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JP2013523106A - 癌を治療するためのヒト化抗ｃｘｃｒ４抗体 - Google Patents

癌を治療するためのヒト化抗ｃｘｃｒ４抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＸＣＲ４に結合できるだけでなくＣＸＣＲ４ホモ二量体および／またはヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導することもできる、新規な単離されたヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。より具体的には、本発明は、ＣＸＣＲ４タンパク質に特異的なｈｚ５１５Ｈ７抗体およびがんを治療するためのその使用に関する。そのような抗体で構成される医薬組成物およびそのような抗体を選択する方法も含まれる。

Description

本発明は、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ）に特異的に結合できる新規な抗体、特にヒト化モノクローナル抗体ならびにそのような抗体をコードするアミノ酸配列および核酸配列に関する。一態様から、本発明は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合でき且つ強力な抗腫瘍活性を有する新規な抗体、誘導化合物または機能的断片に関する。また、本発明は、がんの予防的および／または治療的治療のための薬物としてのならびにがんの診断に関連する方法またはキットにおける、そのような抗体の使用を含んでなる。最後に、本発明は、抗体、細胞毒性薬剤／細胞分裂阻害性の毒素等のその他の抗がん化合物と組み合わせたそのような抗体を含んでなる組成物ならびに特定のがんの予防および／または治療のためのその使用を含んでなる。
ケモカインは、特に免疫応答中のケモカイン勾配として知られるリガンドの化学的勾配に沿った白血球の遊走を制御する小さな分泌型ペプチドである（Zlotnick A. et al., 2000）。これらは、ＮＨ２末端システイン残基の位置に基づいて２つの主要なサブファミリー、ＣＣおよびＣＸＣに分類され、その２つの主要なサブファミリーがＣＣＲおよびＣＸＣＲと命名されているＧタンパク質共役受容体に結合する。５０種類を超えるヒトケモカインおよび１８種類のケモカイン受容体がこれまでに発見されている。
多くのがんが、腫瘍の免疫細胞浸潤ならびに腫瘍細胞の成長、生存、遊走、および血管形成に影響を与える複雑なケモカインネットワークを有する。免疫細胞、内皮細胞および腫瘍細胞は、それら自体がケモカイン受容体を発現し、ケモカイン勾配に応答することができる。ヒトがん生検サンプルおよびマウスがんモデルの研究により、がん細胞のケモカイン受容体発現が転移能の上昇に関連することが示されている。様々な種類のがんに由来する悪性細胞が様々なケモカイン受容体発現プロファイルを示すが、ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が最も多く見られる。上皮、間葉および造血起源の少なくとも２３種類の異なる種類のヒトがん細胞がＣＸＣＲ４受容体を発現する（Balkwill F. et al., 2004）。
ケモカイン受容体４（フーシン、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲまたはＨＵＭＳＴＲとしても知られる）は３５２または３６０アミノ酸を含んでなる２種類のアイソフォームとして存在する。残基Ａｓｎ１１がグリコシル化されており、残基Ｔｙｒ２１が硫酸基の付加によって修飾されており、Ｃｙｓ１０９および１８６が受容体の細胞外部分でジスルフィドブリッジにより結合している（Juarez J. et al., 2004）。
この受容体は、様々な種類の正常組織、ナイーブ非記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、内皮細胞、一次単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞によって、ならびに心臓、結腸、肝臓、腎臓および脳において低レベルで発現される。ＣＸＣＲ４は、白血球の輸送、Ｂ細胞リンパ球新生および骨髄造血において重要な役割を果たしている。
ＣＸＣＲ４受容体は、結腸癌（Ottaiano A. et al., 2004）、乳癌（Kato M. et al., 2003）、前立腺癌（Sun Y.X. et al., 2003）、肺癌［小細胞癌および非小細胞癌（Phillips R.J. et al., 2003）］、卵巣癌（Scotton C.J. et al., 2002）、膵臓癌（Koshiba T. et al., 2000）、腎臓癌、脳癌（Barbero S et al., 2002）、膠芽腫、リンパ腫等これらに限定されない多くのがんで過剰発現される。
これまでに報告されているＣＸＣＲ４受容体のユニークなリガンドはストロマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２である。ＳＤＦ−１は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺において多量に、また腎臓、脳および皮膚でそれより少量分泌される。ＣＸＣＲ４は、拮抗するケモカインであるヒトヘルペスウイルスＩＩＩ型にコードされるウイルスマクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ（ｖＭＩＰ−ＩＩ）によっても認識される。
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、がんにおいて重要な役割を果たしており、転移につながる遊走、侵入に直接関与している。実際に、がん細胞はＣＸＣＲ４受容体を発現し、遊走して全身循環に入る。その後、がん細胞は、高レベルのＳＤＦ−１を産生する臓器の血管床に止まり、そこで増殖し、血管形成を誘導し、転移性腫瘍を形成する（Murphy PM., 2001）。この軸は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路（Barbero S. et al., 2003）および血管形成（Romagnai P., 2004）の活性化を介した細胞増殖にも関与する。実際、ＣＸＣＲ４受容体およびそのリガンドＳＤＦ−１は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を刺激することによって血管形成を明らかに促進し、それによりＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の発現が増加する（Bachelder R.E. et al., 2002）。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が、腫瘍の低酸素領域に蓄積され、刺激されて、腫瘍細胞と協同して血管形成を促進することも知られている。低酸素症がＴＡＭを初めとする種々の種類の細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を選択的にアップレギュレートすることが観察されている（Mantovani A. et al., 2004）。最近、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸がＣＸＣＲ４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の輸送／ホーミングを制御し、血管新生において何らかの役割を果たし得ることが示された。ＨＳＣに加え、機能的ＣＸＣＲ４は他の組織由来の幹細胞（組織コミット幹細胞＝ＴＣＳＣ）上でも発現するので、ＳＤＦ−１は臓器／組織再生に必要なＣＸＣＲ４＋ ＴＣＳＣの化学誘引において重要な役割を果たし得るが、これらのＴＣＳＣはがん発生の細胞的起源でもあり得ること（がん幹細胞理論）が示されている。幹細胞起源のがんは、ヒト白血病および最近になって脳腫瘍や乳がん等の複数の固形腫瘍で示されている。白血病、脳腫瘍、小細胞肺癌、乳癌、肝芽腫、卵巣癌、子宮頸癌等の正常なＣＸＣＲ４＋組織／臓器特異的幹細胞に由来し得るＣＸＣＲ４＋腫瘍が数例ある（Kucia M. et al., 2005）。
ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体を用いてＣＸＣＲ４受容体に干渉することによるインビボでのがん転移ターゲティングが示されている（Muller A. et al., 2001）。簡潔に述べると、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ １７３、Ｒ＆Ｄシステムズ社）が、ＳＣＩＤマウスの同所性乳癌モデル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）においてリンパ節転移の数を有意に減少させることが示された。別の研究（Phillips R.J et al., 2003）でも、ＳＤＦ−１に対するポリクローナル抗体を用いて、同所性肺癌モデル（Ａ５４９）の転移におけるＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の重大な役割が示されたが、この研究では腫瘍の成長にも血管形成にも影響がなかった。他の複数の研究で、ＣＸＣＲ４の２本鎖ｓｉＲＮＡ（Liang Z. et al., 2005）、生体内で安定なＣＸＣＲ４ペプチドアンタゴニスト（Tamamura H. et al., 2003）を用いたインビボでの転移阻害またはＡＭＤ ３１００（Rubin J.B. et al., 2003およびDe Falco V. et al., 2007）もしくはＭａｂ（国際公開第２００４／０５９２８５（Ａ２）号パンフレット）のようなＣＸＣＲ４の小分子アンタゴニストを用いたインビボでの腫瘍成長の阻害も示されている。したがって、ＣＸＣＲ４はがんについての検証済みの治療標的である。
もう１つのケモカイン受容体であるケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）も腫瘍学における興味深い標的であることが報告されている。実際、ＣＸＣＲ２は、複数の種類の腫瘍細胞で自己分泌細胞成長シグナルを伝達し、血管形成を促進することにより間接的に腫瘍増殖に影響を与えることもできる（Tanaka T. et al. 2005）。
ＣＸＣＲ２ケモカイン受容体は３６０個のアミノ酸を含む。これは、主に内皮細胞中で、特に血管新生中に、発現される。複数のケモカインがＣＸＣＲ２受容体に結合する：ＥＲＬ＋血管形成促進ケモカインに属するＣＸＣＬ５、−６、−７、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、−βおよび−γ。ＣＸＣＲ２受容体はＣＸＣＲ４受容体と配列相同性を有し、配列同一性が３７％、配列相同性が４８％である。ＣＸＣＲ２／リガンド軸は、転移（Singh RK. et al., 1994）、細胞増殖（Owen J.D. et al., 1997）等の複数の腫瘍成長機構およびＥＲＬ＋ケモカイン仲介血管形成（Strieter R.M. et al., 2004およびRomagnani et al., 2004）に関与する。最後に、腫瘍関連マクロファージおよび好中球が炎症誘導腫瘍成長の重要な要素であり、ＣＸＣＬ５、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α等のケモカインは好中球のリクルートを開始させる。
二量体化が、Ｇタンパク質共役受容体、とりわけケモカイン受容体、の機能を制御する共通の機構であることが明らかになってきた（Wang J. and Norcross Ｍ., 2008）。複数のケモカイン受容体によるシグナル伝達の開始および変化に、ケモカインの結合に応答したホモ二量体化およびヘテロ二量体化が必要であることが示されている。受容体の二量体またはオリゴマーがおそらくケモカイン受容体の基本的機能単位であるという概念を裏付ける証拠が集まってきている。ケモカイン受容体二量体はリガンド非存在下で見られ、ケモカインは受容体二量体のコンホメーション変化を誘導する。ＣＸＣＲ４は、ホモ二量体を形成するが、例えばδオピオイド受容体（ＤＯＲ）（Hereld D., 2008）またはＣＣＲ２（Percherancier Y. et al., 2005）とヘテロ二量体も形成することが知られている。後者の例では、ＣＸＣＲ４の膜貫通ドメインに由来するペプチドが、リガンドに誘導される二量体コンホメーション遷移をブロックすることによって活性化を阻害した（Percherancier Y. et al., 2005）。別の研究では、ＣＸＣＲ４の膜貫通領域の合成ペプチドであるＣＸＣＲ４−ＴＭ４ペプチドが、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のプロトマー間でのエネルギー移動を減少させ、悪性細胞においてＳＤＦ−１によって誘導される遊走およびアクチン重合化を阻害することが示された（Wang J. et al., 2006）。より最近になって、ＣＸＣＲ７がＣＸＣＲ４と機能的ヘテロ二量体を形成し、ＳＤＦ−１によって誘導されるシグナル伝達を促進することも示された（Sierro F. et al., 2007）。他の構成的ヘテロ二量体の例として、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の相互作用およびそれぞれのホモ二量体形成を示す研究がある。これらのいずれにおいても別のＧＰＣＲ（α（１Ａ）−アドレナリン受容体）との相互作用は示されておらず、このことは、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の相互作用の特異性を示している（Wilson S. et al., 2005）。
既に述べたように、ＣＸＣＲ４受容体およびＣＸＣＲ２受容体は興味深い腫瘍標的である。これらの受容体に干渉することで、腫瘍細胞増殖、血管形成、腫瘍細胞の遊走および侵入、腫瘍による好中球およびマクロファージのリクルートが減少することによりならびにＣＸＣＲ４がん幹細胞が阻害されることにより、非常に効率的に腫瘍の成長および転移が阻害されるはずである。
本発明の発明態様の１つは、ＣＸＣＲ４二量体のコンホメーション変化を誘導するヒト化モノクローナル抗体の作製である。本発明は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の両方に結合でき且つそのコンホメーション変化を誘導でき、強力な抗腫瘍活性を有する、ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７（またはその断片）を包含する。Ｈｚ５１５Ｈ７は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体だけでなくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のコンホメーション変化も誘導する。この新たな特性は、がんにおけるこれら２つのケモカイン受容体の重要な役割を考慮すれば、がん治療用途において興味深いものである。
受容体のホモおよびヘテロ二量体の両方のターゲティングがＭａｂの治療効果を増大させることが既に見出されている。実際、例えば、ＩＧＦ−１Ｒおよびインスリン／ＩＧＦ−１ハイブリッド受容体の両方をターゲティングするＭａｂ（ｈ７Ｃ１０）は、ＩＧＦ−１ＲのみをターゲティングするＭａｂよりも強力にインビボで腫瘍成長を阻害することが示されている（Pandini G., 2007）。
更に、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７は、ＣＸＣＲ４のサイレントアンタゴニストであり、インビトロアッセイにおいて基本的シグナルは変化させないが、種々のアッセイにおいてＳＤＦ−１によって誘導されるシグナル伝達（ＧＴＰγＳ結合、Ｃａ２＋放出）を阻害し、また、インビトロでＳＤＦ−１によって誘導される腫瘍細胞遊走を阻害することができる。
部分的アゴニストまたはインバースアゴニストのいずれかとして作用する分子は、リガンド非存在下で固有の活性を示す。これらの種類の分子はリガンドの非存在下でもそれぞれ高親和性または低親和性ＧＰＣＲ状態を安定化し、それによって下流のシグナル伝達カスケードを活性化または阻害する（Galandin et al., 2007；Kenakin、2004）。
ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂの場合、これは、サイレントアンタゴニストとして振る舞い、ＳＤＦ−１非存在下ではＣＸＣＲ４受容体において固有活性を有さない。オピオイド受容体リガンドで既に観察されているように、この薬理学的特徴は、部分的アゴニストまたはインバースアゴニストと比べて少ない副作用に関連付けられると考えられる（Bosier and Hermans, 2007)。実際、ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂの機能的活性はＳＤＦ−１の存在に完全に依存し、ＳＤＦ−１リガンドの発現、分泌または血流による供給がない組織および臓器ではＣＸＣＲ４受容体活性の調節は観察されない。したがって、ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂは、正または負の効果を有する他のＣＸＣＲ４受容体リガンドよりも毒性が低いと思われる。更に、サイレントアンタゴニストは、薬理学分野で少数である（Wurch et al., 1999、Kenakin, 2004）。
驚くべきことに、本発明者らは初めて、ＣＸＣＲ４に結合でき且つＣＸＣＲ４ホモ二量体および／またはヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導できるヒト化抗体の作製に成功した。より具体的には、本発明のヒト化抗体は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンホメーション変化だけでなくＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のコンホメーション変化も誘導することができる。
以下の説明において、表現「ＣＸＣＲ４二量体」は、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体を包含するものと理解されなければならない。
このようなヒト化抗体は先行技術中で報告されたことがないことをこの段階で述べておかなければならない。更に、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の存在が報告されたこともない。
本発明の一部は、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２によって形成されるヘテロ二量体の存在の発見である。
したがって、特定の態様によれば、本発明は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体を含んでなるまたはからなる単離された複合体を開示する。
前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４化合物部分は、以下からなる群から選択される２種類のヒトＣＸＣＲ４アイソフォームのいずれかである：
−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３４５８（配列番号１）に記載の配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４アイソフォームｂ［ホモサピエンス］；
−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００８５４０（配列番号２）に記載の配列を有するケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４アイソフォームａ［ホモサピエンス］；
−配列番号１または２を有するこれらのｂまたはａアイソフォームのいずれかと少なくとも９５％の同一性を有する、その選択的転写スプライスバリアントまたは天然バリアント；および
−その天然リガンドであるストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）によって特異的に認識でき、好ましくは少なくとも１００、１５０および２００アミノ酸の長さを有する、その断片。
前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２化合物部分は、以下からなる群から選択される：
−ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１５４８（配列番号３）に記載の配列を有するインターロイキン８受容体ベータ［ホモサピエンス］；
−配列番号３を有するこのインターロイキン８受容体ベータと少なくとも９５％の同一性を有する、その選択的転写スプライスバリアントまたは天然バリアント；および
−ＩＬ−８によって特異的に認識でき、好ましくは少なくとも１００、１５０および２００アミノ酸の長さを有する、その断片。
この特定の態様によれば、本発明は更に、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を含んでなるポリペプチドをコードする単離されたＲＮＡまたはＤＮＡを開示する。
本発明は更に、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードする核酸コンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターを開示する。
本発明は更に、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４部分をコードする少なくとも１つの核酸コンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターと前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２部分をコードする第２のコンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターとを含んでなる組成物を含んでなる。
この態様によれば、本発明は更に、前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を発現する組換え宿主細胞を作製する方法であって、
ａ）前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードする核酸コンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターで、または
ｂ）前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ４部分をコードする少なくとも１つの核酸コンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターおよび前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体のＣＸＣＲ２部分をコードする第２のコンストラクト、好ましくはプラスミド等の発現ベクターで、前記宿主細胞を形質転換することを含んでなる、方法を開示する。
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞等の真核細胞である。
前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体をコードする核酸コンストラクトは、ＣＸＣＲ４配列に（特に共有結合により）結合しているｌｕｃマーカー等の第１のマーカーおよびＣＸＣＲ２配列に（特に共有結合により）結合しているＧＦＰマーカー（すなわちＢＲＥＴ分析のため）等の第２のマーカーもコードする。
本発明は更に、抗がん活性を有する化合物またはがんを治療するための組成物の製造に使用可能な化合物を選択する方法であって、
ａ）前記ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体を発現する本発明の組換え宿主細胞を被験化合物と接触させ、かつ
ｂ）この化合物が組換え宿主細胞中においてこのＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体の活性を調節、好ましくは阻害できるかどうかを決定すること
を含んでなることを特徴とする、方法を開示する。
図１Ａおよび図１Ｂは、それぞれ、がん細胞におけるＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の発現をｑＰＣＲ分析により示す図である。 ＦＡＣＳ分析による、がん細胞におけるＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２タンパク質の発現を示す図である。 図３Ａおよび図３Ｂは、野生型ヒトＣＸＣＲ４を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜上における非標識ＳＤＦ−１（図３Ａ）および５１５Ｈ７ Ｍａｂ（図３Ｂ）による特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ１結合との競合を示す図である（Ｔ：全結合；ＮＳ：非特異的結合）。 ＮＩＨ−３Ｔ３細胞中で安定的に発現されている野生型ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、５１５Ｈ７ ＭａｂによるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 ＳＤＦ−１（１０および１００ｎＭ）で刺激されたＨｅＬａヒト腫瘍細胞での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 図６Ａ〜図６Ｃは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を用いた、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＤＦ−１および５１５Ｈ７ Ｍａｂによる、ＣＸＣＲ４受容体と種々の相互作用パートナーとの結合の調節を示す図である（図６Ａ：ＣＸＣＲ４：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化、図６Ｂ：ＣＸＣＲ２：ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体化、図６Ｃ：ＣＸＣＲ４により仲介されるβアレスチンのリクルート）。 図７Ａおよび図７Ｂは、ＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞において、ＳＤＦ−１および５１５Ｈ７ Ｍａｂによる、フォルスコリンによって刺激されるｃＡＭＰ産生の阻害を示す図である。 ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で安定的に発現される構成的活性変異体Ａｓｎ１１９Ｓｅｒ ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応のモニタリングによる、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるインビトロでのＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示す図である。 Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウスにおいて、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍成長の阻害を示す図である。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４細胞（図１１Ａ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１１Ｂ）、Ｕ９３７（図１１Ｃ）がん細胞における抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるＳＤＦ−１誘導カルシウム放出の阻害を示す図である。 Ｕ９３７ Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス生存モデルにおけるマウス抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｍ５１５Ｈ７の活性を示す図である。 Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおいてＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ ２９９異種移植腫瘍成長の阻害におけるマウス抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｍ５１５Ｈ７の活性を示す図である。 野生型ヒトＣＸＣＲ４を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜上におけるマウスｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびキメラｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂによる特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ１結合との競合を示す図である（Ｔ：全結合；ＮＳ：非特異的結合）。 ＳＤＦ−１（１０ｎＭ）で刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞中で安定的に発現される野生型ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、マウスｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびキメラｃ５１５Ｈ７ ＭａｂによるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 ＳＤＦ−１（１０ｎＭ）で刺激されたＨｅＬａヒト腫瘍細胞での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、抗ＣＸＣＲ４ マウスｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびキメラｃ５１５Ｈ７ ＭａｂによるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 図１７Ａ〜図１７Ｃは、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を用いた、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＤＦ−１ならびにｍ５１５Ｈ７およびＣ５１５Ｈ７ Ｍａｂによる、ＣＸＣＲ４受容体と種々の相互作用パートナーとの会合の調節を示す図である（図１７Ａ：ＣＸＣＲ４：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化、図１７Ｂ：ＣＸＣＲ２：ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体化、図１７Ｃ：ＣＸＣＲ４により仲介されるβアレスチンのリクルート）。 図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＣＨＯ−ＣＸＣＲ４細胞（図１８Ａ）およびＵ９３７細胞（図１８Ｂ）中におけるＳＤＦ−１誘導カルシウム放出の阻害を示す図である。 抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７による、インビトロでのＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示す図である。 Ｕ９３７ Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄマウス生存モデルにおける抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７の活性を示す図である。 ５１５Ｈ７重鎖可変ドメインとヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−４９＊０４およびＩＧＨＪ４＊０１とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。５１５Ｈ７ ＶＨアミノ酸配列が、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインメントされている。ＶＨ１およびＶＨ２（ＶＨ３は示さず）配列は、５１５Ｈ７ ＶＨドメインの実施されたヒト化バリアントに対応し、逆変異された残基が太字で示されている。バリアント１ ＶＨ１は逆変異残基を有さず、完全なヒトバリアントを表す。バリアントＶＨ２は８個の逆変異を有し、最もマウスに近いバリアントである。バリアントＶＨ３は５個の逆変異を有する（示さず）。 ５１５Ｈ７軽鎖とヒト生殖系列ＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１とのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。５１５Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列が、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインメントされている。ＶＬ１〜ＶＬ３の配列は、５１５Ｈ７ ＶＬドメインの実施されたヒト化バリアントに対応し、逆変位された残基が太字で示されている。バリアントＶＬ１は逆変位残基を有さず、最もヒトに近いバリアントを表す。バリアントＶＬ２は１３個の逆変位を有し、最もマウスに近いバリアントである。バリアントＶＬ３は５個の逆変位を有する。 図２３Ａ〜２３Ｆは、ヒト化５１５Ｈ７の種々のバリアントおよびキメラ５１５Ｈ７による、ビオチン化マウス抗体５１５Ｈ７の交差ブロックを示す図である。５１５Ｈ７のヒト化バリアント（ｈｚ５１５Ｈ７）が元のマウス抗体５１５Ｈ７を交差ブロックする活性を、ＣＸＣＲ４でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いたフローサイトメトリーで評価した。ヒト化バリアントの活性をキメラ５１５Ｈ７と比較した。キメラＶＬ（ｃＶＬ）と組み合わせたＶＨの３つの異なるバリアント（ＶＨ１〜ＶＨ３）の交差ブロック活性は非常に類似していた（図２３Ａ〜図２３Ｃ）。ＶＬのバリアント１および２と組み合わされた時、ＶＨバリアント１（ＶＨ１、逆変位のないバリアント）では活性が低下しなかった。コンストラクトｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ３では活性の有意な低下が検出された。 ヒト化抗体５１５Ｈ７バリアントＶＨ１ ＶＬ１の活性を調べるためのＢＲＥＴアッセイを示す図である。ヒト化バリアント５１５Ｈ７ ＶＨバリアント１ ＶＬバリアント１（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１）の活性を、ＳＤＦ−１仲介シグナル伝達を阻害する能力により評価した。このバリアントは、ＢＲＥＴによる測定で、ＳＤＦ−１仲介シグナル伝達の軽度な阻害しか示さなかった。ＳＤＦ−１は濃度１００ｎＭで用いた。 図２５Ａ〜図２５Ｄは、１個または２個の逆変異を有するＶＨ１の種々の変異体および種々のＶＬバリアントとｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎとの組合せの比較を示す図である。１個および２個の逆変異をＶＨ１中に入れ、ＶＬ１と組み合わせた。これらのコンストラクトをＢＲＥＴアッセイで評価した（図２５Ａ〜２５Ｃ）。これらの逆変異が１個の変異体のうち、逆変異Ｄ７６Ｎを有するコンストラクトだけが、ＳＤＦ−１仲介シグナル伝達の阻害増加を示した。ＶＨの逆変異２個の変異体はいずれも強力な阻害活性を有さなかった（図２５Ｃ）。ＶＨ１の逆変異１個の変異体Ｄ７６ＮをＶＬの種々のバリアントと組み合わせた。ＳＤＦ−１濃度は１００ｎＭとした。 コンストラクトＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２と比較した、１個または２個の逆変異を有するＶＨ１およびＶＬ１の種々の変異体の順位を示す図である。ＶＨ１中に１個または２個の逆変異を作製し、ＶＬ１と組み合わせた。全コンストラクトをＢＲＥＴアッセイで評価し、阻害率を計算した。ＳＤＦ−１濃度は１００ｎＭとした。 図２７Ａ〜図２７Ｂは、ヒト化５１５Ｈ７の種々のコンストラクトによるＳＤＦ−１結合の阻害ならびにＦＡＣＳおよびＢＲＥＴで得られた結果間の相関を示す図である。βアレスチンのリクルートをブロックする活性が強いヒト化抗体５１５Ｈ７の種々のバリアントを、ビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害する能力についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で調べた（Ａ）。それらをＶＨ１およびＶＬ１と比較した。ＦＡＣＳを用いたアッセイから得られた結果はＢＲＥＴで得られた結果と相関がある（Ｂ）。 ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２ならびに更なるヒト化バージョン５１５Ｈ７ ＶＬ２．１、５１５Ｈ７ ＶＬ２．２および５１５Ｈ７ ＶＬ２．３のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。５１５Ｈ７ ＶＬアミノ酸配列が、選択されたヒトアクセプターフレームワーク配列とアラインメントされている。ＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３配列は、ヒト化５１５Ｈ７ ＶＬ２の実施されたヒト化バリアントに相当し、逆変異された残基が太字で示されている。ＶＬ２．１およびＶＬ２．２は更に４個のヒト化残基を有し、ＶＬ２．３は更に５個のヒト残基を含む。 図２９Ａ〜２９Ｃは、ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４（図２９Ａ）、Ｕ９３７（図２９Ｂ）およびＲａｍｏｓ細胞（図２９Ｃ）上での、５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３）のＣＸＣＲ４への特異的結合を示す図である。 図３０Ａ〜３０Ｄは、ＳＤＦ−１（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）で刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定的に発現される野生型ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２［図３０Ａ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１［図３０Ｂ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２［図３０Ｃ］およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３［図３０Ｄ］）によるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 図３０Ａ〜図３０Ｄは、ＳＤＦ−１（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）で刺激されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定的に発現される野生型ＣＸＣＲ４受容体での［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合反応をモニタリングすることによる、ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２［図３０Ａ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１［図３０Ｂ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２［図３０Ｃ］およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３［図３０Ｄ］）によるＧタンパク質活性化の調節を示す図である。 図３２Ａ〜図３２は、ＣＨＥＫ２９３細胞における生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法を用いた、ＳＤＦ−１およびヒト化５１５Ｈ７ Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３）による、ＣＸＣＲ４受容体と種々の相互作用パートナーとの会合の調節を示す図である。（図３２Ａ：ＣＸＣＲ４：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化、図３２Ｂ：ＣＸＣＲ２：ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体化、図３２Ｃ：ＣＸＣＲ４により仲介されるβアレスチンのリクルート） 図３３Ａ〜図３３Ｄは、Ｇｌｙｏｆｉｘｘ固定したＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍を示す図である。ａ）およびｃ）５１５Ｈ７を用いたＩＨＣ染色、ｂ）およびｄ）ｍＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色、。 図３４Ａ〜図３４Ｄは、ホルムアルデヒド固定したＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍を示す図である。ａ）およびｃ）５１５Ｈ７を用いたＩＨＣ染色、ｂ）およびｄ）ｍＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色。 図３５Ａ〜図３５Ｄは、野生型ヒトＣＸＣＲ４を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞膜上におけるヒト化ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂ（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２［図３５Ａ＆Ｂ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１［図３５Ａ＆３５Ｃ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２［図３５Ａ＆３５Ｄ］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３［図３５Ａ］）による特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ１結合との競合を示す図である（Ｔ：全結合；ＮＳ：非特異的結合）。 ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ ＭａｂによるＵ９３７細胞におけるＳＤＦ−１誘導カルシウム放出の阻害を示す図である。 図３７Ａ〜図３７Ｂは、ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２によるインビトロでのＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示す図である。 Ｇｌｙｏｆｉｘｘ固定したＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍を示す図である。ａ）およびｃ）ビオチン化ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２を用いたＩＨＣ染色、ｂ）およびｄ）ビオチン化ｈＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色。 ホルムアルデヒド固定したＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍を示す図である。ａ）およびｃ）ビオチン化ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２を用いたＩＨＣ染色、ｂ）およびｄ）ビオチン化ｈＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色。 ＳｃｉｄマウスにおけるＢ細胞Ｒａｍｏｓ異種移植腫瘍成長に対するキメラ５１５Ｈ７（ｃ５１５Ｈ７）Ｍａｂの影響を示す図である。 ＳｃｉｄマウスにおけるＢ細胞Ｒａｍｏｓ異種移植腫瘍成長に対するｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂバージョンの影響を示す図である。 ＳｃｉｄマウスにおけるＢ細胞Ｒａｍｏｓ異種移植腫瘍成長に対するｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１ Ｍａｂバージョンの影響を示す図である。
