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JP2012508255A - 内皮を模倣するナノマトリックス - Google Patents

内皮を模倣するナノマトリックス Download PDF

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JP2012508255A JP2011535727A JP2011535727A JP2012508255A JP 2012508255 A JP2012508255 A JP 2012508255A JP 2011535727 A JP2011535727 A JP 2011535727A JP 2011535727 A JP2011535727 A JP 2011535727A JP 2012508255 A JP2012508255 A JP 2012508255A
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Abstract

天然内皮を模倣するナノマトリックスの産生において使用するためのペプチド両親媒性物質が、本明細書で開示される。開示される天然内皮を模倣するナノマトリックスは、内皮化を促進し、再狭窄および血栓症を阻害するための血管ステント等の医療デバイスをコーティングするために使用することができる。本要約は、特定の技術分野における検索の目的の選別手段であることを意図し、本発明を限定することを意図しない。本発明の目的に従って、本明細書に具体化され、広域に説明されるように、本発明は、天然内皮を模倣するナノマトリックスの産生における使用のためのペプチド両親媒性物質に関する。開示された天然内皮を模倣するナノマトリックスは、血管ステント等の医療デバイスをコーティングするために使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１１月７日に出願された米国仮出願第６１／１１２，５７８号、および２００９年７月２日に出願された米国非仮出願第１２／４９７，３０５号の利益を主張し、それぞれは、参照することによって、その全体が本明細書に組み込まれる。
循環器疾患（ＣＶＤ）は、米国で第１の死因である。それらは、毎年約１００万人の生命を奪い、４０００億米ドルを越える。ＣＶＤの主な要因は、動脈の内層中のコレステロールの堆積による動脈閉塞である。これは、アテローム性動脈硬化と称される（Ｓｉｌｖｅｒｔｈｏｒｎ ＤＵ．２００４）。
アテローム性動脈硬化の治療のために、バルーン血管形成術と称される非侵襲的手法が１９７０代に導入され、冠動脈バイパス移植術の魅力的な代替手段を提供した。それは、プラークの部位に挿入されて膨張される、細長い折り畳まれたバルーンカテーテルを使用した。膨張すると、バルーンがプラークを圧迫して破裂させ、閉塞部分を除去する。この技術は、患者に即座の救済を提供する。しかしながらこれは、カテーテルの引き抜き後の動脈の突然の閉鎖の問題により制限される（Ｗｉｎｄｅｃｋｅｒ Ｓ， ｅｔ ａｌ．２０００）。これらの課題は、ベアメタルステント等の新しい生物医学的解決策の設計へと導く。
動脈の突然の閉鎖を阻止するため、ベアメタルステント（ＢＭＳ）として知られている格子状の拡張型金属管が１９９０代に導入された。折り畳まれたステントを備えるバルーンが先端に付いたカテーテルが、ガイドカテーテルおよびガイドワイヤーによって挿入される。プラーク部位でバルーンが膨張されると、ステントが拡張し、所定の位置に固定され、動脈を開いたままに維持する足場を形成する。ＢＭＳの使用は、バルーン血管形成術と比較して、再狭窄の率を減少させた。それは動脈の弾性収縮力を阻止することに成功したものの、ＢＭＳは再狭窄の問題（すなわち、動脈の再閉鎖）に悩まされた（Ｓｈｅｉｂａｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ．２００２）。
図１は再狭窄の原理機構の略図を示し、図は、弾性収縮力、負の血管再構築、および新生内膜増殖を含む（Ｄｏｂｅｓｈ ＰＰ， ｅｔ ａｌ．２００４）。ＢＭＳは、事実上弾性収縮力（Ｓｈｅｉｂａｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ．２００２，Ｏｚａｋｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ．１９９６）および負の血管再構築（Ｓｈｅｉｂａｎ Ｉ， ｅｔ ａｌ．２００２）の問題を排除する。しかしながら、ＢＭＳにおける再狭窄の主要な機構は、新生内膜肥厚である（Ｖｉｏｌａｒｉｓ ＡＧ， ｅｔ ａｌ．１９９７）。新生内膜肥厚は、ステント支柱の血管壁への貫入のために、内皮の裸出によって引き起こされる。破砕されたプラークが血管壁の血栓形成性含有物を管腔に暴露し、血小板接着、活性化、および血栓症のカスケードへと導くことが想像できる。加えて、内皮裸出は抗血栓性因子の損失をもたらす。活性化された血小板は、平滑筋細胞の増殖および遊走に有利に働く因子を放出する。一方でまた、平滑筋細胞は収縮性から合成型へとそれらの形態を変化させる。これは、平滑筋細胞遊走および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）合成の増加をもたらすことができ、新生内膜肥厚およびステント内再狭窄へと導く（Ｂａｕｔｅｒｓ Ｃ， ｅｔ ａｌ．１９９７）。故に、ＢＭＳは高い率のステント内再狭窄によって制限されたままである。したがって、局在化された薬物送達の組み込み等の、ＢＭＳの生物医学的設計のさらなる前進が必要とされた。
カテーテルに基づく薬物送達の主要な課題は、新生内膜肥厚の形成を減少させるために、血管損傷部位における薬物の局在化を達成することである。したがって、制御型薬物送達システムがステントに適用され、薬剤溶出ステント（ＤＥＳ）の開発をもたらしている。ＤＥＳは、米国で２００３年に市販されるようになった（Ｏｎｇ ＡＴ， ｅｔ ａｌ．２００５）。それらは単一または複数の生理活性剤でコーティングされ、移入後、血流および周囲組織中に送達される。これらのステントは、新生内膜肥厚の生化学的経路を標的とすることによって、そのプロセスを妨げる薬物を放出するように設計される。制御拡散、制御溶解／分解、およびイオン交換に基づく方法等の幾つかの薬物送達戦略が、ＤＥＳに対して調査されている（Ａｃｈａｒｙａ Ｇ， ｅｔ ａｌ．２００６）。ＤＥＳは、ＢＭＳと比較して再狭窄を減少させることが示されている（ｄｅ Ｍａｎ ＦＨ， ｅｔ ａｌ．２００７）。２００４年〜２００６年にかけて、それらは、６００万人を越える患者に移入された（Ｃｏｌｏｍｂｏ Ａ， ｅｔ ａｌ．２００７）。
ステント市場は、２つのみの薬剤溶出ステント：（１）Ｃｏｒｄｉｓ ＣＹＰＨＥＲ（商標）、シロリムス溶出ステント、および（２）Ｂｏｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＡＸＵＳ（商標）、パクリタキセル溶出ステントによって占有されている。（ＦＤＡ（食品医薬品局）はＣｙｐｈｅｒステントを２００３年４月、Ｔａｘｕｓステントを２００４年３月に認可した）。シロリムスおよびパクリタキセルの双方は、細胞周期を阻害することによって作用する。シロリムスはキナーゼ活性化を促進する免疫抑制薬物であり、細胞増殖相の阻害へと導く。パクリタキセルは分裂細胞中の微小管に結合し、それらの構築を引き起こし、その結果有糸分裂を阻止する（Ｗｅｓｓｅｌｙ Ｒ， ｅｔ ａｌ．２００６）。数々の無作為化対照試験（Ｍｏｒｉｃｅ ＭＣ， ｅｔ ａｌ．２００２、Ｍｏｓｅｓ ＪＷ， ｅｔ ａｌ．２００３）およびメタアナリシス（Ｒｏｉｒｏｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ．２００６）によって表されるように、これらのＤＥＳの使用は、再狭窄のリスクを少なくとも８０％減少させることを示している。しかしながら、ＤＥＳとＢＭＳとの間では、死亡率に相違が観察されない（Ｒｏｉｒｏｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ．２００６； Ｂａｂａｐｕｌｌｅ ＭＮ， ｅｔ ａｌ．２００４）。これは遅発性ステント血栓症または血液凝固の発生に起因し得るものであり、ＤＥＳ第一世代の懸念の新たな要因となっている（Ｃａｍｅｎｚｉｎｄ Ｅ， ｅｔ ａｌ．２００７、Ｗｅｂｓｔｅｒ ＭＷ， ｅｔ ａｌ．２００７、Ｖａｎ Ｂｅｌｌｅ Ｅ， ｅｔ ａｌ．２００７、 Ｊａｆｆｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ．２００７、Ｌｅｏｎ ＭＢ．２００７）。この遅発性血栓症は、中断された抗血小板療法（Ｚｉｍａｒｉｎｏ Ｍ， ｅｔ ａｌ．２００５）、薬物への反応としてまれな局所過敏症、およびＤＥＳの「適用外の使用」（Ｗｉｎ ＨＫ， ｅｔ ａｌ．２００７）に関連していると見られる。ＦＤＡ基準に従い、ＤＥＳは、以前未治療である長さ３０ｍｍ未満の、および２．５０ｍｍ〜３．７０ｍｍの範囲内である基準血管直径である冠動脈狭窄を罹患する患者に対してのみ認可されている（Ｗｉｎ ＨＫ， ｅｔ ａｌ．２００７； Ｍｅｌｉｋｉａｎ Ｎ， ｅｔ ａｌ．２００６）。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙの研究は、「適用外の使用」が一般的であり、時間と共に頻度が増加したことを報告した（Ｒａｏ ＳＶ， ｅｔ ａｌ．２００６）。加えて、研究は、ＢＭＳ移入の部位と比較した場合、ＤＥＳの方が、持続性のファブリン堆積および乏しい内皮化のため、動脈治癒において有意な遅延を引き起こすことを示している（Ｆｉｎｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．２００７）。血管顕微鏡の知見は、シロリムス溶出ステントの不完全な新生内膜被覆を示す（Ｋｏｔａｎｉ Ｊ， ｅｔ ａｌ．２００６）。また、糖尿病、腎不全、および以前の合併症等の患者のリスク因子は、ＤＥＳを留置した患者における遅発性血栓症の発生率を高めている（Ｊａｆｆｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ．２００７）。
これらの懸念から、手術後、望ましくない炎症反応を誘発し、最終的に血管壁の再内皮化が起こること無く、血管修復を調節し、誘導するように設計されるべきである理想的なステントの概念が生まれた。
本発明の目的に従って、本明細書に具体化され、広域に説明されるように、本発明は、天然内皮を模倣するナノマトリックスの産生における使用のためのペプチド両親媒性物質に関する。開示された天然内皮を模倣するナノマトリックスは、血管ステント等の医療デバイスをコーティングするために使用され得る。開示される方法および組成物の追加の利点は、以下の説明において一部明記され、その説明から一部が理解されるか、あるいは開示される方法および組成物の実践によって学ぶことができる。開示される方法および組成物の利点は、特に、添付された特許請求の範囲に指摘される要素および組み合わせによって、実現および達成される。先述の一般説明および以下詳細説明は共に例示的かつ説明的なものであるに過ぎず、特許請求される本発明を制限するものではないことを理解されたい。
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する付随の図面は、開示される方法および組成物の幾つかの実施形態を解説し、その説明と共に、開示される方法および組成物の原則を説明する役目を果たす。
再狭窄の機構およびタイムラインを示す。新生内膜増殖は、ベアメタルステント（ＢＭＳ）における再狭窄の主な要因である。Ｄｏｂｅｓｈ， Ｐ． Ｐ．， ｅｔ ａｌ．（２００４）． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ． ２４（１１）：１５５４−７７を参照されたい。 図２Ａは、ジアゼニウムジオレートの化学構造を示す。図２Ｂは、求核性アミン（Ｘ−）のＮＯとの反応によって、ジアゼニウムジオレートの形成を示す。図２Ｃは、プロトン付加で、遊離ＮＯを放出するジアゾニウムジオレートの解離を示す。図２Ｄは、溶解素の構造を示す。それは、ＮＯ結合のための２つのペンダントアミン基を有する。 ＰＡの分子構造を示す。ＹＩＧＳＲ（配列番号２）は細胞接着性リガンドであり、ＫＫＫＫＫ（配列番号３）はＮＯドナーである。 自己構築されたナノファイバーを誘発した蒸発のＴＥＭ画像を示す。示されるのは、ＰＡ−ＹＩＧＳＲ（Ａ）、ＰＡ−ＫＫＫＫＫ（Ｂ）、ＰＡ−ＹＫ（Ｃ）、およびＰＡ−ＹＫ−ＮＯ（Ｄ）である。 ＰＡ−ＹＫ（ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫの９：１モル比）ナノマトリックス上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの初期結合を示す。細胞結合は、ガラス上のその結合に対して規格化される。ＨＵＶＥＣは、２時間後、ＡｏＳＭＣより有意に高い結合を示す（ｐ＜０．０５）。エラーバーは、ｎ＝１２に対する平均±標準偏差を表示する。 ＰＡ−ＹＫコーティング上で、初期のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの拡散を示す。＊ＨＵＶＥＣは、２時間後、ＡｏＳＭＣより有意に大きい拡散を表す（ｐ＜０．０１）。エラーバーは、ｎ＝１２に対する平均±標準偏差を示す。 Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭを使用して、２時間後のＰＡ−ＹＫ上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの蛍光画像を表す。図７Ａは、ＨＵＶＥＣが２時間以内にそれらの通常の拡散形態を達成することを示す。図７Ｂは、ＡｏＳＭＣが円形で残存することを示す。 ヒト血液と１５分のインキュベーション後、コラーゲン、ＰＡ−ＹＫ、およびＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上の血小板結合を示す。血小板接着は、ＰＡ−ＹＫまたはコラーゲンＩコーティングされた膜と比較して、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ膜上で有意に少ない。データは３つの試料の平均を表示する。エラーバーは平均±標準偏差を表示する。（＊：ｐ＜０．０５コラーゲンＩと比較；＃：ｐ＜０．０５ＰＡ−ＹＫと比較）。 ＰＣＮＡ染色によって定量的に査定された、ＰＡ−ＹＫおよびＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上に播種されて４８時間後のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖を示す。ＰＡ−ＹＫ−ＮＯは、ＨＵＶＥＣ増殖を増強するが、ＡｏＳＭＣ増殖を減少する。結果は、ＰＣＮＡ陽性細胞の割合として示される。データは、４つの試料の平均を表示する。エラーバーは、平均±標準偏差を表示する。（＊、＃：ｐ＜０．０５）。 ｐＨ７．４、３７℃でＨＢＳ中のＰＡ−ＹＫ−ＮＯ膜から放出されるＮＯを表す。１ヶ月にわたり、放出された総ＮＯの５３％の多相プロファイルを示す。データは、４つの試料の平均を表示する。エラーバーは、平均±標準偏差を表示する。 ナノマトリックスを用いるステントコーティング技術の略図を示す。 臨床医によって取り扱われた後、０．１重量％のＰＡＹＫでコーティングされたステントのＳＥＭ画像を示す。平滑で均一にコーティングされた表面が、取り扱い（血管形成バルーンへの取付および拡張）後も乱されていないことに注目されたい。 図１３Ａは、ウサギ腸骨動脈中にステントを配備するためのバルーンの膨張を示す。図１３Ｂは、組織部の１重量％のナノマトリックスでコーティングされた、移入４週間後のステントを示す。ナノマトリックでコーティングされたステントの表面上に、新生内膜肥厚はほとんど見出されず、血栓も全く見出されなかった。 図１３Ａは、ウサギ腸骨動脈中にステントを配備するためのバルーンの膨張を示す。図１３Ｂは、組織部の１重量％のナノマトリックスでコーティングされた、移入４週間後のステントを示す。ナノマトリックでコーティングされたステントの表面上に、新生内膜肥厚はほとんど見出されず、血栓も全く見出されなかった。 ２週間目の新生内膜の厚さを示す。対照と比較して、高用量ステント中で小さいＮＩの厚さへの明らかな傾向が観察された。Ｎ＝群当たり２ステント。 ４週間目の新生内膜の厚さを示す。ＮＩは２週間目よりも大きかったが、低用量および高用量グループの双方における小さいＮＩの厚さへの傾向は、対照と比較して持続するように見えた。Ｎ＝群当たり２ステント。 ２週間目の炎症スコアを示す。全ての研究対象グループの平均の炎症スコアは、０．５未満であった。Ｎ＝群当たり２ステント。 ４週間目の炎症スコアを示す。全ての研究対象グループの平均の炎症スコアは、０．５未満であった。Ｎ＝群当たり２ステント。 ４週間目の血栓スコアを示す。グループ間に有意な相違を伴わない全てのステントグループの平均の血栓スコアは、０．１未満であった。Ｎ＝群当たり２ステント。 ハイブリッド生物模倣型ナノマトリックスを放出するＮＯの製造を示す。図１９Ａは、ハイブリッドナノマトリックス、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを作成するため、直径３００〜５００ｎｍのｅＰＣＬナノファイバー上にコーティングされた直径８ｎｍのペプチド両親媒性物質ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを放出するＮＯを示す。図１９Ｂは、平滑筋細胞の接着、拡散および増殖を制限すると同時に、ＹＩＧＳＲリガンドの存在を表し、ＮＯの放出が内皮細胞の接着、拡散、および増殖を促進することを示す。 ５０００ｘで、ハイブリッドナノマトリックスのＳＥＭ画像を示す。（Ａ）ｅＰＣＬ。（Ｂ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ。（Ｃ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ。 ６７０００ｘで、自己構築の成功を表しているハイブリッドナノマトリックスのＴＥＭ画像を示す。（Ａ）ｅＰＣＬ。（Ｂ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ。（Ｃ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ、２１ｏ度まで傾いている。（Ｄ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ。（Ｅ）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ、２１度まで傾いている。 ＨＵＶＥＣ接着が、ＰＡ−ＹＩＧＳＲの増加する濃度と共に増加することを示す。ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ５０、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ２５、およびｅＰＣＬと比較した場合、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ７５（＊）およびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ９０（＃）は有意に増加したＨＵＶＥＣ接着を示した。 ２８日にわたる、ＮＯ放出プロファイルを示す。 ２時間目の（Ａ）ｅＰＣＬ（Ｂ）ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ（Ｃ）ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上のＨＵＶＥＣ形態を示す。スケールバー＝２０μｍ。 ２時間目の（Ａ）ｅＰＣＬ（Ｂ）ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ（Ｃ）ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上のＡｏＳＭＣ形態を示す。スケールバー＝２０μｍ。 ２時間目のハイブリッドナノマトリックス上の細胞接着を示す。ｅＰＣＬと比較した場合、ＨＵＶＥＣは、（＊）ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫおよび（＃）ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上の有意に増加した接着を表す。 ハイブリッドナノマトリックス上で増殖する細胞の割合を示す。ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ（＊）と比較した場合、ＨＵＶＥＣはｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上で有意に大きな増殖を示した。ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ（＃）と比較した場合、ＡｏＳＭＣは、ｅＰＣＬ＋ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上で有意に小さな増殖を示した。
開示される方法および組成物は、本明細書に含まれる具体的な実施形態および実施例の以下の詳細な説明、ならびに図および先の、および以下の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
開示される方法および組成物のために使用できる、それらと併用して使用できる、それらの調製のために使用できる、またはそれらの産物である物質、組成物、および成分が開示される。これらおよび他の物質が本明細書で開示され、それぞれの様々な個々の、および集団の組み合わせ、ならびにこれらの化合物の並べ替えの具体的参照が明示的に開示され得ないと同時に、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、それぞれは本明細書で具体的に熟慮され、説明されることを理解されたい。例えば、ペプチドが開示され、考察され、かつ多数の修飾がペプチドを含む多数の分子に行われることが考察される場合、それぞれの、およびどの組み合わせならびにペプチドの並べ替えおよび可能である修飾が、逆であると具体的に示唆されない限り、具体的に熟慮される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣが開示され、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、ならびに分子Ａ〜Ｄの組み合わせの例が開示される場合、次いでもしそれぞれが個々に記載されないならば、それぞれは個々におよび集団的に熟慮される。したがって、この例において、組み合わせＡ〜Ｅ、Ａ〜Ｆ、Ｂ〜Ｄ、Ｂ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、Ｃ〜Ｄ、Ｃ〜Ｅ、およびＣ〜Ｆのそれぞれは具体的に熟慮され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびにその組み合わせ例Ａ〜Ｄの開示から開示されると考慮するべきである。同様にまた、いずれのサブセットまたはこれらの組み合わせも、具体的に熟慮され、開示される。したがって、例えば、Ａ〜Ｅ、Ｂ〜Ｆ、およびＣ〜Ｅのサブグループは具体的に熟慮され、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ｄ、Ｅ、およびＦ；ならびにその組み合わせ例Ａ〜Ｄの開示から開示されると考慮するべきである。この概念は、本明細書の全ての態様に適用し、開示された組成物の作成および使用の方法におけるステップを含むが、それらに限定されない。したがって、実施することができる多様な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれは、いずれの具体的な実施形態または開示される方法の実施形態の組み合わせを用いても実施することができ、それぞれのかかる組み合わせは具体的に熟慮され、開示されると考慮されるべきことを理解されたい。
当業者は、本明細書で説明される方法および組成物の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するであろう、あるいは日常の実験に過ぎないものが使用されていることを確認するであろう。かかる同等物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
開示される方法および組成物は、変わり得るとされている特定の方法、プロトコル、および試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、それは添付の請求項によってのみ限定されることも理解されたい。
本明細書で言及される全ての刊行物は、関連してこれらの刊行物が引用される方法および／または物質を開示し、説明するために、参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前にそれらの開示のみのために提供される。本明細書のいずれも、本発明が先の発明の効力によって、かかる刊行物に先行する権利を有しないものと認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、本明細書で提供される公開日は、実際の公開日とは異なり得るため、独自の確認が必要とされ得る。参照の考察はそれらの著者が主張することを記載し、出願は、引用した書類の正確性および適切性を疑う権利を保有する。
Ａ．定義
本発明は、本発明の以下の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することによって、より容易に理解され得る。
本化合物、組成物、物品、システム、デバイス、および／または方法が開示され、説明される前に、それらが、特定されない限り、具体的な合成方法に限定されることはなく、または特定の試薬は、特定されない限り、当然ながら変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、限定することを意図しないことを理解されたい。いずれの方法および本明細書で説明されるものと同様または同等であるいずれの方法および物質も、本発明の実践または試験に使用できるが、方法および物質の例が今から説明される。
本明細書および添付の請求項で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、かかるペプチドの複数を含み、「ペプチド」への言及は、１つ以上のペプチドおよび当業者等には知られているその同等物への言及である。
「任意」または「任意に」は、後に説明される現象、状況、または材料は発生、存在し得るまたはし得ないことを意味し、その説明は、現象、状況、または材料が発生するまたは存在する、および発生しないまたは存在しない事例を含む。
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」他の特定の値までとして本明細書で示すことができる。このような範囲が示される場合，他の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先述の「約」の使用によって値が近似値として示される場合、特定の値は他の実施形態を形成することを理解されたい。それぞれの範囲の終点は、他の終点に関して、かつ他の終点とは独立に有意である双方であることをさらに理解されたい。また、本明細書に開示される多数の値が存在し、また、それぞれの値は、その値自体に加える特定の値の「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、次いで「約１０」もまた開示される。また、値が次のように開示される場合、その値「未満の、またはと同等である」、「その値よりも大きい、またはと同等である」、および当業者によって適切に理解されるように、値間の可能な範囲も開示されることも理解されたい。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満の、またはと同等である」ならびに「１０よりも大きい、またはと同等である」も開示される。また、本明細書全体にわたって、データは多数の異なるフォーマットで提供され、このデータは、終点および始点、ならびにデータポイントのいずれの組み合わせの範囲も表示することを理解されたい。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５よりも大きい、１０および１５よりも大きいまたはと同等である、１０および１５未満の、１０および１５未満のまたはと同等である、ならびに１０および１５と同等であるもの、ならびに１０〜１５が開示されると考慮されることを理解されたい。また、２つの特定の単位間のそれぞれの単位もまた開示されることも理解されたい。例えば、１０および１５が開示される場合、次いで１１、１２、１３、および１４もまた開示される。
本明細書の説明および請求項にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等のその単語の変化形は、「含むが、それらに限定されない」を意味しており、例えば、他の添加物、成分、整数、またはステップを除外することを意図しない。
