JP3120453B2 - 微小液滴の保持方法、反応方法 - Google Patents
微小液滴の保持方法、反応方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、化学反応などに用いられる極微量の溶液を
ガラスプレート表面などに安定に保持する方法、微量の
試薬を用いてPCR反応等の反応を行う方法及びそれに用
いるに適した反応容器に関する。
ガラスプレート表面などに安定に保持する方法、微量の
試薬を用いてPCR反応等の反応を行う方法及びそれに用
いるに適した反応容器に関する。
背景技術 近年、バイオテクノロジーの分野では、PCR（polymer
ase chainreaction）やEIA（enzyme immunoassay）など
の反応が利用されている。これらの反応においては、コ
スト削減などの観点から、反応液量の微量化が重要であ
る。紙にインクを付着させて文字や画像を可視化するイ
ンクジェットの技術は、もともとは印刷のために開発さ
れたものではあるが、極微量の液体を正確かつ高速に分
注可能であり、反応液量の微量化のための技術として応
用が図られてきた。
ase chainreaction）やEIA（enzyme immunoassay）など
の反応が利用されている。これらの反応においては、コ
スト削減などの観点から、反応液量の微量化が重要であ
る。紙にインクを付着させて文字や画像を可視化するイ
ンクジェットの技術は、もともとは印刷のために開発さ
れたものではあるが、極微量の液体を正確かつ高速に分
注可能であり、反応液量の微量化のための技術として応
用が図られてきた。
特許第4,877,745号明細書及びBioTechniques 15,324
（1993）にはインクジェット技術の分注器としての利用
法が記載され、米国特許第5,449,754号明細書及び米国
特許第5,474,796号明細書にはインクジェット技術の有
機化学合成への応用が記載され、特開平４−262256号公
報、特開平４−289457号公報及びAnalytical Chemistry
67,3051にはインクジェット技術の免疫学的反応への応
用が記載されている。例えば、特開平４−262256号公報
には、必要な試薬をインクジェットによってフィルム上
に印刷しておき、使用時に50μｌ（マイクロリットル）
程度のサンプル溶液を加え、試薬を溶出させて反応を行
い、洗浄、発色を経て検出する方法が記載されている。
（1993）にはインクジェット技術の分注器としての利用
法が記載され、米国特許第5,449,754号明細書及び米国
特許第5,474,796号明細書にはインクジェット技術の有
機化学合成への応用が記載され、特開平４−262256号公
報、特開平４−289457号公報及びAnalytical Chemistry
67,3051にはインクジェット技術の免疫学的反応への応
用が記載されている。例えば、特開平４−262256号公報
には、必要な試薬をインクジェットによってフィルム上
に印刷しておき、使用時に50μｌ（マイクロリットル）
程度のサンプル溶液を加え、試薬を溶出させて反応を行
い、洗浄、発色を経て検出する方法が記載されている。
このように、化学反応における反応溶液の分注器とし
てインクジェットを利用することが考えられているが、
臨床検査などで多数の反応を並列的に行う場合、試薬コ
スト低減のため個々の液量はできるだけ少ない方が望ま
しく、例えば100nl（ナノリットル）以下とするのが望
ましい。しかし、これまでインクジェットを利用して10
0nl以下、例えば10nl〜1pl（ピコリットル）程度の極微
量の液中で臨床検査の反応、例えばPCRや免疫学的反応
を行った例は報告されていない。前記した特開平４−26
2256号公報の例では、反応時の液量は50μｌであり、極
微量とはいえない。
てインクジェットを利用することが考えられているが、
臨床検査などで多数の反応を並列的に行う場合、試薬コ
スト低減のため個々の液量はできるだけ少ない方が望ま
しく、例えば100nl（ナノリットル）以下とするのが望
ましい。しかし、これまでインクジェットを利用して10
0nl以下、例えば10nl〜1pl（ピコリットル）程度の極微
量の液中で臨床検査の反応、例えばPCRや免疫学的反応
を行った例は報告されていない。前記した特開平４−26
2256号公報の例では、反応時の液量は50μｌであり、極
微量とはいえない。
インクジェットを用いて極微量の反応を行った例がこ
れまで報告されていない理由の一つは、インクジェット
で分注した極微量の水溶液は、空気中では数秒程度で蒸
発してしまうからである。米国特許第5,449,754号明細
書におけるように一瞬で完了する有機化学反応では極微
量の反応例が報告されているが、通常の臨床検査の反応
には数分から数時間の時間がかかり、その間反応液を蒸
発させずに空気中に保持しておくのは困難である。
れまで報告されていない理由の一つは、インクジェット
で分注した極微量の水溶液は、空気中では数秒程度で蒸
発してしまうからである。米国特許第5,449,754号明細
書におけるように一瞬で完了する有機化学反応では極微
量の反応例が報告されているが、通常の臨床検査の反応
には数分から数時間の時間がかかり、その間反応液を蒸
発させずに空気中に保持しておくのは困難である。
また、極微量の反応をするために不可欠というわけで
はないが、蛍光法、比色法などにより反応の有無を検出
するとき、反応液が極微量では通常の液量の場合と比べ
て光路長が著しく短くなり、検出が困難になる。従っ
て、測定の際の光路長を長くするための工夫が必要であ
る。
はないが、蛍光法、比色法などにより反応の有無を検出
するとき、反応液が極微量では通常の液量の場合と比べ
て光路長が著しく短くなり、検出が困難になる。従っ
て、測定の際の光路長を長くするための工夫が必要であ
る。
発明の開示 本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みてなさ
れたもので、化学反応などのために例えばインクジェッ
ト法によって吐出された極微量の溶液を蒸発させること
なく長時間安定に保持する方法を提供することを目的と
する。
れたもので、化学反応などのために例えばインクジェッ
ト法によって吐出された極微量の溶液を蒸発させること
なく長時間安定に保持する方法を提供することを目的と
する。
また、本発明は、インクジェット法などによって吐出
された極微量の溶液に対する光学的検出を容易にするた
め、光路長を増大させる方法を提供することを目的とす
る。
された極微量の溶液に対する光学的検出を容易にするた
め、光路長を増大させる方法を提供することを目的とす
る。
本発明は、また、インクジェット法によって吐出され
た微量の試薬を用いてPCR反応などの反応を行わせる方
法、及びそれに用いるのに適した反応容器を提供するこ
とを目的とする。
た微量の試薬を用いてPCR反応などの反応を行わせる方
法、及びそれに用いるのに適した反応容器を提供するこ
とを目的とする。
本発明では、例えばガラス平板などの基板上に、保持
したい極微量の溶液（微小液滴）と混合しにくいオイル
などの液体層を形成し、その液体層中で微小液滴を基板
表面に接触させて保持することで前記目的を達成する。
微小液滴が水性のとき、基板表面に被覆される液体層は
油性とすることができる。また、微小液滴は、基板表面
に被覆された液体層の表面からインクジェット技術など
により打ち込むことができる。
したい極微量の溶液（微小液滴）と混合しにくいオイル
などの液体層を形成し、その液体層中で微小液滴を基板
表面に接触させて保持することで前記目的を達成する。
微小液滴が水性のとき、基板表面に被覆される液体層は
油性とすることができる。また、微小液滴は、基板表面
に被覆された液体層の表面からインクジェット技術など
により打ち込むことができる。
基板上に形成する液体層の粘度や膜厚を適当に選択す
ることにより、液体層の表面から打ち込まれた微小液滴
は基板表面に付着し、液体層の内部に隠れた状態で安定
に保持される。微小液滴は、それと混合しない液体によ
り周囲を覆われているため、蒸発を大幅に減少すること
ができる。また、基板表面に付着して保持されていて位
置が固定されているため、この状態でインクジェット技
術によってさらに試薬を追加することも可能である。
ることにより、液体層の表面から打ち込まれた微小液滴
は基板表面に付着し、液体層の内部に隠れた状態で安定
に保持される。微小液滴は、それと混合しない液体によ
り周囲を覆われているため、蒸発を大幅に減少すること
ができる。また、基板表面に付着して保持されていて位
置が固定されているため、この状態でインクジェット技
術によってさらに試薬を追加することも可能である。
例えば、インクジェット法によって液体層に打ち込む
微小液滴の量が40plのとき、液体層の最適粘度は20〜50
cp、最適膜厚は20〜30μｍである。基板表面に被覆する
液体層の膜厚が薄すぎると、微小液滴はその一部分が液
体層から露出し、蒸発してしまう。また、液体層の膜厚
が厚すぎると、微小液滴は液体層中を浮遊して位置が定
まらないため、試薬の追加などが困難になる。
微小液滴の量が40plのとき、液体層の最適粘度は20〜50
cp、最適膜厚は20〜30μｍである。基板表面に被覆する
液体層の膜厚が薄すぎると、微小液滴はその一部分が液
体層から露出し、蒸発してしまう。また、液体層の膜厚
が厚すぎると、微小液滴は液体層中を浮遊して位置が定
まらないため、試薬の追加などが困難になる。
基板表面に撥水性をもたせることもできる。ここで撥
水性とは、基板表面に付着した液滴において、基板表面
に対する液滴の立ち上がり角度（接触角）の大きさで表
現されるもので、接触角が大きいほど撥水効果が大き
い。また、本発明においては、通常使用されるガラス基
板に付着した液滴の接触角に対して、より大きい接触角
を有する基板表面について撥水性を有すると表現する。
この撥水性は、基板自体をポリプロピレンなどの撥水性
を有する材料で作製することで付与してもよいし、基板
上に撥水性材料をコーティングすることで付与してもよ
い。
水性とは、基板表面に付着した液滴において、基板表面
に対する液滴の立ち上がり角度（接触角）の大きさで表
現されるもので、接触角が大きいほど撥水効果が大き
い。また、本発明においては、通常使用されるガラス基
板に付着した液滴の接触角に対して、より大きい接触角
を有する基板表面について撥水性を有すると表現する。
この撥水性は、基板自体をポリプロピレンなどの撥水性
を有する材料で作製することで付与してもよいし、基板
上に撥水性材料をコーティングすることで付与してもよ
い。
基板表面が撥水性を有していると、基板表面に付着し
た水性の微小液滴は基板との接触面積が小さくなって液
体層の膜厚方向に立ち上がる。従って、微小液滴中で生
じる化学反応を基板に垂直な方向から蛍光法や比色法な
どの光学的方法によって検出するとき、光路長が増大す
るため検出が容易になる。この場合、撥水性を有する基
板あるいは撥水性コーティングは、微小液滴の光学的測
定に影響を与えるものではないことが必要である。
た水性の微小液滴は基板との接触面積が小さくなって液
体層の膜厚方向に立ち上がる。従って、微小液滴中で生
じる化学反応を基板に垂直な方向から蛍光法や比色法な
どの光学的方法によって検出するとき、光路長が増大す
るため検出が容易になる。この場合、撥水性を有する基
板あるいは撥水性コーティングは、微小液滴の光学的測
定に影響を与えるものではないことが必要である。
基板を覆っている液体層中に微小液滴を打ち込んで基
板表面に微小液滴を保持したのち、液体層の上に透明な
スライドグラス等のカバーをかけるようにすると、加熱
の際に生じる対流などによって液体層の液面が乱れるの
を防止し、微小液滴が液体層から露出して蒸発するのを
防止することができる。カバーをかけるに先立って、液
体層に液体を補充してもよい。
板表面に微小液滴を保持したのち、液体層の上に透明な
スライドグラス等のカバーをかけるようにすると、加熱
の際に生じる対流などによって液体層の液面が乱れるの
を防止し、微小液滴が液体層から露出して蒸発するのを
防止することができる。カバーをかけるに先立って、液
体層に液体を補充してもよい。
また、液体層中に打ち込んだ微小液滴の近くの液体層
中に他の水性液体を配置することも微小液滴を安定に保
持する上で有効である。液体層中に保持されている微小
液滴は、反応過程で加熱した際などに周囲の液体に溶出
して体積が減少する傾向がある。反応を行う水性の微小
液滴のすぐ近くに他の水滴を配置すると、微小液滴の近
くの液体層の局所的水分含有量を大きくすることがで
き、反応を行う微小液滴の溶出防止に効果がある。溶出
防止用の水滴の代わりに、反応を行う微小液滴を密集し
て配置することでも同様の溶出緩和効果が得られる。
中に他の水性液体を配置することも微小液滴を安定に保
持する上で有効である。液体層中に保持されている微小
液滴は、反応過程で加熱した際などに周囲の液体に溶出
して体積が減少する傾向がある。反応を行う水性の微小
液滴のすぐ近くに他の水滴を配置すると、微小液滴の近
くの液体層の局所的水分含有量を大きくすることがで
き、反応を行う微小液滴の溶出防止に効果がある。溶出
防止用の水滴の代わりに、反応を行う微小液滴を密集し
て配置することでも同様の溶出緩和効果が得られる。
さらに、光学的測定のための光路長増大の点からは、
微小液滴を液体層の上に配置した透明カバーにも接触さ
せるのが望ましい。これは、基板とカバーとの間の間隔
を狭めて微小水滴を一度カバーに接触させ、そののち基
板とカバーの間隔を再び広げることにより実現できる。
そのためには、基板とカバーとの間のスペーサとして弾
性のある部材を用いるのが好ましい。基板とカバーの間
隔を狭める動作は、最も簡単には指でカバーを押圧する
ことによって行うことができるが、精密モータや圧電素
子を用いてカバーを基板側に押圧することで行つてもよ
い。このように微小液滴を基板表面とカバー底面の両方
に接触させて保持することにより、微小液滴内の基板垂
直方向の光路長を増大することができるとともに、光路
長を一定にすることが可能となり、測定の精度及び信頼
性を向上することができる。
微小液滴を液体層の上に配置した透明カバーにも接触さ
せるのが望ましい。これは、基板とカバーとの間の間隔
を狭めて微小水滴を一度カバーに接触させ、そののち基
板とカバーの間隔を再び広げることにより実現できる。
そのためには、基板とカバーとの間のスペーサとして弾
性のある部材を用いるのが好ましい。基板とカバーの間
隔を狭める動作は、最も簡単には指でカバーを押圧する
ことによって行うことができるが、精密モータや圧電素
子を用いてカバーを基板側に押圧することで行つてもよ
い。このように微小液滴を基板表面とカバー底面の両方
に接触させて保持することにより、微小液滴内の基板垂
直方向の光路長を増大することができるとともに、光路
長を一定にすることが可能となり、測定の精度及び信頼
性を向上することができる。
本発明の反応容器は、透明な下板と、厚さ0.05mm以下
のスペーサと、透明な上板とからなり、スペーサで囲ま
れた領域に溶液を収容することを特徴とする。スペーサ
は両面接着テープとすることができる。また、溶液との
接触部位はウシ血清アルブミンコートを有するのが好ま
しい。
のスペーサと、透明な上板とからなり、スペーサで囲ま
れた領域に溶液を収容することを特徴とする。スペーサ
は両面接着テープとすることができる。また、溶液との
接触部位はウシ血清アルブミンコートを有するのが好ま
しい。
PCRチャンバとしては、エッチング技術によって作製
されたPCR小型反応チャンバがいくつか発表されている
（例えば、松本壮平、工業技術院機械技術研究所発行
「機械研ニュース」533号、No.5、６〜８頁、1996
年）。これらの反応容器は、内部全体にPCR反応液を満
たして使用するもので本発明の反応容器とは使用方法が
異なるが、図21に示した本発明の反応容器は、エッチン
グで作製されるPCRチャンバと比較しても、量産品の
カバーグラスに簡単なコーティングを施し、スペーサも
簡単な紙加工で作製するものであるため、構造が簡単で
安価である、エッチングで作製されたPCRチャンバは
表面仕上げが粗く、沸騰気泡核が存在し、それによって