第１の態様によれば、本発明の主題は、本発明に係るヒト化抗体の作製および選択プロセスである。
第１の態様によれば、本発明は、リガンド依存性およびリガンド非依存性のＣＸＣＲ４活性化の両方を阻害できる抗ＣＸＣＲ４ヒト化抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、の選択プロセスであって、以下の工程を含んでなるプロセスに関する：
ｉ）作製されたヒト化抗体をスクリーニングし、ＣＸＣＲ４に特異的に結合でき且つＣＸＣＲ４活性化を調節できる抗体を選択する工程；
ｉｉ）工程ｉ）の選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンホメーション変化を誘導できる抗体を選択する工程；およびその後
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の選択された抗体を試験し、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体のコンホメーション変化を誘導できる抗体を選択する工程。
「調節する」という表現は、増加または阻害と理解されなければならない。好ましくは、本発明の選択された抗体は、ＣＸＣＲ４活性化を阻害しなければならない。
上記で説明したように、ＣＸＣＲ４二量体コンホメーション変化の誘導は、そのような抗体がより大きな患者集団に実質的利益を提供するので、本発明の主要な態様である。
抗体の作製は、例えば骨髄腫細胞と選択された骨髄腫細胞に適合する免疫化したマウスまたは他の種の脾臓細胞との融合物によって分泌されたマウス抗体のシークエンシングされたＣＤＲからデザインされた組換えヒト化抗体から、当業者に公知の任意の方法により実現することができる（Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）。免疫化した動物としては、ヒト免疫グロブリン座を有して直接ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスが含まれ得る。別の可能な実施形態は、ファージディスプレイ技術を用いてライブラリーをスクリーニングすることにある。
スクリーニング工程ｉ）は、当業者に公知の任意の方法またはプロセスによって実現することができる。非限定的な例として、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ、免疫組織化学、ＦＡＣＳ分析および機能的スクリーニングを挙げることができる。好ましいプロセスは、ＣＸＣＲ４形質転換体に対しておよび産生された抗体が腫瘍細胞上の天然受容体も認識できることを確認するために少なくとも１つの腫瘍細胞系に対してＦＡＣＳ分析によりスクリーニングすることにある。このプロセスは以下の実施例でより正確に説明する。
「ＣＸＣＲ４活性化を調節する」という表現は、後述するマウス抗体についての実施例４、５、７および１１、キメラ抗体についての実施例１６、１７および１９、ならびにヒト化抗体についての実施例２７、２４および２８に記載されている活性の少なくとも１つを調節することが意図され、
好ましくは、
−特にヒト野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋｌ膜等の形質転換真核細胞膜上での競合による、細胞膜の受容体ＣＸＣＲ４上でのリガンドＳＤＦ−１の特異的結合（実施例４、１６、２７参照）；
−特に野生型ＣＸＣＲ４受容体膜を安定且つ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞等の形質転換真核細胞膜上での、細胞膜の受容体ＣＸＣＲ４上でのＧＴＰγＳの特異的結合（実施例５、１７、２４参照）；
−ＣＸＣＲ４により仲介されるｃＡＭＰ産生の阻害（実施例７参照）；および
−ＣＸＣＲ４受容体により仲介される細胞内カルシウムストアの動員（実施例１１、１９、２８参照）
を調節することが意図される。
より好ましくは、これらの活性の少なくとも１つのこの調節は活性の阻害である。
本発明のプロセスの選択工程ｉｉ）およびｉｉｉ）の好ましい実施形態では、前記工程ｉｉ）およびｉｉｉ）は、それぞれＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰおよびＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ／ＣＸＣＲ２−ＹＦＰを発現する細胞のＢＲＥＴ分析によって抗体を評価することならびにＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％、好ましくは４５％、５０％、５５％、最も好ましくは６０％を阻害できる抗体を選択することにある。
ＢＲＥＴ法は、タンパク質二量体化を示すことが知られている技術である［Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89］。
本プロセスの工程ｉｉ）およびｉｉｉ）で使用されるＢＲＥＴ法は当業者に周知であり、以下の実施例で詳細に説明する。より具体的には、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）は、生物発光ドナー（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））と蛍光アクセプターであるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）またはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）の変異体との間で起こる非放射性のエネルギー移動である。本発明では、ＥＹＦＰ（高感度黄色蛍光タンパク質）を用いた。移動効果はドナーとアクセプターの配向および距離に依存する。そして、２つの分子が接近（１〜１０ｎｍ）している場合にのみ、エネルギー移動が起こり得る。この特性を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイを作製する。実際に、２つのパートナー間の相互作用を調べるために、第１のパートナーをウミシイタケルシフェラーゼに、第２のパートナーをＧＦＰの黄色変異体に遺伝的に融合させる。融合タンパク質は、必ずではないが一般的に、哺乳動物細胞中で発現させる。Ｒｌｕｃはその膜透過性基質（セレンテラジン）の存在下で青色光を発する。ＧＦＰ変異体がＲｌｕｃから１０ｎｍよりも近い場合、エネルギー移動が起こり得、追加の黄色シグナルを検出することができる。ＢＲＥＴシグナルは、アクセプターによって発せられた光とドナーによって発せられた光の比として測定される。したがって、２つの融合タンパク質が接近するか、コンホメーション変化によってＲｌｕｃとＧＦＰ変異体が近づくと、ＢＲＥＴシグナルが増加する。
好ましい実施形態にＢＲＥＴ分析がある場合、当業者に公知の任意の方法を用いて、ＣＸＣＲ４二量体のコンホメーション変化を測定することができる。限定されるものではないが、以下の技術を挙げることができる：ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｔｉｍｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））、ＦＬＩＭ（蛍光寿命画像顕微法）またはＳＷ−ＦＣＣＳ単波長蛍光相互相関分光）。
共免疫沈降、Ａｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎ、化学的架橋、二重ハイブリッド、アフィニティークロマトグラフィー、ＥＬＩＳＡまたはファーウェスタンブロッティング法等のその他の古典的技術も用いることができる。
本発明に係るプロセスの特定の態様によれば、工程ｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ４−ＹＦＰの両方を発現する細胞のＢＲＥＴ分析により抗体を評価することおよびＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害できる抗体を選択することにある。
本発明に係るプロセスの別の特定の態様によれば、工程ｉｉｉ）は、ＣＸＣＲ４−ＲＬｕｃ／ＣＸＣＲ２−ＹＦＰの両方を発現する細胞のＢＲＥＴ分析により抗体を評価することおよびＢＲＥＴシグナルの少なくとも４０％を阻害できる抗体を選択することにある。
第２の態様によれば、本発明の主題は、前記プロセスによって得られる、単離されたヒト化抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、である。前記ヒト化抗体、またはその前記断片もしくは誘導体の１つは、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合することができ、また、必要に応じて、好ましくはそれに加えて、そのリガンドの自然な結合を阻害することができ、前記ヒト化抗体は、ＣＸＣＲ４二量体のコンホメーション変化を誘導することもできる。
「機能的断片および誘導体」という表現は、本明細書において以下で詳細に定義される。
ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわちそれらは天然環境にはなく、天然供給源から精製によって単離または獲得することができたものであるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得たものであり、したがって、続けて更に説明されるように、非天然アミノ酸を含んでもよいと理解されなければならない。
より具体的には、本発明の別の態様によれば、抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つが記載され、前記ヒト化抗体は、配列番号４〜９のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲから選択され、ＩＭＧＴに従って定義される、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含んでなることを特徴とする。
第２の態様によれば、本発明は、配列番号４、５、６、７、８もしくは９の配列のＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲまたはＩＭＧＴによる定義で配列が配列番号４、５、６、７、８もしくは９の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる単離されたヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
抗体の「機能的断片」とは、特に、元の抗体と同じＣＸＣＲ４に対する特異性を有する抗体断片、例えば断片Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃもしくは二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）または半減期が延長された任意の断片を意味する。そのような機能的断片は、本明細書において以下で更に詳細に説明される。
抗体の「誘導化合物」または「誘導体」とは、特に、ペプチドスキャフォールドとそのＣＸＣＲ４認識能を保存するための元の抗体のＣＤＲの少なくとも１つとで構成される結合タンパク質を意味する。そのような誘導化合物は当業者に周知であり、本明細書において以下で更に詳細に説明される。本発明の別の実施形態では、誘導化合物または誘導体は、元の抗体の少なくとも２、好ましくは少なくとも３、より好ましくは４、更により好ましくは５、最も好ましくは６個のＣＤＲを含んでなり得る。
より好ましくは、本発明は、遺伝的組換えまたは化学合成によって得られる、本発明に係るヒト化抗体、その誘導化合物またはその機能的断片を含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明に係るヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な抗体集団から生じた抗体を意味すると理解される。より具体的には、集団の個々の抗体は、最小限の割合で見出すことのできる少数の可能な天然の変異を除き、同一である。換言すると、モノクローナル抗体は、単細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核宿主細胞、均一な抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核宿主細胞等）の増殖により生じる均一抗体からなり、一般的に、ただ１つのクラスおよびサブクラスの重鎖ならびに１種類だけの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原に対するものである。更に、種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を通常含むポリクローナル抗体標品とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原の１つのエピトープに対するものである。
ここで、本発明は天然型のヒト化抗体に関するものではなく、すなわち天然環境から取られるものではなく天然供給源から精製によって単離または獲得されるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得られるものであり、したがって後述するように非天然アミノ酸を有してよいと理解されなければならない。
より具体的には、本発明の好ましい実施形態によれば、ヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、配列番号４、５もしくは６のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲまたは配列が配列番号４、５もしくは６の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる重鎖を含んでなること；あるいは配列番号７、８もしくは９のアミノ酸配列のＣＤＲから選択される少なくとも１つのＣＤＲまたは配列が配列番号７、８もしくは９の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも１つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
好ましい様式では、本発明のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つは、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３、を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする：
−ＣＤＲ−Ｈ１は、配列番号４の配列または配列番号４と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
−ＣＤＲ−Ｈ２は、配列番号５の配列または配列番号５と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
−ＣＤＲ−Ｈ３は、配列番号６の配列または配列番号６と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる。
特定の実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つは、配列番号４の配列のＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６の配列のＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖を含んでなることを特徴とする。
更により好ましくは、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つは、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする：
−ＣＤＲ−Ｌ１は、配列番号７の配列または配列番号７の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
−ＣＤＲ−Ｌ２は、配列番号８の配列または配列番号８の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなり；
−ＣＤＲ−Ｌ３は、配列番号９の配列または配列番号９の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる。
特定の実施形態によれば、抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つは、配列番号７の配列のＣＤＲ−Ｌ１、配列番号８の配列のＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号９の配列のＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなることを特徴とする。
本明細書中、「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」および「抗体化合物にまたはその配列に結合しているタンパク質」という用語は同義である。
ここで、本発明は天然型の抗体に関するものではなく、すなわち、天然環境から取られるものではなく天然供給源から精製によって単離または獲得されるか、あるいは遺伝的組換えまたは化学合成によって得られるものであり、したがって後述するように非天然アミノ酸を有してよいと理解されなければならない。
ＩＭＧＴの固有なナンバリングは、抗原受容体、鎖型、または種に関わらず可変ドメインを比較するために定義されたものである［Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。ＩＭＧＴの固有なナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置になる：例えばシステイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴの固有なナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６位、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５位、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４位およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８位）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７の標準化された境界を与える。ギャップは非占有位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（かぎ括弧中に示されドットで区切られる。例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴの固有なナンバリングは、ＩＭＧＴ Ｃｏｌｌｉｅｒｓ ｄｅ Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２Ｄグラフィック表示［Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］に用いられる。
３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。本明細書において、ＣＤＲという用語は、状況に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性による結合を担うアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたはこれらの領域の複数もしくは全部を指すために使用される。
本発明において、核酸またはアミノ酸の２つの配列間の「同一性パーセンテージ」とは、最適なアラインメント後に得られる、比較される２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは完全に統計的であり、２つの配列の間の差はその全長に渡ってランダムに分布される。２つの核酸またはアミノ酸配列の比較は、従来、それらの最適なアラインメント後に配列を比較することによって行われ、前記比較は、セグメントによってまたは「アラインメントウィンドウ」を用いて行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業での比較の他に、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]の局所相同性アルゴリズムを用いて、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]の局所相同性アルゴリズムを用いて、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性サーチ法を用いてまたはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウェア（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウェアＢＬＡＳＴ ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ Ｐ）を用いて行うことができる。
２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性パーセンテージは、２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較される核酸またはアミノ酸配列は、２つの配列間での最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加または欠失を有し得る。同一性パーセンテージは、２つの配列間で、好ましくは２つの完全配列間で、アミノ酸ヌクレオチドまたは残基が同一の箇所の数を決定し、この同一箇所の数をアラインメントウィンドウ中の箇所の総数で割り、その結果に１００を掛けて２つの配列間の同一性パーセンテージを得ることにより計算される。
例えば、サイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｅｃｓ」（Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250）をデフォルトのパラメーター（特にパラメーター、「オープン・ギャップ・ペナルティ」：５、「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」：２について；選択されるマトリックスは、例えばプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ ６２」マトリックス）で使用することができ、このプログラムにより、比較する２つの配列間の同一性パーセンテージが直接計算される。
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の好ましい例として、参照配列、特定の修飾、特に少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、切断または伸張を含むものが含まれる。１または複数の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換は、置換されるアミノ酸が「同等な（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「同等なアミノ酸」という表現は、構造的アミノ酸の１つを置換でき、対応する抗体および後述する具体例の生物学的活性を変化させないと考えられる、任意のアミノ酸を指すものとする。
同等なアミノ酸は、それらで置換されるアミノ酸とそれらの構造的相同性に基づいてまたは生成されるであろう種々の抗体間の生物学的活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。
非限定的な例として、対応する修飾抗体の生物学的活性を大きく変えずに行うことができると考えられる、可能性のある置換を以下の表１にまとめる。同じ条件下で逆置換が当然可能である。
Figure 2013523106
当該技術分野の現在の状況では、６つのＣＤＲ中の最大の可変性（長さおよび組成）は３つの重鎖ＣＤＲ、より具体的にはこの重鎖のＣＤＲ−Ｈ３に見られることが当業者に知られている。したがって、本発明の抗体の、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つの、好ましい特徴的なＣＤＲが重鎖の３つのＣＤＲとなることは明らかであろう。
本発明の別の実施形態では、
以下の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖：
配列番号４の配列または配列番号４の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ１；
配列番号５の配列または配列番号５の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ２；
配列番号６の配列または配列番号６の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｈ３；および
以下の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖：
配列番号７の配列または配列番号７の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ１；
配列番号８の配列または配列番号８の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ２；
配列番号９の配列または配列番号９の配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列のＣＤＲ−Ｌ３；
を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片が開示される。
本発明の別の態様は、上記ヒト化抗体の機能的断片に関する。当業者に明らかなように、機能的断片は必ず、結合断片、すなわち元の抗体と同じ標的に結合できる断片である。更に、機能的断片は、元の抗体の機能を保持している。特に、本発明の機能的断片はＣＸＣＲ４の活性化を調節することができる。より好ましくは、本発明に係る機能的断片はＣＸＣＲ４の活性化を阻害することができる。一実施形態では、ＣＸＣＲ４活性化はリガンド依存的であり、別の実施形態では、前記ＣＸＣＲ４活性化はリガンド非依存的である。
好ましい実施形態では、本発明の機能的断片は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体の活性を調節することにある元の抗体の機能を保持している。好ましくは、前記機能的断片は、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体複合体の活性を阻害する能力を保持している。
より具体的には、本発明は、前記機能的断片が、断片Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃおよび二重特異性抗体；またはペグ化断片等の半減期が延長された任意の断片から選択されることを特徴とする、抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
本発明に係る抗体のそのような機能的断片は、例えば、断片Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝単鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは二重特異性抗体、あるいはポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコールの付加（ペグ化）（ペグ化断片はＦｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（Ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）等の化学修飾によりまたはリポソーム、マイクロスフェアもしくはＰＬＧＡ中への組込みにより半減期が延長された任意の断片からなり、前記断片は、特にそれが由来する抗体の一般的様式の活性を一部であれ発揮できる本発明のヒト化抗体の特徴的ＣＤＲの少なくとも１つを有する。
好ましくは、前記機能的断片は、それらが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変部の部分的配列を含んでなるか含み、前記部分的配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な親和性、好ましくはそれが由来する抗体の親和性の１／１０に少なくとも等しい親和性、より好ましくは少なくとも１／１０の親和性を保持するのに十分である。
そのような機能的断片は、それが由来する抗体の配列の少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは６、７、８、１０、１５、２５、５０または１００個の連続アミノ酸含む。
好ましくは、これらの機能的断片の種類は、それらが得られた抗体と同じ結合特異性を通常有するＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（Ａｂ’）２、Ｆ（Ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたは二重特異性抗体である。本発明によれば、本発明の抗体の断片は、ペプシンもしくはパパインを含む酵素消化等の方法によりおよび／または化学的還元によるジスルフィドブリッジの切断により、上記の抗体から得ることができる。抗体断片は更に、当業者に公知の組換え遺伝子技術によりまたは例えばアプライドバイオシステムズ社から販売されているような自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成等によっても得ることができる。
より具体的には、本発明は、本明細書中でｉ）ＨＺ５１５Ｈ７、Ｈｚ５１５Ｈ７またはｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｉｉ）ＨＺ５１５Ｈ７−２、Ｈｚ５１５Ｈ７−２またはｈｚ５１５Ｈ７−２ Ｍａｂと呼ばれるマウス５１５Ｈ７ Ｍａｂの種々のヒト化抗体バリアントまたはｉｉｉ）前記抗体バリアントの軽鎖および／または重鎖の任意の組合せに関する。
更に分かりやすいように、本発明のヒト化バリアント（型ともいう）ｈｚ５１５Ｈ７およびｈｚ５１５Ｈ７−２のＣＤＲに対応する種々のアミノ酸配列を以下の表２ａに要約する。本発明のヒト化型ｈｚ５１５Ｈ７の種々のバリアントの可変ドメインおよび全長配列に対応する種々のアミノ酸配列を表２ｂに要約する。本発明のヒト化型ｈｚ５１５Ｈ７−２の可変ドメインおよび全長配列に対応する種々のアミノ酸配列を表２ｃに要約する。
Figure 2013523106
Figure 2013523106
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不明瞭さを避けるための例として、「ＶＨ１」という表現は、「ＶＨバリアント１」、「ＶＨ Ｖａｒ１」、「ＶＨ ｖａｒ １」という表現とほぼ同じである）。「コンセンサス」配列の入手は実施例２２に記載されている。
本発明の更に別の具体的態様は、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれラムダまたはカッパ領域およびガンマ−１、ガンマ−２またはガンマ−４領域であることを特徴とするヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
本発明は、２００８年６月２５日付でFrench collection for microorganism cultures（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランス、パリ）に番号Ｉ−４０１９で寄託されたモノクローナル抗体を分泌するマウスハイブリドーマに関する。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫化マウス脾細胞とミエローマＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４系の細胞との融合により得られた。
ここで５１５Ｈ７で参照するマウスモノクローナル抗体は、２００８年６月２５日に番号Ｉ−４０１９でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるものである。
本発明は更にキメラ抗体に関する。
キメラ抗体は、特定の種の抗体に由来する天然の可変領域（軽鎖および重鎖）と前記特定の種と異種の種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域との組合せを含むものである。
これらの抗体、またはそのキメラ断片は、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、キメラ抗体は、プロモーターと、本発明の非ヒトモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列（特にマウス）と、ヒト抗体の定常領域をコードする配列とを含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって作製することができる。そのような組換え遺伝子の１つにコードされる本発明に係るキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域によって決まり、アイソタイプはヒトＤＮＡに由来する定常領域によって決まる。キメラ抗体の作製方法についてはVerhoeyn et al．（BioEssays, 8:74, 1988）を参照されたい。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８３から選択される配列の可変領域を含んでなるキメラ抗体重鎖（ｃ５１５Ｈ７ ＶＨと呼ぶ）に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８４の配列の可変領域を含んでなるキメラ抗体軽鎖（ｃ５１５Ｈ７ ＶＬと呼ぶ）に関する。
好ましい特定の実施形態では、本発明のキメラ抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、配列番号８３のアミノ酸配列を含んでなる重鎖配列および配列番号８４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖配列を含んでなる。
