JP2013524169A - 液滴によるアッセイ用の検出システム - Google Patents

Abstract

光検出用のシステム、方法、および装置と、液滴によるアッセイ用の信号処理。

Description

優先出願の相互参照
本出願は、２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７６８４号に基づくものであり、米国特許法第１１９条（ｅ）項により該仮出願の権利を主張し、参照によりそのすべてをすべての目的において本明細書に組み込む。

他の文献の相互参照
本出願は、２００６年５月９日に発行された米国特許第７０４１４８１号、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４ Ａ１号、およびＪｏｓｅｐｈ Ｒ． Ｌａｋｏｗｉｃｚ著、「ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ」（第２版、１９９９年）を参照により、それらすべてをすべての目的において組み込む。

バイオメディカル分野の応用は、試料のハイスループットアッセイに基づいて行われているものが多々ある。例えば、研究・臨床応用では、標的に特異な反応物を用いたハイスループット遺伝試験により、試料についての質の高い情報が得られ、様々な応用の中でもとりわけ、創薬、バイオマーカの開発、および臨床診断に用いられている。別の例として、感染症の検出では、複数の遺伝標的用の試料をスクリーニングして信頼性の高い結果を得ることがしばしば必要である。

ハイスループットアッセイを飛躍的に改善するには乳剤が極めて有望である。乳化技術を使えば、生化学反応用の独立した反応チャンバとして機能する液滴を数十億個という数で作り出すことができる。例として、（例えば、２００マイクロリットルの）水性試料を区分けして液滴（例えば、それぞれ５０ピコリットルの４００万個の液滴）にし、それらを用いて個々のサブコンポーネント（例えば、細胞、核酸、タンパク質）を別個に超ハイスループットで操作し、処理し、検査することができる。

水滴を油中に懸濁させて、油の中に水が入っている状態の乳剤（水／油）を作ることができる。この乳剤を界面活性剤により安定化させて、加熱、冷却、輸送中に液滴の結合を減らすかまたはなくすことができ、それによって、温度サイクリングを実施することができる。このため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した液滴中の核酸標的分子の単一コピー増幅は、乳剤を使用して実施していた。これらの液滴のうち、ある標的に対して陽性である液滴をポアソン統計に基づいて解析して、試料中の標的の濃度を推定することができる。

液滴によるアッセイでは、しばしば、液滴中の標識として１種または複数種の蛍光体を用いて、増幅などの反応が起こったかどうかがわかる。こうして、個々の液滴中に標的のコピーが少なくとも１つ存在するか否かがわかる。こうした液滴を生成し反応させ（例えば温度サイクリングを実施し）、次いで、各液滴からの放出光を測定して液滴中に標的が存在するか否かを判断し得る。区別可能な異なる蛍光体がそれぞれ異なる標的ごとのレポータとして機能すれば、複数の異なる標的が存在するか否かを各液滴ごとに測定することができる。しかし、２種以上の色（２種以上の別個の蛍光体からの蛍光）を区別可能に単一点検出し、高分解能の液滴データを収集し、一般的な色素（例えばＦＡＭやＶＩＣといった色素）とともに使え、かつ／または、信号の中から液滴を効率的に識別することができる比較的低コストの液滴用の光検出システムを構築するには、越えなければならない多くの技術的なハードルがある。

改善された液滴用の光検出システムが必要とされている。

本開示により、液滴によるアッセイにおける光検出および信号処理のためのシステムが、方法および装置を含めて実現される。

本開示の態様による、液滴によるアッセイにおいて実施し得るステップの例を列記したフローチャートである。 本開示の態様による、液滴を光で照射する照明アセンブリと、液滴からの光を集め検出する集光アセンブリとを備える検出ユニットの例の選択された態様の概略図である。 本開示の態様による、図２の検出ユニットを含む検出システムの例の概略図である。 本明細書で開示する検出システムで使用し得る１対の色素の例の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを正規化して示すグラフである。 本開示の態様による、液滴によるアッセイ用の検出システムの別の例の選択された態様の概略図である。 本開示の態様による、図５の検出システムで収集されるデータの例がこのシステムの照明アセンブリによって生成される照明パルスに対応している様子を示す一連のグラフである。 本開示の態様による、図５のシステム用の制御部の例の選択された態様の概略図であり、この制御部はどの光源が検査領域を照明しているかに基づいてこの光源と対応する検出器の１対だけからデータを収集することを示す。 本開示の態様による、液滴によるアッセイ用の検出システムのさらに別の例の選択された態様の概略図である。 本明細書で開示する信号検出システムが含み得る照明アセンブリおよびキャピラリの例の選択された態様の概略図である。 図９の照明アセンブリを概ね図９の線１０Ａ−１０Ａで切った断面図であり、照明アセンブリのスリットと光ビームの関係の例を示している。 図９のキャピラリを概ね図９の線１０Ｂ−１０Ｂで切った断面図であり、図１０Ａのスリットによって整形されるビームの断面構成を示している。 本明細書で開示する信号検出システムが含み得る検出ユニットおよびキャピラリの例の選択された態様の概略図である。 本開示の態様による、本明細書で開示する検出システムによって収集されるデータを処理する手法の例を示す一連のグラフである。 本開示の態様による、図５のシステムなど、本明細書で開示する検出システムで用いる検出ユニットの例の光学配置の図である。 本開示の態様による、図４のグラフと、その捕捉として図１２の検出ユニットを備えた図５の検出システムで用いる図４の色素に適し得る照明および検出の波長帯の例を付け加えて示す図である。 本開示の態様による、液滴によるアッセイ用の検出システムのさらに別の例の選択された態様の概略図であり、このシステムは、流路に沿って離間して配設された検査部位からなる不連続な検査領域を画定するように配置された一連の検査ユニットを複数備える。 本開示の態様による、液滴によるアッセイ用の検出システムの別の例の選択された態様の概略図であり、このシステムは、流路に沿って離間して配設された多色検査部位からなる不連続な検査領域を画定するように配置された、図５のシステムに示した検出ユニットを複数備える。 本開示の態様による、図１４のシステム構成に従って構築された検出システムの実施形態の選択された態様の図である。

本開示により、液滴によるアッセイにおける光検出および信号処理のためのシステムが、方法および装置を含めて実現される。

液滴を検出する方法が提供される。この方法では、流路の検査領域を、液滴がこの検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するようにし得る。第１のパルスは第２のパルスとスペクトル的に異なり得る。検査領域が第１のパルスおよび第２のパルスで照明される期間に検出される光を表すデータを収集するようにし得る。

液滴を検出する別の方法が提供される。この方法では、流路の検査領域を、液滴がこの検査領域を通過するときに第１の光源および第２の光源によって放出される光パルスで交互に照明するようにし得る。光パルスによって照明される検査領域からの光を検出するようにし得る。第１の信号および第２の信号を生成するようにし得る。第１の信号は、第１の領域が第１の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表し、第２の信号は、第２の領域が第２の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表すようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用の検出システムが提供される。このシステムは、流路と、照明アセンブリとを備えるようにし得る。この照明アセンブリは、流路の検査領域を、液滴がこの検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するように構成し得る。第１のパルスは第２のパルスとスペクトル的に異なるようにし得る。このシステムはさらに、検査領域からの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器と、第１のパルスおよび第２のパルスで検査領域が照明される期間に検出される光を表すデータを収集する制御部とを備えるようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用の別の検出システムが提供される。このシステムは、流路と、流路の検査領域を、液滴がこの領域を通過するときに照明する光ビームを生成するように構成された照明アセンブリとを備えるようにし得る。このシステムはさらに、検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備えるようにし得る。この光ビームは、流路と交差する断面を細長くし得る。

液滴に基づくアッセイ用のさらに別の検出システムが提供される。このシステムは、流路と、流路の検査領域を、液滴がこの領域を通過するときに照明する光源と備えるようにし得る。このシステムはさらに、検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備えるようにし得る。光源が放出する光は、光源と検出器の間の少なくとも１つのスリットを通過して進むようにし得る。

液滴を検出する別の方法が提供される。この方法では、断面が細長い光ビームで流路の検査領域を照明するようにし得る。複数の液滴が検査領域を通過するときに、この領域から経時的に検出される光を表すデータを収集するようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用の別の検出方法が提供される。この方法では、少なくとも２つの別個の信号を生成するようにし得る。これら別個の信号は、液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す。これら少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するようにし得る。この混合信号を処理して液滴に対応する期間を特定するようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用のさらに別の検出方法が提供される。この方法では、少なくとも２つの別個の信号を生成するようにし得る。これら別個の信号は、液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長または波長帯の光を表す。これらの波長または波長帯の検出光は、個々の液滴中の異なる標的の存在の有無を示す。これら少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するようにし得る。この混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するようにし得る。これら識別された期間に検出された別個の信号の各々の値に基づいて、液滴が異なる標的の各々を含むかを判断するようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用のさらに別の検出方法が提供される。この方法では、少なくとも２つの信号を生成するようにし得る。これらの信号は、液滴を含む流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長帯の光を表す。これら少なくとも２つの信号の複数の値を混合して混合信号を形成するようにし得る。この混合信号の液滴に対応する部分を識別するようにし得る。これら識別された部分に対応する少なくとも２つの信号の値を処理して、どの液滴がどの標的を含むかを判断するようにし得る。

液滴に基づくアッセイ用の別の検出システムが提供される。このシステムは、少なくとも２つの異なる色素を含む液滴を運ぶ流体の流れからの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器を備えるようにし得る。このシステムはさらに、液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す別個の信号を生成し、これら少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成し、この混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するように構成された制御部を備えるようにし得る。

液滴用の検出するさらに別の方法が提供される。この方法では、第１の色素および第２の色素を含む液滴を準備するようにし得る。第１の色素の発光スペクトルおよび第２の色素の吸収スペクトルにより重なり合う波長帯が画定し、この重なり合いは、第１の色素が第２の色素の最大吸収波長で励起された場合に第１の色素からその発光最大値の少なくとも半分が生成される程度に大きくし得る。１つまたは複数のＬＥＤから放出され、第１の色素および第２の色素をともに励起し得る励起光で液滴を照明するようにし得る。この励起光は重なり合う波長帯の短波長側の区域のみを含むようにし得る。第１の色素および第２の色素が放出する光を検出するようにし得る。第２の色素が放出する光は、短波長側の区域から離れた重なり合う波長帯の長波長側の区域のみを含む波長域で検出されるようにし得る。

液滴を検出する別の方法が提供される。この方法では、光ビームを生成するようにし得る。この光ビームを主ビームおよび少なくとも１つのサンプリングビームに分岐するようにし得る。このサンプリングビームの強度を監視するようにし得る。この監視ステップから得られる１つまたは複数の測定値に基づいて、光ビームの強度を調整するようにし得る。流路の検査領域を、液滴がこの検査領域を通過するときに主ビームで照明するようにし得る。検査領域から検出される光を表すデータを収集するようにし得る。

本開示のさらなる態様は、以下の節、（Ｉ）液滴によるアッセイ用の検出システムの概要、（ＩＩ）パルス照明を備えた検出システム、（ＩＩＩ）スリットを備えた検出ユニット、（ＩＶ）混合信号による液滴の識別、（Ｖ）検出ユニットの光学配置、（ＶＩ）検査部位を離間させた検出システム、および（ＶＩＩ）選択された実施形態で説明する。

Ｉ．液滴によるアッセイ用の検出システムの概要
図１に、液滴によるアッセイまたは他の手段で区画したものによるアッセイを実施するためのシステムの例５０を示す。簡単には、このシステムは、試料調製ステップ５２、液滴生成ステップ５４、反応（例えば増幅）ステップ５６、検出ステップ５８、およびデータ解析ステップ６０を含み得る。このシステムを用いてデジタルＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）解析を実施することができる。より具体的には、試料調製ステップ５２は、臨床用または環境用などの試料を収集し、試料を処理して関連する核酸を放出させ、（例えば標的核酸を増幅するために）核酸を含む反応混合物を形成することを含み得る。液滴生成ステップ５４は、核酸を液滴中に封入することを含み得る。このステップでは、例えば、液滴１個につきほぼ１つの各標的核酸のコピーがあり、液滴はそれと混ざらない搬送流体、例えば油などの中に懸濁し乳剤を形成している。反応ステップ５６は、これらの液滴を適切に反応させ、例えば、温度サイクリングを実施してＰＣＲ増幅を誘起し、それによって、液滴中に標的核酸がもし存在すれば、その核酸を増幅してさらなるコピーを形成することを含み得る。検出ステップ５８は、液滴からの放射など、増幅があったか否かを示す何らかの１つ（または複数）の信号を検出することを含み得る。最後に、データ解析ステップ６０は、増幅が生じた液滴の割合（液滴の部分）に基づいて試料中の標的核酸の濃度を推定することを含み得る。本明細書で開示する検出システムは、図１のステップの任意の適切な組合せを任意の適切な順序で、ただし特に検出ステップ５８および／またはデータ解析ステップ６０を実施すればよい。本開示の検出システムに適したものとなり得る液滴によるアッセイシステムのさらなる態様は、先に列記した相互参照の項に記載されており、特に、２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３１７６８４号、２００６年５月９日に発行された米国特許第７０４１４８１号、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４ Ａ１号を参照により本明細書に組み込む。

液滴によるアッセイシステムでは、特に検出ステップ５８は、一般に、液滴自体および／または液滴の内容物を感知または検出することを含み得る。液滴自体の検出は、１個の液滴（または複数の液滴）の存在の有無を判断し、かつ／または、その液滴の１つ（または複数）の特徴、中でも例えば、液滴の大きさ（例えば、半径または体積）、形状、種類、および／または凝集状態を決定することを含み得る。液滴の内容物の検出は、内容物の性質（例えば、液滴が１つ（または複数）の標的を含んでいるか否か）、および／または、内容物の特徴（例えば、内容物がＰＣＲなどの反応を経ているか否か、任意のこのような反応の程度、など）を求めることを含み得る。液滴およびその内容物をともに検出し得る場合、これらの検出は独立にまたは並行して、任意の適切な順序で行ってよい。この検出は例えば、１つずつ順番に行うこともできるし（１回に１個の液滴）、並行して行うこともできる。あるいは、あるまとまりで行うことなどもできる。

一般に検出は、所望の情報が得られる、または得られるように処理し得る任意の１種（または複数種）の技術または１つ（または複数）の仕組みを利用して実施し得る。これらの仕組みは、中でも、光学技術（例えば、吸光度、透過率、反射率、散乱、複屈折、２色性、蛍光、燐光などの測定）、電気技術（例えば、バルク抵抗、導電度、容量などの測定）、および／または音響技術（例えば、超音波）を含み得る。蛍光技術は、中でも、蛍光強度、蛍光偏光（または蛍光異方性）（Ｆ／Ｐ）、蛍光相関分光（ＦＣＳ）、光退色後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）、内部全反射蛍光（ＴＩＲＦ）、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）、蛍光寿命、および／または蛍光イメージングを含み得る。

図２に、検出ユニットの例７０を示す。検出ユニット７０は、流路７６内に置かれた液滴７４からの光７２を検出する。この検出ユニットは、少なくとも１つの照明アセンブリ７８および少なくとも１つの集光アセンブリ８０を含み得る。光は、紫外放射、可視光、赤外放射、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

