JP2013151689A - Ｄｈａを含有する脂肪酸組成物を製造する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して、少なくとも７０．０重量％のドコサヘキサエン酸および／またはドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を製造する方法に関する。
【解決手段】本発明の方法は、下記の工程を含む。ａ）ウルケニア属から得たバイオマスを、アルコールとエステル交換し、それにより少なくとも１種類のドコサヘキサエン酸アルキルエステルと少なくとも１種類の飽和脂肪酸エステルとを生成する工程、ｂ）尿素、工程ａ）からのバイオマスの少なくとも一部、および少なくとも１種類の有機溶媒を含有する溶液を生成する工程、ｃ）工程ｂ）からの溶液を冷却または濃縮し、それによりｉ）尿素と飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部とを含有する沈殿物ならびにｉｉ）液体画分を生成する工程、ｄ）沈殿物ｉ）を液体画分ｉｉ）から分離する工程である。本発明は、本発明の方法により得られる脂肪酸組成物およびその使用にも関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して、少なくとも７０．０重量％のドコサヘキサエン酸ならびに／あるいはドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を製造する方法に関する。

長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、ヒトの代謝における必須脂肪酸である。ＰＵＦＡは、さらに２つの大きな群に分けることができる。リノール酸から生じて作られるω−６ＰＵＦＡの群に加えて、α−リノレン酸から生じて作られるω−３ＰＵＦＡの群がある。

ＰＵＦＡは、細胞膜、網膜および髄膜の重要なビルディングブロックであり、ならびに重要なホルモン、例えばプロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンの前駆体である。

ＰＵＦＡは、ビルディングブロックとしての機能に加えて、近年においては人体またはヒト疾患に多くの有益な直接的効果を有することが益々見出されてきている。

数多くの臨床研究によって、ＰＵＦＡは、例えば癌、関節リウマチ、高血圧、および神経皮膚炎、ならびに多くの他の疾患における治癒または緩和に重大な貢献ができることが見出されてきた。このような場合、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）エステルを使用することは、このようなエステル（特に、エチルエステルおよびトリグリセリド）が、味がよく消化器系に容易に吸収される傾向があるため、（遊離ＤＨＡとは対照的に）特に有利なことが多い。このような知見はそもそも、国際機関および当局がＰＵＦＡの１日摂取量を管理する勧告を行ったという事実に原因があった。

炭素鎖にＣ９位を超えて二重結合を導入することができる酵素系をヒトが欠いているため（Δ１２−デサチュラーゼの欠乏）、ＰＵＦＡはヒトにより新規合成されることができない。ヒトは、食事からの前駆体脂肪酸（例えば、α−リノレン酸）の供給を介して多価不飽和脂肪酸を合成できるのみである。しかし、この量が多価不飽和脂肪酸の必要量を賄うのに十分かどうかは議論されている。

必須脂肪酸の大部分は、食事を介して摂取される。特に、植物油は、ω−６脂肪酸に富んでいる（例えば、月見草油はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）を含有する。）が、Ｃ１８の鎖長までのみであり、魚油および微生物からの油は、ω−３脂肪酸に富んでいる（例えば、サケ油はエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）を含有する。）。基本的に、魚油および微生物からの油が、多価不飽和脂肪酸の唯一の商業的な供給源である。しかし一般に、所望のＰＵＦＡ含量は低く、混合物中に存在しており、この場合は拮抗的に作用するＰＵＦＡも存在する場合がある。したがってＰＵＦＡの推奨される１日用量を摂取するために、大量の油を摂取しなくてはならない。特に、これは高用量のＰＵＦＡを摂取しなくてはならない患者にあてはまる（例えば、嚢胞性線維症の場合）。可能な限り目標とした形でそれぞれのＰＵＦＡの効果を達成するために、濃縮したまたは高純度のＰＵＦＡを使用しなくてはならない。したがって、従来技術において、高純度のＰＵＦＡに対する大きな必要性がある。

特定の脂肪酸およびそれらの誘導物を数多くの自然源から単離するため（または少なくとも濃縮するため）、ならびに回収するために、多数の方法が単独でまたは組み合わせて使用されてきた。このような方法には、低温での分別結晶、分子蒸留、尿素アダクト結晶化、金属塩溶液での抽出、向流カラムへの超臨界流体分別およびＨＰＬＣ法が挙げられる。

Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｌｉｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第１４７〜１４９頁（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９７６年）（非特許文献１）において、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルも含有する混合物から飽和脂肪酸のメチルエステルを分離するために、尿素を使用する一般法が開示されている。Ｃｈｒｉｓｔｉｄによれば、尿素が複数の異なる長鎖脂肪族化合物の存在下で結晶化する場合、脂肪族化合物（尿素錯体と言われる）を含む六方晶が形成する。この脂肪族化合物は、次いで濾過により溶液から容易に分離することができる。