本明細書において、「ヒト化抗体」とは、少なくとも１つの重鎖または１つの軽鎖を含んでなる抗体であって、前記重鎖または軽鎖が、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の残りの部分がヒト起源である（例えば、前記残りの部分は１種類（または複数種類）のヒト抗体に由来し得る）ものを指す。「ヒト化抗体」という表現により、本発明は、ヒト化鎖が１つだけで２つめがキメラまたはマウス鎖である抗体を含んでなる。好ましくは、本発明の「ヒト化抗体」は２つのヒト化鎖を含んでなり、すなわち重鎖および軽鎖の両方がヒト化されている。
本発明のヒト化抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって作製することができる（例えば、文献Singer et al., J. Immun., 150:2844-2857, 1992；Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1-142, 1992およびBebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992に記載されている技術）。そのようなヒト化抗体は、インビトロでの診断またはインビボでの予防的および／もしくは治療的処置を含む方法におけるその使用に好ましい。当業者に知られるその他のヒト化技術、例えばＰＤＬ社によって欧州特許第０ ４５１ ２１６号、同第０ ６８２ ０４０号、同第０ ９３９ １２７号、同第０ ５６６ ６４７号または米国特許第５，５３０，１０１号、同第６，１８０，３７０号、同第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号に記載されている「ＣＤＲグラフト化」技術等。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も挙げることができる。
本発明は、上記のマウス抗体５１５Ｈ７から生じたヒト化抗体に関する。
好ましい様式では、ヒト化抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域は、それぞれ、ラムダまたはカッパおよびガンマ−１、ガンマ−２またはガンマ−４領域である。
より具体的には、本発明は、ｉ）ヒト抗体重鎖の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびｉｉ）異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲを含んでなるヒト化抗体重鎖に関し、前記ＣＤＲは、配列番号４、５および６の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなる。
言い換えると、本発明は、配列番号４、５および６の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなるＣＤＲを有するヒト化抗体重鎖に関する。当業者には、抗体５１５Ｈ７のヒト化に異なる生殖系列を選択できることは明らかであり、それにより、異なる型のヒト化５１５Ｈ７が得られる。より具体的には、好ましい非限定的実施形態では、ｊ遺伝子には同じ生殖系列を保存する一方でｖ遺伝子をコードする配列に異なる生殖系列を用いることができる。
本発明では、使用できる生殖系列は以下の２つの補完的基準に基づいて選択される：
−各ＣＤＲのアミノ酸の長さはマウスＣＤＲと生殖系列中の同等物との間で同一でなければならない；および
−アミノ酸中の生殖系列配列は元のマウス配列と少なくとも７０％の同一性を有さなければならない。
不明瞭さを避けるために、ここで本発明は同じ抗体５１５Ｈ７の２つの好ましい非限定的ヒト化型（バージョンともいう）を包含することに注意されたい。Ｈｚ５１５Ｈ７ともいう最初の１つは、重鎖については生殖系列ＩＧＨＶ３−４９＊０４（配列番号７７）およびＩＧＨＪ４＊０１（配列番号８１）、軽鎖については生殖系列ＩＧＫＶ４−１＊０１（配列番号７８）およびＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８２）で得られたヒト化抗体からなる。Ｈｚ５１５Ｈ７−２ともいう２つめは、重鎖については生殖系列ＩＧＨＶ３−７３＊０１（配列番号７９）およびＩＧＨＪ４＊０１（配列番号８１）、軽鎖については生殖系列ＩＧＫＶ２Ｄ−４０＊０１（配列番号８０）およびＩＧＫＪ１＊０１（配列番号８２）で得られたヒト化抗体からなる。
別の実施形態では、本発明は配列番号１０、１１、１２、１３、８５または８７からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１１、１２または１３からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７重鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８５の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｈ３５Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｒ５０Ｆ、Ａ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号８７の配列のヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖可変領域に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、配列番号２１、２２、２３、２４、８９または９１からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、配列番号２１、２２、２３または２４からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体重鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８９の完全配列を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号９１の完全配列を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｈ３５Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｒ５０Ｆ、Ａ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号９１の配列のヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２重鎖に関する。
より具体的には、本発明は、ｉ）ヒト抗体軽鎖の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびｉｉ）異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲ、を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関し、前記ＣＤＲは、配列番号７、８および９の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
言い換えると、本発明は、配列番号７、８および９をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなるＣＤＲを有するヒト化抗体軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、８６または８８からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８６の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８８の配列の可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｌ９Ｓ、Ｉ２１Ｍ、Ｄ４０Ａ、Ｌ４３Ｑ、Ｙ５９Ａ、Ａ６１Ｄ、Ｄ６６Ａ、Ｓ６９Ｔ、Ｇ７４Ｅ、Ｄ７６Ｙおよび／またはＶ８９Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号８８の配列のヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖可変領域に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、９０または９２からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１からなる群から選択される完全配列を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号９０の完全配列を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号９２の完全配列を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｌ９Ｓ、Ｉ２１Ｍ、Ｄ４０Ａ、Ｌ４３Ｑ、Ｙ５９Ａ、Ａ６１Ｄ、Ｄ６６Ａ、Ｓ６９Ｔ、Ｇ７４Ｅ、Ｄ７６Ｙおよび／またはＶ８９Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号９２の配列のヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２軽鎖に関する。
より具体的には、本発明は、ｉ）ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に相同なフレームワーク領域およびｉｉ）異なる哺乳動物種に由来する抗体の対応するＣＤＲに相同なＣＤＲを各々が有する重鎖および軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関し、ここで、前記ＣＤＲは、配列番号４、５および６の配列をそれぞれ含んでなる重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３ならびに配列番号７、８および９の配列をそれぞれ含んでなる軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなる。
言い換えると、本発明は、配列番号４、５および６の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなるＣＤＲを有する重鎖および配列番号７、８および９の配列をそれぞれ含んでなるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなるＣＤＲを有する軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１１、１２、１３、８３、８５または８７からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、８４、８６または８８からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１１、１２または１３からなる群から選択される重鎖可変領域および配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８５の配列の重鎖可変領域および配列番号８６の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８５の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号８６の配列の軽可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｈ３５Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｒ５０Ｆ、Ａ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号８７の配列の重鎖可変領域ならびにＤ４０Ａ、Ｌ４３Ｑ、Ｙ５９Ａ、Ａ６１Ｄ、Ｓ６９Ｔ、Ｇ７４ＥおよびＤ７６Ｙからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、キメラ軽鎖と組み合わされたヒト化重鎖を含んでなるヒト化抗体に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、ヒト化軽鎖と組み合わされたキメラ重鎖を含んでなるヒト化抗体に関する。
より具体的には、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、８６または８８からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ１ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１７の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．１またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．２またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号１９の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．３またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号２０の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ３またはその誘導化合物または機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号８６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８３の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体ｃ５１５Ｈ７ ＶＨ／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１またはその由来化合もしくはは機能的断片に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１０、１１、１２、１３、８５または８７からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１０の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１／ｃ５１５Ｈ７ ＶＬまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ／ｃ５１５Ｈ７ ＶＬまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ／ｃ５１５Ｈ７ ＶＬまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１３の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ２／ｃ５１５Ｈ７ ＶＬまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８５の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号８４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／ｃ５１５Ｈ７ ＶＬまたはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
更に別の実施形態では、本発明は、配列番号２１、２２、２３、２４、８９または９１からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、９０または９２からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号２１、２２、２３または２４からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号８９の配列の重鎖および配列番号９０の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、Ｈ３５Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｒ５０Ｆ、Ａ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号９１の配列の重鎖ならびにＤ４０Ａ、Ｌ４３Ｑ、Ｙ５９Ａ、Ａ６１Ｄ、Ｓ６９Ｔ、Ｇ７４ＥおよびＤ７６Ｙからなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換を含んでなる配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈ５１５Ｈ７−２に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２７の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１７の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２８の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１９の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２２の配列の重鎖および配列番号３０の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２３の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２３の配列の重鎖および配列番号２６の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ ＶＬ１ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１０の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２１の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１０の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１３の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ２／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２１の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２２の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２３の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｖ４８Ｌ Ｄ７６Ｎ／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号２４の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ２／Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬｌ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１７の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１９の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号２０の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬｌ、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２６の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬｌ Ｔ５９Ａ Ｅ６１Ｄ、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２７の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２８の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．１、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．２、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号３０の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ２．３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号９１の配列の重鎖および配列番号３１の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７−２ ＶＨ１／Ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＬ３、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
上記で例示したＶＨ／ＶＬの組合せは限定するものではないと理解されなければならない。当業者であれば、当然、過度な負担なしに且つ発明的能力を用いることなく、本明細書に開示されている全てのＶＨおよびＶＬを再編成することができる。したがって、当業者であれば、本願に開示されている全てのＶＨおよびＶＬの全組合せに対応する全てのヒト化抗体を得ることができる。
本発明の新規な態様は、以下の核酸（全ての縮重遺伝暗号を含む）から選択されることを特徴とする単離された核酸に関する：
ａ）本発明に係るヒト化抗体重鎖をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｂ）本発明に係るヒト化抗体軽鎖をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｃ）本発明に係るヒト化抗体をコードするまたはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に記載の核酸に相補的な核酸；
ｅ）配列番号３８〜４１、４９〜５２、９３または９５の核酸配列を含んでなる少なくとも１つの重鎖と、好ましくはＩＭＧＴまたはＫａｂａｔのＣＤＲのナンバリングによるその３つのＣＤＲの少なくとも１つと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；
ｆ）配列番号４２〜４８、５３〜５９、９４または９６の核酸配列を含んでなる少なくとも１つの軽鎖と、好ましくはＩＭＧＴまたはＫａｂａｔのＣＤＲのナンバリングによるその３つのＣＤＲの少なくとも１つと、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
本発明は更に、ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１ヌクレオチド配列；配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ２ヌクレオチド配列；および配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ３ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子に関する。
本発明は更に、ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３５または６０のＣＤＲ−Ｌ１ヌクレオチド配列；配列番号３６または６１のＣＤＲ−Ｌ２ヌクレオチド配列；および配列番号３７または６２のＣＤＲ−Ｌ３ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子に関する。
本発明は更に、ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子であって、
前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１ヌクレオチド配列；配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ２ヌクレオチド配列；および配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ３ヌクレオチド配列を含んでなり；
前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３５または６０のＣＤＲ−Ｌ１ヌクレオチド配列；配列番号３６または６１のＣＤＲ−Ｌ２ヌクレオチド配列；および配列番号３７または６２のＣＤＲ−Ｌ３ヌクレオチド配列を含んでなる、
核酸分子に関する。
本発明の抗体Ｈｚ５１５Ｈ７のＣＤＲに対応する最適化されたヌクレオチド配列を以下の表３ａに要約する。本発明のヒト化抗体Ｈｚ５１５Ｈ７の種々のバリアントの可変ドメインおよび全長配列に対応する種々の最適化されたヌクレオチド配列を表３ｂに要約する。本発明のヒト化バージョンｈｚ５１５Ｈ７−２の可変ドメインおよび全長配列に対応する種々の最適化されたヌクレオチド配列を表３ｃに要約する。
Figure 2013523106
Figure 2013523106
Figure 2013523106
「最適化された配列」という表現は、興味のあるタンパク質（本明細書では抗体の可変ドメイン）の構成的アミノ酸をコードするコドンが、専用の細胞型（本明細書では哺乳動物細胞）における翻訳機構によってよりよく認識されるように最適化されていることを意味する。この点に関し、最適化された配列によってコードされる所定のタンパク質のアミノ酸配列は最適化されていない配列によってコードされるものと同じであるが、ヌクレオチド配列は異なる。最適化には、Ｇ／Ｃ含量の適合および安定なＲＮＡ二次構造の防止も含まれる（例としては、Kim et al., 1997 Gene 199(l-2):293-301を参照されたい）。
例えば、マウスＣＤＲ−Ｈ１のヌクレオチド配列（配列番号７１）が最適化され、ヒト化ＣＤＲ−Ｈ１のヌクレオチド配列（配列番号３２）に対応し、コドンｇｇｇ、ａｃｔおよびｇａｔ（それぞれ残基Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＡｓｐをコードする）がそれぞれｇｇｃ、ａｃｃおよびｇａｃ（やはりそれぞれ残基Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＡｓｐをコードする）で置換されている。
ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（それぞれ配列番号７２および７３）に関して、これらも最適化され、それぞれ配列番号３３および３４の最適化されたＣＤＲに対応する。
軽鎖の３つのＣＤＲ（それぞれ配列番号７４、７５および７６）についても同様であり、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３（それぞれ配列番号３５、３６および３７）ならびにＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３（それぞれ配列番号６０、６１および６２）に対応する２つの最適化されたヒト化型がある。
元のＣＤＲ、すなわちマウスの最適化されていない配列を以下の表４に要約する。
Figure 2013523106
本明細書中で同義で使用されている、「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は修飾されていてもよく、核酸の断片または領域を定義し、非天然ヌクレオチドを含んでもよく、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、または前記ＤＮＡの転写産物のいずれかであるヌクレオチドの正確な配列を意味する。
本発明は天然の染色体環境中すなわち天然状態のヌクレオチド配列に関するものではないことをここで記載しておく。本発明の配列は、単離および／または精製されたものであり、すなわち、これらは、例えばコピーによって、直接または間接的にサンプリングされ、その環境が少なくとも部分的に変更されたものである。例えば宿主細胞を用いた組換え遺伝子技術によって得られたまたは化学合成によって得られた単離された核酸もここで述べておく。
好ましい配列と最適なアラインメント後に少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性パーセンテージを示す核酸配列」とは、参照核酸配列に関して、特定の修飾、例えば特に欠失、切断、伸張、キメラ融合、および／または置換（特に点での）を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは、遺伝暗号の縮重、あるいは、好ましくは高ストリンジェントな条件化で、特に以下に記載する条件化で、参照配列と特異的にハイブリダイズすると思われる相補的配列に関連する。
高ストリンジェントな条件化でのハイブリダイゼーションとは、２つの相補的ＤＮＡ断片間でハイブリダイゼーションが維持されるように温度およびイオン強度に関連する条件が選択されることを意味する。純粋な例として、上記のポリヌクレオチド断片を定義するためのハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェントな条件は好ましくは以下の通りである。
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２工程で行われる：（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムの溶液に相当）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハルト液、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション；（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは４２℃）で２０時間の一次ハイブリダイゼーション、続いて、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃で２０分間のウォッシュを２回、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃で２０分間のウォッシュを１回。最後のウォッシュを、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは６０℃で３０分間、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で行う。当業者は、既定のサイズのポリヌクレオチドについての上記の高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を、Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3rd edition, 2001)に記載されている手順に従って、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに適合させることができる。
本発明は更に、本発明に記載の核酸を含んでなるベクターに関する。
本発明は、特に、そのようなヌクレオチド配列を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクターに関する。
本発明のベクターは、好ましくは、所定の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能にするエレメントを含む。したがって、ベクターは、プロモーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルならびに好適な転写制御領域を含まなければならない。これは、宿主細胞中に安定に維持することができなければならず、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特別なシグナルを有してもよい。これらの種々のエレメントは、使用される宿主細胞に応じて当業者によって選択および最適化される。そのために、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内の自己複製ベクター中に挿入してもよく、選択された宿主の組込みベクターであってもよい。
そのようなベクターは、当業者により通常用いられる方法によって調製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヒートショックまたは化学的方法等の標準的方法によって好適な宿主中に導入することができる。
ベクターは、例えばプラスミドまたはウイルス起源のベクターである。これらは、本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するために宿主細胞の形質転換に使用される。
本発明は更に、本発明に記載のベクターで形質転換されたまたはこれを含んでなる宿主細胞を含んでなる。
宿主細胞は、原核または真核系、例えば細菌細胞、更に例えば酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞から選択することができる。昆虫または植物細胞を用いることもできる。
本発明は更に、本発明に係る形質転換細胞を有するヒト以外の動物に関する。
本発明の別の態様は、以下の工程を含んでなることを特徴とする、本発明に係る抗体、またはその機能的断片の１つ、を産生する方法に関する：
ａ）本発明に係る宿主細胞の培地および宿主細胞に適した培養条件で培養する工程；および
ｂ）このようにして産生された前記抗体、またはその機能的断片の１つ、を培養培地または前記培養細胞からを回収する工程。
本発明に係る形質転換細胞は、本発明に係る組換えポリペプチドの製造方法に有用である。本発明は更に、ベクターおよび／または本発明に係るベクターによって形質転換された細胞を使用することを特徴とする、組換え型の本発明に係るポリペプチドの製造方法を含んでなる。好ましくは、本発明に係るベクターで形質転換された細胞は、上記ポリペプチドの発現および前記組換えペプチドの回収を可能にする条件下で培養される。
既に述べたように、宿主細胞は原核または真核系から選択することができる。特に、そのような原核または真核系における分泌を促進する本発明のヌクレオチド配列を同定することが可能である。したがって、そのような配列を有する本発明に係るベクターを、分泌される組換えタンパク質の産生に有利に使用することができる。実際、これらの目的の組換えタンパク質の精製は、これらが宿主細胞中よりも細胞培養の上清中に存在することで容易になる。
本発明のポリペプチドは化学合成によって製造することもできる。そのような製造方法の１つも本発明の対象である。化学合成法、例えば固相技術（特にSteward et al, 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed.参照）または部分的固相（ｐａｒｔｉａｌ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ）技術、断片の縮合によるまたは従来の溶液中での合成による化学合成法は当業者に公知である。本発明は更に、化学合成によって得られ且つ対応する非天然アミノ酸を含むことができるポリペプチドを含んでなる。
本発明は更に、本発明の方法によって得られると思われる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなる。
更に別の態様によれば、本発明は、更にヒトケモカインファミリー受容体に特異的に結合でき且つ／またはそのような受容体のシグナル伝達を特異的に阻害できることを特徴とする前述の抗体に関する。
新規な実施形態によれば、本発明は、例えばＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＨＥＲ２ｎｅｕ、ＨＧＦ、ｃＭＥＴ、ＦＧＦ、テトラスパニン、インテグリン、ＣＸＣＲ４（本発明の抗体以外、すなわち別のエピトープを標的とする）、ＣＸＣＲ７またはＣＸＣＲ２等の腫瘍の発症に関与する受容体と相互作用できる第２のモチーフを含んでなるという意味で二重特異性である抗体からなる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
二重特異性または二機能性抗体は、同じ分子中に２つの異なる可変領域が組み合わされた第２世代のモノクローナル抗体である（Hollinger and Bohlen, 1999, Cancer and metastasis, rev. 18:411-419）。新たなエフェクター機能をリクルートする能力または腫瘍細胞表面上の複数の分子を標的とする能力に関して、診断領域および治療領域の両方においてその有用性が実証されている。そのような抗体は、化学的方法（Glennie MJ et al, 1987, J. Immunol. 139, 2367-2375；Repp R. et al, 1995, J. Hemat, 377-382）または体細胞法（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）（Staerz U.D. and Bevan M.J., 1986, PNAS 83, 1453-1457；Suresh M.R. et al, 1986, Method Enzymol., 121 :210-228）によって得ることができ、更に、好ましくは、ヘテロ二量体化させることにより求める抗体の精製を容易にすることが可能な遺伝子操作技術によっても得ることができる（Merchand et al, 1998, Nature Biotech., 16:677-681）。
これらの二重特異性抗体は、完全（ｗｈｏｌｅ）ＩｇＧ、二重特異性Ｆａｂ’２、Ｆａｂ’ＰＥＧ、二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）または二重特異性ｓｃＦｖとして、更には標的とする各抗原について２つの結合部位が存在する四価の二重特異性抗体（Park et al, 2000, Mol. Immunol., 37(18): 1123-30）または前述したその断片として構築してもよい。
二重特異性抗体の製造および投与が２つの特異的抗体の産生より安価である場合の経済的利点に加えて、このような二重特異性抗体の使用には、治療の毒性を低減するという利点がある。実際、二重特異性抗体の使用により、循環抗体の全量を減らすことができ、したがって起こり得る毒性を低減することができる。
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は２価または４価の抗体である。
最後に、本発明は、薬物として使用するための上記の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に関する。
本発明は更に、本発明の抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の１つ、からなる化合物を活性成分として含んでなる医薬組成物に関する。好ましくは、前記抗体に補形剤および／または薬学的に許容されるキャリアが添加される。
本発明は更に、ＣＸＣＲ４に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を同時、別個、または拡張使用(extended use)のための組合せ物として更に含んでなることを特徴とする組成物に関する。
