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KR101822200B1 - 내피 모방 나노매트릭스 - Google Patents

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KR101822200B1
KR101822200B1 KR1020117013015A KR20117013015A KR101822200B1 KR 101822200 B1 KR101822200 B1 KR 101822200B1 KR 1020117013015 A KR1020117013015 A KR 1020117013015A KR 20117013015 A KR20117013015 A KR 20117013015A KR 101822200 B1 KR101822200 B1 KR 101822200B1
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미낙시 쿠샤와하
브리지타 씨. 브로트
피터 앤더슨
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유에이비 리서치 파운데이션
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Abstract

본 발명은 천연 내피 모방 나노매트릭스를 생성시키는 데에 사용하기 위한 펩티드 양쪽성물질에 관한 것이다. 기술된 천연 내피 모방 나노매트릭스는 맥관 스텐트와 같은 의료 기기를 코팅시켜서 내피화를 조장하고 재협착 및 혈전을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 본 요약서는 특정 분야에서 검색을 목적으로 스캐닝 툴로서 의도되며, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

Description

내피 모방 나노매트릭스 {ENDOTHELIUM MIMICKING NANOMATRIX}
본 출원은 내피 모방 나노매트릭스에 관한 것으로서, 2008년 11월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/112,578 및 2009년 7월 2일자로 출원된 미국 정규 출원 번호 12/497,305의 이점을 청구하고 있으며, 이들은 각각 그 전체 내용이 본원에 참고로 통합된다.
관련출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2008년 11월 7일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/112,578 및 2009년 7월 2일자로 출원된 미국 정규 출원 번호 12/497,305의 이점을 청구하고 있으며, 이들은 각각 그 전체 내용이 본원에 참고로 통합된다.
심혈관 질환 (CVD)는 미국에서 사망의 최고의 원인이다. 이들 질병은 약 100만명이 앓고 있으며, 매년 4천억 US 달러를 초과하는 비용이 들고 있다. CVD의 주된 원인은 동맥의 내면에서의 콜레스테롤의 침착에 의한 동맥 폐쇄증이다. 이는 이른바 죽상 동맥경화증이다 (Silverthorn DU. 2004).
죽상 동맥경화증의 치료를 위해, 기구 혈관 형성술로 불리우는 비침입성 기술이 1970년대에 도입되었으며, 이는 관상동맥우회술에 대한 바람직한 대안을 제공하였다. 이는 플라크의 자리에서 삽입되고 팽창되는 가느다란 붕괴 풍선 카테터를 사용하였다. 팽창 시에, 풍선은 플라크를 압축시키고 파열시켜서 폐색을 제거한다. 이 기술은 환자에 대한 순간적인 완화를 제공하였다. 그러나, 이는 카테터의 회수 후에 동맥의 갑작스런 폐쇄의 문제점에 의해 제한된다 (Windecker 등, 2000). 이러한 시도는 일반 금속 스텐트와 같은 생물의학적 해결책의 설계를 유도한다.
동맥의 갑작스런 폐쇄를 예방하기 위해, 일반 금속 스텐트 (BMS)와 같은 격자 형태의 팽창성 금속 튜브가 1990년대에 도입되었다. 붕괴 스텐트를 갖는 풍선 첨단 카테터가 유도 카테터 및 안내 와이어와 함께 삽입된다. 풍선이 플라크 자리에서 팽창되면, 스텐트는 팽창되고, 제 위치에서 잠기고, 동맥 개방을 지지하는 스캐폴드를 생성시킨다. BMS의 사용은 기구 혈관 형성술과 비교하여 재협착의 속도를 감소시켰다. 이들은 동맥의 탄력 반동을 예방하는 데에는 성공적이었지만, BMS는 재협착의 문제점 (즉, 동맥의 재폐쇄)이 있다 (Sheiban I 등, 2002).
도 1은 탄력 반동, 부정 혈관 재형성 및 신생혈관내막 증식을 포함하는 재협착의 원칙적 메카니즘의 개략도를 나타낸다 (Dobesh PP 등, 2004). BMS는 사실상 탄력 반동 (Sheiban I 등, 2002, Ozaki Y 등, 1996) 및 부정 혈관 재형성 (Sheiban I 등, 2002)을 해결한다. 그러나, BMS에서 재협착의 주된 메카니즘은 신생혈관내막 과형성이다 (Violaris AG 등, 1997). 신생혈관내막 과형성은 혈관벽 내로의 스텐트 스트러트의 관통으로 인한 내피세포 제거에 의해 유발된다. 파열된 플라크 가 혈관벽의 혈전성 내용물을 루멘에 노출시켜서, 혈소판 부착, 활성화 및 혈전증의 케스케이드를 유도함이 이미지화될 수 있다. 그 외에, 내피세포 제거는 항혈전성 인자의 손실을 유도한다. 활성화된 혈소판은 평활근 세포 증식 및 이동을 지지하는 인자이다. 한편, 평활근 세포는 또한 이들의 형태 수축성으로터 합성으로 변화시킨다. 이는 평활근 세포 이동 및 증가된 세포외 매트릭스 (ECM) 합성을 결과하여, 신생혈관내막 과형성 및 스텐트내 재협착을 유도할 수 있다 (Bauters C 등, 1997). 따라서, BMS 고속의 스텐트내 재협착에 의해 그 제한이 유지된다. 이와 같이, 국부적 약물 전달과 같은 BMS의 생물의학적 설계에 대한 추가의 진전이 요구된다.
카테터 기본 약물 전달의 주된 시도는 신생혈관내막 과형성의 생성을 감소시키기 위해 맥관 손상의 자리에서 약물의 국부화를 달성시키는 것이다. 이와 같이, 조절된 약물 전달 시스템은 스텐트에 적용되어, 약물 용리 스텐트 (DES)의 개발을 결과하였다. DES는 2003년도에 미국에서 상용화되었다 (Ong AT 등, 2005). 이들은 이식 후에 혈류 및 주변 조직 중에서 전달되는 단일 또는 다중 생체 활성제로 코팅된다. 이들 스텐트 이의 생화학적 경로를 표적화함으로써 신생혈관내막 과형성의 과정에 간섭하는 약제를 방충시키도록 설계된다. 확산 조절, 용해/분해 조절 및 이온교환-기본 방법과 같은 수가지 약물 전달 방법이 DES에 대해 연구되었다 (Acharya G 등, 2006). DES는 BMS와 비교하여 재협착증을 감소시키는 것으로 입증되었다. 이들은 2004년부터 2006년까지 600만명을 초과하는 환자에게 이식되었다 (Colombo A 등, 2007).
스텐트 시장은 하기의 단지 2가지 약물 용리 스텐트에 의해 공유된다: (1) Cordis CYPHERTM 시롤리무스 용리 스텐트 및 (2) Boston Scientific TAXUSTM 파클리탁셀 용리 스텐트. (FDA는 2003년 4월에 Cypher 스텐트 및 2004년 3월에 Taxus 스텐트를 승인하였다). 시롤리무스 및 파클리탁셀은 둘 모두 세포 주기를 억제함으로써 작용한다. 시롤리무스는 키나아제 활성화를 촉진시켜서, 세포성장 단계의 억제를 유도하는 면역억제성 약물이다. 파클리탁셀은 분열중인 세포에서 미소관에 결합하고, 이들이 조직되도록 하여 유사분열을 방지한다 (Wessely R 등, 2006). 이들 DES의 사용은 많은 무작위 조절 시험 (Morice MC 등, 2002; Moses JW 등, 2003) 및 메타-분석 (Roiron C. 등, 2006)에 의해 입증된 바와 같이 재협착의 위험을 80% 이상까지 감소시키는 것으로 입증되었다. 그러나, DES과 BMS 사이에서 치사율의 차이는 관찰되지 않았다 (Roiron C 등, 2006; Babapulle MN 등, 2004). 이는 DES의 첫 번째 발생에서 관심사인 최근 원인인 후기 스텐트 혈전증 또는 혈액 응고의 발생에 기인할 수 있다 (Camenzind E 등, 2007; Webster MW 등, 2007; Van Belle E 등, 2007; Jaffe R 등, 2007; Leon MB. 2007). 상기 후기 혈전증은 약물에 대한 반응으로서 국부 과민증의 드문 경우인 불연속 항혈소판 치료 (Zimarino M 등, 2005), 및 DES의 허가사항외 사용 (Win HK 등, 2007)에 관련된 것으로 여겨진다. FDA 표준에 따라, DES는 단지 30 mm 미만의 길이의 이전에 치료되지 않은 관상동맥 협착 및 2.50 mm 내지 3.70 mm의 기준 맥관 직경을 갖는 환자에 대해서만 승인되었다 (Win HK 등, 2007; Melikian N 등, 2006). 미국심장학회 (American College of Cardiology)로부터의 연구는 허가사항외 사용이 공통적이고 시간 경과에 따라 빈도수가 증가하였음을 보고하였다 (Rao SV 등, 2006). 그 외에, 연구는 DES가 BMS 이식의 자리와 비교하여 지속적 피브린 침착 및 불량한 내피화로 인해 동맥 치료에서 상당한 지연을 유발시킴을 입증하였다 (Finn A 등, 2007). 모세혈관현미경적 소견은 시롤리무스 용리 스텐트의 불완전 신생혈관내막 커버링을 나타낸다 (Kotani J 등, 2006). 또한, 당뇨병, 신부전 및 이전 합병증과 같은 환자 위험 요인은 DES를 수용한 환자의 후기 혈전증의 발생의 원인이 되었다 (Jaffe R 등, 2007).
이들 관심사는 바람직하지 않은 염증 반응을 유도하고 결국 재-내피화 혈관벽을 유도하지 않으면서, 수술 후에 혈관 손상을 제어하고 조절하도록 설계되어야 하는 이상적 스텐트의 아이디어를 제공하였다.
본원에 구현되고 넓게 기술된 바와 같이, 본 발명의 목적에 따라, 본 발명은 천연 내피 모방 나노매트릭스를 생성시키는 데에 사용하기 위한 펩티드 양쪽성물질에 관한 것이다. 기술된 천연 내피 모방 나노매트릭스는 맥관 스텐트와 같은 의료 기기를 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 기술된 방법 및 조성물의 부가적 장점은 하기의 설명에서 부분적으로 열거될 것이며, 설명으로부터 부분적으로 이해될 것이거나, 기술된 방법 및 조성물의 실시에 의해 알게 될 수 있다. 기술된 방법 및 조성물의 장점은 특히 첨부된 특허청구범위에서 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다. 상기 일반적 설명 및 하기의 상세한 설명 두 모두는 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구되는 바와 같이 발명을 제한하는 것이 아님이 이해되어야 한다.
상세한 설명
기술된 방법 및 조성물은 특정 구현의 하기의 상세한 설명 및 그 안에 포함된 실시예 및 도면 및 이들의 상기 및 하기의 설명과 관련하여 더 쉽게 이해될 수 있다.
함께 사용될 수 있거나, 제조에 사용될 수 있거나, 기술된 방법 및 조성물의 생성물인 물질, 조성물 및 성분이 기술되어 있다. 이들 및 다른 물질이 본원에 기술되어 있으며, 이들 물질의 조합, 부분집합, 상호작용, 그룹 등은 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집단적 조합 및 순열이 분명하게 기술되어 있지는 않지만, 각각은 본원에서 특정하게 고려되고 논의될 수 있는 것으로 기술되어 있다. 예를 들어, 펩티드가 기술되고 논의되며, 펩티드를 포함하는 많은 분자에 대해 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의되는 경우, 펩티드 및 가능할 수 있는 변형의 각각의 그리고 모든 조합 및 순열은 특히 대조적으로 특정하게 제시되지 않는 한은 고려된다. 이와 같이, 한 부류의 분자 A, B, 및 C가 기술될 뿐만 아니라 한 부류의 분자 D, E, 및 F 및 조합 분자 A-D의 일례가 기술되는 경우, 각각이 개별적으로 열거되지는 않지만, 각각은 개별적으로 그리고 집단적으로 고려된다. 이와 같이, 상기 예에서, 조합물 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F는 각각 특정하게 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 조합 A-D의 예의 기술로부터 기술되는 것으로 여겨져야 한다. 또한, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합이 또한 특정하게 고려되고 기술된다. 이와 같이, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 부분집합이 특정하게 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 조합 A-D의 예의 기술로부터 기술되는 것으로 여겨져야 한다. 이러한 개념은 기술된 조성물을 제조하고 사용하는 방법에서의 단계를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 본 출원의 모든 면에 적용된다. 이와 같이, 수행될 수 있는 다양한 부가적 단계가 있지만, 이들 부가적 단계는 각각 기술된 방법의 임의의 특정 구현 또는 구현들의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합이 특정하게 고려되고 기술되는 것으로 여겨져야 하는 것으로 이해된다.
당업자들은 일상적 실험, 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 구현에 대한 많은 등가물만을 사용하는 것을 인지할 것이거나 인식할 수 있다. 이러한 등가물은 하기의 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
기술된 방법 및 조성물은 이들이 변할 수 있는 바와 같이 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지는 않는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 구현을 기술하는 것이 목적이며, 단지 첨부된 특허청구범위에 의해 제한될 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
본원에 언급된 모든 공보는 공보가 인용되는 것과 관련하여 방법 및/또는 물질을 설명하고 기술하는 것과 관련하여 본원에 인용되었다. 본원에 기술된 공보는 단지 본 출원의 출원일 전의 이들의 설명을 위해 제공된다. 어느 것도 본 발명이 종래의 발명에 비추어 이러한 공보보다 선행될 자격이 없다는 입장으로서 구성되지 않아야 한다. 추가로, 본원에 제공되는 공고일은 독립적 확인을 필요로 할 수 있는 실제 공고일과는 상이할 수 있다. 관련문헌의 논의는 이들의 저자가 주장하는 것을 규정하며, 출원이은 인용된 문헌의 정확성 및 타당성을 시험하기 위한 권리를 유보하다.
A. 정의
본 발명은 하기의 발명의 상세한 설명 및 그 안에 포함된 실시예와 관련하여 더 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명의 화합물, 조성물, 물품, 시스템, 기기 및/또는 방법이 설명되고 기술되기 전에, 이들은 다른 식으로 규정되지 않는 한은 특정 합성 방법, 또는 물론 변할 수 있는 바와 같이 다른 식으로 규정되지 않는 한은 특정 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 단지 특정 면을 기술하기 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가물인 방법 및 물질은 본 발명의 실시 및 시험에 사용될 수 있지만, 방법 및 물질의 예가 기술된다.
본원 및 첨부된 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 부정관사 및 정관사는 문맥이 명백히 다른 식으로 나타내지 않는 한은 복수를 포함함이 유의되어야 한다. 이와 같이, 예를 들어, "펩티드"에 대한 언급은 복수의 이러한 펩티드를 포함하며, "펩티드" 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 펩티드 및 이의 등가물에 대한 언급이다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 후속적으로 기술되는 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 존재하거나 그렇지 않을 수 있으며, 그 설명은 사건, 상황 또는 물질이 발생하거나 존재하는 경우 또는 이것이 발생하지 않거나 존재하지 않을 수 있는 경우를 포함한다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값 및/또는 "약" 또 다른 특정 값으로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되는 경우, 또 다른 구현은 하나의 특정 값 및/또는 나머지 특정 값을 포함한다. 유사하게, 값이 선행사 "약"에 의해 대략적 값으로서 표현되는 경우, 특정 값이 또 다른 구현을 형성함이 이해될 것이다. 추가로, 각각의 범위의 종말점이 하나의 종말점과 관련하여 그리고 나머지 종말적과 무관하게 현저함이 이해될 것이다. 또한, 본원에 기술된 많은 값이 있고, 또한 각각의 값이 값 자체 이외에 특정 값인 "약"으로서 기술됨이 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 기술되는 경우, "약 10"이 또한 기술된다. 또한, 값이 값 "이하"로 기술되는 경우, 당업자에 의해 적절하게 이해되는 바와 같이 "값 이상" 및 값들 사이의 가능한 범위가 또한 기술됨이 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 기술되는 경우, "10 이하" 및 "10 이상"이 또한 기술된다. 또한, 본 출원 전체에 걸쳐, 데이터는 많은 상이한 포맷으로 제공되며, 상기 데이터는 종말점 및 출발점 및 데이터 포인트의 임의의 조합에 대한 범위를 나타냄이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 "10" 및 특정 데이터 포인트 "15"가 기술되는 경우, 10 및 15 초과, 이상, 미만, 이하 및 동등한 값이 10과 15 사이에서 기술되는 것으로 고려된다. 또한, 2개이 특정 단위 사이의 하나의 단위가 기술될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 10 및 15가 사용되는 경우, 11, 12, 13 및 14가 또한 기술된다.