Ｃｈｒｉｓｔｉｅは、一般に飽和脂肪酸のメチルエステルは、同じ鎖長の不飽和脂肪酸のメチルエステルより容易に尿素錯体を形成し、トランス二重結合を有する不飽和脂肪酸のメチルエステルは、シス二重結合を有する対応する不飽和脂肪酸のメチルエステルより容易に尿素錯体を形成すると述べる。Ｃｈｒｉｓｔｉｅは、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルおよび飽和脂肪酸のメチルエステルを含有する混合物から、多価不飽和脂肪酸のメチルエステルを濃縮するための、尿素の結晶化の使用についても記載している。この方法では、明らかに、２０％の質量収率を有する脂肪酸組成物が得られるが、この刊行物においては、実験手順およびＰＵＦＡの収率の具体的データがない。さらに、生成物の質についてのデータ、例えば過酸化物含量がないことが、それによって推論される。

尿素の結晶化を使用した脂肪酸メチルエステルの分離について記載しているさらなる刊行物は、Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ、Ｔ．Ｙｏｋｏｃｈｉ、Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ、Ｓ．Ｔａｎａｋａ、Ｔ．Ｙａｇｕｃｈｉ、Ｄ．Ｈｏｎｄａ“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｎｄ Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｙａｐ Ｉｓｌａｎｄｓ”、ＪＡＯＣＳ、第７３巻、第１１号、第１４２１〜２６頁（１９９６年）（非特許文献２）である。Ｎａｋａｈａｒａらは、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属細胞を洗浄し、乾燥し、次いで１０％強度のＨＣｌの存在下で直接メタノールとのメチルエステル化を行うことによる、脂肪酸メチルエステルの混合物の生成について記載している。Ｎａｋａｈａｒａらは、得られたメチルエステルの３４．９％はＤＨＡ残基を含有し、得られたメチルエステルの８．７％はＤＰＡ残基を含有していたと報告している。これらの多価不飽和脂肪酸エステルを濃縮するために、メタノールおよび尿素を混合物に加える。次いで、尿素を溶解するためにこの混合物を６０℃に加熱し、次いで１０℃に冷却し尿素を結晶化する。Ｎａｋａｈａｒａらによると、この方法で、７３．３％のＤＨＡメチルエステルおよび１７．７％のＤＰＡメチルエステルを含有する混合物を得る。実験手順、得られた生成物の収率および質についてのさらなる詳細は、刊行物から得ることはできない。

ＷＯ０１／５１５９８Ａ１（特許文献１）には、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の油がアルコール（メタノール）とエステル交換された、多価不飽和脂肪酸エステルの濃縮混合物を生成する方法が開示されている。次いで、この脂肪酸エステルを培地中で尿素と共に溶解し、尿素と共に沈殿する飽和脂肪酸エステルを少なくとも部分的に分離するために冷却または濃縮する。ガスクロマトグラフィーによると、この方法で、２３．４重量％のω−６ＤＰＡメチルエステル、６５．２重量％のω−３ＤＨＡメチルエステル、２．９重量％のミリスチン酸メチルエステルおよび１．５重量％のパルミチン酸メチルエステルを含有する油が得られる。

上記の手順の不利な点は、特に、脂肪酸をエステル化するために有毒のメタノールを使用することである。したがって、これらの刊行物に記載された脂肪酸組成物は、食品分野で使用するのに適切でない。さらに、方法の開示、特にＣｈｒｉｓｔｉｅの方法およびＮａｋａｈａｒａらの方法の開示は、再現できないほど不足している箇所がたくさんあり不完全である。さらに、特にＮａｋａｈａｒａらにおいて記載された方法については、ＤＨＡ含量の比較的高い上昇によって、比較的低い全収率となると推測しなくてはならない。

ＷＯ０１／５１５９８Ａ１

Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｌｉｐｉｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ、第１４７〜１４９頁（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９７６年） Ｔ．Ｎａｋａｈａｒａ、Ｔ．Ｙｏｋｏｃｈｉ、Ｔ．Ｈｉｇａｓｈｉｈａｒａ、Ｓ．Ｔａｎａｋａ、Ｔ．Ｙａｇｕｃｈｉ、Ｄ．Ｈｏｎｄａ"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｎｄ Ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｓｐ．ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｙａｐ Ｉｓｌａｎｄｓ"、ＪＡＯＣＳ、第７３巻、第１１号、第１４２１〜２６頁（１９９６年）

薬品および食物中に多価不飽和脂肪酸、特にＤＨＡおよびそのエステルがますます使用されることによって、可能な限り多くの多価不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸および／またはドコサヘキサエン酸アルキルエステルの画分、ならびに同時に可能な限り少ない飽和脂肪酸の画分を有する脂肪酸組成物を生成するために、可能な限り費用効率が高く信頼性の高い方法に対する要望が生じている。

したがって、この従来技術を鑑みて、このような方法を提供することが本発明の１つの目的であった。この場合本発明の方法は、可能な限り簡単な方法で、大規模で費用効率が高い脂肪酸組成物の生成を可能にするべきである。

同時にこの方法は、可能な限りの高純度および高品質を有し、特に可能な限り低い酸価を有し、および／または可能な限り低い重金属含量を有する脂肪酸組成物を提供するべきである。