本明細書で使用される「治療」という用語は、治癒、寛解、安定化、あるいは疾患、病態、または障害を阻止する意図と共に、患者の医療管理を指す。この用語は、特に疾患、病態、または障害の改善を対象とする治療である積極的治療を含み、また関連する疾患、病態、または障害の要因の除去を対象とする治療である原因治療も含む。加えて、この用語は、疾患、病態、または障害の治癒よりはむしろ症状の軽減のために設計された治療である緩和治療；関連する疾患、病態、または障害の発達の最小化、または部分的なあるいは完全な阻害を対象とする治療である予防的治療；関連する疾患、病態、または障害の改善を対象とする他の具体的な療法を補うために用いられる治療である支持治療を含む。治療は、疾患または状態の完全なアブレーションをもたらす必要はないが、対象の疾患あるいは状態の未治療である状態を超える改善が観察されるような、疾患またはその状態あるいは症状の存在のいずれの減少もさらに理解され、本明細書において熟慮される。それにより、治療は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を指し、疾患または状態のいずれの症状または根本の要因における改善も指す。例えば、組成物またはデバイスの投与前に、妨害物の量と比べてアルチオプラーク（ａｒｔｉｏ ｐｌａｑｕｅ）の１０％の減少をもたらす組成物またはデバイスが、治療であろう。
本明細書で使用される「阻止する」または「阻止している」という用語は、特に事前の行為によって、何らかが起こることを防止する、防ぐ、除去する、未然に防ぐ、中止する、あるいは邪魔することを指す。減少、阻害、または阻止が本明細書で使用される場合、具体的に示唆されない限り、また他の２つの単語の使用も示される明確に開示されることを理解されたい。
本明細書で使用される「投与すること」および「投与」という用語は、薬学的調製を対象に提供するいずれの方法も指す。かかる方法は当業者によく知られており、静脈内投与、動脈内投与、筋内投与、および皮下投与等の注射可能を含む、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、腟内投与、点眼投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、ならびに非経口投与を含むが、それらに限定されない。投与は、連続的または間欠的であり得る。様々な態様において、調製は治療的に投与できる、つまり既存の疾患または状態を治療するために投与される。さらなる様々な態様において、調製は予防的に投与できる、つまり疾患または状態の阻止ために投与される。
本明細書で使用される「対象」という用語は、投与の標的を指す。本明細書で開示される方法の対象は、哺乳動物、魚、トリ、爬虫類、または両生類等の脊椎動物であり得る。したがって、本明細書で開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ネコ、モルモット、またはげっ歯類であり得る。用語は、特定の年齢または性別を表示しない。したがって、オスであろうとメスであろうと、成人および新生対象ならびに胎児を範囲に含めることを意図する。患者は、疾患または障害で苦しむ対象を指す。「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学対象を含む。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、望む結果を達成、あるいは望まれない症状に効果を有するのに十分な量だが、一般的には有害な副作用を引き起こすのには不十分である量を指す。いずれの特定の患者にも必要とされる特定の効果的な服用レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の組成物；年齢、体重、一般的健康、性別および患者の食事；投与の時間；投与の経路；用いられる特定の化合物の排泄率；治療期間；医学分野ではよく知られている用いられた特定の化合物等の因子と併用または同時投与に使用される薬物を含む多様な因子に依存するであろう。例えば、望ましい効果を達成するのに必要とされるものより低いレベルで化合物の用量を開始し、望ましい効果を達成するまで、投与量を徐々に増加することは十分に当技術分野範囲内である。望まれる場合、投与の目的のため、効果的な一日量は複数用量に分割され得る。結果的に、単一用量の組成物はかかる量、または一日量を作り出すそのサブマルチプルを含有できる。投与量は、いずれの禁忌の場合には、個々の医師によって調節できる。投与量は変わり、一日または数日にわたって、１つ以上の用量投与が一日に投与できる。所与のクラスの医薬品の適切な投与量に対して、ガイダンスが、文献中に見出される得る。さらなる態様において、調製は「診断上の有効量」で投与できる、つまり、疾患または状態の診断に対して効果的な量が投与できる。さらなる態様において、調製物は「治療的に有効な量」で投与できる、つまり、疾患または状態の治療に対する効果的な量を投与できる。さらなる態様において、調製物は「予防的に有効な量」で投与できる、つまり、疾患または状態の阻止に対する効果的な量が投与できる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、無菌の水溶または非水溶液、分散液、懸濁液または乳濁液、ならびに使用直前に無菌の注射可能な溶液および分散液へと再構成するための無菌の粉末を指す。好適な水溶および非水溶担体、希釈液、溶剤、または媒体の実施例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、カルボキシメチルセルロース、およびその好適な混合物、植物油（オリーブ油等）、ならびにエチルオレイン酸等の注射可能な有機エステルを含む。適切な流動性は維持され得る、例えば、レシチン等のコーティン物質の使用によって、分散の場合、所要の粒子の大きさの維持によって、界面活性物質の使用によって、維持され得る。また、これら組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントも含有する。微生物の作用の阻止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の様々な抗菌性および抗真菌性薬の包含によって保証できる。また、それは糖、塩化ナトリウム等の等張性薬を含むことも望まれ得る。注射可能な薬学的形態の遷延した吸収は、吸収を遅延するモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の薬の包含によってもたらされ得る。注射可能な貯蔵形態は、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（無水物）等の生物分解性ポリマー中の薬物のマイクロカプセルマトリックスの形成によって作成される。薬物対ポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの本質に依存し、薬物放出の率が調節され得る。また、デポー注射可能な製剤は、体組織と適合するリポソームまたはミクロ乳濁液中の薬物を捕捉することによっても調製される。注射可能な製剤は無菌化され得る、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって、または使用前に無菌の水または他の無菌の注射可能な培地中で溶解または分散され得る、無菌の固体成組物の形態で減菌剤を組み込むことによって無菌化され得る。好適な不活性担体はラクトース等の糖を含む。望ましくは、有効成分の粒子の少なくとも９５重量％は、０．０１〜１０マイクロメーターの範囲において効果的な粒子の大きさを有する。
本明細書で使用される「生物活性薬剤」または「生理活性薬」という用語は、それが適用される生物学的システムにおいて局所性または全身性生物学的、生理的、または治療的な効果が提供できる能力を有する薬を意味する。例えば、生理活性薬は、他の機能の中で、感染症または炎症を制御する、細胞成長および組織再生を増強する、腫瘍成長を制御する、鎮痛薬として作用する、抗細胞結合を促進する、骨成長を増強するために働くことができる。他の好適な生理活性剤は、抗ウイルス薬、ホルモン剤、抗体、または治療用タンパク質を含み得る。他の生理活性剤は、投与される場合、生物学的に活性を示さない薬であるプロドラッグを含むが、対象への投与の際、代謝または幾つかの他の機構を通して生理活性剤へと変換される。加えて、本発明のいずれの組成物も、２つ以上の生理活性剤の組み合わせを含有できる。生物活性薬剤は、様々な対象、例えば、ヒト（すなわち、医学的投与）または動物（すなわち、獣医学的投与）への投与に関連して使用され得ることを理解されたい。
本明細書で使用される「薬学的活性薬剤」という用語は、「薬物」または「ワクチン」を含み、分子、一群の分子、診断上の、治療上の、予防的医療の、または獣医学目的のため、生物へと投与される複合体または物質を意味する。この用語は、臨床的および獣医学スクリーニング、予防、予防法、治癒、健康、検出、画像診断、診断、療法、手術、監視、化粧品、人工装具、科学捜査等に有用な調製物を含む、外部および内部に投与される局所的な、局在型および全身性ヒトおよび動物薬品、治療、治療薬、栄養補助食品、薬用化粧品、生物学的、デバイス、診断および避妊薬を含む。また、この用語は、細胞受容体、膜受容体、ホルモン受容体、治療受容体、微生物、ウイルスまたは選択される標的を認識する能力がある、選択される分子または選択される核酸配列を含む、または植物、動物、および／またはヒトに接触させる能力がある農業品、職場、軍隊、産業および環境の治療学または治療薬に関しても使用され得る。また、この用語は、具体的に生理活性効果、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を産生する核酸を含む核酸および化合物を含み得る。薬学的活性薬剤は、本明細書で開示されたカテゴリーおよび具体的な実施例を含む。具体的な実施例によってカテゴリーが限定されることを意図しない。また、当業者は、該カテゴリー範囲に入る、かつ本発明に従って有用な、数々の他の化合物を認識するであろう。実施例は、放射線増感剤、放射線増感剤および化学療法薬、ステロイド、キサンチン、β２アゴニスト気管支拡張薬、抗炎症薬、鎮痛薬、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、β遮断薬、中枢活性αアゴニスト、α１アンタゴニスト、抗コリン／鎮痙薬、バソプレシン類似体、抗不整脈薬、抗パーキンソン病薬、抗狭心症／降圧薬、抗凝固薬、抗血小板薬、鎮静薬、抗不安薬、ペプチド性薬、生体高分子薬、抗悪性腫瘍薬、緩下剤、止痢薬、抗菌薬、抗真菌性薬、ワクチン、タンパク質、または核酸の組み合わせを含む。さらなる態様において、薬学的活性薬剤は、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、および薬学的に許容されるヒドロコルチゾン誘導体等のクマリン、アルブミン、ブロモリジン（ｂｒｏｍｏｌｉｄｉｎｅ）、ステロイド；テオフィリンおよびドキソフィリン等のキサンチン；サルブタモール、フェンテロール、クレンブテロール、バンブテロール、サルメテロール、フェノテロール等のβ２−アゴニスト気管支拡張薬；抗喘息抗炎症薬、抗関節炎抗炎症薬、および非ステロイド抗炎症薬を含む抗炎症薬；硫化物、メサラミン、ブデソニド、サラゾピリン、ジクロフェナク、薬学的に許容されるジクロフェナク塩、ニメスリド、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎｅ）、アセトミノフェン（ａｃｅｔｏｍｉｎｏｐｈｅｎ）、イブプロフェン、ケトプロフェンおよびピロキシカムを含むが、それらに限定されない実施例；サリチル酸等の鎮痛薬；ニフェジピン、アムロジピン、およびニカルジピン等のカルシウムチャネル遮断薬；カプトプリル、ベナゼプリル塩酸塩、ホシノプリルナトリウム、トランドラプリル、ラミプリル、リシノプリル、エナラプリル、キナプリル塩酸塩、およびモエキシプリル塩酸塩等のアンジオテンシン変換酵素阻害薬；ソタロール塩酸塩、チモロールマレイン酸塩、エスモロール塩酸塩、カルテオロール、プロパノール塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、ペンブトロール硫酸塩、メトプロロール酒石酸塩、メトプロロールコハク酸塩、アセブトロール塩酸塩、アテノロール、ピンドロール、およびビソプロロールフマル酸塩等のβ遮断薬（すなわち、βアドレナリン遮断薬）；クロニジン等の中枢活性α２−アゴニスト；ドキサゾシンおよびプラゾシン等のα１−アンタゴニスト；ジシクロミン塩酸塩、スコポラミン臭化水素酸塩、グリコピロレート、クリジニウム臭化物、フラボキサート、およびオキシブチニン等の抗コリン／鎮痙薬；バソプレシンおよびデスモプレシン等のバソプレシン類似体；キニジン、リドカイン、トカイニド塩酸塩、メキシレチン塩酸塩、ジゴキシン、ベラパミル塩酸塩、プロパフェノン塩酸塩、フレカイニド酢酸塩、プロカインアミド塩酸塩、モリシジン塩酸塩、およびジソピラミドリン酸塩等の抗不整脈薬；ドーパミン、Ｌドーパ／カルビドパ、セレギリン、ジヒドロエルゴクリプチン、ペルゴリド、リスリド、アポモルヒネ、およびブロモクリプチン等の抗パーキンソン病薬；硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、プロプラノロール、アテノロール、およびベラパミル等の抗狭心症薬および降圧薬；クマジン、ワルファリン、アセチルサリチル酸、およびチクロピジン等の抗凝固および抗血小板薬；ベンゾジアゼピンおよびバルビツール酸等の鎮静薬；ロラゼパム、ブロマゼパム、およびジアゼパム等の抗不安薬；カルシトニン、リュープロリドならびに他のＬＨＲＨアゴニスト、ヒルジン、シクロスポリン、インスリン、ソマトスタチン、プロチレリン、インターフェロン、デスモプレシン、ソマトトロピン、チモペンチン、ピドチモド、エリスロポエチン、インターロイキン、メラトニン、顆粒球／マクロファージＣＳＦ、およびヘパリン等のペプチド性および生体高分子薬；エトポシド、エトポシドリン酸塩、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、ロイコボリンカルシウム、タモキシフェン、フルタミド、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ミトタン、およびプロカルバジン塩酸塩等の抗悪性腫瘍薬；センナ濃縮物、カサンスラノール、ビサコジル、およびナトリウムピコスルフェート等の緩下剤；ジフェノキシン塩酸塩、ロペラミド塩酸塩、フラゾリドン、塩酸ジフェノキシラート、および微生物等の止痢薬；細菌性およびウイルス性ワクチン等のワクチン；ペニシリン、セファロスポリン、およびマクロライド、イミダゾールおよびトリアゾール誘導体等の抗真菌性薬等の抗菌薬；ならびに生物学的タンパク質、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドに対してコード化されるＤＮＡ配列等の核酸を含む。薬学活性剤は、様々な対象、例えば、ヒト（すなわち、医学的投与）または動物（すなわち、獣医学的投与）への投与に関連して使用され得ることを理解されたい。
本明細書および最終請求項で使用される化学種の残基は、特定の反応スキームまたはその後の製剤もしくは化学的な生成物中で得られた化学種の生成物である部分を指し、その部分が実際にその化学種から得られたかにはかかわらない。したがって、ポリエステル中のエチレングリコール残基は、ポリエステルにおける１つ以上の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−単位を指し、エチレングリコールがポリエステルの調製に使用されたかにはかかわらない。同様に、ポリエステル中のセバシン酸残基は、ポリエステルにおける１つ以上の−ＣＯ（ＣＨ２）８ＣＯ−部分を指し、その残基は、ポリエステルを得るために、セバシン酸またはそのエステルを反応させて得られるかにはかかわらない。
本明細書で使用される「置換」という用語は、有機化合物の全ての許容できる置換基を含むことが熟慮される。広域な態様において、許容できる置換基は、非環式および環式、分枝および分枝していない、炭素環式および複素環式、ならびに有機化合物の芳香族および非芳香族置換基を含む。例証的な置換基は、例えば、以下に説明されるものを含む。適切な有機化合物に対して、許容できる置換基は、１つ以上あり、同一のものもあれば異なるものもあり得る。この開示の目的のため、窒素等のそのヘテロ原子は、ヘテロ原子の原子価を満足させる水素置換基、および／または本明細書で説明される有機化合物のいずれの許容できる置換基を有することができる。この開示は、有機化合物の許容できる置換基によって、いずれの様式でも限定されることを意図しない。また、「置換」または「で置換」は、かかる置換は置換原子および置換基の許される原子価に従う、その置換が安定化合物をもたらす（例えば、再編成、環化、除去等によって、自然発症的に形質転換を受けない化合物）暗黙的な規定を含む。
様々な用語の定義において、「Ａ１」、「Ａ２」、「Ａ３」、および「Ａ４」は、様々な具体的な置換基を表示するための一般的記号として本明細書で使用される。これらの記号は、いずれの置換基でもあり得るが、本明細書開示されるものには限られず、それらが一事例において特定の置換基であると定義される場合、他の事例においてそれらは、幾つかの他の置換基として定義される。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等の１〜２４個の炭素原子の分枝または分枝していない飽和炭化水素基である。また、アルキル基は置換または未置換でもあり得る。アルキル基は、本明細書で説明される任意置換アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホオキソ、またはチオールを含むが、それらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。「低級アルキル」基は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基である。
本明細書にわたって「アルキル」は、未置換アルキル基および置換アルキル基の双方を指すために一般的に使用される、しかしながらまた、置換アルキル基は、アルキル基上で具体的な置換基（複数可）を同定することによっても本明細書で具体的に言及される。例えば、「ハロゲン化アルキル」という用語は、１つ以上のハロゲン化物、例えば、フッ素、クロリン、臭素、またはヨウ素で置換されるアルキル基を具体的に指す。「アルコキシアルキル」という用語は、以下で説明されるようなアルコキシ基の１つ以上で置換されるアルキル基を具体的に指す。「アルキルアミノ」という用語は、以下で説明されるようなアミノ基等の１つ以上で置換されるアルキル基を具体的に指す。一事例において「アルキル」が使用され、「アルキルアルコール」等の具体的な用語が別で使用される場合、「アルキル」という用語が、「アルキルアルコール」等の具体的な用語を指さないことを示唆することを意味しない。
また、この実践は、本明細書で説明される他の基に対しても使用される。つまり、「シクロアルキル」等の用語が未置換および置換シクロアルキル部分の双方を指すと同時に、置換部分は、加えて、本明細書で具体的に同定される、例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」として言及される。同様に、置換アルコキシは、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」として具体的に言及され得る、特定の置換アルケニルは、例えば「アルケニルアルコール」等である。また、「シクロアルキル」等の一般用語および「アルキルシクロアルキル」等の具体的な用語の使用の実践は、一般用語が具体的な用語を含まないこと示唆することを意味しない。
本明細書で使用される「ポリアルキレン基」という用語は、互いに結合している２つ以上のＣＨ２基を有する基である。ポリアルキレン基は、「ａ」が２〜５００の整数である式-（ＣＨ２）ａ-によって表示され得る。
本明細書で使用される「アルコキシ」および「アルコキシル」という用語は、エーテル結合を介して結合したアルキルまたはシクロアルキル基を指す、つまり、「アルコキシ」基は、上で説明されるように、Ａ１がアルキルまたはシクロアルキルである-ＯＡ１として定義され得る。また、「アルコキシ」は説明されたようにアルコキシ基のポリマーも含み、つまり、アルコキシは、「ａ」が１〜２００の整数であり、ならびにＡ１、Ａ２、およびＡ３がアルキルおよび／またはシクロアルキル基である、-ＯＡ１-ＯＡ２または-ＯＡ１-（ＯＡ２）ａ-ＯＡ３等のポリエーテルであり得る。
本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を含有する構造式を伴う、２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。（Ａ１Ａ２）Ｃ＝Ｃ（Ａ３Ａ４）等の不斉構造は、ＥおよびＺ異性体の双方を含むことを意図する。これは本明細書で構造式中に推定され得る、不斉アルケンが存在する、またはそれは結合シンボルＣ＝Ｃによって明示的に示唆され得る。アルケニル基は、本明細書で説明されるように任意置換アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホオキソ、またはチオールを含むが、それらに限定されない１つ以上の基で置換され得る。
本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素炭素三重結合を含有する構造式を伴う、２〜２４個の炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は未置換、または本明細書で説明されるように任意置換アルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アアリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホオキソ、またはチオールを含むが、それらに限定されない１つ以上の基で置換される。
本明細書で使用される「ペプチド両親媒性物質」という用語は、親水性部分（例えば、親水性ペプチド配列部分）および疎水性部分（例えば、炭化水素部分）の双方を所有するペプチド化合物を指す。典型的にペプチド両親媒性物質に関連する一性質は、自己構築され得る。
本明細書で使用される「親水性ペプチド配列」という用語は、炭化水素部分と比べて親水性の性質を有するペプチド残基配列を指す。親水性ペプチド配列は、１つ以上の機能的なペプチド配列（例えば、分解性ペプチド配列、一酸化窒素ドナー、および／または細胞接着性リガンド）を含み得る。
本明細書で使用される「分解配列」という用語は、生物学的状態下で酵素または加水分解によって分解され得るペプチド残基の配列を指す。
本明細書で使用される「細胞接着性配列」という用語は、細胞に対して接着性リガンドとして操作する能力があるペプチド残基の配列を指す。一態様において、ペプチド両親媒性物質の両親媒性特徴のため、開示された細胞接着性配列はナノファイバー構築の外部表面に暴露される、したがって、かかる細胞接着性配列は、１つ以上の細胞との相互作用に対して利用可能である。一実施例は、内皮細胞接着、拡散、遊走、および／または成長を支えるペプチド配列を指す「内皮細胞接着性配列」である。
本明細書で使用される「一酸化窒素を産生するドナー配列」という用語は、ペプチド残基（例えば、溶解素（Ｋ）またはシステイン（Ｃ））、またはその同等物）、または複合体（例えば、ジアゾニウムジオレート）として可逆的に一酸化窒素ガスを結合する能力があるペプチド残基の配列（例えば、ポリ溶解素（ＫＫＫＫＫ）またはポリシステイン（ＣＣＣＣＣ））を指す。したがって、ペプチドまたは配列は、一酸化窒素ガスのためのリザーバーとしての役割を果たすことができ、時間と共に一酸化窒素を選択的に放出することができる。その用語は、他の一酸化窒素ドナー、例えばシスチンまたはアミン基を含有するいずれのペプチド配列を含み得ることを理解されたい。
本明細書で使用される「自己構築」という用語は、化合物の大多数の分子の特徴を指し、そこで無秩序システムが、外部方向無しで、分子自体間で具体的、局所相互作用の結果として、より構築された構造またはパターンを形成する。一態様において、ペプチド両親媒性物質は自己構築であり得る。さらなる態様において、化合物の大多数の分子は、ナノファイバーへと自己構築され得る。さらなる態様において、ペプチド両親媒性物は、ナノファイバーへと自己構築され得る。さらなる態様において、ペプチド両親媒性物質は、架橋結合の必要性無しでナノファイバーへと自己構築され得る。
Ｂ．組成物
人工的なインプラントの生物学的適合性は、自然システムを模倣することによって改善され得る。結果的に、理想的なステントは天然内皮と同様の性質を有するべきである。したがって、本明細書で開示されるものは、天然内皮を模倣するナノマトリックスである。
天然内皮は、粘弾性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に包埋される内皮細胞から成る。また、構造的統合性を提供することに加えて、ＥＣＭは細胞増殖、分化、および遊走のために重要な動的、機能的環境を提供する（Ｒｏｓｓ ＪＭ．１９９８）。この概念は、細胞行動を調節するための生物模倣型足場に対するＥＣＭ由来細胞接着性リガンドの使用に影響を与えた。分解速度がインビトロＥＣＭ産生およびインビボ組織形成に影響を及ぼすため、足場の分解動態を調節することは他の重要な因子である（Ａｌｓｂｅｒｇ Ｅ， ｅｔ ａｌ．２００３； Ｂｒｙａｎｔ ＳＪ， ｅｔ ａｌ．２００２）。細胞遊走および増殖は、多くの異なる細胞タイプに対する細胞接着に依存する（Ｒｏｓｓ ＪＭ．１９９８）。自然ＥＣＭは、多くの自己構築されたナノ構造をした繊維性タンパク質から成る。また、内皮は一酸化窒素（ＮＯ）等の可溶性因子を放出することによって、血管の非血栓形成性環境を維持する役割も果たす。したがって、天然内皮を模倣するナノマトリックスは、内皮ＥＣＭのこの化学的および生物学的複雑性を模倣するために設計され得る：１）強い内皮細胞保持および遊走を促進するための内皮細胞接着性部分、２）強い内皮化のため、内皮細胞のナノマトリックスへの移動のための細胞媒介分解性部位、３）自然ＥＣＭと同様の自己構築されたナノ繊維性構造、および４）再狭窄および血栓症の阻害と共に、衛生内皮前駆細胞のホーミングを促進するためのＮＯの放出。
本明細書で開示されるように、天然内皮を模倣するナノマトリックスは、親水性ペプチドおよび疎水性尾部を含むペプチド両親媒性物質から産生され得る、その親水性ペプチドは、強い内皮細胞保持および遊走、強い内皮化のためのナノマトリックスへの内皮細胞遊走のための細胞媒介分解性部位、および再狭窄および血栓症の阻害と共に、付随内皮前駆細胞のホーミングを促進するためのＮＯの放出を促進するため、１つ以上の内皮細胞接着性部分を含む。
したがって、本明細書で提供されるものは、親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含むペプチド両親媒性物質であって、親水性ペプチド配列は、分解配列と、および第１の細胞接着性配列およびの１つ以上ならびにドナー配列を産生する一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含み、該第１の接着性配列は平滑筋細胞および／または血小板に結合しない内皮細胞接着性配列である、ペプチド両親媒性物質。
したがって、親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＣＡ
を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、「ＤＳ」は分解配列であり、「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列である。
親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＫＫ
を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、「ＤＳ」は分解配列であり、「ＫＫは一酸化窒素を産生するドナー配列である。
親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＣＡ−−−ＫＫ
を含む、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、「ＤＳ」は分解配列であり、「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である。
親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＫＫ−−−ＣＡ
を含む、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、「ＤＳ」は分解配列であり、「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である。
本明細書で開示されるように、ペプチド両親媒性物質は、ナノマトリックスを形成するために使用され得る。本明細書のナノマトリックスは、両親媒性物質コーティングされたナノファイバーを含み得ることが理解され、本明細書で熟慮される。本明細書で開示されるように、ナノファイバーは、例えば、ポリカプロラクトン線維等のポリエステル線維を含み得る。したがって、本明細書で開示されるものは、例えば、本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質でコーティングされるポリカプロラクトンナノファイバーである。
また、本明細書で開示されるものは、第１および第２のペプチド両親媒性物質を含む組成物であって、それぞれが独立して親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、第１のペプチド両親媒性物質の前記親水性ペプチド配列は、分解配列および内皮細胞接着性配列を含み、第２のペプチド両親媒性物質の親水性ペプチド配列は、分解配列および一酸化窒素を産生するドナー配列を含む。
したがって、第１のペプチド両親媒性物質の親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＣＡ
を含み、式中、各−−−は独立して直接的または間接的共有結合であり、「ＤＳ」は分解配列であり、「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、第２のペプチド両親媒性物質の親水性ペプチド配列は、式
ＤＳ−−−ＫＫ
を含み、「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である。
第１および第２のペプチド両親媒性物質は、開示された組成物において、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、または１：２０を含む、約１：２０〜約２０：１の比率で存在し得る。したがって、第１および第２のペプチド両親媒性物質は、約１：９〜約９：１の比率で組成物において存在し得る。
本明細書で開示された組成物はさらに、分解配列を含むが、内皮細胞接着性配列も一酸化窒素を産生するドナー配列も含まない追加のペプチド両親媒性物質を１つ以上含む。これらの１つ以上の追加のペプチド両親媒性物質は、追加の機能的部分を含み得る。これらの１つ以上の追加のペプチド両親媒性物質は、非機能的配列を含み得る。当業者は、これらの追加のペプチド両親媒性物を、第１および第２のペプチド両親媒性物質の濃度を調節するために使用できる。例えば、第１および第２のペプチド両親媒性物質が約９：１の比率で組成物において存在する場合、また、それらは組成物において、第３のペプチド両親媒性物質が、例えば、約９：１：０．１、９：１：０．２、９：１：０．３、９：１：０．４、９：１：０．５、９：１：０．６、９：１：０．７、９：１：０．８、９：１：０．９、９：１：１、９：１：２、９：１：３、９：１：４、９：１：５、９：１：６、９：１：７、９：１：８、９：１：９、９：１：１０の比率でも存在しえる。多くの他のかかる組み合わせおよび混合物は、当業者によって選択され得、日常技能を使用して最適な性能のために試験され得る。
本明細書で開示された組成物はさらに、ポリカプロラクトンナノファイバー等のポリエステルナノファイバーを含み得る。したがって、例えば、本明細書で開示されるものは、第１および第２のペプチド両親媒性物質でコーティングされたポリカプロラクトンナノファイバーであり、第１のペプチド両親媒性物質はＰＡ−ＹＩＧＳＲであり、第２のペプチド両親媒性物質はＰＡ−ＫＫＫＫＫであり、第１のペプチド両親媒性物質対第２のペプチド両親媒性物質の比率は９：１である。
１．ペプチド両親媒性物質
ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）は、単一の疎水性尾部と抱合した短い親水性ペプチド配列を典型的に伴う両親媒性である（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ ＳＥ， ｅｔ ａｌ． ２００６）。それらの形、負荷、および環境に依存して、これらの分子は、シート、球、杆体、ディスク、またはチャネルへと自己構築できる（Ｌｏｗｉｋ Ｄ， ｅｔ ａｌ．２００４）。親水性頭部が疎水性尾部よりも膨張するように、円錐体形を呈する両親媒性物質は、円柱状ミセルを形成することが知られている（Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００６）。ＰＡの両親媒性本質は、それらの自己構築に関与している。中和溶液において、ＰＡの骨格において負に荷電しているアミノ酸は、それを可溶化するのに役立つことができる。自己構築を誘発するために、負電荷の存在による反発力は、、排除され得る。これは、ＰＡ溶液のｐＨの低下または二価イオンの追加によって、達成できる（Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ ＪＤ， ｅｔ ａｌ．２００２； Ｈａｒｔｇｅｒｉｎｋ ＪＤ， ｅｔ ａｌ．２００１； Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５）。自己構築されたナノファイバー構造において、コアに最も近い４個のアミノ酸は、水素結合を形成することができる。これらの水素結合の存在または不在は、円柱状または自己構築された構造の球状配向を定義できる（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．２００６）。
両親媒性は、細胞膜等の自然生物学的システムにおいて広域に見出される。それは、複雑な階層的順序を伴う超分子構造への生体分子の自己構築の原因である主要な駆動力である。この概念は、生物模倣型足場のためのＰＡの使用を示唆する（Ｃｕｒｔｉｓ Ａ， ｅｔ ａｌ．２００１； Ｂａｒｎｅｓ ＣＰ， ｅｔ ａｌ．２００７）。細胞接着性リガンドまたは生物分解性配列等の様々な生理活性配列から成るＰＡは、自然発生する生体分子と同様の超分子構造を形成するため、生理的な状態下で自己構築され得る。近年、それらは血管の成長（Ｍａｌｋａｒ ＮＢ， ｅｔ ａｌ．２００３； Ｈｏｓｓｅｉｎｋｈａｎｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ．２００６； Ｒａｊａｎｇａｍ Ｋ， ｅｔ ａｌ．２００６）および骨組織修復（Ｈｏｓｓｅｉｎｋｈａｎｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ．２００７； Ｈｏｓｓｅｉｎｋｈａｎｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ．２００６； Ｓａｒｇｅａｎｔ ＴＤ， ｅｔ ａｌ．２００８）を含む様々な生物医学的適用のために、広範に研究されている。
それらの主鎖における異なる細胞接着および分解部分の取り込みの容易さのため、ＰＡは生物模倣型足場に対する魅力的な鋳型である（Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００６； Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５）。
幾つかの態様において、本明細書で開示されたペプチド両親媒性物質は、ナノマトリックスへの自己構築の能力があるいずれの修飾ペプチドでもあり得る。幾つかの態様において、開示されたペプチド両親媒性物質は親水性ペプチドおよび疎水性尾部を含む。親水性ペプチドおよび疎水性尾部の長さは、ペプチド両親媒性物質がナノマトリックスに自己構築する能力を維持するように、選択され得る。したがって、例えば、疎水性尾部の長さは親水性ペプチド中で増加した長さに対し、適応するために増加し得る。当業者は、選択された親水性ペプチドおよび選択された疎水性尾部を用いてナノマトリックスに自己構築するためのペプチド両親媒性物質の能力をスクリーニングするため、日常技能を使用することができる。
２．一酸化窒素（ＮＯ）
内皮から放出されるＮＯは、再狭窄カスケードにおいて多数の重要な現象を遮断することで知られている。ＮＯは、血管壁恒常性を制御する極めて重要な役割を果たす（Ｍａｒｉｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．１９９７、Ｋｕｏ ＰＣ， ｅｔ ａｌ．１９９５、Ｄａｖｉｅｓ ＫＭ， ｅｔ ａｌ．２００１）。酵素、一酸化窒素シンターゼによって、それは、健康な内皮細胞中でアミノ酸Ｌ−アルギニンから連続的に放出される。内皮から放出されるＮＯは可溶性グアニリルシクラーゼを刺激し、環式グアノシン一リン酸塩（ＧＭＰ）の濃度を増加する（Ｋｕｏ ＰＣ， ｅｔ ａｌ．１９９５）。内皮下部の血管平滑筋細胞中の環式ＧＭＰレベルの増加は、細胞内カルシウムを減少するＧＭＰ依存性キナーゼの活性化へと導き、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の弛緩をもたらしている。血管の突然の狭窄に応答するＳＭＣの局所弛緩は、層状の血流の維持にとって重大な意味を持つ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＳ．１９９６）。血管管腔へ放出されるＮＯは、血小板中の環式ＧＭＰレベルも増加させる。それは血小板活性化および内皮の表面への接着を減少し、血管壁非血栓形成性を与える。血小板から放出される成長因子の活性を阻害することによって、ＮＯは血管内の細胞環境を制御する（Ｋｕｏ ＰＣ， ｅｔ ａｌ．１９９５）。その抗血栓形成の役割を前提として、ＮＯの取り込みは、人工血管の生物学的性質を改善することを期待される。ＮＯ放出ポリマーは、心血管デバイスに対し、非血栓形成性コーティング剤としての使用のためのポリ（塩化ビニル）、シリコンゴム、ポリメタクリル酸、およびポリウレタン等の開発に成功した（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＭＭ， ｅｔ ａｌ．２００４、Ｖｅｒｍａ Ｓ， ｅｔ ａｌ．２００５）。例えば、ＮＯは、ジアゼニウムジオレートの形態で血管移植片に組み込まれることに成功している（特殊なクラスの化合物は血中でＮＯを放出する能力がある）（Ｐｕｌｆｅｒ ＳＫ， ｅｔ ａｌ．１９９７）。ウサギにおける初期の研究では、チャネル付ステント中に負荷されたＮＯ含有微粒子からのＮＯの制御放出が、ステント内再狭窄を限定したことを示す（Ｄｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ．２００４）。他の２８日の研究において、ナトリウムニトロプルシドからのステントに基づく一酸化窒素の送達は、ブタのモデルで調査され、新生内膜増殖を減少することを示す（Ｈｏｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ．２００５）。また、前述の機能に加え、ＮＯは内皮細胞成長、生存、および遊走を促進させるその能力でも知られている（Ｚｉｃｈｅ Ｍ， ｅｔ ａｌ．１９９４、Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ．２００３）。また、ＮＯは部分的に循環内皮前駆細胞の動員によって、血管新生においても重大な役割を果たしている（Ａｉｃｈｅｒ Ａ， ｅｔ ａｌ．２００３）。この効果に対して、ハイドロゲルからのＮＯの局所送達は、血管再内皮化の率を増強することを示している（Ｌｉｐｋｅ ＥＡ， ｅｔ ａｌ．２００５）。
抗血栓形成性、ＮＯの恒常性およびプロ内皮化性質は、それを、ステント上でコーティングされる治療薬として、魅力的な候補にする。しかしながら、数秒のみのインビボの短い半減期は、ＮＯを、全身性薬物としての直接的投与に対して非好適にする（Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ．２００７）。また、ＮＯガスは、その酸化を阻止するために必要とされる完全な酸素排除の必要性ため、取り扱いが困難である。故に、ＮＯ担体は、放出の時間までに、それを安定化させるために使用される（Ｈａｎｓｏｎ ＳＲ， ｅｔ ａｌ．１９９５、Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ．２００７）。現在、ＮＯドナー薬物の２つのタイプは臨床的に使用されている：（１）有機硝酸および（２）ナトリウムニトロプルシド（Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ．２００７）。ニトログリセリンは臨床的に使用される有機硝酸である。それは、心不全および慢性アンギナの治療ために経皮吸収パッチで使用される。ニトログリセリンは、酵素媒介放出を受ける３つのニトロキシエステル（亜硝酸塩）基を含有する。この薬物の主要な限界因子は、遷延した連続的な使用後、耐性の発現である。ナトリウムニトロプルシドは、高感受性発作において血圧を減少させるために病院の現場で使用される。それは、５個のシアン化物分子および１個のＮＯ分子に協調された鉄分子を含有する。ＮＯ分子は、シアン化物分子が徐々に遊離されるのに対して、注入間に迅速に放出される。これらのシアン化物分子は、幾つかの場合において有害なレベルに達し得る、この薬物の使用に対する主要な限界を表示している（Ｇｏｒｉ Ｔ， ｅｔ ａｌ．２００２）。
本明細書で開示されるものは、ジアゼニウムジオレートと称されるＮＯ放出化合物のクラスであり、ＮＯＮＯエート（ＮＯＮＯａｔｅ）としても知られている。これらの化合物の化学構造は、その名称から推論できる：ジアゼンＮ＝Ｎ、ｉｕｍ：正式な正の負荷、ジオレート：２つの負の酸素（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．２００６、Ｓａａｖｅｄｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．２０００）。
以下は、ジアゼニウムジオレートの化学構造である、
ジアゼニウムジオレートは、以下の反応で示されるように、求核性アミン（Ｘ−）のＮＯとの反応によって形成され得る、
Ｘ−＋２ＮＯ→Ｘ−［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］−
次いで、ジアゾニウムジオレートは、以下の反応で示されるように、遊離ＮＯを放出するためにプロトン付加で解離する、
Ｘ−［Ｎ（Ｏ）ＮＯ］−→Ｘ−＋２ＮＯ
電子アクセプター性質により、ＮＯはジアゾニウムジオレートを形成するため、求核アミンと反応できる。緩衝液、血液、または細胞培地に溶解される場合、ジアゼニウムジオレートはプロトン付加およびＮＯを放出するための解離を受ける（Ｓａａｖｅｄｒａ Ｊ， ｅｔ ａｌ．２０００、Ｋｅｅｆｅｒ ＬＫ， ｅｔ ａｌ．１９９６、Ｈｒａｂｉｅ ＪＡ， ｅｔ ａｌ．２００２）。放出動態は、求核アミンの構造によって、調節され得る。ジアゼニウムジオレートは、空気不在の中、高圧下でアミンとの直接的反応によって合成され得る。
他の一酸化窒素放出ジアゼニウムジオレート化合物は、当技術分野において知られている。例えば、数秒〜数日間の生理的なｐＨ範囲である半減期と共に、窒素および炭素に基づくＮＯドナー複合体は、当技術分野において利用可能である。
最も一般的なジアゼニウムジオレートは、塩基性培地で一酸化窒素と第２のアミンおよびポリアミンの反応によって形成される。これらは安定固体であり、中性または酸性緩衝液中で一酸化窒素および開始アミンの２つの同等物を再生する能力がある。ＮＯ産生の半減期は、アミンによって数秒〜数時間と変化する。一定のｐＨで、ＮＯの分解物は自発的、第一次の反応物である。非誘導体化ジアゼニウムジオレートの例：
ｉ．Ｏ−誘導体化ジアゼニウムジオレート
ジアゼニウムジオレートアニオンは求電子試薬と反応し、安定共有結合性化合物を産生する。これらの化合物はプロドラッグとして作用する能力を有し、代謝的にジアゼニウムジオレートアニオンに変換する場合のみ、一酸化窒素を放出する。このクラスの幾つかの化合物は、アルキル、またはアリールハロゲン化物、硫酸エステル、エポキシド等のイオン性ジアゼニウムジオレートとの反応によって合成される。Ｏ−誘導体化ジアゼニウムジオレートの例：
ｉｉ．Ｃに基づくジアゼニウムジオレート
数々のＸ線構造決定によって示される結合の正確な説明ではないが、炭素に結合するジアゼニウムジオレート基を含有する化合物は、「イソニトラミン」および「ニトロソヒドロキシルアミン」等の名称の下、１００年以上も知られている。炭素への結合が明らかに新しいＮＯドナーの設計に対して柔軟性の大きな利点を表示すると同時に、これらの物質の全てが自然発症的にＮＯを産生するわけではないことが認識されなければならない。これらの化合物の反応性の範囲は、少しのＮＯも産生されない（まれである）ほど安定している物質から、激烈に分解する物質（また、まれである）までときわめて幅広い。また、多くは、ＮＯおよび純粋ＮＯよりはむしろＮ２Ｏの混合物をも産生する。Ｃに基づくジアゼニウムジオレートの例：
ｉｉｉ．ポリマーに基づくジアゼニウムジオレート
ＮＯ放出の経時変化を調節するため、また体の選択された部位へのＮＯ暴露を制限するため、ジアゼニウムジオレート機能基はポリマーマトリックスへと組み込まれ得る。ＮＯ放出ポリマーは、膜、微粒子、およびゲルから粉末および成形樹脂の範囲である。ポリマージアゼニウムジオレートは、動脈内デバイス中で血栓抵抗力を改善させるために示され、心血管研究において重要なツールとしての役割を果たす。ポリマーに基づくジアゼニウムジオレートの例：
ｉｖ．溶解素
好ましくは、求核性アミンは、アミノ酸（天然または人工）の側鎖（Ｒ基）上にある。例えば、求核性アミンは、溶解素の側鎖（Ｒ基）上にある。以下に示されるように、溶解素は、ＮＯ結合のため２つのペンダントアミン基を有する。
溶解素に基づくポリマーからのＮＯの制御放出は血小板結合および平滑筋細胞増殖を減少させることが示され、それらは再狭窄の主要な原因である（Ｊｕｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．２００５、Ｂｏｈｌ ＫＳ， ｅｔ ａｌ．２０００、Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５）。溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］ｎを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を有することができる。
したがって、一酸化窒素を産生するドナー配列は、１つ以上のジアゼニウムジオレート修飾溶解素残基を含み得る。したがって、一酸化窒素を産生するドナー配列は、ジアゼニウムジオレート修飾アミノペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］ｎを含むことができ、「ｎ」は１〜２０である。幾つかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上である。したがって、一酸化窒素を産生するドナー配列は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］５を含み得る。
一酸化窒素を産生するドナー配列は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む１つ以上の溶解素残基を含み得る。したがって、一酸化窒素を産生するドナー配列は、アミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含むことができ、１つ以上の溶解素残基はジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するために、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。
一酸化窒素を産生するドナー配列は、修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントチオール基を含む１つ以上のシステイン残基を含むことができる。したがって、一酸化窒素を産生するドナー配列は、アミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（配列番号１７）を含むことができ、１つ以上のシステイン残基は修飾ペプチドを形成するために、ＮＯと反応するペンダントチオール基を含む。
各溶解素残基は、２個の一酸化窒素分子に対するドナーであり得ることを理解されたい。溶解素残基またはジアゼニウムジオレート修飾溶解素残基の数は、したがって、望まれるＮＯの量に基づいて選択され得る。これは、これら溶解素残基を含むペプチド両親媒性物質の量または濃度を選択することによって、当業者によりさらに制御され得る。例えば、本明細書で開示されるのは、９：１の比率で、内皮細胞接着配列（「ＰＡ−ＹＩＧＳＲ」）を含む第１のＰＡおよびＮＯドナー配列（「ＰＡ−ＫＫＫＫＫ」）を含む第２のＰＡを含む、内皮を模倣するマトリックスであり、ＰＡ−ＫＫＫＫＫは５つのジアゼニウムジオレート修飾溶解素残基を含む。したがって、当業者は、ジアゼニウムジオレート修飾溶解素残基の数を第２のペプチド両親媒性物質中で増加させることによって、第１のＰＡ対第２のＰＡの比率を付随して増加させることによって（＞９：１）、同一の結果を達成することができる。
したがって、ＮＯ放出の比率および持続時間は、溶解素の数における増加、または第２の両親媒性物質の割合における増加は、ＮＯ放出の比率および／または持続時間を増加するように、第２のＰＡにおいて溶解素の数を増加または減少することによって、あるいは第１および第２のペプチド両親媒性物質の比率を変化することによって調節され得ることが本明細書で理解される。したがって、例えば、ＮＯ放出の比率および／または持続時間は、第２の両親媒性物質における溶解素の数を、ＰＡ−ＫＫＫＫＫから、例えば、ＰＡ−ＫＫＫＫＫＫ、ＰＡ−ＫＫＫＫＫＫＫ、ＰＡ−ＫＫＫＫＫＫＫＫ、ＰＡ−ＫＫＫＫＫＫＫＫＫ、またはＰＡ−ＫＫＫＫＫＫＫＫＫＫに変化することによって、増加されることができる。また、第１の両親媒性物質と比べて第２の両親媒性物質の比率を増加することによって、ＮＯ放出の持続時間および／または比率を増加し得る。したがって、ＮＯ放出の比率および／または持続時間は、ＰＡ−ＹＩＧＳＲ対ＰＡ−ＫＫＫＫＫ比率を９：１から、例えば９：２、３：１、９：４、２：１、９：５、３：２、９：７、９：８、１：１、９：１０、９：１１、３：４、３：５、１：２、３：７、３：８、１：３またはいずれの中間比率へと変化するこによっても増加されるであろう。
同様に、ＮＯ放出の比率および／または持続時間は、ＰＡ−ＹＩＧＳＲ対ＰＡ−ＫＫＫＫＫの比率を減少することによって、またはＰＡ−ＫＫＫＫＫから溶解素を除去することによって、減少され得る。したがって、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１ １４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、またはいずれの中間比率のＰＡ−ＹＩＧＳＲ対ＰＡ−ＫＫＫＫＫの比率は、比率９：１と比べて、ＮＯ放出の比率および／または持続時間が減少されるであろう。また、ＰＡ−ＫＫＫＫＫ中の５からの溶解素の数を減少することは、ＮＯ放出の比率および／または持続時間を減少するであろう（すなわち、ＰＡ−ＫＫＫＫ、ＰＡ−ＫＫＫ、ＰＡ−ＫＫ、またはＰＡ−Ｋ）。
３．ＥＣ接着
ＤＥＳの管腔中の内皮細胞の保持は、その実施にとって重大な意味を持つ。内皮化は、暴露されたステント表面にコーティングされる非血栓形成性をもたらし、その不在は、ステント支柱を流れる血液に間接的に接触させ、血栓形成が結果として生じる。ラミニンは、基底膜の主要な非コラーゲン性グリコタンパク質成分であり、細胞接着、遊走、成長、および分化のメディエータである（Ｂｅｃｋ Ｋ， ｅｔ ａｌ．１９９０）。ＹＩＧＳＲ（配列番号２）は、ラミニン由来細胞接着性配列であり、内皮細胞の結合、拡散、遊走を増強することで知られている（Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ， ｅｔ ａｌ．１９９１）。ＹＩＧＳＲ を介す細胞の拡散（配列番号２）は、６７−ｋＤａ細胞膜に関連する受容体によって媒介される（Ｍａｓｓｉａ ＳＰ， ｅｔ ａｌ．１９９３）。ポリエチレンテレフタラートおよびポリテトラフルオロエチレン等の表面の修飾のためのＹＩＧＳＲの使用（配列番号２）は、ＥＣ接着、拡散、遊走を選択的に増強する（Ｍａｓｓｉａ ＳＰ， ｅｔ ａｌ．１９９１、Ｆｉｔｔｋａｕ ＭＨ， ｅｔ ａｌ．２００５）、ＥＣコロニー形成を促進させることが明らかにされた。
ポリウレタン中のＹＩＧＳＲ（配列番号２）配列の取り込みは、内皮細胞接着および拡散を増強することを示している（Ｊｕｎ Ｈ， ｅｔ ａｌ．２００４）。ＮＯ放出ポリウレタンは、ポリマー中で溶解素に基づくジアゼニウムジオレートを組み込むことによって発達した（Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５）。このポリマーは、内皮細胞接着を刺激すると同時に、血小板接着を劇的に減少させ、平滑筋細胞増殖を阻害することを示している。さらに、血小板結合を阻害すると同時に、ＹＩＧＳＲ（配列番号２）配列のＮＯ放出ポリマー主鎖への取り込みは、内皮細胞増殖を増強することが観察されている（Ｔａｉｔｅ ＬＪ， ｅｔ ａｌ．２００８）。
したがって、開示された親水性ペプチドは、内皮細胞と選択的に結合する第１の接着性配列を含むことができ、したがって、内皮細胞の開示されたペプチド両親媒性物質を含むナノマトリックスへの結合を選択的に促進する。したがって、開示された親水性ペプチドは、内皮細胞に結合するが、平滑筋細胞および／または血小板に実質的には結合しない内皮細胞接着性配列を含む第１の接着性配列を含むことができる。したがって、開示された親水性ペプチドの内皮細胞接着性配列は、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ、配列番号２）を含むことができる。
さらに、開示されたペプチド両親媒性物質の親水性ペプチドは、もう１つ追加の細胞接着性配列を含むことができる。幾つかの態様において、もう１つ追加の細胞接着性配列は内皮細胞に結合し、したがって、開示されたペプチド両親媒性物質を含むナノマトリックスへの内皮細胞の結合を促進する。したがって、もう１つ追加の細胞接着性配列は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号８）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号９）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号１０）、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１１）、Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ（配列番号１２）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（配列番号１３）、およびＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号１４）のうちの１つ以上であり得る。内皮細胞接着性配列（選択的および非選択的）を含む、他のかかる細胞接着性配列が知られており、開示されたペプチド両親媒性物質中で使用することができる。当業者は、候補細胞接着性配列を含むペプチド両親媒性物質を、日常インビトロ法を使用してスクリーニングできる。
４．分解配列
分解配列は、細胞媒介タンパク質分解性分解を受けるアミノ酸配列を含むことができる。
幾つかの態様において、分解配列はマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）特異的切断部位を含む。（ＭＭＰは、メトジンシンスーパーファミリーとして知られる、プロテアーゼのより大きなファミリーに属する亜鉛依存性エンドペプチダーゼである。
最も一般的使用されるＭＭＰの分類は、ＭＭＰの基質特異性の歴史的査定に部分的に基づいており、ＭＭＰの細胞局在性にも部分的に基づいている。これらの基は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、および膜タイプＭＭＰ（ＭＴ−ＭＭＰ）である。
コラゲナーゼは、特徴的な３／４および１／４断片へと三重らせん繊維性コラーゲンを分解する能力がある。これらのコラーゲンは骨および軟骨の主要な成分であり、ＭＭＰは、唯一知られているそれらを分解する能力がある哺乳類の酵素である。典型的に、コラゲナーゼはＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、およびＭＭＰ１８である。また加えて、ＭＭＰ１４は繊維性コラーゲンを切断することが示されており、さらによく議論されるように、ＭＭＰ２にはコラーゲン分解の能力があるという証拠が存在する。
ゼラチナーゼの主要な基質はタイプＩＶコラーゲンおよびゼラチンであり、これらの酵素は、触媒ドメインへと挿入される追加のドメインの存在によって区別される。このゼラチン結合領域は亜鉛結合モチーフの前に即時に配置され、触媒ドメインの構造を破壊しない別々のフォールディング単位を形成する。ゼラチナーゼはＭＭＰ２およびＭＭＰ９である。
ストロメライシンは、細胞外マトリックスタンパク質を切断する広域な能力を掲示するが、三重らせん繊維性コラーゲンを切断することはできない。この基の３つの正規メンバーは、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、およびＭＭＰ１１である。
全ての６つの膜タイプＭＭＰ（ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ２４、およびＭＭＰ２５）は、プロペプチド中にフューリン切断部位を有し、それはＭＭＰ１１でも共有される特徴である。
追加のＭＭＰ切断部位の例は知られており、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａｌａｎ Ｊ． Ｂａｒｒｅｔｔ， Ｎｅｉｌ Ｄ． Ｒａｗｌｉｎｇｓ， Ｊ． Ｆｒｅｄ Ｗｏｅｓｓｎｅｒ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて説明される。
したがって、分解配列はマトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ２）特異的切断部位を含む。例えば、分解配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）を含み得る。