液滴の直径は、流路に対して任意の適切な値とし得る。例えば、液滴の直径は、流路の直径とほぼ同じと（例えば、流路よりもわずかに大きくまたは小さく）することができる。相対的な大きさをこのように設定すると、各液滴を流路のほぼ中心に置くことができ、それによって、液滴が中心からずれることによって生じ得る測定のばらつきがなくなる。あるいは、流路の直径は、液滴の直径よりもかなり大きく、例えば少なくとも約５０％大きくすることができる。この場合、一部の液滴は、検出時に中心からずれていることがあり、そのため、信号強度が変化し得る。

照明アセンブリ７８は、光源８２、８４などの少なくとも１つの光源が生成する少なくとも１つの光ビーム（放射とも称する）で流路７６を照明するためのものである。照明はさらに、またはそれとは別に照射とも言い、光源はさらに、またはそれとは別に放射源と言うこともできる。光源の例には、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザなどが含まれる。各光源は、特定の波長または波長域で放射を放出するように構成された励起源とし得る。マルチ光源励起システムにおける各光源は、それぞれ異なるスペクトル特徴を有する放射を放出してこれら様々なスペクトル特徴に応答する蛍光体と反応するように構成し得る（がそうしなくてもよい）。例えば、励起源は、複数の異なる波長で振幅がピークになる放射、すなわち異なる色の放射を放出するように構成されたＬＥＤとし得る。各光源からの光は、照明光学素子８５を介して流路７６まで伝達し得る。この照明光学素子は、各光源が放出する光のスペクトル特徴を、例えば照明に使われる波長域だけを取り出すことによって改変し得る。

集光アセンブリ８０は、照明アセンブリ７８による流路の照明に応答して生成される光など、流路７６からの光を集め、検出するためのものである。集光アセンブリ８０は、検出器８６、８８などの少なくとも１つの検出器と、流路からの光を透過して１つ（または複数）の検出器まで伝達する集光光学素子９０とを含み得る。検出器の例には、光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＭＯＳ素子などが含まれる。このように、各検出器は点検出器または像形成検出器とし得る。これらの検出器の少なくとも１つは、前方散乱光などの散乱光を検出するように構成された散乱検出器とし得る。散乱検出器からは、液滴の大きさ（例えば、体積および／または直径）についての情報を、場合によっては液滴が一定速度で移動しているという仮定の基で得ることができる。散乱検出器および液滴からの散乱光の検出のさらなる態様が、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４ Ａ１号に記載されており、これを参照により本明細書に組み込む。

照明光学素子８５および集光光学素子９０はそれぞれ、（光学素子８５の場合は）各光源から流路７６に、また（光学素子９０の場合は）流路から各検出器に光を伝達する１つまたは複数の光学要素を含み得る。したがって、照明光学素子は各光源から流路まで進む光の光路を画定し、集光光学素子は流路から各検出器まで進む光の光路を画定し得る。各光路は、分岐させてもよいし、させなくてもよい。検出ユニットで２つ以上の光源を用いる場合、照明光学素子８５は、これらの光源からのビームを結合してもよい。こうすると、流路に入射する放射が複数の光源からのビームを結合したものになる。結合ビームの場合、複数の光源からの個々のビームが互いに重なり合う。検出器ユニットで２つ以上の検出器を用いる場合、集光光学素子９０は、流路から入射し集められた光（例えば放出光）を分岐してもよく、こうすると、集められた光の一部が各検出器に送られる。場合によっては、単一の検出器ユニット内で、照明光学素子が複数の光源からのビームを結合し、集光光学素子が集められた光を複数の検出器に分配してもよい。あるいは、いくつかの実施形態では、照明光学素子でビームを結合するか、集光光学素子で集められた光を分岐するかのいずれか一方とし、ともには行わなくてもよい。

光学要素は、数ある機能の中でも、光を集め、方向付け、かつ／または結像させ、かつ／または選択的に望まれない光を遮蔽する任意の構造または素子とし得る。光学要素は、任意の適切な仕組みによって機能させることができる。これらの仕組みには、数ある中でもとりわけ、光の屈折、反射、回折、遮蔽、および／またはフィルタリングが含まれる。光学要素の例には、レンズ、ミラー、回折格子、プリズム、フィルタ、ビームスプリッタ、透過ファイバ（光ファイバ）、開口、拡散板などが含まれる。流路７６の壁も光学要素として働き得る。例えば、照明光を結像して集光する助けとなる円筒レンズを形成するチューブによって流路を画定することもできる。

検出ユニット内で照明光学素子および／または集光光学素子を使用しない場合もある。例えば、いかなる１つ（または複数）の光学要素も介在させずに、光源からの光ビームを直接、流路まで進ませてもよい。あるいは、またはそれに加えて、いかなる１つ（または複数）の光学要素も介在させずに、流路からの光を直接、検出器（例えば、流路に近い検出器）まで進ませてもよい。

照明アセンブリおよび集光アセンブリは協働して流路の検査領域９２を画定する。この検査領域は、１つ（または複数）の照明アセンブリによって照明される流路の任意の１つまたは複数の部分を含み、検査領域からの光は、１つ（または複数）の集光アセンブリによって検出される。したがって、検査領域は、連続したものでも不連続なものでもよい。後者の場合、２つ以上の離間した検査部位が存在し、これらが合わさって検査領域が形成される。場合によっては、検査領域の重なり合う部分または体積を少なくとも２つの光源（および／またはスペクトル的に互いに異なる光パルス）で照明してもよく、かつ／または、検査領域の重なり合う部分または体積からの光を少なくとも２つの検出器で検出してよい。こうした重なり合う部分は、重なり合いが５０％より大きい場合には同じ部分と見なし得る。

液滴７４は、連続相９８を含む乳剤９６の分散相とし得る。乳剤、液滴、および乳剤の連続相は、検査領域９２を通過させるように流路に沿って移動させることができる。この動きを矢印１００で示す。したがって、液滴を運ぶ流体の流れから光を検出し得る。この場合、液滴は、例えば図示するように１つずつ順番に検査領域を通過する。液滴は、１列で互いに離れて検査領域を通過させることができ、こうすると、個々の液滴が検査領域を通過するときにこれらの液滴から光を検出することができる。液滴は、検査領域の上流に配設される少なくとも１つの分離器（個別器とも称する）を通過させることによって互いに分離することができる。流れが集中する領域となり得る分離器により、液滴を１列に並べることができる。あるいは、またはそれに加えて、この分離器で、乳剤に搬送流体（例えば追加の連続相）を加えることによって液滴を含む乳剤を希釈してもよい。分離器の構造には様々なものがあるが、中でも例えば、十字形構造およびＴ字形構造が挙げられる。検査領域は、この分離器に比較的近づけてよい。例えば、検査領域は、分離器の分離領域または合流領域から、液滴または流路の直径で約１００個、５０個、２５個、または１０個未満離れたところとする。

液滴（および／または乳剤）から集められる光１０２（例えば放出光）は、照明アセンブリからの入射光１０４（例えば励起光）に応答して生成されるようにし得る。流路から集められる光１０２および流路への入射光１０４のそれぞれの光路１０６、１０８の方向関係は任意の適切なものとし得る。ここでは、図の表示を簡略化するために、入射光路（１０８）および集光光路（１０６）を透過構成として示し、照明および集光が流路の両側で行われるようにする。他の構成例では、集光は、照明を横切るように（例えば直交して）行うか、または反射構成で行う。反射構成では、照明および集光の方向は互いに逆平行になる。

検出ユニット７０は、１つまたは複数の光源および１つまたは複数の検出器の任意の適切な組合せを含み得る。例えば、単一光源を単一検出器とともに用いることもできるし、単一光源を複数の検出器とともに用いることもできる。また、２つ以上の光源を単一検出器とともに用いることもできるし、２つ以上の光源を２つ以上の検出器とともに用いることもできる。

いくつかの実施形態では、検出ユニット７０は、特定の波長または波長域の放射を放出するように構成された光源８２を１つだけと、少なくとも２つの検出器８６、８８とを含み得る。集光光学素子９０は、検査領域９２から集めた放射を分岐して、各検出器に放射の適切な部分を受光させるようにし得る。照明された液滴から放出される光は、ビームスプリッタによって分岐してもよいし、かつ／または、１つまたは複数のフィルタによってフィルタリングしてもよい。こうすると、特定の波長域の放射のみが特定の検出器に到達することになる。複数の色素の検出ではそれらの発光スペクトルが重なり合う可能性があるが、上記の構成ではこの状態で複数の色素の検出が可能になる。照明される液滴中に１つまたは複数の標的が存在する場合、これらの標的のレポータは、単一光源から入射する放射によって励起され、特定の波長または波長域の蛍光を発する。得られる蛍光の特徴（すなわち色）は、液滴中に存在する標的によって、または複数の標的の組合せによって決まる。

検出システムの１つまたは複数の検出ユニットは、任意の適切な波長の光で検査領域を照明するようにし得る。重なり合うかまたは離れた複数の照明体積における照明光は、紫外放射、可視光、赤外放射、またはこれらの任意の組合せとし得る。また、複数の検出ユニットは、重なり合うかまたは離れた複数の検出体積からの紫外放射、可視光、および／または赤外放射などの任意の適切な波長の光を検出することができる。例えば、いくつかの実施形態では、液滴が含み得る吸収色素または蛍光色素は、紫外放射、可視光、または赤外放射で励起または照明されると、赤外域（中でも例えば、近赤外または短波長赤外）の光を吸収かつ／または放出する。液滴マーカとし得る赤外色素は、検出される赤外放射を表す信号の液滴領域（ひいては液滴）を識別するために使用するものであり、かつ／または、機器較正用（例えば、検出器利得調整用）の内部参照として機能し得る。あるいは、赤外色素は、液滴中の標的レポータ（例えばプローブ）とし得る。赤外色素を用いると、検出に利用可能な波長域が広がり、そのため、中でも、ハイレベルの多重化、より正確な液滴識別、またはこれらの組合せが可能になる。

１つまたは複数の検出ユニットを用いると、互いに異なる複数の検出構成が得られる。検出構成は一般に、光源、照明光学素子（使用する場合）、集光光学素子（使用する場合）、および検出器の動作可能な組合せを含む。したがって、複数の異なる検出構成を得るには、中でも、照明に用いる光源、光源からの照明光をフィルタリングするのに用いる１つ（または複数）の波長フィルタ（ある場合）、検査部位から集められた光をフィルタリングするのに用いる１つ（または複数）の波長フィルタ（ある場合）、またはこれらの任意の組合せを変更する。場合によっては、別々の信号をそれぞれ異なる検出構成から生成してもよいし、かつ／または、複数の信号をそれに対応する数の異なる検出構成から生成してもよい。２つ以上の検出構成を用いる場合、それぞれの検出構成は、液滴中に存在する複数の色素に対して複数の異なる感度をもつようにし得る。例えば、２種類の色素を用いるアッセイにおいて、２つの異なる検出構成から生成される２つの別々の信号をデコンボルーションしてそれぞれの色素に特異な信号を推定することができる。

図３に、図２の検出ユニット７０を含む検出システムの例１２０を示す。この検出システムはさらに、フルイディクス１２２、照明アセンブリ用の１つまたは複数のフィードバックセンサ１２４（監視センサという用語も用いる）、および少なくとも１つの制御部１２６を含み得る。

フルイディクス１２２は、流路７６とともに用いるものであり、フルイディクス要素の任意の適切な組合せを含み得る。これらのフルイディクス要素は、流路を通して流体の流れを駆動するための少なくとも１つのポンプ１２８、流路に流入し、それを通過し、かつ／またはそれから流出する流れを調節または方向付けるための１つまたは複数の弁１３０、流路７６と連通する他の流路などを含み得る。これら他の流路は、希釈流体を追加して、検査領域の上流に配設された１つまたは複数の液滴分離器（例えば、Ｔ字形または十字形の分離器／個別器１３２）のところで液滴を互いに分離するための１つまたは複数の希釈流路を含み得る。

フィードバックセンサ１２４は、各光源からの光のサンプリング強度を検出するようにし得る。場合によっては、照明光学素子は、１つ（または複数）の光源からのビームを分岐して照明ビームおよびサンプリングビームにしてもよい。サンプリングビームは、流路７６ではなくフィードバックセンサ１２４に向けてサンプリング光学素子１３４を介して送ることができる。このセンサはサンプリングビームの強度を監視するものであり、サンプリングビームの強度は照明ビームの強度に比例している。サンプリングビームは、光源からの主光ビームから、照明光学素子の光路に沿った任意の位置、例えば、１つまたは複数のフィルタによって照明波長帯が画定される前または画定された後で分岐するようにし得る。センサ１２４からの強度情報は、制御部１２６に送信するようにし得る。制御部１２６は、光源に供給される電圧または電力を調整して、ある期間にわたって、例えば、１つのアッセイ内またはアッセイとアッセイの間で光源の強度をより一定に維持するようにし得る。言い換えれば、光源、フィードバックセンサ、および制御部はフィードバックループを形成して、温度変化、光源の古さなどに対して照明強度をより一定に維持し得る。照明波長帯が画定された後の位置にフィードバックセンサを配置すると特に有利となり得る。というのは、ある種の光源（ＬＥＤなど）は、中でも温度変化や光源の古さにより発光最大値の波長がシフトすることがあるからである。波長帯が画定された後でサンプリング光を検出すれば、照明強度に及ぼすスペクトル変化の影響がセンサによって測定されるので、このフィードバックループにより照明強度をより一定に維持することができる。フィードバックセンサの例には、様々な候補の中でもとりわけ、フォトダイオードなど本明細書で開示する検出器のいずれかが含まれる。下記の第Ｖ節で、光源強度を監視するさらなる態様を説明する。

制御部１２６は、光源、照明光学素子、フルイディクス、集光光学素子、検出器、フィードバックセンサ、またはこれらの任意の組合せなど、システムの任意の他の構成要素の動作を制御し、これらの構成要素からの入力を受信し、かつ／または、他の方法によりこれらの構成要素とやりとりすることができる。例えば、制御部は、各光源にどのくらいの電力をいつ供給するかを制御し（例えば、各光源をいつオンオフするかを制御し）、各検出器の感度を（例えば、利得を調整することによって）制御し、検出された光からの信号生成を制御し、光学素子のシャッタ機能を制御し、かつ／または、これらの任意の組合せを制御するようにし得る。あるいは、またはこれに加えて、制御部は、他の機能の中でもとりわけ、検出器固有の信号および／または周期的な信号の生成を制御し、信号に対して液滴識別処理を行い、識別された各液滴を解析から排除すべきかどうか、かつ／または識別された各液滴が１種または複数種の標的を含んでいるどうかを判断し、１種または複数種の標的の濃度を推定し、またはこれらの任意の組合せを行うようにし得る。制御部は、データを処理するための１つまたは複数のプロセッサ（例えば、中央／コンピュータ処理装置（ＣＰＵ）という用語も使われるデジタルプロセッサ）を含み得る。制御部はまた、これらのプロセッサを支援し、かつ／または補助する追加の電子コンポーネント、例えば、増幅器、周波数フィルタ、アナログ／デジタル変換器、バス、１つまたは複数のデータ記憶装置などを含み得る。制御部は、ディスプレイ、キーボード、タッチスクリーン、マウスなどの任意の適切なユーザインターフェースに接続し得る。

ＩＩ． パルス照明を備えた検出システム
この節では、励起光の時間多重（例えば、パルス照明）および／または発光読取値の時間多重を利用して、吸収および発光のスペクトルが重なり合う状態で、蛍光色素からの光の「単一点」検出を行う検出システムの例を図４〜８を参照して説明する（蛍光色素とは蛍光体を含む化合物である）。