본 명세서의 설명 및 특허청구범위 전체에 걸쳐, 용어 "포함하다"는 "포함하지만 제한되지는 않는다"를 의미하며, 예를 들어, 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 제외하는 것으로 의도되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 질병, 병리학적 질환 또는 장애를 치유, 완화, 안정화 또는 예방하기 위한 의도로 환자의 의료적 관리를 의미한다. 상기 용어는 적극 요법 치료, 즉 특정하게 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 개선을 위한 치료를 포함하고, 또한 원인 요법, 즉 관련된 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 원인을 제거하기 위한 치료를 포함한다. 그 외에, 상기 용어는 대기요법, 즉 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 치유보다는 증상의 완화를 위해 설계된 치료; 예방 요법, 즉 관련된 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 발달을 최소화시키거나, 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위한 치료; 및 지지 요법, 즉 관련된 질병, 병리학적 질환 또는 장애의 개선을 위한 또 다른 특이적 치료를 보충하기 위해 사용되는 치료를 포함한다. 추가로, 치료는 질병 또는 질환의 완전한 제거를 결과하지만, 장애 또는 질환이 관찰되지 않는 대상체의 비처리 상태를 초과하는 개선이 관찰될 정도로 질병 또는 질환 및 이들의 증상의 존재의 임의의 감소를 의미할 수 있다. 따라서, 치료는 질병 또는 질환의 임의의 증상 또는 근본 원인의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 개선을 의미한다. 예를 들어, 상기 조성물 또는 기기의 투여 전의 폐색의 양에 비해 아르티오 플라크에서 10% 감소를 결과하는 조성물 또는 기기가 요법이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다" 또는 "예방하는"은 특히 진전 작용에 의해 무언가가 발생하는 것을 막거나, 방지하거나, 중단시키거나 방해하는 것을 의미한다. 감소, 억제 또는 예방이 본원에 사용되는 경우, 다른 식으로 특정하에 제시하지 않는 한은, 나머지 2개의 용어의 사용이 또한 명백하게 기술됨이 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "투여하는" 및 "투여"는 약제 제조물을 대상체에게 제공하는 임의의 방법을 의미한다. 이러한 방법 당업자들에게 널리 공지되어 있으며,경구 투여, 경피 투여, 흡입에 의한 투여, 국소 투여, 질내 투여, 안내 투여, 귓속 투여, 대뇌내 투여, 직장 투여, 및 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근내 투여 및 피하 투여와 같은 주사를 포함하는 비경구 투여를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 투여는 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 다양한 면에서, 제조물은 치료적으로 투여될 수 있으며; 즉, 존재하는 질병 또는 질환을 치료하기 위해 투여된다. 추가의 다양한 면에서, 제조물은 예방적으로 투여될 수 있으며; 즉, 질병 또는 질환의 예방을 위해 투여된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 투여의 표적을 의미한다. 본원에 기술된 방법의 대상체는 포유류, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류와 같은 척추동물일 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 방법의 대상체는 사람, 비-사람 영장류, 말, 돼지, 토끼, 개, 양, 염소, 소, 고양이, 기니아 피그 또는 설치류일 수 있다. 이와 같이, 암수에 관계 없이 어른 및 신생 대상체 및 태아가 포함되는 것으로 의도된다. 환자는 질병 또는 장애가 있는 대상체를 의미한다. 용어 "환자"는 사람 및 가축 대상체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 바람직한 결과를 달성하고 바람직하지 않은 증상에 대한 효과를 갖지만, 일반적으로 부작용을 유발시키기에는 불충분한 양을 의미한다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 유효 투여량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 심각도; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적 건강 상태, 성별 및 다이어트; 투여 시간; 투여 경로; 사용되는 특정 화합물의 분비 속도; 치료 지속 기간; 사용되는 특정 화합물과 조합 또는 일치하여 사용되는 약물 및 의료 분야에 널리 공지된 요인을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다. 예를 들어, 바람직한 효과를 달성하기 위해 필요한 수준보다 낮은 수준에서 화합물의 투여를 시작하고, 바람직한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당분야의 기술 내에서 널리 공지되어 있다. 바람직한 경우, 유효 매일 투여량은 투여를 위해 다중 투여량으로 분할될 수 있다. 결론적으로, 단일 투여량 조성물은 매일 투여량을 만들기 위해 이러한 양 또는 이의 약수를 함유할 수 있다. 투여량은 임의의 사용 금지 사유의 경우에 개별적 의사에 의해 조절될 수 있다. 투여량은 변할 수 있으며, 1일 내지 수일 동안 매일 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 안내는 주어진 부류의 약제 생성물에 대한 적절한 투여량에 대해 관련 문헌에서 발견할 수 있다. 추가 면에서, 제조물은 "진단적 유효량"; 즉, 질병 또는 질환의 진단을 위해 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 추가 면에서, 제조물은 "치료적 유효량"; 즉, 질병 또는 질환의 치료를 위해 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 추가 면에서, 제조물은 "예방적 유효량", 즉, 질병 또는 질환의 예방을 위해 효과적인 양으로 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용될 수 있는 담체"는 무균 수성 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 및 사용 직전에 살균 주사 용액 또는 분산액 내로의 재구성을 위한 무균 분말을 의미한다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 히석제, 용매 또는 용제의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카르복시메틸셀룰로오스 및 적합한 이들의 혼합물, 식물유 (예를 들어 올리브유) 및 에틸 올레에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 바람직한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항박테리아제 및 항균제의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한, 당, 염화나트륨 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사용 약제 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 제제의 포함에 의해 유발될 수 있다. 주사용 데포 형태는 폴리락티드-폴리글리콜라이드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)과 같은 생분해성 중합체 중의 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 생성시킴으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 의존하여, 약물 방출의 속도가 조절될 수 있다. 데포 주사용 제형은 또한 체조직과 양립할 수 있는 리포좀 또는 마이크로에멀션 중에 약물을 포착함으로써 제조된다. 주사용 제형은 예를 들어 박테리아 보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 직전에 무균수 또는 다른 무균 주사용 배지 중에 용해되거나 분산될 수 있는 무균 고체 조성물의 형태로 살균제를 혼입시킴으로써 살균될 수 있다. 적합한 불활성 담체는 락토오스와 같은 당을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 95 중량% 이상의 활성 성분의 입자는 0.01 내지 10 ㎛의 효과적인 입자 크기를 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 활성제" 또는 "생물활성제"는 이것이 적용되는 생물계에서 국소적 또는 전신적 생물학적, 생리학적 또는 치료적 효과를 제공할 수 있는 제제를 의미한다. 예를 들어, 생물활성제는 다른 기능 중에서 감염 또는 염증을 조절하고, 세포 성장 및 조직 재생을 향상시키고, 종양 성장을 조절하고, 진통제로서 작용하고, 항-세포 부착을 조장하고, 골 성장을 향상시키도록 작용할 수 있다. 다른 적합한 생물활성제는 항바이러스제, 호르몬, 항체 또는 치료 단백질을 포함할 수 있다. 다른 생물활성제는 투여될 때에 생물학적으로 활성이 아니지만, 대상체에게 투여시에 대사 또는 일부 다른 메카니즘을 통해 생물활성제로 전환되는 제제인 프로드러그를 포함한다. 부가적으로, 임의의 본 발명의 조성물은 2가지 이상의 생물활성제의 조합물을 함유할 수 있다. 생물학적 활성제는 다양한 대상체, 예를 들어 사람 (즉, 의학적 투여) 또는 동물 (즉, 수의학적 투여)에 대한 투여와 관련하여 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 활성제"는 "약물" 또는 "백신"을 포함하며, 진단적, 치료적, 방부적 의학적 또는 수의학적 용도로 유기체에 투여되는 분자, 분자군, 착물 또는 성분을 의미한다. 상기 용어는 임상적 및 수의학적 검사, 방지, 예방, 치유, 건간, 검출, 이미지화, 진단, 치료, 수술, 모니터링, 미용, 보철, 법의학 등에 유용한 제조물을 포함하는 외부적 및 내부적으로 투여되는 국소적, 국부적 및 전신적 사람 및 동물 약제, 치료제, 치유제, 약효식품, 미용제, 생물학적 제제, 기기, 진단제 및 피임제를 포함한다. 상기 용어는 또한 세포 수용체, 막 수용체, 호르몬 수용체, 치료제 수용체, 미생물, 바이러스 또는 식물, 동물 및/또는 사람을 포함하거나 이들에 접촉할 수 있는 선택된 표적을 인식할 수 있는 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열을 포함하는 농업제약, 작업장, 군대, 산업 및 환경적 치료제 또는 치유제와 관련하여 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한 특히 생물활성 효과를 생성시키는 핵산, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)를 포함하는 핵산 및 화합물을 포함한다. 약제학적 활성제는 본원에 기술된 범주 및 특정 예를 포함한다. 범주는 특정 예에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 당업자들은 또한 상기 범주 내에 있고 본 발명에 따라 유용한 많은 다른 화합물을 인지할 것이다. 예는 방사선증감제, 방사선증감제와 화학치료제의 조합물, 스테로이드, 크산틴, 베타-2-작용물질 기관지 확장제, 항염증제, 진통제, 칼슘 길항물질, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 베타-차단제, 중추 활성 알파-작용물질, 알파-1-길항물질, 항콜린제/진경제, 바소프레신 유사체, 항부정맥약, 항파킨슨병약, 항협심증제/항고혈압제, 항응고제, 항혈소판제, 진정제, 불안완화제, 펩티드성 제제, 생체 중합체 제제, 항종양제, 완하제, 지사제, 항미생물제, 항균제, 백신, 단백질 또는 핵산을 포함한다. 추가 면에서, 약제학적 활성제는 쿠마린; 알부민; 브로로몰리딘; 베타메타손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프레드이솔론, 프레드니손, 트리암시놀론, 부데소니드, 히드로코르티손 및 약제학적으로 허용될 수 있는 히드로코르티손 유도체와 같은 스테로이드; 테오필린 및 독소필린과 같은 크산틴; 살부타몰, 펜테롤, 엘렌부테롤, 밤부테롤, 살메테롤, 페노테롤과 같은 베타-2-작용물질 기관지 확장제; 항천식성 항염증제, 항관절염성 항염증제 및 비-스테로이드성 항염증제를 포함하는 항염증제 (이들의 예는 황화물, 메살라민, 부데소니드, 살라조피린, 디클로페낙, 약제학적으로 허용될 수 있는 디클로페낙 염, 니메술리드, 나프록센, 아세토미노펜, 이부프로펜, 케토프로펜 및 피록시캄을 포함함); 살리실레이트와 같은 진통제; 니페디핀, 암로디핀 및 니카르디핀과 같은 칼슘 채널 차단제; 카프토프릴, 베나제프릴 하이드로클로라이드, 포시노프릴 나트륨, 트란토랄프릴, 라미프릴, 리시노프릴, 에날라프릴, 퀴나프릴 하이드로클로라이드 및 모엑시프릴 하이드로클로라이드와 같은 안지오텐신-전환 효소 억제제; 소탈롤 하이드로클로라이드, 티몰롤 말레에이트, 에스몰롤 하이드로클로라이드, 카프테올롤, 프로파놀롤 하이드로클로라이드, 베타크솔롤 하이드로클로라이드, 펜부톨롤 설페이트, 메토프롤롤 타르트레이트, 메토프롤롤 숙시네이트, 아세부톨롤 하이드로클로라이드, 아테놀롤, 핀돌롤 및 비소프롤롤 푸마레이트와 같은 베타-차단제 (즉, 베타 아드레날린성 차단제); 클로니딘과 같은 중추 활성 알파-2-작용물질; 독사조신 및 프라조신과 같은 알파-1-길항물질; 디시클로민 하이드로클로라이드, 스코폴라민 하이드로브로마이드, 글리코피롤레이트, 클리디늄 브로마이드, 플라복세디트 및 옥시부티닌과 같은 항콜린제/진경제; 바소프레신 및 데스모프레신과 같은 바소프레신 유사체; 퀴니딘, 리도카인, 토카니드 하이드로클로라이드, 멕실레틴 하이드로클로라이드, 디곡신, 베라파밀 하이드로클로라이드, 프로파페논 하이드로클로라이드, 플레카이니드 아세테이트, 프로카이나미드 하이드로클로라이드, 모리시진 하이드로클로라이드 및 디소피라미드 포스페이트와 같은 항부정맥약; 도파민, L-도파/카르비도파, 셀레길린, 디히드로에르고크립틴, 페르골리드, 리수리드, 아포모르핀 및 브로모크립틴과 같은 항파킨슨병약; 이소소르비드 모노니트레이트, 이소소르비드 디니트레이트, 프로파놀롤, 아테놀롤 및 베라파밀과 같은 항협심증제 및 항고혈압제; 쿠마딘, 와르파린, 아세틸살리실산 및 티클로피딘과 같은 항응고제 및 항혈소판제; 벤조디아제핀 및 바르비투레이트와 같은 진정제; 로라제팜, 브로마제팜 및 디아제팜과 같은 불안완화제; 칼시토닌, 류프롤리드 및 다른 LHRH 작용물질, 히루딘, 시클로스포린, 인슐린, 소마토스타틴, 프로티렐린, 인터페론, 데스모프레신, 소마토트로핀, 티모펜틴, 피도티모드, 에리트로포이에틴, 인터류킨, 멜라토닌, 과립구/매크로파지-CSF 및 헤파린과 같은 펩티드성 및 생체 중합체 제제; 엑토포시드, 엑토포시드 포스페이트, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 독소루비신, 시스플라틴, 히드록시우레아, 류코보린 칼슘, 타목시펜, 플루타미드, 아스파라기나아제, 알트레타민, 미토탄 및 프로카르바진과 같은 항종양제; 센나 농축물, 카산트라놀, 비사코딜 및 나트륨 피코설페이트와 같은 완하제; 디페녹신 하이드로클로라이드, 로페라미드 하이드로클로라이드, 푸라졸리돈, 디페녹실레이트 하이드로클로라이드 및 미생물과 같은 지사제; 박테리아성 및 바이러스성 백신과 같은 백신; 페니실린, 세팔로스포린 및 매크롤리드와 같은 항미생물제; 이미다졸 및 트리아졸 유도체와 같은 항균제; 및 생물학적 단백질을 코드화하는 DNA 서열 및 안티센스 올리고누클레오티드와 같은 핵산일 수 있다. 약제학적 활성제는 다양한 대상체, 예를 들어, 사람 (즉, 의학적 투여) 또는 동물 (즉, 수의학적 투여)에 대한 투여와 연관하여 사용될 수 있음이 이해된다.
명세서 및 종결 특허청구범위에 사용되는 바와 같은 화학종의 잔기는 잔기가 실제로 화학종으로부터 얻어짐에도 불구하고, 특정 반응 도식 또는 후속 제형 또는 화학 생성물에서 화학종의 합성 생성물인 잔기를 의미한다. 이와 같이, 폴리에스테르 중의 에틸렌 글리콜 잔기는 에틸렌 글리콜이 폴리에스테르을 제조하기 위해 사용됨에도 불구하고, 폴리에스테르 중의 하나 이상의 -OCH2CH2O- 단위를 의미한다. 유사하게, 폴리에스테르 중의 세바스산 잔기는 잔기가 세바스산 또는 이의 에스테르를 반응시켜서 폴리에스테르를 수득함으로써 얻어짐에도 불구하고, 폴리에스테르 중의 하나 이상의 -CO(CH2)8CO- 잔기를 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용되는 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 면에서, 허용되는 치환기는 유기 화합물의 비고리 및 고리, 측쇄 및 비측쇄, 탄소고리 및 헤테로고리 및 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 예시적 유기 화합물은 예를 들어, 하기에 기술되는 것을 포함한다. 허용되는 치환기는 하나 이상일 수 있으며, 적절한 유기 화합물에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 본 설명을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기술되는 유기 화합물의 수소 치환기 및/또는 임의의 허용되는 치환기를 가질 수 있다. 본 설명은 유기 화합물의 허용되는 치환기에 의해 임의의 방식으로 제하되도록 의도되지 않는다. 또한, 용어 "치환" 또는 "으로 치환된"은 이러한 치환이 치환된 원자 및 치환기의 허용되는 원자가에 따르며, 치환은 안정한 화합물, 예를 들어 배열, 고리화, 제거 등에 의해서와 같이 변형을 자발적으로 일으키지 않는 화합물을 생성시킨다.
다양한 용어를 규정하는 데에 있어서, "A1", "A2", "A3" 및 "A4"는 다양한 특정 치환기를 나타내기 위해 포괄적 기호로서 본원에 사용된다. 이들 기호는 본원에 기술되는 것으로 제한되지 않는 임의의 치환기일 수 있으며, 이들의 하나의 경우에 특정 치환기로서 규정되는 경우에, 이들은 또 다른 경우에 일부 다른 치환기로서 규정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같으 용어 "알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, E실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등과 같은 1 내지 24개의 탄소 원자의 측쇄 또는 비측쇄 포화 탄화수소기이다. 알킬기는 또한 치환되거나 비치환될 수 있다. 알킬기는 본원에 기술되는 바와 같이 선택적으로 치환된 알킬, 시클로알킬, 알콕시, 아미노, 에테르, 할라이드, 히드록시, 니트로, 실릴, 술포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. "저급 알킬"기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기이다.
명세서 전체에 걸쳐, "알킬"은 일반적으로 비치환된 알킬기 및 치환된 알킬기 둘 모두를 언급하기 위해 사용되지만; 그러나, 치환된 알킬기는 또한 특히 알킬기 상의 특정 치환기(들)를 확인함으로써 본원에 언급된다. 예를 들어, 용어 "할로겐화된 알킬"은 특히 하나 이상의 할라이드, 예를 들어, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드로 치환된 알킬기를 의미한다. 용어 "알콕시알킬"은 특히 하기에 기술되는 바와 같이 하나 이상의 알콕시기로 치환된 알킬기를 의미한다. 용어 "알킬아미노"는 특히 하기에 기술되는 바와 같이 하나 이상의 아미노기 등으로 치환된 알킬기를 의미한다. "알킬"이 하나의 경우에 사용되고 "알킬알코올"과 같은 특정 용어가 또 다른 경우에 사용되는 경우, 이는 용어 "알킬"이 "알킬알코올" 등과 같은 특정 용어를 또한 의미하지 않는다는 것을 암시하는 것을 의미하지 않는다.
상기 실시는 또한 본원에 기술된 다른 기를 위해 사용된다. 즉, "시클로알킬"과 같은 용어는 비치환 및 치환 시클로알킬 잔기 둘 모두를 의미하는 반면, 그 외에, 치환된 잔기가 특히 본원에서 확인될 수 있으며; 예를 들어, 특정 치환 시클로알킬는 예를 들어, "알킬시클로알킬"로서 언급될 수 있다. 유사하게, 치환된 알콕시는 특히 예를 들어, "할로겐화된 알콕시"로서 언급될 수 있으며, 특정 치환된 알케닐은 예를 들어, "알케닐알코올"일 수 있다. 다시, "시클로알킬"과 같은 포괄적 용어 및 "알킬시클로알킬"과 같은 특정 용어를 사용하는 관례는 포괄적 용어가 또한 특정 용어를 포함하지 않음을 암시하는 것을 의미하지 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "폴리알킬렌기"는 서로 결합된 2개 이상의 CH2 기를 갖는 기이다. 폴리알킬렌기는 식 -CH2)a-에 의해 표현될 수 있으며, 여기에서 a는 2 내지 500의 정수이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "알콕시" 및 "알콕실"은 에테르 결합을 통해 결합된 알킬 또는 시클로알킬기를 의미하며; 즉 "알콕시"기는 OA1으로서 규정될 수 있으며, 여기에서 A1은 상기 규정된 바와 같은 알킬 또는 시클로알킬이다. "알콕시"는 또한 상기 기술된 알콕시기의 중합체를 포함하며; 즉, 알콕시는 -OA1-, -OA2- 또는 -OA1-OA2)a-OA3와 같은 폴리에테르일 수 있으며, 여기에서 "a"는 1 내지 200의 정수이고, A1, A2 및 A3는 알킬 및/또는 시클로알킬기이다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 구조 식을 갖는 2 내지 24개의 탄소 원자의 탄화수소기이다. (A1A2)C=C(A3A4)와 같은 비대칭 구조는 E 및 Z 이성질체 둘 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 이는 비대칭 알켄이 존재하거나 결합 기호 C=C에 의해 명백하게 나타낼 수 있는, 본원이 구조 식으로 여겨질 수 있다. 알케닐기는 본원에 기술되는 바와 같은 선택적으로 치환된 알킬, 시클로알킬, 알콕시, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할라이드, 히드록시, 케톤, 아지드, 니트로, 실릴, 술포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 용어 "알키닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 구조 식을 갖는 2 내지 24개의 탄소 원자의 탄화수소기이다. 알키닐기는 비치환되거나, 본원에 기술된 바와 같은 선택적으로 치환된 알킬, 시클로알킬, 알콕시, 알케닐, 시클로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알데히드, 아미노, 카르복실산, 에스테르, 에테르, 할라이드, 히드록시, 케톤, 아지드, 니트로, 실릴, 술포-옥소 또는 티올을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드 양쪽성물질"은 친수성 부분 (예를 들어, 친수성 펩티드 서열 잔기) 및 소수성 부분 (예를 들어, 탄화수소 잔기) 둘 모두를 제공하는 펩티드 화합물을 의미한다. 대표적으로 펩티드 양쪽성물질과 관련된 하나의 특성은 자체-조직성이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "친수성 펩티드 서열"은 탄화수소 잔기에 비해 친수성 특성을 갖는 펩티드 잔기 서열을 의미한다. 친수성 펩티드 서열은 하나 이상의 작용성 펩티드 서열 (예를 들어, 분해성 펩티드 서열, 산화질소 공여체, 및/또는 세포 부착성 리간드)를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "분해 서열"은 생물학적 조건 하에 효소 또는 가수분해에 의해 분해될 수 있는 펩티드 잔기의 서열을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 부착성 서열"은 세포에 대한 부착성 리간드로서 작용할 수 있는 펩티드 잔기의 서열을 의미한다. 하나의 면에서, 펩티드 양쪽성물질의 양쪽성 특징으로 인해, 기술된 세포 부착성 서열은 나노섬유 조직체의 외부 표면에서 노출되며; 이와 같이, 이러한 세포 부착성 서열은 하나 이상의 세포와의 상호작용을 위해 이용될 수 있다. 하나의 예는 내피 세포 부착, 퍼짐, 이동, 및/또는 성장을 지지하는 펩티드 서열을 의미하는 "내피 세포 부착성 서열"이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "산화질소 생성 공여체 서열"은 착물 (예를 들어, 디아조늄디올레이트)로서 펩티드 잔기 (예를 들어, 리신 (K) 또는 시스테인 (C)) 또는 펩티드 잔기의 서열 (예를 들어, 산화질소 기체를 가역적으로 결합시킬 수 있는 폴리리신 (KKKKK) 또는 폴리시스테인 (CCCCC) 또는 이의 등가물)을 의미한다. 펩티드 또는 서열은 산화질소 기체에 대한 수용체로서 작용할 수 있으며, 시간 경과에 따라 산화질소를 선택적으로 방출시킬 수 있다. 용어는 다른 산화질소 공여체, 예를 들어 시스틴 또는 아민기를 함유하는 임의의 펩티드 서열을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "자체-조직"은 장애된 시스템이 외부 방향 없이 분자 자체 중에서 특정 국부 상호작용의 결과로서 더 유기화된 구조 또는 패턴을 생성시키는, 화합물의 복수의 분자의 특징을 의미한다. 하나의 면에서, 펩티드 양쪽성물질은 자체-조직될 수 있다. 추가 면에서, 화합물의 복수의 분자는 나노섬유 내로 자체-조직될 수 있다. 추가 면에서, 펩티드 양쪽성물질은 나노섬유 내로 자체-조직될 수 있다. 또 다른 추가 면에서, 펩티드 양쪽성물질은 교차결합에 대한 필요성 없이 나노섬유 내로 자체-조직될 수 있다.