気泡が発生したり、温度制御が影響を受ける（前述の文
献参照）が、本発明の反応容器は、通常のガラス等の材
料を張り合わせたものなので、必要なだけ精密な表面仕
上げが可能である、エッチングで作製されたPCRチャ
ンバでは、全体の組立が終わってから、細い流路が詰ま
らないようにコーティングのための薬品を流し、その後
乾燥させるというコーティングの方法をとり、この方法
で可能なコーティング手法はシリコンコートなどに限ら
れていが、本発明の反応容器は、組立前にコーティング
を行うので、スピナーの利用、ポリマーのラミネート等
あらゆる手法が可能であり、内部表面のコーティングが
容易である、などの利点を有する。
されたPCR小型反応チャンバがいくつか発表されている
（例えば、松本壮平、工業技術院機械技術研究所発行
「機械研ニュース」533号、No.5、６〜８頁、1996
年）。これらの反応容器は、内部全体にPCR反応液を満
たして使用するもので本発明の反応容器とは使用方法が
異なるが、図21に示した本発明の反応容器は、エッチン
グで作製されるPCRチャンバと比較しても、量産品の
カバーグラスに簡単なコーティングを施し、スペーサも
簡単な紙加工で作製するものであるため、構造が簡単で
安価である、エッチングで作製されたPCRチャンバは
表面仕上げが粗く、沸騰気泡核が存在し、それによって
気泡が発生したり、温度制御が影響を受ける（前述の文
献参照）が、本発明の反応容器は、通常のガラス等の材
料を張り合わせたものなので、必要なだけ精密な表面仕
上げが可能である、エッチングで作製されたPCRチャ
ンバでは、全体の組立が終わってから、細い流路が詰ま
らないようにコーティングのための薬品を流し、その後
乾燥させるというコーティングの方法をとり、この方法
で可能なコーティング手法はシリコンコートなどに限ら
れていが、本発明の反応容器は、組立前にコーティング
を行うので、スピナーの利用、ポリマーのラミネート等
あらゆる手法が可能であり、内部表面のコーティングが
容易である、などの利点を有する。
本発明は、PCR法、イムノアッセイ等の微量試料の反
応に適用することができる。高温反応（50℃以上）を伴
うPCR以外の生化学反応、例えばLCR（リガーゼチェーン
リアクション）ハイブリダイゼーション等にも有効であ
る。本発明による反応方法は、微小液滴を基板表面に被
覆された微小液滴と２相に分離する液体層中で基板表面
に接触させて保持するとともに液体層表面をカバーで覆
い、微小液滴中で反応を行わせることを特徴とする。微
小液滴はDNAを含む水性液滴とすることができ、基板表
面に被覆された液体層は油性の液体層とすることができ
る。
応に適用することができる。高温反応（50℃以上）を伴
うPCR以外の生化学反応、例えばLCR（リガーゼチェーン
リアクション）ハイブリダイゼーション等にも有効であ
る。本発明による反応方法は、微小液滴を基板表面に被
覆された微小液滴と２相に分離する液体層中で基板表面
に接触させて保持するとともに液体層表面をカバーで覆
い、微小液滴中で反応を行わせることを特徴とする。微
小液滴はDNAを含む水性液滴とすることができ、基板表
面に被覆された液体層は油性の液体層とすることができ
る。
微小液滴はインクジェット技術によって吐出すること
で基板表面に付着させることができる。微小液滴は、予
め油性の液体層で被覆されている基板に、その液体層の
表面からインクジェットヘッドによって基板表面に達す
るように打ち込んでもよいし、液体層で被覆されていな
い基板表面に直接吐出して付着させ、その後に油性の液
体層を塗布するようにしてもよい。
で基板表面に付着させることができる。微小液滴は、予
め油性の液体層で被覆されている基板に、その液体層の
表面からインクジェットヘッドによって基板表面に達す
るように打ち込んでもよいし、液体層で被覆されていな
い基板表面に直接吐出して付着させ、その後に油性の液
体層を塗布するようにしてもよい。
微小液滴の接触部位は、シリコンコートなどの酵素吸
着防止剤を有するのが望ましい。また、微小液滴の接触
部位はウシ血清アルブミンコートを有するのが好まし
い。ウシ血清アルブミンコートは、特に微小液滴を液体
層で被覆されていない基板表面にインクジェットヘッド
から吐出して付着させる場合、微小液滴の付着性を改善
する効果がある。
着防止剤を有するのが望ましい。また、微小液滴の接触
部位はウシ血清アルブミンコートを有するのが好まし
い。ウシ血清アルブミンコートは、特に微小液滴を液体
層で被覆されていない基板表面にインクジェットヘッド
から吐出して付着させる場合、微小液滴の付着性を改善
する効果がある。
反応容器内部のコーティングとしては、これ以外にも
種々のコーティングを利用することができる。反応容器
内面のコーティングの条件としては、一般に、酸素の
吸着が少ないこと、水滴の付着性が良好であること、
が望ましいが、これらの条件を満たすコーティングとし
て、親水性ポリマーによるコーティングがある。これら
のコーティングは、もともと人工臓器などの医療器具や
分析用キャピラリカラムにおいてタンパク質の吸着を防
止するために開発されたもので、これまで多数の例があ
り、容易に反応容器のコーティングに適用可能である。
種々のコーティングを利用することができる。反応容器
内面のコーティングの条件としては、一般に、酸素の
吸着が少ないこと、水滴の付着性が良好であること、
が望ましいが、これらの条件を満たすコーティングとし
て、親水性ポリマーによるコーティングがある。これら
のコーティングは、もともと人工臓器などの医療器具や
分析用キャピラリカラムにおいてタンパク質の吸着を防
止するために開発されたもので、これまで多数の例があ
り、容易に反応容器のコーティングに適用可能である。
親水性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコ
ール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン
などがあげられる。また、水に不溶な、医療器具のコー
ティングなどに使用される親水性ポリマーとしては、例
えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリ
ン−ｎ−ブチルメタクリレート）共重合体などがあげら
れる。（岩崎ら、表面技術、46巻、10号、880〜886頁、
1995年）、この中で、市販されていて入手しやすいポリ
（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）を例にコーテ
ィング方法の一例を説明する。
ール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン
などがあげられる。また、水に不溶な、医療器具のコー
ティングなどに使用される親水性ポリマーとしては、例
えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、
ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリ
ン−ｎ−ブチルメタクリレート）共重合体などがあげら
れる。（岩崎ら、表面技術、46巻、10号、880〜886頁、
1995年）、この中で、市販されていて入手しやすいポリ
（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）を例にコーテ
ィング方法の一例を説明する。
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（シグ
マ アルドリッチジャパン製）0.2gをジメチルホルムア
ミド（ナカライ製）2mlに溶解した。図41に示すよう
に、このコーティング液143をロの字型スペーサシール1
42を張り付けたカバーグラス141上のガラスが露出して
いる中央部分に20μｌ塗布した。このとき、もし、スペ
ーサシール142がなければ、塗布した液はガラス表面で
はじかれてしまい、均一に塗布することが不可能にな
る。塗布終了後、真空乾燥すると均一な透明なコートが
得られた。
マ アルドリッチジャパン製）0.2gをジメチルホルムア
ミド（ナカライ製）2mlに溶解した。図41に示すよう
に、このコーティング液143をロの字型スペーサシール1
42を張り付けたカバーグラス141上のガラスが露出して
いる中央部分に20μｌ塗布した。このとき、もし、スペ
ーサシール142がなければ、塗布した液はガラス表面で
はじかれてしまい、均一に塗布することが不可能にな
る。塗布終了後、真空乾燥すると均一な透明なコートが
得られた。
また、タンパク質の材料表面への吸着を防ぐため、キ
ャピラリ電気泳動の分野では、キャピラリ内面（溶融石
英）に共有結合的にポリマー固定する方法が知られてお
り、反応容器のコーティングに適用できる。例えば、ポ
リエチレングリコールの固定（G.J.M.BRUINら、ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー、471巻、429〜436頁
（1989年））、ポリアクリルアミドの固定（S.HJERTEN
ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、347巻、1
91〜198頁（1985年））などがある。
ャピラリ電気泳動の分野では、キャピラリ内面（溶融石
英）に共有結合的にポリマー固定する方法が知られてお
り、反応容器のコーティングに適用できる。例えば、ポ
リエチレングリコールの固定（G.J.M.BRUINら、ジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー、471巻、429〜436頁
（1989年））、ポリアクリルアミドの固定（S.HJERTEN
ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー、347巻、1
91〜198頁（1985年））などがある。
さらに、シリコンコートと同等以上の効果を持つコー
ティング法として、フッ素樹脂によるコーティングがあ
る。フッ素樹脂によるコーティング法は多数知られてい
る。この場合も、さらに、ウシ血清アルブミンを塗布す
るなどの水滴付着性を増加させる処理が必要である。
ティング法として、フッ素樹脂によるコーティングがあ
る。フッ素樹脂によるコーティング法は多数知られてい
る。この場合も、さらに、ウシ血清アルブミンを塗布す
るなどの水滴付着性を増加させる処理が必要である。
なお、薬品による表面処理は、時にはコストが高く、
効果が低い場合が考えられる。このような場合には、反
応容器に薄いタンパク質が吸着しにくい樹脂フィルムを
張り付ける方法を用いてもよい。利用できる樹脂フィル
ムの一例としては、フッ素樹脂フィルム、サイトップ
（旭硝子製）があげられる。この場合、フィルム表面の
撥水性が高いため、さらに、ウシ血清アルブミンを塗布
するなど水滴付着性を増加させる処理が必要である。ま
た、水滴付着性を向上させるための方法として、イオン
ビーム等の照射（例えば、雀部ら、高分子加工、44巻、
10号、434〜439頁、1995年）を利用してもよい。
効果が低い場合が考えられる。このような場合には、反
応容器に薄いタンパク質が吸着しにくい樹脂フィルムを
張り付ける方法を用いてもよい。利用できる樹脂フィル
ムの一例としては、フッ素樹脂フィルム、サイトップ
（旭硝子製）があげられる。この場合、フィルム表面の
撥水性が高いため、さらに、ウシ血清アルブミンを塗布
するなど水滴付着性を増加させる処理が必要である。ま
た、水滴付着性を向上させるための方法として、イオン
ビーム等の照射（例えば、雀部ら、高分子加工、44巻、
10号、434〜439頁、1995年）を利用してもよい。
基板表面に被覆された液体層は、オイル中への試薬溶
液溶出防止の観点から、厚さが100μｍ以下とするのが
好ましい。
液溶出防止の観点から、厚さが100μｍ以下とするのが
好ましい。
本発明の反応方法によると、反応１バッチあたりの液
量が微量化され、試薬コストを低減することができる。
また、コピー数が同じであれば、反応液量が少ないほど
サイクル数が短縮できる。たとえば、反応液量が1/1000
になれば、理論上Log21000＝10サイクル短縮される。サ
イクル数短縮によって、反応時間が短縮し、また、副反
応（非特異的増幅、プライマー２量体生成）が減少する
ため、ターゲット検出限界が向上する。
量が微量化され、試薬コストを低減することができる。
また、コピー数が同じであれば、反応液量が少ないほど
サイクル数が短縮できる。たとえば、反応液量が1/1000
になれば、理論上Log21000＝10サイクル短縮される。サ
イクル数短縮によって、反応時間が短縮し、また、副反
応（非特異的増幅、プライマー２量体生成）が減少する
ため、ターゲット検出限界が向上する。
さらに、本発明の反応方法によると、PCRの量子化に
よる定量が可能になる。すなわち、ひとつの反応液をた
くさんのバッチに小分けすると、各バッチ毎にターゲッ
トが１コピー存在するかしないかという状態になる。こ
の状態で、PCRを行うと、ターゲットの濃度に比例し
て、PCRが進行したバッチの数が増加する。そのため、P
CRが進行したバッチ数を計数することにより、元のサン
プル中のターゲット濃度の正確な測定が可能になる。
よる定量が可能になる。すなわち、ひとつの反応液をた
くさんのバッチに小分けすると、各バッチ毎にターゲッ
トが１コピー存在するかしないかという状態になる。こ
の状態で、PCRを行うと、ターゲットの濃度に比例し
て、PCRが進行したバッチの数が増加する。そのため、P
CRが進行したバッチ数を計数することにより、元のサン
プル中のターゲット濃度の正確な測定が可能になる。
図面の簡単な説明 図１は、油膜を被覆したカバーグラスにインクジェッ
トノズルから微小液滴が打ち込まれる様子を模式的に示
した図、図２は微小液滴が保持されている状態を説明す
る図、図３は油膜に打ち込まれた水滴の状態の一例を説
明する図、図４はカバーグラスをプリンターにセットす
るための台紙の説明図、図５はインクジェットノズルに
よる水滴の打ち込みパターンを説明する図、図６は打ち
込まれた微小液滴の保持に失敗した状態の一例を示す説
明図、図７は打ち込まれた微小液滴の保持に失敗した状
態の一例を示す説明図、図８は保護用水滴あるいは複数
の反応用水滴の配置図、図９は反応容器の作製方法を説
明する図、図10は隣接する２滴の水滴の透過微分干渉像
を示す顕微鏡写真、図11は微小液滴中の光路長増大方法
の説明図、図12はカバーと基板表面の間隔を調整する機
構の一例の説明図、図13はヒト男性DNAが入っている試
料（＋）と、入っていない試料（−）の蛍光スペクトル
を示す図、図14は水滴の透過顕微鏡写真、図15は（＋）
の水滴と（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕微鏡写真、
図16はカバーグラス上の油膜を他のカバーグラスで挟む
方法の説明図、図17は水滴の透過顕微鏡写真、図18は
（＋）の水滴と（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕微鏡
写真、図19は基板表面を撥水性とすることによる効果の
説明図、図20は新たな液滴の追加の説明図、図21は本発
明による反応容器の分解組立図、図22は反応容器内にPC
R反応液を入れた反応容器の使用状態の一例を示す上面
図、図23は本発明によるホルダーの一例の分解組立図、
図24は反応容器を組み込んだホルダーの全体図、図25は
反応容器を組み込んだホルダーの分解組立図、図26は本
発明のホルダーを使用した場合の温度変化を示す図、図
27は比較例（上蓋あり）の温度変化を示す図、図28は比
較例（上蓋なし）の温度変化を示す図、図29は比較例
（アルミホイル使用）の温度変化を示す図、図30は比較
例（断熱材使用）の温度変化を示す図、図31は本発明に
よるホルダーの他の例を示す分解組立図、図32は反応容