蛍光放出が生じる波長域は、場合によっては重なり合うことがある。例えば、いくつかの実施形態では、同じ（または異なる）液滴中に２つ以上の蛍光体が存在し得る。この場合、１つの蛍光体の励起スペクトルは別の蛍光体の吸収スペクトルと重なり合っている（例えば、第１の蛍光体は青色光を吸収し緑色光を放出するが、第２の蛍光体は緑色光を吸収し赤色光を放出し得る）。このような場合、これら２種の蛍光体からの光を分離して検出することが望ましい。こうした分離は、蛍光体を空間的に分離するか（例えば、異なる蛍光体を含む異なる液滴を空間的に分離する）、かつ／または、蛍光体からの発光を時間的に分離する（例えば、最初に１つの種類の蛍光体を励起しこの蛍光体からの蛍光を検出し、次いで異なる種類の蛍光体を励起しこの蛍光体からの蛍光を検出する）ことによって行う。

図４に、上記のタイプの重なり合いを有する１対の色素の例のスペクトル特性を表すグラフを示す。このグラフは、本明細書で開示する検出システムで使用し得る色素の吸収スペクトルと発光スペクトルを正規化して示したものである。吸収スペクトルはここでは、各色素の励起スペクトルを表すために用いている。これらの色素は、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）およびＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）であり、これらは、実時間ＰＣＲアッセイ用のＴＡＱＭＡＮプローブなど、蛍光オリゴヌクレオチドプローブ用の標識として一般的なものである。ＦＡＭ色素およびＶＩＣ色素と類似の問題が生じ得る他の一般的な標識は他にもあるが、中でも、ＴＡＭＲＡ色素およびＲＯＸ色素が挙げられる。

ＦＡＭ色素およびＶＩＣ色素は、液滴を用いた「２色」アッセイ用の標識として使用し得る。これらの標識からの発光は区別可能であり、それによって例えば、各液滴中の２つの異なる標的の存在の有無がわかる。しかし、これらの色素は、それぞれのスペクトルが重なり合うという問題１４０が生じる。つまり、ＶＩＣ色素の吸収スペクトルとＦＡＭ色素の発光スペクトルはほぼ重なり合い、これらのスペクトルはほぼ同じ波長で最大になる。重なり合い１４０は、それぞれのスペクトルがその最大値の２０％以上の値で重なり合う波長帯として定義され、ここでは重なり合いの幅は約４５ｎｍである。したがって、ＶＩＣ色素の励起に適した比較的広い波長帯の光（すなわち、重なり合い１４０）は、ＦＡＭからの発光として誤って検出されることがあり、そのため、誤ったまたは不正確な結果が得られることになる。また、ＶＩＣ発光を検出するのに十分な感度が得られ、かつＦＡＭ発光と十分に区別されるようにＦＡＭ色素およびＶＩＣ色素の励起波長および発光波長を選択するのは難しいことがある。言い換えると、「ＶＩＣ」検出構成を用いて検出される強い発光が、ＶＩＣ発光を放出した液滴によるものか、または、このＶＩＣ検出構成によって取得される強いＦＡＭ発光を放出した液滴によるものかどうか、あるいはその両方かを判断することは難しいことがある。

重なり合い１４０によって生じる問題は、ＦＡＭ色素およびＶＩＣ色素からの発光を、検出システムの検査領域内の空間的にずれたそれぞれの検査部位で検出することによって解消することができる。言い換えると、ＦＡＭ色素からの発光は、ＦＡＭ選択励起に応答して一方の検査部位で選択的に検出し、ＶＩＣ選択励起後にＶＩＣ色素からの発光を他方の部位で検出すればよい。しかし、このように検査部位を離すことによって、これら２つの部位からの蛍光データを相関させるという問題が生じ得る。具体的には、一方の部位からの液滴信号を他方の部位からの液滴信号と揃えるまたは合わせることは難しいことがある。というのは、液滴同士の相対的な間隔、ひいては液滴がこれらの部位間を移動するのに要する時間はばらつくことがあるからである。言い換えると、液滴は、検査領域を通って移動する際に互いに対して相対的に速くなったり遅くなったりする。別の言い方をすると、これらの部位からの液滴信号は、オフセットを１回実施するだけでは互いに合わないことがある。したがって、検査部位を離して行う液滴による２色アッセイでは、２つの標的が複数の液滴の中で互いにどのように分布しているか判断できないことがある。

光源にレーザを用いると、重なり合い１４０によって生じるこれらの問題の一部または全部を解消することができる。レーザは、高強度の励起光を単一波長で提供することができ、そのため、対応する色素からの蛍光放出が比較的強くなるように励起し得る。レーザによる励起は単一波長で行い得るので、発光の検出に利用可能な残りの重なり合わない波長域の広さが大きく制限されることはない。また、レーザによって励起され放出される蛍光は強いので、比較的狭い波長帯から十分な量の発光を集めることができる。このことも、励起光と発光の重なり合いをなくす助けになる。レーザには上記その他の利点があるが、液滴によるアッセイに使用するのに十分な強度のレーザは高価であり、場合によっては危険なことがある。

発光ダイオード（ＬＥＤ）は、はるかに安価で安全な蛍光測定用の光源である。しかし、ＬＥＤは、いくつかの理由により、蛍光アッセイに用いるには多くの場合非実用的に思われる。第１に、ＬＥＤはレーザに比べて強度が低く、そのため、発光レベルが低く検出できないことがある。このことは、色素からの発光の大部分を捨てる（すなわち、フィルタリングして捨てる）ことによって励起光または別の色素からの発光との混合を最小限に抑えるかゼロにする場合に大きな問題になることがある。第２に、ＬＥＤは比較的広い波長域の光、例えば最大で５０ｎｍ幅以上の光を放出するのに対し、レーザは単一波長光源である。したがって、検出波長帯にＬＥＤ励起光を混合させないようにするのは難しいことがある。このことは、上記の理由から、ＦＡＭ色素やＶＩＣ色素などの２色アッセイにおいて大きな問題になる。第３に、ＬＥＤが生成する光のスペクトルは一定ではない。例えば、ＬＥＤの最大波長および／またはそのスペクトル分布の形状は、数ある要因の中でもとりわけ、温度、ＬＥＤ自体の物理的な変化（例えば古くなることによる変化）、またはＬＥＤを動作させるのに用いる電圧に応じて変化することがある。光源としてのＬＥＤに固有のこれらの問題は相まって、液滴による２色アッセイにＬＥＤを用いるのは不可能なように思える。スペクトルの重なり合い１４０を有する１対の色素とともに用いるときは特にそうである。

パルス照明によれば、本明細書で開示するように、ＬＥＤを用いることによって生じるこれらの問題の一部を解決し得る。複数の光源からの放射をほぼ同じ空間的な位置で液滴と交差するように構成すればよい。これは、例えば、ある波長域を透過し、他の波長域を反射するダイクロイック面を採用することによって可能である。この場合、複数の励起光源を順次パルス化して、一回にこれらの光源の１つのみからの放射が励起領域に到達するようにするのが望ましいことがある。こうすると、任意の所与の瞬間に１つの励起光源に対応する明確な発光信号を検出することができる。特定の波長域内の放射が特定の検出器に到達することになる。そのため、同じ液滴からの潜在的に重なり合う複数の発光信号を検出することができ、それによって、その液滴内に複数の異なる標的が存在することがわかる。乳剤中の各液滴が励起領域を通過し、そこから出る前に各光源からの放射に少なくとも一度または複数回露光されるのに十分に高速にこれらの光源をパルス化することができる。

異なる蛍光体にあてる照明をパルス化する周波数は、それぞれの蛍光体の寿命によって決まる（または少なくともそれを基にしてわかる）。具体的には、１種類の蛍光体を励起した後で別の種類の蛍光体を励起（かつ／または検出）する前に、少なくとも数期間分（例えば、２、３、５、１０、またはそれ以上）の蛍光寿命だけ待ち、それによって、第１の種類の蛍光体からの蛍光が別の種類の蛍光体を励起（かつ／または検出）する前に十分に減衰するようにして、信号があまり混ざらないようにするのが妥当である。実施形態の例では、一般的な蛍光体（中でも、蛍光寿命がナノ秒程度のもの）に対してキロヘルツ以上の高周波数パルスを得ることができる。

図５に、パルス光源などからのパルス照明を利用する検出システムの例１５０を示す。代替実施形態では、照明光学系８５は、連続光源が生成する１つまたは複数の連続ビームから生成される光パルスを透過させる。例えば、光学系８５は、光源からの連続光ビームを遮蔽して光パルスにする電気光学シャッタを含み得る。さらに別の実施形態では、照明をパルス化しないこともある。

システム１５０は、色素を区別するために空間的に離れた検査部位に対応する１対の光源を備えたシステムと同じ利点を提供し得る。このシステムには、これらの部位からのデータを互いに相関させることができないという潜在的な欠点がない。さらに、システム１５０では、光源としてＬＥＤを用いることができる。システム１５０は、図３の検出システム１２０など、本明細書の他の箇所で開示する検出システムの要素、態様、および特徴の任意の適切な組合せを含み得る。

検出システム１５０は、１対の（または２対以上の）パルス化した光源、例えば、パルス光源１５２および１５４を含み得る。各光源は、他の１つ（または複数）の光源と異なる（単一）波長または波長域の光を放出し得る。あるいは、これらの光源には同じ波長域の光を放出させる代わりに、放出光は各光源ごとに異なるフィルタリングを受けるようにしてもよい。システム１５０の照明アセンブリ７８は、パルス光源および／また光学系８５により、スペクトル的に別個のパルス光で交互に検査領域９２を照明するように構成し得る。スペクトル的に別個の複数のパルスは、とりわけ、最大値をとる波長が異なり、カバーする波長域が異なり、かつ／または、スペクトル分布の形状が異なる。

検出システム１５０は、パルス光源１５２、１５４および検出器８６、８８を用いて、あたかも２つの空間的に分離した検査部位が形成されるようにし得る。各光源からの光パルスは、検出器からの周期的なデータ収集と同期させることができる。各パルス照明源はそれに対応する検出器を有するようにすることができ、これを同じハッチングパターンで示す。光源１５２は検出器８６と動作可能に対になっており、光源１５４は検出器８８と動作可能に対になっている。光源１５２および検出器８６によって画定される検査部位は、光源１５４および検出器８８によって画定される検査部位と重なり合うようにし得るが、これらの光源／検出器対からの信号は、時間ずらし検出および／また検出器からのデータの時間ずらし収集によって時間的に区別することができる。

このシステムの制御部は、これらの光源および検出器（および／また光学素子）と動作可能に接続し得る。制御部は、各光源／検出器対ごとに別個の周期信号を生成し得る。光源／検出器対に対応するこの周期信号は、光源からの光パルスによる照明の期間は少なくとも他に優先してまたは排他的に検出器からデータを周期的に収集することに起因するものである。あるいは、またはそれに加えて、周期信号は、光源からの光パルスに同期して検出器の利得を周期的に変化させることや、集められる光を検出器にパルス的に透過させることを光源からの照明パルスに同期させることに起因する。いずれにしても、周期信号は、検査部位が複数の光源の１つからのみ放出される光によって少なくとも他に優先してまたは排他的に照明される期間に検出される光を表し得る。別の言い方をすれば、周期信号は、ある検出器に対応する光源によって検査部位が照明されるときに、この検出器によって複数の離間した期間に少なくとも他に優先してまたは排他的に検出される光を表し得る。

照明光学系８５および／また収集光学系９０は、照明および検出に用いる光の波長帯を制限または画定する助けになり得る。

光源１５２、１５４は、照明フィルタ１５６、１５８などの少なくとも１つの専用（または共用）の波長フィルタに動作可能に接続し得る。これらのフィルタは、それぞれの光源から流路７６への光路の専用の分岐部分に、すなわち、複数の光源からのビームが混合要素１６０（例えばダイクロイック要素）で混合される前に配設することができ、そのため、各フィルタは複数の光源の１つからの光にのみ影響を及ぼす。照明フィルタ１５６、１５８の機能は、光源の発光スペクトルの少なくとも１つの端部を取り除くことであり、かつ／または、液滴中の特定の色素を選択的に励起し得るように光源の能力を改善することである。言い換えると、これらのフィルタは、２つ以上の色素が区別されるように励起光の能力を改善し得る。

検出器８６、８８は、集光フィルタ１６２、１６４などの少なくとも１つの専用（または共用）の波長フィルタに動作可能に接続し得る。これらのフィルタは、流路７６からそれぞれの検出器への光路の専用の分岐部分に配設することができる。言い換えると、各フィルタは、ビームスプリッタ１６６（例えばダイクロイックフィルタ）と検出器の間に配設され得る。集光フィルタ１６２、１６４は、異なる波長帯の検出光１６８、１７０を透過してそれぞれの検出器に導くように機能し得る。したがって、これらの集光フィルタは、それぞれの検出器が液滴中の特定の色素からの発光を選択的に受け取るように構成し得る。あるいは、またはそれに加えて、これらの集光フィルタは、照明フィルタと協働して、入射光１０４と検出光１６８、１７０の波長の重なり合いを防ぐように構成し得る。いくつかの実施形態では、システム１５０は、液滴から散乱する光を検出する散乱検出器も含み得る。こうすると、検査領域を通過する個々の液滴の大きさを求めることができる。

図６に、一連のグラフ１８０〜１８４を示すが、これらのグラフはいずれも同じ時間範囲を表し、光源１５２、１５４からの照明と同期した周期データを示すものである。図の表示を簡略化するために、グラフ１８０および１８２では、光源１５２および１５４を恣意的にそれぞれ「光源１」および「光源２」と示す。また、光源１からの光による照明パルス期間に検出される光を表すデータを「信号１」とし、光源２からの光による照明パルス期間に検出される光を表すデータを「信号２」とする。

グラフ１８０、１８２は、光源１および２からの光による交互光パルス１８６、１８８を示す。各パルス１８６、１８８は休止期間１９０または１９２に続いて生じ、各光源からの光パルスは、複数の離間した期間１９４に生じる。各光源からの光による照明パルスは、一連の休止期間によって分離することができ、この休止期間には、概ね光源はほとんど光を放出（または伝達）しないか、あるいは全く放出せず（例えば、光源を繰り返しオンオフするか、あるいは、電気光学シャッタを繰り返し開閉し）、各パルスおよび各休止期間が１つのパルスサイクル１９６を画定する。ある光源によるこれらの照明用のパルスおよび休止期間は、ほぼ同じ長さとすることもできるし、異なる長さとすることもできる。また、複数の光源による照明パルスは、互いに同じ長さとすることもできるし、異なる長さとすることもできる。複数の光源による照明パルスは、互いに同じ周波数（例えば、１秒当たりのパルス数）とすることができ、こうすると、パルスサイクルは同じ長さとなるが、互いに時間的にオフセットされるため、複数の光源からの照明パルスが交互に配置される。例えば、一方の光源は他方の光源が休止するたびに光パルスを放出することができ、逆も同様である。複数の光源からの照明パルス間の時間オフセットは、１パルスサイクルの継続時間のほぼ半分とし得る。複数の光源からの光パルスを交互に配置するやり方はいろいろあるが、中でも、（図示するように）照明が行われない短い時間ギャップをパルス間に含めてもよいし、時間ギャップなしで連続して次々とパルスを生成してもよい。あるいは、パルス同士をわずかに重なり合わせてもよい。各光源からのパルス照明は、任意の適切な周波数で生成することができ、例えば中でも、少なくとも約１００Ｈｚ、１ｋＨｚ、１０ｋＨｚ、または１００ｋＨｚで生成することができる。実施形態の例では、各光源からの光による照明パルスを約１００ｋＨｚの周波数で生成することが多い。この場合、パルスサイクルは１０マイクロ秒とすることができ、パルスおよび休止期間はそれぞれ約５マイクロ秒継続することになる。他の実施形態では、中でもとりわけ、各パルスを約１ミリ秒未満継続させることもあるし、各パルスを約１００マイクロ秒、１０マイクロ秒、１マイクロ秒未満しか継続させないこともある。