B. 조성물
인공 이식체의 생물학적 양립성은 천연 시스템을 모방함으로써 개선될 수 있다. 결론적으로, 이상적 스텐트는 천연 내피와 유사한 특성을 가져야 한다. 이와 같이, 천연 내피 모방 나노매트릭스가 본원에 기술되어 있다.
천연 내피는 점탄성 세포외 매트릭스 (ECM)에 삽입된 내피 세포로 구성된다. 구조적 일체성을 제공하는 것 이외에, ECM은 또한 세포 증식, 분화 및 이동을 위해 중요한 역학적, 작용성 환경을 제공한다 (Ross JM. 1998). 상기 개념은 세포 작용을 조절하기 위해 생체모방 스캐폴드에 대한 ECM 유도된 세포 부착성 리간드의 사용에 영향을 주었다. 분해 속도가 생체외에서 ECM 생성 및 조직 생성에 영향을 주기 때문에, 스캐폴드의 분해 반응속도를 조절하는 것이 또 다른 중요한 요인이다 (Alsberg E 등, 2003; Bryant SJ 등, 2002). 세포 이동 및 증식은 많은 상이한 세포 유형에 대한 세포 부착에 의존한다 (Ross JM. 1998). 천연 ECM은 많은 자체-조직화 나노구조 미소섬유 단백질로 구성된다. 내피는 또한 산화질소 (NO)와 같은 가용성 인자를 방출시킴으로써 혈관의 비-혈전성 환경을 유지하는 역할을 한다. 따라서, 천연 내피 모방 나노매트릭스는 내피 ECM의 상기 화학 및 생물학적 복잡성을 모방하도록 설계될 수 있다 : 1) 강한 내피 세포 보유 및 이동을 조장하기 위한 내피 세포 부착성 잔기, 2) 강한 내피화를 위해 나노매트릭스 내로의 내피 세포 이동을 위한 세포 매개된 분해성 자리, 3) 천연 ECM과 유사한 자체-조직화 나노섬유 구조, 및 4) 재협착 및 혈전증을 억제하는 것과 함께 위성 내피 조상 세포의 추적을 조장하기 위한 NO의 방출.
본원에 기술된 바와 같이, 천연 내피 모방 나노매트릭스는 친수성 펩티드 및 소수성 꼬리를 포함하는 펩티드 양쪽성물질로부터 생성될 수 있으며, 친수성 펩티드는 강한 내피 세포 보유 및 이동을 조장하기 위한 내피 세포 부착성 잔기, 강한 내피화를 위해 나노매트릭스 내로의 내피 세포 이동을 위한 세포 매개된 분해성 자리, 및 재협착 및 혈전증을 억제하는 것과 함께 위성 내피 조상 세포의 추적을 조장하기 위한 NO의 방출 중 하나 이상을 포함한다.
따라서, 친수성 펩티드 서열 및 소수성 꼬리를 포함하는 펩티드 양쪽성물질이 본원에 제공되며, 친수성 펩티드 서열은 분해 서열, 및 제1 세포 부착성 서열 및 산화질소 생성 공여체 서열 중 하나 이상을 포함하며, 제1 부착성 서열은 평활근 세포 및/또는 혈소판에 결합하지 않는 내피 세포 부착성 서열이다.
친수성 펩티드 서열은 하기 식을 포함할 수 있다:
DS---CA
상기 식에서, ---는 직접 또는 간접 공유 결합이며, "DS"는 분해 서열이고; "CA"는 내피 세포 부착성 서열이다.
친수성 펩티드 서열은 하기 식을 포함할 수 있다:
DS---KK
상기 식에서, ---는 직접 또는 간접 공유 결합이며, "DS"는 분해 서열이고; "KK"는 산화질소 생성 공여체 서열이다.
친수성 펩티드 서열은 하기 식을 포함할 수 있다:
DS---CA---KK
상기 식에서, ---는 직접 또는 간접 공유 결합이며, "DS"는 분해 서열이고; "CA"는 내피 세포 부착성 서열이며; "KK"는 산화질소 생성 공여체 서열이다.
친수성 펩티드 서열은 하기 식을 포함할 수 있다:
DS---KK---CA
상기 식에서, ---는 직접 또는 간접 공유 결합이며, "DS"는 분해 서열이고; "CA"는 내피 세포 부착성 서열이며; "KK"는 산화질소 생성 공여체 서열이다.
본원에 기술된 바와 같이, 펩티드 양쪽성물질은 나노매트릭스를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 본원의 나노매트릭스는 양쪽성물질 코팅 나노섬유를 포함할 수 있음이 이해되고 고려된다. 본원에 기술된 바와 같이, 나노섬유는 예를 들어, 폴리카프로락톤 섬유와 같은 폴리에스테르 섬유를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질로 코팅된 폴리카프로락톤 나노섬유가 본원에 기술되어 있다.
또한, 각각 독립적으로 친수성 펩티드 서열 및 소수성 꼬리를 포함하는 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질을 포함하는 조성물이 본원에 기술되어 있으며, 여기에서 제1 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열은 분해 서열 및 내피 세포 부착성 서열을 포함하고, 제2 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열은 분해 서열 및 산화질소 생성 공여체 서열을 포함한다.
따라서, 제1 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열은 식 DS---CA를 포함할 수 있고, 제2 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열은 식 DS---KK를 포함할 수 있으며, 여기에서 각각의 ---는 독립적으로 직접 또는 간접 공유 결합이고, "DS"는 분해 서열이고; "CA"는 내피 세포 부착성 서열이며, "KK"는 산화질소 생성 공여체 서열이다.
제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질은 기술된 조성물 중에 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20을 포함하는 약 1:20 내지 약 20:1의 비로 존재할 수 있다. 이와 같이, 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질은 약 1:9 내지 약 9:1의 비로 조성물 중에 존재할 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 추가로 분해 서열을 포함하지만 내피 세포 부착성 서열 또는 산화질소 생성 공여체 서열은 포함하지 않는 하나 이상의 부가적 펩티드 양쪽성물질을 포함한다. 이들 하나 이상의 부가적 펩티드 양쪽성물질은 부가적 작용성 잔기를 포함할 수 있다. 이들 하나 이상의 부가적 펩티드 양쪽성물질은 비-작용성 서열을 포함할 수 있다. 당업자는 이들 부가적 펩티드 양쪽성물질을 사용하여 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질을 조절할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질은 약 9:1의 비로 조성물 중에 존재하며, 예를 들어 약 9:1:0.1, 9:1:0.2, 9:1:0.3, 9:1:0.4, 9:1:0.5, 9:1:0.6, 9:1:0.7, 9:1:0.8, 9:1:0.9, 9:1:1, 9:1:2, 9:1:3, 9:1:4, 9:1:5, 9:1:6, 9:1:7, 9:1:8, 9:1:9, 9:1:10의 비로 제 3 펩티드 양쪽성물질을 갖는 조성물 중에 존재할 수 있다. 많은 다른 이러한 조합물 및 혼합물은 당업자에 의해 선택되며, 일반적 기술을 사용하여 최적 성능에 대해 시험될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 추가로 폴리카프로락톤 나노섬유와 같은 폴리에스테르 나노섬유를 포함할 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질로 코팅된 폴리카프로락톤 나노섬유가 본원에 기술되어 있으며, 제1 펩티드 양쪽성물질은 PA-YIGSR이고 제2 펩티드 양쪽성물질은 PA-KKKKK이며; 제1 펩티드 양쪽성물질 대 제2 펩티드 양쪽성물질의 비는 9:1이다.
1. 펩티드 양쪽성물질
펩티드 양쪽성물질 (PA)는 단일 소수성 꼬리와 콘주게이팅된 대표적으로 짧은 친수성 펩티드 서열을 갖는 양쪽성 구조이다 (Paramonov SE 등, 2006). 이들의 형태, 전하 및 환경에 의존하여, 이들 분자는 시트, 구체, 로드, 디스크 또는 채널로 자체-조직될 수 있다 (Lowik D 등, 2004). 친수성 헤드 그룹이 소수성 꼬리보다 클 정도로, 원뿔 형태를 갖는 양쪽성물질이 원통형 미셀을 생성시키는 것으로 공지되어 있다 (Jun HW 등, 2006). PA의 양쪽성 성질은 이들의 자체-조직에 대해 반응성이다. 중성 용액에서, PA의 골격 중의 음으로 하전된 아미노산은 이를 용해시키기는 데에 도움을 줄 수 있다. 자체-조직을 유도하기 위해, 음전하의 존재로 인한 반발력이 제거될 수 있다. 이는 PA 용액의 pH 및 이가 이온의 첨가를 저하시킴으로써 달성될 수 있다 (Hartgerink JD 등, 2002; Hartgerink JD 등, 2001; Jun HW 등, 2005). 자체-조직화 나노섬유 구조에서, 코어에 가장 근접한 4개의 아미노산이 수소 결합을 생성시킬 수 있다. 이들 수소 결합의 존재 또는 부재는 자체-조직화 구조의 원통형 또는 구형 배향을 규정할 수 있다 (Paramonov SE 등, 2006).
양쪽성은 세포막과 같은 천연 생물계에서 폭넓게 발견된다. 이는 복잡한 계층적 순서를 갖는 초분자 구조 내로의 생체분자의 자체-조직에 대해 반응성인 주요 구동력이다. 상기 개념은 생체모방 스캐폴드에 대한 PA의 사용을 제시한다 (Curtis A 등, 2001; Barnes CP 등, 2007). 세포 부착성 리간드 또는 생분해성 서열과 같은 다양한 생물활성 서열로 구성되는 PA는 생리학적 조건 하에 자체-조직화되어 천연 생체분자와 유사한 초분자 구조를 생성시킬 수 있다. 최근에, 이들은 혈관의 성장 (Malkar NB 등, 2003; Hosseinkhani H 등, 2006; Rajangam K 등, 2006) 및 골조직 재생 (Hosseinkhani H 등, 2007; Hosseinkhani H 등, 2006; Sargeant TD 등, 2008)을 포함하는 다양한 생물의학 분야에 대해 확대 연구되었다.
PA는 이들의 골격 중의 상이한 세포 부착 및 분해 잔기의 혼입의 용이함으로 인해 생체모방 스캐폴드에 대한 바람직한 템플레이트이다 (Jun HW 등, 2006; Jun HW 등, 2005).
본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질은 일부 면에서 나노매트릭스로 자체-조직화될 수 있는 임의의 변형된 펩티드일 수 있다. 일부 면에서, 기술된 펩티드 양쪽성물질은 친수성 펩티드 및 소수성 꼬리를 포함한다. 친수성 펩티드 및 소수성 꼬리의 길이는 펩티드 양쪽성물질이 나노매트릭스로 자체-조직화될 수 있는 능력을 유지할 정도로 선택될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 소수성 꼬리의 길이는 친수성 펩티드에서 증가된 길이에 대해 수용하도록 증가될 수 있다. 당업자는 나노매트릭스로의 자체-조직화하기 위한 선택된 친수성 펩티드 및 선택된 소수성 꼬리를 갖는 펩티드 양쪽성물질의 능력을 보호하기 위해 일반 기술을 사용할 수 있다.
2. 산화질소 (NO)
내피로부터 방출되는 NO는 재협착 캐스케이드에서 많은 주요 이벤트를 차단하는 것으로 공지되어 있다. NO는 혈관벽 항상성을 조절하는 데에 있어서 중심 역할을 한다 (Marin J 등, 1997; Kuo PC 등, 1995; Davies KM 등, 2001). 이는 효소, 산화질소 합성효소에 의해 건강한 내피 세포에서 아미노산 L-아르기닌으로부터 연속적으로 방출된다. 내피로부터 방출되는 NO는 가용성 구아닐릴 시클레아제를 자극하여, 고리형 구아노신 모노포스페이트 (GMP)의 농도를 증가시킨다 (Kuo PC 등, 1995). 내피 아래에 있는 맥관 평활근 세포 중의 고리형 GMP 수준의 증가는 근내 칼슘을 감소시키는 GMP 의존성 키나아제의 활성화를 유도하여 평활근 세포 (SMC)의 이완을 결과한다. 혈관의 갑작스런 수축에 반응하여 SMC의 국부 이완이 층형성 혈류를 유지하기 위해 중요하다 (Beckman JS. 1996). 혈관 루멘 내로 방출되는 NO는 또한 혈소판에서 고리형 GMP 수준을 증가시킨다. 이는 혈소판 활성화 및 내피의 표면에 대한 부착을 감소시켜서, 맥관벽을 비혈전성이 되게 한다. NO는 혈소판으로부터 방출되는 성장 인자의 활성을 억제함으로써 혈관 내에서 세포 환경을 조절한다 (Kuo PC 등, 1995). 이의 항혈전성 역할에 대해, NO의 혼입은 맥관 삽입물의 생물학적 특성을 개선시키는 것으로 기대된다. NO 방출 중합체는 심혈관 기기에 대한 비-혈전성 코팅으로서의 사용을 위해 폴리(비닐 클로라이드), 실리콘 고무, 폴리메타크릴레이트 및 폴리우레탄과 같은 NO 방출 중합체가 성공적으로 개발되었다 (Reynolds MM 등, 2004; Verma 등, 2005). 예를 들어, NO는 디아제늄디올레이트 (혈액에서 NO를 방출시킬 수 있는 특정 부류의 화합물)의 형태로 맥관 그라프트 내로 성공적으로 혼입되었다 (Pulfer SK 등, 1997). 토끼의 초기 연구는 채널화된 스텐트에 로딩된 NO 함유 미소구체로부터의 NO의 조절된 방출이 스텐트내 재협착을 제한함을 보여주었다 (Do Y 등, 2004). 또 다른 28 일 연구에서, 나트륨 마이크로프루사이드로부터의 스텐트-기본 산화질소 전달이 돼지 모델에서 연구되었으며, 혈관내막 증식을 감소시키는 것으로 입증되었다 (Hou D 등, 2005). 상기 언급된 작용 이 외에, NO은 또한 내피 세포 성장, 생존 및 이동을 조장하기 위한 능력이 공지되어 있다 (Ziche M 등, 1994; Kawasaki K 등, 2003). NO 또한 순환 내피 조상 세포의 회복에 의해 부분적으로 신혈관형성에서 중요한 역할을 한다 (Aicher A 등, 2003). 이러한 효과에 대해, 하이드로겔로부터의 NO의 국부 전달은 혈관 재내피화의 속도를 향상시키는 것으로 입증되었다 (Lipke EA 등, 2005).
NO의 항혈전성, 항상성 및 전-내피화 특성은 이를 스텐트 상의 치료적 약물 코팅으로서 바람직한 캔디데이트로 만든다. 그러나, 생체내에서 단지 수초의 짧은 반감기는 NO를 전신 약물로서 직접 투여를 위해 부적합하게 만든다 (Miller M 등, 2007). 또한, NO 기체는 산화를 방지하기 위해 필요한 완전 산소 배체의 필요성으로 인해 취급하기가 어렵다. 따라서, NO 담체는 방출시까지 이를 안정화시키기 위해 사용된다 (Hanson SR 등, 1995; Miller M 등, 2007). 현재, 2가지 유형의 NO 공여체 약물이 임상적으로 사용된다 : (1) 유기 질산염 및 (2) 나트륨 니트로프루사이드 (Miller M 등, 2007). 니트로글리세린이 임상적으로 사용되는 유기 질산염이다. 이는 심부전 및 만성 협심증의 치료를 위한 경피 패치에 사용된다. 니트로글리세린는 효소 매개된 방출을 일으키는 3가지 니트록시-에스테르 (아질산염) 기를 함유한다. 상기 약물에 대한 주요 제한 요인은 연장된 지속적 사용 후의 내성의 발달이다. 나트륨 니트로프루사이드는 병원내 현장에서 사용되어, 과민증 위기에서 혈압을 저하시킨다. 이는 5개의 시안화물 분자 및 NO의 하나의 분자에 배위된 철 분자를 함유한다. NO 분자 주입 동안 신속히 방출되며, 시안화물 분자는 점차적으로 유리된다. 이들 시안화물 분자는 일부 경우에 독성 수준에 도달하며, 상기 약물의 사용에 주요 제한을 제공할 수 있다 (Gori T 등, 2002).
노노에이트(NONOate)으로서 또한 공지된 디아제늄디올레이트로 불리우는 한 부류의 NO 방출 화합물이 본원에 기술되어 있다. 이들 화합물의 화학 구조는 화합물명 : 디아젠 N=N, 이움(ium): 정규 양전하, 디올레에이트: 2개의 음성 산소로부터 추론될 수 있다 (Paramonov SE 등, 2006; Saavedra J 등, 2000).
하기는 디아제늄디올레이트의 화학 구조이다:
Figure 112011042626141-pct00001
디아제늄디올레이트는 하기의 반응으로 나타낸 바와 같이 친핵성 아민 (X-)과 NO의 반응에 의해 생성될 수 있다:
X- + 2NO → X-[N(O)NO]-
다아조늄디올레이트는 하기의 반응으로 나타낸 바와 같이 양자화시에 유리되어 유리 NO를 방출시킨다:
X-[N(O)NO]- → X- + 2NO
이의 전자 수용체 특성으로 인해, NO는 친핵성 아민과 반응하여 디아조늄디올레이트를 생성시킬 수 있다. 완충액, 혈액 또는 세포 배지 중에 용해되는 경우, 디아제늄디올레이트는 양자화 및 해리를 일으켜서 NO를 방출시킨다 (Saavedra J 등, 2000; Keefer LK 등, 1996; Hrabie JA 등, 2002). 방출 반응속도는 친핵성 아민의 구조에 의해 조절될 수 있다. 디아제늄디올레이트는 공기의 부재하에 고압 하에 아민과의 직접 반응에 의해 합성될 수 있다.