さらに、この方法は、可能な限り穏やかであるべきであり、特に可能な限り低い過酸化物含量を有する脂肪酸組成物をもたらすべきである。

加えて、本発明の方法は、可能な限り食品安全性が高い溶媒を用いて、可能な限り行われるべきである。特に、健康に害がある物質の使用は可能な限り避けるべきである。

この方法によって得られる脂肪酸組成物は、特に懸念なしに食品分野で脂肪酸組成物を使用することを可能にするために、可能な限り低いエチルカルバメート含量を有するべきである。

これらの目的および、明示的に記述してはいないが本明細書において議論される内容から明らかなものとして導き出すことができ、または必然的にそこから結果として生じる他の目的は、本請求項１の全ての特徴を有する方法によって達成される。本発明の方法の好都合な変更形態は、請求項１を参照する従属請求項中に記述する。ものに関する請求項の範囲は、本発明の方法で得られる脂肪酸組成物を保護し、使用に関する請求項は、本発明の脂肪酸組成物の使用の特に有利な分野を示す。

脂肪酸組成物を製造する方法であって、
ａ）ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属から得られるバイオマスを、少なくとも１種類のアルコールとエステル交換し、少なくとも１種類のドコサヘキサエン酸アルキルエステルおよび少なくとも１種類の飽和脂肪酸エステルを形成し、
ｂ）尿素、工程ａ）からのエステル交換されたバイオマスの少なくとも一部、および少なくとも１種類の有機溶媒を含有する溶液を生成し、
ｃ）工程ｂ）からの溶液を冷却または濃縮し、
ｉ）尿素と飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部とを含有する沈殿物と、
ｉｉ）液体画分と
を形成し、
ｄ）沈殿物ｉ）を液体画分ｉｉ）から分離する、
脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して、少なくとも７０．０重量％のａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸ならびに／あるいはａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を製造する方法を、容易に予想可能でない形で提供することによって、脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して少なくとも７０．０重量％のドコサヘキサエン酸ならびに／あるいはドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を生成するための、新規で有用な方法が成功裏に提供される。本発明により分離される化合物が非常に複雑な分子であり、これらの間にはごく僅かな構造上の差異があるのみであるが、特にＤＨＡおよび／またはＤＨＡ−エステルの濃縮が本発明により行われるため、これは特に驚くべきことであった。

同時に、本発明による手順は、いくつかのさらなる利点を有する。

・本発明の方法は、簡単な方法で、大規模に、費用効率が高く行うことができる。

・本発明の方法は、非常に効率的で、比較的高い収率で利用可能な脂肪酸組成物を作製する。

・本発明の方法は、比較的高純度および高品質で、特に比較的低い酸価および比較的低い重金属含量を有する脂肪酸組成物を提供する。ＡＯＣＳ公定法Ｊａ８−８７の指示通りに測定すると、この脂肪酸組成物の酸価は、好ましくは脂肪酸組成物１ｇ当たりＫＯＨが１．５ｍｇ以下であり、さらに適切には脂肪酸組成物１ｇ当たりＫＯＨが０．８ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｇ当たりＫＯＨが０．２ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｇ当たりＫＯＨが０．０６ｍｇ以下である。

・本発明の方法は、比較的穏やかであり、比較的低い過酸化物含量を有する脂肪酸組成物をもたらす。ＡＯＣＳ公定法Ｃｄ−３ｄ６３の指示通りに測定すると、脂肪酸組成物の過酸化物価は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．５ｍｅｑ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１ｍｅｑ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０５ｍｅｑ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０１ｍｅｑ以下である。ＬＭＧＢ（ドイツ食品日用品法）第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、脂肪酸組成物の重金属含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．７ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．４ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．３ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低いカドミウム含量によって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物のカドミウム含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低い鉛含量によって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物の鉛含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低い水銀含量により特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明によって得られる脂肪酸組成物の水銀含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０１ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．００５ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低いヒ素含量によって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物のヒ素含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０３ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低い銅含量によって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物の銅含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０６ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低い鉄含量によって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物の鉄含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０６ｍｇ以下である。

・この方法で得られる脂肪酸組成物は、比較的低いニッケル含量よって特徴付けられる。ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、本発明により得られる脂肪酸組成物のニッケル含量は、好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２５ｍｇ以下であり、適切には脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．１０ｍｇ以下であり、特に脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．０６ｍｇ以下である。

・本発明の方法において、比較的食品安全性が高い溶媒が使用される。

・本発明の方法によって得られる脂肪酸組成物は、さらに比較的低いエチルカルバメート含量を有し、したがって特に食品分野における用途に適切である。

本発明は、脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して、好ましくは脂肪酸組成物に含有される脂肪酸および／または脂肪酸エステルの全重量に対して、特に脂肪酸組成物に含有される脂肪酸および／または脂肪酸トリグリセリドの全重量に対して、少なくとも７０．０重量％のａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸および／またはａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を製造する方法に関する。

この状況において「脂肪酸組成物」という表現は、遊離脂肪酸を含有する組成物だけでなく、脂肪酸誘導体、好ましくは脂肪酸エステル、特に脂肪酸トリグリセリドを含有する組成物も含むが、脂肪酸基は基本的には同一または異なっていてもよい。