更に別の実施形態では、本発明は更に、ＩＧＦ−ＩＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲもしくはＶＥＧＦ等の受容体のチロシンキナーゼ活性を特異的に阻害できる化合物または当業者に公知の任意の他の抗腫瘍化合物から選択される少なくとも１つの第２の抗腫瘍化合物を含んでなる上記の医薬組成物に関する。
本発明の第２の好ましい態様によれば、前記第２の化合物は、前記受容体によって促進される増殖および／または抗アポトーシスおよび／または血管形成および／または播種性転移（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）誘導活性を阻害できる単離された抗体である抗ＥＧＦＲ、抗ＩＧＦ−ＩＲ、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ｃＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ等またはその機能的断片および誘導化合物から選択することができる。
リツキシマブ、イブリツモマブまたはトシツモマブ等の抗ＣＤ２０抗体；ゲムツズマブまたはリンツズマブ等の抗ＣＤ３３抗体；エピラツズマブ等の抗ＣＤ２２抗体；アレムツズマブ等の抗ＣＤ５２抗体；エドレコロマブ、Ｃｈ １７−１ＡまたはＩＧＮ−１０１等の抗ＥｐＣＡＭ抗体；ザクチン（Ｘａｃｔｉｎ）等の抗ＣＴＰ２１または１６抗体；１３１Ｉ−Ｃｏｔａｒａ ＴＮＴ−１等の抗ＤＮＡ−Ａｇ抗体；ペムツモマブまたはＲ１１５０等の抗ＭＵＣ１抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１等の抗ＭＵＣ１８抗体；ミツモマブ等の抗ＧＤ３抗体；ＣｅａＶａｃまたはラベツズマブ等の抗ＥＣＡ抗体；ＯｖａＲｅｘ等の抗ＣＡ１２５抗体；アポリズマブ等の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体；ＭＤＸ−０１０等の抗ＣＴＬＡ４抗体；ＭＤＸ−０７０、１１１Ｉｎ＆９０Ｙ−Ｊ５９１、１７７Ｌｕ Ｊ５９１、Ｊ５９１−ＤＭ１等の抗ＰＳＭＡ抗体；ＩＧＮ３１１等の抗ルイスＹ抗体；ＡＳ１４０５、９０ＹｍｕＢＣ１等の抗血管形成抗体；ＴＲＡＩＬ Ｒ１ｍＡｂまたはＴＲＡＩＬ Ｒ２ｍＡｂ等の抗Ｔｒａｉｌ−Ｒ１抗体を好適なものとして挙げられる。
本発明の補足的な別の実施形態は、同時、別個、または拡張使用のための組合せ物または併用剤として細胞毒性薬剤／細胞分裂阻害剤を更に含んでなる上記組成物からなる。
「同時使用」とは、組成物の両化合物を単一の製剤に含めて投与することを意味する。
「別個使用」とは、組成物の両化合物を異なる製剤に含めて同時に投与することを意味する。
「拡張使用」とは、組成物の両化合物を異なる製剤にそれぞれ含めて逐次投与することを意味する。
一般的に、本発明に係る組成物は、がんの治療の有効性をかなり上昇させる。言い換えると、細胞毒性薬剤の投与により、本発明の抗体の治療効果は予想されるよりも大きく増大する。したがって、本発明の組成物によって得られるもう１つの大きなの利点は、使用する活性成分の有効量がより少なくなる可能性、したがって、副作用、特に細胞毒性薬剤の影響が現れるリスクを回避または低減することが可能になる可能性に関する。更に、この組成物は、予想される治療効果をより迅速に達成することを可能にする。
「治療的抗がん剤」または「細胞毒性薬剤」とは、患者に投与された時に患者におけるがんの発症が治療または予防される物質を意味する。そのような薬剤の非限定的な例としては、「アルキル化」剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、クロマチン機能阻害剤、抗血管形成剤、抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬および免疫調節剤が含まれる。
そのような薬剤は、例えばＶＩＤＡＬの「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ」の見出しの下で腫瘍学および血液学に関連する化合物に費やされたページに挙げられており、この文献に参照により引用されている細胞毒性化合物を好ましい細胞毒性薬剤として本明細書に引用する。
「アルキル化剤」とは、細胞中の任意の分子、好ましくは核酸（例えばＤＮＡ）、に共有結合できるまたはこれをアルキル化できる任意の物質を指す。そのようなアルキル化剤の例としては、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、クロルハイドレート、ピポブロマン、プレドニムスチン、リン酸二ナトリウムまたはエストラムスチン等のナイトロジェンマスタード；シクロホスファミド、アルトレタミン、トロホスファミド、スルホスファミドまたはイホスファミド等のオキサザホスホリン；チオテパ、トリエチレンアミンまたはアルテトラミン（ａｌｔｅｔｒａｍｉｎｅ）等のアジリジンまたはエチレン−イミン；カルムスチン、ストレプトゾシン、ホテムスチンまたはロムスチン等のニトロソウレア；ブスルファン、トレオスルファンまたはインプロスルファン等のアルキルスルホナート；ダカルバジン等のトリアゼン；またはシスプラチン、オキサリプラチンもしくはカルボプラチン等の白金錯体が含まれる。
「代謝拮抗剤」とは、特定の活性、一般にＤＮＡ合成、を妨げることにより成長および／または細胞代謝をブロックする物質を指す。代謝拮抗剤の例としては、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、５−フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、クロロデソキシアデノシン、５−アザシチジン、ゲムシタビン、クラドリビン、デオキシコホルマイシンおよびペントスタチンが含まれる。
「抗腫瘍抗生物質」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の合成を防止または阻害できる化合物を意味する。そのような抗腫瘍抗生物質の例としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン バルルビシン、ミトキサントロン、ダクチノマイシン、ミトラマイシン、プリカマイシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシンおよびプロカルバジンが含まれる。
「有糸分裂阻害剤」は、細胞周期および有糸分裂の正常な進行を防止する。一般的に、微小管阻害剤または「タキソイド」、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルが有糸分裂を阻害することができる。ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン等のビンカアルカロイドも有糸分裂を阻害することができる。
「クロマチン阻害剤」または「トポイソメラーゼ阻害剤」は、トポイソメラーゼＩおよびＩＩ等のクロマチンを形作るタンパク質の正常な機能を阻害する物質である。そのような阻害剤の例としては、トポイソメラーゼＩには、カンプトテシンおよびその誘導体、例えばイリノテカンまたはトポテカン；トポイソメラーゼＩＩには、エトポシド、リン酸エチポシドおよびテニポシドが含まれる。
「抗血管形成剤」とは、血管の成長を阻害する任意の薬物、化合物、物質または薬剤である。抗血管形成剤の例としては、限定されるものではないが、ラゾキシン、マリマスタット、バチマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、イロマスタット、ＣＧＳ−２７０２３Ａ、ハロフジノン、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、ＣＤＣ ５０１、ＤＭＸＡＡ、Ｌ−６５１５８２、スクアラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、インターフェロン−α、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン−１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチンおよびビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）が含まれる。
「抗エストロゲン薬」または「エストロゲンアンタゴニスト」とは、エストロゲンの作用を低減、拮抗または阻害する任意の物質を指す。そのような薬剤の例としてはタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イオドキシフェン、アナストロゾール、レトロゾールおよびエキセメスタンが挙げられる。
「抗アンドロゲン薬」または「アンドロゲンアンタゴニスト」とは、アンドロゲンの作用を低減、拮抗または阻害する任意の物質を指す。抗アンドロゲン薬の例としては、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、スプリロノラクトン、酢酸シプロテロン、フィナステリドおよびシミチジンが含まれる。
免疫調節剤とは免疫系を刺激する物質である。免疫調節剤の例としては、インターフェロン、インターロイキン、例えばアルデスロイキン、ＯＣＴ−４３、デニロイキンジフチトクスまたはインターロイキン−２、腫瘍壊死因子、例えばタソネルミン、または他の種類の免疫調節剤、例えばレンチナン、シゾフィラン、ロキニメックス、ピドチモド、ペガデマーゼ、チモペンチン、ポリＩ：Ｃまたはレバミソールと５−フルオロウラシルの組合せが含まれる。
更なる詳細について、当業者は、French Association of Therapeutic Chemistry Teachersによって刊行された「Therapeutic chemistry, vol. 6, Antitumor drugs and perspectives in the treatment of cancer, TEC and DOC edition, 2003［フランス語］」というタイトルのマニュアルを参照することができる。
特に好ましい実施形態では、組合せ物としての本発明の前記組成物は、同時使用のために前記細胞毒性薬剤が前記抗体に化学的に結合していることを特徴とする。
特に好ましい実施形態では、前記組成物は、前記細胞毒性薬剤／細胞分裂阻害剤が、紡錘体阻害剤または安定化剤、好ましくはビノレルビンおよび／またはビンフルニンおよび／またはビンクリスチンから選択されることを特徴とする。
前記細胞毒性薬剤と本発明に係る抗体との間の結合を容易にするために、結合させる２つの化合物の間にポリ（アルキレン）グリコールのポリエチレングリコールまたはアミノ酸等のスペーサー分子を導入してもよく、あるいは、別の実施形態では、前記抗体と反応できる機能が導入された前記細胞毒性薬剤の活性誘導体を用いてもよい。これらの結合技術は当業者に周知であり、本明細書中で更に詳細な説明はしない。
その他のＥＧＦＲ阻害剤としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体Ｃ２２５および抗ＥＧＦＲ２２Ｍａｂ（インクローンシステムズ社（ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ））、ＡＢＸ−ＥＧＦ（アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ）／セルジェネシス社（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ））、ＥＭＤ−７２００（メルク ＫｇａＡ社（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ））または化合物ＺＤ−１８３４、ＺＤ−１８３８およびＺＤ−１８３９（アストラゼネカ社）、ＰＫＩ−１６６（ノバルティス社）、ＰＫＩ−１６６／ＣＧＰ−７５１６６（ノバルティス社）、ＰＴＫ７８７（ノバルティス社）、ＣＰ７０１（セファロン社（Ｃｅｐｈａｌｏｎ））、フルノミド（ｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（ファルマシア社／スゲン社（Ｓｕｇｅｎ）、ＣＩ−１０３３（ワーナーランバート・パークデービス社（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ））、ＣＩ−１０３３／ＰＤ １８３，８０５（ワーナーランバート・パークデービス社）、ＣＬ−３８７，７８５（ワイエス−アイエルスト社（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ））、ＢＢＲ−１６１１（ベーリンガーマンハイムＧＭＢＨ社／ロシュ社）、ナアミジンＡ（ブリストルボード・マイヤーズスクイブ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ−ｂｏａｒｄ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ））、ＲＣ−３９４０−ＩＩ（ファルマシア社）、ＢＩＢＸ−１３８２（ベーリンガーインゲルハイム社）、ＯＬＸ−１０３（メルク・アンド・カンパニー）、ＶＲＣＴＣ−３１０（ベンテク・リサーチ社（Ｖｅｎｔｅｃｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））、ＥＧＦ融合毒素（セラゲン社（Ｓｅｒａｇｅｎ Ｉｎｃ．））、ＤＡＢ−３８９（セラゲン社／リルガンド社（Ｌｉｌｇａｎｄ））、ＺＭ−２５２８０８（王立癌研究所（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ））、ＲＧ−５０８６４（ＩＮＳＥＲＭ）、ＬＦＭ−Ａ１２（パーカーヒューズセンターがん（Ｐａｒｋｅｒ Ｈｕｇｈｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃａｎｃｅｒ））、ＷＨＩ−Ｐ９７（パーカーヒューズセンターがん）、ＧＷ−２８２９７４（グラクソ社）、ＫＴ−８３９１（協和発酵）または「ＥＧＦＲワクチン」（ヨークメディカル社／免疫分子センター（Ｃｅｎｔｒｏ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ））が含まれる。
本発明の別の態様は、前記抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片、の少なくとも１つが細胞毒素および／またはラジオアイソトープと組み合わされているまたはコンジュゲートしていることを特徴とする組成物に関する。
好ましくは、前記毒素または前記ラジオアイソトープは腫瘍細胞の成長または増殖を防止することができ、特に前記腫瘍細胞を完全に不活化することができる。
更に、好ましくは、前記毒素は、腸内細菌毒素、特にシュードモナス外毒素Ａである。
治療抗体と組み合わせるのに好ましいラジオアイソトープは、ガンマ線を発するラジオアイソトープ、好ましくはヨウ素１３１、イットリウム９０、金１９９、パラジウム１００、銅６７、ビスマス２１７およびアンチモン２１１である。アルファ線およびベータ線を発するラジオアイソトープも治療に用いることができる。
「本発明の少なくとも１つの抗体またはその機能的断片と組み合わされた毒素またはラジオアイソトープ」とは、特に２つの化合物間の共有結合により、前記毒素または前記ラジオアイソトープをその少なくとも１つの抗体に結合させることを可能にする任意の手段を指し、結合分子が導入されてもよく、されなくてもよい。
コンジュゲートの要素の全部または一部の化学的（共有）結合、静電結合、または非共有結合を可能にする薬剤の例としては、特に、ベンゾキノン、カルボジイミド、より具体的にはＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチル−アミノプロピル］−カルボジイミド−ヒドロクロリド）、ジマレイミド、ジチオビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセタート（ＳＡＴＡ）、紫外（ＵＶ）線と反応する１または複数の基を有する、１または複数のフェニルアシド基を有する架橋剤、最も好ましくはＮ−［−４（アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−（２’−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミド−イル３（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）および６−ヒドラジノ−ニコチンアミド（ＨＹＮＩＣ）が含まれる。
もう１つの結合形態は、特にラジオアイソトープの場合、二官能性イオンキレート化剤の使用からなり得る。
そのようなキレーターの例としては、免疫グロブリンと金属、特に放射性金属を結合させるために開発されたＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）に由来するキレーターが含まれる。したがって、ＤＴＰＡおよびその誘導体は、リガンド−金属錯体の安定性および剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）を増大させるように種々の基によって炭素鎖上で置換され得る（Krejcarek et al, 1977；Brechbiel et al, 1991；Gansow, 1991；米国特許第４，８３１，１７５号）。
例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびその誘導体は、遊離形態または金蔵イオンとの錯体形態で薬物および生物学において長い間広く使用されており、がん治療のためのラジオ−イムノコンジュゲートを開発するための抗体等の治療または診断目的のタンパク質とカップリングし得る金属イオンと安定なキレートを形成する注目すべき特徴を示す（Meases et al, 1984；Gansow et al, 1990）。
また好ましくは、前記コンジュゲートを形成する本発明の前記少なくとも１つの抗体は、その機能的断片、特に構成要素Ｆｃを失った断片、例えばｓｃＦｖ断片から選択される。
本発明は更に、がんの予防または治療を目的とする薬物を製造するための組成物の使用を含んでなる。
本発明は更に、腫瘍細胞の成長を阻害する薬物を製造するための、本発明に係る、好ましくはヒト化された、抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および／または組成物の使用に関する。広義には、本発明は、がんを予防または治療する薬物を製造するための、好ましくはヒト化された、抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および／または組成物の使用に関する。
予防および／または治療され得る好ましいがんには、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌または任意のその他のがんが含まれる。
本発明は更に、細胞中のＣＸＣＲ４活性を調節するための薬物を製造するための、前述した抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および／または組成物の使用に関する。
本発明の別の態様は、ＣＸＣＲ４発現レベルに関連する疾患の、好ましくはインビトロでの、診断方法における上記抗体の使用に関する。好ましくは、前記診断方法における前記ＣＸＣＲ４タンパク質関連疾患はがんである。
したがって、本発明の抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片は、生体サンプル中のＣＸＣＲ４タンパク質をインビトロで検出および／または定量化する方法、特に、がんのようなこのタンパク質の異常発現に関連する疾患の診断方法において使用でき、前記方法は以下の工程を含んでなる：
ａ）生体サンプルを本発明に係る抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に接触させる工程；
ｂ）形成されるであろう抗原−抗体複合体を示す工程。
したがって、本発明は更に、以下の構成要素を含んでなる、上記方法を実施するためのキットまたは付属物を含んでなる：
ａ）本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体；
ｂ）必要に応じて、免疫学的反応に好ましい培地（ｍｅｄｉｕｍ）を構成するための試薬；
ｃ）必要に応じて、免疫学的反応によって生成する抗原−抗体複合体を明らかにする試薬。
一般的に、本発明は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害の発症についての予後をインビトロで決定するための、それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号７、８および９の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片の使用に関する。
本態様に関して、本発明は、特に、ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害の発症についての予後をインビトロで決定するための、本発明に係るヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片、の使用に関する。
別の態様によれば、本発明は、対象(subject)におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、（ａ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号７、８、９の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつ（ｂ）前記抗体とサンプルの結合を検出することを含んでなる、方法に関する。
特に、本発明は、対象におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）本発明に係るヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつ
（ｂ）前記抗体とサンプルの結合を検出すること
を含んでなる、方法に関する。
非限定的例として、そのような検出は、ＦＡＣＳまたは当業者に公知のその他の任意の技術によってなされ得る。
別の態様によれば、本発明は、対象のＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（ａ’）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号７、８、９の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつ（ｂ’）前記サンプルにおけるＣＸＣＲ４への抗体結合レベルを定量化することを含んでなる方法に関する。
特に、本発明は、対象由来のＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、
（ａ’）本発明に係るヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片に対象由来のサンプルを接触させ、かつ
（ｂ’）前記サンプル中におけるＣＸＣＲ４への抗体結合レベルを定量化すること
を含んでなる方法に関する。
好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４発現レベルは免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
別の態様によれば、本発明は、ＣＸＣＲ４発現腫瘍をインビトロで診断する方法または対象におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の発症についての予後をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（ｉ）本発明に従って、特に本発明のヒト化抗体を用いて、ＣＸＣＲ４の発現レベルを決定する工程；および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを正常組織由来のＣＸＣＲ４の参照発現レベルと比較する工程、を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明は、対象の腫瘍のＣＸＣＲ４の状態をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（１）本発明に従って、特に本発明のヒト化抗体を用いて、ＣＸＣＲ４の発現レベルを決定する工程；（２）前記腫瘍をＣＸＣＲ４発現レベルについてスコア化する工程；および（３）前記スコア化を対照サンプルから得られたものと比較する工程、を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明は、発がん性障害が抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）本発明に従って対象の腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定する工程；および
（ｂ）状態がＣＸＣＲ４（＋）であった場合、発がん性傷害が抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片または誘導体を用いた治療に感受性であることを決定する工程
を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明はＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび／または同定する方法であって、
ａ）ＣＸＣＲ４を発現している細胞を選択する工程；
ｂ）それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号７、８、９の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片と前記細胞をインキュベートする工程；
ｃ）抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、とＣＸＣＲ４との結合を阻害する能力について、被験分子を評価する工程；および
ｄ）前記阻害が可能な分子を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
この態様によれば、本発明は特に、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび／または同定する方法であって、
ａ）ＣＸＣＲ４を発現している細胞を選択する工程；
ｂ）本発明に係るヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片と前記細胞をインキュベートする工程；
ｃ）抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、とＣＸＣＲ４との間の結合を阻害する能力について、被験細胞を評価する工程；および
ｄ）前記阻害が可能な分子を選択する工程
を含んでなる方法に関する。
別の態様によれば、本発明は、それぞれ配列番号４、５および６の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の３つのＣＤＲを含んでなる重鎖ならびにそれぞれ配列番号７、８、９の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の３つのＣＤＲを含んでなる軽鎖を含んでなる抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片を少なくとも含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キットに関する。
この態様によれば、本発明は特に、少なくとも１つの本発明に係るヒト化抗体重鎖および／またはヒト化抗体軽鎖および／またはヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キットに関する。
別の態様によれば、本発明は、腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定するための本発明に係るキットであって、前記キットが、
ｉ）前記抗ＣＸＣＲ４抗体とＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬；および
ｉｉ）ＣＸＣＲ４発現レベルをスコア化するのに有用な陽性および陰性対照サンプル
を更に含んでなるキットに関する。
好ましくは、抗体またはその機能的断片は、支持体、特にタンパク質チップ上に固定化することができる。そのようなタンパク質チップの１つは本発明の対象である。
好ましくは、タンパク質チップは、生体サンプル中のＣＸＣＲ４を検出および／または定量化するために必要なキットまたは付属物中で使用することができる。
本発明において「生体サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」という用語は、生きている生物から採取したサンプル（特に、哺乳動物、特にヒトから採取した血液、組織、臓器等のサンプル）またはかかるＣＸＣＲ４タンパク質の１つを含むと思われる任意のサンプル（例えば、必要に応じて形質転換された、細胞サンプル）に関するということを述べておく必要がある。
前記抗体、またはその機能的断片は、検出可能および／または定量化可能なシグナルを得るためのイムノコンジュゲートまたは標識抗体の形態であり得る。
本発明の標識抗体、またはその機能的もしくは断片としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸脱水素酵素またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素とあるいはビオチン、ジゴキシゲニンまたは５−ブロモ−デオキシウリジン等の分子と組み合わせることができる抗体コンジュゲート（イムノコンジュゲート）が含まれる。蛍光標識、特にフルオレセインおよびその誘導体、蛍光色素、ローダミンおよびその誘導体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ダンシル、ウンベリフェロン等も、本発明の抗体またはその機能的断片と組み合わせることができる。そのようなコンジュゲートにおいて、本発明の抗体またはその機能的断片は当業者に公知の方法によって調製することができる。それらは、酵素または蛍光標識と、ポリアルデヒド、グルタルアルデヒド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）等のスペーサー基または連結基を介して直接結合させてもよく、治療のためのコンジュゲートについて上記で述べたような結合剤の存在下で結合させてもよい。フルオレセイン標識を有するコンジュゲートはイソチオシアナートとの反応によって調製することができる。
その他のコンジュゲートとして更に、化学発光標識、例えばルミノールおよびジオキセタン、生物発光標識、例えばルシフェラーゼおよびルシフェリン、または放射性標識、例えばヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネチウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀１０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルル１２１ｍ、テルル１２２ｍ、テルル１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、フッ素１８、イットリウム１９９およびヨウ素１３１が含まれ得る。直接または前述したＥＤＴＡもしくはＤＴＰＡ等のキレート化剤を介してラジオアイソトープと抗体を結合させるための当業者に公知の従来の方法を診断用ラジオアイソトープに用いることができる。そこで、クロラミン−Ｔ法［Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495］による［Ｉ１２５］Ｎａでの標識；Crockford et al.（米国特許第４，４２４，２００号）に記載されているテクネチウム９９ｍでの標識またはHnatowich（米国特許第４，４７９，９３０号）に記載されているＤＴＰＡを介した結合を挙げておくべきであろう。
バイオマーカーとしての本発明の抗体の使用も開示される。方法は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する種々の過剰増殖発がん性障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、限定されるものではないが例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、皮膚癌、食道癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、結腸直腸癌、骨肉腫、神経芽細胞腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、腎癌、膠芽腫、甲状腺癌、横紋筋肉腫、またはＣＸＣＲ４の発現に関連する任意のその他のがんを検出または診断するために用いられ得る。当業者に理解されるように、特定の障害に関連する抗体発現レベルは予め存在する状態の性質および／または重症度に応じて異なる。
当業者に公知の従来の方法のいずれかにおける本発明の抗体の投与（例えば局所、非経口、筋肉内等）は、サンプル中の異形成細胞を検出する非常に有用な方法であって、ＣＸＣＲ４の発現に関連するまたは仲介される過剰増殖障害の治療を受けている患者の治療計画を臨床医がモニタリングすることを可能にする方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害をインビボでイメージングするための医薬組成物であって、インビボでＣＸＣＲ４に結合する標識された上記モノクローナル抗体またはその断片と薬学的に許容されるキャリアとを含んでなる医薬組成物に関する。
本発明の抗体またはその機能的断片もしくは誘導体は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する種々の病態の検出、診断、およびステージ分類を含む種々の医学的目的または研究目的に有用であろう。
ステージの決定は、潜在的な予後的価値（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ）があり、最適な治療法をデザインする基準を提供する［Simpson et al. J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)］。一般的に、例えば乳癌の病理学的ステージ分類は臨床的ステージ分類よりも正確な予後が分かるため好ましい。しかし、臨床的ステージ分類は、病理学的評価のための組織を得る侵襲的手技に依存しないので、病理学的ステージ分類と同程度に正確であるなら、臨床的ステージ分類が好ましい。
好適な標識または他の適切な検出可能な生体分子もしくは化学物質と共に使用される場合、本発明の抗体はインビトロおよびインビボでの診断および予後予測への応用に特に有用である。
イムノアッセイで使用するための標識は一般に当業者に公知であり、酵素、ラジオアイソトープ、ならびに蛍光性、発光性および発色性の物質、例えば着色された粒子、例えばコロイド金またはラテックスビーズが含まれる。好適なイムノアッセイには酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。様々な種類の標識および本発明の抗体に標識をコンジュゲートする方法が当業者に周知であり、例えば以下に記載するものがある。
本明細書において、「ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、障害に罹患している対象における高レベルまたは異常に低いレベルのＣＸＣＲ４（異常）の存在が障害の病態生理であるか障害の悪化に寄与する因子であることが示されているまたは疑われている疾患および他の障害を含むことが意図される。あるいは、そのような障害は、例えば、障害に罹患している対象の冒された細胞または組織の細胞表面上におけるＣＸＣＲ４レベルの増加によって示され得る。ＣＸＣＲ４レベルの増加は、例えば、本発明の抗体５１５Ｈ７またはｈｚ５１５Ｈ７を用いて検出され得る。更に、比較的自律的な成長を示す細胞を指し、それらは細胞増殖制御の有意な消失を特徴とする異常な成長の表現型を示す。あるいは、細胞は、正常レベルのＣＸＣＲ４を発現し得るが、異常な増殖によって特徴付けられる。
特定の実施形態では、ＣＸＣＲ４に関連する場合の「増加した発現」とは、（ＲＮＡ発現またはタンパク質発現による測定で）対照と比べて統計的に有意な発現の増加を示すタンパク質または遺伝子発現レベルを指す。
より具体的には、ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害をインビトロで診断するためまたはＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害、例えばＣＸＣＲ４の発現に関連するがんの発症についての予後をインビトロで決定するための、前述の本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体の使用が考えられる。
本発明に係る別の広い態様は、対象におけるＣＸＣＲ４の発現に関連する病的状態への感受性または病的過剰増殖発がん性障害を診断する方法であって、サンプル中のＣＸＣＲ４を有する細胞の有無を決定することおよび前記ＣＸＣＲ４を有する細胞の有無に基づいて病的状態または状的状態への感受性を診断することを含んでなる方法に関する。本発明の抗体の診断における使用は、原発性腫瘍、がん転移、がん幹細胞を含んでなる。抗体は、検出可能且つ／または定量可能なシグナルが得られるようなイムノコンジュゲートの形態または標識抗体の形態で存在し得る。
より具体的には、本発明に係る好ましい主題は、対象においてＣＸＣＲ４を発現する腫瘍の存在および／または位置をインビトロで検出する方法であって、前記方法が、（ａ）本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体に対象由来のサンプルを接触させ。かつ（ｂ）前記抗体とサンプルとの結合を検出することを含んでなる方法である。この主題の別の態様は、臨床試験中、より具体的にはＣＸＣＲ４受容体のダウンレギュレーションおよびまたは分解が被験化合物の作用機序の一部である時の、ＣＸＣＲ４標的療法に対する応答としてのＣＸＣＲ４発現の追跡である。
当業者に明らかなように、本発明の抗体の結合の検出は種々のアッセイにより示され得る。アッセイを行うための任意の手段を本発明と共に用いることができるが、例としてＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＩＨＣを挙げることができる。
本明細書において、「サンプル」という用語は、新生物細胞を含むまたは含むと思われる結腸、胃、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、皮膚、甲状腺、リンパ節、骨髄または他の臓器もしくは組織の細胞等の新生物細胞を含むまたは含み得る、任意の生体液、細胞、組織、臓器、またはその一部を意味することが意図される。この用語は、個体中に存在するサンプルおよび個体から得られたまたは個体に由来するサンプルを含む。例えば、サンプルは、生検によって得られた検体の組織切片または組織培養に入れたもしくは適応させた細胞であり得る。サンプルは更に、細胞成分画分もしくは抽出物、または粗もしくは実質的に純粋な核酸分子もしくはタンパク質標品であり得る。
臨床サンプルは、対象から得られ且つ例えばＣＸＣＲ４発現レベルを決定または検出する診断検査またはモニタリング検査等の本発明の方法に有用である様々な種類のサンプルを包含することが意図される。この定義は、外科的切除によって得られた固体組織サンプル、病理標本、保存サンプル、または生検標本、組織培養またはそれに由来する細胞およびその子孫、ならびにこれらの供給源のいずれかから調製された切片またはスメアを包含する。非限定的な例として、結腸、胃、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、皮膚、甲状腺、リンパ節、骨髄等から得られたサンプルが挙げられる。この定義はまた、生体起源の液体サンプルを包含し、その中に懸濁されている細胞もしくは細胞断片または液体培地およびその溶質のいずれかを指し得る。