다른 산화질소 방출 디아제늄디올레이트 화합물은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 수초 내지 많은 일수의 생리학적 pH에서 반감기를 갖는 질소- 및 탄소-기본 NO 공여체 착물이 이용될 수 있다.
가장 공통적인 디아제늄디올레이트는 염기성 배지 중에서 이차 아민 및 폴리아민과 산화질소의 반응에 의해 생성된다. 이들은 중성 또는 산성 완충액 중에서 2 당량의 산화질소 및 출발 아민을 재생시킬 수 있는 안정한 고체이다. NO 생성의 반감기는 아민에 의존하여 수초로부터 많은 시간으로 변한다. NO로의 분해는 일정한 pH에서 자발적인 일차 반응이다. 비유도 디아제늄디올레이트의 일례는 다음과 같다:
Figure 112011042626141-pct00002
i. O 유도된 디아제늄디올레이트
디아제늄디올레이트 음이온은 친전자성 물질과 반응하여 안정한 공유 화합물을 생성시킨다. 이들 화합물은 프로드러그로서 작용할 능력을 가져서, 단지 대사적으로 디아제늄디올레이트 음이온으로 전환되는 경우에만 산화질소를 방출시킨다. 상기 부류의 수가지 화합물은 알킬 또는 아릴 할라이드, 황산염 에스테르, 에폭시드 등과 이온성 디아제늄디올레이트의 반응에 의해 합성되었다. O 유도된 디아제늄디올레이트는 하기와 같다:
Figure 112011042626141-pct00003
ii. C계 디아제늄디올레이트
탄소에 결합된 디아제늄디올레이트기를 함유하는 화합물은 이들이 많은 X-선 구조 결정 함유에 의해 입증되는 바와 같이 결합의 정확한 설명은 아니지만, "이소니트라민" 및 "니트로소히드록실아민"과 같은 명칭 하에 100 년 넘게 공지되었다. 탄소에 대한 부착이 명백하게 새로운 NO 공여체의 설계에 대한 유연성의 큰 장점을 제공하지만, 이들 물질이 모두 자발적으로 NO를 생성시키는 것이 아님이 인지되어야 한다. 이들 화합물의 반응성의 범위는 NO가 생성되지 않을 (드뭄) 정도로 안정한 물질로부터 활발히 (드뭄) 분해되는 물질로 충분한 규모를 제공한다. 많은 것은 또한 순수 NO보다는 오히려 NO와 N2O의 혼합물을 생성시킨다. C-기본 디아제늄디올레이트의 예는 하기와 같다:
Figure 112011042626141-pct00004
Figure 112011042626141-pct00005
iii. 중합체계 디아제늄디올레이트
NO 방출의 시간을 조절하고, 또한 본체의 선택된 자리에 대한 NO 노출을 제한하기 위해, 디아제늄디올레이트 작용성 기는 중합체 매트릭스 내로 혼입될 수 있다. NO 방출 중합체는 막, 미소구체 및 겔로부터 분말 및 성형성 수지까지 다양하다. 중합체 디아제늄디올레이트는 동맥내 기기에서 혈전 저항성을 개선시키는 것으로 입증되었으며, 심혈관 연구에서 중요한 수단으로서 역할을 할 수 있다. 중합체-기본 디아제늄디올레이트의 예는 하기와 같다:
Figure 112011042626141-pct00006
iv. 리신
바람직하게는, 친핵성 아민 아미노산 (천연 또는 인공)의 곁사슬 (R 기) 상에 위치한다. 예를 들어, 친핵성 아민은 리신의 곁사슬 (R 기) 상에 위치할 수 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, 리신은 NO 결합에 대한 2개의 펜던트 아민기를 갖는다.
Figure 112011042626141-pct00007
리신계 중합체로부터의 NO의 조절된 방출은 재협착의 주 원인인 혈소판 부착 및 평활근 세포 증식을 감소시키는 것으로 입증되었다 (Jun H 등, 2005; Bohl K 등, 2000; Jun HW 등, 2005). 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드 [K[N(O)NO-]]n을 생성시키는 펜던트 아민기를 가질 수 있다.
따라서, 산화질소 생성 공여체 서열은 하나 이상의 디아제늄디올레이트-변형 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 산화질소 생성 공여체 서열은 디아제늄디올레이트-변형된 아미노 펩티드 [K[N(O)NO-]]n을 포함할 수 있으며, 여기에서 n은 1 내지 20이다. 일부 면에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다. 이와 같이, 산화질소 생성 공여체 서열은 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드 [K[N(O)NO-]]5를 포함할 수 있다.
산화질소 생성 공여체 서열은 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함하는 하나 이상의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 산화질소 생성 공여체 서열은 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:3)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기 중 하나 이상은 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다.
산화질소 생성 공여체 서열은 NO와 반응하여 변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 티올기를 포함하는 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 산화질소 생성 공여체 서열은 아미노산 서열 Cys-Cys-Cys-Cys-Cys (서열 번호:17)을 포함할 수 있으며, 여기에서 시스테인 잔기 중 하나 이상은 NO와 반응하여 변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 티올기를 포함한다.
각각의 리신 잔기는 2개의 산화질소 분자에 대한 공여체일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 리신 잔기 또는 디아제늄디올레이트-변형된 리신 잔기의 수는 바람직한 NO의 양을 기준으로 선택될 수 있다. 이는 추가로, 이들 리신 잔기를 포함하는 펩티드 양쪽성물질의 양 또는 농도를 선택함으로써 당업자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 9:1의 비로 내피 세포 부착 서열 ("PA-YIGSR")을 포함하는 제 1 PA 및 NO 공여체 서열 ("PA-KKKKK")를 포함하는 제 2 PA를 포함하는 내피 모방 매트릭스가 본원에 기술되어 있으며, 여기에서 PA-KKKKK는 5개의 디아제늄디올레이트-변형된 리신 잔기를 포함한다. 따라서, 당업자는 제2 펩티드 양쪽성물질 중의 디아제늄디올레이트-변형 리신 잔기의 수를 증가시키고, 동시에 제 1 PA 대 제 2 PA의 비 (>9:1)를 증가시킴으로써 동일한 결과를 달성할 수 있었다.
이와 같이, NO 방출의 속도 및 지속기간은 리신의 수의 증가 또는 제 2 양쪽성물질의 비율의 증가가 NO 방출의 속도 및/또는 지속기간을 증가시킬 정도로, 제 2 P중의 리신의 수를 증가 또는 감소시키거나, 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질의 비를 변경시킴으로써 조절될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, NO 방출의 속도 및/또는 지속기간은 제 2 양쪽성물질 중의 리신의 수를 PA-KKKKK로부터 예를 들어 PA-KKKKKK, PA-KKKKKKK, PA-KKKKKKKK, PA-KKKKKKKKK 또는 PA-KKKKKKKKKK로 변경시킴으로써 증가될 수 있다. 또한, 제 1 양쪽성물질에 대한 제 2 양쪽성물질의 비를 증가시킴으로써, NO 방출의 지속기간 및/또는 속도가 증가될 수 있다. 이와 같이, NO 방출의 속도 및/또는 지속기간은 PA-YIGSR 대 PA-KKKKK 비를 9:1로부터 예를 들어 9:2, 3:1, 9:4, 2:1, 9:5, 3:2, 9:7, 9:8, 1:1, 9:10, 9:11, 3:4, 3:5, 1:2, 3:7, 3:8, 1:3 또는 이들 사이의 임의의 비로 변경시킴으로써 증가될 것이다.
유사하게, NO 방출의 속도 및/또는 지속기간은 PA-YIGSR 대 PA-KKKKK의 비를 감소시키거나 PA-KKKKK로부터 리신을 제거함으로써 감소될 수 있다. 이와 같이, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1 또는 이들 사이의 임의의 비의 PA-YIGSR 대 PA-KKKKK의 비는 9:1 비에 비해 NO 방출의 속도 및/또는 지속기간을 감소시킬 것이다. 또한, PA-KKKKK 중의 5개로부터 리신의 수를 감소시키면 NO 방출의 속도 및/또는 지속기간이 감소될 것이다 (즉, PA-KKKK, PA-KKK, PA-KK 또는 PA-K).
3. EC 부착
DES의 루멘에서 내피 세포의 보유는 이의 성능에 중요하다. 내피화는 노출된 스텐트 표면에 대한 비-혈전성 코팅을 결과하며, 이의 부재는 유동 혈액 및 최종적 혈전 생성과 직접 접촉하고 있는 스텐트 스트러트를 남긴다. 라미닌은 기저막의 주요 비-콜라겐성 당단백질 성분이며, 세포 부착, 이동, 성장 및 분화의 중개제이다 (Beck K 등, 1990). YIGSR (서열 번호: 2)는 내피 세포의 부착, 퍼짐 및 이동을 향상시키는 것으로 공지된 라미닌 유도된 세포 부착성 서열이다 (Hubbell JA 등, 1991). YIGSR (서열 번호: 2)를 통한 세포 퍼짐은 67-kDa 세포막 관련 수용체에 의해 중개된다 (Massia SP 등, 1993). 폴리에틸렌 테레프탈레이트 및 폴리테트라플루오로에틸렌과 같은 표면의 변형을 위한 YIGSR (서열 번호: 2)의 사용은 EC 부착, 퍼짐 및 이동을 선택적으로 향상시키고 (Massia SP 등, 1991; Fittkau MH 등, 2005), EC 콜로니 생성을 조장하는 것으로 입증되었다.
폴리우레탄 중의 YIGSR (서열 번호: 2) 서열의 혼입은 내피 세포 부착 및 퍼짐을 향상시키는 것으로 입증되었다 (Jun H 등, 2004). NO 방출 폴리우레탄은 중합체 중에 리신-기본 디아제늄디올레이트를 혼입시킴으로써 발달되었다 (Jun HW 등, 2005). 상기 중합체는 혈소판 부착을 급격히 감소시키고 평활근 세포 증식을 억제하면서, 내피 세포 부착을 자극하는 것으로 입증되었다. 더욱더, NO 방출 중합체 골격 내로의 YIGSR (서열 번호: 2) 서열의 혼입은 내피 세포 증식을 향상시키면서, 동시에 혈소판 부착을 억제하는 것으로 관찰되었다 (Taite LJ 등, 2008).
따라서, 기술된 친수성 펩티드는 내피 세포를 선택적으로 결합시켜서 기술된 펩티드 양쪽성물질을 포함하는 나노매트릭스에 대한 내피 세포의 결합을 선택적으로 조장하는 제1 부착성 서열을 포함한다. 이와 같이, 기술된 친수성 펩티드는 내피 세포에 결합하지만 실질적으로 평활근 세포 및/또는 혈소판에 결합하지 않는 내피 세포 부착성 서열을 포함하는 제1 부착성 서열을 포함할 수 있다. 이와 같이, 기술된 친수성 펩티드의 내피 세포 부착성 서열은 아미노산 서열 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR ; 서열 번호:2)를 포함할 수 있다.
기술된 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드는 추가로 하나를 초과하는 부가적 세포 부착성 서열을 포함할 수 있다. 일부 면에서, 하나를 초과하는 부가적 세포 부착성 서열은 내피 세포를 결합시켜서, 기술된 펩티드 양쪽성물질을 포함하는 나노매트릭스에 대한 내피 세포의 결합을 조장한다. 이와 같이, 하나를 초과하는 부가적 세포 부착성 서열은 Arg-Gly-Asp (서열 번호:8), Arg-Gly-Asp-Ser (서열 번호:9), Asp-Gly-Glu-Ala (서열 번호:10), Val-Ala-Pro-Gly (서열 번호:11), Arg-Glu-Asp-Val (서열 번호:12), Asp-Gly-Glu-Ala (서열 번호:13) 및 Lys-Arg-Ser-Arg (서열 번호:14) 중 하나 이상일 수 있다. 내피 세포 부착성 서열 (선택성 및 비-선택성)을 포함하는 다른 이러한 세포 부착성 서열은 공지되어 있으며, 기술된 펩티드 양쪽성물질에 사용될 수 있다. 당업자는 일상적 생체외 방법을 사용하여 캔디데이트 세포 부착성 서열을 포함하는 펩티드 양쪽성물질을 보호할 수 있다.
4. 분해 서열
분해 서열은 세포 매개된 단백질 분해를 일으키는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 면에서, 분해 서열은 매트릭스 금속단백질 분해효소 (MMP) 특정 분열 자리를 포함한다 (MMP는 메트징신 슈퍼패밀리 (metzincin superfamily)로서 공지된 더 큰 부류의 단백질 분해효소에 속하는 아연 의존성 펩티드 중간 분해효소이다).
MMP의 가장 공통적으로 사용되는 그룹은 부분적으로 MMP의 기재 특이성의 역사적 평가 및 부분적으로는 MMP의 세포 편재화에 근거한 것이다. 이들 그룹은 콜라게나아제, 젤라티나아제, 스트로멜리신 및 막형 MMP (MT-MMP)이다.
콜라게나아제는 삼중-나선 미소섬유 콜라겐을 독특한 3/4 및 1/4 단편으로 분해시킬 수 있다. 이들 콜라겐은 뼈 및 연골의 주요 성분이며, MMP는 이들을 분해시킬 수 있는 유일하게 공지된 포유류 효소이다. 통상적으로, 콜라게나아제는 MMP1, MMP8, MMP13 및 MMP18이다. 그 외에, MMP14는 또한 미소섬유 콜라겐을 분열시키는 것으로 입증되었으며, 더욱 논쟁적으로는 MMP2가 콜라겐 분해될 수 있다는 증거가 있다.
젤라티나아제의 주된 기재는 타입 IV 콜라겐 및 젤라틴이고, 이들 효소는 촉매 도메인 내로 삽입되는 부가적 도메인의 존재에 의해 구별된다. 상기 젤라틴-결합 영역은 아연 결합 모티프의 바로 앞에 위치하며, 촉매 도메인의 구조를 파괴하지 않는 분리 폴딩 단위를 생성시킨다. 젤라티나아제는 MMP2 및 MMP9이다.
스트로렐리신은 세포외 매트릭스 단백질을 분열시키기 위한 넓은 능력을 나타내지만, 삼중-나선 미소섬유 콜라겐을 분열시킬 수 없다. 상기 군의 3가지 표준 구성원은 MMP3, MMP10 및 MMP11이다.
모든 6개의 막 유형 MMP (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP24 및 MMP25)는 특징이고 MMP11에 의해 공유되는 프로-펩티드 중의 푸린 분열 자리를 갖는다.
부가적 MMP 분열 자리의 예는 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Handbook of proteolytic enzyme, Edited by Alan J. Barrett, Neil D. Rawling, J. Fred Woessner, Academic Press]에 기술되어 있다.
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따라서, 분해 서열은 매트릭스 금속단백질 분해효소-2 (MMP2) 특정 분열 자리를 포함한다. 예를 들어, 분해 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호: 1)을 포함할 수 있다.
PA 골격 중의 MMP-2 특정 서열과 같은 MMP 특정 서열의 혼입은 나노매트릭스가 세포 매개된 단백질 분해를 일으켜서 나노매트릭스를 통한 세포 이동 및 천연 ECM에 의한 최종적 재형성을 가능하게 함을 보장할 수 있다 (Jun HW 등, 2005; Giannelli G 등, 1997). MMP2에 대해, 상기 분열은 글리신과 로이신 잔기 사이에서 기대된다 (Jun HW 등, 2005).
5. 소수성 꼬리
소수성 꼬리는 선택적으로 치환된 C4 또는 더 큰 알킬 사슬을 갖는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 소수성 꼬리는 선택적으로 치환된 C6 내지 C28 또는 더 큰 알킬 사슬을 갖는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 소수성 꼬리는 선택적으로 치환된 C10 내지 C25 또는 더 큰 알킬 사슬을 갖는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 소수성 꼬리는 선택적으로 치환된 C5, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25, C26, C27, C28 또는 더 큰 알킬 사슬을 갖는 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 소수성 꼬리는 선택적으로 치환된 C16 알킬 사슬을 갖는 잔기를 가질 수 있다.
6. 특정 구현
친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1) 및 아미노산 서열 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:2)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:4)를 포함할 수 있다.
친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1) 및 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:3)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 이와 같이, 친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:5)를 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다.
친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1), 아미노산 서열 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:2) 및 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:3)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 이와 같이, 친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:6)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 이와 같이, 친수성 펩티드 서열은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:7)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다.
7. 전기방사
정전기 방사로서 섬유 생산 산업 내에서 또한 공지된, 섬유를 생성시킬 수 있는 액체 및/또는 용액의 전기방사의 기술은 널리 공지되어 있으며, 많은 특허 및 일반적 문헌에 기술되어 있다. 대표적으로, 전기방사의 공정은 일반적으로 액체의 표면에서 전기장의 생성을 수반한다. 상기 공정에 의해 생성되는 섬유는 매우 다양한 분야에 사용되어 왔으며, U.S. Pat. Nos. 4,043,331 및 4,878,908로부터 부직포 구조를 생성시키는 데에 유용한 것으로 공지되어 있다. 생성되는 전기력은 전하를 수반하는 액체의 제트를 발생시킨다. 이와 같이, 액체 제트는 적합한 전위에서 다른 전기적으로 충전된 대상물로 유인될 수 있다. 액체의 제트가 길어지고 이동함에 따라, 이는 경화되고 건조될 것이다. 길어진 액체의 제트의 경화 및 건조는 액체를 냉각시킴으로써 유발될 수 있으며, 즉 액체는 정상적으로 실온에서 고체이며; 예를 들어 탈수화 (물리적으로 유도된 경화)의 의해 또는 경화 메카니즘 (화학적으로 유도된 경화)에 의해 용매가 증발된다. 생성되는 섬유는 적합하게 위치한 반대로 충전된 수용체 상에 수집되고, 후속적으로 이로부터 필요에 따라 제거되거나, 반대로 충전된 발생된 표적 영역에 직접 도포된다.
