：使用市售CO2雷射畫線機(Helix 24,Epilog,USA)在聚(甲基丙烯酸甲酯(PMMA)載玻片(大小= 標準載玻片，厚度=1.5mm)上產生微圖案。亦使用雷射來雕刻63μm厚之雙邊黏著膠帶(8018PT,3M公司)以切出圍繞PMMA上之微流體圖案之邊框。使用CorelDraw(Corel,Ottawa,Canada)繪製PMMA載玻片上之微溝槽圖案及微結構，且然後轉移至雷射畫線機以在基板上直接加工。在此研究中，製備6種類型之晶片。藉由將切出之3M黏著膠帶(夾入)置於頂部(PMMA載玻片)與底部載玻片之間將經雕刻之晶片與經血漿處理之載玻片黏合在一起，以形成密封通道。微流體晶片中脂質囊泡之製備、EpCAM、EpAb4-1之抗體之生物素化、抗EpCAM支撐之脂質雙層包膜之順序製備已於先前闡述但簡要闡述於本文中。

用由莫耳比為95/5之1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-帽-生物素基(b-PE)組成之脂質囊泡油處理微流體通道之內壁。移除過量脂質後，經由NA-生物素識別將中性親和素^TM(NA)偶聯至SLB中之b-PE，然後將生物素化EpAb4-1(b-EpAb4-1)偶聯至NA以完成表面形成。圖9顯示具有不同流動路徑、尺寸及具有此表面修飾之微結構之一系列微流體裝置。

實例15：結腸直腸癌細胞系捕獲效率研究

結腸直腸癌細胞系捕獲效率係使用HCT116來表徵。將經CellTracker綠預染色之300至2000個HCT116細胞摻入玻璃底孔(直徑：6mm，高度：5mm)中且等待10min以使細胞沉降。在將細胞轉移至自健康個體收集之全血之前及之後藉由螢光顯微術(Leica AF 6000高級螢光成像系統)使孔板底部成像，以確保精確計數。所摻入細胞之實際數量定義為(轉移前孔中之細胞數)減掉(轉移後孔中剩餘之細胞數)。適當溫和混合後，使細胞-血液混合物流經功能化微通道。此後，用0.5mL PBS洗滌微通道，且引入0.3mL Hoechst溶液(1μg/mL於PBS中)以對細胞核染色。對通道進行螢光顯微拍照以計數在通道中捕 獲之總細胞數。結腸直腸癌細胞系捕獲效率定義為(確認之所捕獲細胞數)/(實際摻入之細胞數)×100%。

實例16：使用castPCR技術用於臨床樣品及基因分型之CTC之臨床樣品選擇及免疫螢光染色

自110個患有0-IV期結腸直腸癌之患者及28個健康供體(62個雌性及76個雄性)獲得末梢血液，每個個體一管。在此研究中接受無先前癌症治療之結腸直腸癌患者，使其在當天或前一天在手術前接受抽血。藉由結腸鏡檢查無結腸疾病來確認健康供體且在該程序之前使其接受抽血。患者及健康供體之平均年齡為62歲及44歲。研究方案經中國科學院機構審查委員會(Institutional Review Boards of Academia Sinica)(AS‧IRBOI-12040)及長庚紀念醫院(100-1023B)批準。

用4%多聚甲醛(PFA)固定自晶片釋放至過濾膜上之所捕獲細胞，用1×PBS中之0.1% triton X-100透化且用BSA封阻。隨後，在4℃下用兔抗人類細胞角蛋白20(CK20)(Abcam,Cambridge,UK)及大鼠抗人類CD45(Abcam Cambridge,UK)將細胞染色過夜，且然後用PBS洗滌。在PBS洗滌後，在室溫下將細胞與FITC偶聯之山羊抗大鼠IgG抗體(Abcam Cambridge,UK)及Alexa Fluor® 568抗兔IgG抗體(Life Technologies,CA,USA)一起培育1h，然後用PBS洗滌以移除過量二級抗體。CTC計數概述於圖21中。