本発明によると、脂肪酸とは、飽和または一価不飽和または多価不飽和でもよく、好ましくは６〜３０個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸である。

本発明の方法において、出発物質として、ウルケニア属から得られるバイオマスを使用する。ウルケニア属から得られるバイオマスは、それ自体は公知である。本発明によれば、ウルケニア属の野生型菌株からのバイオマスだけでなく、ＤＨＡ（ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）および／またはＤＰＡ（ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）を効率的に生成する、ウルケニア属の突然変異型または組換え型菌株のバイオマスも使用することができる。このような突然変異型または組換え型菌株には、元のウルケニア属の野生型菌株の割合と比較して、同一の基質を使用して、脂肪中にＤＨＡおよび／またはＤＰＡをより高率で含有し、ならびに／あるいは、元のウルケニア属の野生型菌株によって生成される量と比較して、同一の基質を使用して、脂質の全体量をより多く含有する微生物が含まれる。

本発明の特に好ましい実施形態では、出発物質として、ウルケニア属乾物を使用する。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、ウルケニア属からの油を出発物質として使用する。

ウルケニア属からの油は、ＤＨＡに富んだ微生物を培養し、培養物からバイオマスを回収し、それを分解し、油を単離することにより得ることが適切である。この状況において非常に特に適切な方法は、その開示内容が明確にここで参照により本明細書中に組み込まれているＷＯ０３／０３３６３１Ａ１に記載されている。

油の単離のために、有機溶媒、特にヘキサンによる、または超臨界液体による抽出方法を用いることが好ましい。ヘキサンによる乾燥バイオマスの浸出によってバイオマスから油を抽出することが適切である。このような有機溶媒による抽出は、とりわけＷＯ９７３７０３２、ＷＯ９７４３３６２およびＥＰ５１５４６０に記載されている。特に包括的な記述が、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、第５６１〜５７９頁、１９８９年、“Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＵＦＡｓ”にも見出すことができる。

あるいは、溶媒なしで抽出を行うこともできる。この状況において特に適切な方法は、ＥＰ−Ａ−１１７８１１８に記載されている。この方法においては、バイオマスの水性懸濁液を生成し、遠心分離により水相から油相を分離することによって、溶媒が回避される。

ウルケニア属から得られるバイオマスの組成は、広範囲に変化させることができる。少なくとも１種類の多価不飽和脂肪酸基を含む、少なくとも１種類のグリセリド、特にトリグリセリドを含有することが好ましい。特に好ましい実施形態では、バイオマス中の脂肪酸基の少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも２５％、特に少なくとも３０％はＤＨＡ基である。

「グリセリド」とは、この表現が本明細書において使用される限りは、グリセロールと少なくとも１種類の脂肪酸とのエステルであり、この場合、グリセロールの１〜３個のヒドロキシル基は１種または複数の脂肪酸基でエステル化されている。複数の脂肪酸基が存在する場合は、脂肪酸基は同一でもまたは異なっていてもよい。

多くの適切な出発物質において、グリセリドの大部分は、トリグリセリド、すなわち３個の脂肪酸基とグリセロールとのエステルである。この場合、各脂肪酸基は、飽和（すなわち炭素原子間の全ての結合が単結合である。）でもよく、または不飽和（すなわち少なくとも１個の炭素−炭素二重結合または三重結合が存在する。）でもよい。不飽和脂肪酸基の種類は、本明細書においてはωで特徴付けられることが多い。この数字は、末端メチル基から数えた脂肪酸または脂肪酸基の第１の二重結合の位置を示す。

本発明によると、ウルケニア属から得られるバイオマスは、最初に少なくとも１種類のアルコールとエステル交換される。エステル交換工程の目的は、出発物質中のグリセリドのグリセロールバックボーンから脂肪酸基を除去すること、およびエステルが互いに分離できるように、それぞれの基の別個のエステル（少なくとも１種類のドコサヘキサエン酸アルキルエステルおよび少なくとも１種類の飽和脂肪酸エステル）を形成することである。

本発明によると、エステル交換は、少なくとも１種類の式Ｒ^１−ＯＨ（式中、Ｒ^１は１〜２０個の、好ましくは１〜６個の、特に１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状アルキル基）のアルコールを使用して行うことが好ましい。メチルエステルおよびエチルエステル、特にエチルエステルが、特に好ましい。

本発明の第１の好ましい実施形態によれば、エステル交換は、少なくとも１種類の塩基により触媒される。好ましい塩基は、ナトリウムメトキシド、カリウムメトキシド、元素ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムを含む。バイオマスと塩基／アルコール混合物との容積比は、１：１から１：５であることが好ましい。アルコール中の塩基濃度は、０．１から２Ｍであることが好ましい。好ましい変形形態によると、エステル交換反応は室温（すなわち、約２０〜２５℃の範囲の温度）で、６〜２０時間行われる。さらに好ましい変形形態によると、エステル交換反応は、室温を超えた温度で、好ましくは少なくとも４０℃の温度で、特に好ましくは７０〜１５０℃の温度で、特に混合物中の１種または複数の成分の沸点を超えた温度で、（還流させながら）行われる。