器を組み込んだホルダーの分解組立図、図33は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図34は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図35は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図36は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図37はDNAポリ
メラーゼの濃度を変化させた反応液の反応終了後の蛍光
スペクトルを示す図、図38は反応終了後の反応液の蛍光
スペクトルを示す図、図39は温度サイクルをかけたサン
プル（＋）と、かけないサンプル（−）の蛍光における
ＲとＧの割合をプロットした図、図40は電気泳動による
分析結果を示す写真、図41は反応容器に親水性ポリマー
を塗布する手順を示す説明図である。
トノズルから微小液滴が打ち込まれる様子を模式的に示
した図、図２は微小液滴が保持されている状態を説明す
る図、図３は油膜に打ち込まれた水滴の状態の一例を説
明する図、図４はカバーグラスをプリンターにセットす
るための台紙の説明図、図５はインクジェットノズルに
よる水滴の打ち込みパターンを説明する図、図６は打ち
込まれた微小液滴の保持に失敗した状態の一例を示す説
明図、図７は打ち込まれた微小液滴の保持に失敗した状
態の一例を示す説明図、図８は保護用水滴あるいは複数
の反応用水滴の配置図、図９は反応容器の作製方法を説
明する図、図10は隣接する２滴の水滴の透過微分干渉像
を示す顕微鏡写真、図11は微小液滴中の光路長増大方法
の説明図、図12はカバーと基板表面の間隔を調整する機
構の一例の説明図、図13はヒト男性DNAが入っている試
料（＋）と、入っていない試料（−）の蛍光スペクトル
を示す図、図14は水滴の透過顕微鏡写真、図15は（＋）
の水滴と（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕微鏡写真、
図16はカバーグラス上の油膜を他のカバーグラスで挟む
方法の説明図、図17は水滴の透過顕微鏡写真、図18は
（＋）の水滴と（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕微鏡
写真、図19は基板表面を撥水性とすることによる効果の
説明図、図20は新たな液滴の追加の説明図、図21は本発
明による反応容器の分解組立図、図22は反応容器内にPC
R反応液を入れた反応容器の使用状態の一例を示す上面
図、図23は本発明によるホルダーの一例の分解組立図、
図24は反応容器を組み込んだホルダーの全体図、図25は
反応容器を組み込んだホルダーの分解組立図、図26は本
発明のホルダーを使用した場合の温度変化を示す図、図
27は比較例（上蓋あり）の温度変化を示す図、図28は比
較例（上蓋なし）の温度変化を示す図、図29は比較例
（アルミホイル使用）の温度変化を示す図、図30は比較
例（断熱材使用）の温度変化を示す図、図31は本発明に
よるホルダーの他の例を示す分解組立図、図32は反応容
器を組み込んだホルダーの分解組立図、図33は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図34は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図35は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図36は反応終了
後の反応液の蛍光スペクトルを示す図、図37はDNAポリ
メラーゼの濃度を変化させた反応液の反応終了後の蛍光
スペクトルを示す図、図38は反応終了後の反応液の蛍光
スペクトルを示す図、図39は温度サイクルをかけたサン
プル（＋）と、かけないサンプル（−）の蛍光における
ＲとＧの割合をプロットした図、図40は電気泳動による
分析結果を示す写真、図41は反応容器に親水性ポリマー
を塗布する手順を示す説明図である。
発明を実施するための最良の形態 以下、図面を用いて本発明の実施の形態を説明する。
実施の形態１ ここでは、微小液滴を保持する基板として顕微鏡観察
用のカバーグラスを、微小液滴として水滴を、基板表面
に被覆する微小液滴と混合しにくい液体としてオイルを
用い、カバーグラス表面を被覆している油膜の中にイン
クジェットノズルから水滴を打ち込んで、水滴が基板表
面に安定に保持される条件を探索した。
用のカバーグラスを、微小液滴として水滴を、基板表面
に被覆する微小液滴と混合しにくい液体としてオイルを
用い、カバーグラス表面を被覆している油膜の中にイン
クジェットノズルから水滴を打ち込んで、水滴が基板表
面に安定に保持される条件を探索した。
図１は、油膜を被覆したカバーグラスにインクジェッ
トノズルから水滴が打ち込まれる様子を模式的に示した
図である。スライドグラス10の表面には油膜11が塗布さ
れている。インクジェットノズル12から所定の速度で吐
出された水滴13は、スライドグラス10の上方からその表
面を被覆する油膜11中に打ち込まれる。油膜11中に打ち
込まれた水滴13は、図２に示すように、水滴13の全体が
油膜11の内部に隠れ、なおかつスライドグラス10の表面
に付着した状態にする。この状態で、水滴13は油膜11に
保護され、蒸発することなく長時間安定に保持される。
また、スライドグラス10の表面に付着しているため、水
滴13の位置的安定性も確保される。
トノズルから水滴が打ち込まれる様子を模式的に示した
図である。スライドグラス10の表面には油膜11が塗布さ
れている。インクジェットノズル12から所定の速度で吐
出された水滴13は、スライドグラス10の上方からその表
面を被覆する油膜11中に打ち込まれる。油膜11中に打ち
込まれた水滴13は、図２に示すように、水滴13の全体が
油膜11の内部に隠れ、なおかつスライドグラス10の表面
に付着した状態にする。この状態で、水滴13は油膜11に
保護され、蒸発することなく長時間安定に保持される。
また、スライドグラス10の表面に付着しているため、水
滴13の位置的安定性も確保される。
基板10に塗布する油膜11の粘度、膜厚は、打ち込む水
滴13の量、速度によって最適な値の範囲が決まる。油膜
11の粘度、膜厚が不適切であると、図３（ａ）のように
水滴14が油膜11の上部に露出して空気に触れ、蒸発して
しまう。あるいは、図３（ｂ）のように水滴15が油膜11
の内部に浮いてしまう。油膜中に浮遊した水滴15は、や
がては油膜と空気のと境界に到達し、蒸発してしまう可
能性が高い。
滴13の量、速度によって最適な値の範囲が決まる。油膜
11の粘度、膜厚が不適切であると、図３（ａ）のように
水滴14が油膜11の上部に露出して空気に触れ、蒸発して
しまう。あるいは、図３（ｂ）のように水滴15が油膜11
の内部に浮いてしまう。油膜中に浮遊した水滴15は、や
がては油膜と空気のと境界に到達し、蒸発してしまう可
能性が高い。
水滴を一ケ所に複数回分注すると、図３（ｃ）のよう
な状態になることが多い。これは、油膜11の内部に水滴
16が入ったものの、油膜11の表面がくぼんでいる状態で
ある。オイルの粘度が不適切な場合、図３（ｃ）の状態
からすぐに図３（ａ）のような状態に移り、水滴の表面
から油膜がなくなって、やがて蒸発してしまう。しか
し、オイルの粘度が適切な場合、水滴の表面に油膜はし
ばらく保持される。この場合には、図３（ｃ）の状態の
時にさらにオイルを加えることで、図２のような状態に
もっていくことができる。
な状態になることが多い。これは、油膜11の内部に水滴
16が入ったものの、油膜11の表面がくぼんでいる状態で
ある。オイルの粘度が不適切な場合、図３（ｃ）の状態
からすぐに図３（ａ）のような状態に移り、水滴の表面
から油膜がなくなって、やがて蒸発してしまう。しか
し、オイルの粘度が適切な場合、水滴の表面に油膜はし
ばらく保持される。この場合には、図３（ｃ）の状態の
時にさらにオイルを加えることで、図２のような状態に
もっていくことができる。
次に、具体的な例について説明する。微小液滴を吐出
するために、セイコーエプソン社製のインクジェットプ
リンタMJ−500Cを実験に使用した。モノクロ印字用ヘッ
ドに、東レ製「TORAY PURE LV−10T」で製造した超純
水を充填し、吐出させた。プリンタの制御は、パーソナ
ルコンピュータ（NEC製、PC9801ns）でコントロールコ
ード「EPSON ESC/PJ84」のイメージ処理機能を使用し
て行った。
するために、セイコーエプソン社製のインクジェットプ
リンタMJ−500Cを実験に使用した。モノクロ印字用ヘッ
ドに、東レ製「TORAY PURE LV−10T」で製造した超純
水を充填し、吐出させた。プリンタの制御は、パーソナ
ルコンピュータ（NEC製、PC9801ns）でコントロールコ
ード「EPSON ESC/PJ84」のイメージ処理機能を使用し
て行った。
このときの縦方向、横方向のドット密度はいずれも36
0ドット／インチであった。このプリンタの解像度はセ
ミ720dpi（720dpi×720dpiで、隣接するドットは印刷し
ない）であるので、１ドットは実際には２滴からなると
思われる。超純水を98304ドット吐出したとき、全体の
液量は4.0μｌであったので、１ドットあたりの液量は
約40plである。
0ドット／インチであった。このプリンタの解像度はセ
ミ720dpi（720dpi×720dpiで、隣接するドットは印刷し
ない）であるので、１ドットは実際には２滴からなると
思われる。超純水を98304ドット吐出したとき、全体の
液量は4.0μｌであったので、１ドットあたりの液量は
約40plである。
水滴を付着させる基板としては、顕微鏡観察用カバー
グラス（マツナミ製、18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）
を使用した。このカバーグラスをプリンタにセットする
ため、図４に示すような台紙を使用した。台紙20は、コ
ピー用紙又はオーバーヘッドプロジェクタ用の透明シー
トで作り、図中に斜線で示した左下の10mm×10mmの部分
21を観察用にくり抜いたものである。この台紙のくり抜
かれた部分を含む18mm×18mmの部分22に両面接着テープ
（ニチバン製セルタックCW−18）でカバーグラスを裏側
から接着した。
グラス（マツナミ製、18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）
を使用した。このカバーグラスをプリンタにセットする
ため、図４に示すような台紙を使用した。台紙20は、コ
ピー用紙又はオーバーヘッドプロジェクタ用の透明シー
トで作り、図中に斜線で示した左下の10mm×10mmの部分
21を観察用にくり抜いたものである。この台紙のくり抜
かれた部分を含む18mm×18mmの部分22に両面接着テープ
（ニチバン製セルタックCW−18）でカバーグラスを裏側
から接着した。
カバーグラスを接着した台紙をプリンタにセットし、
カバーグラス上に後述するオイルからなる油膜を塗布し
た。油膜を塗布する範囲は、カバーグラスの中央部10mm
×10mmの台紙がくり抜かれた部分21である。マイクロピ
ペットで一定量（１μｌ〜５μｌ）のオイルをカバーグ
ラス上においたあと、ピペットの先端で10mm×10mmの範
囲に均等に塗布した。
カバーグラス上に後述するオイルからなる油膜を塗布し
た。油膜を塗布する範囲は、カバーグラスの中央部10mm
×10mmの台紙がくり抜かれた部分21である。マイクロピ
ペットで一定量（１μｌ〜５μｌ）のオイルをカバーグ
ラス上においたあと、ピペットの先端で10mm×10mmの範
囲に均等に塗布した。
油膜を塗布したあと、プリンタで水滴を打ち込んだ。
水滴の打ち込みパターンは図５に示したとおりであり、
１ドットの水滴25を8/360インチ（0.56mm）の間隔で、
縦横それぞれ４つずつ、計16カ所に打ち込んだ。
水滴の打ち込みパターンは図５に示したとおりであり、
１ドットの水滴25を8/360インチ（0.56mm）の間隔で、
縦横それぞれ４つずつ、計16カ所に打ち込んだ。
顕微鏡（オリンパス光学工業製倒立型顕微鏡1MT−
２）で観察すると、打ち込まれた水滴の保持に成功した
場合には、水滴が油膜の底でカバーグラスに付着し、水
滴全体が油膜の内部に隠れた状態になる。この状態を模
式的に表すと図２のようになる。このとき、水滴は直径
約100μｍで、ほぼ円形に観察された。
２）で観察すると、打ち込まれた水滴の保持に成功した
場合には、水滴が油膜の底でカバーグラスに付着し、水
滴全体が油膜の内部に隠れた状態になる。この状態を模
式的に表すと図２のようになる。このとき、水滴は直径
約100μｍで、ほぼ円形に観察された。
打ち込まれた水滴の保持に失敗した場合には、図６の
ように、油膜11がとぎれてカバーグラス10の表面がむき
出しになって観察されることがある。これは、図３
（ａ）の状態から水滴が蒸発したものと考えられる。ま
た、観察される水滴の大きさが異常に小さい（直径50μ
ｍ以下）ことがある。これは、図３（ａ）の状態からあ
る程度水滴が蒸発した後、図２に示す正常な保持状態に
なったためと思われる。水滴が実際にこのようにして蒸
発していく様子を時には顕微鏡下で観察できることもあ
る。このようなタイプの失敗は、主として油膜が薄すぎ
る場合に起こる。
ように、油膜11がとぎれてカバーグラス10の表面がむき
出しになって観察されることがある。これは、図３
（ａ）の状態から水滴が蒸発したものと考えられる。ま
た、観察される水滴の大きさが異常に小さい（直径50μ
ｍ以下）ことがある。これは、図３（ａ）の状態からあ
る程度水滴が蒸発した後、図２に示す正常な保持状態に
なったためと思われる。水滴が実際にこのようにして蒸
発していく様子を時には顕微鏡下で観察できることもあ
る。このようなタイプの失敗は、主として油膜が薄すぎ
る場合に起こる。
また、図３（ｂ）に示すように、水滴が油膜中に浮遊
しているのが観察される場合もある。あるいは、図７の
ように、離れた場所に２つの水滴32,33が観察されるこ
ともある。これは、１ドットが２滴からできているた
め、２つの水滴が油膜11中を漂ったのち、別々の場所で
カバーグラス10に付着したためと思われる。このような
タイプの失敗は、主として油膜11が厚すぎる場合に起こ
る。
しているのが観察される場合もある。あるいは、図７の
ように、離れた場所に２つの水滴32,33が観察されるこ
ともある。これは、１ドットが２滴からできているた
め、２つの水滴が油膜11中を漂ったのち、別々の場所で
カバーグラス10に付着したためと思われる。このような
タイプの失敗は、主として油膜11が厚すぎる場合に起こ
る。
最適な油膜の条件を検討するため、オイルの種類、及
び膜厚を変えて図５のようなパターンで水滴を打ち込む
実験を３回行い、水滴が正常な状態で保持される割合、
すなわち図２に示したように、水滴13の全体が油膜11の
内部に隠れ、なおかつスライドグラス10の表面に付着し
た状態になる割合を調べた。結果を表１に示す。表中の
数字は、水滴打ち込みの成功率（％）を表す。また、オ
イルとしては以下のものを使用した。
び膜厚を変えて図５のようなパターンで水滴を打ち込む
実験を３回行い、水滴が正常な状態で保持される割合、
すなわち図２に示したように、水滴13の全体が油膜11の
内部に隠れ、なおかつスライドグラス10の表面に付着し
た状態になる割合を調べた。結果を表１に示す。表中の
数字は、水滴打ち込みの成功率（％）を表す。また、オ
イルとしては以下のものを使用した。
A:シグマ社製ミネラルオイルM5904（粘度20cp） B:信越化学工業（株）製シリコンオイルKF96−30（粘度
30cp） C:上記Ｂと下記Ｅを1:1の割合で混合したオイル D:ベックマン社製真空拡散ポンプ用オイル330246（粘度
40cp） E:信越化学工業（株）製シリコンオイルKF96−50（粘度
50cp） F:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度50cp） G:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度100cp） H:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度200cp） 表１より、ここでの実験条件に対して最適なオイルの
粘度は30〜40cp、オイルの量は１〜２μｌ（油膜の厚さ