本発明に係る別の態様は、対象から得られたＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現レベルをインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（ａ’）本発明に係る抗体またはその機能的断片もしくは誘導体に対象から得られたサンプルを接触させ、かつ（ｂ’）前記サンプルにおけるＣＸＣＲ４への抗体結合レベルを定量化することを含んでなる方法に関する。
当業者に明らかなように、ＣＸＣＲ４への抗体結合レベルは、いくつかの方法で、例えば種々のアッセイによって、定量化され得る。アッセイを行うための任意の手段を本発明と一緒に用いることができるが、好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ法に基づくか、免疫蛍光法によるか、免疫組織化学またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術または同等の技術による、免疫酵素的方法を利用する。
好ましくは、生体サンプルは生体液、例えば血清、全血、細胞、組織サンプルまたはヒト起源の生検試料で形成される。サンプルは、例えば、ＣＸＣＲ４の発現に関連する病的過剰増殖発がん性障害の存在について好都合にアッセイすることができる生検された組織を含み得る。
被験サンプル中に存在するＣＸＣＲ４の量が決定されたら、その結果を、ＣＸＣＲ４の発現に関連する過剰増殖発がん性障害を有さない個体から被験サンプルと同様にして得た対照サンプルのものと比較することができる。ＣＸＣＲ４レベルが被験サンプルで有意に上昇している場合、それが由来する対象が前記疾患を有するまたは発症する可能性が高くなっていると結論付けることができる。
本発明は、より具体的には、対象におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍をインビトロで診断する方法またはＣＸＣＲ４発現腫瘍の発症についての予後をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（ｉ）上記ＣＸＣＲ４の発現レベルを決定する工程；および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを正常組織またはＣＸＣＲ４を発現しない組織のＣＸＣＲ４参照発現レベルと比較する工程、を含んでなる方法に関する。
本願において、疾患を「診断する」とは、例えば、ＣＸＣＲ４の発現に関連するまたは仲介される病的過剰増殖発がん性障害の存在を診断または検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、およびＣＸＣＲ４の発現に関連する障害を示す細胞またはサンプルを同定または検出することを含むことが意図される。
本願において、「予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」とは、疾患から回復する可能性または推定される疾患の発症もしくは転帰（ｏｕｔｃｏｍｅ）の予測を意味する。例えば、対象から得られたサンプルが本発明の抗体を用いた染色に陽性であった場合、その対象の「予後」は、サンプルがＣＸＣＲ４染色に陰性であった場合よりも良い。サンプルは、以下で更に詳細に説明されるように適切なスケールに基づいてＣＸＣＲ４発現レベルについてスコア化され得る。
しかし、本発明の別の態様は更に、その作用機序の１つとしてＣＸＣＲ４の分解を誘導する治療化合物のためにＣＸＣＲ４発現をモニタリングすることに関する。その場合、細胞膜上でのＣＸＣＲ４発現の追跡が臨床試験および「テーラーメイド」治療中の処置の有効性を評価する重要なツールとなり得る。
ＣＸＣＲ４発現レベルは、好ましくは、「参照レベル」または「参照発現レベル」ともいう対照の細胞またはサンプルにおけるレベルに関連して比較または測定される。「参照レベル」、「参照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は本明細書で同義で使用されている。大まかに言うと、「対照レベル」は、疾患またはがんを一般的に有さない比較可能な対照細胞で測定される別個のベースラインレベルを意味する。これは同じ個体から得られてもよく、病気サンプルもしくは被験サンプルを得た個体と同じ疾患を有さないまたは正常な別の個体から得られてもよい。本発明の文脈で、「参照レベル」という用語は、患者のがん細胞を含むサンプルにおけるＣＸＣＲ４の発現の試験レベルを評価するために用いられる、ＣＸＣＲ４の発現の「対照レベル」を指す。例えば、患者の生体サンプルにおけるＣＸＣＲ４レベルがＣＸＣＲ４の参照レベルより高い場合、細胞はＣＸＣＲ４の発現が高レベルまたは過剰であると見なされる。参照レベルは複数の方法によって決定することができる。したがって、発現レベルは、ＣＸＣＲ４発現細胞の数に依存せずにＣＸＣＲ４を有する細胞またはＣＸＣＲ４発現レベルを定義し得る。したがって、各患者の参照レベルは、本明細書に記載の参照レベルを決定するための方法のいずれかによって決定することができるＣＸＣＲ４の参照比によって定めることができる。
例えば、対照は、種々の形態を取り得る所定の値であり得る。それは中央値または平均値等の単一のカットオフ値であり得る。「参照レベル」は、全ての患者に個々に等しく適用可能な単一の数値であってもよく、具体的な患者小集団に応じて異なってもよい。したがって、例えば、同じがんに対して年長の男性の参照レベルが若い男性と異なることがあり、同じがんに対して女性の参照レベルが男性と異なることがあり得る。あるいは、「参照レベル」は、試験する新生物細胞の組織と同じ組織から得た非発がん性がん細胞におけるＣＸＣＲ４発現レベルを測定することによって決定されてもよい。また、「参照レベル」は、患者の新生物細胞におけるＣＸＣＲ４と同じ患者の非腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ４レベルとの特定の比率であり得る。「参照レベル」はまた、腫瘍細胞をシミュレートするようにマニピュレートされ得るまたは参照レベルを正確に決定する発現レベルが得られる任意のその他の様式でマニピュレートされ得るインビトロ培養細胞のＣＸＣＲ４レベルであり得る。一方、「参照レベル」は、ＣＸＣＲ４レベルが上昇していない群中およびＣＸＣＲ４レベルが上昇している群中等、同等な群に基づいて確立されてもよい。比較可能な群の別の例は、特定の疾患、状態または症状を有する群および疾患のない群である。所定の値は、例えば、被験集団を、低リスク群、中リスク群、高リスク群等の群に、あるいは第１四分位または第１五分位が最もリスクの低いもしくはＣＸＣＲ４の量が最も多い個体となり、第４四分位または第５五分位が最もリスクが高いもしくはＣＸＣＲ４の量が最も少ない個体となる四分位または五分位に均等（または不均等）に分けられるように調整され得る。
参照レベルはまた、同じがんを有する患者の集団におけるＣＸＣＲ４レベルの比較によっても決定され得る。これは、例えば、患者の全コホートがグラフィカルに表され、第１軸がＣＸＣＲ４レベルを表し、第２軸がコホート中で腫瘍細胞が所定のレベルのＣＸＣＲ４を発現する患者の数を表す、ヒストグラム分析によって達成され得る。ＣＸＣＲ４が同じまたは同様なレベルのコホートの亜集団集団を特定することにより、２以上の別個の患者群を決定することができる。次いで、これらの別個の群が最も良く区別されるレベルに基づいて参照レベルを決定することができる。参照レベルは、１つがＣＸＣＲ４である２種以上のマーカーのレベルを表してもよい。２種以上のマーカーは例えば各マーカーレベルの値の比率によって表され得る。
同様に、健康と思われる集団は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する状態を有することが知られている集団とは異なる「正常」範囲を有する。したがって、選択される所定の値は、個体が分類されるカテゴリーを考慮したものであり得る。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者による日常的な実験によって選択することができる。「上昇」「増加」とは、選択された対照と比べて高いことを意味する。通常、対照は、適切な年齢範囲の健康で正常と思われる個体に基づく。
また、本発明に係る対照は、所定の値に加えて、実験材料と並行して試験される材料のサンプルであり得ると理解される。例としては、同じ対象から同時に得られた組織または細胞、例えば対象から得られた１つの生検試料の一部または１つの細胞サンプルの一部が含まれる。
ＣＸＣＲ４仲介疾患の患者の臨床診断またはモニタリングでは、正常対象または非がん組織から得た対応する生検サンプルにおけるレベルと比較したＣＸＣＲ４発現細胞の検出またはＣＸＣＲ４レベルの増加により、一般的に、ＣＸＣＲ４仲介障害を有するまたは有することが疑われる患者が示される。
上記に基づいて、本発明は、組織サンプルにおけるＣＸＣＲ４発現レベルを検出することを含んでなり、その存在ががんへの感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を示し、ＣＸＣＲ４発現の程度が感受性の程度に相関する、がんへの感受性を予測する方法を提供する。したがって、具体的な実施形態では、乳房組織、卵巣組織、前立腺組織、膵臓組織、皮膚組織、食道組織、肺組織、頭頸部組織、膀胱組織、結腸直腸組織、骨肉腫組織、神経芽細胞腫組織、急性リンパ性白血病細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、慢性リンパ性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、腎臓組織、膠芽腫組織、甲状腺組織、横紋筋肉腫組織、またはＣＸＣＲ４を発現する細胞が疑われる任意の他の組織におけるＣＸＣＲ４の発現が検査され、サンプル中のＣＸＣＲ４の存在により、がん感受性または組織特異的腫瘍の出現もしくは存在の兆候が示される。
腫瘍の攻撃性を評価する方法も提供される。一実施形態では、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察する方法が、腫瘍サンプル中の細胞によって発現されるＣＸＣＲ４のレベルを決定すること、そのようにして決定されたレベルを、同じ個体から異なる時点に採った同等な組織サンプルにおいて発現されるＣＸＣＲ４のレベルと比較することを含んでなり、腫瘍サンプルにおける経時的なＣＸＣＲ４発現の程度からがんの進行についての情報が得られる。
更に別の実施形態では、本願は、対象に適した治療プロトコールを決定する方法を提供する。
本発明に係るＣＸＣＲ４の有無またはＣＸＣＲ４レベルの変化は、対象が再発性、進行性、または持続性のＣＸＣＲ４に関連するがんを有しやすいことを示し得る。したがって、ＣＸＣＲ４を発現する細胞数の増加または種々の組織もしくは細胞に存在するＣＸＣＲ４濃度の変化を測定することにより、ＣＸＣＲ４に関連する悪性腫瘍を改善するための特定の治療計画が有効であるかどうかを決定することができる。
本発明の別の主題は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する発がん性障害のインビボでのイメージング法である。例えば、そのような方法は、発がん性障害の症状を呈する患者に用いることができる。例えば患者のＣＸＣＲ４発現レベルが増加している場合、患者はがん性障害に罹りやすい。また、この方法は、ＣＸＣＲ４によって仲介されるがんを過去に診断された患者における進行および／または治療への反応をモニタリングするのに有用であり得る。上記目的に基づいて、本発明は、好ましくは標識された、特に放射性標識された、本発明に係る抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体、を含んでなるインビボイメージング試薬および医学的イメージングにおけるその使用を提供する。したがって、本発明に係る一般的な方法は、前述の標識されたモノクローナル抗体等のイメージング有効量のイメージング試薬および薬学的に有効なキャリアを患者に投与し、その後、サンプル中に存在するＣＸＣＲ４に薬剤が結合した後に薬剤を検出することによって作用する。特定の実施形態では、方法は、ターゲティング部分および活性部分を含んでなるイメージング有効量のイメージング剤を投与することによって作用する。イメージング剤は、ヒト等の哺乳動物における診断使用に有効な量で投与され、その後、イメージング剤の局在および蓄積が検出される。イメージング剤の局在および蓄積は、放射性核種のイメージング、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、陽電子放射断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、Ｘ線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出によって検出され得る。
標的化された抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術を用いた診断は、受容体発現レベルに関するｉｎ ｓｉｔｕ情報を提供するので、そのような治療に必要な受容体発現レベルに基づいて治療に感受性である患者を選択することを可能にする。
モノクローナル抗体を用いた免疫療法では、ヒト化抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体トラスツズマブが出現して乳癌におけるＨｅｒ２過剰発現の決定が現在臨床的に重要であるトラスツズマブを用いた治療と同様に、治療に対する反応は標的受容体発現レベルに依存する。トラスツズマブはＨｅｒ２過剰発現がん細胞を特異的にターゲティングすることによって作用するので、トラスツズマブを用いた治療にはＨｅｒ２過剰発現を示すことが必須である。Ｈｅｒ２の正確な検査は、高価で潜在的に毒性であるトラスツズマブ治療を非過剰発現腫瘍患者に与えないことおよびトラスツズマブの恩恵を受け得る全患者が適切な治療を受けるようにすることを目的としている。
Ｈｅｒ２を過剰発現した患者の選択に関するトラスツズマブを用いた教示で、モノクローナル抗体を用いた治療法を用いる時に受容体の発現レベルを決定することおよび治療用のモノクローナル抗体と同時に患者の選択に用いることができるモノクローナル抗体を開発することの利点が示された。
したがって、本発明は、対象の腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定する方法であって、前記方法が、（１）上記ＣＸＣＲ４の発現レベルを決定する工程、（２）前記腫瘍をＣＸＣＲ４発現についてスコア化する工程、および（３）前記スコア化を対照サンプルから得られたものと比較する工程、を含んでなる方法に関する。
本発明の意味における「ＣＸＣＲ４状態」とは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、染色体ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、遺伝子チップまたは当業者に公知のその他の方法等の任意の方法によって測定されるＣＸＣＲ４遺伝子発現レベルの決定に基づいたＣＸＣＲ４陽性［ＣＸＣＲ４（＋）］、ＣＸＣＲ４陰性［ＣＸＣＲ４（−）］クラスへの腫瘍の分類に関する。
好ましい実施形態では、診断のための抗体は、組織サンプルがホルマリン固定、Ｇｌｙｃｏ−ｆｉｘｘ固定、パラフィン包埋および／または凍結された時に標的受容体に結合できなければならない。
より具体的には、ＣＸＣＲ４発現レベルは免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定される。
例えば、サンプルは抗体染色のレベル０〜３＋のスケールでＣＸＣＲ４発現レベルについてスコア化され得、ここで、半定量的な４段階の強度増加で０は陰性、１＋〜３＋は陽性の染色を表す。各陽性スコアはスコア０（陰性）と比べて再発および致死性の疾患のリスクの有意な低下に関連し得るので、スコア１＋〜３＋は陽性として記録することができるが、陽性スコア間の強度増加は更なるリスク低下を示し得る。ＣＸＣＲ４の予後的価値を評価するために任意の従来のハザード分析法が用いられ得る。代表的な分析法としては、打切り例存在下での生存または時間と事象のデータをモデル化するためのセミパラメトリックな方法であるコックス比例分析（Hosmer and Lemeshow, 1999；Cox, 1972）が含まれる。他の生存分析、例えば生命表またはカプラン・マイヤー法と異なり、コックスはモデルに予測変数（共変数）を含めることができる。従来の分析法、例えばコックスを用いて、原発性腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現状態と疾患再発の発生までの時間（無症候生存時間または転移疾患までの時間）または疾患による死亡までの時間（全生存時間）のいずれかとの相関に関する仮説を調べることが可能であり得る。コックス比例分析は、コックス比例ハザード分析としても知られる。この方法は、患者生存時間に対する腫瘍マーカーの予後的価値を試験するための標準的方法である。多変量モードで用いた時、複数の共変数の影響が並行して試験され、その結果、独立した予後的価値を有する個々の共変数、すなわち最も有用なマーカーを同定することができる。腫瘍の陽性または陰性の「ＣＸＣＲ４状態」、［ＣＸＣＲ４（＋）またはＣＸＣＲ４（−）ともいう］という用語はそれぞれスコア０またはスコア１＋〜３＋を指す。
サンプルは乳癌の診断またはモニタリング中に「スコア化」され得る。最も簡単な形態では、スコア化は、免疫組織化学によるサンプルの視覚検査によって判定されるカテゴリー的な陰性または陽性であり得る。より定量的なスコア化では、染色強度およびサンプル採取された染色（「陽性」）細胞の割合の２つのパラメーターを判定する。これら２つのパラメーターに基づいて、陽性染色の増加が反映されるように数値が割り当てられ得る。Allred et al（Allred, Harvey et al. 1998）は、これを達成する方法の１つを記載しており、その方法では、０（陰性）〜３＋のスケールで両パラメーターをスコア化し、個々のパラメーターのスコアを全体スコアへと集計する。これにより、可能なスコアが０、２、３、４、５、６、７または８であるスケールが得られる（Allredのスケールではスコア１は可能でないことに注意されたい）。それより幾分簡単なスコア化方法では、核染色の強度および染色された核を示す細胞の割合をまとめて０〜３＋の複合スケールにする。いずれのスコア化方法も、細胞核中の活性化されたＳｔａｔ５の染色の強度および割合のスコア化に適用され得る。本明細書で使用される腫瘍の陽性または陰性の「ＣＸＣＲ４状態」という用語は、簡略化したスケールでそれぞれスコア０または１＋〜３＋に対応するＣＸＣＲ４の発現レベルを指す。
一般的に、本発明に係る試験またはアッセイの結果は、種々のフォーマットのいずれで示されてもよい。結果は定性的な様式で示されてもよい。例えば、試験報告で、特定のポリペプチドが検出されたかどうかだけが、おそらくは検出限界と共に、示されてよい。結果は、半定量的様式で示されてもよい。例えば、種々の範囲が定義され得、この範囲に、ある程度の定量的情報を与えるスコア（例えば１＋〜３＋）が割り当てられてよい。そのようなスコアは、種々のファクター、例えばＣＸＣＲ４が検出される細胞の数、シグナルの強度（ＣＸＣＲ４の発現レベルまたはＣＸＣＲ４を有する細胞を示し得る）等を反映し得る。結果は、定量的様式、例えばポリペプチド（ＣＸＣＲ４）が検出される細胞のパーセンテージやタンパク質濃度等として示されてもよい。当業者に理解されるように、試験によって得られる結果の種類は、ポリペプチドの検出に関連する試験の技術的限界および生物学的意義に応じて変わり得る。例えば、特定のポリペプチドの場合、完全に定性的な結果（例えば特定の検出レベルでポリペプチドが検出されるかどうか）によって意義のある情報が得られる。より定量的な結果（例えば、正常レベルに対する被験サンプル中のポリペプチド発現レベルの比率）が必要な場合もある。
より好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４発現レベルのスコア化は、反応生成物の強度および陽性細胞のパーセンテージの評価に基づいて０〜３＋に段階評価される。更に分かり易いように、これらのパラメーターを以下の表５に要約する。浸潤腫瘍の完全に膜の周囲における反応性のみを考慮すべきであり、これは見た目が「チキンワイヤー」に似ていることが多かった。今回の指針では、ＩＨＣでＣＸＣＲ４のボーダーライン（２＋以上のスコア）としてスコア化されたサンプルは、ＣＸＣＲ４（＋）と見なす必要があり、更なる評価が必要である。もしも、限定されるものではないが、対照が予想された通りでない場合、サンプルのほとんどにアーチファクトの影響がある場合、および正常な乳管（内部対照）のサンプルが膜における強い陽性を示す（過剰な抗原検出を示唆する）場合、ＩＨＣ分析を不適とし、繰り返すか、ＦＩＳＣＨまたは任意の他の方法で試験すべきである。
Figure 2013523106
本発明に係る方法のより好ましい実施形態では、前記スコア化は、染色の強度および陽性細胞のパーセンテージの２つのパラメーターに基づく適切なスケールの使用を含んでなる。
好ましい実施形態では、本発明に係る方法の適切なスケールは、腫瘍細胞の膜反応性（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）なしが０にスコア化され、１０％を超える腫瘍細胞での強く完全な反応性が３＋にスコア化される、０〜３＋のスケールである。
より具体的には、前述のように、前記適切なスケールは、腫瘍細胞の膜反応性なしが０にスコア化され；１０％を超える腫瘍細胞におけるかすかに知覚可能な膜反応性が１＋にスコア化され、１０％を超える腫瘍細胞における弱〜中程度の完全な膜反応性が２＋にスコア化され；１０％を超える腫瘍細胞における強力で完全な反応性が３＋にスコア化される、０〜３のスケールである。
本発明の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが２＋のＣＸＣＲ４（＋）である。
本発明の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが３＋のＣＸＣＲ４（＋）である。
本発明の別の特定の態様によれば、腫瘍はスコアが２＋または３＋のＣＸＣＲ４（＋）である。
本発明によれば、本発明は更に、発がん性障害が抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する方法であって、前記方法が、（ａ）前述したように対象の腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定する工程および（ｂ）状態がＣＸＣＲ４（＋）であった場合に、発がん性障害が抗ＣＸＣＲ４抗体またはその断片もしくは誘導体を用いた治療に感受性であるかどうかを決定する工程、を含んでなる方法に関する。
本発明の別の態様によれば、本発明の抗体を含んでなる、そのような診断または予後予測方法に有用なキットも考えられる。
便利なように、パッケージ化された所定量の試薬の組合せと診断アッセイを実施するための説明書、例えばキットも本発明の範囲内である。キットは、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットでＣＸＣＲ４をインビトロで検出および定量化するための抗体を含む。本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいてＣＸＣＲ４をインビトロで検出および定量化するためのキット中に提供され得る。抗体が酵素で標識される場合、キットは、酵素に要求される基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆物質）を含む。更に、安定化剤、バッファー（例えばブロックバッファーまたは溶解バッファー）等のその他の添加剤も含まれ得る。そのようなキットは、バイアル、チューブ等の１または複数の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を収納するように区画化された収納容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）を含んでなってもよく、そのような容器に本発明の別個の構成要素が収容される。例えば、１つの容器には、不溶性または一部可溶性のキャリアに結合した第１の抗体が含まれ得る。第２の容器には、凍結乾燥された形態または溶液の形態で、可溶性で検出可能な標識された第２の抗体が含まれ得る。収納容器は、凍結乾燥形態または溶液形態の検出可能な標識された第３の抗体を収容する第３の容器を含んでもよい。このような性質のキットは、本発明のサンドイッチアッセイにおいて使用することができる。ラベルまたは添付文書により、組成物の説明および意図されるインビトロまたは診断で使用するための指示が提供され得る。
種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液濃度が得られるように大きく異なってよい。特に、試薬は、溶解されて適切な濃度の試薬溶液を提供する補形剤を含む、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。
本発明の更に別の態様によれば、本明細書中に詳述されているモノクローナル抗体またはその結合断片は、検出可能な部分で標識されて提供され、前述の抗原を有する細胞を診断または同定するための例えばキット中にパッケージ化されて使用されてよい。そのような標識の非限定的な例としては、フルオレセインイソチオシアネート等のフルオロフォア；発色団、放射性核種、または酵素が含まれる。そのような標識された抗体または結合断片は、例えば、抗原の組織学的局在、ＥＬＩＳＡ、セルソーティング、ならびにＣＸＣＲ４およびこの抗原を有する細胞を検出または定量化するその他の免疫学的技術に用いられ得る。
アポトーシスアッセイ、細胞からのＣＸＣＲ４の精製または免疫沈降のための陽性対照として有用なキットも提供される。ＣＸＣＲ４を単離および精製するために、キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）にカップリングした本明細書に記載の抗体またはその抗体結合断片を含んでよい。ＣＸＣＲ４をインビトロ（例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロット）で検出および定量化するための抗体を含むキットが提供され得る。製造物と共に、キットは、容器と、容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含んでなる。容器は、少なくとも１つの本発明の抗ＣＸＣＲ４抗体またはその結合断片を含んでなる組成物を収容する。例えば希釈剤およびバッファー、対照抗体を含む更なる容器を含めてもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明および意図されるインビトロまたは診断での使用のための指示を提供し得る。
より具体的には、本発明は、当業者に公知の任意の方法により腫瘍のＣＸＣＲ４状態を決定するためのキットに関する。好ましい実施形態では、実施例に記載されるように、本発明は、ＩＨＣの方法により腫瘍のＣＸＣＲ４状態を決定するためのキットに関する。
特定の実施形態では、本発明は、前述した少なくとも１つの抗ＣＸＣＲ４抗体またはその機能的断片もしくは誘導体を含んでなるキットにあり、前記抗体は好ましくは標識されている。
例えば前述の標識の使用を初めとする任意の標識方法が当業者によって用いられ得ると理解されなければならない。
好ましい実施形態では、対象におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置をインビトロで検出するのに有用な本発明に係るキットは、前記抗ＣＸＣＲ４抗体とＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬を更に含んでなる。
別の好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現レベルをインビトロで決定するのに有用な本発明のキットは、前記標識抗体とＣＸＣＲ４との間の結合レベルを定量化するのに有用な試薬を更に含んでなる。
更に別の実施形態では、腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定するのに有用な本発明に係るキットは、
ｉ）前記標識抗体とＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するのに有用な試薬；および
ｉｉ）ＣＸＣＲ４発現レベルをスコア化するのに有用な陽性および陰性対照サンプル
を更に含んでなる。
腫瘍のＣＸＣＲ４状態をインビトロで決定するための前記キットは、マウス抗体に特異的なポリクローナル抗体を更に含んでなってよく、好ましくはマウス抗体に特異的な前記ポリクローナル抗体は標識されている。
本発明は更に、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する細胞へと生物学的活性化合物を特異的にターゲティングするための薬物の製造における本発明に係る抗体の使用に関する。
本明細書において、「生物学的活性化合物」とは、細胞活性、特に成長、増殖、転写および遺伝子翻訳を調節、特に阻害できる任意の化合物である。
本発明は更に、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明に係る抗体またはその機能的断片で構成されるインビボ診断試薬および医学的イメージングにおける、特にＣＸＣＲ４の細胞発現または過剰発現に関連するがんを検出するための、その使用に関する。
本発明は更に、薬物として用いられる、本発明に係る組合せ物としての組成物または抗ＣＸＣＲ４／毒素コンジュゲートもしくはラジオアイソトープに関する。
好ましくは、組合せ物としての前記組成物または前記コンジュゲートに補形剤および／または薬学的賦形剤が添加される。
本明細書において、「薬学的賦形剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｖｅｈｉｃｌｅ）」とは、二次的な反応を生じさせずに、例えば活性化合物の投与を容易にするか、生物中でのその寿命および／または有効性を増加させるか、溶液中での溶解性を上昇させるか、保存性を高める、医薬組成物に入れられる化合物または化合物の組合せを意味する。そのような薬学的キャリアは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与経路に応じて当業者により適応される。
好ましくは、そのような化合物は、全身経路によって、特に静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下または経口経路によって投与される。より好ましくは、本発明に係る抗体で構成される組成物は、等間隔で時間を空けて複数回に分けて投与される。
それらの投与経路、投薬スケジュールおよび最適な生薬形態は、患者に適した治療を確立する時に一般的に考慮される基準、例えば患者の年齢または体重、全身状態の重症度、治療に対する許容度および副作用歴等に基づいて決定することができる。
したがって、本発明は、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する細胞に生物学的活性化合物を特異的にターゲティングするための薬物製造における抗体、またはその機能的断片の１つ、の使用に関する。
既に示されているように、本発明に係るＣＸＣＲ４ Ｍａｂは、がんの治療において強力な活性を有するので、がんを治療するためのＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗腫瘍薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。これらのアッセイの最初の工程では、ＣＸＣＲ４発現細胞を本発明の抗体とインキュベートし、その後、抗体結合を阻害する能力について分子を評価することができる。この種のアッセイに用いられる細胞はトランスフェクトされた細胞系、例えばＣＨＯ−ＣＸＣＲ４、ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４、またはＣＸＣＲ４でトランスフェクトされたヒト細胞系、例えばＵ３７３−ＭＡＧＩ−ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ４を発現するヒト細胞系、例えばＮＡＬＭ６または初代細胞、例えばＰＢＭＣであり得る。ＣＸＣＲ４発現細胞上での抗体結合を阻害するＣＸＣＲ４のアンタゴニストをスクリーニングするために用いられる方法は、Zhao Q. et al. (AIDS Research And Human Retroviruses, 2003, 19, pp947-955)に記載されている細胞ベースの競合的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはJuarez J. et al. (Leukemia 2003, 17, ppl294-1300)に記載されているような蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いたプロトコールであり得る。
したがって、本発明の特定の態様によれば、
ａ）ＣＸＣＲ４を発現する細胞を選択する工程；
ｂ）前記細胞を、本発明の抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、とインキュベートする工程；
ｃ）抗体、またはその機能的断片もしくは誘導体の１つ、とＣＸＣＲ４との結合を阻害する能力について、被験分子を評価する工程；および
ｄ）前記阻害が可能な分子を選択する工程
を含んでなる、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗腫瘍薬剤として分子をスクリーニングおよび／または同定する方法が考えられる。
実施例および上記にレジェンドを示した図を用いた説明中で本発明のその他の特徴および利点が更に明らかになる。
実施例１：癌細胞におけるＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の発現
−Ｑ−ＰＣＲ分析：
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、種々のがん細胞系におけるＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２の相対的発現を定量化した。
ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉまたはＭｉｄｉ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（キアゲン社、フランス）を用いて種々の細胞系からＲＮＡサンプルを抽出した。次いで、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ自動電気泳動システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、フランス）を用いてＲＮＡサンプルを制御し、良好な品質／完全性であることを示した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社、フランス）を用いて１μｇの各ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ鋳型に変換した。ＣＸＣＲ２にはＴａｑＭａｎプローブ、ＣＸＣＲ４にはＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎを用いて、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡレベルを定量化した。サンプルを比較するためには標準化が必要であるので、内部参照ＲＰＬ０を含めた。ＴａｑＭａｎプローブ（ＣＸＣＲ２に使用）は５’ＦＡＭレポーター標識および３’ＴＡＭＲＡ消光基を有する。５０℃で２分間および９５℃で１０分間加熱することによりＰＣＲ酵素を活性化した。５μｌのｃＤＮＡ鋳型（１／２０希釈）、１×ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社、米国ニュージャージー州ブランチバーグ）、５０〜９００ｎＭの各プライマー、および５０〜１００ｎＭのプローブを含む合計体積５０μｌのＰＣＲミックス中において９５℃で１５秒間および６２℃で１分間を４０または４５サイクル行う２工程の手順を用いた。全ての反応はｉＣｙｃｌｅ機（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて行った。Ｑ−ＰＣＲはサイクル閾値（Ｃｔ）を決定することができる。Ｃｔ値が小さいほど、被験遺伝子の発現が多い。ヒトリボソームタンパク質である大きなＰ０用のプライマーおよびプローブには、
フォワードプライマー：５’−ＧＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号６３）；
リバースプライマー：５’−ＡＧＧＡＣＴＣＧＴＴＴＧＴＡＣＣＣＧＴＴＧＡ−３’（配列番号６４）；
プローブ：５−（ＦＡＭ）−ＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号６５）
を用いた。
ヒトＣＸＣＲ４（ケモカイン受容体４）用のプライマーには、
フォワードプライマー：５’−ＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣ−３’（配列番号６６）；
リバースプライマー：５’−ＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号６７）
を用いた。
ヒトＣＸＣＲ２（ケモカイン受容体２）用のプライマーおよびプローブには、
フォワードプライマー：５’−ＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣＣＴＧＧ−３’（配列番号６８）；
リバースプライマー：５’−ＣＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ−３’（配列番号６９）；
プローブ：５’−（ＦＡＭ）−ＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡ−（ＴＡＭＲＡ）−３’（配列番号７０）
を用いた。
本発明者らの比較実験では、２つの遺伝子［被験遺伝子（ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２）およびＲＰＬ０］の発現を、被験細胞系および参照細胞系の２つの異なるサンプルで定量化した。参照細胞系は、定量化する遺伝子の発現が最も少ない細胞系に相当する。遺伝子発現の比較計算は以下の式を用いてなされた：
相対遺伝子発現＝（１＋Ｅ遺伝子）−ΔＣｔ（１）／（１＋ＥＲＰＬ０）−ΔＣｔ（２）
Ｅ遺伝子＝定量化する遺伝子のプライマー／プローブを用いたＰＣＲ効率
ＥＲＰＬ０＝ＲＰＬ０プライマー／プローブを用いたＰＣＲ効率
Ｃｔ＝閾値サイクル
ΔＣｔ（１）＝Ｃｔ遺伝子（被験細胞系）−Ｃｔ遺伝子（参照細胞系）
ΔＣｔ（２）＝ＣｔＲＰＬ０（被験細胞系）−ＣｔＲＰＬ０（参照細胞系）
一連のＰＣＲそれぞれについて、相対的な遺伝子定量値を計算し、がん細胞系を、その発現レベルを考慮して、最も多い群から陰性の群へと分類した。全データを図１Ａおよび１Ｂに示す。ＣＸＣＲ２の場合のＤＵ１４５およびＵ−８７ＭＧを除いて、試験した全てのがん細胞系がＣＸＣＲ４（図１Ａ）およびＣＸＣＲ２（図１Ｂ）を発現していた。