本発明の第２の好ましい実施形態によれば、好ましくは不活性ガス雰囲気下で、ならびに水の非存在下で、少なくとも１種類のアルコールおよび少なくとも１種類の酸、好ましくはＨＣｌを含有する混合物中で、バイオマスを約０〜約１５０℃の温度で好ましくはインキュベーションすることによって、少なくとも１種類の酸によりエステル交換が触媒される。好ましい変形形態によると、トリグリセリド／酸／アルコール混合物を少なくとも２時間還流する。さらに好ましい変形形態によると、トリグリセリド／酸／アルコール混合物を、０〜５０℃の温度で少なくとも１２時間保持する。

酸触媒エステル交換は、通常可逆性であるので、反応が基本的に完全転換まで進むように、アルコールは十分に過剰に充填することが好ましい。アルコール／酸混合物中のトリグリセリド濃度は、０．１〜１５重量％であることが好ましい。アルコール／酸混合物中の酸、好ましくはＨＣｌの濃度は、４〜１５重量％であることが好ましい。このような混合物は、例えば、気体の塩化水素を乾燥アルコールに導入することによる、またはアセタールクロライドをアルコールに添加することによるなどの、多くの従来技術で公知の方法により生成することができる。本発明によればＨＣｌが最も好ましいが、他の酸も代わりに使用することができる。このような酸は、アルコール中で０．５〜５重量％の濃度で使用することが好ましいＨ_２ＳＯ_４である。しかし、Ｈ_２ＳＯ_４は、強酸化剤であり、したがって短い還流時間（すなわち６時間未満）、低濃度（すなわち５重量％未満）および低温（すなわち１５０℃未満）と組み合わせて使用することが好ましいという事実を考慮するべきである。適切な酸のさらなる例は、１〜２０重量％の濃度で使用することが好ましいフッ化ホウ素である。しかし、フッ化ホウ素は不要な副生成物を形成する傾向が高いため、フッ化ホウ素よりＨＣｌが好ましい。

エステル交換反応は、不活性ガス雰囲気下（例えば希ガスおよび／またはＮ_２）で行うことが好ましい。さらに、自動酸化を防止するために、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸パルミテートまたは没食子酸プロピル）を、反応混合物に添加することもできる。

エステル交換の間、少なくとも１種類の有機溶媒が加えられることが好ましい。好ましい溶媒は、特にエステル交換される脂肪酸エステルを溶解することができるような化合物を含む。出発物質がエステル交換される複数の脂肪酸エステルを含有する場合、有機溶媒は、エステル交換される脂肪酸エステルの全てを溶解できることが好ましい。本発明による非常に特に適切な溶媒は、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチルおよびジエチルエーテル、特にジクロロメタンを含む。

エステル交換後に、水を加えることによって、このエステルを反応混合物から分離することが好ましい。（有機である）エステルが反応混合物の上に浮いて、残存する反応混合物から簡単に分離できる場合も多い。これは、特に大規模な工業的用途に適用される。

あるいは、エステルを残存する反応混合物から分離するために液−液溶媒抽出を用いることができる。この抽出は、広範囲に変化させることができる。好ましい変形形態によると、水を混合物に加え、エステルを非極性溶媒で抽出する。エステル交換が少なくとも１種類の塩基で触媒された場合、混合物を中和するために、または特に好ましくは混合物を弱酸ｐＨとするために、水に十分な量の酸、好ましくはＨＣｌ、クエン酸または酢酸、特にＨＣｌを含むことが好ましい。非極性溶媒の全容積と（加えた水を含めた）反応塊の容積の比は、広範囲に変化させることもでき、特に１：３から４：３である。特に好ましい実施形態では、混合物は、最後に混合する非極性有機溶媒の複数の画分で抽出される。本発明による特に適切な非極性溶媒には、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサンおよびヘプタンが含まれるが、ヘキサンおよび石油エーテルが最も好ましい。

非極性溶媒は、例えば、ジエチルエーテルなどの少量の微極性有機溶媒も含有することができる。脂肪酸エステルも同様に微極性であるので、このような極性成分を使用することによって、水層からの脂肪酸エステルの抽出を向上させることにつながる傾向がある。微極性の有機成分が使用される場合、微極性成分の非極性成分に対する体積濃度は、好ましくは約２０％以下、特に好ましくは１０％以下、特に５％〜１０％である。

得られた有機抽出溶媒層は、例えば、任意の酸残基および／または残存する水を除去するために洗浄することができる。弱塩基、例えば炭酸カリウムを含有する水溶液で、この層を洗浄することにより酸残基を除去することが好ましい。例えば、この層をブライン（すなわち飽和塩溶液）で洗浄することにより、および／または無水塩（例えば、硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウム）で乾燥させることにより、残存する水を除去することができる。