場合によっては、照明パルスの周波数は、各光源からの光による少なくとも１つのパルスすなわち２つ以上のパルスで各液滴を照明するように選択し得る。したがって、検査部位における液滴の滞留時間および各液滴ごとの所望の測定数（例えば信号値の数）によって適切なパルス周波数が決まり得る。液滴が検査部位を横切るのに要する時間よりもパルスレートを速くすることができ、それによって、液滴は少なくとも１回すなわち複数回、光源からの光で照明される。液滴が小さいとき、かつ／または液滴が速く移動するときはパルスレートを速くしてもよい。パルスレートが速い場合には、より高速な検出器が必要になることがある。

グラフ１８４は、検出器８６、８８（図５参照）によって検出される光から生成される周期信号２１０、２１２がパルス１８６、１８８と同期している様子を示す。（２１０で示す）周期信号１は、光源１（光源１５２）からの光による照明パルスの期間、少なくとも他に優先してまたは排他的に検出器８６によって検出される光から生成され、（２１２で示す）周期信号２は、光源２（光源１５４）からの光によるパルスの期間、少なくとも他に優先してまたは排他的に検出器８８によって検出される光から生成されるようにし得る。

グラフ１８４では、信号１または２のうち、標的に対して陽性を示す液滴（すなわち、信号２では「液滴Ａ」であり、信号１では「液滴Ｂ」）が存在するために他の部分より強くなっている部分に注目している。各液滴は、信号１または２からの２つまたは３つの信号値２１６によって表される。いくつかの実施形態では、各パルス期間内の異なる時間に検出される光から２つ以上の信号値２１６を生成し得る。

照明パルス周波数は、各光源からの少なくとも１つすなわち２つ以上のパルス光で各液滴が照明されるように選択し得る。したがって、検査部位に液滴が留まる時間および各液滴ごとに望まれる（それぞれ異なるパルスからの）信号値の数によって適切なパルス周波数を決めることができる。実施形態の例では、各光源ごとに１００ｋＨｚで照明をパルス化し得る。１秒につき１０００個の液滴が検査部位を通過し得るが、これらの液滴は平均で液滴２個分の直径だけ互いに分離することができ、各光源からの光による３０個の照明パルスの期間に、各液滴ごとの各信号につき約３０個の信号値を生成し得る。

図７に、システム１５０用の制御部の例２３０を示す。制御部２３０は、図３の制御部１２６など、本明細書の別の箇所で説明する特性、構造、または特徴の任意のものを有し得る。制御部は、構成要素として中でも、ゲート２３２、増幅器２３４、低周波数透過フィルタ２３６、アナログ／デジタル変換器２３８、およびプロセッサ２４０の任意の組合せを含み得る。これらの構成要素のいずれも検出器８６専用とすることもできるし、検出器８８と共用することもできる。増幅器２３４は、検出器から受け取った信号を増幅し得る。フィルタ２３６は、信号の高周波数成分を除去して信号対雑音比を改善し得る。変換器２３８は、アナログ信号をデジタル信号に変換し得る。プロセッサ２４０は、このデジタル信号を操作かつ／または記憶することができる。

ここで示す構成では、制御部２３０は、一方の検出器、すなわち、検出器８６（「検出器１」）のみによって検出される光２４２から信号値を生成しているところである。制御部の各構成要素とプロセッサ２４０の間を延びる一連の矢印で信号の生成を示す。下側の制御部の構成要素に矢印がないのは、検出器８８からは信号が生成されていないことを示す。

光源１５２からの光パルスの期間に第１の色素２４４からの光２４２を他に優先して検出し得る。制御部２３０は、他方の検出器（検出器８８（「検出器２」））によって検出される望まれない光２４６から信号値を生成しておらず、光源１５４はオフになっている。望まれない光２４６は様々な仕組みによって生成されることがあるが、中でも、第１の色素２４４からの発光２４８や、光源１５２からのパルス光を吸収し得る第２の色素２５２からの発光２５０である。

ゲート２３２は、各検出器からの信号生成がその検出器に対応する光源からの光による照明パルスと同期するように構成される。このゲートは、各照明パルス期間に信号が生成され、特にこの信号の１つまたは複数の信号値が生成され、このパルス期間には他方の検出器からは信号が生成されないように構成し得る。この図ではゲートは、検出器８８によって検出される光からは信号が生成されず、検出器８６から信号が生成されるようにしている。これに続く光源１５４からの光パルスの期間では、想像線２５４で概略的に示すように、ゲート２３２によりこれらの検出器による信号生成が逆になる。ゲート２３２は、照明スケジュールに対応する時間スケジュールに従って動作し得るので、時間ゲートと言うこともできる。

このゲートは、任意の適切な１つ（または複数）の構成要素に対して、信号生成を許可するか、または許可しないように動作し得る。例えば、このゲートは、例えば検出器８６、８８の利得をそれぞれの光パルスにほぼ同期させて交互に増減するによって検出器自体の動作を制御することができる。場合によっては、このゲートは、ある照明パルス期間に集められた光が誤った検出器（すなわち、図７の構成では検出器８８）に届かないようにする光ゲート、例えば電気光学シャッタとし得る。あるいは、このゲートは、ある検出器によって検出されるほぼ連続した信号をこの検出器に対応しない光源からの照明パルスにほぼ同期して周期的に処理しないことによって、この連続信号を周期信号に変換してもよい。この連続信号はアナログでもデジタルでもよく、ゲート２３２によってアナログまたはデジタルの形式の連続信号を処理しないようにし得る。このゲートは様々な処理がなされないようにし得るが、例えば中でも、検出器から増幅器２３４への連続信号の入力、増幅された連続信号のフィルタ２３６への入力、またはフィルタリングされた信号の変換器２３８への入力がなされないようにし得る。場合によっては、プロセッサ２４０が、例えば、信号値を選択的に取り除いて周期信号を生成することによってデジタル的に連続信号を処理し得る。ただし、アナログフィルタ２３６を通した後で連続信号をデジタル処理によって周期信号に変換するのは望ましくないことがある。アナログフィルタから得られる周期信号の質は劣化していることがある。というのは、アナログフィルタは、連続信号の各部分を一緒に劣化させかねず、そのため、周期信号がデジタル的に形成される際にこれら各部分が分離し難くなるからである。

図８に、液滴によるアッセイ用の検出システムのさらに別の例２８０を示す。システム２８０は、図５の検出システム１５０に類似しており、例えば、少なくとも２つの光源１５２、１５４によってパルス化照明を提供することができる。ただし、単一検出器２８２を利用して各光源からの光による照明期間に光を検出し得る。このシステムの集光光学素子は、１つまたは複数の波長域の光を選択的に取り除く少なくとも１つの波長フィルタ２８４を含み得る。この１つ（または複数）の波長フィルタは、一方または両方の光源から放出され集められた光１０２を取り除き、液滴中の少なくとも１対の蛍光体から放出され集められた光を透過させるように選択し得る。異なる複数の標的に対応する複数の信号を区別することは、異なる複数の蛍光体を選択的に励起する複数の光源の能力に依存することがあるが、ここでは単一検出器しか使用しないので、これらの蛍光体の発光スペクトルが異なることには一般に依存しない。

検出器２８２は、両方の光源からの光によるパルス照明期間に検出される光を表すほぼ連続した信号を生成し得る。このシステムでは、制御部がこの連続信号を、それぞれ異なる光源からの光による照明パルス期間に検出される光を表す２つ以上の周期信号に変換することができる。

ＩＩＩ． スリットを備えた検出ユニット
本節では、本明細書で開示する検出システムのいずれかの照明光学素子および／または集光光学素子に組み込むことができるスリットを図９および図１０Ａ〜１０Ｃを参照して説明する。

図９、１０Ａ、および１０Ｂに、本明細書で開示する検出システムが含み得る照明アセンブリ３１０およびチューブ３１２（例えばキャピラリ）の例の選択された態様を示す。チューブ３１２は、液滴７４が照明される場所である流路７６を画定するものである。実施形態の例では、チューブ３１２および流路７６は円筒形である。

照明アセンブリ３１０は、少なくとも１つの光源３１４と、光源からの光を透過してチューブ３１２に導く照明光学系３１６とを含み得る。この照明光学系は、スリット３２０を画定する開口要素３１８を含み得る。このスリットは、光源から流路７６まで進む光の光路上の１つまたは複数の光学要素３２２、３２４の前および／または後ろに配設し得る（図９参照）。

開口要素３１８には光源３１４からの光ビーム３２６を入射させることができるが、このビームの一部のみがスリット３２０を通過し得る。通過した光は、ある形状のビーム、すなわち、ブレード状の光３２８を形成する。具体的には、開口要素３１８は、ガラスなどの光透過性基板３３０と、この基板上に形成される遮蔽層３３２とを含み得る。この遮蔽層はほぼ不透明とすることができ、そのため、光を通過させない。実施形態の例では、この遮蔽層は、例えばエッチングによって層３３２を選択的に除去することによって形成される。フォトリソグラフィなどによって層３３２の上にマスクを形成することによって層３３２のエッチングを制限して、スリット位置までエッチングを行えばよい。この遮蔽層の組成は任意の適切なものとし得る。実施形態の例では、この遮蔽層の組成を金およびクロムとし得る。基板３３０の反対側の面には、ＭｇＦ_２からなる被覆を施してもよい。

ブレード状の光３２８は、その断面形状が、すなわち、ブレード状の光の進行方法に直交する断面が（図１０Ｂに示すように）細長い光である。ブレード状の光３２８は、少なくとも全体的に平坦な対向面３３４を有する平面ビームとし得る。このブレード状の光は、例えば、検出ユニットの光源からほぼ平行光でスリットを照明することによって形成し得る。あるいは、光源をスリット上に結像してもよい。場合によっては、光源をスリット上に結像させると、検査部位の照明強度を、他の部分は変えずに、より強くすることができる。というのは、光源からスリットに入射する（ひいてはスリットを通過する）光が多くなり、光源からスリット周囲の非透過材料に入射し遮蔽される光が少なくなるからである。

スリット３２０は、任意の適切な特性を有するようにし得る。このスリットの長さは、ビーム３２６の直径とほぼ同じとしてもよいし、それよりも長くも短くもし得る。例えば、図１０Ａに示すように、スリット３２０をビーム径よりも長くすると、ブレード状の光３２８の対向する端部３３６がスリットの形状にならないようにし得る（図１０Ａおよび１０Ｂ参照）。このスリットは、流路７６の所望の照明体積と、スリットが流路に投影されるまでに拡大または縮小される度合いとに基づいて任意の適切な幅を有するようにし得る。例えば、ブレード状の光３２８は、少なくとも１つのレンズ３２４を通過してから流路７６のある領域を照明するようにし得る。レンズ３２４により流路７６上にスリットの像を形成することができる。また、任意選択で、レンズ３２４によりスリット像をスリット自体よりも小さくすることができる。実施形態の例では、スリット３２０の幅は約１０〜２００マイクロメートルであり、スリット像は流路のところでは縮小され、そのため、ブレード状の光３２８の厚さは流路のところで、様々な値の中でもとりわけ、約５〜１５０マイクロメートルまたは約５０〜１００マイクロメートルになる。

図１０Ｂに、流路７６全体の距離の半分のところで切ったブレード状の光３２８の断面領域３３８を示す。ブレード状の光３２８は、断面では、流路７６によって定義される長軸３４０に対して横に細長い光である。すなわち、このブレード状の光は、軸３４０に少なくともほぼ直交する方向に細長い光であり、ほぼ直交する方向とは、約２０°、１０°、または５°のずれの範囲で直交することを意味する。この領域の長さ３４２は、その幅３４４よりもかなり長く、少なくとも約２倍、５倍、または１０倍長い。長さ３４２は、流路７６および／またはチューブ３１２の直径よりも長くし得る。したがって、ブレード形状に沿ったこの位置でのブレード状の光３２８の断面領域は、流路および／またはチューブと部分的にしか重なり合わず、断面領域は流路および／またはチューブの対向する一方または両方の面から突き出ている。ブレード状の光は一般に、断面長さが流路および／またはチューブの直径よりも長いブレード状の光は特に、円筒形または円錐形の光ビームによる照明と比べて、１つまたは複数の利点がある。これらの利点には、照明光学系と流路の位置合わせずれに対する許容度が大きいこと、および／または、２つの光源からの照明光が流路の互いに重なり合わない領域を照明する危険性が小さいことが含まれる。

ブレード状の光３２８によれば、流路７６の体積３４６が照明されるようにし得る（図９参照）。体積３４６の断面形状は、流路７６の断面形状に対応するようにし得る。したがって、体積３４６は、流路がほぼ円筒形の場合には、ほぼ円盤状とし得る。体積３４６は対向する面が平坦であり、流路軸３４０に平行に測った寸法（すなわち、図１０Ｂの幅３４４）を液滴の直径よりも大きくすることもできるし、直径とほぼ同じにすることもできる。または、（図に示すように）直径よりも小さくすることもできる。ブレード状の光３２８を薄くすると（すなわち、幅３４４を狭くすると）、体積３４６から検出される光から生成される信号がより高分解能になり得る。例えば、ブレード状の光を液滴の直径よりも薄くすると、液滴の大きさおよび形状についてのデータをより正確に収集することができ、流路内で互いに近接した液滴をより高い分解能で検出し得る。また、スリットを使用すると、照明の精度が高くなるので、開口数が大きなレンズを使用して発光を収集することができる。あるいは、スリットを使用すると、収集光学系を使用せずに検出することもできる。

図９に、チューブ３１２の追加の態様を示す。このチューブは、チューブ３１２全体にわたって光の透過を制限する被覆またはシース３４８を含むようにすることができ、照明が行われるチューブの区域３５０に沿って選択的に被覆３４８を取り除くことができる。被覆３４８のごく狭い部分のみを正確に取り除くことは難しいことがあり、そのため、区域３５０を液滴の直径よりもかなり長くするとよい。したがって、ブレード状の光３２８を使えば、照明を区域３５０内の狭い領域に制限し得る。被覆は、例えば、ポリイミドで形成する。いくつかの実施形態では、被覆３４８の狭い部分（例えば、液滴の直径に匹敵する部分またはそれよりも小さい部分）だけを取り除くことができる。