−ＦＡＣＳ分析：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３およびＵ９３７がん細胞系に透過処理を行い、その後、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体［４４７１７（Ｒ＆Ｄシステムズ社）対そのアイソタイプ対照ＩｇＧ２ｂ（シグマ社）］または１０μｇ／ｍＬの抗ＣＸＣＲ２モノクローナル抗体（抗ｈ−ＣＸＣＲ２、クローン４８３１１、Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｍａｂ ３３１対そのアイソタイプ対照ＩｇＧ２ａ）のいずれかとインキュベートした。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で細胞を洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ標識された二次抗体を細胞に添加し、４℃で２０分間インキュベートした。その後、細胞を再度２回洗浄した。２回目の洗浄後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合実験の結果を図２に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ３、Ｕ９３７等の腫瘍細胞はＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２タンパク質の両方を発現していた。
実施例２：ヒトＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製
ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を作製するために、組換えＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞ならびに／またはＣＸＣＲ４の細胞外のＮ末端およびループに相当するペプチドでＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。最初の免疫化後に６〜１６週齢のマウスを、フロイント完全アジュバント中で抗原を用いて皮下（ｓ．ｃ．）に一度免疫化し、その後、フロイント不完全アジュバント中で抗原を用いて皮下に２〜６回免疫化を行った。眼窩後出血によって免疫応答をモニタリングした。ＥＬＩＳＡで血清をスクリーニングし（後述）、抗ＣＸＣＲ４抗体の力価が高いマウスを融合に用いた。屠殺して脾臓を取り出す２日前にマウスの静脈内に抗原の追加免疫を行った。
−ＥＬＩＳＡ
抗ＣＸＣＲ４抗体を産生するマウスを選択するために、免疫化したマウスから得られた血清をＥＬＩＳＡで調べた。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、５μｇ等量ペプチド／ｍＬでＢＳＡにコンジュゲートされた精製［１−４１］Ｎ末端ペプチドでコーティングし、１００μＬ／ウェル、４℃で一晩インキュベートした後、２５０μＬ／ウェルの０．５％ゼラチンを含むＰＢＳでブロッキングした。ＣＸＣＲ４免疫化マウスの血漿希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン・ラボラトリーズ社）と３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質でプレートを発色させ、１００μＬ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加することで５分後に反応を停止させた。最も大きな力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を作ったマウスを抗体作製に用いた。
−ＣＸＣＲ４に対するＭａｂを産生するハイブリドーマの作製
最も力価が大きい抗ＣＸＣＲ４抗体を作ったＢａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾細胞を、ＰＥＧを用いてマウス骨髄腫細胞系Ｓｐ２／０と融合させた。細胞を約１×１０５／ウェルでマイクロタイタープレートにプレーティングした後、ｕｌｔｒａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ＋２ｍＭ Ｌ−グルタミン＋１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム＋１×ＨＡＴを含む選択培地中で２週間インキュベートした。次いで、抗ＣＸＣＲ４モノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡでウェルをスクリーニングした。次いで、抗体を分泌するハイブリドーマを、限界希釈により少なくとも２回サブクローニングし、インビトロで培養して抗体を作製し、更に分析した。
実施例３：抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７の結合特異性およびがん細胞系認識のＦＡＣＳによる特徴解析
本実験では、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４への特異的結合をＦＡＣＳ分析によって調べた。
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｌａおよびＵ９３７がん細胞系を、１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体５１５Ｈ７と一緒にインキュベートした。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で細胞を洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ標識二次抗体を細胞に添加し、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度２回洗浄した。２回目の洗浄後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合実験の結果を以下の表６に示す。表は、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系に特異的に結合したが、元のＮＩＨ３Ｔ３細胞上では認識がなかったこと［ＦＡＣＳで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示している。このＭａｂは、ヒトがん細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｕ９３７前骨髄球がん細胞およびＨｅｌａ子宮頸癌細胞も認識することができた。
抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７は、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４形質移入体を認識したが、元のＮＩＨ３Ｔ３野生型細胞は認識しなかった。Ｍａｂ ５１５Ｈ７はがん細胞系も認識することができた。
Figure 2013523106
実施例４：ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜における［ １２５ Ｉ］ＳＤＦ−１と抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７の競合結合
このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトＣＸＣＲ４受容体への放射標識［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の結合に５１５Ｈ７ Ｍａｂが競合する能力を評価することができる。
ヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列（参照配列ＮＭ＿００３４６７）を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）をトランスフェクションすることにより、ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。完全培養培地［５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５００μｇ／ｍｌのジェネテシンを添加したＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２］中で細胞を増殖させた。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中でＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞を機械的に破砕した後、遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１（比活性：１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜（３０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＢＳＡ １％］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、放射性リガンド（１ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。２５℃で１時間後に結合平衡に達した。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。１０μＭの非標識ＳＤＦ−１存在下で非特異的結合を推定した。
非標識ＳＤＦ−１は、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合を用量依存的に阻害し、ｐＫｉ値（ＩＣ５０＝特異的［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合を５０％阻害するリガンド濃度）は７．７５±０．２７ｎＭ（ｎ＝４）であった（図３Ａ）。同じ実験条件下で、５１５Ｈ７（１００ｎＭ）は、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合と効率的に競合した（［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の阻害率：６４±３％）（図３Ｂ）。
実施例５：抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７による、野生型ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜における［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能的アッセイでは、野生型ヒトＣＸＣＲ４受容体を介したＧタンパク質の活性化ならびにＣＸＣＲ４リガンドおよび５１５Ｈ７ Ｍａｂによるその調節をモニタリングすることができる。
ＣＨＯ−Ｋ１についての上記実施例と同様にして、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を得た。完全培養培地［１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、２μ 重炭酸ナトリウムを添加したＥＭＥＭ］中でＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）細胞を増殖させた。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を行った。ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＧＤＰ ３μΜ、ＭｇＣｌ２ ｌ０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１または興味のあるＭａｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。結合反応は、２５℃で１時間行った。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。チェン・プルソフの等式：
ＫＢ＝［アンタゴニスト濃度］／｛（ＥＣ５０’／ＥＣ５０）−１｝
（式中、ＥＣ５０およびＥＣ５０’はそれぞれｍＡｂ非存在下および存在下でのＳＤＦ−１の効力である）
を用いてアンタゴニストの効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を計算した。
ＳＤＦ−１は、ＣＸＣＲ４受容体によるＧタンパク質活性化により、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の用量依存的増加を誘導した。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の最大刺激は、ＨｅＬａおよびＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞膜で、基底の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合に対してそれぞれ１６７％および３２０％である。ＳＤＦ−１の効力は、どちらの細胞系でも同様であり、４１．３±９．７ｎＭに相当した（図４）。これらの実験条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞中で決定された５１５Ｈ７ Ｍａｂのアンタゴニストとしての効力は１５ｎＭであった。ＨｅＬａ細胞でも同様なアンタゴニストの効果が観察された（図５）。
実施例６：ＣＸＣＲ４と種々の相互作用パートナーとの会合：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対する５１５Ｈ７ Ｍａｂの影響
この機能的アッセイでは、ＣＸＣＲ４受容体へのＳＤＦ−１および／または５１５Ｈ７Ｍａｂの結合によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン２シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。
従来の分子生物学的技術を用いて、調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを対応する色素（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ実験を行う２日前に、対応するＢＲＥＴパートナーをコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトした：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ２のヘテロ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２：ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４に仲介されるβアレスチン２のリクルートの研究には［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋β−ａｒｒ２：ＹＦＰ］。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を５％ＣＯ２、３７℃で培養した。次いで、１ウェル当たり２００μｌのＤＭＥＭを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。ＢＲＥＴ実験直前に、ＤＭＥＭを除き、すぐに細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のＰＢＳ中で３７℃にて１０分間細胞をインキュベートし、その後、３００ｎＭのＳＤＦ−１とまたはＳＤＦ−１なしで、５μＭのセレンテラジンＨを添加して最終体積を５０μｌにした。３７℃で更に１０分間インキュベートした後、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光取得（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（ベルトールド社）を用いて開始した（１ｓ／波長／ウェルで、室温にて１５回反復）。
ＢＲＥＴ比の計算は以前に記載されているように行った（Angers et al., 2000）：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ実験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞での（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この等式を簡単にすることにより、ＢＲＥＴ比が、Ｒｌｕｃに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比５３０／４８５ｎｍによって補正された、２つのＢＲＥＴパートナーが存在する時に得られる比５３０／４８５ｎｍに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表す：ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものに相当する。
ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体に融合したアダプタータンパク質とアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約２０％増加させた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図６Ａ）。興味深いことに、ＳＤＦ１（３００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ２およびＣＸＣＲ４に融合したアダプタータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約２４％減少させた。このことは、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図６Ｂ）。この後者の場合、ＳＤＦ−１によって活性化されるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２のコンホメーションはＢＲＥＴエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、５１５Ｈ７ Ｍａｂは、ＳＤＦ−１によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができ（ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴの増加を６９％阻害、図６Ａ）、また、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体形成のコンホメーション変化も調節することができた（５１５Ｈ７は、ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴの減少を９０％阻害、図６Ｂ）。５１５Ｈ７ Ｍａｂは更に、単独で、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４の空間的近接をそれぞれ調節することができた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対する５１５Ｈ７ Ｍａｂの影響を示している（図６Ａおよび６Ｂ）。
ＳＤＦ−１（３００ｎＭ）によるＣＸＣＲ４活性化により、２３３％のＢＲＥＴシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた（図６Ｃ）。このリクルートは５１５Ｈ７ Ｍａｂによって一部阻害され（約９５％、図６Ｃ）、シグナル伝達に対するＭａｂ ５１５Ｈ７の影響が示された。
実施例７：ＣＸＣＲ４によって仲介されるｃＡＭＰ産生の阻害
この機能的アッセイは、阻害性Ｇｉ／ｏタンパク質を介してアデニル酸シクラーゼレベルでＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。
ｃＡＭＰ ＬＡＮＣＥ法（パーキンエルマー社）を供給業者に説明されているように用いた。簡潔に述べると、前述したように、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を得、増殖させた。トリプシンを含まない薬剤ベルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）を用いて細胞を回収し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ結合抗ｃＡＭＰ Ｍａｂ（１００倍希釈）および化合物（フォルスコリン、ＳＤＦ−１および／または５１５Ｈ７ Ｍａｂ）を含む溶液中に１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。室温で３０分間インキュベートした後、ユウロピウム−ストレプトアビジン（１／１２５希釈）複合体およびビオチン−ｃＡＭＰ（１／１２５希釈）複合体を含む検出液（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、得られたＦＲＥＴシグナルを、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（ベルトールド社）マルチラベルリーダーで測定した。データは、任意の蛍光値としてまたはＦＫの影響を引いた後のＳＤＦ−１応答に対する相対刺激として表される。
フォルスコリン（ＦＫ）は、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞中で約０．３μＭの効力でｃＡＭＰ産生を用量依存的に刺激した（図７Ａ）。ＳＤＦ−１共存在下では、ＣＸＣＲ４受容体による阻害性Ｇｉ／ｏタンパク質の活性化の結果として細胞内ｃＡＭＰレベルが減少した。ＳＤＦ−１の効力は、５．０±３．１ｎＭであった（図７Ａ）。５１５Ｈ７ Ｍａｂは、フォルスコリンに刺激されるＳＤＦ−１（１００ｎＭ）の効果を８０％超効率的に阻害した（図７Ｂ）。
実施例８：Ｍａｂ ５１５Ｈ７による、構成的活性型変異体Ａｓｎ １１９ Ｓｅｒ ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜での［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能的アッセイでは、構成的活性型変異体（ＣＡＭ）Ａｓｎ１１９Ｓｅｒ ＣＸＣＲ４受容体を介したＧタンパク質活性化をモニタリングすることができる（Zhang et al., 2002参照）。この高感度アッセイでは、ＣＸＣＲ４リガンドをその固有の活性に基づいて識別することができる（部分アゴニスト、サイレントアンタゴニストまたはインバースアゴニスト）。Zhangらによって以前に報告されているように、ＡＭＤ３１００またはＴ１４０等のＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＡＭ ＣＸＣＲ４受容体でそれぞれ部分アゴニストおよびインバースアゴニストとして振る舞う。サイレントアンタゴニストの同定は、このクラスの分子が活性状態および不活性状態の両方のＣＸＣＲ４に対して同様な親和性を示さなければならないため、困難であり得る（Wurch et al., 1999）。
従来の分子生物学的技術を用いてＣＸＣＲ４受容体のコード配列中にＡｓｎ１１９Ｓｅｒの変異を導入した（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット、ストラタジーン社、米国）。上記実施例と同様にして、ＣＡＭ ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を行った。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取込みは、ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＧＤＰ ３μΜ、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ７．４］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。結合反応は２５℃で１時間行った。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）で放射線数を測定した。
ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）は、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を１３０％刺激した。インバースアゴニストＴ１４０は、基底の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合およびＳＤＦ−１刺激［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の両方を阻害した（それぞれ−１７％および−１５９％）。対照的に、５１５Ｈ７ Ｍａｂは、ＣＡＭ ＣＸＣＲ４でサイレントアンタゴニストとして振る舞い、基底の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は変化させなかった（図８）が、ＳＤＦ−１誘導［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は阻害した（図８）。
実施例９：ＳＤＦ−１によって誘導されるＵ９３７細胞遊走に対する抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７の影響
遊走プロセスに対する抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体５１５Ｈ７の阻害効果を評価するために、２％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中の１０００００個のＵ−９３７細胞を遊走チャンバーの上側チャンバー（２４ウェルプレート、細孔径８μｍ）にプレーティングし、ウェルの下部にＳＤＦ−１が存在するものと存在しないもの、上側チャンバー中にはＭａｂ ５１５Ｈ７が存在するものと存在しないものを用意した。この試験では、マウスＩｇＧ２ｂをアイソタイプ対照として導入した。プレーティングの２時間後に遊走細胞を数える。図９に示す結果から、予想された通り、ＳＤＦ−１がＵ−９３７細胞遊走の有意な増加を誘導できることが示された。細胞をＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照とインキュベートした時には影響は観察されなかった。一方、５１５Ｈ７ Ｍａｂとインキュベートした細胞では、８０％を超える、ＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の有意且つ再現可能な減少が観察された。
実施例１０：抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７による、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍成長の阻害
これらの実験の目的は、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７がＮｏｄ／ＳＣＩＤマウスにおけるＭＤＢ−ＭＢ−２３１異種移植片の成長を阻害する能力を評価することである。
ＥＣＡＣＣから入手したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社、英国スコットランド）、１０％ＦＣＳ（シグマ社、米国メリーランド州セントルイス）でルーチンに培養した。細胞が対数増殖期になるように、移植の４８時間前に細胞を分割した。ＰＢＳ中の１０００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を７週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウス（チャールス・リバー社、フランス）に移植した。移植の５日後に、腫瘍は測定可能であり（３４ｍｍ３＜Ｖ３＜４０ｍｍ３）、腫瘍のサイズが同等なマウス６頭の群にマウスを分けた。マウス１頭当たり２ｍｇの負荷量のＭａｂ ５１５Ｈ７でマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）治療した。
その後、０．５ｍｇ／用量（ｄｏｓｅ）／マウスのＭａｂ ５１５Ｈ７を週２回、週３回、マウスに注射した。対照群としてＰＢＳ群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。マン・ホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。
これらの実験で、治療期間中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比べて、０．５ｍｇ／用量の５１５Ｈ７で、Ｄ７とＤ３９の間に腫瘍成長の有意な阻害があり（ｐ≦０．００２）、Ｍａｂ ５１５Ｈ７では治療５週間後の平均腫瘍体積がＰＢＳに対して５０％減少していた（図１０）。
実施例１１：ＣＸＣＲ４受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員
この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激によるＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。
上記実施例と同様にして、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺癌）およびＵ９３７（ヒト白血病）細胞を、完全培養培地、それぞれ［１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ］および［１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／ｌ グルコースを添加したＲＰＭＩ １６４０］中で増殖させた。全ての種類の細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で黒色９６ＭＷプレートの適切な培養培地中にプレーティングした。実験を行う前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素（Ｆｌｕｏ−４ Ｎｏ Ｗａｓｈ、インビトロジェン社、米国）を含むローディングバッファー［ＨＢＳＳ １×、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、プロベニシド酸 ２５ｍＭ］を３７℃で３０分間、その後２５℃で３０分間ローディングした。各ウェルに直接注入することでＳＤＦ−１による刺激を行った。拮抗作用の実験では、ＳＤＦ−１の少なくとも１０分前に１０μｌのＭａｂ溶液をローディングバッファ−に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（ベルトールド社）を用いて動的蛍光測定を行った：励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ、励起エネルギー１００００任意単位。ＳＤＦ−１注入の前２０秒間にわたり、１秒毎に０．１秒間、各ウェルの蛍光を記録した（基底シグナル）。次いで、２０μｌのＳＤＦ−１を注入し、続いて、２分間にわたってデータを記録した。各実験条件は２連で（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行った。基底の蛍光および細胞を含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正する。ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表した。
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は組換えＣＨＯ／ＣＸＣＲ４において細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導したが、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞では蛍光シグナルが検出されなかった。最大強度は基底の蛍光に対して１６０％超にまで達し、ＳＤＦ−１刺激後約３０秒で観察された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＵ−９３７の両方で、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）による最大蛍光強度は低め（基底に対して１３０〜１４０％）であるが、同様な動的曲線（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）が観察された（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ）。５１５Ｈ７抗体（１３３ｎＭ）は、調べた３つの細胞系の全てにおいて、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって誘導されるカルシウムシグナルを強力且つほとんど完全に阻害した。
実施例１２：Ｕ９３７マウス生存モデルにおける抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７の活性
ＡＴＣＣから得たＵ９３７細胞をＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン中で培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の２日前に細胞を分けた。１０００万個のＵ９３７細胞を雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した。移植の２日後、マウスを、２ｍｇの５１５Ｈ７Ｍａｂ／マウスの負荷量で、次いで１ｍｇの抗体／マウスで週２回、皮下（ｓ．ｃ．）処置した。ＰＢＳを注射されたマウスとマウスＩｇＧアイソタイプ対照を投与されたマウスの間で生存率に差が観察されないことが以前の研究で示されているので、対照マウスにはＰＢＳを注射した。マウスの生存は毎日モニタリングした。
図１２の結果は、５１５Ｈ７ Ｍａｂで処置されたマウスで劇的且つ有意に寿命が増加し、５１５Ｈ７ ＭａｂではＴ／Ｃ％が約２８０であることを示している（図１２）。
実施例１３：抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７による、Ｎｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＴ細胞ＫＡＲＰＡＳ ２９９異種移植腫瘍成長の阻害
本実験の目的は、抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ５１５Ｈ７がＮｏｄ／ＳｃｉｄマウスにおけるＫＡＲＰＡＳ ２９９異種移植片の成長を阻害する能力を評価することである。
ＥＣＡＣＣから得たＫＡＲＰＡＳ ２９９細胞を、ＲＰＭＩ培地、１％Ｌ−Ｇｌｕおよび１０％ＦＣＳ（シグマ社、米国メリーランド州セントルイス）中でルーチンに培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の４８時間前に細胞を分けた。ＰＢＳ中の５００万個のＫＡＲＰＡＳ ２９９細胞を７週齢のＮｏｄ／Ｓｃｉｄマウス（チャールス・リバー社、フランス）に移植した。移植の５日後、腫瘍は測定可能であり（３２ｍｍ３＜Ｖ３＜４９ｍｍ３）、腫瘍のサイズが同等なマウス６頭の群にマウスを分けた。マウス１頭当たり２ｍｇの負荷量のＭａｂ ５１５Ｈ７でマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。
その後、１ｍｇ／用量（ｄｏｓｅ）／マウスのＭａｂ ５１５Ｈ７を週２回、マウスに注射した。対照群としてＰＢＳ群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。マン・ホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。
これらの実験で、処置期間中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比べて、１ｍｇ／用量の５１５Ｈ７ ＭａｂではＤ７とＤ３３の間に腫瘍成長の有意な阻害があり（ｐ≦０．００２）、処置５週間後の平均腫瘍体積がＭａｂ ５１５Ｈ７ではＰＢＳに対して６３％減少していた（図１３）。
実施例１４：抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７の産生
マウス５１５Ｈ７ Ｍａｂのキメラ形態をデザインした：これは、ヒトのＣκおよびＩｇＧ１定常ドメインに遺伝的に融合させた目的のマウス抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインに相当する。ＨＥＫ２９３／ＥＢＮＡシステムとｐＣＥＰ４発現ベクター（インビトロジェン社、米国）を用いた一過性のトランスフェクションによって組換えＭａｂを産生した。
５１５Ｈ７ Ｍａｂ軽鎖および重鎖の可変ドメインに対応する全ヌクレオチド配列を網羅的遺伝子合成（ジーンクラスト社（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ）、ルクセンブルク）によって合成した。これらを、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの軽鎖（Ｃκ）または重鎖（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のいずれかの定常ドメインの全コード配列を有するｐＣＥＰベクター（インビトロジェン社、米国）にサブクローニングした。全てのクロニーング工程は、実験マニュアル（Sambrook and Russel, 2001）に記載されているように従来の分子生物学的技術に従っておよび供給業者の取扱説明書に従って行った。各遺伝子コンストラクトを、Ｂｉｇ Ｄｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社、米国）を用いたヌクレオチドシークエンシングで完全に検証し、３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社、米国）を用いて分析した。
懸濁液に適応させたＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞（インビトロジェン社、米国）を、オービタルシェーカーを用いて、６ｍＭのグルタミンを添加した５０ｍｌの無血清培地Ｅｘｃｅｌｌ ２９３（ＳＡＦＣバイオサイエンス社）を入れた２５０ｍｌフラスコ中でルーチンに成長させた（回転速度１１０ｒｐｍ）。終濃度１ｍｇ／ｍｌで水中に混合して調製した２５ｋＤａの線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ））およびプラスミドＤＮＡ（重鎖と軽鎖のプラスミド比１：１で終濃度１．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、２．１０６細胞／ｍｌで一過性のトランスフェクションを行った。トランスフェクションの４時間後、等体積の新鮮な培養培地で培養液を希釈して最終細胞密度を１０６細胞／ｍｌとした。細胞生存率およびＭａｂ産生に基づいて培養プロセスをモニタリングした。典型的には、培養は４〜５日間維持した。プロテインＡ樹脂（ＧＥヘルスケア社、米国）を用いた従来のクロマトグラフィー法でＭａｂを精製した。Ｍａｂは機能的評価に適したレベルで産生された。産生レベルは一般に、精製Ｍａｂで６〜１５ｍｇ／ｌである。
実施例１５：抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７の結合特異性およびがん細胞系認識のＦＡＣＳ分析による特徴解析
本実験では、ヒトＣＸＣＲ４への抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７の特異的結合をＦＡＣＳ分析によって調べた。