に換算して10〜20μｍ）であることがわかる。
30cp） C:上記Ｂと下記Ｅを1:1の割合で混合したオイル D:ベックマン社製真空拡散ポンプ用オイル330246（粘度
40cp） E:信越化学工業（株）製シリコンオイルKF96−50（粘度
50cp） F:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度50cp） G:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度100cp） H:昭和石油製粘度計校正用標準液（粘度200cp） 表１より、ここでの実験条件に対して最適なオイルの
粘度は30〜40cp、オイルの量は１〜２μｌ（油膜の厚さ
に換算して10〜20μｍ）であることがわかる。
実施の形態２ 実施の形態１で説明したように、微小液滴を保持する
基板上に油膜を塗布し、その油膜内部に微小液滴を保持
することにより、空気中への水滴の急速な蒸発を防止す
ることができる。しかし、これだけでは極微量の反応を
行うのに充分とはいえない。通常、オイルは一定の水分
を含有することができる。例えば、シリコンオイルの場
合、含有できる水分は100〜200ppmである。そのため、
油膜中に長時間極微量水滴を放置したり、反応を促進す
るために加熱したりすると、微小液滴中の水分が周囲の
油層に溶出し、蒸発したのと同じ状態になってしまう。
基板上に油膜を塗布し、その油膜内部に微小液滴を保持
することにより、空気中への水滴の急速な蒸発を防止す
ることができる。しかし、これだけでは極微量の反応を
行うのに充分とはいえない。通常、オイルは一定の水分
を含有することができる。例えば、シリコンオイルの場
合、含有できる水分は100〜200ppmである。そのため、
油膜中に長時間極微量水滴を放置したり、反応を促進す
るために加熱したりすると、微小液滴中の水分が周囲の
油層に溶出し、蒸発したのと同じ状態になってしまう。
水滴の油層への溶出を防止するための効果的な方法と
しては、図８（ａ）のように、実際に化学反応を行う水
滴40のまわりに保護用の水滴41を配置すればよい。この
ように配置すると、反応用水滴40の油層への溶出速度が
遅くなる。これは、反応用水滴40付近のオイルの水分含
量が保護用水滴41によって局所的に上昇するためと考え
られる。
しては、図８（ａ）のように、実際に化学反応を行う水
滴40のまわりに保護用の水滴41を配置すればよい。この
ように配置すると、反応用水滴40の油層への溶出速度が
遅くなる。これは、反応用水滴40付近のオイルの水分含
量が保護用水滴41によって局所的に上昇するためと考え
られる。
保護用水滴41の組成は何でもよく、ただの蒸留水でも
よい。反応用水滴40は高価な試薬を含むため、量を増や
すとコストがかかることになるが、保護用水滴41は安価
なため量を増やしてもコストは無視できる。したがっ
て、保護用水滴41は、必要なだけ量を多くすることがで
きる。保護用水滴41は、反応用水滴40のまわりにたくさ
んあればよく、例えば図８（ｂ）に示すように反応用水
滴40を包囲して配置するなど種々の配置が考えられる。
保護用水滴41を使用する代わりに、図８（ｃ）に示すよ
うに、反応用水滴40同士を互いに密集させて配置しても
同様に反応用水滴の油層への溶出速度を緩和する効果が
得られる。
よい。反応用水滴40は高価な試薬を含むため、量を増や
すとコストがかかることになるが、保護用水滴41は安価
なため量を増やしてもコストは無視できる。したがっ
て、保護用水滴41は、必要なだけ量を多くすることがで
きる。保護用水滴41は、反応用水滴40のまわりにたくさ
んあればよく、例えば図８（ｂ）に示すように反応用水
滴40を包囲して配置するなど種々の配置が考えられる。
保護用水滴41を使用する代わりに、図８（ｃ）に示すよ
うに、反応用水滴40同士を互いに密集させて配置しても
同様に反応用水滴の油層への溶出速度を緩和する効果が
得られる。
次に、保護用水滴を配置することの効果についてより
詳細に説明する。実施の形態１と同様に、セイコーエプ
ソン社製のインクジェットプリンタMJ−500Cを用い、モ
ノクロ印字用ヘッドに、東レ製「TORAY PURE LV−10
T」で製造した超純水を充填し、マツナミ製顕微鏡観察
用カバーグラス（18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）を実
施の形態１と同様に、図４に示す台紙にセットしてその
上に超純水を打ち出した。カバーグラスに塗布したオイ
ルはシグマ社のミネラルオイルM5904、量は３μｌであ
る。打ち出しパターンは図５と同じであるが、重ね打ち
を10回行った。そののちオイルをさらに20μｌ追加し、
顕微鏡で観察したところ、16カ所の水滴全てが同じよう
に直径240μｍ程度の円形に見えた。
詳細に説明する。実施の形態１と同様に、セイコーエプ
ソン社製のインクジェットプリンタMJ−500Cを用い、モ
ノクロ印字用ヘッドに、東レ製「TORAY PURE LV−10
T」で製造した超純水を充填し、マツナミ製顕微鏡観察
用カバーグラス（18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）を実
施の形態１と同様に、図４に示す台紙にセットしてその
上に超純水を打ち出した。カバーグラスに塗布したオイ
ルはシグマ社のミネラルオイルM5904、量は３μｌであ
る。打ち出しパターンは図５と同じであるが、重ね打ち
を10回行った。そののちオイルをさらに20μｌ追加し、
顕微鏡で観察したところ、16カ所の水滴全てが同じよう
に直径240μｍ程度の円形に見えた。
その後、図９に示すように、コの字形に切った両面シ
ール（宝酒造製、insitu PCR用シール、厚さ約150μ
ｍ）45をカバーグラス10の端の方に貼り合わせ、この上
からさらにもう一枚カバーグラスを貼り合わせた。図
中、ハッチングを施した部分46は、油膜のある領域を指
す。そして、シールのない部分47をマニキュアで固め
て、密閉した。
ール（宝酒造製、insitu PCR用シール、厚さ約150μ
ｍ）45をカバーグラス10の端の方に貼り合わせ、この上
からさらにもう一枚カバーグラスを貼り合わせた。図
中、ハッチングを施した部分46は、油膜のある領域を指
す。そして、シールのない部分47をマニキュアで固め
て、密閉した。
こうして作製した反応容器を図４に示した台紙から剥
がし、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製DNA
サーマルサイクラー480）のヒートブロック上に載せ、9
4℃１分、55℃１分、72℃１分の温度サイクルを24回繰
り返したのち、水滴の状態を顕微鏡で観察した。図10
は、隣接する２滴の水滴の透過微分干渉像を示す顕微鏡
写真である。図の左側が中央部の方向である。左側、す
なわち中央部の水滴の方が盛り上がっているように見
え、水滴の量が多いことが分かる。ピントがぼけて黒く
点々と見えるのはカバーガラスに挟み込んだ内部に付着
した水滴であり、この水滴も中央部の方が多い。このよ
うに、全部で16カ所ある水滴のうち、周辺部にある12カ
所の水滴は、中央部の４カ所の水滴と比べて量が少なく
なっていた。これは、中央部の水滴に対して、周辺部の
12の水滴が前述の保護用水滴の役割を果たしたためと考
えられる。
がし、サーマルサイクラー（パーキンエルマー社製DNA
サーマルサイクラー480）のヒートブロック上に載せ、9
4℃１分、55℃１分、72℃１分の温度サイクルを24回繰
り返したのち、水滴の状態を顕微鏡で観察した。図10
は、隣接する２滴の水滴の透過微分干渉像を示す顕微鏡
写真である。図の左側が中央部の方向である。左側、す
なわち中央部の水滴の方が盛り上がっているように見
え、水滴の量が多いことが分かる。ピントがぼけて黒く
点々と見えるのはカバーガラスに挟み込んだ内部に付着
した水滴であり、この水滴も中央部の方が多い。このよ
うに、全部で16カ所ある水滴のうち、周辺部にある12カ
所の水滴は、中央部の４カ所の水滴と比べて量が少なく
なっていた。これは、中央部の水滴に対して、周辺部の
12の水滴が前述の保護用水滴の役割を果たしたためと考
えられる。
次に、前記と同様にして超純水をカバーグラス上に打
ち出した。ただし、塗布したオイルの量は２μｌ、重ね
打ち回数は２回である。打ち終わったあと、２μｌのオ
イルを追加し、カバーをかけずにそのままサーマルサイ
クラーのヒートブロック上に載せ、前記と同様の温度サ
イクルを開始した。すると、最初に94℃に温度が上昇し
た時点で油膜の液面が乱れ、水滴が空気中に露出し、蒸
発してしまった。このことから、油膜の上面にカバーを
かけるのが有効であることが分かる。
ち出した。ただし、塗布したオイルの量は２μｌ、重ね
打ち回数は２回である。打ち終わったあと、２μｌのオ
イルを追加し、カバーをかけずにそのままサーマルサイ
クラーのヒートブロック上に載せ、前記と同様の温度サ
イクルを開始した。すると、最初に94℃に温度が上昇し
た時点で油膜の液面が乱れ、水滴が空気中に露出し、蒸
発してしまった。このことから、油膜の上面にカバーを
かけるのが有効であることが分かる。
実施の形態３ 極微量の水滴中で進行した反応を検出する方法として
は、水滴の吸光度、蛍光、発光等の光学的変化を測定す
る方法が最も有力である。この場合、図11（ａ）に示す
ように、水滴の付着している基板10の表面と油膜11の上
面にかけるカバー50に透明な材料を使用し、これらと垂
直な方向から励起光の照射、蛍光、発光、透過光の観察
を行うのが合理的である。ところが、一般的な光学セル
などを使用する場合と比べて、光路長が短く、しかも一
定しないため、定量的な観察をしにくいという問題があ
る。
は、水滴の吸光度、蛍光、発光等の光学的変化を測定す
る方法が最も有力である。この場合、図11（ａ）に示す
ように、水滴の付着している基板10の表面と油膜11の上
面にかけるカバー50に透明な材料を使用し、これらと垂
直な方向から励起光の照射、蛍光、発光、透過光の観察
を行うのが合理的である。ところが、一般的な光学セル
などを使用する場合と比べて、光路長が短く、しかも一
定しないため、定量的な観察をしにくいという問題があ
る。
そこで、この問題の解決策として、図11（ｂ）に示す
ように、水滴が付着している基板10の表面と油膜11の上
面に設置したカバー50との間隔を一旦狭めて水滴13をカ
バー50に接触させ、そののち再び図11（ｃ）に示すよう
に間隔を広げる方法を採用した。これによって、水滴13
が基板表面と垂直な方向に引き延ばされ、水滴13中の光
路長を最初より長く、しかも一定にすることができる。
ように、水滴が付着している基板10の表面と油膜11の上
面に設置したカバー50との間隔を一旦狭めて水滴13をカ
バー50に接触させ、そののち再び図11（ｃ）に示すよう
に間隔を広げる方法を採用した。これによって、水滴13
が基板表面と垂直な方向に引き延ばされ、水滴13中の光
路長を最初より長く、しかも一定にすることができる。
カバー50と基板10の表面の間隔を調整する機構とし
て、最も単純な方法は、図12（ａ）に断面を略示するカ
バー50、基板10、基板とカバーとの間隔を規制するスペ
ーサ52,53等に弾性のある部材を使用し、図12（ｂ）に
示すようにカバーに基板表面との間隔を狭めるような力
を加える方法である。この力は指で加えてもよいが、精
密モータや圧電素子などを使用して力を加えてもよい。
て、最も単純な方法は、図12（ａ）に断面を略示するカ
バー50、基板10、基板とカバーとの間隔を規制するスペ
ーサ52,53等に弾性のある部材を使用し、図12（ｂ）に
示すようにカバーに基板表面との間隔を狭めるような力
を加える方法である。この力は指で加えてもよいが、精
密モータや圧電素子などを使用して力を加えてもよい。
次に、微小液滴を基板表面とカバーグラスの両方に接
触させて光路長を増大したことによる効果について、よ
り具体的に説明する。パーキンエルマー社の「TAQMAN
PCR試薬キット」を用いて溶液を調整した。まず、キッ
トの説明書に従って、次の〔表２〕のように試薬を混合
した。
触させて光路長を増大したことによる効果について、よ
り具体的に説明する。パーキンエルマー社の「TAQMAN
PCR試薬キット」を用いて溶液を調整した。まず、キッ
トの説明書に従って、次の〔表２〕のように試薬を混合
した。
表２ 試薬 最終濃度 KCl 50mM Tris−HCl、pH8.3 10mM MgCl2 3.5mM dATP 200μＭ dCTP 200μＭ dGTP 200μＭ dUTP 400μＭ β−アクチンフォワードプライマー （配列番号１） 300nM β−アクチンリバースプライマー （配列番号２） 300nM β−アクチンプローブ（配列番号３） 200nM AmpliTaq DNAポリメラーゼ 0.25U/μｌ AmpErase UNG 0.01U/μｌ ヒト男性DNA 0.2ng/μｌ （ヒト弾性DNAは、入っているものとないものの２種類
を調製した） 配列番号１ ５′−TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA
−３′ 配列番号２ ５′−CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
−３′ 配列番号３ ５′−（FAM）ATGCCC−Ｘ（TAMRA）
CCCCCATGCCATCCTGCGTp−３′ ただし、Ｘはリンカー部がついているヌクレオチド、
ｐはリン酸化を示す。FAM,TAMRAは蛍光色素名である。
を調製した） 配列番号１ ５′−TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA
−３′ 配列番号２ ５′−CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG
−３′ 配列番号３ ５′−（FAM）ATGCCC−Ｘ（TAMRA）
CCCCCATGCCATCCTGCGTp−３′ ただし、Ｘはリンカー部がついているヌクレオチド、
ｐはリン酸化を示す。FAM,TAMRAは蛍光色素名である。
ヒト男性DNAが入っているもの（＋）、入っていない
もの（−）各300μｌを調製し、それぞれ６本のチュー
ブに50μｌずつ分割した。これをサーマルサイクラーに
入れ、50℃１分、90℃１分のあと、92℃１分、54℃１
分、72℃２分の温度サイクルを40サイクル繰り返し、さ
らに72℃で10分間反応させた。
もの（−）各300μｌを調製し、それぞれ６本のチュー
ブに50μｌずつ分割した。これをサーマルサイクラーに
入れ、50℃１分、90℃１分のあと、92℃１分、54℃１
分、72℃２分の温度サイクルを40サイクル繰り返し、さ
らに72℃で10分間反応させた。
反応終了後、（＋）と（−）の溶液をそれぞれ１本の
チューブに集めた。（＋）と（−）の溶液それぞれ10μ
ｌをTE緩衝液（10mM Tris−HCl pH8.0、1mM EDTA p
H8.0）990μｌに加え、蛍光分光光度計（日本分光工業
製、FP−777）で蛍光スペクトルを測定した。
チューブに集めた。（＋）と（−）の溶液それぞれ10μ
ｌをTE緩衝液（10mM Tris−HCl pH8.0、1mM EDTA p
H8.0）990μｌに加え、蛍光分光光度計（日本分光工業
製、FP−777）で蛍光スペクトルを測定した。
結果を図13に示す。励起波長は488nmである。ヒト男
性DNAの入っているサンプル（＋）は、入っていないサ
ンプル（−）と比べて、520nm付近の蛍光強度が強くな
っている。
性DNAの入っているサンプル（＋）は、入っていないサ
ンプル（−）と比べて、520nm付近の蛍光強度が強くな
っている。
（＋）と（−）の溶液をそれぞれ別のモノクロ用プリ
ンタヘッドに充填し、実施の形態１と同様にしてカバー
グラス上に打ち出した。カバーグラス上に塗布したオイ
ルはベックマン社製真空拡散ポンプ用オイル330246で、
使用量は２μｌである。打ち出したドットパターンは、
縦２ドット×横２ドットの４ドットで５回重ね打ちを行
った。（＋）のドット群と（−）のドット群は、互いに
約0.7mm離して同一のカバーグラス上に打ち出した。