図１０Ｃに、本明細書で開示する信号検出システムが含み得る検出ユニットの別の例３６０の選択された態様を示す。照明アセンブリ３６２は、ビーム３６４で流路７６を照明して照明体積３６６が得られるようにし得る。この照明体積は、流路７６に沿って測った寸法が液滴の直径よりも大きくなるようにし得る。あるいは、ブレード状の光によってこの照明体積を生成してもよい（例えば、図９、１０Ａ、および１０Ｂ参照）。いずれにしても、スリット３２０を備えた開口要素３１８をユニット３６０の集光光学系３６８に含めることができる。このスリットは、流路７６によって定義される長軸にほぼ直交する方向を向くようにし得る。このスリットは、流路にかなり近づけることができ、例えば、流路を画定するチューブその他の部材に当接させることができる。あるいは、このスリットは、流路と検出器３７０の間で集光光学系によって形成される像面に配設し得る。集光光学系にスリットを含めると、光の収集を照明体積の一部にのみ制限することができる。場合によっては、集光光学系でスリットを使用すると、照明光学系を用いずに照明し得る。

実施形態によっては、照明光学系にスリットを含め、集光光学系にも別のスリットを含めることができる。これらのスリットは互いに平行になるようにし得る。このような二重スリット構成を採用すると、流路の照明および集光に関わる体積がより精度よく画定されるので、背景光を減らす助けとなり得る。場合によっては、照明および集光の両側でスリットを使用すると、他には何の照明光学素子または収集光学素子も用いずに照明および集光が可能になり得る。

ＩＶ． 混合信号による液滴の識別
本節では、混合信号を用いることによって液滴を識別する手法の例を図１１を参照して説明する。

図１１に、本明細書で開示する検出システムによって収集されるデータを処理する手法の例を示すフローチャートをグラフ３８０〜３８８とともに示す。

グラフ３８０は、図６に関連してすでに説明したものだが、連続相中の液滴が検査領域を通過する際に検出される光を表す１対の別個の信号２１０、２１２を示す。これら別個の信号はそれぞれ、液滴が存在しない領域についての参照用データ４０２の間に挿入された、個々の液滴についての液滴データ４００を含む。１つの目標は、液滴データを効率的に識別して、参照用データに影響されずにさらなる解析を行うことである。しかし、別個の信号が２つ以上ある（例えば、標的が２つ以上ある）場合、これら別個の信号は、液滴データの位置については常に互いに一致するとは限らない。別個の信号の一方または両方が背景光信号に近いときは特にそうである。例えば、液滴Ａは信号２から明確に識別されるが、信号１からは明確に識別されず、液滴Ｂについてはその逆が成り立つ。信号処理アルゴリズムにより、各信号を個々に調べて液滴の特徴を探すことができるが、一方の信号では液滴が識別されるが、他の信号では識別されないことがある。光検出の同じ期間を表す２つ以上の別個の信号中の情報が役に立つ液滴データ識別手法が必要とされている。

グラフ３８２は、グラフ３８０の別個の信号を混合した結果、混合信号４０４が形成されたことを示す。具体的には、同じ期間４１０に、別個の信号２１０、２１２からそれぞれ検出される光を表す個々の信号値４０６、４０８を混合して、一連の期間ごとに、混合信号４０４を形成する混合値４１２を生成することができる。いくつかの実施形態では、３つ以上の別個の信号からの信号値を混合することができる。各期間ごとに複数の信号値を混合すると、得られた信号値は、その期間の重なり合う部分または重なり合わない部分で検出される光を表す。例えば、この図では、２つの別個の信号は周期的であり、互いに時間的にオフセットされており、混合される個々の信号値は、ある期間の連続しており重なり合っていない部分を表す。他の例では、２つ（または３つ以上）の別個の信号を時間的にオフセットせずに同期させることができる。

別個の信号からの信号値は、任意の適切なやり方で混合し得る。例えば、２つ（または３つ以上）の信号値を各期間ごとに下記の式を用いて混合して線形混合値を形成し得る。
Ｙ＝ａＸ_１＋ｂＸ_２
式中、Ｙは混合信号の混合値であり、ａおよびｂは定数である。Ｘ_１およびＸ_２は、２つの別個の信号からの互いに対応する個々の信号値である。他の別個の信号からの追加の信号値（例えば、ｃＸ_３、ｄＸ_４など）も含めることができる。これらの定数は互いに同じとしてもよいし、異なってもよい。実施形態の例では、これらの定数は、少なくともほぼ同じものとし、そのため、別個の信号の同じ割合の部分を用いて混合信号を生成する。したがって、得られた混合信号は、別個の信号２１０、２１２の平均に対応し得る。

グラフ３８４で示すように、液滴を表す混合信号の個々の液滴領域４１４（例えば、山または谷）を識別することができる。各液滴領域は、複数の混合値４１２の時間シーケンスを含み、そのため、液滴の特徴を包括的に表し得る。液滴の識別は、任意の適切なアルゴリズムで混合信号を処理して液滴の特徴を探すことによって行うことができる。液滴識別アルゴリズムは、例えば、混合信号によって形成される山４１５（または谷）の高さ（または深さ）、幅、滑らかさ、および／または単調さの許容される範囲に対応する１つまたは複数のあらかじめ定義した条件に基づくようにし得る。

４１６、４１８で示すそれぞれの別個の信号からの各液滴領域４１４に対応する信号値は、グラフ３８６、３８８で示すように、他の信号値に対して選択的に処理し得る。この選択的な処理では、グラフには示していないが、識別された液滴領域の外側の信号値をすべて無視する。この選択的処理により、それぞれの別個の信号によって表される標的が液滴領域に対応する液滴中に存在するか否かを判断することができる。

Ｖ． 検出ユニットの光学配置
本節では、本明細書で開示する検出システムで用いる検出ユニットの例４４０、特にその光学配置の例を図１２および図１３を参照して説明する。検出ユニット４４０は、例えば、検出システム１５０（図５参照）に組み込むことができる。

検出ユニット４４０は、その構成要素の中でもとりわけ、照明アセンブリ４４２、集光アセンブリ４４４、および監視アセンブリ４４６を含み得る。照明アセンブリ４４２は、流路７６を画定するキャピラリ４４８を照明するようにし得る。集光アセンブリは、流路７６から受け取る光、特に放出される光を集め検出するようにし得る。

照明アセンブリは、約４４０〜５２０ｎｍ（４８０〜４８５ｎｍで最大強度）の光を放出する青色ＬＥＤ４５０と、約４７０〜５５０ｎｍ（５０５〜５１０ｎｍで最大強度）の光を放出するシアンＬＥＤ４５２とを含み得る。これらのＬＥＤは、約３００〜１０００ｍＡの駆動電流で、とりわけ約１０〜２００ルーメンの光束を生成し得る。各ＬＥＤは、任意の適切な周波数、例えば１００ｋＨｚでパルス化されるように構成することができ、これらの光源のパルスは互いに交互に配置される。

ＬＥＤ４５０、４５２からの光は、これらのＬＥＤが放出する光を平行にする接合レンズ４５４を介して進み、平行ビーム４５６が形成されるようにし得る。これらの平行ビームはそれぞれのフィルタ、すなわち、波長フィルタ４５８、４６０を介してフィルタリングされるようにし得る。フィルタ４５８は、４８５ｎｍ以下の光を透過させる短波長透過フィルタとし得る。フィルタ４６０は、４９７〜５１８ｎｍの光を透過させる特定波長域透過フィルタとし得る。こうして、フィルタリングされたビーム４６２、４６４が得られる。これらのフィルタリングされたビームは、ＬＥＤからのビームに沿って延びる光軸４６８、４６９に対して４５°傾いたダイクロイック要素４６６で混合し得る。ダイクロイック要素４６６は、公称反射カットオフ波長が約４９５ｎｍになるようにし得る。そのため、青色ＬＥＤ４５０からの光およびシアンＬＥＤ４５２からの光が効率的に混合される。いくつかの実施形態では、ダイクロイック要素４６６は、軸４６９の周りで９０°回転させた位置に配置し得る。この場合、フィルタリングされた青色ビーム４６２の光軸は、本紙面では回転されたダイクロイック要素４６６の後ろに青色ＬＥＤ４５０が位置した状態で、本紙面の後ろから前に向かってダイクロイック要素まで延びるようにし得る。

いずれにしても、ＬＥＤからのフィルタリングされたビームをダイクロイック要素４６６によって混合することができ、それによって混合ビーム４７０が得られる。混合ビーム４７０は、ダイクロイックビームスプリッタ４７１によって分岐して、主ビーム４７２およびサンプリングビーム４７４が形成される。元の光の大部分（例えば９５％）が主ビームを形成し、元の光のわずかな部分（例えば５％）がサンプリングビームを形成するようにし得る。このサンプリングビームは、監視アセンブリ４４６に関連して以下でさらに説明する。主ビーム４７２は、開口要素４７８（例えば、図９および図１０Ａ〜１０Ｃの開口要素３１８参照）によって画定されるスリット４７６を介して進み、それによってブレード状の光４８０を形成するようにし得る。ブレード状の光４８０は、１対の離間したレンズ群４８２によってキャピラリ４４８上に結像されるようにし得る。このブレード状の光は、キャピラリ４４８の長軸にほぼ直交する平面を画定するようにし得る。この平面において、ブレード状の光はキャピラリと交差する。

集光アセンブリ４４４は、キャピラリ４４８から受け取った光を集め検出する。集められる光の光軸は、キャピラリの長軸と、ブレード状の照明光４８０によって画定される照明軸との両方にほぼ直交するようにし得る。集光アセンブリ４４４は、例えば、集光光学系４８８によってキャピラリから集められる光の検出器として機能する１対の光電子増倍管（ＰＭＴ）４８４、４８６を含み得る。光学系４８８は、キャピラリから光を受け取り、２つの検出器に送る。キャピラリからの光は、最初は共用の光軸に沿って進むが、次いで、それぞれのＰＭＴに延びる１対の光軸に分かれて進む。

キャピラリから延びる共用の光軸に沿って、非球面レンズ４９０がキャピラリ近傍に配設されるようにし得る。レンズ４９０の開口数は、放出光が効率的に集められるように大きく（直径１０ｍｍでＮＡが０．６２５）し得る。また、キャピラリのうち照明される検査部位は、チャンバ４９２によってほぼ囲まれるようにし得る。こうすると、非球面レンズを介して照明光が入射し、放出光が出射し、それ以外の光は遮蔽される。このチャンバの内側を光吸収材料で覆い（すなわち、黒くし）、障害物またはエッジの発生を最小限に抑えるかまたはなくして、散乱光および反射光を最小限に抑えるようにし得る。このチャンバは、放出光を非球面レンズに向かって反射する少なくとも１つのミラー４９３も含み得る。言い換えると、このミラーは、非球面レンズから離れるように放出される光を集める助けとなり得る。それによって、放出光の検出効率が改善される。このミラーは、例えば、楕円ミラーとし得る。場合によっては、検査部位は、ミラー（または少なくともミラーの領域）と集光光学要素（例えば非球面レンズ４９０）の間、および／またはミラー（または少なくともミラーの領域）と検出器（例えば、集光光学系を用いない場合）の間に少なくとも概ね配設し得る。

非球面レンズ４９０で集められた光は、最終調整ダイクロイック要素４９４を通過して進むようにし得る。ダイクロイック要素４９４は、５００ｎｍよりも短い光を取り除いてＬＥＤからの励起光、具体的には青色ＬＥＤ４５０が放出した光が残っていればそれを除去するためのものである。ダイクロイック要素４９４を通過した光は、次いで、ダイクロイックビームスプリッタ４９６に当たり、そこで光は分岐して、約５５０ｎｍよりも短い反射分岐ビーム部分４９８と、約５５０ｎｍよりも長い透過分岐ビーム部分５００が形成される。分岐ビーム部分４９８はＰＭＴ４８４に伝達され、分岐ビーム部分５００はＰＭＴ４８６に伝達される。それぞれのビーム部分は、フィルタ５０２または５０４などの１つまたは複数の波長フィルタ、少なくとも１つのレンズ５０６、および光学開口要素５０８を通過してから、それぞれのＰＭＴに到達するようにし得る。フィルタ５０２は、約５４０ｎｍよりも短い光を取り除く長波長透過フィルタとし得る。フィルタ５０４は、約５２０ｎｍよりも短い光および約５５５ｎｍよりも長い光を取り除く特定波長域透過フィルタとし得る。

照明光学系および集光光学系で用いるこれらのフィルタは、励起光が検出器に到達しないようにするのに効果的である。ただし、その代わりに、またはそれに加えて、互いに交差偏光した偏光フィルタを用いることによって、検出光に励起光が混ざるのをさらに減らすか、なくすことができる。この場合、各光源からの照明光ビームを、混合した後で、キャピラリへの光路上の第１偏光フィルタ５１０（照明側フィルタ）で偏光させて、光源からの光を偏光ビームにすることができる。集められた光は、分岐する前に、第２偏光フィルタ５１２（集光側フィルタ）を通過させるようにし得る。したがって、第２フィルタ５１２は、第１フィルタ５１０によって偏光した光を遮断する。これは、この光が、第２フィルタで遮断される偏光面内で偏光しているからである。このようにして、照明／励起光を第２偏光フィルタによって集光側で遮断していずれの検出器にも到達しないようにし得る。フィルタをこのように構成すると、ＶＩＣやＦＡＭなどの１対の色素とともに用いる場合、すなわち、一方の色素（例えばＶＩＣ色素）の励起スペクトルが他方の色素の発光スペクトルと重なり合う場合に特に適したものになり得る。これに加えて、またはその代わりに、このフィルタ配置により、流路によるクロストークを減らすことができる。フィルタ５１０および５１２は、互いに直交する面内で光を偏光させる吸収性直線偏光子とし得る。キャピラリ４４８から放出される光は一般に無偏光であり、そのため、放出光のかなりの部分（例えば約半分）が偏光フィルタ５１２を通過し得る。

監視アセンブリ４４６は、それぞれのＬＥＤ４５０、４５２からの照明光の照明強度を監視するようにし得る。この監視アセンブリは、制御部およびＬＥＤ４５０、４５２とともにフィードバックループの一部として構成することができ、それによって、キャピラリのところで照明強度がほぼ一定に維持される。サンプリングビーム４７４は、各ＬＥＤによるキャピラリ照明波長帯がそれぞれのフィルタ４５８、４６０によって画定した後で、ビームスプリッタ４７１を介してアセンブリ４４６によって受け取られる。したがって、ＬＥＤが出力する光の全体的な増減によって生じる各波長帯ごとの強度変化をアセンブリ４４６によって測定することができ、それに加えて、ＬＥＤのスペクトル分布のシフトその他の変化によって生じるいかなる強度変化もアセンブリ４４６によって測定することができる。

監視アセンブリ４４６は、各光源ごとに対応するセンサ５１４または５１６を含み得る。このセンサは、例えば、フォトダイオードとし得る。サンプリングビーム４７４は、ダイクロイックビームスプリッタ５１８によって分岐されるようにし得るが、このダイクロイックビームスプリッタ５１８は、ダイクロイック要素４６６と少なくともほぼ同じ反射特性（例えば、公称反射カットオフ波長が４９５ｎｍ）を有するようにし得る。言い換えると、ビームスプリッタ５１８は、ダイクロイック混合要素４６６と逆の働きをする。そのため、ビームスプリッタ５１８は、ＬＥＤ４５０に対応する青色ビーム部分５２０およびＬＥＤ４５２に対応する緑色ビーム部分５２２を生成し得る。緑色ビーム部分５２２は、ミラー５２４によって反射されてセンサ５１６に向かうようにし得る。各ビーム部分は、拡散板５２６を通過してからセンサ５１４または５１６に到達するようにし得る。