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞系を、１０μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ｃ５１５Ｈ７と一緒にインキュベートした。次いで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で細胞を洗浄した。次に、Ａｌｅｘａ標識二次抗体を細胞に添加し、４℃で２０分間インキュベートした。次いで、細胞を再度２回洗浄した。２回目の洗浄後、ＦＡＣＳ分析を行った。これらの結合実験の結果を以下の表７に示す。表は、抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系に特異的に結合し、ヒトがん細胞系、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞も認識すること［ＦＡＣＳで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示している。
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実施例１６：ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜における抗ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７と［ １２５ Ｉ］ＳＤＦ−１の競合結合
このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトＣＸＣＲ４受容体への放射標識［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の結合に対してマウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７が競合する能力を評価することができる。
ヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列（参照配列ＮＭ＿００３４６７）を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）をトランスフェクションすることにより、ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。完全培養培地［５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５００μｇ／ｍｌのジェネテシンを添加したＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２］中で細胞を増殖させた。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中でＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞を機械的に破砕した後、遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１（比活性：１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の結合を行った。簡潔に述べると、細胞膜（３０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＢＳＡ １％］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、放射性リガンド（１ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。２５℃で１時間後に結合平衡に達した。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。１０μＭの非標識ＳＤＦ−１存在下で非特異的（ＮＳ）結合を推定した。
抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ（１００ｎＭ）は、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合と効率的に競合し、競合効果（［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の阻害率）は以下の順番であった：ｍ５１５Ｈ７（６２±１０％）およびｃ５１５Ｈ７（５５±４％）（図１４）。
実施例１７：抗ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７による、野生型ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜における［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能的アッセイでは、野生型ヒトＣＸＣＲ４受容体を介したＧタンパク質の活性化ならびに抗ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７によるその調節をモニタリングすることができる。
ＣＨＯ−Ｋ１についての上記実施例と同様にして、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を得た。完全培養培地［１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン、２μＭ 重炭酸ナトリウムを添加したＥＭＥＭ］中でＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）細胞を増殖させた。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を行った。ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＧＤＰ ３μΜ、ＭｇＣｌ２ ｌ０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１および興味のあるＭａｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。結合反応は２５℃で１時間行った。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。各ＭａｂについてＩＣ５０を計算した。
これらの実験条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞中で決定されたｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｃ５１５Ｈ７ ＭａｂのＩＣ５０はそれぞれ１．９ｎＭおよび１．５ｎＭであった（図１５）。同じ実験条件でＨｅＬａ細胞を用いて決定されたｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｃ５１５Ｈ７ ＭａｂのＩＣ５０はそれぞれ０．２ｎＭおよび０．６ｎＭであった（図１６）。
実施例１８：ＣＸＣＲ４と種々の相互作用パートナーとの会合：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対するマウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ ５１５Ｈ７の影響
この機能的アッセイでは、ＣＸＣＲ４受容体へのＳＤＦ−１ならびに／またはｍ５１５Ｈ７マウスＭａｂおよびｃ５１５Ｈ７キメラＭａｂの結合によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン２シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。
調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを、従来の分子生物学的技術を用いて、対応する色素（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ実験を行う２日前に、対応するＢＲＥＴパートナーをコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトした：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ２のヘテロ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２−ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４に仲介されるβアレスチン２のリクルートの研究には［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋β−ａｒｒ２−ＹＦＰ］。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を５％ＣＯ２、３７℃で培養した。次いで、１ウェル当たり２００μｌのＤＭＥＭを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。ＢＲＥＴ実験直前に、ＤＭＥＭを除き、すぐに細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のＰＢＳ中で３７℃にて１５分間細胞をインキュベートし、その後、１００ｎＭのＳＤＦ−１とまたはＳＤＦ−１なしで、５μＭのセレンテラジンＨを添加して最終体積を５０μｌにした。３７℃で５分間インキュベートし、ホモおよびヘテロ二量体でのみ室温で更に２０分間インキュベートした後、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光取得（ｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）を、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（ベルトールド社）を用いて開始した（１ｓ／波長／ウェルで、室温にて１５回反復）。
ＢＲＥＴ比の計算は以前に記載されているように行った（Angers et al., 2000）：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ実験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞での（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この等式を簡単にすることにより、ＢＲＥＴ比が、Ｒｌｕｃに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比５３０／４８５ｎｍによって補正された、２つのＢＲＥＴパートナーが存在する時に得られる比５３０／４８５ｎｍに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表す：ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものに相当する。
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約１０％増加させた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図１７Ａ）。興味深いことに、ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約１７％減少させた。このことは、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図１７Ｂ）。この後者の場合、ＳＤＦ−１によって活性化されるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２のコンホメーションはＢＲＥＴエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、ｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂは、ＳＤＦ−１によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができ（ｃ５１５Ｈ７は、ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴの増加を９６％阻害。図１７Ａ）、また、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体形成のコンホメーション変化も調節することができた（ｃ５１５Ｈ７は、ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴの減少を９８％阻害。図１７Ｂ）。ｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂは更に、それらだけで、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４の空間的近接をそれぞれ調節することができた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対するこれらのＭａｂの影響を示している（図１７Ａおよび１７Ｂ）。
ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によるＣＸＣＲ４活性化により、４００％のＢＲＥＴシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた（図１７Ｃ）。このリクルートはｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂによって一部阻害され（約９３％、図１７Ｃ）、シグナル伝達に対するこれらのＭａｂの影響を示している。
実施例１９：ＣＸＣＲ４受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員
この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激によるＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。
上記実施例に記載したように、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。Ｕ９３７（ヒト白血病）細胞を、完全培養培地、それぞれ［１０％ ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ］および［１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／ｌ グルコースを添加したＲＰＭＩ １６４０］中で増殖させた。全ての種類の細胞を、１００，０００細胞／ウェルの密度で黒色９６ＭＷプレートの適切な培養培地中にプレーティングした。実験を行う前に細胞を一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素（Ｆｌｕｏ−４ Ｎｏ Ｗａｓｈ、インビトロジェン社、米国）を含むローディングバッファー［ＨＢＳＳ １×、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、プロベニシド酸 ２５ｍＭ］を３７℃で３０分間、その後２５℃で３０分間ローディングした。各ウェルに直接注入することでＳＤＦ−１による刺激を行った。拮抗作用の実験では、ＳＤＦ−１の少なくとも１０分前に１０μｌのＭａｂ溶液をローディングバッファ−に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（ベルトールド社）を用いて動的蛍光測定を行った：励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ、励起エネルギー１００００任意単位。ＳＤＦ−１注入の前２０秒間にわたり、１秒毎に０．１秒間、各ウェルの蛍光を記録した（基底シグナル）。次いで、２０μｌのＳＤＦ−１を注入し、続いて、２分間にわたってデータを記録した。各実験条件は２連で（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行った。基底の蛍光および細胞を含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正した。ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表した。
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は組換えＣＨＯ／ＣＸＣＲ４において細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導したが、ナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞では蛍光シグナルが検出されなかった。最大強度は基底の蛍光に対して１４０％超にまで達し、ＳＤＦ−１刺激後約４０秒で観察された。Ｕ−９３７細胞でも同様な動的曲線（ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｕｒｖｅ）が観察された（図１８Ａ、１８Ｂ）。キメラ抗体ｃ５１５Ｈ７（１３３ｎＭ）は、調べた両方の細胞系において、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって誘導されるカルシウムシグナルを強力且つほとんど完全に阻害した。
実施例２０：ＳＤＦ−１によって誘導されるＵ９３７細胞遊走に対する抗ＣＸＣＲ４マウスＭａｂ ｍ５１５Ｈ７およびキメラＭａｂ Ｃ５１５Ｈ７の影響
遊走プロセスに対する抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂ ｍ５１５Ｈ７およびｃ５１５Ｈ７の阻害効果を評価するために、２％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中１０００００個のＵ−９３７細胞を遊走チャンバーの上側チャンバー（２４ウェルプレート、細孔径８μｍ）にプレーティングし、ウェルの下部にＳＤＦ−１が存在するものと存在しないもの、上側チャンバー中にＭａｂ ｃ５１５Ｈ７およびｍ５１５Ｈ７が存在するものと存在しないものを用意した。この試験では、マウスＩｇＧ２ｂをアイソタイプ対照として導入した。プレーティングの２時間後に遊走細胞を数えた。図１９に示す結果から、予想されたように、ＳＤＦ−１がＵ−９３７細胞遊走の有意な増加を誘導できることが示された。細胞をＩｇＧ２アイソタイプ対照とインキュベートした時には影響が観察されなかった。一方、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｍ５１５Ｈ７ Ｍａｂとインキュベートした細胞では、ＳＤＦ−１誘導Ｕ９３７細胞遊走の有意且つ再現可能な減少が観察され、この減少はｃ５１５Ｈ７ ＭａｂおよびＭ５１５Ｈ７ Ｍａｂでは約８０％を超えた。
実施例２１：Ｕ９３７マウス生存モデルにおける抗ＣＸＣＲ４キメラＭａｂ ｃ５１５Ｈ７の活性
ＡＴＣＣから得たＵ９３７細胞をＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン中で培養した。細胞が対数増殖期にあるように、移植の２日前に細胞を分けた。１０００万個のＵ９３７細胞を雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。移植の２日後、マウスを、２ｍｇのｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ／マウスの負荷量で、次いで１ｍｇの抗体／マウスで週２回、皮下（ｓ．ｃ．）処置した。ＰＢＳを注射されたマウスとマウスＩｇＧアイソタイプ対照を投与されたマウスの間で生存率に差が観察されないことが以前の研究で示されているので、対照マウスにはＰＢＳを注射した。マウスの生存は毎日モニタリングした。
図２０に示す結果は、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂで処置されたマウスで劇的且つ有意に寿命が増加し、Ｔ／Ｃ％が約１８０であることを示している。
実施例２２：抗ＣＸＣＲ４マウス抗体５１５Ｈ７のヒト化
一般的手順
ＣＤＲ移植の包括的規則を適用して５１５Ｈ７抗ＣＸＣＲ４抗体のヒト化を行った。ＩＭＧＴの固有なナンバリングスキームならびにＭＩＧＴのライブラリーおよびツール（Lefranc, 1997 - www.imgt.org）を応用して、ＣＤＲおよびフレームワーク（ＦＲ）領域の免疫遺伝学的分析および決定を行った。
ＳＤＦ−１に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力について、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体の機能的活性を生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）アッセイで試験することにより、ヒト化プロセスの効率を評価した。このアッセイでは、ＣＸＣＲ４をルシフェラーゼでタグ化し、βアレスチンをＹＦＰでタグ化した。ＳＤＦ−１に仲介されるＣＸＣＲ４へのβアレスチンのリクルートはＣＸＣＲ４のシグナル伝達における重要な工程である。ヒトＣＸＣＲ４で安定にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞系を用いて５１５Ｈ７のヒト化バリアントの結合も決定した。ビオチン化マウス抗体との競合アッセイを用いて結合活性を評価した。第２の試みとして、ＲＡＭＯＳ細胞へのビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害する能力について、ヒト化抗体を評価した。ＲＡＭＯＳ細胞は、ＣＸＣＲ４を多く発現し、ＣＸＣＲ７およびＳＤＦ−１の発現が少ないので選択された。
これらのアッセイを用いて、抗ＣＸＣＲ４抗体の組換えヒト化バージョンの特徴解析を行った。可変ドメインをヒトＩｇＧ１／ｋ定常ドメインと構成し、哺乳動物用発現ベクターｐＣＥＰにクローニングした。組換えＩｇＧ１／κ由来抗体をＨＥＫ２９３細胞中で一時的に発現させた。発現培養上清をろ過し、プロテインＡセファロースを用いて抗体を精製した。精製抗体をＰＢＳバッファー中に再度懸濁し、ＥＬＩＳＡで抗体濃度を求めた。
５１５Ｈ７可変ドメインのヒト化
ＣＤＲ移植に好適なヒト生殖系列を選択するために、マウスの５１５Ｈ７ ＶＨ配列との相同性が最も高いヒト生殖系列遺伝子を同定した。ＩＭＧＴのデータベースおよびツールを利用して、マウス５１５Ｈ７ ＶＨ ＣＤＲのヒトアクセプター配列としてヒトＩＧＨＶ３−４９＊０４生殖系列遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４＊０１ Ｊ生殖系列遺伝子を選択した。ヒトＶ遺伝子ＩＧＨＶ３−４９＊０４は、マウス５１５Ｈ７重鎖可変ドメインのＶ遺伝子に８０．２７％の相同性を有する。ヒトＪ遺伝子ＩＧＨＪ４＊０１ Ｊの相同性は８７．５０％である。選択されたヒト生殖系列遺伝子とマウス抗体５１５Ｈ７のＶＨドメインは、１９残基異なる。元の抗体のＶＨドメインと生殖系列配列とのアラインメントを図２１に示す。
軽鎖可変ドメインに関しては、ヒト生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ４−１＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１を選択した（図２２）。ヒトＶ遺伝子ＩＧＫＶ４−１＊０１との相同性は７９．１２％である。軽鎖の５１５Ｈ７ Ｊ遺伝子はヒトＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１に対して８４．８５％の相同性を有する。
翻訳されたヒト生殖系列遺伝子ＩＧＨＶ３−４９＊０４およびＩＧＫＶ４−１＊０１のアミノ酸配列を用いて、結晶化のなされている相同な抗体を同定した。重鎖では、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋのアクセッション番号１ＭＡＭの抗体をモデルとして選び、軽鎖では、抗体１ＳＢＳを選んだ。コンピュータープログラムＤＳ ｖｉｓｕａｌを用いて２つのドメインを構築し、ヒト化抗体５１５Ｈ７のモデルとして用いた。
元の抗体と対応するヒト生殖系列配列との間で異なる各残基の位置に基づいて、ヒトとマウスの配列間で異なる各残基に優先順位（ｐｒｉｏｒｉｔｙ ｒａｎｋ ｏｒｄｅｒ）を付与した（図２１および２２）。これらの優先度を用いて、各ヒト化可変ドメインの３つの異なるバリアントを作出し、それぞれＶＨ１、ＶＨ２およびＶＨ３と命名した。
最初の一連の実験で、本発明者らは、３つの最初のヒト化バリアントを構築し、その抗ＣＸＣＲ４結合活性を分析した。ＶＨバリアント１（ＶＨ１）をマウスＶＬと組み合わせ、これらのコンストラクトを、ビオチン化した元のマウス５１５Ｈ７抗体の結合を阻害する能力について評価した。全てのコンストラクトで、マウス抗体との競合能は同程度であった（図２３Ａ〜Ｃ）。このことは、最もヒトに近いＶＨバリアントがそれほどヒトに近くないバリアントと同じ結合能力を有することを示している。そこで、ＶＨ１を、ＶＬの３つの異なるバリアントと組み合わせた（図２３Ｄ〜Ｆ）。ＶＨ１とＶＬ３の組合せだけが、ビオチン化マウス抗体と競合する能力の低下を示し、一方、フレームワーク中に逆変位を有さない最もヒトに近いバリアントＶＨ１ ＶＬ１はキメラ抗体と同じ交差ブロック活性を示した。
このバリアントＶＨ１ ＶＬ１を更に、ＳＤＦ−１に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力についてＢＲＥＴアッセイで調べた（図２４）。元の抗体の交差ブロックにより決定された望ましい受容体結合活性にも関わらず、コンストラクトＶＨ１ ＶＬ１はβアレスチンのリクルートの弱い阻害しか示さなかった。この強力な阻害活性の欠如のため、マウス残基でヒトフレームワーク残基を置換する必要がある。ＶＨ１に１つの逆変異を入れた。以下の残基を置換した：Ｖ４８Ｌ、Ｅ６１Ｄ、Ｄ７６ＮおよびＡ８１Ｌ（アミノ酸一次配列に基づいたナンバリング）。バリアントＶＨ１のこれらの逆変異１つの変異体をバリアントＶＬ１と組み合わせた。これらのうち、逆変異Ｄ７６Ｎでのみ、ＢＲＥＴアッセイによる評価で、シグナル伝達の阻害が増加した（図２５Ｂ）。
このコンストラクトの活性を上昇させ、更に他の残基の重要性を評価するために、ＶＨ１について種々の二重逆変異の変異体を構築した。こららのコンストラクトの阻害活性はわずかに向上した（平均約４５〜５０％の阻害）が、十分ではなかった（図２５Ｃ）。次に、逆変異が１つの変異体Ｄ７６Ｎを３つの異なるＶＬバリアントと組み合わせた（図２５Ｄ）。コンストラクトｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２は、キメラ抗体と同じ範囲である平均８８．２％の活性を示した。
バリアントＶＬ１ドメイン中に一重および二重逆変異を構築し、コンストラクトｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２の活性と比較した（図２６）。調べた組合せのいずれも、このコンストラクトと同様なまたはこれより優れた活性を有さなかった。
ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２のフレームワーク中のヒト残基のパーセンテージを計算した：１８０残基中１４個の非ヒト残基を含み、これは９２．２％の＜ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ＞に等しい。比較として、市販のヒト化抗体ベバシズマブおよびトラスツズマブはその可変ドメイン中にそれぞれ３０および１４個の非ヒト残基を含む。
ＳＤＦ−１に仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する効果が最も強かった、最も良い４つのヒト化型を、ビオチン化ＳＤＦ−１の結合を阻害する能力についても試験した（図２７Ａ）。ＳＤＦ−１結合とβアレスチンリクルートの阻害は密接に相関していた。この相関は、ＳＤＦ−１結合の阻害がシグナル伝達阻害の主要な機構である可能性が最も高いことを示している。
ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２バリアントを更にヒト化するために、図２６で評価した二重および三重変異体で得られた情報を用いて、更に３つのバリアントをデザインした。バリアントＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３（ＶＬ２−１、ＶＬ２−２およびＶＬ２−３とも呼ぶ）中でそれぞれ更に４および５個の残基をヒト化した。これらは残基Ｄ９、Ｐ４９、Ｄ６６、Ｓ６９、Ｓ８３、Ｌ８４；Ｖ８９に相当する。ＶＬ２と比較したこれら３つのバリアントのアラインメントを図２８に示す。
これらのＶＬ２バリアントがＳＤＦ−１によって仲介されるβアレスチンのリクルートを阻害する能力を評価した。ヒト化ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ＶＬ２．１、ＶＬ２．２およびＶＬ２．３バリアントはキメラ抗体ｃ５１５Ｈ７と同様な活性を示した（図２６）。
５１５Ｈ７−２可変ドメインのヒト化
別のヒト化型を作製するために、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方についてＣＤＲ移植に別の好適なヒト生殖系列を選択した。これらの両方について、マウス配列との相同性のパーセンテージに関してだけでなく、それらがそれぞれマウス５１５Ｈ７のＶＬおよびＶＨと同じＣＤＲ長を有するように、生殖系列を選択した。
ＩＭＧＴのデータベースおよびツールを用いて、ヒトＩＧＨＶ３−７３＊０１生殖系列遺伝子およびヒトＩＧＨＪ４＊０１Ｊ生殖系列遺伝子を、マウス５１５Ｈ７ ＶＨ ＣＤＲのヒトアクセプター配列として選択した。ヒトＶ遺伝子ＩＧＨＶ３−７３＊０１は、マウス５１５Ｈ７重鎖可変ドメインのＶ遺伝子に対して７９％を超える相同性を有する。ヒトＪ遺伝子ＩＧＨＪ４＊０１Ｊに対する相同性は８７．５０％である。
軽鎖可変ドメインに関して、ヒト生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ２Ｄ−４０＊０１およびＩＧＫＪ１＊０１を選択した。ヒトＶ遺伝子ＩＧＫＶ２Ｄ−４０＊０１との相同性は７０％を超える。軽鎖の５１５Ｈ７のＪ遺伝子はヒトＪ遺伝子ＩＧＫＪ１＊０１に対して８４．８５％の相同性を有する。
元の抗体と対応するヒト生殖系列の配列間で異なる各残基の位置および当業者の知識に基づいて、逆変異する残基として複数の重要な残基を特定した。
重鎖に関して、これらの残基はＨ３５Ｓ、Ｖ４８Ｌ、Ｒ５０Ｆ、Ａ６１Ｄ、Ｄ７６Ｎおよび／またはＡ８１Ｌである（表２ｃの配列番号８６および９０参照）。
軽鎖に関して、これらの残基はＬ９Ｓ、Ｉ２１Ｍ、Ｄ４０Ａ、Ｌ４３Ｑ、Ｙ５９Ａ、Ａ６１Ｄ、Ｄ６６Ａ、Ｓ６９Ｔ、Ｇ７４Ｅ、Ｄ７６Ｙおよび／またはＶ８９Ｌである（表２ｃの配列番号８５および８９参照）。
実施例２３：抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７の結合特異性およびがん細胞系認識のＦＡＣＳ分析による特徴解析
この実験では、抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７のヒトＣＸＣＲ４への特異的結合をＦＡＣＳ分析により調べた。
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞およびＲａｍｏｓ、Ｕ９３４がん細胞系を、０〜１０μｇ／ｍＬのヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７（ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２［＝ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１［＝ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２．１］、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２［＝ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２．２］およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３［＝ｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２．３］）と一緒に、４℃、暗黒下、１００μｌのＦａｃｓバッファー中で２０分間インキュベートした。Ｆａｃｓバッファーで３回洗浄した後、細胞を二次抗体のヤギ抗ヒトＡｌｅｘａ４８８（１／５００希釈）と一緒に、４℃、暗黒化で２０分間インキュベートした。Ｆａｃｓバッファーで３回洗浄した後、各ウェルにヨウ化プロピジウムを添加し、生細胞のみをＦａｃｓで分析した。各条件について蛍光強度の平均値を評価するために少なくとも５０００個の生細胞を評価した。
これらの結合実験の結果を図２９Ａ〜２９Ｃに示す。これらは、抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７が、ヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞系に特異的に結合すること（図２９Ａ）（元のＮＩＨ３Ｔ３細胞ではＭＦＩ＝２．２）ならびにヒトがん細胞系、例えばＵ９３７（図２９Ｂ）およびＲａｍｏｓ（図２９Ｃ）も認識すること［ＦＡＣＳで得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示している。
実施例２４：抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７による、野生型ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞膜における［ ３５ Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の調節
この機能的アッセイでは、野生型ヒトＣＸＣＲ４受容体を介したＧタンパク質の活性化および抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７によるその調節をモニタリングすることができる。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞についての上記実施例と同様にして、野生型ＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を得た。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中で機械的に破砕し、更に遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を行った。ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（比活性：１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取込みおよび検出を行った。簡潔に述べると、細胞膜（１０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ＧＤＰ ３μΜ、ＭｇＣｌ２ ｌ０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ｐＨ＝７．４］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１および興味のあるＭａｂ）、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．２〜０．４ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。結合反応は２５℃で１時間行った。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。各ＭａｂについてＩＣ５０を計算した。
これらの実験条件下で、ＮＩＨ３Ｔ３／ＣＸＣＲ４細胞中で決定されたヒト化（ｈｚ）５１５Ｈ７ ＭａｂのＩＣ５０は、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂが３．８６ｎＭ（図３０Ａ）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−１ Ｍａｂが４．０５ｎＭ（図３０Ｂ）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−２ Ｍａｂが５．１９ｎＭ（図３０Ｃ）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−３ Ｍａｂが８．５ｎＭ（図３０Ｄ）であった。
ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂは、ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって刺激される［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合も阻害することができ、阻害率は、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂが８６％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−１ Ｍａｂが６９％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−２ Ｍａｂが６６％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２−３ Ｍａｂが５８％（図３１）であった。
実施例２５：ＣＸＣＲ４と種々の相互作用パートナーとの会合：生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）法による、ホモおよびヘテロ二量体化、βアレスチンのリクルートならびにこれらの二量体に対するヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７の影響
この機能的アッセイでは、ＣＸＣＲ４受容体へのＳＤＦ−１および／または５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂの結合によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成レベルでのコンホメーション変化ならびにβアレスチン２シグナル伝達タンパク質のリクルートを評価することができる。
従来の分子生物学的技術を用いて、調べる相互作用パートナーのそれぞれの発現ベクターを対応する色素（ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ実験を行う２日前に、対応するＢＲＥＴパートナーをコードする発現ベクターでＨＥＫ２９３細胞を一時的にトランスフェクトした：ＣＸＣＲ４ホモ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４とＣＸＣＲ２のヘテロ二量体化の研究には［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２−ＹＦＰ］、ＣＸＣＲ４に仲介されるβアレスチン２のリクルートの研究には［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋β−ａｒｒ２−ＹＦＰ］。翌日、ポリリジンで予めコーティングされた白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］中に細胞を分注した。プレートに細胞を付着させるために、最初に細胞を５％ＣＯ２、３７℃で培養した。次いで、１ウェル当たり２００μｌのＤＭＥＭを用いて細胞を一晩飢餓状態にした。ＢＲＥＴ実験直前に、ＤＭＥＭを除き、すぐに細胞をＰＢＳで洗浄した。次いで、抗体存在下または非存在下のＰＢＳ中で３７℃にて１５分間細胞をインキュベートし、その後、１００ｎＭのＳＤＦ−１とまたはＳＤＦ−１なしで、５μＭのセレンテラジンＨを添加して最終体積を５０μｌにした。３７℃で５分間インキュベートし、ホモおよびヘテロ二量体でのみ更に室温で２０分間インキュベートした後、Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（ベルトールド社）を用いて４８５ｎｍおよび５３０ｎｍでの発光取得を開始した（１ｓ／波長／ウェルで、室温にて１５回反復）。