ＰＡ主鎖におけるＭＭＰ−２特異的配列等のＭＭＰ特異的配列の取り込みは、ナノマトリックスが細胞媒介タンパク質分解性分解を受けることを保証することができ、ナノマトリックスを介して細胞遊走を可能とし、天然ＥＣＭとの再構築が結果として生じる（Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５、Ｇｉａｎｎｅｌｌｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ．１９９７）。ＭＭＰ２の場合、この切断は、グリシン残基とロイシン残基との間で行われると考えられる（Ｊｕｎ ＨＷ， ｅｔ ａｌ．２００５）。
５．疎水性尾部
疎水性尾部は、任意置換Ｃ４またはより大きなアルキル鎖を有する部分を含むことができる。したがって、疎水性尾部は、任意置換Ｃ６〜Ｃ２８またはより大きなアルキル鎖を有する部分を含むことができる。したがって、疎水性尾部は、任意置換Ｃ１０〜Ｃ２５またはより大きなアルキル鎖を有する部分を含むことができる。したがって、疎水性尾部は、任意置換Ｃ５、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、またはより大きなアルキル鎖を有する部分を含むことができる。したがって、疎水性尾部は、任意置換Ｃ１６アルキル鎖を有する部分を含むことが出来る。
６．具体的な実施形態
親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）およびアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号２）を含むことができる。したがって、親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号４）を含むことができる。
親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）およびアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。したがって、親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号５）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。
親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号２）、およびアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。したがって、親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号６）を含む親水性ペプチド配列を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。したがって、親水性ペプチド配列は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号７）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。
７．エレクトロスピニング
また、線維形成産業においては静電スピンとしても知られている、線維を形成する能力がある液体および／または溶液のエレクトロスピニング技術は、よく知られており、多数の特許ならびに一般的な文献において説明されている。典型的に、エレクトロスピニングのプロセスは、液体の表面での電場の作成を一般的に含む。このプロセスによって産生される線維は、広域で多様な適用に使用され、米国特許第４，０４３，３３１号および４，８７８，９０８号より、不織布構造の形成において特に有用であることが知られている。得られた電気力は、電荷を運ぶ液体の噴流を作成する。したがって、液体噴流は、好適な電位で荷電された他の物体に誘引され得る。液体の噴流が伸長し移動するたびに、それは硬化し乾燥するであろう。伸長した液体の噴流の硬化および乾燥は、液体の冷却によって引き起こされ得る、すなわち液体が室温では通常固体である場合、溶剤の蒸発は、例えば脱水（物理的に誘発された硬化）、治癒機構（化学的に誘発された硬化）による。産生された線維は好適に位置され、逆に負荷されたレシーバ上に収集される、その後必要に応じてそれから除去される、または逆に負荷された一般化された標的領域に直接的に適用される。
一態様において、エレクトロスピニング（ＥＳ）は、静電場および流体間の相互作用を活用する、流体の原子化プロセスである。一態様において、流体は伝導流体である。エレクトロスピニングの間、ミクロンまたはサブミクロンの大きさである直径を伴う線維は、ポリマー溶液からの静電電位の手段として押し出される（米国特許第１，９７５，５０４号、Ｆｏｒｍｈａｌｓを参照されたい）。外部静電場が流体（例えば、セミ希釈ポリマー溶液またはポリマー融解物）に適用される場合、懸濁された円錐液滴が電場と共に平衡状態にある。静電場が液体の表面張力を克服するのに十分に強い場合、静電噴霧が発生する。次いで、液体液滴は不安定になり、小さい噴流は液滴の表面から駆出される。それが接地された標的に達すると、比較的微細、すなわち小さな直径の線維を含有する相互接続された線維として、物質は収集されることができる。これらの小さな直径の線維から得られた膜（または複数の膜）は、非常に大きな表面領域対体積比率および小さなポアの大きさを有する。このプロセスは、典型的に非常に柔軟であるラウンド繊維から成る不織布マットまたはフェルトを産生する。高表面領域および優れた機械特性のため、電気紡糸メッシュは濾過および複合材料強化材において典型的に適用を見出す。全く同一の理由のため、ポリ（乳酸）およびそのグリコール酸ならびに他のポリエステルを伴う共重合体等の生体適合性ポリマーに由来するフェルトおよびメッシュは、組織工学において細胞の関連を基質（足場）として探究されている（エチレンビニルアルコール、プロパノール７０％、および水３０％を含有する単相システムからエレクトロスピニングプロセスよって作製される線維を説明するＫｅｎａｗｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３，２４（６），９０７を参照されたい）。かかる柔軟な多孔性培地は、皮膚、血管、および神経人工装具の工学に特に好適である。
ＥＳプロセスにおいて変化し得るパラメータは、電場、「テイラーコーン」および標的間の距離、およびポリマー溶液粘性である（Ｆｒｉｄｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇ． Ｃ． Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ｌｅｔｔ．２００３，９０（１４），１４４５０２）。線維形成プロセスの複雑性のため、電子紡糸線維の幾何学を変えるための試みは非常に少ない。近年、Ｒｅｎｅｋｅｒおよび共同研究者達は、分枝およびリボン状の線維の形成を幾つかの溶剤システムにおいて観察し、ガーデンホースにおけるものと同様の座屈不安定性のため、この形成がポリマーの表皮の崩壊の原因であるとした（Ｋｏｏｍｂｈｏｎｇｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ．： Ｐａｒｔ Ｂ：Ｐｏｌｙｍ． Ｐｈｙｓ．２００１，３９，２５９８−２６０６を参照されたい）。しかしながら、かかる線維の形成は、一般的に知られているＥＳの作動状態下において、予想可能な様式で達成可能ではない。参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第４，３２３，５２５号および第４，６８９，１８６号、Ｂｏｒｎａｔは、線維形成物質を含有する液体を静電気的にスピンすることによる管状製品の製造のためのプロセスを対象とする。
ＥＳは、直径がミクロン大またはサブミクロン大である線維が静電電位によってポリマー溶液から押し出されるプロセスである（図５）。典型的なＥＳプロセスにおいて、高電位ＤＣ場（例えば、５−３０ｋＶ）に供すると同時に、ポリマー溶液はノズルを介して注入される。かかる状態下において、「レイリー不安定性」と称される現象に供する液滴のため、ポリマー溶液は「テイラーコーン」へと噴出され、ポリマー噴流の発泡を導く。噴流が推進されるたびに、線維の形成は、溶剤蒸発および噴流の菲薄化によって促進される。線維形態に影響を与えるために変化するパラメータは、電界強度、「テイラーコーン」および標的間の距離、ポリマー溶液の粘性を含む。「テイラーコーン」形成の複雑性のため、線維形態を調節する大抵の試みは、ポリマー溶液性質を調節することに集中している。これは、ポリマー濃度または分子量を増加する、あるいは有機溶剤の揮発性を増加するかのどちらかによって達成され得る、その全てが、スピンの間、ポリマー線維が凝固する速度を速める。一般的に、粘性および溶剤揮発性の増加はより厚い線維をもたらしている。
従来のアプローチの限界は、双方とも表面領域を増加させることによって細胞相互作用に非常に影響する、態様比率（ラウンド対フラット線維）および線維空隙率等の他の線維性質変化することを可能としないことであり、それは細胞に接触する適用および組織工学（ＴＥ）おいて望ましい性質である。
優れた機械的性質、高表面領域対重量比率、および柔軟性は、電子紡糸線維を濾過および複合材料強化材における広域な範囲の適用の候補へとした。また、具体的なポリマー性質と併用してこれらの特性は、電子紡糸フェルトを組織工学の足場ならびに薬物送達デバイスに適したものにする。電子紡糸物質は、典型的に高いアスペクト比を所有し、それは、様々な適用、例えば組織工学（ＴＥ）適用に対して望ましい性質であり得る。
典型的に線維直径は、電界強度を変化することによって（印加電圧または先端から標的の距離のどちらかを変化することによって）、蒸発率（スピン環境を変化することを通して、または異なる揮発度の溶剤を使用することを通して）を変化することによって、またはポリマー濃度を変化することによって調節される。最後の方法は、ポリマー濃度は調節するのに容易な変数であり、繰り返し可能および強烈な効果を線維直径に与えるため、研究者達の間で特定の人気を有する。この方法は、固体線維沈殿物の前に溶液から蒸発しなければならない溶剤の量、および溶液の粘性の双方を変化させることによって行う、故に、「テイラーコーン」形成および最終噴流直径が生ずる。
従来の方法において、表面幾何学および電子紡糸ナノファイバーの形態は、修飾するのに困難である。典型的電子紡糸線維は、幾つかのポリマー／溶剤システムで観察される多孔性おおびフラット線維形態を介して円形断面を採用するが、わずかな研究しかこれらの形態を調節することに成功していない。線維断面形を修飾するために使用される一般的な技術は、ポリマーを相互スピンさせ、選択的に特定のポリマー相を除去するためである。より近年のアプローチは、非混合第二相および同軸性紡糸口金を使用することによって、中空繊維形態を産生することに成功している。双方の技術は、複雑なプロセスのステップまたは望ましい最終形を達成するための専門化されたエレクトロスピニング装置のどちらかを含む。
従来のエレクトロスピニング技術において最も調節されたパラメータのうちの１つは、溶解されたポリマーの濃度を変化させることである。典型的にこれは、エレクトロスピニング中の線維形成プロセスおよび時間尺度をいかに変化するかによって、最終線維直径を調節することを可能とする効果を有する。ポリマー濃度に加えて、さらに重要なパラメータのうちの１つは、溶液の粘性である。粘性は、「テイラーコーン」形成および安定性において大きな役割を果たす。
しかしながら、ポリマー溶液の濃度を変化することは２つの限界を有する。低濃度溶液は、適切に「テイラーコーン」を形成するための粘性を欠き得る。従来の技術において、単一の帯電噴流を描く代わりに、紡糸口金からの噴流を複数の液滴に分解した。このプロセスは電気スプレイと称され、表面コーティングおよびインクジェット印刷の適用の様なプロセスにおいて利用されている。
本明細書で開示されたＰＡは、例えば、ポリエステルナノファイバー（例えば、電子紡糸ポリカプロラクトン（ｅＰＣＬ）ナノファイバー）等の電子紡糸ナノファイバー上にコーティングされ得る。本明細書で開示されたＰＡは、幾つかの手段のうちの１つにおいて、ｅＰＣＬ上にコーティングされ得る。圧力勾配はシリンジの形成において使用され得る。ｅＰＣＬナノファイバーディスクは、シリンジのバレル中に配置されることができ、ＰＡ溶液はそれを通して押し出されることができる。これは反対側からも繰り返されることができる。代替的に、ｅＰＣＬナノファイバーは、回転技術を用いてＰＡでコーティングされ得る。部分的にＰＡ溶液中に浸漬されると同時に、ｅＰＣＬナノファイバーは、マンドレル上に乗り、回転することができる。
ナノファイバー形成に対して好適なポリマーは、エレクトロスピニングに対して好適なものを含む。例えば、ポリマーは、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオレフィン、またはポリカーボネートであり得る。一態様において、ポリマーは無定形生物分解性ポリエステルであり得る。ポリマーは分枝または直鎖であることが熟慮される。また、遮断および移植片共重合体を含む共重合体も熟慮される。また、ポリマー混合物は、開示される方法および組成物において用いることができる。
一態様において、好適なポリマーは、ポリエステル、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリリン酸塩、ポリリン酸エステル、ポリジオキサノン、ポリホスホン酸エステル、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリカーボネート、ポリアルキル炭酸塩、ポリオルト炭酸塩、ポリエステルアミド、ポリアミド、ポリアミン、ポリペプチド、ポリウレタン、ポリエーテルエステル、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレン酸化物、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、およびその組み合わせを含む。
さらなる態様において，好適なポリマーは、ポリ（ラクチド）−コ−（ポリアルキレン酸化物）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−コ−（ポリアルキレン酸化物）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）−ｂ−（ポリアルキレン酸化物）、およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド−コ−カプロラクトン）−ｂ−（ポリアルキレン酸化物）を含む。
さらなる態様において、好適なポリマーは、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（バレロラクトン）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−バレロラクトン）、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン）、ポリ（グリコリド−コ−バレロラクトン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド−コ−カプロラクトン）、およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド−コ−バレロラクトン）を含む。
さらなる態様において、好適なポリマーは、ポリ（ラクチド）−コ−ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）−コ−ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）−ｂ−ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド−コ−カプロラクトン）−ｂ−ポリ（ビニルピロリドン）を含む。
一態様において、ポリマー線維は、当業者に知られているいずれの生体適合性ポリマーも含み得る。さらなる態様において、ポリマー線維は、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはポリ（ε−カプロラクトン）、またはその共重合体、もしくはその混合物を含む。さらなる態様において、線維のポリマーは、ポリエチレンおよび／またはポリウレタンであり得る。さらなる態様において、ポリマーは、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（グラクサノン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ピロリ酸）、およびポリ（ホスファゼン）であり得る。使用できる追加のポリマーは、ポリアルキレンポリマーおよび共重合体、フルオロ炭素ポリマーおよび共重合体、ポリエステルポリマーおよび共重合体、ポリエーテルポリマーおよび共重合体、シリコンポリマーおよび共重合体、ならびにポリウレタンポリマーおよび共重合体を含むが、それらに限定されない。使用できる他のポリマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ（テトラフルオロエチレン−コ−ヘキサフルオロプロペン）、修飾エチレン−テトラフルオロエチレン共重合体、エチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体、ポリビニリデンフルオリド、ポリエチレン酸化物、ポリエチレンテレフタラート、シリコン、ポリウレタン、ポリエーテル遮断アミド、およびポリエーテルエステルを含むが、それらに限定されない。さらなる態様において、ポリマーは、１つ以上のポリマー、例えば、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリ（ｐ−フェニレンビニレン）、ポリパラレン（ｐｏｌｙｐａｒａｌｅｎｅ）、またはその混合物であり得る。さらなる態様において、ポリマーはポリ（エチレンビニル酢酸）であり得る。
一態様において、ポリマーは、生体適合性ポリマーである。一態様において、ポリマーはポリカプロラクトンである。さらなる態様において、ポリカプロラクトンは、両親媒性合成遮断共重合体の疎水性遮断として使用される。
一態様において、ポリマーは分解性ポリマーである。「分解性」とは、特定の状態下でしばらくして、ポリマーが分解することを意味する。さらなる態様において、ポリマーは「生物分解性」ポリマーであり、生理的な状態下でしばらくして分解する。さらなる態様において、ポリマーは非分解性および／または非生物分解性である。例えば、ポリマーは１つ以上の加水分解性結合を含むことができる。加水分解性結合の存在は、生物学的システムにおいてナノファイバーの分解を促進できる。さらなる態様において、ポリマーは１つ以上の加水分解性結合を含まない。
８．ＥＣＭを模倣するナノマトリックス
本明細書に開示されたものは内皮を模倣するナノマトリックスであり、ナノファイバーに構築された本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質の１つ以上を含む。ナノファイバーは、式ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫを有するペプチド両親媒性物質の混合物を含み得る。
ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、約２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３：、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、または１：２０を含む約１：２０〜約２０：１の比率でナノファイバー中に存在し得る。したがって、ナノファイバーは、式ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫを有するペプチド両親媒性物質の混合物を含み得る。ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、約１：９〜約９：１の比率でナノファイバー中に存在し得る。本明細書で開示されるように、この比率は、当業者により、ペプチド両親媒性物質および望ましいＮＯ放出の１つ以上において、ジアゼニウムジオレート修飾溶解素残基の数にある程度基づいて選択され得る。
開示された内皮を模倣するナノマトリックスのＤＳ−−−ＣＡペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）およびアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号２）を含み得る。したがって、開示された内皮を模倣するナノマトリックスのＤＳ−−−ＣＡペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号４）を含み得る。
開示された内皮を模倣するナノマトリックスのＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）と、溶解素残基のうちの１つ以上とを含むことができ、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するために一酸化窒素と反応するペンダントアミン基を含む。したがって、開示された内皮を模倣するナノマトリックスのＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）およびアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するために一酸化窒素と反応するペンダントアミン基を含む。したがって、開示された内皮を模倣するナノマトリックスのＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号５）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。幾つかの態様において、ＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］ｎを形成するために一酸化窒素と反応する。幾つかの態様において、ｎは１〜２０であり得る。幾つかの態様において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上であり得る。幾つかの態様において、ＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］５を形成するため一酸化窒素と反応する。
開示された内皮を模倣するナノマトリックスのナノファイバーは、式ＤＳ−−−ＣＡ−−−ＫＫ、ＤＳ−−−ＫＫ−−−ＣＡを有するペプチド両親媒性物質、またはその組み合わせを含むことができる。例えば、ＤＳ−−−ＣＡ−−−ＫＫおよびＤＳ−−−ＫＫ−−−ＣＡペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１）、アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号２）、およびアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。例えば、ＤＳ−−−ＣＡ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号６）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。ＤＳ−−−ＫＫ−−−ＣＡペプチド両親媒性物質は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（配列番号７）を含むことができ、溶解素残基は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成するため、ＮＯと反応するペンダントアミン基を含む。
幾つかの態様において、開示された内皮を模倣するナノマトリックスのペプチド両親媒性物質は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］ｎを形成するために一酸化窒素と反応する。幾つかの態様において、ｎは１〜２０である。幾つかの態様において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上である。したがって、幾つかの態様において、ペプチド両親媒性物質は、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］５を形成するために一酸化窒素と反応する。
本明細書に開示されるものは、ＮＯ放出ペプチド両親媒性物質（ＰＡｓ）でコーティングされる電子紡糸ポリカプロラクトン（ｅＰＣＬ）ナノファイバーを含むハイブリッドナノマトリックスである。近年、エレクトロスピニングは、ナノスケール範囲の直径を伴う均一なポリマー線維を製造するその能力のため、大きな注目を集めている（Ｌｉ ＷＪ， ｅｔ ａｌ．２００３、Ｃｈｏｉ ＪＳ， ｅｔ ａｌ．２００８、Ｚｈａｎｇ ＹＺ， ｅｔ ａｌ．２００５、Ｍａｔｔｈｅｗｓ ＪＡ， ｅｔ ａｌ．２００２、およびＨｅｙｄａｒｋｈａｎ−Ｈａｇｖａｌｌ Ｓ， ｅｔ ａｌ．２００８）。これらの線維は、コラーゲン等のナノ繊維性ＥＣＭタンパク質と構造的に同様である。しかしながら、これらのナノファイバーは、それらの生理活性の欠乏によって妨げられ、細胞との相互作用およびそれらの接着ならびに増殖の促進のために重要である。本明細書で開示される、この生理活性は、ペプチド両親媒性物質（ＰＡ）でそれらをコーティングすることによって、これらのｅＰＣＬナノファイバー上で与えられることができる。これらのＰＡは、酵素媒介分解性部位および細胞接着性リガンドを有することができ、したがってＥＣＭの生化学的態様を模倣することができる。ｅＰＣＬナノファイバー上のＰＡのこのコーティングは、図１９で示されるように、ハイブリッド生物模倣型ナノマトリックスを構成する。研究で使用されるＰＡは、マトリックスメタロプロテアーゼ−２（ＭＭＰ−２）分解性部位Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＧＴＡＧＬＩＧＱ）から成る。ＭＭＰは、構造的に健康な細胞によって産生され、したがってこの部位の存在は、細胞によるナノマトリックスの再構築を促進する（Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｍａｓｓｉａ ＳＰ ａｎｄ Ｈｕｂｂｅｌｌ ＪＡ：１９９１、およびＡｎｄｕｋｕｒｉ Ａ， ｅｔ ａｌ．２００９）。また、ＰＡは、内皮細胞接着および拡散を促進することで知られているＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）配列に由来するラミニン、およびＮＯドナーとして作用するポリ溶解素（ＫＫＫＫＫ）配列も含有する。ＮＯを提供する残基のＰＡへの取り込みは、再内皮化を増強すると同時に、平滑筋細胞増殖および血小板接着を制限するであろう、ハイブリッドナノマトリックスから局所血流へのＮＯの制御放出を提供することが期待される。
９．ステント
また、本明細書で開示されるものは、本明細書で開示される内皮を模倣するナノマトリックスでコーティングされる医療デバイスを含む組成物である。医療デバイスは、対象の体内で使用するためのものであることが知られる、または明らかにされているいずれのデバイスであり得る。好ましくは、医療デバイスは心血管系中に挿入されるものである。医療デバイスは、手術用移植材料としての使用に好適ないずれの物質も含み得る。
大抵のステントは、ステンレススチール３１６Ｌから作られる。最新の例は、Ｃｏｒｄｉｓ Ｐａｌｍａｚ−Ｓｃｈａｔｚステント、Ｃｏｒｄｉｓ Ｃｒｏｓｓｆｌｅｘステント、Ｇｕｉｄａｎｔ ＭｕｌｔｉＬｉｎｋステント、およびＭｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｂｅｓｔｅｎｔを含む。スチールステントの不利点は、亜急性血栓症および再狭窄、出血性合併症、腐食、およびステント留置された血管セグメントの再拡張の高い発生率を含む。
金は、高い可視性、生体適合性、および通常、不活性金属として長い間知られている。また、金鍍金ハイブリッドステントは優れた視感度および可動性を示すが、かなり高価である。
現在、Ｃｏｎｉｃｈｒｏｍｅ（商標）、ＰｈｙｎｏｘＴＭ、およびＥｌｇｉｌｏｙ（商標）は、コバルトクロムニッケルモリブデン鉄合金の商標名である。このコバルトクロム合金は、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｗａｌｌステント等のステントを製造するために使用され得る。
タンタル（元素＃７３）は、輝く、可動性の、高い放射線不透過性の金属である。ステンレススチールより脆いが、タンタルは、腐食に対して高い延性および抵抗性を示す。タンタルステントの最新の例は、ＭｅｄｔｒｏｎｉｃおよびＴａｎｔａｌｕｍ ＣｏｒｄｉｓステントによるＷｉｋｔｏｒステントを含む。
ニチノール（「ニッケルチタンＮａｖａｌ Ｏｒｄｉｎａｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」より）は、生体適合性、超弾性形状記憶合金の例である。５５％のニッケルおよび４５％のチタンから成る形状記憶合金のため、ニチノールは、その相転移後、特定の温度まで加熱され、具体的な形状に戻る能力を有する。形状記憶合金は、オーステナイト相中のそれらのより強く、高い温度形成から、マルテンサイト相中のそれらのより弱く、低い温度形成へと冷却された場合、それらの結晶構造中で相転移を受ける。また、ニチノールは、超弾性であり、歪められることをそのオーステナイト温度で可能とするバネ状の、「ゴム状」行動を有する。ニッケルに対する増加した感受性を持つ患者においても、ニッケルおよびチタン間の強い金属間結合は非常に低い反応率を有する。これは、強い免疫応答を阻止し、腐食を減少する。現在の例は、Ｂｏｓｔｏｎ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＮｉｔｉｎｏｌ−ｓｅｌｆ−ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｒａｄｉｕｓステントを含む。Ｂｏｓｔｏｎ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＳｙｍｂｉｏｔステントは、両側がｅＰＴＦＥの１６ミクロンの厚い層で覆われるニチノールから成る。