図１３に、図４のグラフと、その捕捉として図４の色素、すなわち、ＦＡＭ色素およびＶＩＣ色素に適し得る、図１２の検出ユニット４４０を備えた図５の検出システムにおける照明および検出の波長帯の例を付け加えて示す。一方の光源、すなわち、青色ＬＥＤ４５０は、約４８５ｎｍよりも短い波長帯５３０の光でキャピラリ４４８を照明するようにし得る。波長帯５３０を定義する波長境界は、より短くてもよいし、そうでなくてもよい。他方の光源、すなわち、シアンＬＥＤ４５２は、約４９５〜５１５ｎｍの波長帯５３２の光でキャピラリ４４８を照明するようにし得る。したがって、これらの波長帯が重なり合う場合が（ない場合も）ある。場合によっては、照明波長帯５３０と５３２の間にギャップ５３４が形成されることがある。ギャップ５３４は、取り得る値の中でも、例えば、少なくとも約２、５、または１０ｎｍとし得る。場合によっては、光源の一方または両方は、ある範囲の波長ではなく、単一波長の光を放出するようにし得る（例えばレーザ）。場合によっては、単一光源により、両方の色素の励起光を生成するようにし得る。いずれにしても、波長帯５３０の光は一方の色素（ＦＡＭ色素）によって選択的に吸収され、波長帯５３２の光は他方の色素（ＶＩＣ色素）によって選択的に吸収される。したがって、ＬＥＤ４５０はＦＡＭ色素を選択的に励起し、ＬＥＤ４５２はＶＩＣ色素を選択的に励起する。

検出波長帯５３６、５３８において光が収集されるようにし得る。これらの検出波長帯は、重なり合ってもよいし、そうでなくてもよい。重なり合いがある場合、重なり合う幅は、取り得る値の中でもとりわけ、約０〜２０ｎｍまたは０〜１０ｎｍとし得る。検出波長帯５３６は一方の色素（ＦＡＭ色素）からの発光を選択するものであり、検出波長帯５３８は他方の色素（ＶＩＣ色素）からの発光を選択するものである。したがって、検出波長帯５３６は、照明波長帯５３０、青色ＬＥＤ４５０、およびＦＡＭ色素に対応し、検出波長帯５３８は、照明波長帯５３２、シアンＬＥＤ５２、およびＶＩＣ色素に対応する。

照明波長帯５３２および検出波長帯５３６はそれぞれ異なる色素を表している。これらの波長帯は、検出波長帯５３６の光が上記の節ＩＩで説明したように交互に配置された光パルスを用いて検出されるときに、シアンＬＥＤ４５２がオフになっているときに限り、潜在的に重なり合うことがある。ただし、検出波長帯５３６用の検出器は、ＬＥＤ４５２からのパルス期間に、照明波長帯５３２の光によって飽和してしまうことがある。このＬＥＤ４５２からのパルスにより、ＬＥＤ４５２がオフされた後でも、他方の光源による次のパルス期間にこの検出器が光を正確に測定できなくなることがある。というのは、検出器が回復するのに要する時間はパルス継続時間よりもはるかに長いことがあるからである。したがって、照明波長帯５３２を検出波長帯５３６から離すことが望ましいことがある。あるいは、またはそれに加えて、波長帯５３２による照明期間中、波長帯５３６用の検出器（例えば検出器４８６）を動作させないことが望ましいことがある。こうするにはいろいろな方法があるが、例えば中でも、ＰＭＴ検出器のダイノード電圧またはＡＰＤ（アバランシェフォトダイオード）検出器に対するバイアス電圧を下げることによって、または、電気光学シャッタを使用して検出器に光が到達しないようにすることによって行うことができる。

図１３のグラフには、重なり合い１４０を照明波長帯５３２と検出波長帯５３６の間でバランスよく分割するやり方の例が示されている。短波長側の区域（すなわち、波長帯５３２）を照明専用とし、それに重なり合わない長波長側の区域（すなわち、波長帯５３６）を検出専用とし、重なり合い１４０のそれぞれほぼ同じサイズ（互いに長さで約５０％以内）の区域を照明および検出に割り当てることができる。さらに、波長帯５３２および５３６は、少なくとも約２、５、または１０ｎｍのギャップ５４０だけ離して、いかなる励起光も検出器に到達しないようにし得る。ギャップ５４０は、一方の色素の吸収スペクトルの最大値および／または他方の色素の発光スペクトルの最大値の近傍（例えば、約１０または２０ｎｍ以内）にあるようにし得る。

ＶＩ． 検査部位を離間させた検出システム
本節では、励起／発光体積を空間的に離して離間した検査部位を画定する検出システムの例を図１４〜１６を参照して説明する。

いくつかのシステムの実施形態では、複数の励起源からの放射は空間的にずらせてよく、すなわち、それぞれ実質的に異なる空間位置で液滴と交差させてよい。この場合、１つの光源のみからの放射が所与の時間に任意の特定の液滴に到達するので、励起源をパルス化したり、その他の方法で交互に変化したりすることは不要である。共用の単一領域または単一点を励起するシステムの場合と同様に、複数の空間的にずれた領域を励起するシステムでは、液滴から放出される複数の信号を区別するために、ビームスプリッタおよび／またはフィルタを複数の検出器とともに用いるか、または、異なる標的分子を励起した結果生じる複数の発光スペクトルを区別することができる単一の検出器を用いることができる。

図１４に、液滴によるアッセイで用いる検査部位を空間的にずらした検出システムの例５５０を示す。このシステムは、流路７６に沿って離間して配設された検査部位５５６〜５６０からなる不連続な検査領域５５４を画定するように配置された複数の検査ユニット５５２を備える。

これらの検査部位は、互いに任意の適切な空隙（取り得る値の中でも、例えば、約５ｃｍ、１ｃｍ、または１ｍｍ、あるいは約１００、５０、２５、または１０個分の液滴または流路の直径よりも短い空隙）で配設するようにし得る。これらの検査部位は互いにできる限り近づけて配設することが望ましいことがある。というのは、検査部位を近づけると、異なる検査部位から検出されるデータを相関させる際に生じる問題を小さくできるからである。液滴が検査部位間を移動するときに、流れの中で液滴間の空隙が変化するほど通過時間は長くない。いくつかの構成では、ある液滴が一連の検査部位をすべて通過してから次の液滴が検査領域に入ることになる程度に検査部位を互いに十分に近づけることができる。検査部位をこの程度に近接させると、それぞれの部位から収集される液滴データを同期させるという問題がなくなる。

各検出ユニット５５２は、少なくとも１つの光源５６２、照明光学素子５６４、集光光学素子５６６、および検出器５６８を含み得る。これらの検出ユニットは、互い異なる波長または波長帯の照明光を提供し、かつ／または、互いに異なる波長または波長帯の光を集め検出することができる。

図１５に、液滴によるアッセイ用の検出システムのさらに別の例５８０を示す。システム５８０は、流路７６に沿って離間して配設された検査部位５８６〜５９０からなる不連続な検査領域５８４を画定するように配置された複数の検出ユニット５８２を備える。各検出ユニットは、少なくとも１つまたは少なくとも１対の光源５９２、５９４と、少なくとも１つまたは少なくとも１対の検出器５９６、５９８を備えるようにし得る。いくつかの実施形態では、これらの検出ユニットの１つまたは複数に、検出システム１５０または２８０（図４〜８）、照明アセンブリ３１０（図９および１０Ａ〜１０Ｃ）、および／または検出ユニット４４０（図１２）について上記で開示した特徴の任意の組合せを組み込むようにし得る。これらの特徴には、例えば、照明をパルス化し、照明パルスに対応する周期信号を生成すること、スリットにより光ビームを整形し、かつ／または選択的に遮断すること、混合信号を使用して液滴を識別すること、複数の色素について励起／発光が重なり合う領域を一方の色素に用いる照明波長帯および他方の色素に用いる検出波長帯になるようバランスよく分割すること、および／または、照明強度を閉ループにより監視することが含まれる。

図１６に、検出システム５５０の実施形態６１０を示す。流路７６を画定するキャピラリ６１２は、各検出ユニット５５２を通って延びる。このキャピラリは、ブラケット６１４によって定位置で固定される。各光源５６２はＬＥＤを含む。代替光源または集光器、光ファイバ６１６は、検出ユニットを通って延びる。各ユニット５５２の集光光学素子５６６は、フィルタ６１８を含み得る。フィルタ６１８は、ユーザが容易に交換し得るようになっている。光電子増倍管６２０によって光を検出することができる。