ンタヘッドに充填し、実施の形態１と同様にしてカバー
グラス上に打ち出した。カバーグラス上に塗布したオイ
ルはベックマン社製真空拡散ポンプ用オイル330246で、
使用量は２μｌである。打ち出したドットパターンは、
縦２ドット×横２ドットの４ドットで５回重ね打ちを行
った。（＋）のドット群と（−）のドット群は、互いに
約0.7mm離して同一のカバーグラス上に打ち出した。
（＋）の溶液と（−）の溶液を打ち出したあと、カバ
ーグラス上に約５μｌのオイルを追加し、顕微鏡（オリ
ンパス光学工業社製、1MT−２）で観察した。図14は、
観察された水滴の透過顕微鏡写真である。図14の左側が
（＋）の溶液からなる水滴であり、右側が（−）の溶液
からなる水滴である。水滴は直径約300μｍのほぼ円形
であった。次に、この２つ並んだ水滴を励起波長約480n
mのＢ励起で蛍光観察した。図15は、図14のように並ん
だ（＋）の水滴と、（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕
微鏡写真である。図15に示されるように、蛍光は弱く、
ぼんやりとしか（＋）の水滴と（−）の水滴の違いは分
からなかった。
ーグラス上に約５μｌのオイルを追加し、顕微鏡（オリ
ンパス光学工業社製、1MT−２）で観察した。図14は、
観察された水滴の透過顕微鏡写真である。図14の左側が
（＋）の溶液からなる水滴であり、右側が（−）の溶液
からなる水滴である。水滴は直径約300μｍのほぼ円形
であった。次に、この２つ並んだ水滴を励起波長約480n
mのＢ励起で蛍光観察した。図15は、図14のように並ん
だ（＋）の水滴と、（−）の水滴の蛍光観察像を表す顕
微鏡写真である。図15に示されるように、蛍光は弱く、
ぼんやりとしか（＋）の水滴と（−）の水滴の違いは分
からなかった。
次に、（＋）と（−）の溶液を同様にカバーグラス上
のオイル塗布領域55に打ち出したあと、図16（ａ）に示
すように、カバーグラス10の端部56,57に両面接着テー
プ（ニチバン製、セルタックCW−18）を２枚重ねて貼り
付けた、その上からカバーグラスをもう一枚貼り付け
た。この両面接着テープの厚さは約70μｍであり、２枚
重ね合わせると厚さ約140μｍになる。さらに、図16
（ｂ）に示すように、テープを貼っていないカバーグラ
スの端部に余分にオイル58,59を追加した。
のオイル塗布領域55に打ち出したあと、図16（ａ）に示
すように、カバーグラス10の端部56,57に両面接着テー
プ（ニチバン製、セルタックCW−18）を２枚重ねて貼り
付けた、その上からカバーグラスをもう一枚貼り付け
た。この両面接着テープの厚さは約70μｍであり、２枚
重ね合わせると厚さ約140μｍになる。さらに、図16
（ｂ）に示すように、テープを貼っていないカバーグラ
スの端部に余分にオイル58,59を追加した。
カバーグラス10の中央付近を指で押さえ、水滴が油膜
の上のカバーグラスに付着したのを確認したあと、ゆっ
くり指を離した。図16（ｂ）のように端部に追加したオ
イルのおかげで、２枚のカバーグラスの間に気泡は入ら
なかった。
の上のカバーグラスに付着したのを確認したあと、ゆっ
くり指を離した。図16（ｂ）のように端部に追加したオ
イルのおかげで、２枚のカバーグラスの間に気泡は入ら
なかった。
図17はこうして形成した水滴の透過顕微鏡写真であ
り、左側が（＋）の水滴、右側が（−）の水滴である。
このように、水滴は、図11（ｃ）の模式図に示したよう
に、円柱状になっていることが分かる。円柱の直径は約
80μｍであった。Ｂ励起で蛍光観察したところ、図18に
示すように、（＋）の水滴の方が（−）の水滴よりも強
く光っている様子がはっきりと分かった。
り、左側が（＋）の水滴、右側が（−）の水滴である。
このように、水滴は、図11（ｃ）の模式図に示したよう
に、円柱状になっていることが分かる。円柱の直径は約
80μｍであった。Ｂ励起で蛍光観察したところ、図18に
示すように、（＋）の水滴の方が（−）の水滴よりも強
く光っている様子がはっきりと分かった。
微小液滴中の光路長を増加させるための他の方法とし
て、水滴を付着させる基板の材料として撥水性のあるも
の、あるいは撥水性のコーティングを施したものを使用
した。水滴が付着する基板61の表面に撥水性がない場合
は、図19（ａ）に略示するように基板61との接触面積が
大きくなるため、基板表面に垂直方向の水滴内の光路長
が短くなる。一方、水滴が付着する基板62の表面に撥水
性がある場合には、図19（ｂ）のように基板表面に垂直
方向の水滴64内の光路長が長くなる。
て、水滴を付着させる基板の材料として撥水性のあるも
の、あるいは撥水性のコーティングを施したものを使用
した。水滴が付着する基板61の表面に撥水性がない場合
は、図19（ａ）に略示するように基板61との接触面積が
大きくなるため、基板表面に垂直方向の水滴内の光路長
が短くなる。一方、水滴が付着する基板62の表面に撥水
性がある場合には、図19（ｂ）のように基板表面に垂直
方向の水滴64内の光路長が長くなる。
ここでいう撥水性とは、通常使用されるガラス基板に
付着した水滴の接触角に対して、より大きな接触角を有
する場合をいい、撥水性のある材料としては、例えばポ
リプロピレン、ポリエチレンなどの透明な材料を用いる
ことができる。また、撥水性コーティング材は多数市販
されており、本発明で用いることのできる撥水性コーテ
ィング材としては、例えばシグマ社のシグマコートをあ
げることができる。
付着した水滴の接触角に対して、より大きな接触角を有
する場合をいい、撥水性のある材料としては、例えばポ
リプロピレン、ポリエチレンなどの透明な材料を用いる
ことができる。また、撥水性コーティング材は多数市販
されており、本発明で用いることのできる撥水性コーテ
ィング材としては、例えばシグマ社のシグマコートをあ
げることができる。
特開平４−262256号公報には、撥水性基板の上にイン
クジェットで吐出した液を載せる示唆があるが、これは
本発明のように光路長を増大することを意図するもので
はない。また、米国特許第5,474,796号にも撥水性、親
水性のパターンを作った上にインクジェットで液を載せ
る記載があるが、これは隣り合った液滴を空間的に分け
るのが目的であり、同様に光路長を増大することを意図
するものではない。
クジェットで吐出した液を載せる示唆があるが、これは
本発明のように光路長を増大することを意図するもので
はない。また、米国特許第5,474,796号にも撥水性、親
水性のパターンを作った上にインクジェットで液を載せ
る記載があるが、これは隣り合った液滴を空間的に分け
るのが目的であり、同様に光路長を増大することを意図
するものではない。
次に、水滴の付着する表面を撥水性とすることの効果
を確認するため、マツナミ製顕微鏡観察用カバーグラス
（18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）にシグマ社のシグマ
コートを塗布し、乾燥させ、撥水性コートを施した。そ
の後、実施の形態１と同様に、図４に示した台紙に接着
し、インクジェットで水滴を打ち出して、撥水性コート
のある場合とない場合の水滴の様子を比べてみた。使用
したオイルは、信越化学工業製シリコンオイルKF96−30
とKF−50を1:1の割合で混合したもので、オイルの塗布
量は撥水性コートがあるものが２μｌ、撥水性コートの
ないものが３μｌであった。インクジェットヘッドから
打ち出した水滴のパターンは実施の形態１と同様にし
た。
を確認するため、マツナミ製顕微鏡観察用カバーグラス
（18mm×18mm、厚さ0.12〜0.17mm）にシグマ社のシグマ
コートを塗布し、乾燥させ、撥水性コートを施した。そ
の後、実施の形態１と同様に、図４に示した台紙に接着
し、インクジェットで水滴を打ち出して、撥水性コート
のある場合とない場合の水滴の様子を比べてみた。使用
したオイルは、信越化学工業製シリコンオイルKF96−30
とKF−50を1:1の割合で混合したもので、オイルの塗布
量は撥水性コートがあるものが２μｌ、撥水性コートの
ないものが３μｌであった。インクジェットヘッドから
打ち出した水滴のパターンは実施の形態１と同様にし
た。
顕微鏡で観察した水滴の大きさ（基板垂直方向から見
た水滴の直径）は、撥水性コートのある方が40μｍ程度
であったのに対し、撥水性コートのない方は100μｍ程
度であった。このことから、水滴の状態が図19のように
なっており、撥水性コートを設けることによって基板垂
直方向の水滴内光路長を増大することができることが分
かる。
た水滴の直径）は、撥水性コートのある方が40μｍ程度
であったのに対し、撥水性コートのない方は100μｍ程
度であった。このことから、水滴の状態が図19のように
なっており、撥水性コートを設けることによって基板垂
直方向の水滴内光路長を増大することができることが分
かる。
なお、微小水滴中で化学反応を行うときは、複数のノ
ズルから別々の試薬を同じ場所に吐出し、その場で混合
することになる。このとき、図20（ａ）に示すように、
微小液滴13が基板10の表面に付着していると、位置決め
が容易であり、水滴（試薬）65の追加、混合が容易であ
る。一方、図20（ｂ）に示すように水滴15が油膜11中を
漂っていると、新たな水滴（試薬）65の追加は困難であ
る。このような試薬の追加という観点からも、微小液滴
は基板表面に付着した状態で保持する必要がある。
ズルから別々の試薬を同じ場所に吐出し、その場で混合
することになる。このとき、図20（ａ）に示すように、
微小液滴13が基板10の表面に付着していると、位置決め
が容易であり、水滴（試薬）65の追加、混合が容易であ
る。一方、図20（ｂ）に示すように水滴15が油膜11中を
漂っていると、新たな水滴（試薬）65の追加は困難であ
る。このような試薬の追加という観点からも、微小液滴
は基板表面に付着した状態で保持する必要がある。
実施の形態４ 微量容器のPCR用加熱ホルダー（１） 従来、in situ PCR装置としては、アルミホイルでス
ライドグラスを包んでヒートブロック上に設置するタイ
プのもの（例えば、米国特許第5,538,871号明細書参
照）、あるいは平坦なヒートブロックにスライドグラス
を設置するタイプのもの（例えば、宝酒造TP3000）が知
られている。しかし、これらのPCR装置では、前記実施
の形態で用いた微量PCR用の反応容器の正確な温度制御
困難である。そこで、前述の反応容器を使用して微量PC
Rを行う際に有用な加熱ホルダーを作製した。
ライドグラスを包んでヒートブロック上に設置するタイ
プのもの（例えば、米国特許第5,538,871号明細書参
照）、あるいは平坦なヒートブロックにスライドグラス
を設置するタイプのもの（例えば、宝酒造TP3000）が知
られている。しかし、これらのPCR装置では、前記実施
の形態で用いた微量PCR用の反応容器の正確な温度制御
困難である。そこで、前述の反応容器を使用して微量PC
Rを行う際に有用な加熱ホルダーを作製した。
図21は、本発明による反応容器の分解組立図である。
図21に示すように、反応容器100は２枚の透明板101,103
を中央に穴の開いた環状のスペーサ102を介して接着し
た構造を有する。透明板101,103の材質はガラスまたは
プラスチックとすることができ、厚さは0.1〜0.2mmが好
ましい。スペーサ102は、ポリ塩化ビニルの両面接着テ
ープで構成することができ、厚さ0.02mm程度が好まし
い。反応容器100の外形は、例えば18mm×18mmの正方形
とすることができる。
図21に示すように、反応容器100は２枚の透明板101,103
を中央に穴の開いた環状のスペーサ102を介して接着し
た構造を有する。透明板101,103の材質はガラスまたは
プラスチックとすることができ、厚さは0.1〜0.2mmが好
ましい。スペーサ102は、ポリ塩化ビニルの両面接着テ
ープで構成することができ、厚さ0.02mm程度が好まし
い。反応容器100の外形は、例えば18mm×18mmの正方形
とすることができる。
図22は、反応容器内にPCR反応液を入れた反応容器の
使用状態の一例を示す上面図である。図21に示した中央
に正方形の穴が開いた正方形のスペーサ102を、下側の
透明板101に接着したとき形成される凹部が、反応容器1
00の液体収容部として利用される。反応容器100の内部
はオイルで満たされ、10nl程度のPCR反応液の水滴104が
数十個内部に点在される。PCR反応液の水滴104は、イン
クジェットヘッドから反応容器内に打ち込まれたもので
ある。オイルは、PCR反応液の水滴104を打ち込む前に反
応容器内に満たしておいてもよいし、PCR反応液の水滴1
04を打ち込んだ後に水滴104に被せるようにして満たし
てもよい。その後、上側の透明板103をスペーサ102の両
面接着テープ上に配置して密封することで反応容器100
内に反応液が収容される。
使用状態の一例を示す上面図である。図21に示した中央
に正方形の穴が開いた正方形のスペーサ102を、下側の
透明板101に接着したとき形成される凹部が、反応容器1
00の液体収容部として利用される。反応容器100の内部
はオイルで満たされ、10nl程度のPCR反応液の水滴104が
数十個内部に点在される。PCR反応液の水滴104は、イン
クジェットヘッドから反応容器内に打ち込まれたもので
ある。オイルは、PCR反応液の水滴104を打ち込む前に反
応容器内に満たしておいてもよいし、PCR反応液の水滴1
04を打ち込んだ後に水滴104に被せるようにして満たし
てもよい。その後、上側の透明板103をスペーサ102の両
面接着テープ上に配置して密封することで反応容器100
内に反応液が収容される。
図23は、ホルダー本体の分解組立図である。図23に示
したホルダー110は、図４に示した反応容器100を６個収
容することができる大きさを有し、外枠111と穴あき板1
12と底板113を接着して作製される。外枠111は、発泡ポ
リプロピレン等からなる断熱材で作られている。穴あき
板112は薄い合成樹脂板からなり、図の例の場合、反応
容器100が挿入される貫通穴を６固有する。底板113は熱
伝導性に優れた薄いアルミニウム、銅などの金属板で作
られる。外枠111の内側の側面114にはシリコンゴムが塗
布され、断熱材内部へのオイルの侵入を防止している。
したホルダー110は、図４に示した反応容器100を６個収
容することができる大きさを有し、外枠111と穴あき板1
12と底板113を接着して作製される。外枠111は、発泡ポ
リプロピレン等からなる断熱材で作られている。穴あき
板112は薄い合成樹脂板からなり、図の例の場合、反応
容器100が挿入される貫通穴を６固有する。底板113は熱
伝導性に優れた薄いアルミニウム、銅などの金属板で作
られる。外枠111の内側の側面114にはシリコンゴムが塗
布され、断熱材内部へのオイルの侵入を防止している。
図24は反応容器を組み込んだホルダーの全体図、図25
はその分解組立図である。図25に示すように、反応容器
100をホルダー本体110の外枠111によって形成される凹
部にはめ込み、その上から上蓋115をかぶせ、サーマル
サイクラーのヒートブロック120の上に設置する。上蓋1
15は5mm程度の厚さを有し、発泡ポリプロピレン等の断
熱材で作られている。反応容器100、ホルダー本体110、
ヒートブロック120の間の熱伝導性を高めるため、隙間
はオイルやグリースで満たされている。また、全体の密
着性を高めるため、サーマルサイクラーに設置するとき
は、上蓋115の上に3kg程度のオモリを載せるのが好まし
い。
はその分解組立図である。図25に示すように、反応容器
100をホルダー本体110の外枠111によって形成される凹
部にはめ込み、その上から上蓋115をかぶせ、サーマル
サイクラーのヒートブロック120の上に設置する。上蓋1
15は5mm程度の厚さを有し、発泡ポリプロピレン等の断
熱材で作られている。反応容器100、ホルダー本体110、
ヒートブロック120の間の熱伝導性を高めるため、隙間
はオイルやグリースで満たされている。また、全体の密
着性を高めるため、サーマルサイクラーに設置するとき
は、上蓋115の上に3kg程度のオモリを載せるのが好まし
い。
こうして作製してホルダーに反応容器を収容し、温度