하나의 면에서, 전기방사 (ES)는 정전기장과 유체 사이의 상호작용을 이용하는 유체의 세분화 공정이다. 하나의 면에서, 유체는 도전성 유체일 수 있다. 전기방사 동안, 마이크론 또는 서브마이크론 크기 직경을 갖는 섬유는 중합체 용액으로부터 정전기 전위에 의해 압출된다 (U.S. Pat. No. 1,975,504 to Formhals). 외부 정전기장이 유체 (예를 들어, 반희석 중합체 용액 또는 중합체 용융물)에 적용되는 경우, 현탁된 원뿔형 방울은 전기장과 평형을 이룬다. 정전기 세분화는 정전기장이 액체의 표면장력을 극복하기에 충분히 강한 경우에 발생한다. 액체 방울은 불안정하게 되고, 아주 작은 제트는 방울의 표면으로부터 방출된다. 이것이 근거 표적에 도달함에 따라, 물질은 비교적 매세한, 즉 작은 직경을 함유하는 상호연결된 웹으로서 수집된다. 이들 작은 직경 섬유로부터의 생성된 필름 (또는 막)은 매우 큰 표면적 대 부피 비 및 작은 공극 크기를 갖는다. 상기 공정은 대표적으로 매우 유연한 둥근 섬유로 구성된 부직포 매트 또는 펠트를 수득한다. 이들의 높은 표면적 및 우수한 기계적 특징으로 인해, 전기방사 메쉬는 통상적으로 여과 및 복합 강화에서 그 응용이 발견되었다. 매우 동일한 이유로, 폴리(락트산) 및 글리콜산 및 다른 폴리에스테르와의 이의 공중합체와 같은 생체양립성 중합체로부터 유도되는 펠트 및 메쉬는 조직의 가공에서 세포의 결합을 위한 기재 (스캐폴드)로서 연구되고 있다 (참조: 에틸렌 비닐 알코올, 70% 프로판올 및 30% 물을 함유하는 단일상 시스템으로부터의 전기방사 공정에 의해 섬유를 제조하는 것을 기술하는 Kenawy 등, Biomaterials, 2003, 24 (6), 907). 이러한 유연한 다공성 배지는 피부, 맥관 및 천연 삽입물의 가공에 특히 적합하다.
ES 공정에서 변할 수 있는 매개변수는 전기장, "테일러 콘"과 및 표적 사이의 거리 및 중합체 용액 점도이다 (Fridrikh 등, G. C. Phys Rev Lett. 2003, 90(14), 144502). 섬유 생성 공정의 복잡성으로 인해, 전기방사 섬유의 기하학적 형태를 변경시키기 위해 매우 적은 시도가 이루어졌다. 최근에, 리네커 (Reneker) 및 공동연구자는 일부 용매계 중에서의 측쇄 및 리본형 섬유의 생성을 관찰하였으며, 이를 가든 호스에서 관찰되는 것과 유사한 버클링 불안정성으로 인한 중합체 표피의 파괴의 결과로 보고 있다 (참조: Koombhongse 등, Polm. Sci.: Part B: Polm. Phys. 2001, 39, 2598-2606). 그러나, 이러한 섬유의 생성은 일반적으로 공지된 ES 작업 조건 하에 예측할 수 있는 방식으로 달성될 수 없다. 본원에 참고문헌으로 인용된 특허 [U.S. Pat. Nos. 4,323,525 및 4,689,186 to Bornat]는 섬유-생성 물질을 함유하는 액체를 정전기적으로 방사시킴으로써 관형 생성물의 생성 방법에 관한 것이다.
ES는 마이크론 또는 서브마이크론 크기 직경을 갖는 섬유를 정전기 전위에 의해 중합체 용액으로부터 압출시키는 공정이다 (도 5). 대표적 ES 공정에서, 중합체 용액은 고전압 DC 장 (예를 들어, 5-30 kV)을 받으면서 노즐을 통해 주입된다. 이러한 조건 하에, 중합체 용액은 중합체 제트의 포말을 유도하는 "롤리 (Raleigh) 불안정성"으로 불리우는 현상을 받게되는 방울로 인해 "테일러 콘" 내로 분출된다. 제트가 추진됨에 따라, 섬유의 생성은 제트의 용매 증발 및 솎음에 의해 용이해진다. 섬유 형태에 영향을 주도록 변할 수 있는 매개변수는 전기장 강도, "테일러 콘"과 표적 사이의 거리 및 중합체 용액의 점도이다. "테일러 콘" 생성의 복잡성으로 인해, 섬유 형태를 조절하는 데에 있어서의 대부분의 시도는 중합체 용액 특성을 조절하는 데에 초점이 있었다. 이는 중합체 농도 또는 분자량을 증가시키거나 유기 용매의 휘발성을 증가시킴으로써 달성될 수 있으며; 이들은 모두 방사 동안 중합체 섬유가 고화되는 속도를 가속시킨다. 일반적으로, 점도 및 용매 휘발성이 증가되면 섬유가 더 두꺼워진다.
통상적인 시도의 제한은 이들이 표면적을 증가시킴으로써 세포 상호작용에 심하게 영향을 줄 수 있는 종횡비 (라운더 대 플래터 섬유) 및 섬유 다공성과 같은 다른 섬유 특성의 변경을 할 수 없다는 점이며, 이는 세포 접촉 응용 및 조직 공학 (TE)에서 바람직한 특성일 수 있다.
우수한 기계적 특성, 높은 표면적 대 중량 비 및 유연성은 여과 및 복합 강화에서 광범위한 응용을 위한 전기방사 섬유 캔디데이트를 만들었다. 특정 중합체 특성과 조합된 이들 특징은 또한 조직 공학 스캐폴드 및 약물 전달 기기에 대해 이상적인 전기방사 펠트를 만든다. 전기방사 물질은 대표적으로 높은 종횡비를 가지며, 이는 다양한 응용, 예를 들어 조직 공학 (TE) 응용에 대한 바람직한 특성일 수 있다.
섬유 직경은 대표적으로 전기장 강도를 변동시키거나 (인가된 전압 또는 팁 대 표적 간격을 변동시킴으로써), 증발 속도를 변동시키거나 (방사 환경을 변동시키거나 상이한 휘발성의 용매를 사용함으로써), 또는 중합체 농도를 변동시킴으로써 조절된다. 마지막 방법은 중합체 농도가 용이한 조절 변수이고 섬유 직경에 대한 반복적이고 급격한 효과를 가질 수 있으므로, 연구자 중에서 특별한 인기가 있다. 상기 방법은 고체 섬유가 용액으로부터 침전되기 전에 증발되어야 하는 용매의 변동시키고, 용액의 점도 및 이에 따른 "테일러 콘" 생성 및 최종 제트 직경을 변동시킴으로써 작용한다.
통상적인 방법에서, 전기방사 나노섬유의 표면 기하학 및 형태는 변형시키기가 더욱 어렵다. 대표적 전기방사 섬유는 수가지 중합체/용매계에서 다공성 및 편평한 섬유 형태를 관찰되었을 지라도 순환 단면을 취하지만, 이들 형태를 조절하는 데에 성공한 연구는 거의 없다. 섬유 단면 형태를 변형시키기 위해 사용되는 공통적인 기술은 중합체를 동시 방사시키고, 특정 중합체 상을 선택적으로 제거하는 것이었다. 더욱 최근의 시도는 비혼화성 제2 상 및 공축 방사구를 사용함으로써 중공 섬유 형태를 생성시키는 데에 성공하였다. 이들 기술은 둘 모두 바람직한 최종 형태를 달성하기 위해 복합한 가공 단계 및 특정화된 전기방사 기기를 수반한다.
통상적인 전기방사 기술에서 대부분의 조절된 매개변수 주 하나는 용해된 중합체의 농도를 변동시키는 것을 수반한다. 이는 대표적으로 전기방사 동안의 섬유 생성 공정 및 기간을 변동시킴으로써 최종 섬유 직경을 조절할 수 있는 효과를 갖는다. 중합체 농도와 결부된 더욱 중요한 매개변수 중 하나는 용액의 점도이다. 점도는 "테일러 콘" 생성 및 안정성에서 큰 역할을 한다.
그러나, 중합체 용액의 농도를 변동시키는 것은 2가지 제한이 있다. 저농도 용액은 "테일러 콘"을 적절하게 생성시키기 위한 점도가 부족할 수 있다. 통상적인 기술에서, 단일 대전 제트를 방사구로부터 뽑아내는 것 대신에, 제트는 다중 방울로 분해된다. 상기 공정은 전기분무로 불리우며, 표면 코팅 및 잉크젯 프린팅을 적용시키는 것과 같은 공정에 사용되어 왔다.
본원에 기술된 PA는 예를 들어 폴리에스테르 나노섬유 (예를 들어, 전기방사 폴리카프로락톤 (ePCL) 나노섬유)와 같은 전기방사 나노섬유 상에 코팅될 수 있다. 본원에 기술된 PA는 수가지 방식 중 하나로 ePCL 상에 코팅될 수 있다. 압력 기울기는 주사기의 형태로 사용될 수 있다. ePCL 나노섬유 디스크는 주사기의 배럴 내에 위치할 수 있으며, PA 용액은 이를 통해 밀어질 수 있다. 이는 나머지 측면으로부터 반복될 수 있다. 대안적으로, ePCL 나노섬유는 회전 기술에 의해 PA로 코팅될 수 있다. ePCL 나노섬유는 맨드릴 상에 고정되고 회전하면서, PA 용액 중에 부분적으로 침지될 수 있다.
나노섬유 생성에 적합한 중합체는 전기방사에 적합한 것을 포함한다. 예를 들어, 중합체는 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리올레핀 또는 폴리카아보네이트일 수 있다. 하나의 면에서, 중합체는 무정형 생분해성 폴리에스테르일 수 있다. 중합체는 측쇄 또는 직쇄일 수 있는 것으로 고려된다. 블록 및 그라프트 공중합체를 포함하는 공중합체가 또한 고려된다. 중합체 혼합물이 또한 기술된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다.
하나의 면에서, 적합한 중합체는 폴리에스테르; 폴리무수물; 폴리오르토에스테르; 폴리포스파젠; 폴리포스페이트; 폴리포스포에스테르; 폴리디옥사논; 폴리포스포네이트; 폴리히드록시알카노에이트; 폴리카아보네이트; 폴리알킬카아보네이트; 폴리오르토카아보네이트; 폴리에스테르아미드; 폴리아미드; 폴리아민; 폴리펩티드; 폴리우레탄; 폴리에테르에스테르; 폴리알킬렌 글리콜; 폴리알킬렌 옥사이드; 폴리펩티드; 폴리사카라이드; 폴리비닐 피롤리돈 및 이들의 조합물을 포함한다.
추가 면에서, 적합한 중합체 폴리(락티드)-코-(폴리알킬렌 옥사이드); 폴리(락티드-코-글리콜라이드)-코-(폴리알킬렌 옥사이드); 폴리(락티드-코-카프로락톤)-b-(폴리알킬렌 옥사이드); 및 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-카프로락톤)-b-(폴리알킬렌 옥사이드)를 포함한다.
추가 면에서, 적합한 중합체 폴리(락티드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(카프로락톤); 폴리(발레로락톤); 폴리(히드록시부티레이트); 폴리(락티드-코-글리콜라이드); 폴리(락티드-코-카프로락톤); 폴리(락티드-코-발레로락톤); 폴리(글리콜라이드-코-카프로락톤); 폴리(글리콜라이드-코-발레로락톤); 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-카프로락톤); 및 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-발레로락톤)을 포함한다.
추가 면에서, 적합한 중합체 폴리(락티드)-코-폴리(비닐피롤리돈); 폴리(락티드-코-글리콜라이드)-코-폴리(비닐피롤리돈); 폴리(락티드-코-카프로락톤)-b-폴리(비닐피롤리돈); 및 폴리(락티드-코-글리콜라이드-코-카프로락톤)-b-폴리(비닐피롤리돈)을 포함한다.
하나의 면에서, 중합체 섬유는 당업자들에게 공지된 임의의 생체양립성 중합체를 포함할 수 있다. 추가 면에서, 중합체 섬유는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산) 또는 폴리(ε-카프로락톤), 또는 이들의 공중합체 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 추가 면에서, 섬유의 중합체는 폴리에틸렌 및/또는 폴리우레탄일 수 있다. 추가 면에서, 중합체는 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(글락사논), 폴리(오르토에스테르), 폴리(피롤산), 및 폴리(포스파젠)일 수 있다. 사용될 수 있는 부가적 중합체는 폴리알킬렌 중합체 및 공중합체, 플루오로카본 중합체 및 공중합체, 폴리에스테르 중합체 및 공중합체, 폴리에테르 중합체 및 공중합체, 실리콘 중합체 및 공중합체 및 폴리우레탄 중합체 및 공중합체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 사용될 수 있는 다른 중합체는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리(테트라플루오로에틸렌-코-헥사플루오로프로펜), 변형된 에틸렌-테트라플루오로에틸렌 공중합체, 에틸렌 클로로트리플루오로에틸렌 공중합체, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 실리콘, 폴리우레탄, 폴리에테르 블록 아미드, 및 폴리에테르 에스테르를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 추가 면에서, 중합체는 하나 이상의 중합체, 예를 들어, 폴리피롤, 폴리아닐린, 폴리티오펜, 폴리(p-페닐렌 비닐렌), 폴리파랄렌, 또는 이들의 혼합물을 일 수 있다. 추가 면에서, 중합체 폴리 (에틸렌-비닐 아세테이트)일 수 있다.
하나의 면에서, 중합체는 생체양립성 중합체. 하나의 면에서, 중합체는 폴리카프로락톤이다. 추가 면에서, 폴리카프로락톤이 양쪽성 합성 블록 공중합체의 소수성 블록으로서 사용된다.
하나의 면에서, 중합체는 분해성 중합체이다. "분해성"은 중합체가 일정 기간 후에 특정 조건하에 분해됨을 의미한다. 추가 면에서, 중합체는 일정 기간 후에 생리학적 조건하에 분해되는 "생분해성" 중합체이다. 추가 면에서, 중합체는 비-분해성 및/또는 비-생분해성이다. 예를 들어, 중합체는 하나 이상의 가수분해성 결합. 가수분해성 결합의 존재는 생물계에서 나노섬유의 분해를 용이하게 할 수 있다. 추가 면에서, 중합체는 하나 이상의 가수분해성 결합을 포함하지 않는다.
8. ECM 모방 나노매트릭스
나노섬유 내로 조직화된 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질 중 하나 이상을 포함하는 내피 모방 나노매트릭스가 본원에 기술되어 있다. 나노섬유는 식 DS---CA 및 DS---KK를 갖는 펩티드 양쪽성물질의 혼합물을 포함할 수 있다.
DS---CA 및 DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 약 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13:, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 또는 1:20을 포함하여 약 1:20 내지 약 20:의 비로 나노섬유 중에 존재할 수 있다. 이와 같이, 나노섬유는 식 DS---CA 및 DS---KK를 갖는 펩티드 양쪽성물질의 혼합물을 포함할 수 있다. DS---CA 및 DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 약 1:9 내지 약 9:1의 비로 나노섬유 중에 존재할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 상기 비는 부분적으로 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질 중의 디아제늄디올레이트-변형된 리신 잔기의 수 및 바람직한 NO 방출을 기준으로 당업자에 의해 선택될 수 있다.
기술된 내피 모방 나노매트릭스의 DS---CA 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1) 및 아미노산 서열 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:2)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 기술된 내피 모방 나노매트릭스의 DS---CA 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:4)를 포함할 수 있다.
기술된 내피 모방 나노매트릭스의 DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1), 산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시킬 수 있는 펜던트 아민기를 포함하는 및 하나 이상의 리신 잔기를 포함할 수 있다. 이와 같이, 기술된 내피 모방 나노매트릭스의 DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1) 및 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:3)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 산화질와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 이와 같이, 기술된 내피 모방 나노매트릭스의 DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:5)를 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 일부 면에서, DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드 [K[N(O)NO-]]n을 생성시켰다. 일부 면에서, n은 1 내지 20일 수 있다. 일부 면에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다. 일부 면에서, DS---KK 펩티드 양쪽성물질은 산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드 [K[N(O)NO-]]5를 생성시켰다.
기술된 내피 모방 나노매트릭스의 나노섬유는 식 DS---CA---KK, DS---KK---CA 또는 이들의 조합을 갖는 펩티드 양쪽성물질을 포함한다. 예를 들어, DS---CA---KK 및 DS---KK---CA 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (서열 번호:1), 아미노산 서열 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:2) 및 아미노산 서열 Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:3)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. 예를 들어, DS---CA---KK 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (서열 번호:6)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다. DS---KK---CA 펩티드 양쪽성물질은 아미노산 서열 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (서열 번호:7)을 포함할 수 있으며, 여기에서 리신 잔기는 NO와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 펜던트 아민기를 포함한다.
일부 면에서, 기술된 내피 모방 나노매트릭스의 펩티드 양쪽성물질은 산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드 [K[N(O)NO-]]n을 생성시켰다. 일부 면에서, n은 1 내지 20이다. 일부 면에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다. 따라서, 일부 면에서, 펩티드 양쪽성물질은 산화질소와 반응하여 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드 [K[N(O)NO-]]5를 생성시켰다.
산화질소(NO) 방출 펩티드 양쪽성물질 (PA)로 코팅된 전기방사 폴리카프로락톤 (ePCL) 나노섬유를 포함하는 하이브리드 나노매트릭스가 본원에 기술되어 있다. 전기방사는 나노스케일의 직경을 갖는 균일한 중합체 섬유를 제조하기 위한 능력으로 인해, 최근에 많은 흥미를 발생시키고 있다 (Li WJ 등, 2003; Choi J 등, 2008; Zhang YZ 등, 2005; Matthews JA 등, 2002; 및 Heydarkhan-Hagvall 등, 2008). 이들 섬유는 콜라겐과 같은 나노미소섬유 ECM 단백질과 구조적으로 유사하다. 그러나, 이들 나노섬유는 세포와 상호작용하고 이들의 부착 및 증식시키기 위해 중요한 생체활성의 결여에 의해 저해된다. 상기 생체활성은 이들을 펩티드 양쪽성물질 (PA)로 코팅시킴으로써 이들 ePCL 나노섬유에 제공될 수 있다. 이들 PA는 효소 중개 분해성 자리 및 세포 부착성 리간드를 수반할 수 있으며, 따라서, ECM의 생화학 면을 모방한다. ePCL 나노섬유 상의 PA의 상기 코팅은 도 19에 도시된 바와 같이 하이브리드 생체모방 나노매트릭스를 구성한다. 연구에 사용되는 PA는 매트릭스 금속단백질 분해효소-2 (MMP-2) 분해성 자리 Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln (GTAGLIGQ)로 구성된다. MMP는 본질적으로 건강한 세포에 의해 생성되며, 따라서, 상기 자리의 존재는 세포에 의한 나노매트릭스의 재형성을 조장한다 (Jun 등, 2005; Massia SP 및 Hubbell JA: 1991; 및 Andukuri A 등, 2009). PA는 내피 세포 부착 및 퍼짐을 조장하는 것으로 공지된 라미닌 유도 Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) 서열, 및 NO 공여체로서 작용하는 폴리리신 (KKKKK) 서열을 함유한다. PA 내로의 NO 공여 잔기의 혼입은 하이브리드 나노매트릭스로부터 국부 혈류로의 NO의 조절된 방출을 제공하는 것으로 예측되며, 이는 평활근 세포 증식 및 혈소판 부착을 제한하면서 재내피화를 향상시킬 것이다.
9. 스텐트
또한, 본원에 기술된 내피 모방 나노매트릭스로 코팅된 본원에 기술된 의료 기기를 포함하는 조성물이 본원에 기술되어 있다. 의료 기기는 대상체의 체내에 사용하도록 공지되고 확인된 임의의 기기이다. 바람직하게는, 의료 기기는 심혈관계 내에 삽입되는 기기이다. 의료 기기는 외과용 이식체로서 사용하기에 적합한 임의의 재료이다.