藉由市售TaqMan®突變檢測分析(Life Technologies,Carlsbad,CA)檢測KRAS、TP53及APC突變狀況。該等分析使用競爭性等位基因特異性TaqMan PCR(castPCR技術)。每一野生型或突變體等位基因分析係由經修飾或未經修飾之等位基因特異性前置引子、基因座特異性TaqMan®探針、基因座特異性後置引子及等位基因特異性MGB封阻劑構成。利用突變體等位基因分析及相應的基因參考分析來運行每一測試樣品。利用Seq檢測系統2.3版來分析結果以產生CT_靶及CT_參考之 值。使用檢測△CT截止值來確定樣品之突變體等位基因分析可檢測之突變%的限值。%與△CT之間之轉換公式為2-(△CT)×100%。突變體等位基因分析敏感性為0.1%。因此，△CT<9.96之值為陽性，且△CT>9.96之值為陰性。

應理解，可在實踐本發明中採用本文中所述之本發明實施例之各種替代實施例。以下申請專利範圍意欲界定本發明之範疇並由此涵蓋該等申請專利範圍及其等效內容範疇內之方法及結構。

105‧‧‧結合部分

110‧‧‧連接體

115‧‧‧非結垢組合物

120‧‧‧表面

125‧‧‧接觸

130‧‧‧所關注粒子

135‧‧‧流經

140‧‧‧氣泡

Claims (48)