制御特性を測定した。測定のため、反応容器にはPCR反
応液を入れず、代わりに熱電対を挿入した。ホルダーを
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社、DNA480）、
上に設置し、92℃１分、54℃１分、72℃２分の温度サイ
クルを実施し、デジタル温度計（横川電機、型番2575）
及びペンレコーダー（グラフテック製、型番SR6512）を
用いて反応容器内部の温度を記録した。図26は、１サイ
クルの実測温度を示すグラフである。図中の温度が横に
書いてある横線は、設定温度、設定時間を示す。図から
明らかなように、実測温度は設定温度とほぼ一致してい
た。
制御特性を測定した。測定のため、反応容器にはPCR反
応液を入れず、代わりに熱電対を挿入した。ホルダーを
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社、DNA480）、
上に設置し、92℃１分、54℃１分、72℃２分の温度サイ
クルを実施し、デジタル温度計（横川電機、型番2575）
及びペンレコーダー（グラフテック製、型番SR6512）を
用いて反応容器内部の温度を記録した。図26は、１サイ
クルの実測温度を示すグラフである。図中の温度が横に
書いてある横線は、設定温度、設定時間を示す。図から
明らかなように、実測温度は設定温度とほぼ一致してい
た。
比較のために、スライドグラス上に、ポリ塩化ビニル
の両面接着テープからなるスペーサ（図21のスペーサ10
2に相当）を介してカバーグラスを接着し、カバーグラ
スとスライドグラスの隙間にシリコンオイルを充填して
熱電対を挿入したものを作製した。これをin situ用に
平板のヒートブロックを持つサーマルサイクラー（宝酒
造、TP3000）に設置し、92℃１分、54℃１分、72℃２分
の温度サイクルを実施して、デジタル温度計（横川電
機、型番2575）及びペンレコーダー（グラフテック製、
型番SR6512）を用いて反応容器内部の温度を記録した。
使用したサーマルサイクラーの上蓋を閉めた場合と、閉
めない場合について、測定を行った。
の両面接着テープからなるスペーサ（図21のスペーサ10
2に相当）を介してカバーグラスを接着し、カバーグラ
スとスライドグラスの隙間にシリコンオイルを充填して
熱電対を挿入したものを作製した。これをin situ用に
平板のヒートブロックを持つサーマルサイクラー（宝酒
造、TP3000）に設置し、92℃１分、54℃１分、72℃２分
の温度サイクルを実施して、デジタル温度計（横川電
機、型番2575）及びペンレコーダー（グラフテック製、
型番SR6512）を用いて反応容器内部の温度を記録した。
使用したサーマルサイクラーの上蓋を閉めた場合と、閉
めない場合について、測定を行った。
図27は上蓋を閉めた場合の測定結果を示し、図28は上
蓋を閉めない場合の測定結果を示す。いずれの場合でも
設定温度と実測温度に差があることが分かる。特に、上
蓋を閉めなかった図28の場合に設定温度と実測温度の差
が顕著であることが分かる。
蓋を閉めない場合の測定結果を示す。いずれの場合でも
設定温度と実測温度に差があることが分かる。特に、上
蓋を閉めなかった図28の場合に設定温度と実測温度の差
が顕著であることが分かる。
また、比較のために、in situ PCR用のヒートブロッ
クを使用しない場合の従来のin situ PCRの方法の温度
制御特性を調べた。スライドグラス上に、ポリ塩化ビニ
ルの両面接着テープからなるスペーサ（図21のスペーサ
102に相当）を介してカバーグラスを接着し、カバーグ
ラスとスライドグラスの隙間にシリコンオイルを充填し
て、熱電対を挿入した。スライドガラスをアルミホイル
で包み込んだ上で、サーマルサイクラー（パーキンエル
マー社、DNA480）に設置した。92℃１分、54℃１分、72
℃２分の温度サイクルを実施し、デジタル温度計（横川
電機、型番2575）及びペンレコーダー（グラフテック
製、型番SR6512）を用いて反応容器内部の温度を記録し
た。その結果、図29に示すように、設定温度と実測温度
に差があった。
クを使用しない場合の従来のin situ PCRの方法の温度
制御特性を調べた。スライドグラス上に、ポリ塩化ビニ
ルの両面接着テープからなるスペーサ（図21のスペーサ
102に相当）を介してカバーグラスを接着し、カバーグ
ラスとスライドグラスの隙間にシリコンオイルを充填し
て、熱電対を挿入した。スライドガラスをアルミホイル
で包み込んだ上で、サーマルサイクラー（パーキンエル
マー社、DNA480）に設置した。92℃１分、54℃１分、72
℃２分の温度サイクルを実施し、デジタル温度計（横川
電機、型番2575）及びペンレコーダー（グラフテック
製、型番SR6512）を用いて反応容器内部の温度を記録し
た。その結果、図29に示すように、設定温度と実測温度
に差があった。
更に比較のために、in situ PCR用のヒートブロック
を使用しない場合の従来のin situ PCRの方法の温度制
御特性を調べた。
を使用しない場合の従来のin situ PCRの方法の温度制
御特性を調べた。
スライドグラス上に、ポリ塩化ビニルの両面接着テー
プからなるスペーサ（図21のスペーサ102に相当）を介
してカバーグラスを接着し、カバーグラスとスライドグ
ラスの隙間にシリコンオイルを充填して、熱電対を挿入
した。アルミホイルで包み込み、さらに断熱材で覆って
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社、DNA480）に
設置した。92℃１分、54℃１分、72℃２分の温度サイク
ルを実施し、デジタル温度計（横川電機、型番2575）及
びペンレコーダー（グラフテック製、型番SR6512）を用
いて反応容器内部の温度を記録した。
プからなるスペーサ（図21のスペーサ102に相当）を介
してカバーグラスを接着し、カバーグラスとスライドグ
ラスの隙間にシリコンオイルを充填して、熱電対を挿入
した。アルミホイルで包み込み、さらに断熱材で覆って
サーマルサイクラー（パーキンエルマー社、DNA480）に
設置した。92℃１分、54℃１分、72℃２分の温度サイク
ルを実施し、デジタル温度計（横川電機、型番2575）及
びペンレコーダー（グラフテック製、型番SR6512）を用
いて反応容器内部の温度を記録した。
その結果、図30に示すように、かなり正確に温度制御
されていた。ただし、図26と図30とを比較すると明らか
なように、スライドグラスを使用せずに新熱材を直接微
量反応容器にかぶせる構造を取る本実施例のホルダーを
用いる方が、温度制御の正確性は優れていた。スライド
グラスを使用した場合に、温度制御の正確性が劣ってい
たのは、スライドグラスが断熱材ほど断熱性が良くない
ためと考えられる。
されていた。ただし、図26と図30とを比較すると明らか
なように、スライドグラスを使用せずに新熱材を直接微
量反応容器にかぶせる構造を取る本実施例のホルダーを
用いる方が、温度制御の正確性は優れていた。スライド
グラスを使用した場合に、温度制御の正確性が劣ってい
たのは、スライドグラスが断熱材ほど断熱性が良くない
ためと考えられる。
本実施の形態によるホルダーは、本発明の微量PCR反
応容器に適した形状を有する。そして、ヒートブロック
と反対側の面に断熱材を使用し、スライドグラスを除去
して代わりにカバーグラスを採用しており、断熱材の使
用によって温度制御の正確性が高まった。また、温度制
御されるべき部分はホルダーの底板113と反応容器本体1
00だけなので、熱容量が小さく、また、熱伝導が良好な
ため、サーマルサイクラーの制御パラメーター（ヒート
ブロックの熱容量、熱伝導率に基づき、通常は変更でき
ない）を変更しなくても制御が可能なため、どの様なサ
ーマルサイクラーを使用しても正確な温度制御が期待で
きる。
応容器に適した形状を有する。そして、ヒートブロック
と反対側の面に断熱材を使用し、スライドグラスを除去
して代わりにカバーグラスを採用しており、断熱材の使
用によって温度制御の正確性が高まった。また、温度制
御されるべき部分はホルダーの底板113と反応容器本体1
00だけなので、熱容量が小さく、また、熱伝導が良好な
ため、サーマルサイクラーの制御パラメーター（ヒート
ブロックの熱容量、熱伝導率に基づき、通常は変更でき
ない）を変更しなくても制御が可能なため、どの様なサ
ーマルサイクラーを使用しても正確な温度制御が期待で
きる。
なお、反応容器100は、ときどきシールが不完全で、
内部に空気が混入することがあるが、本発明のホルダー
を用いると、ホルダー110の全体の底にオイルが満たさ
れるため、反応容器のシールが不完全な場合でも、反応
容器内に空気が混入することを防止できる。
内部に空気が混入することがあるが、本発明のホルダー
を用いると、ホルダー110の全体の底にオイルが満たさ
れるため、反応容器のシールが不完全な場合でも、反応
容器内に空気が混入することを防止できる。
本実施の形態で説明したホルダーの変形例として、上
面が平板のサーマルサイクラーを使用する場合、底板11
3を使わず、穴あき板112の下面をヒートブロックに直接
粘着させるようにしてもよい。この場合、何回も粘着、
剥離可能なことが望ましい。全体の各部品の密着性を高
めるため、上部におもりをのせる代わりに、万力のよう
なものを使って、サーマルサイクラー120とホルダー110
を締め付けてもよい。
面が平板のサーマルサイクラーを使用する場合、底板11
3を使わず、穴あき板112の下面をヒートブロックに直接
粘着させるようにしてもよい。この場合、何回も粘着、
剥離可能なことが望ましい。全体の各部品の密着性を高
めるため、上部におもりをのせる代わりに、万力のよう
なものを使って、サーマルサイクラー120とホルダー110
を締め付けてもよい。
実施の形態５ 微量容器のPCR用加熱ホルダー（２） 本発明の反応容器を保持するホルダーの他の例につい
て説明する。本実施の形態のホルダーは、スライドガラ
スと同一サイズを有するのが特徴である。このホルダー
の使用により、図21に示した本発明の微量PCR用反応容
器を一般的なin situ PCR用サーマルサイクラーで利用
することが可能となる。
て説明する。本実施の形態のホルダーは、スライドガラ
スと同一サイズを有するのが特徴である。このホルダー
の使用により、図21に示した本発明の微量PCR用反応容
器を一般的なin situ PCR用サーマルサイクラーで利用
することが可能となる。
図31は、ホルダーの分解組立図である。ホルダー本体
130は、底板132と穴あき板131からなり、両者を接着し
て構成される。底板132及び穴あき板131は、熱伝導性に
優れた金属、あるいは反対に断熱材などで作られる。穴
あき板131は、反応容器が収まる穴を複数固有する。ホ
ルダー130の全体寸法は、in situ PCRで使用される顕微
鏡用スライドグラスと同一の外寸（75.9mm×26.1mm×1.
1mm）を有する。
130は、底板132と穴あき板131からなり、両者を接着し
て構成される。底板132及び穴あき板131は、熱伝導性に
優れた金属、あるいは反対に断熱材などで作られる。穴
あき板131は、反応容器が収まる穴を複数固有する。ホ
ルダー130の全体寸法は、in situ PCRで使用される顕微
鏡用スライドグラスと同一の外寸（75.9mm×26.1mm×1.
1mm）を有する。
図32は、反応容器を組み込んだホルダーの分解組立図
である。反応容器100は、ホルダー本体130のくほみには
め込んで固定される。反応容器100をホルダー130に装着
した後、本体の上面に再剥離が容易な接着剤あるいはマ
ジックテープ等によって固定板133を着脱可能に取り付
ける。固定板133は、熱伝導性に優れた薄い金属からな
り、反応容器100をホルダー本体130に固定する役割を有
する。また、ホルダー本体130、反応容器100、固定板13
3の間の熱伝導性を高めるため、隙間をオイルあるいは
グリースで満たす。サーマルサイクラーに設置するとき
には、固定板133の側をヒートブロックに接触させるよ
うにする。
である。反応容器100は、ホルダー本体130のくほみには
め込んで固定される。反応容器100をホルダー130に装着
した後、本体の上面に再剥離が容易な接着剤あるいはマ
ジックテープ等によって固定板133を着脱可能に取り付
ける。固定板133は、熱伝導性に優れた薄い金属からな
り、反応容器100をホルダー本体130に固定する役割を有
する。また、ホルダー本体130、反応容器100、固定板13
3の間の熱伝導性を高めるため、隙間をオイルあるいは
グリースで満たす。サーマルサイクラーに設置するとき
には、固定板133の側をヒートブロックに接触させるよ
うにする。
本実施の形態のホルダーを使用すると、保管の際もス
ライド用の保管箱が利用できて便利である。また、固定
板133は必ずしも必要ではなく、ホルダー本体130と反応
容器100が適当な方法で固定されていればよい。
ライド用の保管箱が利用できて便利である。また、固定
板133は必ずしも必要ではなく、ホルダー本体130と反応
容器100が適当な方法で固定されていればよい。
実施の形態６ インクジェットヘッドとして、パソコン用インクジェ
ットプリンタ（MJ500C、セイコーエプソン製）のモノク
ロ印刷用ヘッドを使用し、インクジェットによって微量
の試薬を混合し、10nlのPCRを行った。PCR反応を行うの
に先立ち、（１）インクジェットヘッド内部のコーティ
ング、（２）マイクロリットルスケールでの反応容器コ
ーティング、（３）マイクロリットルスケールでの酵素
濃度、（４）反応容器表面の水滴付着性の改善、（５）
水滴溶出防止のための反応容器内部厚さ、（６）PCR反
応促進のための酵素の増量について検討した。
ットプリンタ（MJ500C、セイコーエプソン製）のモノク
ロ印刷用ヘッドを使用し、インクジェットによって微量
の試薬を混合し、10nlのPCRを行った。PCR反応を行うの
に先立ち、（１）インクジェットヘッド内部のコーティ
ング、（２）マイクロリットルスケールでの反応容器コ
ーティング、（３）マイクロリットルスケールでの酵素
濃度、（４）反応容器表面の水滴付着性の改善、（５）
水滴溶出防止のための反応容器内部厚さ、（６）PCR反
応促進のための酵素の増量について検討した。
（１）インクジェットヘッド内部のコーティングの検討 インクジェットヘッド内部の酵素の吸着を防止するた
め、コーティングを検討した。PCRが進行したかどうか
光学的に検出するためのシステムとして、タックマンシ
ステム（パーキンエルマー製）を利用することにした。
次の〔表３〕のようにPCR反応液を調製した。
め、コーティングを検討した。PCRが進行したかどうか
光学的に検出するためのシステムとして、タックマンシ
ステム（パーキンエルマー製）を利用することにした。
次の〔表３〕のようにPCR反応液を調製した。
表３ ヒトゲノムを鋳型にしたタックマンPCRの組成試薬 最終濃度 KCl 50mM Tris−HCl,pH8.3 10mM MgCl2 3.5mM dATP 0.2mM dCTP 0.2mM dGTP 0.2mM dTTP 0.2mM β−アクチンフォワードプライマー （配列番号１） 0.3μＭ β−アクチンリバースプライマー （配列番号２） 0.3μＭ β−アクチンプローブ（配列番号３） 0.2mM アンプリタック DNAポリメラーゼ 0.1U/μｌ アンプイレース UNG 0.01U/μｌ ヒト男性DNA （ベーリンガー・マンハイム社製） 1ng/μｌ この反応液を、ヘッドの内部に充填し、パソコン（PC
9801ns、日本電機製）に接続されたプリンタに取り付
け、カバーグラス上に噴射した。その後、ピペットで0.
5mlチューブに移した。これを繰り返し、合計40μｌの
反応液を集め、４本の0.5mlチューブに小分けし、サー
マルサイクラー（DNA480,パーキンエルマー製）にセッ
トし、50℃２分、95℃10分のあと、92℃１分、54℃１
分、72℃２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反
応させる温度サイクルにかけた。
9801ns、日本電機製）に接続されたプリンタに取り付
け、カバーグラス上に噴射した。その後、ピペットで0.