대부분의 스텐트는 316L 스테인레스강으로부터 제조된다. 현재의 예는 Cordis Palmaz-Schatz 스텐트, Cordis Crossflex 스텐트, Guidant MultiLink 스텐트 및 Medtronic Be 스텐트를 포함한다. 강 스텐트의 단점은 아급성 혈전증 및 재협착, 출혈 합병증, 부식 및 스텐트 삽입 혈관 세그먼트의 재팽창의 높은 발생을 포함한다.
금은 매우 가시적인 생체양립성이며, 일반적으로 불활성 금속이다. 금-판 하이브리드 스텐트는 우수한 가시성 및 가요성을 갖지만, 또한 매우 비싸다.
현재, Conichrome® PhynoxTM 및 Elgiloy®이 코발트-크롬-니켈-몰리브덴-철 합금에 대한 상표명이다. 상기 코발트 크롬 합금은 Schneider W모든스텐트와 같은 스텐트를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
원소 번호 73인 탄탈은 광택성의 가요성이며, 방사선불투과성이다. 스테인레스강보다 더 부서지기 쉽지만, 탄탈은 높은 연성 및 내식성을 나타낸다. 탄탈 스텐트의 현재의 예는 Medtronic의 Wiktor 스텐트 및 Tantalum 스텐트를 포함한다.
니티놀 ("NIckel Titanium Naval Ordinance Laboratory"로부터의 제품)이 생체양립성의 초탄성 형상 기억 합금의 일례이다. 55% 니켈 및 45% 티탄으로 구성된 형상 기억 합금으로서, 니티놀은 이의 상전이 후에 특정 온도로 가열시에 특정 형상으로 환원하려는 능력을 갖는다. 형상 기억 합금은 오스테나이트 상에서의 더 강한 고온 형태로부터 마르센사이트 상에서의 더 약한 저온 형태로 냉각되는 경우에 결정 구조의 상전이를 일으킨다. 니티놀은 또한 초탄성이 되게 하고 오스테나이트 온도에서 뒤틀리는 탄성의 "고무형" 성질을 갖는다. 니켈과 티탄 사이의 강한 금속간 결합은 니켈에 대한 증가된 민감성을 갖는 환자에서도 매우 낮은 반응 속도를 갖는다. 이는 강한 면역 반응을 예방하고, 부식을 감소시킨다. 현재의 예는 Boston Scientific's Nitinol-자체-팽창 반경 스텐트를 포함한다. 유럽에서 이용되고 있는 Boston Scientific,s Symbiot 스텐트는 ePTFE의 16-마이크론 두께 층에 의해 양측면 상에 덮어진 니티놀로 구성된다.
중합체 스텐트에 대한 재료는 중합체 전립선내 포장재 및 형상 기억 중합체와 결합된 생분해성 스텐트를 포함한다. 실리콘은 스텐팅을 위해 선택된 제 1 유기 물질이다. 실리콘은 낮은 율의 조직 종양을 유도하는 교호 실리콘 및 산소 원자로부터 유도되는 축합 중합체이다. 그러나, 실리콘은 불량한 생체 내구성, 인장강도 및 코일 강도, 및 내부 대 외부 직경 비를 갖는다.
폴리에틸렌 또는 폴리우레탄을 사용하는 순수 플라스틱 담관 스텐트가 또한 환자에 사용되었다. 그러나, 폴리에틸렌은 환자의 20-30%에서 슬러지를 유도하고, 단백질 부착 및 생물막 생성을 조장하고, 답즙 결정 및 음식 입자를 포획한다. 대조적으로, 폴리우레탄 우수한 인장강도 및 코일 강도를 갖지만, 이는 또한 이용할 수 있는 가장 반응성인 물질 중 하나이다.
생분해성 및 생체흡수성 스텐트는 또한 스텐팅을 위한 또한 독자 생존 가능한 물질이다. 생분해, 생체흡수 및 생물침식은 종종 유의어로서 부정확하게 사용되지만, 이들은 상이한 정의를 갖는다. 생분해에서, 효소 또는 미생물와 같은 생물작용제는 분해 공정에서 우세한 성분이다. 생분해성 이식체는 일반적으로 단기 및 임시 응용에 유용하다. 생체재흡수 및 생체흡수는 분해 생성물이 생물학적 환경에서 식세포작용과 같은 세포 활성에 의해 제거된다. 대조적으로, 생물침식성 중합체는 생리학적 조건하에 수용성 물질로 전환된 물-불용성 중합체이다. 이는 침식 공정에 수반되는 물리적 메카니즘에 상관없이 일어난다. 이 경우에 접두어 "생물"은 고온, 강산 또는 강염기 또는 기후를 통한 침식과 상반되게 생리학적 조건에서 일어나는 침식를 의미한다.
손상된 혈관에 대한 스텐트의 임시 구조적 지지로 인해, 생분해성 중합체는 약물 전달계에 대해 완전한 생체양립성이 쉽게 분해될 수 있는 물질로서 관찰될 수 있다. 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르 및 폴리무수물과 같은 일부 생분해성 중합체는 또한 약물의 국부 전달을 조절할 수 있으며, 또한 가수분해 및 다른 메카니즘을 통해 "안전하게" 분해된다. 생분해성 약물 전달계는 안정한 분해, 투과성 및 중간 인장강도를 필요로 한다. 스텐트에서, 구조적 지지는 생체양립성, 혈액양립성 및 우수한 혈액동력학이 동반될 수 있다. 현재, 생분해성 스텐트는 일반적으로 혈전 및 맥관 손상을 유도한다.
듀크 생체흡수성 스텐트는 제 1 생분해성 스텐트이다. 다른 것은 또한 소의 아킬레스건으로부터 구조적 안정성을 위해 화학적으로 교차결합되는 일자형 사이드 없이 관 내로 타입 I 콜라겐을 생성시킴으로써 입증된 혼입 천연 단백질을 갖는다. 콜라겐은 고유한 음전하를 갖기 때문에 매우 혈액양립성이다. 콜라겐 생성물은 이들의 생활주기 전체에 걸쳐 생체양립성이며, 혈전의 감소를 나타내었다. 또한, 항응고제 및 섬유소용해제는 콜라겐에 직접 결합될 수 있으며, 이는 약제 전달에 대한 용량에 도움을 준다. Cordis Corporation은 또한 폴리락티드와 트리메틸렌 카아보네이트의 배합물로부터 가공되는 생분해성 스텐트 원형을 개발하였다.
중합체 분해를 가속시키는 일부 요인은 생성물에 더 높은 친수성 골격, 더 높은 친수성 말단기, 더 낮은 결정도, 더 높은 다공성 및 더 작은 전체 크기를 제공하는 것을 포함한다. 사용되는 가장 공통적인 화학적 작용기는 에스테르, 무수물, 오르토에스테르 및 아미드이다.
최종 중합체 가능성은 형상 기억 중합체이다. 중합체가 합성되면, 이는 무수한 형태로 가열되거나 냉각될 수 있다. 적합한 자극을 도입시킬 때에, 중합체는 임시 상태로부터 기억되는 영구 형상으로 전이될 것이다. 이들 중합체의 대부분은 주로 존재하는 지방족 폴리에스테르, 특히 폴리(에테르에스테르), 및 L,L-디락티드, 디글리콜리드 및 p-디옥사논의 양을 보호함으로써 결정되는 적합한 세그먼트로부터 생성된다. 매크로디올은 이미 입증된 단량체에 근거하여 합성될 수 있다.
따라서, 스텐트와 같은 본원에 기술된 의료 기기는 티탄 합금을 포함할 수 있다. 의료 기기 코발트-크롬을 포함할 수 있다. 의료 기기는 니켈-티탄을 포하할 수 있다. 의료 기기는 생분해성 중합체를 포함할 수 있다.
일부 면에서, 의료 기기는 맥관 스텐트이다. 일부 면에서, 스텐트는 약물 용리 스텐트이다. 예를 들어, 스텐트는 시롤리무스 용리 스텐트 또는 파클리탁셀 용리 스텐트일 수 있다.
당업자는 기술된 내피 모방 나노매트릭스에 사용하기 위한 부가적 의료 기기를 인지할 수 있다. 바람직하게는, 의료 기기는 정상적으로 천연 내피를 포함하는 몸의 조직 또는 기관에 투여되는 기기이다. 예를 들어, 일부 면에서, 의료 기기는 맥관 그라프트이다. 일부 면에서, 의료 기기는 카테터이다. 일부 면에서, 의료 기기는 페이스메이커이다. 일부 면에서, 의료 기기는 심장판막이다.
또한, 기술된 코팅 의료 기기를 대상체에 이식하는 방법이 기술되어 있다. 이와 같이, 하나의 면에서, 방법은 내피 모방 나노매트릭스로 코팅시킨 의료 기기 (예를 들어, 스텐트, 맥관 그라프트, 카테터, 페이스메이커 또는 심장판막)을 포함하는 조성물을 제공하고, 코팅된 기재를 대상체에 이식하는 단계를 포함한다. 추가 면에서, 제공 단계는 의료 기기를 내피 모방 나노매트릭스로 코팅시키는 것이다. 추가 면에서, 방법은 대상체에게 이식하기 전에 내피 모방 나노매트릭스를 의료 기기 상에 코팅시키는 단계를 포함한다. 추가 면에서, 방법은 대상체에 이식한 후에 내피 모방 나노매트릭스를 의료 기기 상에 코팅시키는 단계를 포함한다.
10. 치료 방법
본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질은 스텐트 또는 심장판막과 같은 다른 의료 기기를 코팅시키기 위한 나노매트릭스의 일부로서 사용될 수 있다. 유사하게, 펩티드 양쪽성물질은 그라프트의 재협착을 예방하기 위해 심방 또는 정맥 그라프트와 같은 맥관 그라프트와 함께 사용될 수 있다. 이와 같이, 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질을 심혈관 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 심혈관 질환을 치료하는 방법이 본원에 기술되어 있다.
본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질은 펩티드 양쪽성물질로 코팅된 맥관 스텐트, 맥관 그라프트, 카테터, 페이스메이커 또는 심장판막과 같은 의료 기기의 적용에 의해 투여될 수 있는 것으로 이해된다. 추가로, 펩티드 양쪽성물질은 의료 기기 사용하는 데에 있어서 폴리카프로락톤 나노섬유와 같은 나노매트릭스의 일부로서 사용될 수 있다. 이와 같이, 예를 들어, 본원에 기술된 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질로 코팅된 폴리에스테르 나노섬유 (예를 들어, 폴리카프로락톤 나노섬유)와 같은 나노섬유를 포함하는 스텐트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 죽상 동맥경화증을 치료하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 예를 들어 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질과 같은 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질 중 임의의 것이 기술된 방법에 사용될 수 있으며, 여기에서 각각의 양쪽성물질은 친수성 펩티드 서열 및 소수성 꼬리를 포함하고, 친수성 펩티드 서열은 분해 서열 및 제1 세포 부착성 서열 및 산화질소 생성 공여체 서열 중 하나 이상을 포함하는 것으로 이해된다.
유사하게, 심혈관 질환의 치료의 시도 중 하나는 그라프트가 사용되는 경우에 추가의 폐색, 특히 그라프트의 폐색의 예방이다. 그라프트 개존율은 개방되거나 폐색되지 않고 유지되려는 그라프트의 능력을 의미한다. 이와 같이, 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질 중 하나 이상으로 코팅된 그라프트를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여 그라프트 개존율을 증가시키는 방법이 본원에 기술되어 있다.
11. 펩티드
본원에 기술된 바와 같이, 공지되고 본원에서 고려되는 작용성 펩티드/ 단백질의 많은 변이체가 있다. 단백질 변이체 및 유도체는 당업자들에 잘 이해되며, 아미노산 서열 변형물을 수반할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형물은 대표적으로 3개의 부류 중 하나 이상에 속한다: 치환, 삽입 또는 결실 변이체. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합 및 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 정상적으로, 예를 들어 1 내지 4개의 잔기의 정도로 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 삽입보다 작은 삽입일 것이다. 실시예에 기술된 것과 같은 면역원성 융합 단백질 유도체는 생체외에서의 교차결합에 의해 또는 융합을 부호화하는 DNA에 의해 형질전환된 재조합 세포 배양에 의해 면역원성을 제공하기 위해 충분히 큰 폴리펩티드를 표적 서열에 융합시킴으로써 제조된다. 결실은 단백질 서열로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 제거를 특징으로 한다. 대표적으로, 약 2개 이하 내지 6개의 잔기가 단백질 분자 내의 임의의 하나의 자리에서 결실된다. 이들 변이체는 정상적으로, 단백질을 부호화하는 DNA에서 누클레오티드의 자리 특이적 돌연변이 생성에 의해 제조되어, 변이체를 부호화하는 DNA를 생성시킨 후에, 재조합 세포 배양에서 DNA를 발현시킨다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 예정된 자리에서 치환 돌연변이, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이 및 PCR 돌연변이를 제조하기 위한 기술은 널리 공지되어 있다. 아미노산 치환은 대표적으로 단일 잔기의 치환이지만, 즉시 많은 상이한 위치에서 일어날 수 있으며; 삽입은 일반적으로 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 정도일 것이고; 및 결실은 약 1 내지 30개의 잔기일 것이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접 쌍, 즉, 2개의 잔기의 결실 또는 2개의 잔기의 삽입으로 이루어진다. 치환, 결실, 삽입 또는 임의의 이들의 조합은 최종 구성에 도달하도록 조합될 수 있다. 돌연변이는 서열을 판독 프레임 밖에 위치시키지 않아야 하며, 바람직하게는 이차 mRNA 구조를 생성시킬 수 있는 상보적 영역을 발생시킬 것이다. 치환 변이체는 하나 이상의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 위치에서 삽입된 변이체이다. 이러한 치환은 일반적으로 하기의 표 2에 따라 이루어지며, 보존성 치환을 이미한다.
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작용성 및 또는 면역학적 동일성의 실질적 변동은 표 2에 기재된 것보다 보존성이 더 낮은 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 배열로서 치환의 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 자리에서 분자의 소수성의 변동 또는 (c) 곁사슬의 벌크를 유지시키는 데에 대한 효과에서 더욱 현저히 상이한 잔기를 선택함으로써 이루어진다. 일반적으로 단백질 특성의 가장 큰 변동을 발생시키는 것으로 기대되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어 로이실, 이소로이실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로 (에 의해) 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 (에 의해) 치환되거나; (c) 양성 곁사슬을 갖는 잔기, 예를 들어, 리실, 아르기닐 또는 히스티딜이 음성 잔기, 예를 들어, 글루타밀 또는 아스파르틸로 (에 의해) 치환되거나; 또는 (d) 큰 곁사슬을 갖는 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌이 곁사슬을 갖지 않는 잔기, 예를 들어, 글리신으로 (에 의해) 치환된 (이 경우에는, (e) 황산화 및/또는 글리코실화를 위한 자리의수를 증가시킴으로써) 것일 것이다.
예를 들어, 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 또 다른 잔기에 의한 하나의 아미노산 잔기의 대체는 보존성 치환으로서 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 보존성 치환은 하나의 소수성 잔기를 또 다른 잔기로 대체하거나, 하나의 극성 잔기를 또 다른 잔기로 대체한다. 치환은 예를 들어, Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Ly, Arg; 및 Phe, Tyr과 같은 조합을 포함한다. 각각의 명료하게 설명되는 서열의 이러한 보존적으로 치환된 변이체는 본원에 제공된 모자이크 폴리펩티드 내에 포함된다.
치환적 또는 결실적 돌연변이는 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)에 대한 자리를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정한 잔기의 결실이 또한 바람직하다. 잠재적 단백질 분해 자리, 예를 들어 Arg의 결실 또는 치환이 예를 들어 염기성 잔기 중 하나를 결실시키거나, 이를 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기에 의해 치환시킴으로써 수행될 수 있다.
특정 번역후 유도체화는 발현된 폴리펩티드 상에서의 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 자주 번역후에 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기로 탈아미드화된다. 부가적으로, 이들 잔기는 온화한 산성 조건 하에서 탈아미드화된다. 다른 번역후 변형 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 곁사슬의 o-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화 및, 일부 경우에, C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.
기술된 단백질의 변이체 및 유도체를 규정하기 위한 하나의 방식은 특정의 공지된 서열에 대한 상동성/동일성에 대해 변이체 및 유도체를 규정하는 것이다. 특히, 규정된 서열에 대해 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 상동성을 갖는 본원에 기술된 이들 및 다른 단백질의 변이체가 기술되어 있다. 당업자들은 2개의 단백질의 상동성을 결정하는 방식을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어, 상동성은 상동성이 가장 높은 수준에 있도록 2개의 서열을 정렬한 후에 계산될 수 있다.
상동성을 계산하는 또 다른 방식은 공개된 연산에 의해 수행될 수 있다. 비료를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소적 상동성 연산에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 연산에 의해, 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 연산의 전산화 도구에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Softwear Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
상동성의 동일한 유형은 핵산에 대해, 예를 들어 핵산 정렬에 관련된 최소한의 물질에 대해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger 등 방법 Enzymol. 183:281-306, 1989]에 기술되어 있는 연산에 의해 얻어질 수 있다.
보존성 돌연변이 및 상동성의 설명은 변이체가 보존성 돌연변이인 특정 서열에 대해 70% 이상의 상동성을 갖는 구현과 같이 임의의 조합으로 함께 조합될 수 있다.
상기 명세서가 다양한 단백질 및 단백질 서열을 기술함에 따라, 단백질 서열을 부호화할 수 있는 핵산이 또한 설명됨이 이해된다. 이는 특정 단백질 서열에 관련된 모든 변성 서열, 즉, 단백질 서열의 기술된 변이체 및 유도체를 부호화하는 변성 핵산을 포함하는 모든 핵산 뿐만 아니라 하나의 특정 단백질을 부호화하는 서열을 갖는 모든 핵산을 포함한다. 이와 같이, 각각의 특정 핵산 서열은 본원에 기재되어 있지 않지만, 각각의 그리고 모든 서열은 사실상 설명된 단백질 서열을 통해 본원에 설명되고 기술됨이 이해된다.
기술된 조성물 내로 혼입될 수 있는 많은 아미노산 및 펩티드 유사체가 있음이 이해된다. 예를 들어, D 아미노산 또는 천연 아미노산과 상이한 작용성 치환기를 갖는 아미노산이 많다. 펩티드 유사체의 입체 이성질체 뿐만 아니라 천연 펩티드의 상반된 입체 이성질체가 기술된다. 이들 아미노산은 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 충전시키고, 이용하는 유전적 조성물, 예를 들어 앰버 코돈을 가공하여 유사 아미노산을 자리 특이적 방식으로 펩티드 사슬 내로 삽입함으로써 펩티드 사슬 내로 쉽게 혼입될 수 있다 (최소한 아미노산 유사체에 관련된 물질에 대해 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Thorson 등, Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic engineering Reviews 13:197-216 (1995), Cahill 등, TIB, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678-682 (1994)]).
펩티드와 유사하지만, 천연 펩티드 결합을 통해 연결되지 않는 분자가 생성될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체에 대한 결합은 CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2 --, --CH=CH-- (시스 및 트랜스), --COCH2 --, --CH(OH)CH2-- 및 --CHH2SO를 포함할 수 있다 (이들 및 다른 것들은 본원에 참고문헌으로 인용된 하기 문헌에서 발견될 수 있다 : Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide backbone Modifications (General review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. 등, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola 등, Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis 및 trans); Almquist 등 J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White 등 Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke 등 European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Hollayl 등 Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); and Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S--)). 특히 바람직한 비-펩티드 결합은 --CH2NH--이다. 펩티드 유사체는 b-알라닌, g-아미노부티르산 등과 같은 결합 원자 사이의 하나를 초과하는 원자를 가질 수 있는 것으로 이해된다.