ポリマーステントのための物質は、ポリマー腔内管、および形状記憶ポリマーと共役する生物分解性ステントを含む。シリコンは、ステント植込術のために選択された第１の有機物質であった。シリコンは、組織外傷の低率を誘発するシリコンおよび酸素原子を変えることに由来する縮合ポリマーである。しかしながら、シリコンは乏しい耐菌、張力、およびコイルの強さ、ならびに内側対外側の直径比率を有する。
また、ポリエチレンまたはポリウレタンを使用する純粋プラスチック胆管ステントも、患者において使用されている。しかしながら、ポリエチレンは２０〜３０％の患者において血泥を誘発し、タンパク質粘着性および生物膜形成を促進し、胆汁結晶および食物粒子を捕捉する。また対照的に、ポリウレタンは、優れた張力およびコイルの強さ、ならびに優れた耐菌を有するが、利用可能な反応性の最も高い物質のうちの１つでもある。
また、生物分解性および生物吸収性ステント材料もステント植込術に有望な材料である。生物分解、生物吸収、および生物侵食は大抵同義語として間違って使用されるが、それらは異なる定義を有する。生物分解において、酵素または微生物等の生物学的薬は、分解プロセスにおいて優性成分である。通常、生物分解性インプラントは、短期または一時的な適用に有用である。生物再吸収および生物吸収は、分解生成物が、生物学的環境における食作用等の細胞活性によって除去されることを示唆する。一方、生物侵食可能ポリマーは、生理的な状態下で水可溶性物質へと変換される水不溶性ポリマーである。これは、侵食プロセスに含まれる物理的機構にかかわらず発生する。この場合の接頭辞「生物」は、高い温度、強い酸または塩基、もしくは天候を通す侵食とは対照的に、生理的な状態で発生する侵食を指す。
損傷した血管に対するステントの一時的な構造的支持のため、生物分解性ポリマーは生体適合性としてみなすことができるが、容易に使い捨て可能な物質であり、薬物送達システムに最適である。ポリエステル、ポリオルトエステル、およびポリ無水物等の生物分解性ポリマーは、薬物の局所送達を調節でき、また加水分解性および他の機構を通して「安全に」分解できる。生物分解性薬物送達システムは、定常分解、透過性、および中等度の張力の強さを必要とする。ステントにおいて、構造的支持は生体適合性、血液適合性、および優れた血行動態を伴わなければならない。現在、生物分解性ステントは、通常血栓症および血管損傷を誘発する。
Ｄｕｋｅ生物吸収性ステントは最初の生物分解性ステントであった。また、精製したウシのアキレス腱からのタイプＩコラーゲンを形成することによって、自然ポリマーを、構造的安定性のために化学的に架橋結合されたマイナス側の無い管へと組み込むことに試みた人たちもいた。本質的な負電荷を運ぶため、コラーゲンはかなり血液適合可能である。コラーゲン生成物は、それらのライフサイクルにわたって生体適合可能であり、血栓症の減少を示した。また、抗凝固および線維素溶解性薬は直接的にコラーゲンに結合でき、その薬物送達能力を助ける。また、Ｃｏｒｄｉｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社は、ポリ乳酸およびトリメチレン炭酸塩のブレンドから作られる生物分解性ステント原型も開発した。
ポリマー分解を促進する幾つかの因子は、より親水性の主鎖、より親水性の末端基、小さい結晶化度、大きい多孔度、および小さい全体の大きさを伴う生成物を提供することを含む。最も一般的な化学的機能基は、エステル、無水物、オルトエステル、およびアミドを使用した。
最終ポリマーの可能性は、形状記憶ポリマーである。一度ポリマーが合成されると、無数の形に加熱または冷却され得る。好適な刺激が導入される際、ポリマーは、その一時的な状態から記憶される、永久形状へと転移するであろう。これらのポリマーの大抵は、既存の脂肪族ポリエステル、特にポリ（エーテルエステル）、ならびにＬ，Ｌ−ジラクチド、ジグリコリド、およびｐ−ジオキサノンの質のスクリーニングによって、第１に決定される好適なセグメントから作成される。マクロジオールは、これらの既に認可されたモノマーに基づいて合成され得る。
したがって、ステント等の本明細書で開示される医療デバイスは、チタン合金を含み得る。医療デバイスはコバルトクロムを含み得る。医療デバイスはニッケルチタンを含み得る。医療デバイスは生物分解性ポリマーを含み得る。
幾つかの態様において、医療デバイスは血管ステントである。幾つかの態様において、ステントは薬剤溶出ステントである。例えば、ステントは、シロリムス溶出ステントまたはパクリタキセル溶出ステントであり得る。
当業者は、開示された内皮を模倣するナノマトリックス用いる使用のための追加の医療デバイスを認識し得る。好ましくは、医療デバイスは、通常天然内皮を含む体の組織または器官に投与されるものである。例えば、幾つかの態様において、医療デバイスは血管移植片である。幾つかの態様において、医療デバイスはカテーテルである。幾つかの態様において、医療デバイスはペースメーカーである。幾つかの態様において、医療デバイスは心臓弁である。
また、開示されるものは、開示されるコーティングされた医療デバイスを対象に移入する方法でもある。したがって、一態様において、方法は、内皮を模倣するナノマトリックスでコーティングされる医療デバイス（例えば、ステント、血管移植片、カテーテル、ペースメーカー、または心臓弁）を含む組成物を提供する、コーティングされた基質を対象に移入するステップを含む。さらなる態様において、提供されるものは、内皮を模倣するナノマトリックスで医療デバイスをコーティングすることである。さらなる態様において、方法は、対象に移入する前に、医療デバイス上に内皮を模倣するナノマトリックスをコーティングするステップを含む。さらなる態様において、方法は、対象に移入した後に、医療デバイス上に内皮を模倣するナノマトリックスをコーティングするステップを含む。
１０．治療の方法
本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質は、心臓弁等のステントまたは他の医療デバイスをコーティングするため、ナノマトリックスの一部として使用できる。同様に、ペプチド両親媒性物質は、移植片の再狭窄を阻止するため、心房性または静脈性移植片等の血管移植片と併用して使用できる。したがって、本明細書で開示されるものは、循環器疾患を治療する方法であって、循環器疾患に罹患する対象に、本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質を投与することを含む。
本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質は、血管ステント、血管移植片、カテーテル、ペースメーカー、または心臓弁等のペプチド両親媒性物質でコーティングされる医療デバイスの適用によって、投与できることを理解されたい。ペプチド両親媒性物質は、その使用において、ポリカプロラクトンナノファイバー等のナノマトリックスの一部として、医療デバイス上で使用され得ることをさらに理解されたい。したがって、例えば、本明細書で開示されるものは、１つ以上のペプチド両親媒性物質でコーティングされる、ポリエステルナノファイバー（例えば、ポリカプロラクトンナノファイバー）等のナノファイバーを含むステントを対象に投与することによって、アテローム性動脈硬化を治療する方法である。本明細書で開示されるいずれのペプチド両親媒性物質も、例えば、１つ以上のペプチド両親媒性物質等の開示される方法用いて使用でき、各両親媒性物質は親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、親水性ペプチド配列は分解配列と、第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含むこをも理解されたい。
同様に、循環器疾患の治療の１つの課題は、移植片が使用される場合、さらなる閉塞の阻止である。具体的に、移植片の閉塞である。移植片開存性は、開いたまま、または非閉塞のまま残存する移植片の能力を指す。したがって、本明細書で開示されるものは、本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質のうちの１つ以上でコーティングされる移植片を対象に投与することを含む移植片開存性を増加する方法である。
１１．ペプチド
本明細書で考察されるように知られており、本明細書で熟慮される機能性ペプチド／タンパク質の数々の変異体が存在する。タンパク質変異体および誘導体は当業者によく知られており、アミノ酸配列修飾を含むことができる。例えば、アミノ酸配列修飾は、３つのクラスのうちの１つ以上に典型的に該当する：置換、挿入、または欠失の変異体。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の内配列挿入を含む。挿入は、例えば、約１から４つの残基である、アミノまたはカルボキシル末端融合のそれらよりも、通常小さな挿入であるであろう。実施例において説明されるもの等の免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロ架橋結合によって、標的配列を免疫原性に与えるのに十分に大きいポリペプチドを融合することによって、または融合をコード化するＤＮＡで形質転換される組換え細胞培養によって、作られる。欠失は、タンパク質配列からの１つ以上のアミノ酸残基の除去によって、特徴づけられる。典型的にわずか約２つ〜６つの残基は、タンパク質分子内において、いずれの１つの部位で欠失される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコード化するＤＮＡ中でヌクレオチドの部位特異的変異原性によって調製される、その結果、変異体をコード化するＤＮＡを産生し、その後、組換え細胞培養中でＤＮＡを発現する。知られている配列を有するＤＮＡ中において、所定の部位で置換変異を作成するための技術はよく知られている、例えば、Ｍ１３プライマー変異原性およびＰＣＲ変異原性である。アミノ酸置換は典型的に単一の残基であるが、多数の異なる部位で一度に発生でき、通常、挿入は約１〜１０のアミノ酸残基であろう、欠失は約１〜３０の残基の範囲であろう。欠失または挿入は、好ましくは隣接対において作られる、すなわち、２つの残基の欠失または２つの残基の挿入である。置換、欠失、挿入、またはそのいずれの組み合わせも、最終構造物に達するため、組み合わせられ得る。変異は、配列を読み枠の範囲外に配置しなければならず、好ましくは第２のｍＲＮＡ構造を産生する相補領域を作成するであろう。置換変異体とは、少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置で挿入されるものである。かかる置換は、一般的に以下の表２に従って作られ、保存的置換と称される。
機能または免疫学的同一性において実質的な変化は、表２のものよりも保存的ではない置換を選択することによって、作られる、すなわち、（ａ）置換の領域中のポリペプチド主鎖の構造の、例えばシートまたはらせん構造として、（ｂ）標的部位で分子の負荷または疎水性の、または（ｃ）大部分の側鎖の、維持への影響においてより有意に異なる残基を選択することである。タンパク質性質中で最大の変化を産生することが一般的に期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルは疎水性残基に対して（によって）置換される、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、またはバリル、もしくはアラニル、（ｂ）システインまたはプロリンはいずれの他の残基に対しても（によっても）置換される、（ｃ）陽性物質側鎖、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルを有する残基は、電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに対して（によって）置換される、または（ｄ）巨大側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンは側鎖、例えば、グリシンを有さないものに対して（によって）この場合は置換される、（ｅ）硫酸化および／または糖鎖付加のため、部位の数を増加による、のうちのものであろう。
例えば、生物学的におよび／または化学的に同様である別のものとの１つのアミノ酸残基の置換は、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、別のものに対して置換される１つの疎水性残基、または別のもに対して置換される１つの極性残基である。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒ等の組み合わせを含む。それぞれが明示的に開示される配列のかかる保存的に置換された変異は、本明細書で提供されるモザイクポリペプチドに含まれる。
置換のまたは欠失の変異原性は、Ｎ−糖鎖付加（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−糖鎖付加（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位に挿入するために用いることができる。また、システインまたは他の不安定残基の欠失も望ましい。潜在的タンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの欠失または置換は、例えば塩基性残基の１つを欠失すること、またはグルタミニルまたはヒスチジル残基で１つを置換することによって達成され得る。
特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチド上の組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパリル（ａｓｐａｒｙｌ）残基へと翻訳後脱アミドされる。代替的に、弱酸性状態下で、これらの残基は脱アミドされる。他の翻訳後修飾は、プロリンおよび溶解素の水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、溶解素のｏ−アミノ基のメチル化、アルギニン、およびヒスチジン側鎖（Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに幾つかの事例において、Ｃ−末端カルボキシルのアミド化を含む。
本明細書で開示されたタンパク質の変異体および誘導体を定義する手段は、具体的に知られている配列に対する相同性／同一性の観点から、異体および誘導体を定義することを通じることを理解されたい。具体的に開示されるものは、本明細書で開示される少なくとも、７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の記載される配列に対する相同性を有する、これらおよび他のタンパク質の変異体である。当業者は、いかに２つのタンパク質の相同性を決定するかを容易に理解する。例えば、相同性がその最高のレベルであるように、相同性は、２つの配列を整列させた後に算出することができる。
相同性を算出する別の手段は、公表されたアルゴリズムによって実施することができる。比較のための配列の最適整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． ＭｏＬ Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５： ２４４４（１９８８）の同様の方法の検索、これらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ソフトウェア Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）のコンピュータ化された実行、または検査によって行われ得る。
相同性の同一タイプは、例えば、Ｚｕｋｅｒ， Ｍ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：２８１−３０６，１９８９に開示されるアルゴリズムによって核酸のために得られことができ、少なくとも核酸整列に関連している物質のために、参照により本明細書に組み込まれる。
保存的変異および相同性の説明は、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態等のいずれの組み合わせにも一緒に組み込まれることができ、変異体は保存的変異であることを理解されたい。
様々なタンパク質およびタンパク質配列が本明細書で考察されるように、それらのタンパク質配列をコード化できる核酸もまた開示されることを理解されたい。これは、特異的タンパク質配列に関連している全ての縮重配列を含み得る、すなわち、縮重核酸を含む、タンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコード化する、１つの特定のタンパク質配列ならびに全ての核酸をコード化する配列を有する全ての核酸である。したがって、各特定の核酸配列は本明細書に記入され得ないが、開示されるタンパク質配列を通して、実際には各および全ての配列が本明細書に開示され、説明されていることを理解されたい。
開示される組成物に組み込まれ得る、数々のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することを理解されたい。例えば、天然アミノ酸とは異なる機能置換基を有する、数々のＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。自然発生するペプチドの逆の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、分子を選択アミノ酸で荷電することによって、かつ例えば、部位特異的手段で、ペプチド鎖に類似体アミノ酸を挿入する、アンバーコドンを利用する遺伝子構造物を設計することによって、ポリペプチド鎖に容易に組み込まれることができる（Ｔｈｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３：３４８−３５４（１９９２）、Ｉｂｂａ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＳ， １４（１０）：４００−４０３（１９８９）、Ｂｅｎｎｅｒ， ＴＩＢ Ｔｅｃｈ， １２：１５８−１６３（１９９４）、Ｉｂｂａ ａｎｄ Ｈｅｎｎｅｃｋｅ， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）の全ては、少なくともアミノ酸類似体に関連している物質の参照により、本明細書に組み込まれる）。
ペプチドに似ている分子が産生され得るが、天然ペプチド結合を介して結合されていない。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体の結合は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ-を含むことができる（これらおよび他のものは、Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ． Ｆ． ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ． Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ， ｅｄｓ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐ．２６７（１９８３）、Ｓｐａｔｏｌａ， Ａ． Ｆ．， Ｖｅｇａ Ｄａｔａ （Ｍａｒｃｈ１９８３）， Ｖｏｌ． １， Ｉｓｓｕｅ ３， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ （ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｖｉｅｗ）、Ｍｏｒｌｅｙ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８、Ｈｕｄｓｏｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９） （−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）、Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６） （−−ＣＨ Ｈ２−−Ｓ）、 Ｈａｎｎ Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． Ｉ ３０７−３１４（１９８２） （−−ＣＨ−−ＣＨ−−， ｃｉｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓ）、Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２３：１３９２−１３９８（１９８０） （−−ＣＯＣＨ２−−）、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）、Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ， ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）： ９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、Ｈｏｌｌａ日 ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ． Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）、およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）中に見出すことができる、これらのそれぞれは、参照により、本明細書に組み込まれる。特に好まれる非ペプチド結合は−−ＣＨ２ＮＨ-である。ペプチド類似体は、ｂアラニン、ｇアミノ酪酸等の結合原子間の、１個を越える原子を有することができることを理解されたい。
アミノ酸類似体および類似体ならびにペプチド類似体は大抵、より経済的な生成物、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的性質（半減期、吸収、効力、有効性等）、特異性の変化（例えば、生物活性の広域スペクトル）、減少した抗原性、およびその他の望ましい性質を増強する。
Ｄアミノ酸はペプチダーゼ等では認識されないため、より安定なペプチドを産生するため使用され得る。同一タイプのＤアミノ酸（例えば、Ｌ溶解素の代わりにＤ溶解素）で、コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置換は、より安定なペプチドを産生するために使用され得る。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化する、または結合するために使用できる。これは、特定の構造にペプチドを制約するのに有益であり得る。（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６１：３８７（１９９２）は、参照により、本明細書に組み込まれる）。
１２．核酸
本明細書で開示される核酸に基づく多様な分子が存在し、例えば、本明細書で開示されるペプチド両親媒性物質をコード化する、核酸を含む。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換を作成することができる。これらの非限界実施例および他の分子は、本明細書で考察される。例えば、細胞中でベクターが発現する場合、発現されたｍＲＮＡはＡ、Ｃ、Ｇ、およびＵを典型的に作成するであろうことを理解されたい。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外因性送達を通して、細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子が、細胞環境でアンチセンス分子の分解を減少するヌクレオチド類似体を作成することは利点であることを理解されたい。
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、およびリン酸塩部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、リン酸塩部分および糖部分を介して一緒に結合されることができ、ヌクレオシド間の結合を作る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン‐９‐イル（Ａ）、シトシン‐１‐イル（Ｃ）、グアニン‐９‐イル（Ｇ）、ウラシル‐１‐イル（Ｕ）、およびチミン‐１‐イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸塩部分は五価のリン酸塩である。ヌクレオチドの非限界実施例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸塩）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸塩）であり得る。当技術分野、および本明細書において利用可能である、多くの多様なこれらのタイプの分子が存在する。
ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、および／またはリン酸塩部分の幾つかのタイプの修飾を含有するヌクレオチドである。当技術分野において、ヌクレオチドの修飾はよく知られており、例えば、５‐メチルシトシン（５‐メ‐Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２‐アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸塩部分での修飾を含むであろう。当技術分野、および本明細書において利用可能である、多くの多様なこれらのタイプの分子が存在する。
ヌクレオチド置換はヌクレオチドと同様な機能的性質を有する分子であるが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等のリン酸塩部分を含有しない。ヌクレオチド置換は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するであろう分子であるが、リン酸塩部分以外の部分を介して一緒に結合される。適切な標的核酸と相互作用している場合、ヌクレオチド置換は二重らせんタイプ構造に適合することができる。当技術分野、および本明細書において利用可能である、多くの多様なこれらのタイプの分子が存在する。
また、例えば、細胞の取り込みを増強するため、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に他のタイプの分子（抱合体）を結合させることも可能である。抱合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体に化学的に結合することができる。かかる抱合体は、コレステロール部分等の脂質部分を含むが、それらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３‐６５５６）。当技術分野、および本明細書において利用可能である、多くの多様なこれらのタイプの分子が存在する。
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との、少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンに基づくヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換のＣ２、Ｎ１、およびＣ６配置、ならびにピリミジンに基づくヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換のＣ２、Ｎ３、Ｃ４配置を含む。
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体のＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上で起こる相互作用であり、二本鎖ＤＮＡの主要な溝で暴露される。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、プリンヌクレオチドのＣ６位で、Ｎ７位および反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
本明細書で開示されるシグナル経路に含まれるタンパク質分子に関連している多様な配列が存在し、それらの全ては核酸によってコード化されるか、あるいは核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体の配列、ならびに他の類似体、およびこれらの遺伝子の対立遺伝子、ならびにスプライス変異体および変異体の他のタイプは、ジェンバンクを含む、多様なタンパク質および遺伝子データベースにおいて入手可能である。ジェンバンクで出願の時に利用可能であったそれらの配列は、参照することにより、それらの全体、ならびに本明細書で含有される個々のサブ配列が本明細書に組み込まれる。ジェンバンクは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉからアクセスできる。当業者は、配列矛盾および差異をいかに解決するか、特定の配列から他の関連した配列に関連する組成物および方法をいかに調節するかを理解している。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書で開示され、当技術分野において知られている情報が与えられることにより、いずれの所与の配列のためにも設計され得る。