5mlチューブに移した。これを繰り返し、合計40μｌの
反応液を集め、４本の0.5mlチューブに小分けし、サー
マルサイクラー（DNA480,パーキンエルマー製）にセッ
トし、50℃２分、95℃10分のあと、92℃１分、54℃１
分、72℃２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反
応させる温度サイクルにかけた。
反応終了後、10μｌの反応液に、TE緩衝液（pH8.0）
を990μｌ加え、蛍光分光光度計（FP777,日本分光製）
で、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は488nmにし
た。測定の結果、４つのサンプルいずれからも図33のよ
うな蛍光スペクトルが得られた。図33を見ると、蛍光色
素FAM由来の520nmのピークが、蛍光色素TAMRA由来の580
nmのピークよりも小さい。これは、PCR反応が進行しな
かったことを示している。原因は、ヘッド内部への酵素
の吸着によるものと考えられた。
を990μｌ加え、蛍光分光光度計（FP777,日本分光製）
で、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は488nmにし
た。測定の結果、４つのサンプルいずれからも図33のよ
うな蛍光スペクトルが得られた。図33を見ると、蛍光色
素FAM由来の520nmのピークが、蛍光色素TAMRA由来の580
nmのピークよりも小さい。これは、PCR反応が進行しな
かったことを示している。原因は、ヘッド内部への酵素
の吸着によるものと考えられた。
そこで、酵素の吸着を防止するため、反応液を充填す
る前に、５％ウシ血清アルブミン水溶液をインクジェッ
トヘッド内部に満たし、室温で一晩放置し、そのあと、
同様の実験を行った。蛍光スペクトルを測定したとこ
ろ、実験した２つのサンプルいずれからも、図34に示す
蛍光スペクトルが得られた。図34を見ると、蛍光色素FA
M由来の520nmのピークが、蛍光色素TAMRA由来の580nmの
ピークよりも大きい。これはPCR反応が進行したことを
示していた。これらの検討により、ヘッド内部の前処理
として、ウシ血清アルブミンによるコーティングが有効
なことが示された。
る前に、５％ウシ血清アルブミン水溶液をインクジェッ
トヘッド内部に満たし、室温で一晩放置し、そのあと、
同様の実験を行った。蛍光スペクトルを測定したとこ
ろ、実験した２つのサンプルいずれからも、図34に示す
蛍光スペクトルが得られた。図34を見ると、蛍光色素FA
M由来の520nmのピークが、蛍光色素TAMRA由来の580nmの
ピークよりも大きい。これはPCR反応が進行したことを
示していた。これらの検討により、ヘッド内部の前処理
として、ウシ血清アルブミンによるコーティングが有効
なことが示された。
（２）マイクロリットルスケールでの反応容器コーティ
ングの検討 続いて、反応容器への酵素の吸着を防止するため、コ
ーティングの検討をおこなった。市販の顕微鏡用カバー
グラス（マツナミ製）にシグマコート（アルドリッチジ
ャパン製）を塗布、乾燥し、表面をシリコンコートし
た。そして、図21煮染めしたように反応容器を作成し
た。カバーグラスからなる透明板101,103の寸法は18mm
×18mm、スペーサ102として用いた市販のin situ PCR用
両面シール（宝酒造製）の寸法は18mm×18mm、中央の正
方形の穴は、10mm×10mm、厚さは0.2mmである。
ングの検討 続いて、反応容器への酵素の吸着を防止するため、コ
ーティングの検討をおこなった。市販の顕微鏡用カバー
グラス（マツナミ製）にシグマコート（アルドリッチジ
ャパン製）を塗布、乾燥し、表面をシリコンコートし
た。そして、図21煮染めしたように反応容器を作成し
た。カバーグラスからなる透明板101,103の寸法は18mm
×18mm、スペーサ102として用いた市販のin situ PCR用
両面シール（宝酒造製）の寸法は18mm×18mm、中央の正
方形の穴は、10mm×10mm、厚さは0.2mmである。
下側カバーグラス101と、シール102を張り合わせたと
ころに、前記〔表３〕の組成のPCR反応液20μｌを内側
に入れ、そのあと、上側カバーグラス103を張り付け
た。これを図25に示したように加熱ホルダーに入れ、サ
ーマルサイクラーに仕掛けて、反応させた。その後、反
応容器を破壊して、内部の反応液を取り出し、TE緩衝液
（pH8.0）で薄めて、蛍光スペクトルを測定した。図35
はカバーグラス101,103をシリコンコートした場合、図3
6はシリコンコートしなかった場合の蛍光スペクトルで
ある。カバーグラス101,103をシリコンコートした場合
だけ、PCRが進行していたことが分かる。
ころに、前記〔表３〕の組成のPCR反応液20μｌを内側
に入れ、そのあと、上側カバーグラス103を張り付け
た。これを図25に示したように加熱ホルダーに入れ、サ
ーマルサイクラーに仕掛けて、反応させた。その後、反
応容器を破壊して、内部の反応液を取り出し、TE緩衝液
（pH8.0）で薄めて、蛍光スペクトルを測定した。図35
はカバーグラス101,103をシリコンコートした場合、図3
6はシリコンコートしなかった場合の蛍光スペクトルで
ある。カバーグラス101,103をシリコンコートした場合
だけ、PCRが進行していたことが分かる。
（３）マイクロリットルスケールでの酵素濃度の検討 シリコンコートした反応溶液において必要な酵素濃度
について検討した。反応液の組成は次の〔表４〕の通り
であるが、DNAポリメラーゼの濃度を変化させた。通常
チューブ内で反応するときと比べて、１倍（0.025U/μ
ｌ）、２倍（0.050U/μｌ）、５倍（0.125U/μｌ）、10
倍（0.25U/μｌ）にし、これまでと同様に、サーマルサ
イクラーにかけた後、TE緩衝液で希釈して、蛍光スペク
トルを測定した。
について検討した。反応液の組成は次の〔表４〕の通り
であるが、DNAポリメラーゼの濃度を変化させた。通常
チューブ内で反応するときと比べて、１倍（0.025U/μ
ｌ）、２倍（0.050U/μｌ）、５倍（0.125U/μｌ）、10
倍（0.25U/μｌ）にし、これまでと同様に、サーマルサ
イクラーにかけた後、TE緩衝液で希釈して、蛍光スペク
トルを測定した。
表４ ターゲットDNA取得のためのPCRの組成 Takara Ex Taq（宝酒造製） 12.5μｌ（62.5U） 10×Ex Taq緩衝液（宝酒造製） 250μｌ dNTP混合液（宝酒造製） 200μｌ ヒト男性ゲノムDNA （ベーリンガー・マンハイム社製） 25μｌ（250ng） プライマーF3 25μｌ（2.5nmol） プライマーR3 25μｌ（2.5nmol） 滅菌水 1962.5μl 図37は、測定された蛍光スペクトルを示す。蛍光色素FA
M由来の520nmのピークと、蛍光色素TAMRA由来の580nmの
ピークを比べると、酵素量が２〜５倍で一定になり、PC
Rが進行していることが分かる。また、酵素濃度を通常
チューブ内で反応するときと比べて４倍（0.1U/μｌ）
にし、４個の反応容器に充填して反応したところ、いず
れも、図38のような蛍光スペクトルが得られた。
M由来の520nmのピークと、蛍光色素TAMRA由来の580nmの
ピークを比べると、酵素量が２〜５倍で一定になり、PC
Rが進行していることが分かる。また、酵素濃度を通常
チューブ内で反応するときと比べて４倍（0.1U/μｌ）
にし、４個の反応容器に充填して反応したところ、いず
れも、図38のような蛍光スペクトルが得られた。
これらの結果から、20μｌスケールで、シリコンコー
トした反応容器を用いる場合、通常チューブ内の濃度の
４倍（0.1U/μｌ）以上の酵素が必要であることが分か
った。
トした反応容器を用いる場合、通常チューブ内の濃度の
４倍（0.1U/μｌ）以上の酵素が必要であることが分か
った。
（４）反応容器表面の水滴付着性の改善 前述のように、反応容器表面への酵素の吸着を防止す
るためには、反応容器の内面にシリコンコートを施す必
要がある。しかし、シリコンコートを施した表面は、撥
水性が高いため、インクジェットノズルで微小水滴を噴
射すると、水滴が容器の表面から飛び跳ね、一定の量を
再現性良く分注することが困難である。そこで、反応容
器表面の水滴付着性を改善するため、シリコンコートし
た上に、更にウシ血清アルブミンをコーティングするこ
とにした。
るためには、反応容器の内面にシリコンコートを施す必
要がある。しかし、シリコンコートを施した表面は、撥
水性が高いため、インクジェットノズルで微小水滴を噴
射すると、水滴が容器の表面から飛び跳ね、一定の量を
再現性良く分注することが困難である。そこで、反応容
器表面の水滴付着性を改善するため、シリコンコートし
た上に、更にウシ血清アルブミンをコーティングするこ
とにした。
コーティング処理として、５％ウシ血清アルブミン水
溶液を染み込ませた実験用ティッシュペーパー（キムワ
イプ、十條キンバリー製）でカバーグラスの表面を拭い
た後、再びきれいに拭き取った。処理後のカバーグラス
は、見かけは処理前と変わらないが、水滴の付着性が改
善されており、インクジェットノズルにより、再現性良
く水滴を分注することができた。
溶液を染み込ませた実験用ティッシュペーパー（キムワ
イプ、十條キンバリー製）でカバーグラスの表面を拭い
た後、再びきれいに拭き取った。処理後のカバーグラス
は、見かけは処理前と変わらないが、水滴の付着性が改
善されており、インクジェットノズルにより、再現性良
く水滴を分注することができた。
（５）水滴溶出防止のための反応容器内部厚さの検討 反応容器の下面となるカバーグラスを、プリンタに設
置するため、図４で説明したように台紙20に張り付け
た。台紙20の材質はプラスチック製のシートで、大きさ
は70mm×120mm、斜線で示した部分21（大きさ10mm×10m
m）が観察用に切り抜かれており、二点差線で示した部
分22にカバーグラスを接着した。この台紙20をプリンタ
に給紙し、カバーグラス上に水滴を分注した。例えば、
10nlの水滴を分注するためには、７ドット×７ドットの
正方形を５回重ねうちする。１ドットの液量は、約40pl
であるので、７×７×５＝245ドットの液量は、245×40
＝9800pl、つまり、約10nlとなる。
置するため、図４で説明したように台紙20に張り付け
た。台紙20の材質はプラスチック製のシートで、大きさ
は70mm×120mm、斜線で示した部分21（大きさ10mm×10m
m）が観察用に切り抜かれており、二点差線で示した部
分22にカバーグラスを接着した。この台紙20をプリンタ
に給紙し、カバーグラス上に水滴を分注した。例えば、
10nlの水滴を分注するためには、７ドット×７ドットの
正方形を５回重ねうちする。１ドットの液量は、約40pl
であるので、７×７×５＝245ドットの液量は、245×40
＝9800pl、つまり、約10nlとなる。
前記〔表４〕の組成の反応液を、インクジェットノズ
ルから約10nl（245ドット）を分注し、分注後、直ち
に、オイル（シリコンオイルKF96−50、粘度50cp、信越
化学製）を上からかぶせ、スペーサ、上板カバーグラス
を順に取り付けて、台紙上に図21のような反応容器を組
み立てた。スペーサとして、市販のin situ PCR用両面
シール（宝酒造製）を使用したので、反応容器内面の厚
さは約200μｍになった。その後、反応容器を台紙から
切り離し、図24、図25で説明したホルダーに取り付け、
50℃２分、95℃10分のあと、92℃１分、54℃１分、72℃
２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反応させる
温度サイクルをかけてPCR反応をおこなった。
ルから約10nl（245ドット）を分注し、分注後、直ち
に、オイル（シリコンオイルKF96−50、粘度50cp、信越
化学製）を上からかぶせ、スペーサ、上板カバーグラス
を順に取り付けて、台紙上に図21のような反応容器を組
み立てた。スペーサとして、市販のin situ PCR用両面
シール（宝酒造製）を使用したので、反応容器内面の厚
さは約200μｍになった。その後、反応容器を台紙から
切り離し、図24、図25で説明したホルダーに取り付け、
50℃２分、95℃10分のあと、92℃１分、54℃１分、72℃
２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反応させる
温度サイクルをかけてPCR反応をおこなった。
反応終了後、蛍光顕微鏡（BX60、オリンパス光学製）
で観察した。ダイクロイックミラーユニットは、WIBキ
ューブで、励起光が460〜490nm、蛍光が515nm以上であ
った。観察の結果、オイル中の反応液の水滴の大きさ
が、温度サイクル開始前の約半分になっていた。これ
は、高温により、水滴がオイル中に溶出したためと思わ
れる。水滴の蛍光評価も、蛍光プローブの濃度が大きく
変化しているため、困難であった。
で観察した。ダイクロイックミラーユニットは、WIBキ
ューブで、励起光が460〜490nm、蛍光が515nm以上であ
った。観察の結果、オイル中の反応液の水滴の大きさ
が、温度サイクル開始前の約半分になっていた。これ
は、高温により、水滴がオイル中に溶出したためと思わ
れる。水滴の蛍光評価も、蛍光プローブの濃度が大きく
変化しているため、困難であった。
そこで、スペーサとして、厚さ50μｍのポリ塩化ビニ
ル製シール（加藤紙工製）を使用した。下記の〔表５〕
の反応液の組成で、同様の実験を行ったところ、水滴の
大きさは変化なく、溶出は起こっていなかった。これ
は、反応容器の内部厚さが大幅に薄くなったため、オイ
ル全体の体積が減ったこと、オイルと水滴の界面の面積
が減少したことによると考えられた。しかし、水滴の蛍
光は、温度サイクル前と変化がなく、PCRは進行しなか
ったと考えられた。
ル製シール（加藤紙工製）を使用した。下記の〔表５〕
の反応液の組成で、同様の実験を行ったところ、水滴の
大きさは変化なく、溶出は起こっていなかった。これ
は、反応容器の内部厚さが大幅に薄くなったため、オイ
ル全体の体積が減ったこと、オイルと水滴の界面の面積
が減少したことによると考えられた。しかし、水滴の蛍
光は、温度サイクル前と変化がなく、PCRは進行しなか
ったと考えられた。
表５ 試薬 最終濃度 KCl 50mM Tris−Cl,pH8.3 10mM MgCl2 3.5mM dATP 0.2mM dCTP 0.2mM dGTP 0.2mM dTTP 0.2mM β−アクチンフォワードプライマー （配列番号１） 0.3μＭ β−アクチンリバースプライマー （配列番号２） 0.3μＭ β−アクチンプローブ（配列番号３） 0.2nM アンプリタック DNAポリメラーゼ 0.1U/μｌ （通常スケールのチューブの場合の４倍の濃度） アンプイレース UNG 0.01U/μｌ ターゲットDNA（配列番号４） 1ng/μｌ さらに、次のような方法で加熱時のオイル中への水滴
の溶出量を測定した。
の溶出量を測定した。
（ａ）前述の方法と同様にして、インクジェットプリン
タから245ドット（10nl）の超純水をカバーグラス表面
に噴出し、水滴の上にマイクロピペットでオイルを被せ
た。カバーグラスにロの字型スペーサ（厚さ50μｍ）を
１〜３枚接着し、更にその上からもう１枚のカバーグラ
スを接着した。このようにして、10nlの超純水をオイル
で満たされた反応容器の内部に封入した複数のサンプル
を用意した。反応容器内部の厚さは、ロの字型スペーサ
１枚の厚さが50μｍなので、スペーサ１枚の時は50μ
ｍ、２枚の時は100μｍ、３枚の時は150μｍである。オ
イルとしては、ミネラルオイル（M5904,シグマアルドリ
ッチジャパン）とシリコンオイル（KF96−50、信越化
学）を使用した。
タから245ドット（10nl）の超純水をカバーグラス表面
に噴出し、水滴の上にマイクロピペットでオイルを被せ
た。カバーグラスにロの字型スペーサ（厚さ50μｍ）を
１〜３枚接着し、更にその上からもう１枚のカバーグラ
スを接着した。このようにして、10nlの超純水をオイル
で満たされた反応容器の内部に封入した複数のサンプル
を用意した。反応容器内部の厚さは、ロの字型スペーサ
１枚の厚さが50μｍなので、スペーサ１枚の時は50μ
ｍ、２枚の時は100μｍ、３枚の時は150μｍである。オ
イルとしては、ミネラルオイル（M5904,シグマアルドリ
ッチジャパン）とシリコンオイル（KF96−50、信越化
学）を使用した。
（ｂ）反応容器内の水滴を倒立顕微鏡（オリンパス、IM
T−２）で観察し、写真を撮影した。
T−２）で観察し、写真を撮影した。
（ｃ）続いて、反応容器をホルダー内に格納し、サーマ
ルサイクラーに設置し、反応容器に次の温度サイクルを
与えた。
ルサイクラーに設置し、反応容器に次の温度サイクルを
与えた。
50℃２分、95℃10分 1サイクル 92℃１分、54℃１分、72℃２分 40サイクル 72℃10分 1サイクル （ｄ）温度サイクル終了後、再び反応容器内の水滴の顕
微鏡写真を撮影した。水滴の顕微鏡写真をスキャナでパ
ソコンに読み込み、画像解析ソフト（NIM Image,Nation
al Institute of Health,USA）で水滴の大きさを測定し
た。反応容器内部の水滴を顕微鏡で観察すると、２枚の
カバーグラスに挟まれた円柱状の形状だった。温度サイ
クルの前後で、反応容器内部の厚さは変わらないので、
顕微鏡で観察した水滴の平面的大きさが水滴の体積に比
例していると考えられる。
微鏡写真を撮影した。水滴の顕微鏡写真をスキャナでパ
ソコンに読み込み、画像解析ソフト（NIM Image,Nation
al Institute of Health,USA）で水滴の大きさを測定し
た。反応容器内部の水滴を顕微鏡で観察すると、２枚の
カバーグラスに挟まれた円柱状の形状だった。温度サイ
クルの前後で、反応容器内部の厚さは変わらないので、
顕微鏡で観察した水滴の平面的大きさが水滴の体積に比
例していると考えられる。
（ｅ）温度サイクル前後の水滴の大きさを比較し、水滴
のオイル中への溶出率を算出した。結果を下記の表６に
示す。
のオイル中への溶出率を算出した。結果を下記の表６に
示す。
表６において、スペーサの枚数が１枚でシリコンオイ
ルを使用したときの溶出率がマイナスになっているの
は、容器の撓みに基づく実験上の誤差である。表６か
ら、オイル中への水滴の溶出は、容器内部の厚さが厚い
ほど多く、特に厚さが100μｍを超えると顕著である。
従って、溶出防止のためには容器内部の厚さを100μｍ
以下とするのが好ましい。
ルを使用したときの溶出率がマイナスになっているの
は、容器の撓みに基づく実験上の誤差である。表６か
ら、オイル中への水滴の溶出は、容器内部の厚さが厚い
ほど多く、特に厚さが100μｍを超えると顕著である。
従って、溶出防止のためには容器内部の厚さを100μｍ
以下とするのが好ましい。