아미노산 유사체 및 유사체 및 펩티드 유사체는 종종 더 경제적인 생성, 더 높은 화학적 안정성, 향상된 약리학적 특성 (반감기, 흡수, 효능, 효과 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물 활성), 감소된 항원성 등과 같은 향상되고 바람직한 특성을 갖는다.
D-아미노산은 D 아미노산이 펩티다아제 및 유사물에 의해 인지되지 않기 때문에 더욱 안정한 펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 동일한 유형의 D-아미노산 (예를 들어, L-리신 대신에 D-리신)을 갖는 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의 계통적 치환이 더욱 안정한 펩티드를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 잔기는 2개 이상의 펩티드를 함께 고리화시키거나 부착하기 위해 사용될 수 있다. 이는 펩티드를 특정 구조 내로 구속하는 데에 유익할 수 있다 (본원에 참고문헌으로 인용된 문헌[Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)]).
12. 핵산
예를 들어 본원에 기술된 펩티드 양쪽성물질을 부호화하는 핵산을 포함하는 핵산에 근거한 다양한 분자가 본원에 기술되어 있다. 기술된 핵산은 예를 들어 누클레오티드, 누클레오티드 유사체, 또는 누클레오티드 치환체로 구성될 수 있다. 이들 및 다른 분자의 비제한적 예는 본원에 기술되어 있다. 예를 들어, 벡터가 세포 중에서 발현되는 경우, 발현된 mRNA는 대표적으로 A, C, G 및 U로 구성될 수 있음이 이해된다. 또한, 예를 들어 안티센스 분자가 예를 들어 외인성 전달을 통해 세포 또는 세포 환경 내로 도입되는 경우, 안티센스 분자는 세포 환경에서 안티센스 분자의 분해를 감소시키는 누클레오티드 유사체로 구성되는 것이 유리하다.
누클레오티드는 염기 잔기, 당 잔기 및 포스페이트 잔기를 함유하는 분자이다. 누클레오티드는 이들의 포스페이트 잔기 및 당 잔기를 통해 함께 결합되어 누클레오시드간 결합을 생성시킬 수있다. 누클레오티드의 염기 잔기는 아데닌-9-일 (A), 시토신-1-일 (C), 구아닌-9-일 (G), 우라실-1-일 (U) 및 티민-1-일 (T)일 수 있다. 누클레오티드의 당 잔기는 리보오스 또는 데옥시리보오스이다. 누클레오티드의 포스페이트 잔기는 오가 포스페이트이다. 누클레오티드의 비제한적 예는 3'-AMP (3'-아데노신 모노포스페이트) 또는 5'-GMP (5'-구아노신 모노포스페이트)이다. 당분야에 이용할 수 있고 본원에서 이용할 수 있는 이들 유형의 분자의 많은 변이체가 있다.
누클레오티드 유사체는 염기, 당 및/또는 포스페이트 잔기에 대한 변형물의 일부 유형을 함유하는 누클레오티드이다. 누클레오티드에 대한 변형물은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸시토신, 크산틴, 하이포크산틴 및 2-아미노아데닌, 및 당 또는 포스페이트 잔기에서의 변형물을 포함한다. 당분야에 이용할 수 있고 본원에서 이용할 수 있는 이들 유형의 분자의 많은 변이체가 있다.
누클레오티드 치환체는 펩티드 핵산 (PNA)과 같은, 누클레오티드와 유사한 작용기 특성을 갖지만 포스페이트 잔기를 함유하지 않는 분자이다. 누클레오티드 치환체는 왓슨-크릭 (Watson-Creek) 또는 훅스틴 (Hoogsteen) 방식으로 핵산을 인지할 것이만 포스페이트 잔기와는 상이한 잔기를 통해 함께 결합되는 분자이다. 누클레오티드 치환체는 적절한 표적 핵산과 상호작용할 경우에 이중 나선형 구조에 따를 수 있다. 당분야에 이용할 수 있고 본원에서 이용할 수 있는 이들 유형의 분자의 많은 변이체가 있다.
또한, 다른 유형의 분자 (콘쥬게이트)를 누클레오티드 또는 누클레오티드 유사체에결합시켜서, 예를 들어 세포 흡수를 향상시킬 수 있다. 콘쥬게이트는 누클레오티드 또는 누클레오티드 유사체에 화학적으로 결합될 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 콜레스테롤 잔기와 같은 지질 잔기를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다 (Letsinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556). 당분야에 이용할 수 있고 본원에서 이용할 수 있는 이들 유형의 분자의 많은 변이체가 있다.
왓슨-크릭 상호작용은 누클레오티드, 누클레오티드 유사체 또는 누클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 표면과 일회 이상의 상호작용이다. 누클레오티드, 누클레오티드 유사체, 또는 누클레오티드 치환체의 왓슨-크릭 표면은 푸린계 누클레오티드, 누클레오티드 유사체 또는 누클레오티드 치환체의 C2, N1 및 C6 위치 및 피리미딘계 누클레오티드, 누클레오티드 유사체 또는 누클레오티드 치환체의 C2, N3 및 C4 위치를 포함한다.
훅스틴 상호작용은 이중 DNA의 주요 그루브에 노출되는 누클레오티드 또는 누클레오티드 유사체의 훅스틴 표면 상에서 수행되는 상호작용이다. 훅스틴 표면은 푸린 누클레오티드의 C6 위치에서 N7 위치 및 반응성 기 (NH2 또는 O)를 포함한다.
본원에 기술된 신호화 경로에 수반되는 단백질 분자에 관련된 다양한 서열이 있으며, 이들은 모두 핵산에 의해 부호화되거나 핵산이다. 이들 유전자의 사람 유사체에 대한 서열, 및 이들 유전자의 다른 유사체, 및 이들 유전자의 대립유전자, 및 접합 변이체 및 다른 유형의 변이체가 유전자 은행을 포함하는 다양한 단백질 및 유전자 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 유전자 은행에서 본 출원을 출원할 때에 이용할 수 있는 서열은 이들의 입력에서 뿐만 아니라 그 안에 함유된 개별적 서열에 대해 참고로 인용되었다. 유전자 은행은 http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi에서 접근할 수 있다. 당업자들은 서열 불일치 및 차이점을 해결하고, 다른 관련된 서열에 대한 특정 서열에 관련된 조성물 및 방법을 조절하는 방식을 이해한다. 프라이머 및/또는 프로브는 본원에 기술되고 당분야에 공지된 정보를 제공하는 임의의 주어진 서열을 위해 설계될 수 있다.
C. ECM 모방 나노매트릭스를 제조하는 방법
또한, 본원에 기술된 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질의 자체-조직을 나노섬유 내로 유도하는 것을 포함하여, 내피 모방 나노매트릭스를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 자체-조직은 예를 들어, 고체 표면 상에 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질을 포함하는 액체 조성물을 건조시킴으로써 유도될 수 있다. 펩티드 양쪽성물질의 자체-조직을 유도하는 다른 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 기술된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직체는 이가 이온 (염화칼슘) 또는 pH에 의해 유도될 수 있다.
기술된 방법은 추가로, 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질을 산화질소와 반응시켜서 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드를 생성시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드는 서열 [K[N(O)NO-]]n을 포함할 수 있다. 일부 면에서, n은 1 내지 20이다. 일부 면에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상이다. 이와 같이, 디아제늄디올레이트-변형된 펩티드는 서열 [K[N(O)NO-]]5를 포함할 수 있다.
D. ECM 모방 나노매트릭스를 사용하는 방법
또한, 의료 기기를 본원에 기술된 내피 모방 나노매트릭스로 코팅시키는 것을 포함하는 방법이 기술되어 있다. 방법은 의료 기기 상에서 본원에 기술된 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질의 자체-조직을 나노섬유 내로 유도하는 것을 포함한다. 예를 들어, 방법은 의료 기기 상에서 하나 이상의 펩티드 양쪽성물질을 포함하는 액체 조성물을 건조시키는 것을 포함할 수 있다.
의료 기기 대상체의 체내에 사용하도록 공지되고 확인된 임의의 기기일 수 있다. 바람직하게는, 의료 기기 심혈관계 내로 삽입되는 기기이다.
의료 기기 외과용 이식체로서 사용하기에 적합한 임의의 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 의료 기기는 티탄 합금을 포함할 수 있다. 의료 기기는 코발트-크롬을 포함할 수 있다. 의료 기기는 니켈-티탄을 포함할 수 있다. 의료 기기는 생분해성 중합체를 포함할 수 있다.
일부 면에서, 의료 기기는 맥관 스텐트이다. 예를 들어, 스텐트는 일반 금속 스텐트일 수 있다. 일부 면에서, 스텐트는 약물 용리 스텐트이다. 예를 들어, 스텐트는 시롤리무스 용리 스텐트 또는 파클리탁셀 용리 스텐트일 수 있다.
일부 면에서, 의료 기기는 맥관 그라프트이다. 일부 면에서, 의료 기기는 카테터이다. 일부 면에서, 의료 기기는 페이스메이커이다. 일부 면에서, 의료 기기는 심장판막이다.
또한, 기술된 내피 모방 나노매트릭스 조성물이 추가로 하나 이상의 생물학적 활성제(들)을 포함할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 하나의 면에서, 내피 모방 나노매트릭스는 유효량의 하나 이상의 생물학적 활성제(들)을 포함할 수 있다.
또한, 기술된 내피 모방 나노매트릭스 조성물이 추가로 하나 이상의 약제학적 활성제(들)을 포함할 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 하나의 면에서, 내피 모방 나노매트릭스는 유효량의 하나 이상의 약제학적 활성제(들)을 포함할 수 있다.
E. 친수성 펩티드를 제조하는 방법
본원에 기술된 조성물 및 기술된 방법을 수행하기 위해 필요한 조성물은 다른식으로 특정게 기재하지 않는 한은 특정 시약 또는 화합물에 대해 당업자들에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
1. 펩티드 합성
서열 번호:1 내지 서열 번호:11과 같은 기술된 단백질을 생성시키는 하나의 방법은 2개 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 단백질 화학 기술에 의해 함께 결합시키는 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc (9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 또는 Boc (삼차-부틸옥시카르보닐) 화학을 사용하는 현재 이용될 수 있는 실험실 장치를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). 당업자는 기술된 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 예를 들어 표준 화학 반응에 의해 합성될 수 있음을 쉽게 인지할 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성될 수 있으며 이의 합성으로부터 분해될 수 없는 반면, 펩티드 또는 단백질의 다른 단편은 합성되고 후속적으로 수지로부터 분해되어, 나머지 단편 상에서 작용적으로 차단되는 말단기를 노출시킬 수 있다. 펩티드 축합 반응에 의해, 이들 2개의 단편은 각각 이들의 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통해 공유결합되어 항체 또는 이의 단편을 생성시킬 수 있다 (Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY (최소한 펩티드 합성에 관련된 물질에 대해 본원에 참고문헌으로 인용됨)). 대안적으로, 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이 독립적으로 생체내에서 합성된다. 단리되면, 독립적 펩티드 또는 폴리펩티드는 결합되어 유사한 펩티드 축합 반응을 통해 펩티드 또는 이의 단편을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 클로닝되거나 합성된 펩티드 세그먼트의 효소적 결찰은 비교적 짧은 펩티드 단편을 결합시켜서 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 완전 단백질 도메인을 생성킨다 (Abrahmsen L 등, Biochemistry, 30:4151 (1991)). 대안적으로, 합성 펩티드의 본래의 화학적 결찰이 이용되어 더 짧은 펩티드 단편으로부터 큰 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 구성할 수 있다. 상기 방법은 2단계 화학 반응으로 구성된다 (Dawson 등 Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 초기 공유 생성물로서 제 1 단계는 티오에스테르-결합 중간생성물을 제공하기 위한, 비보호 합성 펩티드--티오에스테르와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 또 다른 비보호 펩티드 세그먼트의 화학선택적 반응이다. 반응 조건의 변동 없이, 상기 중간생성물은 자발적인 빠른 분자내 반응을 일으켜서 결찰 자리에서 본래의 펩티드 결합을 생성시킨다 (Baggiolini M 등 (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I 등, J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark-Lewis I 등, Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K 등, Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
대안적으로, 비보호 펩티드 세그먼트는 화학적으로 결합되며, 여기에서 화학적 결찰의 결과로서 펩티드 세그먼트들 사이에서 생성되는 결합은 비천연 (비-펩티드) 결합이다 (Schnolzer, M 등 Science, 256:221 (1992)). 상기 기술은 충분한 생물학적 활성을 갖는 다량의 비교적 순수한 단백질 뿐만 아니라 단백질 도메인의 유사체를 합성하기 위해 사용되어 왔다 (deLisle Milton RC 등, Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Pres, New York, pp. 257-267 (1992)).
2. 핵산 합성
서열 번호:1 내지 서열 번호:11과 같은 기술된 단백질을 생성시키는 방법은 발현 조절 서열에 조작적으로 결합된 기술된 단백질을 부호화하는 핵산을 생성시키는 것이다. 이러한 핵산은 표준 화학 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있거나, 효소적 방법 또는 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법은 표준 효소적 분해 후의 누클레오티드 단편 단리 (참조예 : Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Pres, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6)으로부터 예를 들어 Milligen or Beckman System 1Plus DNA 합성기 (예를 들어, Milligen-Biosearch, Burlington, MA의 Model 8700 자동화 합성기 또는 ABI Model 380B)를 사용하여 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 의한 순수 합성 방법을 변동할 수 있다. 올리고누클레오티드를 제조하기 위한 방법은 또한 문헌[Ikuta 등, Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)] (포스포트리에스테르 및 포스파이트-트리에스테르 방법) 및 문헌[Narang 등, Methods Enzymol., 65:610-620 (1980)] (포스포트리에스테르 방법)에 의해 기술된다. 단백질 핵산 분자는 문헌[Nielsen 등, Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)]에 의해 기술된 것과 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
F. 펩티드 양쪽성물질을 제조하는 방법
또한, a) 분해 서열 및 내피 세포 부착성 서열 및 산화질소 생성 공여체 서열 중 하나 이상을 포함하는 친수성 펩티드를 제공하는 단계; 및 b) 친수성 펩티드의 N-말단을 소수성 잔기로 알킬화시키는 단계를 포함하는 펩티드 양쪽성물질을 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 추가 면에서, 알킬화는 소수성 카르복실산에 의한 아미드화를 포함할 수 있다. 소수성 카르복실산은 지방산일 수 있다. 지방산은 팔미트산일 수 있다.
기술된 양쪽성물질이 통상적인 합성 기술을 통해 소수성 잔기의 부착에 의해 제조도리 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 소수성 잔기는 친수성 펩티드의 N-말단에서 부착될 수 있다. 즉, 소수성 친전자성 화합물 (예를 들어, 알킬 할라이드, 카르복실산 화합물)은 N-말단에서 존재하는 아민 작용기와 반응하여 공유 결합 (예를 들어, 이차 또는 삼차 아민, 아미드)를 제공할 수 있다.
추가의 예에서, 소수성 잔기는 친수성 펩티드의 C-말단에서 부착될 수 있다. 즉, 소수성 친핵성 화합물 (예를 들어, 알코올, 아민, 티올)은 C-말단에서 존재하는 카르복실산 작용기와 반응하여 공유 결합 (예를 들어, 에스테르, 아미드, 티오에스테르)를 제공할 수 있다. 추가로, C-말단에서 존재하는 카르복실산 작용기가 반응 전에 유도체화되거나 환원될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 카르복실산 작용기는 환원되어 알코올을 생성시키고 후속적으로 하나 이상의 소수성 친전자성 화합물 (예를 들어, 알킬 할라이드, 카르복실산 화합물)과 반응하여 공유 결합 (예를 들어, 에테르, 에스테르)를 제공할 수 있다.
당업자들에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 펩티드 서열은 하나 이상의 펜던트 기를 갖는 펩티드 잔기를 포함할 수 있다. 다양한 면에서, 펜던트 기는 하나 이상의 친핵성 잔기 (예를 들어, 아민, 히드록실, 티올) 또는 하나 이상의 친전자성 잔기 (예를 들어, 카르복실산 작용기)를 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 기술된 친수성 펩티드의 N-말단 및 C-말단에 대해 상기 기술된 것과 유사한 방식으로 반응할 수 있다.
본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 첨부 도면은 기술된 방법 및 조성물의 수가지 구현을 예시하며, 설명과 함께 기술된 방법 및 조성물의 원리를 예시하는 것이다.
도 1은 재협착의 메카니즘 및 시각표를 도시한 것이다. 혈관내막 증식이 일반 금속 스텐트 (BMS)에서의 재협착의 주된 원인이다 (Dobesh, P. P. 등 (2004). Pharmacotherapy. 24(11): 1554-77).
도 2A는 디아제늄디올레이트의 화학 구조를 도시한 것이다. 도 2B는 친핵성 아민 (X-)과 NO의 반응에 의한 디아제늄디올레이트의 생성을 도시한 것이다. 도 2C는 유리 NO를 방출시키기 위한 양성자화에 대한 다아조늄디올레이트의 해리를 도시한 것이다. 도 2D는 리신의 구조를 도시한 것이다. 이는 NO 결합을 위한 2개의 펜던트 아민기를 갖는다.
도 3은 PA의 분자 구조를 도시한 것이다. YIGSR (서열 번호:2)는 세포 부착성 리간드이고, KKKKK (서열 번호:3)은 NO 공여체이다.
도 4는 증발 유도 자체-조직화 나노섬유의 TEM 이미지를 도시한 것이다. PA-YIGSR (A), PA-KKKKK (B), PA-YK (C) 및 PA-YK-NO (D)가 도시되어 있다.
도 5는 PA-YK (9:1 몰비의 PA-YIGSR 및 PA-KKKKK) 나노매트릭스에 대한 HUVEC 및 AoSMC의 초기 부착을 도시한 것이다. 세포 부착은 유리에 대한 부착의 수준으로 정상화된다. *HUVEC는 2 시간 후에 AoSMC 보다 현저히 더 높은 부착을 나타낸다 (p<0.05). 오차 막대는 n=12에 대한 평균 ±표준편차를 나타낸다.
도 6은 PA-YK 코팅에 대한 HUVEC 및 AoSMC의 초기 퍼짐을 도시한 것이다. *HUVEC는 2 시간 후에 AoSMC 보다 현저히 더 높은 퍼짐을 나타낸다 (p<0.01). 오차 막대는 n=12에 대한 평균 ±표준편차를 나타낸다.
도 7은 칼세인(Calcein) AM을 사용하는, 2 시간 후의 PA-YK에 대한 HUVEC 및 AoSMC의 형광 이미지를 도시한 것이다. 도 7A는 HUVEC가 2 시간 내에 이들의 규칙적 퍼짐 형태를 달성함을 나타낸다. 도 7B는 AoSMC의 형태가 둥글게 유지됨을 나타낸다.