Ｃ．ＥＣＭを模倣するナノマトリックスを作成する方法
また、開示されるものは、内皮を模倣するナノマトリックスを作成する方法であって、本明細書で開示される１つ以上のペプチド両親媒性物質のナノファイバーへの自己構築を誘発することを含む。自己構築は、例えば、固体表面上に１つ以上のペプチド両親媒性物質を含む液体組成物を乾燥させることによって、誘発することができる。ペプチド両親媒性物質の自己構築を誘発する他の方法は、当技術分野において知られており、開示される方法で使用できる。例えば、構築は、二価イオン（塩化カルシウム）またはｐＨによって誘発され得る。
さらに、開示される方法は、１つ以上のペプチド両親媒性物質を一酸化窒素と反応させ、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドを形成することを含み得る。例えば、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドは、配列［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］ｎを含むことができる。幾つかの態様において、ｎは１〜２０である。幾つかの態様において、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上である。したがって、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチドは、配列［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］５を含み得る。
Ｄ．ＥＣＭを模倣するナノマトリックスを使用する方法
また、開示されるものは、本明細書で開示される内皮を模倣するナノマトリックスで医療デバイスをコーティングすることも含む方法である。方法は、本明細書で開示される１つ以上のペプチド両親媒性物質のナノファイバーへの、医療デバイス上の自己構築を誘発することを含み得る。例えば、方法は、１つ以上のペプチド両親媒性物質を含む液体組成物を医療デバイス上で乾燥させることを含み得る。
医療デバイスは、対象の体内で使用されるものであることが知られており、明らかにされているいずれのデバイスであり得る。好ましくは、医療デバイスは心血管系中に挿入されるものである。
医療デバイスは、手術用移植材料としての使用に好適ないずれの物質も含み得る。例えば、医療デバイスはチタン合金を含み得る。医療デバイスは、コバルトクロムを含み得る。医療デバイスはニッケルチタンを含み得る。医療デバイスは生物分解性ポリマーを含み得る。
幾つかの態様において、医療デバイスは血管ステントである。例えば、ステントはベアメタルステントであり得る。幾つかの態様において、ステントは薬剤溶出ステントである。例えば、ステントは、シロリムス溶出ステントまたはパクリタキセル溶出ステントであり得る。
幾つかの態様において、医療デバイスは血管移移植片である。幾つかの態様において、医療デバイスはカテーテルである。幾つかの態様において、医療デバイスはペースメーカーである。幾つかの態様において、医療デバイスは心臓弁である。
また、開示される内皮を模倣するナノマトリックス組成物は、１つ以上の生物活性薬剤（複数可）をさらに含み得ることも熟慮されている。例えば、一態様において、内皮を模倣するナノマトリックスは、有効量の１つ以上の生物活性薬剤（複数可）を含むことができる。
また、開示される内皮を模倣するナノマトリックス組成物は、１つ以上の薬学的活性薬剤（複数可）をさらに含み得ることも熟慮されている。例えば、一態様において、内皮を模倣するナノマトリックスは、有効量の１つ以上の薬学的活性薬剤（複数可）を含むことができる。
Ｅ．親水性ペプチドを作成する方法
本明細書で開示される組成物および開示される方法を実施するために必要な組成物は、具体的に記されない限り、その特定の試薬または化合物に対して、当業者に知られているいずれの方法を使用しても作成され得る。
１．ペプチド合成
配列番号１〜配列番号１１等の開示されるタンパク質を産生する１つの方法は、２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを、タンパク質化学技術によって一緒に結合させることである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９‐フルオロレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ‐ブチルオキシカルボニル）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのどちらかを使用する、現在利用可能である実験機器を使用して化学的に合成できる。（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当業者は、例えば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学的反応物によって合成され得ることを容易に認識することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、その合成樹脂から合成され、切断され得ないが、ペプチドまたはタンパク質の他の断片が、その樹脂から合成、その後に切断され、その結果、他の断片上で機能的に遮断された末端基を暴露する。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、それぞれそれらのカルボキシルおよびアミノ終端でペプチド結合を介して共有結合的に結合することができ、抗体またはその断片を形成する。（Ｇｒａｎｔ ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．（１９９２）、Ｂｏｄａｎｓｋｙ Ｍ ａｎｄ Ｔｒｏｓｔ Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ‐Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．，ＮＹ（少なくともペプチド合成に関連している物質のために、参照により本明細書に組み込まれる）。代替的に、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に説明されるように、独立してインビボ合成される。一度単離されると、これらの独立ペプチドまたはポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を介してペプチドまたはその断片を形成するために結合され得る。
例えば、クローン化されたまたは合成ペプチドセグメントの酵素連結は、より大きいペプチド断片、ポリペプチド、または全タンパク質ドメインを産生するため、比較的短いペプチド断片を結合させる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。代替的に、合成ペプチドの自然化学的連結は、より短いペプチド断片から大きいペプチドまたはポリペプチドを合成的に構成するために利用され得る。この方法は、２つのステップの化学的反応から成る（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６：７７６‐７７９（１９９４））。最初のステップは、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する他の無保護ペプチドセグメントとの無保護の合成ペプチド-チオエステルの化学選択的反応であり、初期共有結合性生成物としてチオエステル結合中間体を提供する。反応状態において変化無しで、この中間体は自発的で、急速な分子内反応を受け、連結部位で天然ペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１、Ｃｌａｒｋ‐Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６９：１６０７５（１９９４）、Ｃｌａｒｋ‐Ｌｅｗｉｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３０：３１２８（１９９１）、Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：６６２３−３０（１９９４））。
代替的に、無保護ペプチドセグメントは化学的結合であり、ペプチドセグメント間で化学的連結の結果として形成されるその結合は、不自然（非ペプチド）結合である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ， Ｍ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体ならびに完全な生物学的活性を伴う大量の比較的に純粋なタンパク質の合成のために使用される（ｄｅＬｉｓｌｅ Ｍｉｌｔｏｎ ＲＣ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＩＶ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２５７‐２６７ （１９９２））。
２．核酸合成
配列番号１〜配列番号１１等の開示されるタンパク質を産生する他の方法は、発現制御配列に手術可能的に結合する開示されるタンパク質をコード化する核酸を産生することである。かかる核酸は、標準的な化学的合成方法を使用して作成することができる、または酵素法あるいはいずれの他の知られている方法を使用して産生できる。かかる方法は、ヌクレオチド断片単離に続き、標準的な酵素消化から（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９） Ｃｈａｐｔｅｒｓ ５， ６）例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎシステム１Ｐｌｕｓ ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ生物検索、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡまたはＡＢＩモデル３８０Ｂの自動化された合成機Ｍｏｄｅｌ８７００）を使用するシアノエチルホスホロアミダイト方法による純粋な合成方法の範囲である。また、オリゴヌクレオチドを作成するのに有用な合成方法は、Ｉｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３−３５６（１９８４）、（ホスホトリエステルおよび亜リン酸エステルトリエステル方法）、およびＮａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ６５：６１０−６２０（１９８０）、（ホスホトリエステル方法）により説明される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． ５：３−７（１９９４）によって、説明されるもの等の知られている方法をしようすることにより作成され得る。
Ｆ．ペプチド両親媒性物質を作成する方法
また、本明細書で開示されるものは、以下のステップを含むペプチド両親媒性物質を作成する方法である、ａ）分解配列と、内皮細胞接着性配列と、一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含む、親水性ペプチドを提供するステップと、ｂ）疎水性部分を用いて前記親水性ペプチドのＮ終端をアルキル化するステップ。さらなる態様において、アルキル化は、疎水性カルボン酸を用いるアミド化を含む。疎水性カルボン酸は脂肪酸であり得る。脂肪酸はパルミチン酸であり得る。
開示される両親媒性物質は、従来の合成技術を介して疎水性部分の結合によって、調製することができることが熟慮されている。例えば、疎水性部分は、親水性ペプチドのＮ終端で結合され得る。つまり、疎水性求電子化合物（例えば、アルキルハロゲン化物、カルボキシル化合物）は、Ｎ終端に存在するアミン機能と反応でき、共有結合を提供する（例えば、二級または三級アミン、アミド）。
さらなる例において、疎水性部分は、親水性ペプチドのＣ終端で結合され得る。つまり、疎水性求核性化合物（例えば、アルコール、アミン、チオール）は、Ｃ終端に存在するカルボキシル官能基と反応でき、共有結合を提供する（例えば、エステル、アミド、チオエステル）。Ｃ終端に存在するカルボキシル官能基は、反応前に誘導体化され得る、あるいは減少され得ることをさらに熟慮されている。例えば、カルボキシル官能基はアルコールを形成するために減少され得る、疎水性求電子化合物（例えば、アルキルハロゲン化物、カルボキシル化合物）のうちの１つ以上とその後反応でき、共有結合を提供する（例えば、エーテル、エステル）。
当業者によって容易に理解されるように、ペプチド配列は、ペンダント基のうちの１つ以上を有するペプチド残基を含み得る。ペンダント基は、様々な態様において、求核性部分（例えば、アミン、ヒドロキシル、チオール）のうちの１つ以上、または求電子部分（例えば、カルボキシル官能基）のうちの１つ以上を含み得る）。かかる部分は、開示される親水性ペプチドのＮ終端およびＣ終端に関して、上で開示されるものに類似する様式で反応し得る。
Ｇ．実施例
以下の実施例は、本明細書で主張される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法がいかにして作成され、評価されているかを完全に開示および説明することにより、当業者に提供するため提示されており、純粋に例示的であることを意図し、本開示を制限することを意図しない。数（例えば、量、温度等）に関する正確性を保証する努力は行われているが、幾つかの誤差および偏差が生じた場合には説明する必要がある。示唆されない限り、部分は重量部分であり、温度は℃または外気温であり、圧力は大気圧または大気圧に近いものである。
１．実施例１：
ｉ．物質および方法
ａ．ペプチド両親媒性物質の合成
細胞接着性配列ＹＩＧＳＲ（配列番号２）（「ＰＡ−ＹＩＧＳＲ」）またはＮＯドナー配列ＫＫＫＫＫ（配列番号３）（「ＰＡ−ＫＫＫＫＫ」）を伴うＭＭＰ２感受性配列（ＧＴＡＧＬＩＧＱ、配列番号１）から成る２つの１３アミノ酸ペプチドを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ａｐｅｘ３９６ペプチド合成機で標準的なＦｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して合成した。ジメチル形成アミド（ＤＭＦ）中で、ペプチドのＮ終端を、パルミチン酸の２つの同等物、ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＢＴＵ）の２つの同等物、およびジイソプロピルエチルアミン（ＤｉＥＡ）の４つの同等物と、室温で１２時間反応させることによって、アルキル化を得た。アルキル化反応を繰り返した後、ＰＡの切断および脱保護を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、脱イオン（ＤＩ）水、トリイソプロピルシラン、およびアニソールの混合物を使用して、９０：１：１：１の比率で、室温で３時間実施した。溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。ＰＡを冷たいエーテル中で沈殿し、収集し、真空下で乾燥した。粗ＰＡを、２重量％の濃度でＤＩ水に溶解した。ＰＡを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により分析した。
ｂ．透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像診断
ＴＥＭ試料に対して、５μｌの各０．１重量％のＰＡ水溶液を、炭素でコーティングされたフォルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）銅グリッド（４００メッシュ）上で流延した。このグリッドを一晩乾燥した。画像診断の前に、乾燥した試料を、１０μｌの２０％のホスホタングステン酸（ＰＴＡ）で３０秒、負染色した。試料を、６０ｋＶの加速電圧でＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２ＴＥＭ顕微鏡上で画像化（４２０００ｘ、５２０００ｘ）した。
ｃ．ナノファイバーへのペプチド両親媒性物質の自己構築
ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫの０．１重量％の保存液をＤＩ水（ｐＨ７．４）中で調製し、９：１（「ＰＡ−ＹＫ」）のモル比で混合した。ウェル当たり５０μｌのＰＡ−ＹＫ溶液を、カバーガラスに結合する１２−ウェルシリコンｆｌｅｘｉＰＥＲＭ細胞培養チャンバー中で置換した。チャンバーを化学的ドラフト中に２４時間配置し、溶剤蒸発によって自己構築を誘発した。さらに、そのチャンバーを、３７℃のインキュベーターでさらに４８時間乾燥した。
ｄ．細胞維持
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を内皮成長培地（ＥＧＭ）完全培地（０．１％のゲンタマイシン／アンホテリシンＢ）で成長させた。この細胞培地を全てのＨＵＶＥＣ研究において使用した。細胞をトリプシン処理（０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡ）によって継代し、２５００〜５０００個の細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）は、平滑筋細胞基本培地（ＳｍＢＭ）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（商標）キット完全培地（０．１％のゲンタマイシン／アンホテリシンＢ）中で成長した。この細胞培地を全てのＡｏＳＭＣ研究において使用した。細胞をトリプシン処理（０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡ）、および２５００〜５０００個の細胞／ｃｍ２の密度での継代培養によって、継代した。全ての細胞培養を、標準的な培養条件（３７℃、９５％の相対湿度、および５％のＣＯ２）下で維持した。全ての細胞および培地を、Ｌｏｎｚａ Ｉｎｃ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入した。
ｅ．ＰＡ−ＹＫナノマトリックス上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの初期結合および拡散
ＰＡ−ＹＫナノマトリックスでコーティングされた培養チャンバーを、本明細書で開示されるように調製した。初期細胞結合のために、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを、ＰＡ−ＹＫナノマトリックスでコーティングされた培養チャンバー上で、それぞれ３０，０００個の細胞／ｃｍ２および１５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で播種した。２時間のインキュベーション後、細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生死判別／細胞毒性キット（分子プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用してＣａｌｃｅｉｎ ＡＭ緑色の蛍光色素およびＥｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１赤色の蛍光色素で染色した。視野（２０ｘ）当たりの結合した細胞の数を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ２０００）を使用し、５つの確率場を平均することによって明らかにし、試料当たりで平均化した。個々の細胞の拡散を、画像処理ソフトウェア（ＮＩＳ−ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ ２．３０）によって分析した。
ｆ．ＰＡ−ＹＫおよびＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上の血小板接着
ＰＡ−ＹＫおよびＰＡ−ＹＫ−ＮＯ溶液を本明細書で説明されるように調製し、１５０μｌの溶液を１３ｍｍの円形のカバーガラスに滴下することによって、膜に流し込む。溶液の２．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩを３％の氷酢酸中で調製し、同一の様式で膜に流し込み、制御面としての役割を果たす。健康なボランティアからの全血液を、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ヘパリン管（ＢＤ、ＮＪ）中で収集し、１０ｕＭのメパクリンで混合し、血小板を蛍光標識した。研究前に、ＰＡ−ＹＫ、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ、およびコラーゲン膜をＰＢＳで濯いだ。その後、コラーゲンＩ、ＰＡ−ＹＫ、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ膜を、メパクリン標識血液で別々に、３７℃で１５分インキュベーションし、次いでＰＢＳで濯いだ。視野（４０ｘ）当たりの接着血小板の数を、試料当たり、５つの確率場を平均化することによって、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ２０００）を使用して決定した。
ｇ．洗浄したＮＯの調製
最初に、ＮＯ溶液を洗浄した。洗浄は、ガスが液体の大きい表面領域を通過するプロセスであり、ガス流から望ましくない不純物を除去する。この場合において、市販の一酸化窒素をアルカリ性溶液に通過させ、望ましくない高い窒素酸化物種を溶解する。図４に示された装置を、最初にアルゴンで脱気した。ＮＯを５Ｍ ＮａＯＨ溶液を通して洗浄し、ＰＡ−ＹＫ溶液を含有する反応槽中で収集した。
ｈ．ＮＯを放出するナノマトリックス（ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ）の合成
アルゴンガス下で、ＰＡ−ＹＫを洗浄したＮＯと反応させることによって、「ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ」を合成した。１００ｍＬの丸底フラスコで一晩、アルゴンガス下で、０．１重量％のＰＡ−ＹＫ水溶液を洗浄したＮＯ溶液と室温で反応させた。１３ｍｍカバーガラス上に１３０μｌ滴下することによって、得られたＰＡ−ＹＫ溶液を膜に流し込んだ。膜を初めの２４時間化学的ドラフト中で乾燥させ、次の４８時間３７℃で乾燥させた。ＮＯ放出特性を決定するため、２４個のウェル組織培養プレートにおいて、５００μｌのＨＢＳ中で各ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ膜をインキュベーションした（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）。ＨＢＳを収集し、凍結し（−２０℃）、１ヶ月以上異なる時点で新鮮なＨＢＳによって置換した。ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスからのＮＯ放出を、次いでＧｒｅｉｓｓアッセイを使用して確認し、数量化した、亜硝酸塩含有物を測定するためサルファニルアミドおよびＮ−１ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリド（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＷＩ）を含有しており、それは番号５６の主要分解生成物である。５日目の終わりに、それぞれの収集された試料を１００μｌのＧｒｉｅｓｓ試薬と混合した。室温で１５分インキュベーション後、５４０ｎｍで、吸光マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８００， ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， ＶＴ）を使用して、試料を読んだ。
ｉ．ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖の評価
ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびＰＡ−ＹＫ膜を本明細書で説明されるように調製し、４時間ＵＶ下で無菌化した。細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色を増殖することによって、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖を評価した。ＰＣＮＡは、細胞増殖の開始において役割を果たす核中に見出される、３６ｋＤａ非ヒストンタンパク質である。細胞周期のＳ期後期の核小体中のその顕著な存在は、それを細胞増殖に対する理想的なマーカーとする。それぞれ３０，０００個の細胞／ｃｍ２および１５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを播種した。細胞を、標準的な培養条件（３７℃、９５％の相対湿度、および５％のＣＯ２）下でインキュベーションした。４８時間のインキュベーション後、細胞を１０％の中性緩衝ホルマリン溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中で固定し、ＰＢＳで濯いだ。次いで、細胞を、固定組織学的評価メタノール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をインキュベーションすることによって透過処理し、続いてＰＢＳで濯いだ。３％の水素過酸化物溶液を使用し、内在性ペルオキシダーゼを遮断した。ＰＢＳで濯いだ後、細胞を、次いでトリス緩衝生理食塩水でインキュベーションし、続いて、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３％のＦＢＳで１：１００まで希釈したマウスＩｇＧ抗ＰＣＮＡ一次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションした。一次抗体を吸引し、ＰＢＳで濯いだ後、細胞をＰＢＳ中で３％のＦＢＳで１：１００まで希釈した抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションし、続いて、アミノエチルカルバゾール色素原（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションした。色素原は、細胞の増殖を表示する赤色の沈殿物を産生する。次いで、細胞をＰＢＳで濯ぎ、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。３７ｍＭのアンモニウム水酸化物で試料を２〜３回濯ぐことによって、過剰のヘマトキシリンを洗い流した。視野（２０Ｘ）当たりの増殖する細胞の割合を、５つの確率場を試料当たりで平均化した後、位相差顕微鏡法（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ２０００）を使用して、赤い色の増殖細胞およびヘマトキシリン染色された青色の非増殖細胞を数えることによって、決定した。
ｊ．統計分析
全てのデータを、ＳＰＳＳソフトウェアを使用した一方向の分散分析試験により比較した。０．０５未満のｐ値を統計的に有意と考慮する。
ｉｉ．結果
ａ．ナノファイバーへのペプチド両親媒性物質の自己構築
ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫを合成するのに成功し、それらの分子量をＭＡＬＤＩ−Ｔの質量分析法によって確認した。ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫ（「ＰＡ−ＹＫ」）のハイブリッドペプチド両親媒性物質を、ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫの０．１重量％の溶液を９：１のモル比で混合することによって、合成した。ナノファイバーへのＰＡの自己構築を、前述のように、溶剤を蒸発することによって誘発した。アルゴン下で、ＰＡ−ＹＫをＮＯとさらに反応させることによって、ＮＯ放出ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを合成した。ＴＥＭ画像（図４）は、溶剤蒸発によるナノファイバーへのＰＡの自己構築を実証する。得られたナノファイバーは、二価イオンまたはｐＨ変化をしようした自己構築の研究でこれまで報告されたものと同様の寸法である。
ｂ．初期細胞の結合および拡散の評価
ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの双方をＰＡ−ＹＫナノマトリックス上で別々に播種し、細胞結合を評価し、内皮細胞がナノマトリックス中で接着性リガンドＹＩＧＳＲを認識するかどうかを明らかにした。ＡｏＳＭＣと比較して、ＨＵＶＥＣの初期結合はわずかに高いことを見出した（図５）。２時間後、これを、ＰＡ−ＹＫナノマトリックス上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの拡散を評価することによって、確認した（図６および７）。２時間後、ＨＵＶＥＣが、ＡｏＳＭＣより３倍拡散することを見出した。その結果は、ＨＵＶＥＣが、ＰＡ−ＹＫに組み込まれるＹＩＧＳＲを認識することを示唆しており、ＰＡ−ＹＫナノマトリックスがＨＵＶＥＣ結合および拡散を促進することを示す。