ＢＲＥＴ比の計算は以前に記載されているように行った（Angers et al., 2000）：［（発光５３０ｎｍ）−（発光４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（発光４８５ｎｍ）、式中、Ｃｆ＝同じ実験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質のみを発現する細胞の（発光５３０ｎｍ）／（発光４８５ｎｍ）。この等式を簡単にすることにより、ＢＲＥＴ比が、Ｒｌｕｃに融合したパートナーのみがアッセイ中に存在する時に同じ条件下で得られる比５３０／４８５ｎｍによって補正された、２つのＢＲＥＴパートナーが存在する時に得られる比５３０／４８５ｎｍに相当することが示される。読み取り易いように、結果をミリＢＲＥＴ単位（ｍＢＵ）で表す：ｍＢＵはＢＲＥＴ比に１０００を掛けたものに相当する。
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４受容体に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約１２％増加させた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図３２Ａ）。興味深いことに、ＳＤＦ１（１００ｎＭ）は、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２に融合したドナータンパク質およびアクセプタータンパク質の空間的近接により生じるＢＲＥＴシグナルを約１６％減少させた。このことは、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体の形成または予め存在する二量体のコンホメーション変化を示していると考えられる（図３２Ｂ）。この後者の場合、ＳＤＦ−１によって活性化されるＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２のコンホメーションはＢＲＥＴエネルギー移動にあまり好ましくないようである。どちらの場合にも、５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂは、ＳＤＦ−１によって誘導されるＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンホメーション変化を調節することができ、ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴ増加の阻害率は、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２ Ｍａｂが約８８％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．１ Ｍａｂが６５％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．２ Ｍａｂが３３％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．３ Ｍａｂが２１％であり（図３２Ａ）、また、ＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体では、ＳＤＦ−１によって誘導されるＢＲＥＴ減少の阻害率は、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２ Ｍａｂが約１００％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．１ Ｍａｂ、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．２ Ｍａｂおよびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．３ Ｍａｂが５０％であった（図３２Ｂ）。５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂは更に、それらだけで、それぞれＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４の空間的近接を調節することができた。このことは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体のコンホメーションの両方に対するこれらのＭａｂの影響を示している（図３２Ａおよび３２Ｂ）。
ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によるＣＸＣＲ４活性化により、３９０％のＢＲＥＴシグナル増加によって示されるように、細胞内シグナル伝達分子βアレスチンが強くリクルートされた（図３２Ｃ）。このリクルートは５１５Ｈ７ヒト化Ｍａｂによって一部阻害され、阻害はｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２ Ｍａｂで約９４％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．１ Ｍａｂで８１％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．２ Ｍａｂで８２％、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ−ＶＬ２．３ Ｍａｂで７１％であり（図３２Ｃ）、シグナル伝達に対するこれらのＭａｂの影響を示している。
実施例２６：免疫組織化学的研究（ＩＨＣ）
切片を脱パラフィンし、再水和し、熱処理によるエピトープ賦活化（ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために予め９８℃に温めたｐＨ８のＥＤＴＡ中に７分間置いた。トリス緩衝食塩水−０．０５％ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）（ダコ社、Ｓ３００６）で３回洗浄した後、５分間ペルオキシダーゼブロッキング試薬（ダコ社、Ｋ４００７）を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（ＵｌｔｒａＶ ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−ラブビジョン社（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ））中で５分間インキュベートした後、抗ＣＸＣＲ−４マウスモノクローナル抗体（５０μｇ／ｍｌ、クローン５１５Ｈ７、ピエールファーブル社（Ｐｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ））または対照としてのマウスＩｇＧ１／κ（５０μｇ／ｍｌ、Ｘ０９３１、ダコ社）と４℃で一晩インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｄｕａｌ Ｌｉｎｋと室温で１時間インキュベートした。褐色反応産物の発色にジアミノベンジジンを用いた（ダコ社、Ｋ３４６８）。スライドを対比染色のためにヘマトキシリンに４分間浸し（ダコ社、Ｓ３３０９）、ＰＢＳで洗浄した後、Ｆａｒａｍｏｕｎｔ封入剤およびカバースリップ中にマウントした。この免疫組織化学的方法では、褐色反応産物が細胞膜の陽性染色に関連し、褐色反応産物の欠如が陰性染色および細胞膜が可視化されないことに関連する。
抗ＣＸＣＲ４マウスモノクローナル抗体、クローン５１５Ｈ７により、様々な種類の腫瘍の細胞膜が異なるように染色された。５１５Ｈ７の抗腫瘍活性が示された２つの異種移植モデル、ＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９で行った染色を図３３および３４に示した。図３３および３４に示されているように、得られた染色は固定依存的である。実際、膜染色は組織をホルマリン固定した場合の方が弱く（図３４ａおよび３４ｃ）、Ｇｌｙｏ−ｆｉｘｘ（ホルマリンの代替物）を用いた場合に膜染色が有意に増加した（図３３ａおよび３３ｃ）。
実施例２７：ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１膜における［ １２５ Ｉ］ＳＤＦ−１と抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７の競合結合
このアッセイでは、オルソステリックまたはアロステリックな結合部位において、ヒトＣＸＣＲ４受容体への放射標識［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の結合に対してヒト化Ｍａｂ ５１５Ｈ７が競合する能力を評価することができる。
ヒトＣＸＣＲ４受容体の全コード配列（参照配列ＮＭ＿００３４６７）を有する哺乳動物用発現ベクターでナイーブＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）をトランスフェクションすることにより、ヒトＣＸＣＲ４受容体を安定的且つ構成的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を得た。完全培養培地［５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および５００μｇ／ｍｌのジェネテシンを添加したＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２］中で細胞を増殖させた。溶解バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０ｍＭ］中でＣＨＯ／ＣＸＣＲ４細胞を機械的に破砕した後、遠心（１００００ｇ、１５分間）して得られた細胞膜上で、放射性リガンド結合実験を行った。［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の結合（比活性：１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＳＰＡ法（シンチレーション近接アッセイ、ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。簡潔に述べると、細胞膜（３０μｇ／ウェル）を、結合バッファー［Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＢＳＡ １％］中で、評価する化合物（ＳＤＦ−１またはｍＡｂ）、放射性リガンド（１ｎＭ）および最後にＳＰＡ−ＷＧＡ−ＰＶＴビーズ（７．３ｍｇ／ウェル）と一緒にインキュベートした。２５℃で１時間後に結合平衡に達した。遠心［１０００ｇで１０分間］後、シンチレーションカウンター（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、パーキンエルマー社）を用いて放射線数を測定した。１０μＭの非標識ＳＤＦ−１存在下で非特異的（ＮＳ）結合を推定した。
抗ＣＸＣＲ４ Ｍａｂは、［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合と効率的に競合し、競合効果（［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１の阻害率）は以下の順番であった：ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２（７７％）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１（６８％）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２（６１％）およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．３（４９％）（図３５Ａ）。
Ｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂは［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合を用量依存的に阻害し、ＩＣ５０は、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂが１．４４ｎＭ（図３５Ｂ）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１ Ｍａｂが６．６９ｎＭ（図３５Ｃ）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．２ Ｍａｂが５．９１ｎＭであった（図３５Ｄ）。
実施例２８：ＣＸＣＲ４受容体に仲介される細胞内カルシウムストアの動員
この機能的アッセイは、小胞体の細胞内ストアからのカルシウムの遊離を誘導するホスホリパーゼＣ経路の刺激によるＣＸＣＲ４受容体シグナル伝達をモニタリングするようにデザインした。
完全培養培地［１０％ＦＣＳ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１％非必須アミノ酸溶液、１％ピルビン酸ナトリウム、１％Ｌ−グルタミン、４．５ｇ／１ グルコースを添加したＲＰＭＩ １６４０］中でＵ９３７（ヒト白血病）細胞を増殖させた。細胞を１００，０００細胞／ウェルの密度で黒色９６ＭＷプレートの適切な培養培地中にプレーティングし、実験を行う前に一晩飢餓状態にした。細胞に、蛍光カルシウム色素（Ｆｌｕｏ−４ Ｎｏ Ｗａｓｈ、インビトロジェン社、米国）を含むローディングバッファー［ＨＢＳＳ １×、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、プロベニシド酸 ２５ｍＭ］を３７℃で３０分間、その後２５℃で３０分間ローディングした。各ウェルへの直接注入によりＳＤＦ−１による刺激を行った。拮抗作用の実験では、ＳＤＦ−１の少なくとも１０分前に１０μｌのＭａｂ溶液をローディングバッファ−に直接添加した。以下の設定で、マルチモード蛍光マイクロプレートリーダーＭｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０（ベルトールド社）を用いて動的蛍光測定を行った：励起４８５ｎｍ、発光５３５ｎｍ、励起エネルギー１００００任意単位。ＳＤＦ−１注入の前２０秒間にわたり、１秒毎に０．１秒間、各ウェルの蛍光を記録した（基底シグナル）。次いで、２０μｌのＳＤＦ−１を注入し、続いて、２分間にわたってデータを記録した。各実験条件は２連で（ｉｎ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）行った。基底の蛍光および細胞含まない対照ウェルにより発せられた蛍光を引くことにより各ウェルの値を最初に補正する。ＳＤＦ−１に（１００ｎＭ）よって得られた最大刺激に対するパーセンテージとして相対データを表す。
ＳＤＦ１（１００ｎＭ）はＵ９３７細胞中で細胞内カルシウムの急速且つ強力な放出を誘導した。最大強度は基底の蛍光に対して３４０％を超え、ＳＤＦ−１による刺激後約４０秒で観察された。ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂ（１３３ｎＭ）は、Ｕ９３７細胞系においてＳＤＦ−１（１００ｎＭ）によって誘導されるカルシウムシグナルを一部阻害した（図３６、前記Ｍａｂはレジェンド中でｈｚ５１５Ｈ７ＶＬ２とだけ記載されている）。
実施例２９：ＳＤＦ−１によって誘導されるＵ９３７細胞遊走に対する抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７の影響
遊走プロセスに対する抗ＣＸＣＲ４ヒト化Ｍａｂ ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２（ｈｚ５１５Ｈ７と呼ぶ）の阻害効果を評価するために、２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、１０μｇ／ｍｌの抗体と共にＵ９３７細胞を４０分間インキュベートした。合計５×１０４個の細胞を上側のｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバー（コーニング社、米国マサチューセッツ州ローウェル）に入れた。下側チャンバーには、２％ＦＢＳを含む培地に含めてＳＤＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した。細胞播種の２時間後にｔｒａｎｓｗｅｌｌチャンバーから上側チャンバーに遊走した細胞数を数えることにより、Ｕ９３７細胞の遊走を測定した。ＡＴＰの定量化に基づいて培養液中の生細胞数を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標） Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙを用いて遊走した細胞を計数した。
図３７Ａに示した結果から、予想された通り、ＳＤＦ−１がＵ−９３７細胞遊走の有意な増加を誘導できることが実証された。細胞をＩｇＧ１アイソタイプ対照とインキュベートした時には影響は観察されなかった。一方、図３７Ａは、１０μｇ／ｍｌのｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ ＭａｂによるＳＤＦ１誘導Ｕ９３７細胞遊走の阻害を示している。結果は３連（ｉｎ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行った３つの独立した実験の平均±ＳＤを表している。
図３７Ｂは、ＳＤＦ−１誘導細胞遊走に対する様々な量のｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂの効果を示す図である。結果は４つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している（ＩＣ５０＝４．５３ １０−３μｇ／ｍｌ±２．２ １０−３）。
実施例３０：ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２を用いた免疫組織化学的研究（ＩＨＣ）
切片を脱パラフィンし、再水和し、熱処理によるエピトープ賦活化（ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）のために予め９８℃に温めたｐＨ８のＥＤＴＡ中に７分間置いた。トリス緩衝食塩水−０．０５％ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ−Ｔ）（ダコ社、Ｓ３００６）で３回洗浄した後、５分間ペルオキシダーゼブロッキング試薬（ダコ社、Ｋ４００７）を用いて内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（ＵｌｔｒａＶ ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−ラブビジョン社）中で５分間インキュベートした後、ビオチン化されたヒト化抗ＣＸＣＲ４抗体（５０μｇ／ｍｌ、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２、ピエールファーブル社）またはアイソタイプ対照としてのビオチン化されたヒトＩｇＧ１（５０μｇ／ｍｌ、ＢＰ０７８、バインディング・サイト社（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ））と４℃で一晩インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ストレプトアビジンＨＲＰと室温で１時間インキュベートした。褐色反応産物の発色にジアミノベンジジン（ダコ社、Ｋ３４６８）を用いた。スライドを対比染色のためにヘマトキシリンに４分間浸し（ダコ社、Ｓ３３０９）、ＰＢＳで洗浄した後、Ｆａｒａｍｏｕｎｔ封入剤およびカバースリップ中にマウントした。この免疫組織化学的方法では、褐色反応産物が細胞膜の陽性染色に関連し、褐色反応産物の欠如が陰性染色および細胞膜が可視化されないことに関連する。
ビオチン化抗ＣＸＣＲ４ヒト化抗体５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２により、様々な種類の腫瘍の細胞膜が異なるように染色される。図３８および３９に、マウスを５１５Ｈ７で処置した時に抗腫瘍活性が示された２つの異種移植モデルＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９で行った染色を示した。図３８および３９に示されているように、得られた染色は固定依存的である。実際、膜染色は組織をホルマリンで固定した場合の方が弱く（図３９ａおよび３９ｃ）、一方、Ｇｌｙｏ−ｆｉｘｘ（ホルマリンの代替物）を用いた場合に膜染色が有意に増加した（図３８ａおよび３８ｃ）。
実施例３１：ＳｃｉｄマウスにおけるＢ細胞Ｒａｍｏｓ異種移植腫瘍成長に対するキメラ５１５Ｈ７（ｃ５１５Ｈ７）、ヒト化型ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１ Ｍａｂの影響
ＡＴＣＣから入手したＲａｍｏｓ細胞をＲＰＭＩ １６４０培地、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕ（シグマ社、米国メリーランド州セントルイス）中でルーチンに培養した。細胞が対数増殖期になるように、移植の４８時間前に細胞を分けた。７週齢の雌ＳＣＩＤマウス（チャールス・リバー社、フランス）にＰＢＳ中１０００万個のＲａｍｏｓ細胞を皮下（ｓｃ．）移植した。移植の５日後、腫瘍は測定可能であり（平均１００ｍｍ３）、腫瘍のサイズが同等なマウス６頭の群にマウスを分けた。マウス１頭当たり２ｍｇの負荷量のＭａｂ ｃ５１５Ｈ７、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１Ｄ７６Ｎ ＶＬ２またはｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１でマウスを腹腔内（ｉ．ｐ．）処置した。その後、１ｍｇ／用量／マウスのＭａｂ ｃ５１５Ｈ７、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２またはｈｚ５１５Ｈ７ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１を週２回マウスに注射した。対照群としてＰＢＳ群をこの実験に含めた。腫瘍体積を週２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さによって計算した。マン・ホィットニー検定を用いて、各測定で統計解析を行った。
これらの実験で、処置期間中に死亡は観察されなかった。ＰＢＳ群と比べて、１ｍｇ／用量のｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂ（図４０）、ｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２ Ｍａｂ（図４１）およびｈｚ５１５Ｈ７ ＶＨ１ Ｄ７６Ｎ ＶＬ２．１（図４２）で、Ｄ１１とＤ５４の間に腫瘍成長の有意な阻害があり、ｃ５１５Ｈ７ Ｍａｂおよびｈｚ５１５Ｈ７ Ｍａｂでは、処置されたマウスでＰＢＳ群と比べて処置４週間後の平均腫瘍体積が９２％減少していた。

Claims (26)

  1. ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなるＣＤＲを有するヒト化抗体重鎖であって、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３がそれぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなる、ヒト化抗体重鎖。
  2. 配列番号１０、１１、１２、１３、８５または８７からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなる、請求項１に記載のヒト化抗体重鎖。
  3. 配列番号２１、２２、２３、２４、８９または９１からなる群から選択される完全配列を含んでなる、請求項１または２に記載のヒト化抗体重鎖。
  4. ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなるＣＤＲを有するヒト化抗体軽鎖であって、前記ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３がそれぞれ配列番号７、８および９の配列を含んでなる、ヒト化抗体軽鎖。
  5. 配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、８６または８８からなる群から選択される配列の可変領域を含んでなることを特徴とする、請求項４に記載のヒト化抗体軽鎖。
  6. 配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、９０または９２からなる群から選択される完全配列を含んでなることを特徴とする、請求項４または５に記載のヒト化抗体軽鎖。
  7. ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片であって、前記ヒト化抗体が、重鎖および軽鎖を含んでなり、前記重鎖が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３からなるＣＤＲを有し、前記軽鎖が、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３からなるＣＤＲを有し、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３が、それぞれ配列番号４、５および６の配列を含んでなり、前記ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３が、それぞれ配列番号７、８および９の配列を含んでなる、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。
  8. 配列番号１０、１１、１２、１３、８３、８５または８７からなる群から選択される配列の重鎖可変領域および配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、８４、８６または８８からなる群から選択される配列の軽鎖可変領域を含んでなる、請求項７に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。
  9. 配列番号２１、２２、２３、２４、８９または９１からなる群から選択される配列の重鎖および配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、９０または９２からなる群から選択される配列の軽鎖を含んでなる、請求項７または８に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。
  10. 以下からなる群から選択される、請求項７に記載のヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片：
    −配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２７の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１７の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２８の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２２の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号１９の配列の軽鎖可変領域を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２２の配列の重鎖および配列番号３０の配列の軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２３の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２３の配列の重鎖および配列番号２６の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１０の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２１の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１０の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２１の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１１の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２２の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１２の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２３の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号１３の配列の重鎖可変領域および配列番号８８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号２４の配列の重鎖および配列番号９２の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１４の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２５の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１５の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２６の配列の軽鎖を含んでなることを特徴とするヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１６の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２７の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１７の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２８の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１８の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号２９の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号１９の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号３０の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号８７の配列の重鎖可変領域および配列番号２０の配列の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片；
    −配列番号９１の配列の重鎖および配列番号３１の配列の軽鎖を含んでなるヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片。
  11. 以下の核酸から選択される、単離された核酸分子：
    ａ）請求項１、２、または３のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
    ｂ）請求項４、５または６のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
    ｃ）請求項７〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片をコードする核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡ；
    ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）に記載の核酸に相補的な核酸；
    ｅ）配列番号３８〜４１、４９〜５２、９３または９５の核酸配列を含んでなる重鎖の３つのＣＤＲの少なくとも１つと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸；および
    ｆ）配列番号４２〜４８、５３〜５９、９４または９６の核酸配列を含んでなる軽鎖の３つのＣＤＲの少なくとも１つと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうる少なくとも１８ヌクレオチドの核酸。
  12. −ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする核酸配列であって、前記重鎖可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１ヌクレオチド配列、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ２ヌクレオチド配列および配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ３ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列；
    −ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸配列列であって、前記軽鎖可変領域のヌクレオチド配列が、配列番号３５または６０のＣＤＲ−Ｌ１ヌクレオチド配列、配列番号３６または６１のＣＤＲ−Ｌ２ヌクレオチド配列および配列番号３７または６２のＣＤＲ−Ｌ３ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列；および
    −ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする核酸配列をコードする核酸配列であって、
    ｉ）前記重鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３２のＣＤＲ−Ｈ１ヌクレオチド配列、配列番号３３のＣＤＲ−Ｈ２ヌクレオチド配列および配列番号３４のＣＤＲ−Ｈ３ヌクレオチド配列を含んでなり、
    ｉｉ）前記軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、配列番号３５または６０のＣＤＲ−Ｌ１ヌクレオチド配列、配列番号３６または６１のＣＤＲ−Ｌ２ヌクレオチド配列および配列番号３７または６２のＣＤＲ−Ｌ３ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸配列
    からなる群から選択される核酸配列を含んでなる、請求項１１に記載の単離された核酸分子。
  13. 請求項１１または１２に記載の核酸で構成される、ベクター。
  14. 請求項１３に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
  15. 請求項１４に記載のベクターで形質転換された細胞を含んでなる、ヒト以外のトランスジェニック動物。
  16. 以下の工程を含んでなる、ヒト化抗体、またはその誘導化合物もしくは機能的断片の産生方法：
    −請求項１４に記載の宿主細胞の培地および前記宿主細胞に適した培養条件で培養する工程、および
    −産生された前記抗体またはその機能的断片の１つを前記培養培地または前記培養細胞から回収する工程。
  17. 薬物として使用するための、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片。
  18. 請求項１〜３に記載のヒト化抗体重鎖および／または請求項４〜６に記載のヒト化抗体軽鎖からなる化合物を活性成分として含んでなる、組成物。
  19. 請求項７〜１０および１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体またはその誘導化合物もしくは機能的断片からなる化合物を活性成分として含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
  20. 同時、別個または拡張使用のための組合せ物としてＣＸＣＲ４に対する抗体以外の抗腫瘍抗体を更に含んでなる、請求項１８または１９に記載の組成物。
  21. 同時、別個または拡張使用のための組合せ物または接合物として細胞毒性薬剤／細胞分裂阻害剤、細胞毒および／またはラジオアイソトープを更に含んでなる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 薬物として使用するための、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. がんを予防または治療するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および／または請求項４〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および／または請求項７〜１０もしくは１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および／または請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記がんが、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌から選択されるがんである、請求項２３に記載のヒト化抗体重鎖および／または軽鎖および／またはヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片および／または組成物。
  25. 対象においてＣＸＣＲ４を発現する腫瘍の存在および／または位置をインビトロで検出する方法であって、
    （ａ）前記対象由来のサンプルを、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および／または請求項４〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および／または請求項７〜１０もしくは１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片に接触させ、かつ
    （ｂ）前記抗体と前記サンプルの結合を検出すること
    を含んでなる、方法。
  26. 少なくとも１つの請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗体重鎖および／または請求項４〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体軽鎖および／または請求項７〜１０もしくは１７のいずれか一項に記載のヒト化抗体もしくはその誘導化合物もしくは機能的断片を含んでなるキットであって、前記抗体が好ましくは標識されている、キット。
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