ＶＩＩ． 選択された実施形態
本節では、液滴によるアッセイ用の検出システムの追加の態様および特徴について説明する。これらを一連の番号を振ったパラグラフとして提示するが、追加の態様および特徴はこれらに制限されるものではない。これらのパラグラフはそれぞれ、１つまたは複数の他のパラグラフ、および／または、本出願の他の箇所で開示したものと任意の適切なやり方で組み合わせることができる。以下では、これらのパラグラフの一部は、特に他のパラグラフを参照しさらに制限を加えることによって上記の適切な組合せの一部の例が示されるが、これらに限定されるものではない。
１． 液滴を検出する方法であって、（Ａ）流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するステップであって、前記第１のパルスは前記第２のパルスとスペクトル的に異なる、ステップと、（Ｂ）前記検査領域が前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで照明される期間に検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
２． 前記第１のパルスは第１の範囲の波長の光を画定し、前記第２のパルスは第２の範囲の波長の光を画定し、前記第１の範囲は前記第２の範囲と異なる、パラグラフ１に記載の方法。
３． 前記第１のパルスのみが単一波長の光によって生成されるか、または、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスがともにそれぞれの単一波長の光によって生成される、パラグラフ１に記載の方法。
４． 前記第１のパルスはパルス化された光源によって生成される、パラグラフ１から３のいずれかに記載の方法。
５． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれのパルス化された光源によって生成される、パラグラフ１から４のいずれかに記載の方法。
６． 前記第１のパルスまたは前記第２のパルス、あるいは前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの両方は、前記検査領域まで間欠的に伝達される少なくとも１つの連続光ビームによって生成される、パラグラフ１に記載の方法。
７． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、少なくとも１つのＬＥＤから放出される光を含む、パラグラフ１に記載の方法。
８． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれのパルス化されたＬＥＤから放出される、パラグラフ７に記載の方法。
９． 前記検査領域のうちそれぞれ重なり合う体積が、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスによって照明される、パラグラフ１に記載の方法。
１０． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に、前記検査領域の重なり合う体積からの光を検出するステップをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
１１． 少なくとも１つの第１のパルスおよび少なくとも１つの第２のパルスで各液滴が照明される、パラグラフ１に記載の方法。
１２． 複数の第１のパルスおよび複数の第２のパルスで各液滴が照明される、パラグラフ１１に記載の方法。
１３． 各液滴は、前記液滴の直径よりも狭い光ビームで照明される、パラグラフ１に記載の方法。
１４． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれ第１および第２の光源によって放出される光を含み、前記方法は、前記第１および第２の光源によって放出される前記光を、前記光が前記検査領域を照明する前にスリットを通過させるステップをさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
１５． データを収集する前記ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光をそれぞれ表す第１の信号および第２の信号を生成するステップを含む、パラグラフ１に記載の方法。
１６． 前記液滴は第１の色素および第２の色素を含み、前記第１の信号は第１の検出構成から生成され、前記第２の信号は第２の検出構成から生成され、前記第１の検出構成の前記第１および第２の色素に対する感度は、前記第２の検出構成の前記第１および第２の色素に対する感度と相対的に異なる、パラグラフ１５に記載の方法。
１７． 第１の検出器および第２の検出器で前記検査領域からの光を検出するステップをさらに含み、前記第１の信号は前記第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は前記第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、パラグラフ１５に記載の方法。
１８． 各検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に光を検出する、パラグラフ１７に記載の方法。
１９． 各検出器の利得は、第１のパルスまたは第２のパルスが前記流路の前記検査領域を照明しているかどうかに従って、経時的に調整される、パラグラフ１７に記載の方法。
２０． 前記第１の信号および前記第２の信号は周期信号である、パラグラフ１５に記載の方法。
２１． 前記データは、前記検査領域が前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで照明される期間に同じ検出器で検出される光を表す、パラグラフ１に記載の方法。
２２． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に前記検査領域からの光を検出するステップをさらに含み、光を検出する前記ステップでは、第１の信号および第２の信号が生成され、データを収集する前記ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスに対応して前記第１の信号および前記第２の信号をそれぞれ周期的にゲーティングするステップを含む、パラグラフ１に記載の方法。
２３． 前記照明ステップは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する光ビームを前記流路と交差させるステップを含む、パラグラフ１に記載の方法。
２４． 前記照明ステップは、前記流路の円盤状の体積を照明するステップを含む、パラグラフ１に記載の方法。
２５． 前記照明ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスとスペクトル的に異なる第３の光パルスで前記流路の前記検査領域を照明するステップを含む、パラグラフ１に記載の方法。
２６． 液滴を検出する方法であって、（Ａ）流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光源および第２の光源によって放出される光パルスで交互に照明するステップと、（Ｂ）前記光パルスによって照明される前記検査領域からの光を検出するステップと、（Ｃ）第１の信号および第２の信号を生成するステップとを含み、前記第１の信号は、第１の領域が前記第１の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は、第２の領域が前記第２の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表す、方法。
２７． 前記第１の信号および前記第２の信号に基づいて、前記液滴中の第１の標的および第２の標的の濃度を推定するステップをさらに含む、パラグラフ２６に記載の方法。
２８． 個々の液滴中で増幅反応が起こったかどうかを判断するステップをさらに含む、パラグラフ２６に記載の方法。
２９． 液滴に基づくアッセイ用の検出システムであって、（Ａ）流路と、（Ｂ）前記流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するように構成された照明アセンブリであって、前記第１のパルスは前記第２のパルスとスペクトル的に異なる、照明アセンブリと、（Ｃ）前記検査領域からの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器と、（Ｄ）前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光を表すデータを収集する制御部とを備える、システム。
３０． 前記第１のパルスは第１の範囲の波長の光を画定し、前記第２のパルスは第２の範囲の波長の光を画定し、前記第１の範囲は前記第２の範囲と異なる、パラグラフ２９に記載のシステム。
３１． 前記第１のパルスのみが単一波長の光によって生成されるか、または、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスがともにそれぞれの単一波長の光によって生成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
３２． 前記照明アセンブリは少なくとも１つのパルス化された光源を備える、パラグラフ２９に記載のシステム。
３３． 前記照明アセンブリは１対のパルス化されたＬＥＤを備える、パラグラフ２９に記載のシステム。
３４． 前記照明アセンブリは、前記検査領域に間欠的に伝達される光ビームを放出するように構成された少なくとも１つの連続光源を備える、パラグラフ２９に記載のシステム。
３５． 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、前記検査領域の重なり合う体積を照明するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
３６． 前記１つまたは複数の検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に前記検査領域の重なり合う体積からの光を検出するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
３７． 前記照明アセンブリは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する光ビームで前記検査領域を照明するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
３８． 前記照明アセンブリは、光が前記検査領域を照明する前に通過する少なくとも１つのスリットを備える、パラグラフ２９に記載のシステム。
３９． 前記制御部は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光をそれぞれ表す第１の信号および第２の信号を生成するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
４０． 前記１つまたは複数の検出器は、第１の検出器および第２の検出器を含み、前記第１の信号は前記第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は前記第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、パラグラフ３９に記載のシステム。
４１． 各検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に光を検出するように構成される、パラグラフ４０に記載のシステム。
４２． 前記第１の信号および前記第２の信号は周期信号である、パラグラフ３９に記載のシステム。
４３． 前記制御部は、第１のパルスまたは第２のパルスが前記流路の前記検査領域を照明しているかどうかに従って、経時的に各検出器の利得を調整するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
４４． 前記１つまたは複数の検出器は、それぞれ少なくともほぼ連続な第１の信号および第２の信号を生成し、前記制御部は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスに対応して前記第１の信号および前記第２の信号をそれぞれ周期的にゲートして前記信号を周期的にするように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
４５． 前記照明アセンブリは、前記流路によって画定される長軸に対して横に細長い断面を有する光ビームを形成する、パラグラフ２９に記載のシステム。
４６． 前記照明アセンブリは、前記流路の円盤状の体積を照明するように構成される、パラグラフ２９に記載のシステム。
４７． 前記照明アセンブリは、第１の光源および第２の光源を備え、前記システムは、前記光源が前記流路の重なり合う体積を照明するときに、前記液滴を前記検査領域に通過させるように構成された少なくとも１つのポンプをさらに備える、パラグラフ２９に記載のシステム。
４８． 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、（Ａ）流路と、（Ｂ）前記流路の検査領域を、液滴が前記領域を通過するときに照明する光ビームを生成するように構成された照明アセンブリと、（Ｃ）前記検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、（Ｄ）前記検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備え、前記光ビームは、前記流路と交差する断面が細長い、システム。
４９． 前記照明アセンブリは光源およびスリットを備え、前記光源によって放射される光は、前記検査領域に到達する前に前記スリットを通過する、パラグラフ４８に記載のシステム。
５０． 前記光ビームは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する、パラグラフ４８に記載のシステム。
５１． 前記ビームの断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記流路の対向する面から外側に延びる、パラグラフ４８に記載のシステム。
５２． 前記流路はチューブによって画定され、前記ビームの断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記チューブの直径よりも長い、パラグラフ５１に記載のシステム。
５３． 前記断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記チューブと交差しない対向する端部を有する、パラグラフ５２に記載のシステム。
５４． 前記光ビームは、前記流路の円盤状の体積を照明する、パラグラフ４８に記載のシステム。
５５． 前記光ビームは対向する平坦な側面を有する、パラグラフ４８に記載のシステム。
５６． 前記光ビームは前記流路の長軸に平行な寸法を有し、前記寸法にわたって前記ビームが前記流路と交差し、前記寸法は前記流路の直径よりも短い、パラグラフ４８に記載のシステム。
５７． 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、（Ａ）流路と、（Ｂ）前記流路の検査領域を、液滴が前記領域を通過するときに照明する光源と、（Ｃ）前記検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、（Ｄ）前記検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備え、前記光源が放出する光は、前記光源と前記検出器との間の少なくとも１つのスリットを通過して進む、システム。
５８． 前記少なくとも１つのスリットは、前記光源から前記検査領域への光路上に配設されるスリットを含む、パラグラフ５７に記載のシステム。
５９． 前記少なくとも１つのスリットは、集光光学素子と前記流路との間に配設されるスリットを含む、パラグラフ５７に記載のシステム。
６０． 液滴を検出する方法であって、（Ａ）断面が細長い光ビームで流路の検査領域を照明するステップと、（Ｂ）複数の液滴が前記検査領域を通過するときに、前記領域から経時的に検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
６１． 前記照明ステップは、光源と前記検査領域との間の光路上に配設されたスリットを通して光を送るステップを含む、パラグラフ６０に記載の方法。
６２． 前記検査領域の円盤状の体積を照明する、パラグラフ６０に記載の方法。
６３． 前記光ビームは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する、パラグラフ６０に記載の方法。
６４． 前記照明ステップは、液滴を、前記液滴の直径よりも薄い光ビームで照明するステップを含む、パラグラフ６０に記載の方法。
６５． 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、（Ａ）液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す少なくとも２つの別個の信号を生成するステップと、（Ｂ）前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するステップと、（Ｃ）前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を特定するステップとを含む、方法。
６６． 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値の線形結合を形成するステップを含む、パラグラフ６５に記載の方法。
６７． 線形結合を形成する前記ステップは、前記値を同じ割合で含む線形結合を形成するステップを含む、パラグラフ６６に記載の方法。
６８． 前記混合ステップは、前記少なくとも２つの信号によるデジタル形式で行われる、パラグラフ６５に記載の方法。
６９． 前記混合ステップは、前記少なくとも２つの信号が生成されているときに、少なくとも部分的に行われる、パラグラフ６５に記載の方法。
７０． 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値を混合するステップを含み、所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間のそれぞれ異なる部分で検出される光を表す、パラグラフ６５に記載の方法。
７１． 所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間の互いに重なり合わない部分で検出器される光を表す、パラグラフ７０に記載の方法。
７２． 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値を混合するステップを含み、所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間の同じ部分またはすべての部分で検出される光を表す、パラグラフ６５に記載の方法。
７３． 前記別個の信号は、流体の流れを保持する流路のある領域から、第１の光源および第２の光源からの交互に配置された光パルスで前記領域が照明される期間に検出される光を表す第１の信号および第２の信号を含む、パラグラフ６５に記載の方法。
７４． 前記第１の信号は、前記第１の光源からのパルス期間に第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は、前記第２の光源からのパルス期間に第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、パラグラフ７３に記載の方法。
７５． それぞれの異なる色素は蛍光体を含む、パラグラフ６５に記載の方法。
７６． 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、（Ａ）液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長または波長帯の光を表す少なくとも２つの別個の信号を生成するステップであって、それぞれの波長または波長帯から検出される光は個々の液滴中の異なる標的の存在の有無を示す、ステップと、（Ｂ）前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するステップと、（Ｃ）前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するステップと、（Ｄ）前記識別された期間に検出された別個の信号の各々の値に基づいて、液滴が異なる標的の各々を含むかを判断するステップとを含む、方法。
７７． 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、（Ａ）液滴を含む流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長帯の光を表す少なくとも２つの信号を生成するステップと、（Ｂ）前記少なくとも２つの信号の複数の値を混合して混合信号を形成するステップと、（Ｃ）前記混合信号の液滴に対応する部分を識別するステップと、（Ｄ）前記識別された部分に対応する前記少なくとも２つの信号の値を処理して、どの液滴がどの標的を含むかを判断するステップとを含む、方法。
７８． 液滴に基づくアッセイ用の検出システムであって、（Ａ）少なくとも２つの異なる色素を含む液滴を運ぶ流体の流れからの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器と、（Ｂ）液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す別個の信号を生成し、前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成し、前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するように構成された制御部とを備える、システム。
７９． 液滴用の検出方法であって、（Ａ）第１の色素および第２の色素を含む液滴を準備するステップであって、前記第１の色素の発光スペクトルおよび前記第２の色素の吸収スペクトルが重なり合う波長帯を画定し、前記重なり合いは、前記第１の色素が前記第２の色素の最大吸収波長で励起された場合に前記第１の色素からその発光最大値の少なくとも半分が生成される程度に大きい、ステップと、（Ｂ）前記第１の色素および前記第２の色素をともに励起し得る励起光で前記液滴を照明するステップであって、前記励起光は１つまたは複数のＬＥＤによって放出され、前記重なり合う波長帯の短波長側の区域のみを含む、ステップと、（Ｃ）前記第１の色素および前記第２の色素が放出する光を検出するステップとを含み、前記第２の色素が放出する光は、前記短波長側の区域から離れた前記重なり合う波長帯の長波長側の区域のみを含む波長域で検出される、方法。
８０． 前記吸収スペクトルおよび前記発光スペクトルが、それぞれ約２０ｎｍ以内である波長でそれぞれ最大値を有する、パラグラフ７９に記載の方法。
８１． 前記１つまたは複数のＬＥＤは、前記第１の色素を選択的に励起する第１のＬＥＤおよび前記第２の色素を選択的に励起する第２のＬＥＤを含む、パラグラフ７９に記載の方法。
８２． 前記第１の色素および前記第２の色素からそれぞれ選択的に検出される光を表す第１の組のデータおよび第２の組のデータを収集するステップをさらに含む、パラグラフ７９に記載の方法。
８３． 前記第１の色素はＦＡＭ色素であり、前記第２の色素はＶＩＣ色素である、パラグラフ７９に記載の方法。
８４． 前記重なり合う波長帯は、前記それぞれのスペクトルがその吸収または発光の最大値の２０％以上の値で重なり合うところとして定義され、前記重なり合う波長帯の幅は少なくとも２５ｎｍである、パラグラフ７９に記載の方法。
８５． 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、（Ａ）第１の色素および第２の色素を含む液滴を受け取るように構成された流路であって、前記第１の色素の発光スペクトルおよび前記第２の色素の吸収スペクトルにより重なり合う波長帯が画定され、前記重なり合いは、前記第１の色素が前記第２の色素の最大吸収波長で励起された場合に前記第１の色素からその最大発光値の少なくとも半分が生成される程度に大きい、流路と、（Ｂ）１つまたは複数のＬＥＤを含み、前記第１および第２の色素をともに励起し得る励起光で前記液滴を照明するように構成された照明アセンブリであって、前記励起光は、前記ＬＥＤから放出され、前記重なり合う波長帯の短波長側の区域のみを含む、照明アセンブリと、（Ｃ）前記第１の色素および前記第２の色素が放出する光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器であって、前記第２の色素からの前記光は、前記短波長側の区域から離れた前記重なり合う波長帯の長波長側の区域のみを含む波長域で検出される、検出器と、を備えるシステム。
８６． 前記照明アセンブリは、前記短波長側の区域を画定する１つまたは複数のフィルタを備える、パラグラフ８５に記載のシステム。
８７． 前記１つまたは複数の検出器を含む集光アセンブリをさらに備え、前記集光アセンブリは、前記長波長側の区域を画定する１つまたは複数のフィルタを含む、パラグラフ８５に記載のシステム。
８８． 液滴用の検出方法であって、（Ａ）光ビームを生成するステップと、（Ｂ）前記光ビームを主ビームおよび少なくとも１つのサンプリングビームに分岐するステップと、（Ｃ）前記サンプリングビームの強度を監視するステップと、（Ｄ）前記監視ステップから得られる１つまたは複数の測定値に基づいて、前記光ビームの強度を調整するステップと、（Ｅ）流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに前記主ビームで照明するステップと、（Ｆ）前記検査領域から検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
８９． 光ビームを生成する前記ステップは、光源から放出される光をフィルタリングして前記放出される光のスペクトルを変化させるステップを含み、前記分岐ステップは、前記フィルタリングステップの後で実施される、パラグラフ８８に記載の方法。
９０． 前記フィルタリングステップは、特定波長域透過波長フィルタ、長波長透過フィルタ、短波長透過フィルタ、またはこれらの組合せを用いて実施される、パラグラフ８８に記載の方法。
９１． 光ビームを生成する前記ステップは、少なくとも２つの光源から放出される光ビームを混合するステップを含み、前記混合ステップは、前記フィルタリングステップの後で実施される、パラグラフ８８に記載の方法。
９２． 光ビームを生成する前記ステップは、ＬＥＤを用いて光を放出させるステップを含む、パラグラフ８８に記載の方法。
９３． 光ビームを生成する前記ステップは、第１の光源および第２の光源からの光を混合するステップを含み、前記分岐ステップは、前記光ビームを第１のサンプリングビームおよび第２のサンプリングビームに分岐するステップを含み、前記第１のサンプリングビームは前記第１の光源に対応し、前記第２のサンプリングビームは前記第２の光源に対応する、パラグラフ８８に記載の方法。
９４． 前記調整ステップにより、前記主ビームの各光源に対応する部分の強度がほぼ一定に保たれる、パラグラフ９３に記載の方法。

上記の開示は、それぞれ独立した有用性を有する複数の別個の発明を含み得る。これらの発明をそれぞれその好ましい１つ（または複数）の形式で開示したが、本明細書で開示し図示したこれらの発明の特定の実施形態を限定的に捉えるべきではない。というのは、数多くの変形例が可能だからである。本発明の対象は、本明細書で開示した様々な要素、特徴、機能、および／または特性のあらゆる新規の自明でない組合せおよび小規模な組合せを含む。添付の特許請求の範囲では、特に、新規で自明でないと見なせるある種の組合せおよび小規模な組合せを示す。上記特徴、機能、要素、および／または特性の他の組合せおよび小規模な組合せで実施される発明は、本出願または関連出願の権利を主張する出願で特許請求することができる。このような特許請求の範囲は、異なる発明や同じ発明を対象にしていたり、元となる特許請求の範囲よりも広かったり、狭かったり、同じであったり、または異なったりするが、本開示の発明の対象に含まれると見なせる。

７０ 検出ユニット
７２ 光
７４ 液滴
７６ 流路
７８ 照明アセンブリ
８０ 集光アセンブリ
８２、８４ 光源
８５ 照明光学素子
８６、８８ 検出器
９０ 集光光学素子
９２ 検査領域
９６ 乳剤
９８ 連続相
１００ 乳剤、液滴の動き
１０２ 集光
１０４ 入射光
１０６ 集光光路
１０８ 入射光路

Claims (94)