抽出後に、脂肪酸エステルを非極性溶媒層中で濃縮することができる。本発明の好ましい一実施形態では、非極性溶媒の一部を蒸発させることによってエステルを濃縮する。

ＤＨＡアルキルエステルに加えて、ウルケニア属から得られるバイオマスのエステル交換は、通常他の脂肪酸エステルをもたらす。このような脂肪酸エステル、特に飽和脂肪酸エステルの多くは、未知のおよび／または不利な医学的特性ならびに栄養的特性を有する。したがって特に飽和脂肪酸エステルを可能な限り完全にエステル交換反応混合物から除去することが必要である。したがって、本発明の方法は、
ｂ）尿素、工程ａ）からのエステル交換されたバイオマスの少なくとも一部、および少なくとも１種類の有機溶媒を含有する溶液を最初に生成し、
ｃ）工程ｂ）からの溶液を冷却または濃縮し、
ｉ）尿素と飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部とを含有する沈殿物と、
ｉｉ）液体画分と
を形成し、
ｄ）沈殿物ｉ）を液体画分ｉｉ）から分離する
尿素の結晶化を含む。

上記の方法を用いたエステル交換により得られた、多価不飽和脂肪酸エステル（例えば、ＤＨＡのエステル）と飽和脂肪酸エステルとを含有する溶液中で尿素を結晶化する場合は、尿素と飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部とを含有する沈殿物が形成する。しかし、この沈殿物は、多価不飽和脂肪酸エステルの画分を実質的に溶液より少なく含む。したがって、多価不飽和脂肪酸エステルの大部分は溶液中に残り、沈殿した飽和脂肪酸エステルから容易に分離することができる。

本発明の尿素の結晶化分離方法は、最初に脂肪酸エステルおよび尿素を含有する溶液を形成することを含む。尿素の量は、溶液から分離される飽和脂肪酸の全量に比例することが好ましい。脂肪酸エステル混合物と尿素の質量比は、１：１から１：４であることが好ましい。

この溶液は、混合物中の尿素および所望のＤＨＡエステル、特に好ましくは尿素および全ての脂肪酸エステルを溶解する、少なくとも１種類の有機溶媒も含むことが好ましい。この状況において特に適切な溶媒には、１〜４個の炭素原子を有するアルコールが含まれ、メタノールおよびエタノールでは、特にエタノールが、特に好ましい。脂肪酸エステルの混合物と溶媒の容積比は、１：５から１：２０であることが好ましい。

基本的に尿素の全てが溶液中で溶解することが好ましい。これは一般に、溶液を好ましくは５０℃超の温度まで加熱することにより達成することができる。本発明の非常に特に好ましい実施形態によれば、尿素と脂肪酸エステルとの混合物を、特に５０℃超の温度まで、好ましくは加熱しながら、溶液中でそれぞれ別個に溶解し、次いで残存する溶液を互いに混合することにより、溶液が調製される。

飽和脂肪酸エステルを分離するために、脂肪酸エステルおよび尿素を含有する溶液を冷却し、尿素含有沈殿物を形成することが好ましい。４０℃未満の、好ましくは３０℃以下の、特に２５℃以下の温度まで溶液を冷却することが好ましく、１０℃超の、好ましくは１５℃以上の、適切には２０℃以上の温度であることが有利である。冷却した溶液を時々撹拌しながら、冷却温度で一定期間、通常約２０時間以下、好ましくは５〜２０時間静置することが好ましい。

本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、脂肪酸エステルおよび尿素を含有する溶液を濃縮することにより、尿素含有沈殿物が形成される。例えば溶液中の溶媒の一部を蒸発することによって、この溶液を濃縮することができる。除去される溶媒の量は、飽和濃度を超える溶液中の尿素濃縮をもたらすのに十分であることが好ましい。

尿素の結晶化は、不活性ガス雰囲気下（例えば、希ガスおよび／またはＮ_２）で行うことが適切である。

尿素含有沈殿物が形成した後に、この沈殿物を、多価不飽和エステルに富んだ液体画分から分離することが好ましい。これは濾過または遠心分離によって行うことが好ましい。特に好ましい実施形態では、沈殿物に付着した多価不飽和脂肪酸エステルを回収するために、その後沈殿物を少量の有機溶媒（尿素で飽和していることが好ましい）で洗浄する。この洗浄液を、次に液体画分と混合することが好ましい。

この液体画分を濃縮し、水と混合することが好ましく、および液体画分中に含有されているエステルを非極性溶媒で抽出することが好ましい。例えば液体画分から溶媒の一部を蒸発させることによって液体画分を濃縮することができ、蒸発する溶媒の量は、さらに尿素が沈殿するほど多くないことが好ましい。濃縮した液体画分に加えられる水の量は、広範囲に変化させることができる。水と濃縮した液体画分の容積比は、４：１から１：１であることが好ましい。

非常に特に好ましい実施形態に照らして、尿素を中和するための十分な量の酸、好ましくはＨＣｌも加えられる。本発明の目的のために、特に適切な非極性溶媒には、石油エーテル、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチルおよびヘプタンが含まれ、ヘキサンが最も好ましい。非極性溶媒と濃縮した液体画分／水混合物の容積比は、１：５から５：１であることが好ましい。