（６）PCR反応促進のための酵素の増量の検討 反応液量を微量化してゆくと、体積あたりの表面積が
増加し、反応液の表面に酵素が吸着し、反応液中の酵素
活性が減少すると考えられる。そこで酵素を増量し、微
量PCRを検討した。
増加し、反応液の表面に酵素が吸着し、反応液中の酵素
活性が減少すると考えられる。そこで酵素を増量し、微
量PCRを検討した。
下記の〔表７〕に示す組成の反応液を使用した。酵素
量は、通常スケールのチューブの場合の20倍であった。
インクジェットノズルから約10nl（245ドット）を分注
し、反応容器を組み立てた。スペーサとして、厚さ50μ
ｍのポリ塩化ビニル製シール（加藤紙工製）を使用し
た。オイルは信越化学製シリコンオイルKF96−50、粘度
50cpを使用した。
量は、通常スケールのチューブの場合の20倍であった。
インクジェットノズルから約10nl（245ドット）を分注
し、反応容器を組み立てた。スペーサとして、厚さ50μ
ｍのポリ塩化ビニル製シール（加藤紙工製）を使用し
た。オイルは信越化学製シリコンオイルKF96−50、粘度
50cpを使用した。
表７ 試薬 最終濃度 KCl 50mM Tris−Cl、pH8.3 10mM MgCl2 3.5mM dATP 0.2mM dCTP 0.2mM dGTP 0.2mM dTTP 0.2mM β−アクチンフォワードプライマー （配列番号１） 0.3μＭ β−アクチンリバースプライマー （配列番号２） 0.3μＭ β−アクチンプローブ（配列番号３） 0.2mM アンプリタック DNAポリメラーゼ 0.5U/μｌ （通常スケールのチューブの場合の20倍の濃度） アンプイレース UNG 0.01U/μｌ ターゲットDNA（配列番号４） 1ng/μｌ 50℃２分、95℃10分のあと、92℃１分、54℃１分、72
℃２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反応させ
る温度サイクルをかけて、蛍光顕微鏡で観察した。観察
の結果、温度サイクルをかけたサンプル（＋）と、かけ
ないサンプル（−）を比べると、はっきりと蛍光の変化
が観察された。（＋）は明るい緑色、（−）は赤っぽい
黄色に見えた。この蛍光色の違いは、通常のチューブで
タックマンPCRをした場合の、PCRが進行した場合としな
かった場合の蛍光スペクトルの違いに対応していた。
（＋）の水滴の内部では、PCRが進行したと考えられ
る。
℃２分を40サイクル繰り返し、更に72℃10分で反応させ
る温度サイクルをかけて、蛍光顕微鏡で観察した。観察
の結果、温度サイクルをかけたサンプル（＋）と、かけ
ないサンプル（−）を比べると、はっきりと蛍光の変化
が観察された。（＋）は明るい緑色、（−）は赤っぽい
黄色に見えた。この蛍光色の違いは、通常のチューブで
タックマンPCRをした場合の、PCRが進行した場合としな
かった場合の蛍光スペクトルの違いに対応していた。
（＋）の水滴の内部では、PCRが進行したと考えられ
る。
（＋）と（−）の反応容器を重ね合わせ、両方の水滴
を一枚の顕微鏡写真に写した。フィルムはカラースライ
ドフィルム（エクタクロームダイナEX、ISO100、コダッ
ク製）を使用した。現像したフィルムをフィルムスキャ
ナー（クイックスキャン35、ミノルタ製）でパソコンに
取り込み、画像解析ソフト（フォトショップ、アドベ
製）で解析した。２つの水滴の蛍光画像の中の任意の30
点をとって、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）に色分解し
た値を求め、Ｒ＋Ｇ＋Ｂに対する、ＲとＧの割合をプロ
ットしたのが図39である。（＋）と（−）がはっきり異
なる蛍光を発していることが分かる。
を一枚の顕微鏡写真に写した。フィルムはカラースライ
ドフィルム（エクタクロームダイナEX、ISO100、コダッ
ク製）を使用した。現像したフィルムをフィルムスキャ
ナー（クイックスキャン35、ミノルタ製）でパソコンに
取り込み、画像解析ソフト（フォトショップ、アドベ
製）で解析した。２つの水滴の蛍光画像の中の任意の30
点をとって、赤（Ｒ）、緑（Ｇ）、青（Ｂ）に色分解し
た値を求め、Ｒ＋Ｇ＋Ｂに対する、ＲとＧの割合をプロ
ットしたのが図39である。（＋）と（−）がはっきり異
なる蛍光を発していることが分かる。
（７）実験例 以上の検討により、次の条件でPCR反応を行うのが有
利であることが判明した。そこで、この条件下でPCR反
応を行った。
利であることが判明した。そこで、この条件下でPCR反
応を行った。
（ａ）反応溶液のオイル中への溶出を防止するため、内
面厚さ50μｍ以下の薄型反応容器を使用（構造が簡単で
安価） （ｂ）酸素の吸着防止と水滴の飛散防止を両立させた容
器表面コーティング （ｃ）酸素の増量によるPCR反応の促進 10ナノリットルの微量PCRのための鋳型DNAとして、ヒ
トのβ−アクチン遺伝子の一部を選んだ。この遺伝子の
塩基配列は、ナカジマら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナルアカデミー・オブ・サイエンス、82巻、6133〜
6137頁（1985年）に示されている。このうち、2058番目
から2552番目の塩基配列、長さ495bpの部分（配列番号
４）を、ゲノムDNAから通常反応スケールのPCRで取得を
することにした。
面厚さ50μｍ以下の薄型反応容器を使用（構造が簡単で
安価） （ｂ）酸素の吸着防止と水滴の飛散防止を両立させた容
器表面コーティング （ｃ）酸素の増量によるPCR反応の促進 10ナノリットルの微量PCRのための鋳型DNAとして、ヒ
トのβ−アクチン遺伝子の一部を選んだ。この遺伝子の
塩基配列は、ナカジマら、プロシーディング・オブ・ナ
ショナルアカデミー・オブ・サイエンス、82巻、6133〜
6137頁（1985年）に示されている。このうち、2058番目
から2552番目の塩基配列、長さ495bpの部分（配列番号
４）を、ゲノムDNAから通常反応スケールのPCRで取得を
することにした。
配列番号４の領域の両端にあたる、プライマーF3（配
列番号５）（サワディーテクノロジー製）、プライマー
R3（配列番号６）（サワディーテクノロジー製）を設計
した。〔表４〕のPCR反応液の調製を行った。反応液の
全体の液量は2.5mlとした。これを50μｌずつ48本の0.5
mlチューブに小分けし、サーマルサイクラー（DNA480、
パーキンエルマー製）にセットし、94℃１分、65℃１
分、72℃1.5分が30サイクル、72℃２分が１サイクルか
らなる温度サイクルにかけた。
列番号５）（サワディーテクノロジー製）、プライマー
R3（配列番号６）（サワディーテクノロジー製）を設計
した。〔表４〕のPCR反応液の調製を行った。反応液の
全体の液量は2.5mlとした。これを50μｌずつ48本の0.5
mlチューブに小分けし、サーマルサイクラー（DNA480、
パーキンエルマー製）にセットし、94℃１分、65℃１
分、72℃1.5分が30サイクル、72℃２分が１サイクルか
らなる温度サイクルにかけた。
反応終了後、プライマー等を除去するため、全ての液
を一つに集め、限外濾過で精製した。チューブ式限外濾
過膜（マイクロコン1000、アミコン製）６本に小分け
し、遠心分離器で、500G、24分で濾過した。さらに、各
チューブにTE緩衝液（pH8.0）300μｌを加え、遠心分離
器で、500G、15分で濾過し、洗浄した。洗浄は２回行っ
た。さらに各チューブにTE緩衝液（pH8.0）10μｌを加
え、限外濾過膜上に残った精製サンプルを溶解した。図
40は、0.8％アガロースゲル電気泳動による分析結果で
ある。図40の各レーンは各々の試料の泳動結果を示して
いる。
を一つに集め、限外濾過で精製した。チューブ式限外濾
過膜（マイクロコン1000、アミコン製）６本に小分け
し、遠心分離器で、500G、24分で濾過した。さらに、各
チューブにTE緩衝液（pH8.0）300μｌを加え、遠心分離
器で、500G、15分で濾過し、洗浄した。洗浄は２回行っ
た。さらに各チューブにTE緩衝液（pH8.0）10μｌを加
え、限外濾過膜上に残った精製サンプルを溶解した。図
40は、0.8％アガロースゲル電気泳動による分析結果で
ある。図40の各レーンは各々の試料の泳動結果を示して
いる。
レーン1:分子量マーカーφX174/Hinc II（2.6μｇ） レーン2:限外濾過前反応液（10μｌ） レーン3:洗浄後の液（１回目）（10μｌ） レーン4:洗浄後の後液（２回目）（10μｌ） レーン5:精製後サンプル（10μｌ） レーン２では、PCRにより一本のバンドが、増幅され
ていることがわかる。このバンドの位置は、レーン１の
分子量マーカーの495bpの一と同じであり、目的のバン
ド（長さ495bp）であると判断される。レーン２の下の
方に薄く見えるバンドは、プライマー等であり、限外濾
過で精製した後のレーン５では除かれていた。このよう
にして、本発明の反応容器を用いて微量PCRが可能であ
ることが示された。
ていることがわかる。このバンドの位置は、レーン１の
分子量マーカーの495bpの一と同じであり、目的のバン
ド（長さ495bp）であると判断される。レーン２の下の
方に薄く見えるバンドは、プライマー等であり、限外濾
過で精製した後のレーン５では除かれていた。このよう
にして、本発明の反応容器を用いて微量PCRが可能であ
ることが示された。
ここでは、一つの反応容器の中に一つの反応液の水滴
がある状態でPCRを行う例について説明したが、実際に
は、一つの反応液の水滴の直径は数百μｍであるため、
10mm×10mmの反応容器の内部には、数十個の水滴を並べ
ることができる。水滴を多数並べることにより、同時に
多種類の反応を実行可能である。また、同じ種類の反応
を多数実行することにより、PCRの量子化によるターゲ
ット濃度の定量も可能となる。また、ここでは、単一の
ノズルから既に混合された反応液を噴射したが、別々の
試薬を別々のインクヘッドノズルから噴射して、蓋を閉
めていない反応容器中反応液敵同士を結合させて混合す
ることも可能である。
がある状態でPCRを行う例について説明したが、実際に
は、一つの反応液の水滴の直径は数百μｍであるため、
10mm×10mmの反応容器の内部には、数十個の水滴を並べ
ることができる。水滴を多数並べることにより、同時に
多種類の反応を実行可能である。また、同じ種類の反応
を多数実行することにより、PCRの量子化によるターゲ
ット濃度の定量も可能となる。また、ここでは、単一の
ノズルから既に混合された反応液を噴射したが、別々の
試薬を別々のインクヘッドノズルから噴射して、蓋を閉
めていない反応容器中反応液敵同士を結合させて混合す
ることも可能である。
インクジェットから試薬を噴射して混合するとき、噴
射した液が水滴に突入するときに液が飛び散る場合があ
る。このような場合、水滴の上部に油膜を形成してお
き、その油膜を通して試薬を油膜底部に固定されている
水滴中に打ち込んで混合するようにすると、油膜によっ
て噴射液が水滴に到達する前に速度が弱まる効果、及び
油膜の存在によって水滴から飛沫が飛び散りにくくなる
効果によって液の飛散が防止される。
射した液が水滴に突入するときに液が飛び散る場合があ
る。このような場合、水滴の上部に油膜を形成してお
き、その油膜を通して試薬を油膜底部に固定されている
水滴中に打ち込んで混合するようにすると、油膜によっ
て噴射液が水滴に到達する前に速度が弱まる効果、及び
油膜の存在によって水滴から飛沫が飛び散りにくくなる
効果によって液の飛散が防止される。
本実施の形態では、オイルにはシリコンオイルを使用
した。しかし、水滴のオイル中への溶出を防止するとい
うために、フッ素系オイルを使用してもよい。フッ素系
オイルとしては、例えば、フロリナート（住友スリーエ
ム製）、USL完全フッ素（井内盛栄堂製）があげられ
る。パラフィンオイル、シリコンオイルの水分含量が10
0ppm以上であるのに対し、フッ素系オイルでは、10ppm
程度なので、オイル中への水滴の溶出の大幅な低減が期
待できる。
した。しかし、水滴のオイル中への溶出を防止するとい
うために、フッ素系オイルを使用してもよい。フッ素系
オイルとしては、例えば、フロリナート（住友スリーエ
ム製）、USL完全フッ素（井内盛栄堂製）があげられ
る。パラフィンオイル、シリコンオイルの水分含量が10
0ppm以上であるのに対し、フッ素系オイルでは、10ppm
程度なので、オイル中への水滴の溶出の大幅な低減が期
待できる。
また、本実施の形態では、10nlの水滴を分注したあと
に、オイルを被せたが、オイルを容器表面に薄く塗った
後に、水滴を分注することもできる。特に、液量が微量
になったり、必要な試薬を分注する合計の時間が長くな
る場合（例えば多数のサンプルを、並列処理する場合）
は、後者のオイルを先に塗布する方法のほうが空気中へ
の蒸発による液量の変動を防止するために望ましい。
に、オイルを被せたが、オイルを容器表面に薄く塗った
後に、水滴を分注することもできる。特に、液量が微量
になったり、必要な試薬を分注する合計の時間が長くな
る場合（例えば多数のサンプルを、並列処理する場合）
は、後者のオイルを先に塗布する方法のほうが空気中へ
の蒸発による液量の変動を防止するために望ましい。
PCRの進行状況を光学的に検出する方法はタックマン
以外にも、それらを利用してもよい。例えば、蛍光エネ
ルギー移動を利用したアンプリセンサーシステム（フナ
コシ製）、エチジウムブロミド等のインターカレーを利
用した方法（特開平５−184397号公報）、蛍光偏光の変
化を利用した方法（特開平７−23800号公報）などを利
用することができる。光学的検出方法以外には、MALDI
質量分析の利用も考えられる。反応終了後、反応容器の
一方の蓋をはがし、MALDI用マトリックス試薬の追加な
ど、必要な前処理を行って多数の微量なPCR産物の分子
量を正確に測定し、点変異や、トリプレットリピートな
どの繰り返し数を正確に検出することも可能である。
以外にも、それらを利用してもよい。例えば、蛍光エネ
ルギー移動を利用したアンプリセンサーシステム（フナ
コシ製）、エチジウムブロミド等のインターカレーを利
用した方法（特開平５−184397号公報）、蛍光偏光の変
化を利用した方法（特開平７−23800号公報）などを利
用することができる。光学的検出方法以外には、MALDI
質量分析の利用も考えられる。反応終了後、反応容器の
一方の蓋をはがし、MALDI用マトリックス試薬の追加な
ど、必要な前処理を行って多数の微量なPCR産物の分子
量を正確に測定し、点変異や、トリプレットリピートな
どの繰り返し数を正確に検出することも可能である。
産業上の利用可能性 本発明によると、極微量の溶液を蒸発させることなく
長時間安定に保持することができ、インクジェット法な
どによって吐出された極微量の溶液による化学反応が可
能となる。
長時間安定に保持することができ、インクジェット法な
どによって吐出された極微量の溶液による化学反応が可
能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−208836（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−3231（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−105708（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−257709（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−245771（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−233710（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−323192（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 1/00 101 G01N 33/48 B01J 19/00 C12M 1/00 C12Q 1/68
Claims (12)
- 【請求項１】基板上に微小液滴を保持する方法であっ
て、前記微小液滴を前記基板表面に被覆された前記微小
液滴と２相に分離する液体層中で前記基板表面に接触さ
せて保持することを特徴とする微小液滴の保持方法。 - 【請求項２】前記微小液滴は水性であり、前記基板表面
に被覆された液体層は油性であることを特徴とする請求
項１記載の微小液滴の保持方法。 - 【請求項３】前記微小液滴を、前記基板表面に被覆され
た液体層の表面から打ち込むことを特徴とする請求項１
又は２記載の微小液滴の保持方法。 - 【請求項４】前記基板表面は撥水性を有することを特徴
とする請求項１、２又は３記載の微小液滴の保持方法。 - 【請求項５】前記液体層表面をカバーで覆うことを特徴
とする請求項１〜４のいずれか１項記載の微小液滴の保
持方法。 - 【請求項６】前記微小液滴の近くの前記液体層中に他の
水性液体を保持することを特徴とする請求項５記載の微
小液滴の保持方法。 - 【請求項７】前記微小液滴は前記カバーにも接触してい
ることを特徴とする請求項５又は６記載の微小液滴の保
持方法。 - 【請求項８】微小液滴を基板表面に被覆された前記微小
液滴と２相に分離する液体層中で前記基板表面に接触さ
せて保持するとともに前記液体層表面をカバーで覆い、
前記微小液滴中で反応を行わせることを特徴とする反応
方法。 - 【請求項９】前記微小液滴はDNAを含む水性液滴であ
り、前記基板表面に被覆された液体層は油性であること
を特徴とする請求項８記載の反応方法。 - 【請求項１０】前記微小液滴の接触部位は酵素吸着防止
剤を有することを特徴とする請求項９記載の微小液滴の
反応方法。 - 【請求項１１】前記微小液滴の接触部位はウシ血清アル
ブミンコートを有することを特徴とする請求項９記載の
微小液滴の反応方法。 - 【請求項１２】前記基板表面に被覆された液体層は、厚
さが100μｍ以下であることを特徴とする請求項８又は
９記載の反応方法。
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| JP17785797 | 1997-06-19 | ||
| JP9-177857 | 1997-06-19 | ||
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Family
ID=16038311
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| Country | Link |
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| JP (1) | JP3120453B2 (ja) |
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