1. 液滴を検出する方法であって、
   流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するステップであって、前記第１のパルスは前記第２のパルスとスペクトル的に異なる、ステップと、
   前記検査領域が前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで照明される期間に検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
2. 前記第１のパルスは第１の範囲の波長の光を画定し、前記第２のパルスは第２の範囲の波長の光を画定し、前記第１の範囲は前記第２の範囲と異なる、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１のパルスのみが単一波長の光によって生成されるか、または、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスがともにそれぞれの単一波長の光によって生成される、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１のパルスはパルス化された光源によって生成される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれのパルス化された光源によって生成される、請求項１に記載の方法。
6. 前記第１のパルスまたは前記第２のパルス、あるいは前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの両方は、前記検査領域まで間欠的に伝達される少なくとも１つの連続光ビームによって生成される、請求項１に記載の方法。
7. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、少なくとも１つのＬＥＤから放出される光を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれのパルス化されたＬＥＤから放出される、請求項７に記載の方法。
9. 前記検査領域のうちそれぞれ重なり合う体積が、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスによって照明される、請求項１に記載の方法。
10. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に、前記検査領域の重なり合う体積からの光を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
11. 少なくとも１つの第１のパルスおよび少なくとも１つの第２のパルスで各液滴が照明される、請求項１に記載の方法。
12. 複数の第１のパルスおよび複数の第２のパルスで各液滴が照明される、請求項１１に記載の方法。
13. 各液滴は、前記液滴の直径よりも狭い光ビームで照明される、請求項１に記載の方法。
14. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、それぞれ第１および第２の光源によって放出される光を含み、前記方法は、前記第１および第２の光源によって放出される前記光を、前記光が前記検査領域を照明する前にスリットを通過させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. データを収集する前記ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光をそれぞれ表す第１の信号および第２の信号を生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記液滴は第１の色素および第２の色素を含み、前記第１の信号は第１の検出構成から生成され、前記第２の信号は第２の検出構成から生成され、前記第１の検出構成の前記第１および第２の色素に対する感度は、前記第２の検出構成の前記第１および第２の色素に対する感度と相対的に異なる、請求項１５に記載の方法。
17. 第１の検出器および第２の検出器で前記検査領域からの光を検出するステップをさらに含み、前記第１の信号は前記第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は前記第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、請求項１５に記載の方法。
18. 各検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に光を検出する、請求項１７に記載の方法。
19. 各検出器の利得は、第１のパルスまたは第２のパルスが前記流路の前記検査領域を照明しているかどうかに従って経時的に調整される、請求項１７に記載の方法。
20. 前記第１の信号および前記第２の信号は周期信号である、請求項１５に記載の方法。
21. 前記データは、前記検査領域が前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで照明される期間に同じ検出器で検出される光を表す、請求項１に記載の方法。
22. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に前記検査領域からの光を検出するステップをさらに含み、光を検出する前記ステップでは、第１の信号および第２の信号が生成され、データを収集する前記ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスに対応して前記第１の信号および前記第２の信号をそれぞれ周期的にゲーティングするステップを含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記照明ステップは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する光ビームを前記流路と交差させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記照明ステップは、前記流路の円盤状の体積を照明するステップを含む、請求項１に記載の方法。
25. 前記照明ステップは、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスとスペクトル的に異なる第３の光パルスで前記流路の前記検査領域を照明するステップを含む、請求項１に記載の方法。
26. 液滴を検出する方法であって、
    流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光源および第２の光源によって放出される光パルスで交互に照明するステップと、
    前記光パルスによって照明される前記検査領域からの光を検出するステップと、
    第１の信号および第２の信号を生成するステップとを含み、
    前記第１の信号は、第１の領域が前記第１の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は、第２の領域が前記第２の光源からの光パルスで照明されるときに少なくとも他に優先して検出される光を表す、方法。
27. 前記第１の信号および前記第２の信号に基づいて、前記液滴中の第１の標的および第２の標的の濃度を推定するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
28. 個々の液滴中で増幅反応が起こったかどうかを判断するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
29. 液滴に基づくアッセイ用の検出システムであって、
    流路と、
    前記流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに第１の光パルスに対して第２の光パルスが交互に配置された光パルスで照明するように構成された照明アセンブリであって、前記第１のパルスは前記第２のパルスとスペクトル的に異なる、照明アセンブリと、
    前記検査領域からの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器と、
    前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光を表すデータを収集する制御部とを備える、システム。
30. 前記第１のパルスは第１の範囲の波長の光を画定し、前記第２のパルスは第２の範囲の波長の光を画定し、前記第１の範囲は前記第２の範囲と異なる、請求項２９に記載のシステム。
31. 前記第１のパルスのみが単一波長の光によって生成されるか、または、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスがともにそれぞれの単一波長の光によって生成される、請求項２９に記載のシステム。
32. 前記照明アセンブリは少なくとも１つのパルス化された光源を備える、請求項２９に記載のシステム。
33. 前記照明アセンブリは１対のパルス化されたＬＥＤを備える、請求項２９に記載のシステム。
34. 前記照明アセンブリは、前記検査領域に間欠的に伝達される光ビームを放出するように構成された少なくとも１つの連続光源を備える、請求項２９に記載のシステム。
35. 前記第１のパルスおよび前記第２のパルスは、前記検査領域の重なり合う体積を照明するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
36. 前記１つまたは複数の検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に前記検査領域の重なり合う体積からの光を検出するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
37. 前記照明アセンブリは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する光ビームで前記検査領域を照明するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
38. 前記照明アセンブリは、光が前記検査領域を照明する前に通過する少なくとも１つのスリットを備える、請求項２９に記載のシステム。
39. 前記制御部は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスで前記検査領域が照明される期間に検出される光をそれぞれ表す第１の信号および第２の信号を生成するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
40. 前記１つまたは複数の検出器は、第１の検出器および第２の検出器を含み、前記第１の信号は前記第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は前記第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、請求項３９に記載のシステム。
41. 各検出器は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスの期間に光を検出するように構成される、請求項４０に記載のシステム。
42. 前記第１の信号および前記第２の信号は周期信号である、請求項３９に記載のシステム。
43. 前記制御部は、第１のパルスまたは第２のパルスが前記流路の前記検査領域を照明しているかどうかに従って、経時的に各検出器の利得を調整するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
44. 前記１つまたは複数の検出器は、それぞれ少なくともほぼ連続な第１の信号および第２の信号を生成し、前記制御部は、前記第１のパルスおよび前記第２のパルスに対応して前記第１の信号および前記第２の信号をそれぞれ周期的にゲートして前記信号を周期的にするように構成される、請求項２９に記載のシステム。
45. 前記照明アセンブリは、前記流路によって画定される長軸に対して横に細長い断面を有する光ビームを形成する、請求項２９に記載のシステム。
46. 前記照明アセンブリは、前記流路の円盤状の体積を照明するように構成される、請求項２９に記載のシステム。
47. 前記照明アセンブリは、第１の光源および第２の光源を備え、前記システムは、前記光源が前記流路の重なり合う体積を照明するときに、前記液滴を前記検査領域に通過させるように構成された少なくとも１つのポンプをさらに備える、請求項２９に記載のシステム。
48. 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、
    流路と、
    前記流路の検査領域を、液滴が前記領域を通過するときに照明する光ビームを生成するように構成された照明アセンブリと、
    前記検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、
    前記検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備え、
    前記光ビームは、前記流路と交差する断面が細長い、システム。
49. 前記照明アセンブリは光源およびスリットを備え、前記光源によって放射される光は、前記検査領域に到達する前に前記スリットを通過する、請求項４８に記載のシステム。
50. 前記光ビームは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する、請求項４８に記載のシステム。
51. 前記ビームの断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記流路の対向する面から外側に延びる、請求項４８に記載のシステム。
52. 前記流路はチューブによって画定され、前記ビームの断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記チューブの直径よりも長い、請求項５１に記載のシステム。
53. 前記断面は、前記流路全体の半分の位置で、前記チューブと交差しない対向する端部を有する、請求項５２に記載のシステム。
54. 前記光ビームは、前記流路の円盤状の体積を照明する、請求項４８に記載のシステム。
55. 前記光ビームは対向する平坦な側面を有する、請求項４８に記載のシステム。
56. 前記光ビームは前記流路の長軸に平行な寸法を有し、前記寸法にわたって前記ビームが前記流路と交差し、前記寸法は前記流路の直径よりも短い、請求項４８に記載のシステム。
57. 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、
    流路と、
    前記流路の検査領域を、液滴が前記領域を通過するときに照明する光源と、
    前記検査領域から受け取った光を検出するように構成された検出器と、
    前記検出器によって検出される光を表すデータを収集する制御部とを備え、
    前記光源が放出する光は、前記光源と前記検出器との間の少なくとも１つのスリットを通過して進む、システム。
58. 前記少なくとも１つのスリットは、前記光源から前記検査領域への光路上に配設されるスリットを含む、請求項５７に記載のシステム。
59. 前記少なくとも１つのスリットは、集光光学素子と前記流路との間に配設されるスリットを含む、請求項５７に記載のシステム。
60. 液滴を検出する方法であって、
    断面が細長い光ビームで流路の検査領域を照明するステップと、
    複数の液滴が前記検査領域を通過するときに、前記領域から経時的に検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
61. 前記照明ステップは、光源と前記検査領域との間の光路上に配設されたスリットを通して光を送るステップを含む、請求項６０に記載の方法。
62. 前記検査領域の円盤状の体積を照明する、請求項６０に記載の方法。
63. 前記光ビームは、前記流路によって画定される長軸に対して横方向に細長い断面を有する、請求項６０に記載の方法。
64. 前記照明ステップは、液滴を、前記液滴の直径よりも薄い光ビームで照明するステップを含む、請求項６０に記載の方法。
65. 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、
    液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す少なくとも２つの別個の信号を生成するステップと、
    前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するステップと、
    前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を特定するステップとを含む、方法。
66. 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値の線形結合を形成するステップを含む、請求項６５に記載の方法。
67. 線形結合を形成する前記ステップは、前記値を同じ割合で含む線形結合を形成するステップを含む、請求項６６に記載の方法。
68. 前記混合ステップは、前記少なくとも２つの信号によるデジタル形式で行われる、請求項６５に記載の方法。
69. 前記混合ステップは、前記少なくとも２つの信号が生成されているときに、少なくとも部分的に行われる、請求項６５に記載の方法。
70. 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値を混合するステップを含み、所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間のそれぞれ異なる部分で検出される光を表す、請求項６５に記載の方法。
71. 所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間の互いに重なり合わない部分で検出器される光を表す、請求項７０に記載の方法。
72. 前記混合ステップは、個々の期間ごとに前記別個の信号からの値を混合するステップを含み、所与の期間ごとに混合される値の各々は、前記所与の期間の同じ部分またはすべての部分で検出される光を表す、請求項６５に記載の方法。
73. 前記別個の信号は、流体の流れを保持する流路のある領域から、第１の光源および第２の光源からの交互に配置された光パルスで前記領域が照明される期間に検出される光を表す第１の信号および第２の信号を含む、請求項６５に記載の方法。
74. 前記第１の信号は、前記第１の光源からのパルス期間に第１の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表し、前記第２の信号は、前記第２の光源からのパルス期間に第２の検出器によって少なくとも他に優先して検出される光を表す、請求項７３に記載の方法。
75. それぞれの異なる色素は蛍光体を含む、請求項６５に記載の方法。
76. 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、
    液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長または波長帯の光を表す少なくとも２つの別個の信号を生成するステップであって、それぞれの波長または波長帯から検出される光は個々の液滴中の異なる標的の存在の有無を示す、ステップと、
    前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成するステップと、
    前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するステップと、
    前記識別された期間に検出された別個の信号の各々の値に基づいて、液滴が異なる標的の各々を含むかを判断するステップとを含む、方法。
77. 液滴に基づくアッセイ用の検出方法であって、
    液滴を含む流体の流れから一連の期間に検出されるそれぞれ異なる波長帯の光を表す少なくとも２つの信号を生成するステップと、
    前記少なくとも２つの信号の複数の値を混合して混合信号を形成するステップと、
    前記混合信号の液滴に対応する部分を識別するステップと、
    前記識別された部分に対応する前記少なくとも２つの信号の値を処理して、どの液滴がどの標的を含むかを判断するステップとを含む、方法。
78. 液滴に基づくアッセイ用の検出システムであって、
    少なくとも２つの異なる色素を含む液滴を運ぶ流体の流れからの光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器と、
    液滴を運ぶ流体の流れから一連の期間に、それぞれ異なる検出構成で検出される光を表す別個の信号を生成し、前記少なくとも２つの別個の信号を混合して混合信号を形成し、前記混合信号を処理して液滴に対応する期間を識別するように構成された制御部とを備える、システム。
79. 液滴用の検出方法であって、
    第１の色素および第２の色素を含む液滴を準備するステップであって、前記第１の色素の発光スペクトルおよび前記第２の色素の吸収スペクトルが、重なり合う波長帯を画定し、前記重なり合いは、前記第１の色素が前記第２の色素の最大吸収波長で励起された場合に前記第１の色素からその発光最大値の少なくとも半分が生成される程度に大きい、ステップと、
    前記第１の色素および前記第２の色素をともに励起し得る励起光で前記液滴を照明するステップであって、前記励起光は１つまたは複数のＬＥＤによって放出され、前記重なり合う波長帯の短波長側の区域のみを含む、ステップと、
    前記第１の色素および前記第２の色素が放出する光を検出するステップとを含み、前記第２の色素が放出する光は、前記短波長側の区域から離れた前記重なり合う波長帯の長波長側の区域のみを含む波長域で検出される、方法。
80. 前記吸収スペクトルおよび前記発光スペクトルが、それぞれ約２０ｎｍ以内である波長でそれぞれ最大値を有する、請求項７９に記載の方法。
81. 前記１つまたは複数のＬＥＤは、前記第１の色素を選択的に励起する第１のＬＥＤおよび前記第２の色素を選択的に励起する第２のＬＥＤを含む、請求項７９に記載の方法。
82. 前記第１の色素および前記第２の色素からそれぞれ選択的に検出される光を表す第１の組のデータおよび第２の組のデータを収集するステップをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
83. 前記第１の色素はＦＡＭ色素であり、前記第２の色素はＶＩＣ色素である、請求項７９に記載の方法。
84. 前記重なり合う波長帯は、前記それぞれのスペクトルがその吸収または発光の最大値の２０％以上の値で重なり合うところとして定義され、前記重なり合う波長帯の幅は少なくとも２５ｎｍである、請求項７９に記載の方法。
85. 液滴に基づくアッセイにおける検出システムであって、
    第１の色素および第２の色素を含む液滴を受け取るように構成された流路であって、前記第１の色素の発光スペクトルおよび前記第２の色素の吸収スペクトルにより重なり合う波長帯が画定され、前記重なり合いは、前記第１の色素が前記第２の色素の最大吸収波長で励起された場合に前記第１の色素からその最大発光値の少なくとも半分が生成される程度に大きい、流路と、
    １つまたは複数のＬＥＤを含み、前記第１および第２の色素をともに励起し得る励起光で前記液滴を照明するように構成された照明アセンブリであって、前記励起光は、前記ＬＥＤから放出され、前記重なり合う波長帯の短波長側の区域のみを含む、照明アセンブリと、
    前記第１の色素および前記第２の色素が放出する光を検出するように構成された１つまたは複数の検出器であって、前記第２の色素からの前記光は、前記短波長側の区域から離れた前記重なり合う波長帯の長波長側の区域のみを含む波長域で検出される、検出器と、を備えるシステム。
86. 前記照明アセンブリは、前記短波長側の区域を画定する１つまたは複数のフィルタを備える、請求項８５に記載のシステム。
87. 前記１つまたは複数の検出器を含む集光アセンブリをさらに備え、前記集光アセンブリは、前記長波長側の区域を画定する１つまたは複数のフィルタを含む、請求項８５に記載のシステム。
88. 液滴用の検出方法であって、
    光ビームを生成するステップと、
    前記光ビームを主ビームおよび少なくとも１つのサンプリングビームに分岐するステップと、
    前記サンプリングビームの強度を監視するステップと、
    前記監視ステップから得られる１つまたは複数の測定値に基づいて、前記光ビームの強度を調整するステップと、
    流路の検査領域を、液滴が前記検査領域を通過するときに前記主ビームで照明するステップと、
    前記検査領域から検出される光を表すデータを収集するステップとを含む、方法。
89. 光ビームを生成する前記ステップは、光源から放出される光をフィルタリングして前記放出される光のスペクトルを変化させるステップを含み、前記分岐ステップは、前記フィルタリングステップの後で実施される、請求項８８に記載の方法。
90. 前記フィルタリングステップは、特定波長域透過波長フィルタ、長波長透過フィルタ、短波長透過フィルタ、またはこれらの組合せを用いて実施される、請求項８８に記載の方法。
91. 光ビームを生成する前記ステップは、少なくとも２つの光源から放出される光ビームを混合するステップを含み、前記混合ステップは、前記フィルタリングステップの後で実施される、請求項８８に記載の方法。
92. 光ビームを生成する前記ステップは、ＬＥＤを用いて光を放出させるステップを含む、請求項８８に記載の方法。
93. 光ビームを生成する前記ステップは、第１の光源および第２の光源からの光を混合するステップを含み、前記分岐ステップは、前記光ビームを第１のサンプリングビームおよび第２のサンプリングビームに分岐するステップを含み、前記第１のサンプリングビームは前記第１の光源に対応し、前記第２のサンプリングビームは前記第２の光源に対応する、請求項８８に記載の方法。
94. 前記調整ステップにより、前記主ビームの各光源に対応する部分の強度がほぼ一定に保たれる、請求項９３に記載の方法。

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