本発明の特に好ましい実施形態では、（上で述べたように、微極性である）脂肪酸エステルの回収率を最大化するために、液体画分も微極性有機溶媒で抽出される。本発明に特に適切な微極性溶媒には、ジエチルエーテルおよび酢酸エチルが含まれ、ジエチルエーテルが最も好ましい。微極性溶媒と濃縮した液体画分／水混合物の容積比は１：５から５：１であることが好ましい。微極性溶媒による抽出後に、この抽出物を混合することが好ましい。

抽出後に、例えばブラインで洗浄することによりおよび／または無水塩（例えば、硫酸ナトリウム）を用いることにより、抽出物を乾燥させることができる。次いで、例えば溶媒の部分的または完全蒸発によって溶液を濃縮することが好ましい。

本発明の方法は、特に、飽和脂肪酸エステルの非常に効率的な除去によって特徴付けられる。したがって、本発明の状況において、エステル交換されたバイオマスは、尿素の結晶化を直接、すなわちさらなる中間の工程なしに受けることが好ましい。

このように本発明の方法の効率性をさらに向上させるために、尿素の結晶化前に、他の成分を部分除去することにより、エステル交換されたバイオマス中の多価不飽和脂肪酸の画分を増加させることは、一般に必要ではないが、これも可能である。それ自体公知の方法でこれを進めることができるが、この場合は、抽出方法、特に（前述のような）非極性溶媒による抽出、および脱ろう法の使用も、特によく実証済みである。

脱ろうは、多価不飽和脂肪酸エステルの画分を実質的により少なく沈殿させる一方で、飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部を沈殿させる温度にまで、エステル交換されたバイオマスを含有する溶液を冷却することを含む。溶液を、０℃未満の温度まで、特に好ましくは−３０〜−１０℃の範囲の温度まで、特に−２５〜−１５℃の範囲の温度まで冷却することが好ましい。溶液を不活性ガス雰囲気下で２０時間までこのような温度に保持することが好ましい。

脱ろうは、脂肪酸エステル混合物中でＤＨＡエステルと少なくとも１種類の飽和脂肪酸エステルとを溶解する有機溶媒中で行うことが好ましい。特に適切な溶媒にはメタノールおよびエタノールが含まれるが、エタノールが最も好ましい。脂肪酸エステル混合物と有機溶媒の容積比は、１：５から１：２０であることが好ましい。

沈殿物の形成後に、溶液を沈殿物から分離して、所望の多価不飽和脂肪酸エステルに富んだ液体画分を形成することが好ましい。これは、濾過または遠心分離により行われることが好ましい。液体画分を分離した後で、ロータリーエバポレーター中で溶媒を蒸発させることによって濃縮することが適切である。

本発明により得られる脂肪酸組成物の用途として可能性のある分野は、当業者であればすぐさま明らかである。それらは特に、ＰＵＦＡおよびＰＵＦＡエステルのために示された全ての用途に適切である。この場合、本発明の脂肪酸組成物は、大半が直接使用することができる。しかし、用途によっては、１種または複数の脂肪酸エステルを液相中で事前にけん化することが必要である。これは例えば、エタノール中でのＫＯＨとの反応により行うことができる。

本発明により得られた脂肪酸組成物は特に、脂肪酸医薬組成物中の有効成分または含有成分として、化粧用調製品中の成分として、食品添加物または食品成分として、機能性食品の成分として、あるいはエステルおよび酸などの高度に濃縮されたＰＵＦＡ二次製品を製造するために使用される。

本発明の概念を制限することなしに、本発明を以下に実施例によってより詳細に記述する。

＜実施例１＞
１．エステル交換
ナトリウムエチラート１３．１２ｇを無水エタノール２２８ｇに溶かした溶液を、ウルケニア属未精製油５６０．５ｇと無水エタノール２９２ｇとの混合物へ撹拌しながら滴下して添加する。その結果得られる混合物を、２．５時間撹拌する。その後、水４４６６ｇを加え、このバッチを１時間静置する。１時間後、さらに水１７１ｇを加える。このバッチをさらに１２時間静置し、ここで２相が形成される。油相を分離し、エタノールおよび残水をロータリーエバポレーターで除去する。エステル交換されたエチルエステル油４０５．７ｇが得られる。

２．尿素沈殿
尿素６８０ｇを、７７℃でエタノール４４３０ｍｌ中で溶解する（撹拌機、温度計および冷却器を備えた６リットルの四つ首丸底フラスコ）。同時に、エタノール４４３ｍｌ中のエステル交換されたエチルエステル油４０４ｇを、７０℃でプレインキュベーションし、尿素溶液に加える。このバッチを１２時間静置する。形成した沈殿物を分離し、残存する液相をロータリーエバポレーターで１．５リットルにまで濃縮する。その後、２モルの塩酸１．５リットルおよび水２．５リットルを液相に加える。有機相を分離し、４５℃で真空ポンプで乾燥する。

精製油２３０ｇを得る。この油の脂肪酸プロファイルを表１に表し、油の質（酸価、過酸化物価、重金属含量）の特性データを表２に表す。

＜実施例２＞
１．エステル交換
ウルケニア属の乾燥バイオマス１ｋｇを、１０％強度のエタノール性硫酸２．５リットルと共に、７５℃で窒素下４８時間撹拌する。このバッチを５０℃まで冷却し、ヘキサン３．５リットルで抽出する。ヘキサン相を分離し、溶媒（ヘキサン）をロータリーエバポレーターで除去する。エステル交換されたエチルエステル油３９０．１ｇが得られる。