ｃ．ＰＡ−ＹＫナノマトリックス上の血小板結合の評価
ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびＰＡ−ＹＫナノマトリックス上の血小板結合を、メパクリン標識された全血液を使用して評価した。陽性対照コラーゲンＩと比較して、ＰＡ−ＹＫナノマトリックス上の血小板接着は約５０倍低かった。さらに、ＮＯ放出ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスへの血液の暴露は、事実上いずれの血小板結合ももたらさなかった。（図８）
ｄ．ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスからのＮＯ放出
１ヶ月間にわたってＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスからのＮＯ放出プロファイルを図１０に示す。最初の２４時間で大抵のＮＯを放出し、続いて２週間にわたって緩徐な持続された放出をし、続いて別のバースト放出し、約５３％のＮＯの回復をもたらした。１００％のＮＯ（８．６μモル）の値を、ＰＡ−ＹＫ中の全ての溶解素残基がＮＯの２つの分子と反応すると想定することによって算出した。
ｅ．ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上のＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖の評価
ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣ上のＮＯの効果を検討するため、細胞を、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスでコーティングされた培養チャンバー上で播種した。細胞の増殖を、４８時間のインキュベーション後、ＰＣＮＡ染色を使用して評価した。また、対照のＰＡ−ＹＫナノマトリックスに関する並列増殖研究を行った。図９に示されるように、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上のＰＣＮＡ陽性ＨＵＶＥＣ（（６６．８±１．９４）％）の割合をＰＡ−ＹＫ（（５０．２９±３．４）％）と比較して、有意に大きいことを見出した。逆に、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ（（１６．４±２．８）％）上のＰＣＮＡ陽性ＡｏＳＭＣの割合は、ＰＡ−ＹＫ（（３４．８±１．９）％）よりも有意に低かった。
２．実施例２：天然内皮を模倣する自己構築されたナノマトリックスのインビボ評価
自己構築されたナノマトリックスでコーティングされたステントをウサギ腸骨動脈に移入し、狭窄症および血栓症の証拠を組織形態計測によって評価した。
ｉ．材料および方法
ａ．ステントのコーティングおよび特徴づけ
ＰＡ溶液を用いた均一なコーティングのために、市販のステンレススチールステントを、速度１５ｒｐｍで回転しているモーターに結合しているマンドレル（ステンレススチールワイヤー−０．０１８インチ直径）上に乗せた。回転しているステントを、図１１に示されるように、上部が開いたリザーバーに含有されるＰＡ溶液中に浸漬した。その上部が開いたリザーバーは、ステントの表面上でＰＡのナノマトリックスへの自己構築を起こさせる蒸発を促進する。ステントの回転は、ステントの外側および内側表面にわたる、ＰＡナノファイバーの均一なコーティングを保証する。ステントの両端のストッパーは、マンドレル上でステントが滑るのを阻止する。ＰＡ溶液中でステントを１２時間回転させ、次いでさらに２４時間乾燥させた。図１２は、臨床医によって取り扱われた後の０．１重量％のＰＡＹＫでコーティングされたステントのＳＥＭ画像を示す。処置（血管形成術バルーンの埋込および拡張）後も、平滑で均一にコーティングされる表面は乱されないことに留意されたい。この結果は、ＰＡナノマトリックスをステント上に均一にコーティングでき、処置プロセス中でも安定であることを示唆する。
ｂ．インビボ査定の研究対象グループ
本研究において、雄の白ニュージーランドウサギを使用した。一羽のウサギを群当たりに使用し、ウサギ当たり２つのステントを移入した。２つの異なるナノマトリックスのコーティングおよび１つのコーティングされていないベアメタルステンレススチールステントが存在し、評価された。各ステントタイプを、以下のように２週間および４週間で評価した：対照（ベアメタルステント）２週間、４週間；低用量（０．１重量％のＰＡＹＫＮＯでコーティングされた）２週間、４週間；および高用量（１重量％のＰＡＹＫＮＯでコーティングされた）２週間、４週間。２週間目の時点において、予めバルーンを損傷させずに全てのステントを移入した。全てのウサギを、少なくとも手術前の２日間収容した。手術プロトコルは、ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＡｌａｂａｍａのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）より認可された、以下に説明される。
ｃ．ステント移入
処置の日、ウサギをケタミン／キシラジン３５／５ｍｇ／ｋｇで麻酔した。気管内管を挿入し、１分当たり１６呼吸の速度で４００ｍｌの１回換気量で作動する人工呼吸器に接続した。麻酔をイソフルラン２％で持続した。心拍数および血液酸素飽和を、動物の舌上に配置したパルス酸素濃度計を使用して監視した。後肢上の腱板を使用して、血圧を連続的に監視した。ウサギを背側横臥位でテーブルに固定した。アスピリン８１ｍｇ／日を処置の前日から、安楽死実施時まで、連日経口投与した。
右頸動脈を外科的に暴露し、血管アクセスを得た。６Ｆｒｅｎｃｈ Ｓｈｅａｔｈを頸動脈に挿入し、ヘパリン（１５０単位／ｋｇ）を静脈内に投与した。透視下で、６Ｆｒｅｎｃｈ ＪＲ４冠状動脈ガイドカテーテルを、０．０１４”冠状動脈ガイドワイヤーを越えて下行大動脈に進めた。血管造影を、カテーテルを通して注入した約８ｃｃｓのメグルミンジアトリゾエート対比を使用して実施した。ベースライン動脈造影図をデジタルに記録した。血管造影に続いて、送達バルーンに取り付けたステントを、ガイドワイヤーを越えて１つの腸骨動脈に進めた。１．１対１のステント対動脈比率で、ステントをわずかに大きくして留置した。第２のステントを同様の様式で他の腸骨動脈中に留置した。ステント移入後、カテーテル、ガイドワイヤー、および動脈シースを除去した。頸動脈を連結した。創傷を縫合閉鎖した。次いで、動物を観察下で回復させた。処置を終えてから１２時間ごとにＢｕｐｒｅｎｅｘ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内投与した。
動物を、いずれの有意な食欲喪失／体重減少（２０％を越える体重減少）、および下肢中の血液循環の欠乏も連日監視した。
ｄ．ステント回収
ステント移入２週間後および４週間後、安楽死を実施し、ステント留置された腸骨動脈をホルマリンでかん流圧固定した。ステントを除去し、組織学的研究のため１０％の緩衝ホルマリンに入れた。
ｅ．組織プロセス
全ての固定されたステントを脱水し、メチルメタクリル酸樹脂中に包埋した。完全な重合後、予備粉砕によって、目的の領域を表面に近づける。遮断の反対側を、Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ４０００（Ｅｘａｋｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ， ＯＫ）を使用してスライド上に乗せた。Ｅｘａｋｔ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｓａｗ（Ｅｘａｋｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ， ＯＫ）を使用し、切片（約１００ミクロンの厚さ）を各検体から切断した。Ｅｘａｋｔ Ｄｉａｍｏｎｄ Ｓａｗは、水冷却および流水装置が備わったダイアモンドコーティングされた切断帯に利用する大きな帯のこに似たものである。切片をＥｘａｋｔ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｘａｋｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ， ＯＫ）を用いて約２０〜３０μｍまで接地した、それは高精度の平行面を産生し、粗荒な研磨紙を使用して平滑した。研究される検体の表面に達した後、それを４０００グリッツの紙やすりで磨き、表面を可能な限り平滑に作成する。切片を、ステントの２５％、５０％、および７５％領域で作成した。全ての切片を、メチレンブルー／Ｂａｓｉｃ Ｆｕｃｈｓｉｎ染色で染色した。
組織学的分析は、損傷、血栓形成、炎症、および新生内膜の存在を含む。ステント留置されたセグメントを分析し、Ｓｃｈｗａｒｔｚ損傷スコアを使用して、動脈性損傷の類別をした。また、炎症および血栓も、評価尺度を用いて各支柱の周囲で査定した。各支柱の新生内膜の厚さをミクロンで測定した。コンピュータガイド形態計測測定を、デジタル画像およびＢｉｏｑｕａｎｔ画像分析ソフトウェア（Ｂｉｏｑｕａｎｔ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｒｐ， Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ， ＴＮ）を使用して実施した。コンピュータ化された面積測定法を実施した。
ｉｉ． 結果
図１３Ａは、ウサギ腸骨動脈中に留置されたステントのバルーンの膨張の成功を示す。図１３Ｂで示されるように、ステントを全体的に完全に留置し、微細基礎組織損傷が存在した。血管は無傷であり、開存性であった。ナノマトリックスコーティングの白点または剥離のいずれも記されなかった。微細炎症をステント支柱周囲で見出した。顕著に、非常に小さい新生内膜肥厚が存在し、ナノマトリックスでコーティングされたステントの表面上で血栓は見出されなかった。
各ステント支柱の損傷スコアを、以下のように０〜３に割り当てた：０＝損傷無し、１＝内弾性板の破壊、２＝培地の穿孔、および３＝外弾性膜から外膜の穿孔。
各セグメントの平均の損傷スコアを、検討された切片で支柱の総計によって、損傷スコアの合計を分割することによって算出した。４週間目の群（平均損傷スコア〜０．０２）の対照ステントを除外して、いずれのステントにおいても損傷の証拠は見られなかった。
新生内膜厚さ（ＮＩ）をミクロンで測定した。図１４に示されるように２週間目で、対照と比較して、高用量ステントにおいてより小さいＮＩの厚さの傾向が見られる。図１５で示されるように４週間目のＮＩは、２週間目よりも大きいが、対照と比較して、低用量および高用量群の双方において小さいＮＩの傾向が持続して見られる。
各支柱周囲の炎症を以下の評価尺度を使用して査定した：０＝支柱周囲の炎症細胞無し；１＝支柱周囲の軽い、非周囲リンパ球組織球性浸潤物；２＝支柱非周囲の局在化された、中等度から高密度の細胞集合体；および３＝支柱の濾過において、周囲の高密度のリンパ球組織球性細胞。
全ての研究対象群の平均の炎症スコアは０．５未満であり、４週間目ステントの群に対して有意な差異をいずれの２週間目ステントの群中にも伴わなかった。また、炎症スコアは、図１６および１７に示されるように、２週間および４週間目の群の双方で同様であることを見出した。
各支柱周囲の血栓スコアを０〜３でスケーリングした。２週間目で、全てのステントにおいて微細な血栓が存在した、またはいずれの血栓も見出されなかった。４週間目で、全てのステント群に対して、群間の有意な差異無しで、平均血栓スコアは０．１未満であった。図１８で示されるように、２つの高用量ステントのうちの１つは、４週間目で、いずれの血栓も掲示しなかった。
ｉｉｉ．結論
総合的に、全ての動物が残存し、全ての群中のステント留置に関連した微細組織損傷が存在した。ナノマトリックスコーティングの白点または剥離のいずれも記されなかったように、ステントコーティングは安定しているように見える。２週間および４週間目の時点の双方で、微細炎症が存在し、血栓はほとんど観察されなかった。群の全域で新生内膜厚さの比較は、いずれの群間でも相当の差異は示されないが、コーティングされていない対照ステント群と比較して、高用量および低用量ステント群において減少傾向の気配が存在した。内皮細胞を、高用量ステントを含む組織切片上で観察した。ファブリン堆積の不在および存在しない支柱周囲の結果としての血栓は、表面上に裏打ちされる内皮細胞の存在のためであり得る。
３．実施例３：電子紡ＰＣＬナノファイバーおよび天然内皮を模倣するペプチド両親媒性物質（ＰＡ）の組み合わせによるハイブリッド生物模倣型ナノマトリックス
ｉ．材料および方法
ａ．ｅＰＣＬナノファイバーの合成
２２．５重量％の粘性ポリマー溶液を得るため、ＰＣＬペレット（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ、Ｍｎ＝８０，０００）を、クロロホルムに対するメタノールの比率が１：１（ｖ／ｖ）の溶媒系に溶解し、２５Ｇの鈍端針でキャップされたシリンジへ移した。シリンジを、流速１ｍｌ／ｈｒに設定されたシリンジポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ， ＭＡ）中に配置した。針先を高電圧電源（Ｇａｍｍａ Ｈｉｇｈ−Ｖｏｌｔａｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｏｒｍｏｎｄ Ｂｅａｃｈ， ＦＬ）に接続し、＋２１ｋＶの電位を針先に加えた。得られた電子紡糸ＰＣＬ（ｅＰＣＬ）ナノファイバーは、針先から２８ｃｍのところに配置された接地アルミニウムコレクター上に沈着した。次いで、それらの上にｅＰＣＬシートを伴うコレクターを真空乾燥器中に２〜３日貯蔵し、いずれの残留溶媒も除去した。ｅＰＣＬナノファイバーの形態を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して特徴づけた。ナノファイバーを金／パラジウムでスパッタコーティングし、それらの形態を２０ｋＶの加速電圧において、Ｐｈｉｌｉｐｓ ＳＥＭ５１０下で観察した。ＳＥＭ画像を、画像分析器（Ｉｍａｇｅ−ｐｒｏｐｌｕｓ， Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ Ｃｏ．， Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）を使用して線維直径の測定のため、分析した。
ｂ．ペプチド両親媒性物質の合成
上述のようにペプチドは、Ａａｐｐｔｅｃｈ Ａｐｅｘ３９６ペプチド合成機中でＦｍｏｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して合成できる（Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。細胞接着性配列ＹＩＧＳＲまたはＮＯを供与している残基ＫＫＫＫＫを伴うＭＭＰ−２感受性配列（ＧＴＡＧＬＩＧＱ）から成る２つの１３アミノ酸ペプチドを合成した。これらのペプチドをアルキル化し、１６炭素パルミチル鎖に結合し、その結果、両親媒性物質を作成した。したがって、２つの異なるＰＡ、Ｃ１６−ＧＴＡＧＬＩＧＱ−ＹＩＧＳＲ（ＰＡ−ＹＩＧＳＲ）およびＣ１６−ＧＴＡＧＬＩＧＱ−ＫＫＫＫＫ（ＰＡ−ＫＫＫＫＫ）を合成した。
ｃ．細胞維持
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）は、内皮成長培地（ＥＧＭ）（２％ＦＢＳ、０．１％ｈＥＧＦ、０．１％ヒドロコルチゾン、０．１％ゲンタマイシンＡ、０．４％ウシの脳抽出液）を追加した内皮基本培地（ＥＢＭ）中で成長した。この細胞培地を全てのＨＵＶＥＣ研究において使用した。細胞をトリプシン処理（０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ）によって培養し、２５００〜５０００個の細胞／ｃｍ２の密度で継代培養した。ヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）は、平滑筋細胞成長培地（ＳｍＧＭ−２）ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ（商標）キット（５％ＦＢＳ、０．１％インスリン、０．２％ｈＦＧＦ−Ｂ、０．１％ゲンタマイシンＡ、０．１％ｈＥＧＦ）を追加した平滑筋細胞基本培地（ＳｍＢＭ）中で成長した。この細胞培地を全てのＡｏＳＭＣ研究において使用した。細胞をトリプシン処理（０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡ）、および３５００個の細胞／ｃｍ２の密度での継代培養によって、培養した。全ての細胞培養を、標準的な培養条件（３７℃、９５％の相対湿度、および５％のＣＯ２）下で維持した。全ての細胞および培地を、Ｌｏｎｚａ Ｉｎｃ社（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入した。
ｄ．ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫの比率の最適化
ＨＵＶＥＣを、ｅＰＣＬ−ＹＫ９０（９０％ＰＡ ＹＩＧＳＲ、１０％ＰＡ ＫＫＫＫＫ）、ｅＰＣＬ−ＹＫ７５（７５％ＰＡ ＹＩＧＳＲ、２５％ＰＡ ＫＫＫＫＫ）、ｅＰＣＬ−ＹＫ５０（５０％ＰＡ ＹＩＧＳＲ、５０％ＰＡ ＫＫＫＫＫ）、およびｅＰＣＬ−ＹＫ２５（２５％ＰＡ ＹＩＧＳＲ、７５％ＰＡ ＫＫＫＫＫ）として設計される、ｅＰＣＬ上にコーティングされた異なるモル比のＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫ上に、３０，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で播種した。コーティングされていないｅＰＣＬを対照として使用した。２時間のインキュベーション期間後、培地を吸引し、細胞を４００μｌの０．２５％の透明なトリプシンを使用して３０分トリプシン処理した。トリプシン処理された細胞を、ＰＢＳを用いた１：１の希釈で１．５ｍｌのエッペンドルフ管に収集し、−８０ｏＣで貯蔵した。したがって、収集された試料をＰｉｃｏｇｒｅｅｎ ＤＮＡアッセイに供し、細胞の数に比例するＤＮＡ含有物を評価した。
細胞を繰り返す凍結融解サイクルによって透過処理した。次いで、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素を細胞試料に追加した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ色素は細胞中の二本鎖ＤＮＡに結合し、その数量化を可能とする。知られている量のウシ胸腺ｄｓＤＮＡを基準として使用した。蛍光性を蛍光マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴ， Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＶＴ）中で測定した。ＤＮＡの量は、細胞当たり８ｐｇ ＤＮＡの経験値によって、細胞の数と相関した。
ｅ．ＮＯ放出ハイブリッドナノマトリックスの調製および特徴づけ
高圧下で、ＰＡ溶液を一晩純粋なＮＯと反応させることによって、ＮＯ放出ＰＡを合成した。純粋なＮＯを洗浄プロセスによって得た。市販のＮＯガスを５Ｍのカリウム水酸化物に通過させ、高い酸化物種等の不純物を除去した。ＮＯ洗浄前、アルゴンをそのシステムを通過させることによって、装置を脱気した。
９：１比率のＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫを、最高の比率として選択した。以下で、この混合物はＰＡ−ＹＫとして言及される。したがって、ＰＡ−ＹＫをＮＯと反応させてＮＯ放出ＰＡを得た、それはＰＡ−ＹＫ−ＮＯと称される。自己構築のＰＡ−ＹＫおよびＰＡ−ＹＫ−ＮＯを透過電子顕微鏡法によって特徴づけた。これは、ＮＯ反応が自己構築プロセスを妨げないことを確認するために行われた。ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを直径１６ｍｍのｅＰＣＬディスク上にコーティングし、ＮＯ放出ハイブリッドナノマトリックスを得、ｅＰＣＬ−ＹＫ−ＮＯと称した。これを以下のように行った。
Ｈｕｍｂｏｌｄｔボーリングマシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｅＰＣＬシートを直径１６ｍｍのディスクに切断した。これらのディスクを減少濃度のエタノールを用いて無菌化した。これらのディスクを２００μｌの０．１重量％のＰＡでコーティングした。次いで、これらの足場を振盪機上に２４時間配置し、次いで４８時間ドラフト中で乾燥することによって溶剤蒸発を通して、ＰＡをｅＰＣＬナノファイバー上で自己構築した。ｅＰＣＬナノファイバー上のＰＡの自己構築の成功をＴＥＭによって確認した。ＰＣＬを６００メッシュ六角形のＴＥＭグリッド上で電子紡糸し、４８時間真空乾燥器中で乾燥した。次いで、それらを５μｌの０．１重量％のＰＡでコーティングした。次いで、グリッドをドラフト中で一晩乾燥した。次いで、これらのグリッドを２％のＰＴＡで３０秒染色した。次いで、グリッドを、６０ｋＶの加速電圧でＦＥＩ Ｔｅｃｈｎａｉ Ｔ１２ ＴＥ顕微鏡を使用して画像化した。また、ＰＡがｅＰＣＬネットワークを妨げないことを保証するため、ＰＡでコーティングされたｅＰＣＬを、ＳＥＭを使用して画像化した。
ＮＯ放出研究のため、１６ｍｍのｅＰＣＬ足場を２００μｌの１重量％ＰＡ−ＹＫ−ＮＯでコーティングした。次いで、これらのディスクを２４時間振盪機中に配置した、続いて４８時間のドラフト中で、ｅＰＣＬナノファイバー上へのＰＡの自己構築を可能とした。次いで、これらの足場を、４８ウェル組織培養プレートにおいて、４００μｌのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩（ＨＢＳ）中でインキュベーションした。試料を、０時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、４日、６日、１０日、１４日、２１日、および２８日時点で収集した。対照として、ｅＰＣＬ足場をＰＡ−ＹＩＧＳＲ−ＮＯでコーティングした。ＰＡ−ＹＩＧＳＲを純粋なＮＯと反応させることによって、ＰＡ−ＹＩＧＳＲ−ＮＯを得た。これは、ＮＯのＰＡへの非特異的結合を説明する。試料を収集した後、亜硝酸塩含有物を、Ｇｒｅｉｓｓアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することによって測定し、サルファニルアミドおよびＮ−１ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリドを使用する。亜硝酸塩はＮＯの一次分解生成物である。５０μｌの試料を、５０μｌのサルファニルアミドおよび５０μｌのＮ−１ナフチルエチレンジアミンジヒドロクロリドで処置した。１５分のインキュベーション後、ミクロプレートリーダー（ＥＬｘ８００， ＢＩＯ−ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， ＶＴ）を使用して、吸光度を５４０ｎｍで読んだ。ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＩＧＳＲ−ＮＯ間の亜硝酸塩含有量の差異から、ＰＡ−ＫＫＫＫＫの溶解素残基から放出されるＮＯの量が明らかにされる。これを、時間に対して放出されるＮＯの測定としてプロットする。
ｆ．ハイブリッドナノマトリックス上の細胞行動の評価
それぞれ３０，０００個の細胞／ｃｍ２および１５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ上に、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを播種した。２時間のインキュベーション後、細胞を形態学的にＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ生死判別／細胞毒性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）で染色した。初期細胞接着を、３つの異なる基質、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ、およびｅＰＣＬ上にＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを播種することによって分析した。４８ウェル組織培養プレートのウェルに保持されている基質上で、ＨＵＶＥＣを３０，０００個の細胞／ｃｍ２で播種し、ＡｏＳＭＣを１５，０００個の細胞／ｃｍ２で播種した。２時間のインキュベーション期間後、培地を吸引し、細胞を４００μｌの０．２５％透明なトリプシンを使用して３０分トリプシン処理した。トリプシン処理された細胞を、ＰＢＳを用いた１：１希釈で１．５ｍｌのエッペンドルフ管に収集し、−８０ｏＣで貯蔵した。したがって、収集された試料をＰｉｃｏｇｒｅｅｎ ＤＮＡアッセイに供し、細胞の数に比例するＤＮＡ含有物を評価した。
細胞増殖へのＮＯの影響を評価するため、０．１重量％のＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびＰＡ−ＹＫを１６ｍｍのｅＰＣＬディスク上にコーティングした。それぞれ３０，０００個の細胞／ｃｍ２および１５，０００個の細胞／ｃｍ２の密度で、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを播種した。細胞核抗原（ＰＣＮＡ）染色を増殖することによって、ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖を評価した。４８時間のインキュベーション後、細胞を１０％のホルマリン中に固定し、メタノール中で透過処理し、３％の水素過酸化物溶液を使用して遮断した。次いで、細胞をトリス緩衝生理食塩水でインキュベーションし、続いてＰＢＳ中で３％のＦＢＳで１：１００に希釈されたマウスＩｇＧ抗ＰＣＮＡ一次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションした。次いで、細胞を続いてＰＢＳ中で３％のＦＢＳで１：１００に希釈されたマウスＩｇＧ抗ＰＣＮＡ一次抗体（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションし、続いてアミノエチルカルバゾール色素原（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）でインキュベーションした。細胞をＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、３７ｍＭのアンモニウム水酸化物で濯いだ。視野（２０Ｘ）当たりの増殖する細胞の割合を、位相差顕微鏡法を使用して、赤い色の増殖細胞および青色の非増殖細胞を数えることによって、決定した。全ての細胞数量化のため、５つの確率場を各ウェルに対して画像化し、平均化した。さらに、研究を構成するぞれぞれの状態のため、４つの試料を試験した。グラフに示されるその結果は、３つの独立した研究（ｎ＝１２）からの１２０を越える画像の平均を描写している。
ｇ．統計分析
全ての研究を、少なくとも３つの独立した時間で実施した。全てのデータを一方向の分散分析試験と比較し、ＳＰＳＳソフトウェアを使用して統計的有意性を評価した。分散分析内で、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を実施し、対間で有意な差異を見出した。ｐ＜０．０５の値であれば、統計的に有意であるとみなした。
ｉｉ．結果および考察
本明細書で開示されるものは、心血管埋植物表面上に天然内皮の性質を再構成するため設計された、ハイブリッド生物模倣型ナノマトリックスである。生物医学的適用に望ましい特性を有することで知られているｅＰＣＬナノファイバーを製造することに成功した。図２０ａのＳＥＭ画像に示されるように、ｅＰＣＬ線維は比較的均一な形態を有し、２００ｎｍ〜７００ｎｍのナノスケール直径を有し、ビーズを含まない。また、全てのｅＰＣＬナノファイバーの典型的な、ランダムで、織り合わさった本質は画像からも確かである。加えて、大抵の線維は、３００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内になるように測定された直径を有した、それは天然ＥＣＭ中に見出されるコラーゲン線維束と同様である（Ｅｌｓｄａｌｅ Ｔ ａｎｄ Ｂａｒｄ Ｊ：１９７２）。ＥＣＭを模倣する線維性トポグラフィーのこの態様が細胞によって好まれる。しかしながら、この魅力的な形態学的特徴は、ｅＰＣＬ中の生理活性の欠乏により否定される。ｅＰＣＬ上のこの細胞認識部位の欠乏は、足場が細胞と活発に相互作用することを阻止し、したがって、宿主組織と効果的に統合されることができない。したがって、また本明細書で開示される、これらのｅＰＣＬナノファイバーは生理活性に恵まれた。