1. 一種方法，其包含：(a)使用微流體裝置，自源自個體之異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞，其中該微流體裝置包含非結垢組合物且對該稀有細胞具有至少40%之捕獲效率；及(b)自該微流體裝置釋放所捕獲之稀有細胞，同時使該所釋放稀有細胞之至少40%維持活力。
2. 如請求項1之方法，其進一步包含分析該等所釋放之稀有細胞，由此評價該個體中病況之存在、不存在、嚴重程度、轉移、起源組織。
3. 如請求項2之方法，其中該病況係癌症且該異質細胞樣品係血液樣品。
4. 如請求項2之方法，其中該病況係良性疾病。
5. 如請求項2之方法，其中該等稀有細胞係CTC。
6. 如請求項5之方法，其中分析包含計數CTC、計數活CTC或對該等CTC實施分子分析測定。
7. 如請求項2之方法，其中該病況係癌症且評價該嚴重程度包含確定癌症時期。
8. 如請求項7之方法，其中該癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。
9. 如請求項2之方法，其進一步包含在第二時間點重複步驟(a)及(b)。
10. 如請求項5之方法，其中該分析包含比較所釋放活CTC之數量與截止值。
11. 如請求項10之方法，其中該截止值係3個稀有細胞且該血液樣品 具有等於或至多6mL之體積。
12. 如請求項11之方法，其中該血液樣品具有等於至多2mL之體積。
13. 如請求項12之方法，其中評價該嚴重程度包含確定癌症時期，且其中該癌症時期包含發育不良、I期、II期、III期或IV期癌症。
14. 如請求項13之方法，其進一步包含基於該癌症時期選擇針對該個體之藥物療法。
15. 如請求項2之方法，其中該評價確定發育不良或I期癌症之存在或不存在，且在成像診斷之前進行。
16. 如請求項15之方法，其中該成像診斷包含超音波、CT、MRI、PET或觸診分析。
17. 如請求項2之方法，其中該病況係結腸疾病、GI疾病或卵巢/子宮內膜疾病，且其中該分析該等所釋放之稀有細胞包含用DAPI、抗CK20及抗CD45對該等所釋放之稀有細胞染色。
18. 如請求項2之方法，其中該病況係乳房疾病或前列腺疾病，且其中該分析該等所釋放之稀有細胞包含用抗PSA及抗PSMA對該等所釋放之稀有細胞染色。
19. 如請求項2之方法，其中該病況係乳房疾病，且其中分析該等所釋放之稀有細胞包含用一或多種選自由抗CK7、抗HER2、抗ER及抗PR組成之群之標記物對該等所釋放之稀有細胞染色。
20. 如請求項1之方法，其中該病況係肺疾病，且其中分析該等所釋放之稀有細胞包含用一或多種選自由抗CK7、抗TTF1及抗EGFR組成之群之標記物對該等所釋放之稀有細胞染色。
21. 如請求項2之方法，其中該病況係癌症，且其中分析該等所釋放之稀有細胞包含用抗廣譜CK或抗CK18對該等稀有細胞染色。
22. 如請求項2之方法，其中該病況係微轉移。
23. 一種評價個體之癌症起源之方法，其包含：使用微流體裝置，自異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞；用抗體組對該等所富集之稀有細胞染色，其中該抗體組包含兩種或更多種不同類型之抗體；及基於染色結果預測該等稀有細胞之癌症起源。
24. 如請求項23之方法，其中預測癌症起源包含1)確定癌細胞之存在，及2)若存在癌細胞，確定該癌症起源。
25. 如請求項23之方法，其中該抗體組包含抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、抗CK20、抗CDX-2、抗PSA或抗PSMA。
26. 如請求項25之方法，其中該癌症起源包含乳癌、肺癌、胰臟癌、結腸直腸癌、前列腺癌或其他起源之癌症。
27. 如請求項23之方法，其中該異質細胞樣品係體積等於或至多為6mL之血液樣品。
28. 如請求項27之方法，其中該血液樣品具有等於或至多2mL之體積。
29. 如請求項23之方法，其進一步包含基於癌症進展選擇針對該個體之藥物療法。
30. 一種釋放捕獲於微流體表面上之靶細胞之方法，該方法包含：使空氣泡沫流動經過該微流體表面，其中該微流體表面包含脂質雙層，且該等靶細胞捕獲於該脂質雙層之頂層上；及剝離該頂層，由此釋放捕獲於該頂層上之該等靶細胞。
31. 如請求項30之方法，其中該等所捕獲之靶細胞係以至少40%之效率及40%之活力釋放。
32. 如請求項30之方法，其進一步包含1)用抗體組對該等靶細胞染色，及2)基於染色結果鑑別起源。
33. 如請求項32之方法，其中該抗體組包含以下中之至少兩者：抗廣譜CK、抗CK18、抗CK7、抗TTF-1、與抗CDX-2混合之抗CK20、與抗PSMA混合之抗PSA。
34. 如請求項30之方法，其進一步包含分析該等所釋放之靶細胞，由此評價個體中病況之存在、不存在、嚴重程度、轉移、起源組織。
35. 一種釋放捕獲於包含非結垢組合物之微流體表面上之靶細胞的方法，該方法包含：影響該非結垢組合物之狀態；及釋放該等靶細胞，其中該等靶細胞因該非結垢組合物之狀態受影響而釋放。
36. 一種評價個體中病況之存在、不存在或嚴重程度之方法，其包含實施診斷測試，其中該診斷測試具有曲線下面積為0.75或更大之ROC曲線。
37. 如請求項36之方法，其中該病況係癌症。
38. 如請求項36之方法，其中該病況係I期或I期前癌症。
39. 如請求項36之方法，其進一步包含基於該ROC曲線比較血液樣品中之CTC細胞計數值與截止值，由此評價該病況之存在或不存在。
40. 一種評價個體中病況之存在、不存在或嚴重程度之方法，其包含：使用微流體裝置，自體積等於或小於7mL之患者血液樣品選擇性地富集稀有細胞；及分析該等稀有細胞，由此評價該個體中該病況之存在或嚴重程度。
41. 如請求項40之方法，其中該患者血液樣品具有等於或小於2mL 之體積。
42. 如請求項40之方法，其中該病況係發育不良或I期癌症。
43. 如請求項40之方法，其中分析該等稀有細胞包含比較該患者血液樣品中之稀有細胞數與截止值，其中該截止值係基於ROC曲線下面積為0.75或更大之測試來產生。
44. 如請求項40之方法，其中稀有細胞係CTC且其中該病況係癌症。
45. 一種確定個體中發育不良或I期癌症之存在或不存在之方法，其包含：使用微流體裝置，自源自該個體之異質細胞樣品選擇性地富集稀有細胞；及確定所富集之稀有細胞數且比較該數值與截止值，由此確定該個體中發育不良或I期癌症之存在或不存在。
46. 如請求項45之方法，其中稀有細胞係CTC。
47. 如請求項45之方法，其中確定存在或不存在係在成像之前進行。
48. 如請求項47之方法，其中成像無法檢測或確定發育不良或I期癌症之存在或不存在。