２．尿素沈殿
尿素５９９ｇを、７７℃でエタノール３．９リットル中で溶解する（撹拌機、温度計および冷却器を備えた６リットルの四つ首丸底フラスコ）。同時に、エタノール３９０ｍｌ中のエステル交換されたエチルエステル油３９０ｇを、７０℃でプレインキュベーションし、尿素溶液に加える。このバッチを１２時間静置する。形成した沈殿物を分離し、残存する液相をロータリーエバポレーターで１．５リットルにまで濃縮する。その後、２モルの塩酸１．５リットルおよび水２．５リットルを液相に加える。有機相を分離し、４５℃で真空ポンプで乾燥する。精製油２１６．２ｇを得る。この油の脂肪酸プロファイルを表１に表し、油の質（酸価、過酸化物価、重金属含量）の特性データを表２に表す。

Claims (22)

1. 脂肪酸組成物中に含有される脂肪酸および／または脂肪酸誘導体の全重量に対して、少なくとも７０．０重量％のドコサヘキサエン酸および／またはドコサヘキサエン酸アルキルエステルを含有する脂肪酸組成物を製造する方法であって、
   ａ）ウルケニア属から得られるバイオマスを、少なくとも１種類のアルコールとエステル交換し、少なくとも１種類のドコサヘキサエン酸アルキルエステルおよび少なくとも１種類の飽和脂肪酸エステルを形成し、
   ｂ）尿素、工程ａ）からのエステル交換されたバイオマスの少なくとも一部、および少なくとも１種類の有機溶媒を含有する溶液を生成し、
   ｃ）工程ｂ）からの前記溶液を冷却または濃縮し、
   ｉｉｉ）尿素と前記飽和脂肪酸エステルの少なくとも一部とを含有する沈殿物と、
   ｉｖ）液体画分と
   を形成し、
   ｄ）沈殿物ｉ）を前記液体画分ｉｉ）から分離する方法。
2. バイオマスとしてウルケニア属からの油を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. バイオマスとしてウルケニア属乾燥バイオマスを使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 前記エステル交換のために、式Ｒ^１−ＯＨ（式中、Ｒ^１は１〜２０個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状アルキル基である）のアルコールを使用することを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
5. 前記エステル交換が、少なくとも１種類の塩基の存在下で行われることを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
6. 前記エステル交換が、少なくとも１種類の酸の存在下で行われることを特徴とする、請求項１ないし４の少なくとも一項に記載の方法。
7. 工程ｂ）からの前記有機溶媒が、１〜４個の炭素原子を有する少なくとも１種類のアルキルアルコールを含むことを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
8. 工程ｃ）において、前記溶液を１５℃以下の温度に冷却することを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
9. 前記溶液を１５℃から２５℃までの範囲内の温度に冷却することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 工程ｂ）において、工程ａ）からの前記エステル交換されたバイオマスを直接使用することを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
11. 工程ｂ）において、他の成分を部分的に分離することにより、工程ａ）からの前記エステル交換されたバイオマス中の多価不飽和脂肪酸の画分を増加させることにより、前記エステル交換されたバイオマスから得た油を使用することを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
12. 前記エステル交換されたバイオマス中の多価不飽和脂肪酸の画分が抽出方法によって増加することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記エステル交換されたバイオマス中の多価不飽和脂肪酸の画分が脱ろう法によって増加することを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記脂肪酸エステルが前記液相中でけん化されることを特徴とする、前記請求項の少なくとも一項に記載の方法。
15. 前記請求項の少なくとも一項により得ることができる脂肪酸組成物。
16. ＡＯＣＳ公定法Ｊａ８−８７の指示通りに測定すると、脂肪酸組成物１ｇ当たりＫＯＨが１．５ｍｇ以下の酸価を有することを特徴とする、請求項１５に記載の脂肪酸組成物。
17. ＡＯＣＳ公定法Ｃｄ−３ｄ ６３の指示通りに測定すると、脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．５ｍｅｑ以下の過酸化物価を有することを特徴とする、請求項１５または１６に記載の脂肪酸組成物。
18. ＬＭＢＧ第３５条Ｌ０６．００−７の指示通りに測定すると、脂肪酸組成物１ｋｇ当たり０．７ｍｇ以下の重金属含量を有することを特徴とする、請求項１５、１６または１７に記載の脂肪酸組成物。
19. 医薬組成物中の有効成分としての、請求項１５ないし１８の少なくとも一項に記載の脂肪酸組成物の使用。
20. 化粧用調製品中の成分としての、請求項１５ないし１８の少なくとも一項に記載の脂肪酸組成物の使用。
21. 食品添加物および／または食品成分としての、請求項１５ないし１８の少なくとも一項に記載の脂肪酸組成物の使用。
22. 動物飼料の成分としての、請求項１５ないし１８の少なくとも一項に記載の脂肪酸組成物の使用。