この生理活性を、ＰＡの使用を介して、ｅＰＣＬナノファイバーに導入した。２つの異なるＰＡ、Ｃ１６−ＧＴＡＧＬＩＧＱ−ＹＩＧＳＲ（ＰＡ−ＹＩＧＳＲ）およびＣ１６−ＧＴＡＧＬＩＧＱ−ＫＫＫＫＫ（ＰＡ−ＫＫＫＫＫ）の合成に成功した。ＰＡは、ＹＩＧＳＲまたはポリ溶解素（ＫＫＫＫＫ）基と共に酵素媒介分解性ＭＭＰ−２感受性配列（ＧＴＡＧＬＩＧＱ）を含有し、ＮＯを供与している残基を形成する。また、ＰＡ−ＹＫを、異なるモル比のＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫを混合することによって設計した。したがって、細胞接着性リガンドおよびＮＯの密度は、ＰＡ−ＹＩＧＳＲおよびＰＡ−ＫＫＫＫＫの比率が変わることによって調製できる。これらのＰＡ−ＹＫを上にコーティングし、ハイブリッドナノマトリックス（ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ）を作成した、次いでそれをＳＥＭによって特徴づけた（図２０ｂ）。ＰＡ−ＹＫでのコーティングがｅＰＣＬナノファイバー形態に影響しないことは明白である。また、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫをＴＥＭによって特徴づけた（図２１ａ）。ＴＥＭ画像から、中枢ｅＰＣＬナノファイバー（直径約３００ｎｍ）を観察し、そのどちらかの側をＰＡ（直径７〜８ｎｍ）でコーティングした。ＴＥＭ画像の深度の欠乏のため、均一なコーティングを、画像を得るため横軸中で電子顕微鏡のステージを傾けることによって、確認した（図２１ｂ）。この画像は傾けられていない画像と同様であり、したがってｅＰＣＬナノファイバー上のＰＡのコーティングが均一であることを合理的に推定できる。最適なマトリックス組成物を決定するため、内皮細胞をｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫの様々な比率で播種し、細胞接着は、増加するＰＡ−ＹＩＧＳＲ濃度と共に有意に大きかった（図２２）。したがって、これ以降ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ９０（９：１ｍｏｌ／ｍｏｌ）はｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫとして称され、全てのさらなる研究のために使用された。
ＰＡ−ＹＫをＮＯと反応させＰＡ−ＹＫ−ＮＯを得た。次いで、これをｅＰＣＬ上にコーティングし、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを製造した、それはＮＯ放出、生物模倣型ハイブリッドナノマトリックスである。ｅＰＣＬ−ＹＫ−ＮＯをＳＥＭ（図１９ｃ）によって特徴づけ、ＰＡ−ＹＫ−ＮＯがｅＰＣＬナノファイバーの形態に影響しないことを確認した。均一なコーティングを確認するため、次いでｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯをＴＥＭによって画像化した（図２１ｃ）。ＰＡ−ＹＫ−ＮＯの均一なコーティングは、ｅＰＣＬナノファイバーのどちらの側上でも可視であり、また横軸中で画像を傾けた後、画像診断によってこれを確認した（図２１ｄ）。
ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯハイブリッドナノマトリックスからのＮＯ放出プロファイルを、Ｇｒｅｉｓｓアッセイを使用して評価した。ＮＯ放出の成功を２８日にわたり観察した。初期のバースト放出は最初の４８時間中に発生し、続いて４週間の期間にわたって放出を緩徐に持続し、ＮＯの４８％の回復をもたらす（図２３）。初期のバースト放出は、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノ線維性マトリックスの表面からのＮＯ放出として説明でき、局所送達に容易に到達可能であった。これは平滑筋細胞の増殖を限界するために特に重要であり、再狭窄において重要な現象のうちの１つであり、損傷の翌日には始まっている（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ ＷＳ：２００７）。したがって、ＮＯの４８時間バースト放出は、新生内膜肥厚の停止にとって重大な意味を持つ。その後の持続した放出は、拡散および酵素分解の組み合わせによって、大量のハイブリッドナノ線維性マトリックスからのＮＯ放出に起因し得る。時間と共に、ＭＭＰ−２分解性部位の存在のため、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯを緩徐に分解し、これは、大量のマトリックスからの持続されたＮＯの放出を助けることが考えられる。また、酵素媒介分解性部位の存在は、ハイブリッドナノマトリックス中のＮＯの濃度勾配を作成することが期待される。研究から、４週間の期間にわたってＮＯの３．８μモルが、直径１６ｍｍのｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯディスクから放出されたことを観察できる。この量は、１ｘ１０−１０ｍｏｌｃｍ−２ ｍｉｎ−１の率で、内皮細胞によって放出される累積ＮＯに相当する（Ｖａｕｇｈｎ ＭＷ， ｅｔ ａｌ．１９９８）。長期間にわたって緩徐に持続された放出が、平滑筋細胞の非増殖状態、血管壁の抗血栓形成性本質を維持すること、回復期間に内皮化を促進するために必要とされ、典型的に数週間かかる。ハイブリッドナノマトリックスの別の特徴は、ＰＡ−ＫＫＫＫＫ中の溶解素部分の数を変化することによって、放出されるＮＯの量が今後の適用において容易に調製できることである。したがって、ＰＡ−ＫＫＫＫＫ中の溶解素の数を拡張することによって（例えば、ＰＡ−ＫＫＫＫＫＫＫ）、またはＰＡ−ＹＫ中のＰＡ−ＫＫＫＫＫの割合を増加することによって（例えば、９：２、３：１、９：４、２：１、９：５、３：２、９：７、９：８、１：１、３：４のＰＡ−ＹＩＧＳＲ対ＰＡ−ＫＫＫＫＫ比率）、溶解素の数を増加することは、ＮＯ放出の率を増加でき、ＮＯ放出の持続時間を増加できる。
初期細胞接着を、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ上でＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣを播種することによって研究した。コーティングされていないｅＰＣＬを対照として使用した。これらの細胞を形態学的に画像化し、ｅＰＣＬと比較した場合、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫがＡｏＳＭＣ拡散を支持しないにもかかわらず（図２５）、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫがＨＵＶＥＣの接着および拡散を改善することを見ることができる（図２４）。図２６ａから、コーティングされていないｅＰＣＬと比較した場合（１２４９０±６３９）、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ（１５５７６±２４１４）およびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ（１６６８５±８０８）が有意に大きなＨＵＶＥＣ接着を示すことを見ることができる。図２６ｂから、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ（９１２３±１３４４）およびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ（９４０４±１２５９）がｅＰＣＬ（９３１０±５６１）と似たような接着を示し、したがってＡｏＳＭＣ接着を支持しないことが明白である。これらの結果は、ハイブリッドナノマトリックス（ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯおよびｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ）が内皮細胞接着および拡散を促進し、同時に平滑筋細胞接着および拡散を支持しないことを明確に示す。これはＰＡが、ラミニン由来のＹＩＧＳＲ細胞接着性部分の形態として、ｅＰＣＬナノファイバーに、内皮細胞特異的な生理活性を与えるためである。
ＨＵＶＥＣおよびＡｏＳＭＣの増殖へのＮＯの効果を、４８時間のインキュベーション後、Ｇｒｅｉｓｓアッセイを使用して研究した。図２７に示されるように、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫナノマトリックスと比較して、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックス上のＰＣＮＡ陽性ＨＵＶＥＣの割合（７０±２％）が、有意に大きいことを見出した（５７±３％）。しかしながら、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯ上のＰＣＮＡ陽性ＡｏＳＭＣの割合（４１±３％）は、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫよりも有意に低かった（５８±４％）。これらの結果は、ｅＰＣＬ−ＰＡ−ＹＫ−ＮＯナノマトリックスが、内皮細胞成長を増強するが、平滑筋細胞の成長を制限することを示唆している。平滑筋成長を阻止すると同時に、内皮化の増強は、内膜過形成および再狭窄を阻止することによって、移植片開存性を改善することに向けての重大なステップである。
したがって、このハイブリッドナノマトリックスは、生物模倣型心血管埋植材料として使用できる可能性が大きい。従来の心血管埋植材料は構造的支持を提供することに限られており、天然内皮を密接に模倣する能力が無いため、宿主組織と効果的に統合されることができない。加えて、それらは再内皮化、再狭窄、および血栓症の欠乏によって特徴づけられる。本明細書で開示されるように、電子紡糸ＰＣＬおよびＰＡナノファイバーから成るハイブリッド生物模倣型足場が開発された。ｅＰＣＬは、機械的な強さおよび定期的な拍動力に暴露される心血管移植片に望ましいトポグラフィー構造を提供する。ＰＡナノファイバーは内皮細胞接着性ＹＩＧＳＲ部分から成り、ずれ流動に対して内皮細胞の接着を補充、かつ促進することが期待される。ＮＯはハイブリッドナノマトリックス平滑筋細胞増殖から放出され、内皮細胞増殖を促進すると同時に、ナノマトリックスに抗血栓性本質を与える。ＰＡ中に存在する酵素媒介分解性部位はマトリックスの緩徐な細胞を対象とする分解を引き起こすことが期待され、これがＮＯの持続放出の一助となる。したがって、このハイブリッドナノマトリックスの適用の実施例として、ナノマトリックスは、血管移植片および心臓弁等の移入可能な心血管デバイス上に使用できる。
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Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ， Ｍｅｇｓｏｎ Ｉ． Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｄｏｎｏｒ ｄｒｕｇｓ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２００７； １５１：３０５−３２１．
Ｍｏｒｉｃｅ ＭＣ， Ｓｅｒｒｕｙｓ ＰＷ， Ｓｏｕｓａ ＪＥ， Ｆａｊａｄｅｔ Ｊ， Ｂａｎ Ｈａｙａｓｈｉ Ｅ， Ｐｅｒｉｎ Ｍ， Ｃｏｌｏｍｂｏ Ａ， Ｓｃｈｕｌｅｒ Ｇ， Ｂａｒｒａｇａｎ Ｐ， Ｇｕａｇｌｉｕｍｉ Ｇ， Ｍｏｌｎａｒ Ｆ， Ｆａｌｏｔｉｃｏ Ｒ． Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｅｎｔ ｆｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ２００２； ３４６（２３）：１７７３−１７８０．
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Ｐｕｌｆｅｒ ＳＫ， Ｏｔｔ Ｄ， Ｓｍｉｔｈ ＤＪ． Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｉｎｔｏ ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔｓ． Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． １９９７； ３７（２）：１８２−１８９．
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Ｒｏｉｒｏｎ Ｃ， Ｓａｎｃｈｅｚ Ｐ， Ｂｏｕｚａｍｏｎｄｏ Ａ， Ｌｅｃｈａｔ Ｐ， Ｍｏｎｔａｌｅｓｃｏｔ Ｇ． Ｄｒｕｇ ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔｓ： ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ． Ｈｅａｒｔ． ２００６； ９２（５）：６４１−６４９．
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Ｓｈｅｉｂａｎ Ｉ， Ｃａｒｒｉｅｒｉ Ｌ， Ｃａｔｕｚｚｏ Ｂ， Ｄｅｓｔｅｆａｎｉｓ Ｐ， Ｏｌｉａｒｏ Ｅ， Ｍｏｒｅｔｔｉ Ｃ， Ｔｒｅｖｉ ＧＰ． Ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔ： ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ． Ｍｉｎｅｒｖａ ｃａｒｄｉｏａｎｇｉｏｌｏｇｉｃａ． ２００２；５０（５）：４４３−４５３．
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Ｗｉｎ ＨＫ， Ｃａｌｄｅｒａ ＡＥ， Ｍａｒｅｓｈ Ｋ， Ｌｏｐｅｚ Ｊ， Ｒｉｈａｌ ＣＳ， Ｐａｒｉｋｈ ＭＡ， Ｇｒａｎａｄａ ＪＦ， Ｍａｒｕｌｋａｒ Ｓ， Ｎａｓｓｉｆ Ｄ， Ｃｏｈｅｎ ＤＪ， Ｋｌｅｉｍａｎ ＮＳ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｎｔ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｏｆｆ−ｌａｂｅｌ ｕｓｅ ｏｆ ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔｓ． ＪＡＭＡ． ２００７； ２９７（１８）：２００１−２００９．
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Ｚｈａｎｇ ＹＺ， Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ Ｊ， Ｈｕａｎｇ ＺＭ， Ｌｉｍ ＣＴ， Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓ： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ ＰＣＬ−ｃｏｌｌａｇｅｎ ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ ｕｓｉｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２００５， ６：２５８３−２５８９．
Ｚｉｃｈｅ Ｍ， Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉ Ｌ， Ｍａｓｉｎｉ Ｅ， Ａｍｅｒｉｎｉ Ｓ， Ｇｒａｎｇｅｒ ＨＪ， Ｍａｇｇｉ ＣＡ， Ｇｅｐｐｅｔｔｉ Ｐ， Ｌｅｄｄａ Ｆ． Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １９９４； ９４（５）：２０３６−２０４４．
Ｚｉｍａｒｉｎｏ Ｍ， Ｒｅｎｄａ Ｇ， Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａ Ｒ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｒｕｇ−ｅｌｕｔｉｎｇ ｓｔｅｎｔｓ． Ｄｒｕｇｓ． ２００５； ６５（６）：７２５−７３２．
Ｉ．配列
配列番号1
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
配列番号2
Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
配列番号3
Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
配列番号4
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
配列番号5
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
配列番号6
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
配列番号7
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
配列番号8
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
配列番号9
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ
配列番号10
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
配列番号11
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
配列番号12
Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
配列番号13
Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ
配列番号14
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
配列番号15
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
配列番号16
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ
配列番号17
Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ
当業者にとって、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明に様々な修正および変化を加え得ることが明白である。本明細書で開示される本発明の明細書および実践を考慮すると、本発明の他の実施形態は、当業者にとって明白である。以下請求項によって示唆される本発明の正確な範囲および精神と共に、本明細書および実施例は例示としてのみ考慮されることが意図される。

Claims (41)

  1. 親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含むペプチド両親媒性物質であって、前記親水性ペプチド配列は、分解配列と、第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含み、前記第１の接着性配列は平滑筋細胞および／または血小板に結合しない内皮細胞接着性配列である、ペプチド両親媒性物質。
  2. 前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＣＡ
    を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、
    「ＤＳ」は分解配列であり、
    「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列である、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  3. 前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＫＫ
    を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、
    「ＤＳ」は分解配列であり、
    「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  4. 前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＣＡ−−−ＫＫ
    を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、
    「ＤＳ」は分解配列であり、
    「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、
    「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  5. 前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＫＫ−−−ＣＡ
    を含み、式中、−−−は直接的または間接的共有結合であり、
    「ＤＳ」は分解配列であり、
    「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、
    「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  6. 前記分解配列は、細胞媒介タンパク質分解性分解を受ける配列を含む、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  7. 前記分解配列は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）特異的切断部位を含む、請求項６に記載のペプチド両親媒性物質。
  8. 前記分解配列は、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）特異的切断部位を含む、請求項７に記載のペプチド両親媒性物質。
  9. 前記両親媒性物質は、ナノファイバー上にコーティングされる、請求項１に記載のペプチド両親媒性物質。
  10. 前記ナノファイバーはポリエステルを含む、請求項９に記載のペプチド両親媒性物質。
  11. 前記ポリエステルはポリカプロラクトンである、請求項１０に記載のペプチド両親媒性物質。
  12. 前記ナノファイバーはエレクトロスピニングによって製造される、請求項９に記載のペプチド両親媒性物質。
  13. 第１および第２のペプチド両親媒性物質を含む組成物であって、それぞれが独立して親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、前記第１のペプチド両親媒性物質の前記親水性ペプチド配列は、分解配列および内皮細胞接着性配列を含み、前記第２のペプチド両親媒性物質の前記親水性ペプチド配列は、分解配列および一酸化窒素を産生するドナー配列を含む、組成物。
  14. 前記第１のペプチド両親媒性物質の前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＣＡ
    を含み、式中、各−−−は独立して、直接的または間接的共有結合であり，
    「ＤＳ」は分解配列であり、
    「ＣＡ」は内皮細胞接着性配列であり、
    前記第２のペプチド両親媒性物質の前記親水性ペプチド配列は、式
    ＤＳ−−−ＫＫ
    を含み、式中、「ＫＫ」は一酸化窒素を産生するドナー配列である、請求項１３に記載の組成物。
  15. ナノファイバーをさらに含み、前記第１および第２の両親媒性物質は、ナノファイバー上にコーティングされる、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記ナノファイバーはポリエステルを含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記ポリエステルはポリカプロラクトンである、請求項１６に記載の組成物。
  18. ナノファイバーへと構築された１つ以上のペプチド両親媒性物質を含む内皮を模倣するナノマトリックスであって、前記ペプチド両親媒性物質は、それぞれ親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、前記親水性ペプチド配列は、分解配列と、第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含み、前記第１の接着性配列は、平滑筋細胞および／または血小板に結合しない内皮細胞接着性配列である、内皮を模倣するナノマトリックス。
  19. 前記ナノファイバーは、式ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫを有するペプチド両親媒性物質の混合物を含む、請求項１８に記載の内皮を模倣するナノマトリックス。
  20. 前記ＤＳ−−−ＣＡおよびＤＳ−−−ＫＫペプチド両親媒性物質は、約１：９〜約９：１の比率で前記ナノファイバー中に存在する、請求項１９に記載の内皮を模倣するナノマトリックス。
  21. 前記ナノファイバーはポリカプロラクトンをさらに含む、請求項１８に記載の内皮を模倣するナノマトリックス。
  22. 内皮を模倣するナノマトリックスでコーティングされた医療デバイスを含む組成物であって、ナノファイバーへと構築された１つ以上のペプチド両親媒性物質を含み、前記ペプチド両親媒性物質は、それぞれ親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、前記親水性ペプチド配列は、分解配列と、第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含み、前記第１の接着性配列は、平滑筋細胞および／または血小板に結合しない内皮細胞接着性配列である、組成物。
  23. 前記医療デバイスは、血管ステント、血管移植片、カテーテル、ペースメーカー、または心臓弁である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記ナノファイバーは、ポリカプロラクトンナノファイバーを含み、その上に前記両親媒性物質がコーティングされ、前記ナノマトリックスを形成する、請求項２２に記載の組成物。
  25. ペプチド両親媒性物質を作成する方法であって、
    ａ）分解配列と、内皮細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含む、親水性ペプチドを提供するステップと、
    ｂ）疎水性部分を用いて前記親水性ペプチドのＮ末端をアルキル化するステップと、を含む、方法。
  26. 前記アルキル化は、疎水性カルボン酸を用いるアミド化を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記疎水性カルボン酸は脂肪酸である、請求項２６に記載の方法。
  28. ナノファイバーへの１つ以上のペプチド両親媒性物質の自己構築を誘発することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記１つ以上のペプチド両親媒性物質を一酸化窒素と反応させて、ジアゼニウムジオレート修飾ペプチド［Ｋ［Ｎ（Ｏ）ＮＯ−］］５を形成することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  30. 循環器疾患に罹患する対象を治療する方法であって、前記対象に、１つ以上のペプチド両親媒性物質を投与することを含む、方法。
  31. 前記ペプチド両親媒性物質は、それぞれ親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、前記親水性ペプチド配列は、分解配列と、１つ以上の第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ペプチド両親媒性物質は、ポリエステルナノファイバー上にコーティングされる、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記ポリエステルナノファイバーは、ポリカプロラクトンナノファイバーである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記循環器疾患はアテローム性動脈硬化である、請求項３０に記載の方法。
  35. 前記ペプチド両親媒性物質は、医療デバイスを介して前記対象に投与される、請求項３０に記載の方法。
  36. 前記医療デバイスは、血管ステント、血管移植片、カテーテル、ペースメーカー、または心臓弁である、請求項３５に記載の方法。
  37. 移植片の開存性を改善する方法であって、移植片のレシピエントに１つ以上のペプチド両親媒性物質を投与することを含む、方法。
  38. 前記ペプチド両親媒性物質は、それぞれ親水性ペプチド配列および疎水性尾部を含み、前記親水性ペプチド配列は、分解配列と、第１の細胞接着性配列および一酸化窒素を産生するドナー配列のうちの１つ以上とを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ペプチド両親媒性物質は、ポリエステルナノファイバー上にコーティングされる、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記ポリエステルナノファイバーは、ポリカプロラクトンナノファイバーである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記移植片は、動脈、静脈、血管ステント、カテーテル、ペースメーカー、または心臓弁である、請求項３７に記載の方法。
JP2011535727A 2008-11-07 2009-11-09 内皮を模倣するナノマトリックス Active JP5693458B2 (ja)

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