도 8은 15분 동안 사람 혈액에 의한 인큐베이션 후에 콜라겐, PA-YK 및 PA-YK-NO 나노매트릭스에 대한 혈소판 부착을 도시한 것이다. 혈소판 부착은 PA-YK 또는 콜라겐 I-코팅 막과 비교하여 PA-YK-NO 막에 대해서 현저히 더 낮다. 데이터는 3개의 샘플의 평균을 나타낸다. 오차 막대 평균 ± 표준편차를 나타낸다 (*: 콜라겐 I과 비교하여 p < 0.05; #: PA-YK와 비교하여 p < 0.05).
도 9는 PCNA 염색에 의해 정량적으로 평가하여, 48 시간 후에 PA-YK 및 PA-YK-NO 나노매트릭스 상에 씨딩된 HUVEC 및 AoSMC의 증식을 도시한 것이다. PA-YK-NO는 HUVEC 증식을 향상시키지만, AoSMC 증식을 감소시킨다. 결과는 PCNA 양성 세포의 %로서 표현되었다. 데이터는 4개의 샘플의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± 표준편차를 나타낸다 (*, #: p < 0.05).
도 10은 pH 7.4, 37℃에서 HBS 중에서의 PA-YK-NO 막으로부터의 NO 방출을 도시한 것이다. 총 NO의 53%가 방출되었으며, 이는 1개월에 걸친 다상성 프로파일을 나타내는 것이다. 데이터는 4개의 샘플의 평균을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 11은 나노매트릭스에 의한 스텐트 코팅 기술을 개략적으로 도시한 것이다.
도 12는 임상의에 의한 취급 후에 0.1 중량% PAYK 코팅 스텐트의 SEM 이미지를 도시한 것이다. 취급 (혈관확장 풍선 상에 고정 및 팽창) 후에 온전 상태로 유지되는 매끄러운 균일한 코팅 표면이 주목된다.
도 13a는 토끼 장골 동맥에 스텐트를 배치하기 위한 풍선 팽창을 도시한 것이다. 도 13b는 이식 4 주 후에 1 중량% 나노매트릭스 코팅 스텐트의 조직 절편을 도시한 것이다. 나노매트릭스 코팅 스텐트의 표면에서 신생혈관내막 과형성은 거의 발견되지 않았으며, 혈전은 발견되지 않았다.
도 14는 2 주에서의 신생혈관내막 두께를 도시한 것이다. 대조군과 비교하여 고투여량 스텐트에서 NI 두께가 더 작아지려는 명백한 경향이 관찰되었다. N = 군당 2개 스텐트.
도 15는 4 주에서의 신생혈관내막 두께를 도시한 것이다. NI는 대조군과 비교하여 2 주에서 더 크지만, 저투여량 및 고투여량 군 둘 모두에서 NI가 더 작아지려는 경향이 지속되는 것으로 보인다. N = 군당 2개 스텐트.
도 16은 2 주에서 염증 스코어를 도시한 것이다. 모든 연구 군에 대한 평균 염증 스코어는 0.5 미만이었다. N = 군당 2개 스텐트.
도 17은 4 주에서 염증 스코어를 도시한 것이다. 모든 연구 군에 대한 평균 염증 스코어는 0.5 미만이었다. N = 군당 2개 스텐트.
도 18은 4 주에서 혈전 스코어를 도시한 것이다. 평균 혈전 스코어는 모든 연구 군에 대해 0.1 미만이었으며, 군들 사이에 현저한 차이는 없었다. N = 군당 2개 스텐트.
도 19는 NO 방출 하이브리드 생체모방 나노매트릭스의 제작을 도시한 것이다. 도 19A는 직경이 8 nm인 NO 방출 펩티드 양쪽성물질 PA-YK-NO이 직경이 300-500 nm인 ePCL 나노섬유 상에 코팅되어 하이브리드 나노매트릭스 ePCL-PA-YK-NO를 생성시킴을 나타낸다. 도 19B는 YIGSR 리간드의 존재 및 NO의 방출이 내피 세포의 부착, 퍼짐 및 증식을 촉진시키면서, 평활근 세포의 부착, 퍼짐 및 증식을 제한함을 나타낸다.
도 20은 5000x에서의 하이브리드 나노매트릭스의 SEM 이미지를 도시한 것이다. (A) ePCL. (B) ePCL+PA-YK. (C) ePCL+PA-YK-NO.
도 21은 67000x에서의 하이브리드 나노매트릭스의 TEM 이미지를 도시한 것이며, 이는 성공적인 자가 조직을 나타내는 것이다. (A) ePCL. (B) ePCL+PA-YK. (C) 21o로 경사진 ePCL+PA-YK, (D) ePCL+PA-YK-NO. (E) 21o로 경사진 ePCL+PA-YK-NO.
도 22는 HUVEC 부착이 PA-YIGSR의 농도의 증가에 따라 증가함을 나타낸다. ePCL-PA-YK75 (*) 및 ePCL-PA-YK90 (#)는 ePCL-PA-YK50, ePCL-PA-YK25 및 ePCL과 비교하여 증가된 HUVEC 부착을 나타내었다.
도 23은 28 일에 걸친 NO 방출 프로파일을 도시한 것이다.
도 24는 (A) ePCL, (B) ePCL-PA-YK, (C) ePCL-PA-YK-NO에 대한 2 시간에서의 HUVEC 형태를 도시한 것이다. 스케일 바아 = 20㎛.
도 25는 (A) ePCL, (B) ePCL-PA-YK, (C) ePCL-PA-YK-NO에 대한 2 시간에서의 AoSMC 형태를 도시한 것이다. 스케일 바아 = 20㎛.
도 26은 2 시간에서의 하이브리드 나노매트릭스에 대한 세포 부착을 도시한 것이다. HUVEC는 ePCL과 비교하여 (*) ePCL+PA-YK 및 (#) ePCL-PA-YK-NO에 대해 현저히 증가된 부착을 나타내었다.
도 27은 하이브리드 나노매트릭스 상에서의 증식 세포의 %를 도시한 것이다. HUVEC는 ePCL+PA-YK(*)와 비교하여 ePCL+PA-YK-NO에 대해 현저히 더 높은 증식을 나타내었다. AoSMC는 ePCL+PA-YK(#)와 비교하여 ePCL+PA-YK-NO에 대해 현저히 더 낮은 증식을 나타내었다.
G. 실시예
하기의 실시예는 본원에 청구되는 화합물, 조성물, 물품, 기기 및/또는 방법이 이루어지고 평가되는 방식의 완전한 설명 및 기술을 당업자들에게 제공하도록 기재되었으며, 순수하게 대표적인 것으로 의도되며, 설명을 제한하도록 의도되지 않는다. 값 (예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하려는 시도가 이루어지고 있지만, 일부 일부 오차 및 편차가 고려되어야 하다. 다른식으로 제시되지 않는 하, 부는 중량부이고, 온도는 ℃ 또는 주변 온도이며, 압력은 대기압 또는 근대기압이다.
1. 실시예 1:
i. 물질 및 방법
a. 펩티드 양쪽성물질의 합성
세포-부착성 서열 YIGSR (서열 번호:2) ("PA-YIGSR") 또는 NO 공여체 서열 KKKKK (서열 번호:3) ("PA-KKKKK")를 갖는 MMP-2 민감성 서열 (GTAGLIGQ; 서열 번호:1)로 구성된 2개의 13-아미노산 펩티드를 Advanced Chemtech Apex 396 펩티드 합성기에서 표준 Fmoc-화학을 사용하여 합성하였다. 펩티드의 N-말단을 실온에서 12시간 동안 디메틸포름 (DMF) 중에서 2 당량의 팔미트산, 2 당량의 o-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 및 4 당량의 디이소프로필에틸아민 (DiEA)와 반응시킴으로써 알킬화를 얻었다. 알킬화 반응을 반복한 후에, PA의 분열 및 탈보호를 실온에서 3시간 동안 90:1:1:1의 비의 트리플루오로아세트산 (TFA), 탈이온 (DI) 수, 트리이소프로필실란 및 아니솔의 혼합물을 사용하여 수행하였다. 용액을 회전 증발기를 사용하여 농축시켰다. PA를 냉각 에테르 중에서 침전시키고, 수집하고, 진공하에 건조시켰다. 미정제 PA를 2 중량%의 농도로 탈이온수 중에 용해시켰다. PA를 매트릭스-보조 레이저 흡착 이온화 비행시간형 (MALDI-TOF) 질량 분석법에 의해 분석하였다.
b. 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지화
TEM 샘플에 대해, 5 ㎕의 각각의 0.1 중량% PA 수용액을 탄소 코팅 폼바 (formvar) 구리 그리드 (400 메쉬) 상에서 캐스팅하였다. 상기 그리드를 밤새 건조시켰다. 이미지화 전에, 건조된 샘플을 30초 동안 10 ㎕의 20% 포스포텅스텐산 (PTA)으로음성적으로 염색하였다. 샘플을 60 kV 가속전압에서 FEI Tecnai T12 TEM 현미경 상에서 이미지화하였다 (42000x, 52000x).
c. 나노섬유으로의 펩티드 양쪽성물질의 자체-조직
PA-YIGSR 및 PA-KKKKK에 대한 0.1 중량%의 원료 용액을 탈이온수 (pH 7.4) 중에서 제조하고, 및 9:1의 몰비로 혼합시켰다 ("PA-YK"). 웰당 50 ㎕의 PA-YK 용액을 유리커버슬립에 부착된 12-웰 실리콘 flexiPERM 세포-배양 챔버 내에 넣었다. 챔버를 24 시간 동안 화학적 발연 후드 내에 넣어서 용매 증발에 의해 자체-조직을 유도하였다. 챔버를 추가로 37℃ 인큐베이터 내에서 또 다른 48 시간 동안 건조시켰다.
d. 세포유지
사람 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)를 내피 성장 배지 (EGM) 완전 배지 (0.1% 젠타마이신/암포테리신 B) 중에서 성장시켰다. 상기 세포 배지를 모든 HUVEC 실험에 사용하였다. 세포를 트립신화 (0.05% 트립신/EDTA)에 의해 통과시키고, 2500-5000 세포/㎠의 밀도로 이차 배양시켰다. 사람 대동맥 평활근 세포 (AoSMC)를 평활근 세포 기본 배지 (SmBM) SingleQuot®Kit 완전 배지 (0.1 % 젠타마이신/암포테리신 B) 중에서 성장시켰다. 상기 세포 배지를 모든 AoSMC 실험에 사용하였다. 세포를 트립신화 (0.05% 트립신/EDTA)에 의해 통과시키고, 3500 세포/㎠의 밀도로 이차 배양시켰다. 모든 세포 배양액을 표준 배양 조건 하에서 유지시켰다 (37℃, 95% 상대 습도, 및 5% CO2). 모든 세포 및 배지를 Lonza Inc. (Walkersville, MD)로부터 구입하였다.
e. PA-YK 나노매트릭스 상에서의 HUVEC 및 AoSMC의 초기 부착 및 퍼짐
PA-YK 나노매트릭스 코팅 배양 챔버를 본원에 기술된 바와 같이 제조하였다. 초기 세포 부착을 위해, HUVEC 및 AoSMC를 각각 30,000 세포/㎠ 및 15,000 세포/㎠의 밀도로 PA-YK 나노매트릭스 코팅 배양 챔버 상에 씨딩하였다. 2 시간의 인큐베이션 후에, 세포를 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Molecular Probe, Eugene, OR)을 사용하여 칼세인 AM 녹색 형광 염료 및 에티듐 호모다이머-1 적색 형광 염료로 염색하였다. 시계 (20 x) 당 부착된 세포의 수를 형광 현미경 (Nikon Eclipse E2000)을 사용하여 결정하였으며, 5개의 랜덤 시계를 평균냄으로써, 샘플에 대해 평균내었다. 개별적 세포 퍼짐을 이미지 공정 소프트웨어 (NIS-elements AR 2.30)에 의해 분석하였다.
f. PA-YK 및 PA-YK-NO 나노매트릭스 상의 혈소판 부착
PA-YK 및 PA-YK-NO 용액을 본원에 기술된 바와 같이 제조하고, 및 150 ㎕의 용액을 13 mm 순환 유리 커버 슬립 상에 적가함으로써 막으로 주조하였다. 2.5 mg/ml 콜라겐 I의 용액을 3% 빙초산 중에서 제조하고, 대조군 표면으로 작용하는 것과 동일한 방식으로 막으로 주조하였다. 건강한 지원자의 전혈을 BD Vacutainer® Heparin Tubes (BD, NJ) 내에 수집하고, 10uM 메파크린과 혼합시켜서 혈소판을 형광적으로 표지하였다. 실험 전에, PA-YK, PA-YK-NO, 및 콜라겐 막을 PBS로 세정하였다. 그 후에, 콜라겐 I, PA-YK, PA-YK-NO 막을 15분 동안 37℃에서 메파크린-표지화 혈액과 분리적으로 인큐베이팅시킨 후, PBS로 세정였다. 시계 (40x)당 부착 혈소판의 수를 샘플당 5개의 랜덤 시계를 평균냄으로써 형광 현미경 (Nikon Eclipse E2000)을 사용하여 결정하였다.
g. 세척된 NO의 제조
우선, NO 용액을 세척할 수 있다. 세척은 기체를 큰 표면적의 액체를 통해 통과시켜서 기류로부터 원하지 않는 불순물을 제거하는 공정이다. 상기 경우에, 시판용 산화질소 를 원하지 않는 고급 산화질소 종을 용해시키는 알칼리성 용액을 통해 통과시켰다. 도 4에 도시된 장치를 먼저 아르곤으로 탈기시켰다. NO를 5 M NaOH 용액을 통해 세척하고 및 PA-YK 용액을 함유하는 반응용기 내에 수집하였다.
h. NO 방출 나노매트릭스 (PA-YK-NO)의 합성
"PA-YK-NO"를 PA-YK를 아르곤 기체 하에 세척된 NO와 반응시킴으로써 합성시켰다. 0.1 중량% PA-YK 수용액을 실온에서 아르곤 기체 하에 100 mL 둥근 바닥 플라스크 내에서 세척된 NO 용액과 밤새 반응시켰다. 생성된 PA-YK 용액을 13mm 유리 커버 슬립 상에서 130 ㎕를 적가함으로써 막으로 주조하였다. 막을 첫 번째 24 시간 동안 화학적 발연 후드에서 그리고 다음 48 시간 동안 37℃에서 건조시켰다. NO 방출 프로파일을 결정하기 위해, 각각의 PA-YK-NO 막을 24 웰 조직 배양 플레이트 (Corning Inc., Corning, NY) 내에서 500 ㎕의 HBS 중에서 인큐베이팅시켰다. HBS를 수집하고, 동결시키고 (-20℃), 1 개월을 초과하는 상이한 시점에서 새로운 HBS로 교체하였다. PA-YK-NO 나노매트릭스로부터의 NO 방출을 확인하고, 술파닐아미드 및 N-1 나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드을 함유하는 그레이쓰 어쎄이 (Greiss assay) (Promega, WI)를 사용하여 정량화시켜서, NO.56의 주요 분해 생성물인 아질산염 함량을 측정하였다. 5일의 종료시에, 각각의 수집된 샘플을 100㎕의 그레이쓰 시약과 혼합시켰다. 실온에서 15분 동안의 인큐베이션 후에, 샘플을 흡수도 마이크로플레이트 판독기 (EL x 800, BIO-TEK Instrument, VT)를 사용하여 540 nm에서 판독하였다.
i. PA-YK-NO 나노매트릭스 상에서의 HUVEC 및 AoSMC의 증식의 평가
PA-YK-NO 및 PA-YK 막을 본원에 기술된 바와 같이 제조하고, 4 시간 동안 UV 하에서 살균시켰다. HUVEC 및 AoSMC의 증식을 세포핵 항원 (PCNA) 염색을 증식시킴으로써 평가하였다. PCNA는 세포 증식의 개시에서 역할을 하는 핵에서 발견되는 36 kDa 비-히스톤 단백질이다. 세포 주기의 후기 S 단계 동안의 핵소체 중의 이의 현저한 존재는 이를 세포 증식에 대한 이상적 마아커로 만든다. HUVEC 및 AoSMC를 각각 30,000 세포/㎠ 및 15,000 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 세포를 표준 배양 조건 (37℃, 95% 상대 습도 및 5% CO2) 하에서 인큐베이팅시켰다. 48 시간의 인큐베이션 후에, 세포를 10% 중성 완충 포르말린 용액 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 중에 고정시키고, PBS로 세정하였다. 그 다음, 세포를 조직학적 등급 메탄올 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 중에서 인큐베이팅시킨 후에 PBS로 세정함으로써 투과시켰다. 3% 과산화수소 용액을 사용하여 내인성 퍼옥시다아제를 차단시켰다. PBS로 세정한 후에, 세포를 트리스-완충 식염으로 인큐베이팅시킨 후, 3% FBS를 사용하여 인산염-완충 식염 (PBS) 중에서 1:100으로 희석시킨 마우스 IgG 항-PCNA 일차 항체 (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시켰다. 일차 항체를 흡인시키고 PBS로 세정한 후에, 세포를 3% FBS를 사용하여 PBS 중에서 1:100으로 희석시킨 항-마우스 IgG HRP (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시킨 후에, 아미노에틸카르바졸 색원체 (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시켰다. 색원체는 증식 세포를 나타내는 적색 침전물을 생성시킨다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 마이어 (Mayer) 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 과량의 헤마톡실린을 샘플을 37mM 수산화암모늄으로 2-3 회 세정함으로써 세척해내었다. 시계 (20 X) 당 증식 세포의 비율을 샘플당 5개의 시계를 평균낸 후에 상 대비 현미경 (Nikon Eclipse E2000)을 사용하여 적색 증식 세포 및 헤마톡실린 염색 청색 비증식 세포를 계수함으로써 결정하였다.
j. 통계적 분석
모든 데이터를 SPSS 소프트웨어를 사용하여 일방 ANOVA 시험으로 비교하였다. 0.05 미만의 값이 통계적으로 현저한 것으로 고려되었다.
ii. 결과
a. 나노섬유 내로의 펩티드 양쪽성물질의 자체-조직
PA-YIGSR 및 PA-KKKKK를 성공적으로 합성시켰으며, 이들의 분자량을 MALDI-Tof 질량 분석법에 의해 확인하였다. PA-YIGSR 및 PA-KKKK ("PA-YK")의 하이브리드 펩티드 양쪽성물질을 PA-YIGSR 및 PA-KKKKK의 0.1 중량% 용액을 9:1의 몰비로 혼합시킴으로써 합성시켰다. 나노섬유 내로의 PA의 자체-조직을 상기 기술된 바와 같이 용매를 증발시킴으로써 유도하였다. NO 방출 PA-YK-NO를 아르곤 하에서 PA-YK를 NO와 반응시킴으로써 합성시켰다. TEM 이미지 (도 4)는 용매 증발에 의한 성공적인 나노섬유 내로의 PA의 자체-조직을 입증하였다. 얻어진 나노섬유는 이가 이온 또는 pH 변동을 사용하는 자체-조직 연구에서 이전에 보고된 것과 치수가 유사하였다.
b. 초기 세포 부착 및 퍼짐의 평가
HUVEC 및 AoSMC 둘 모두를 PA-YK 나노매트릭스 상에 분리적으로 씨딩하고, 세포 부착을 내피 세포가 나노매트릭스에서 부착성 리간드 YIGSR을 인지하는 지를 결정하기 위해 평가하였다. HUVEC의 초기 부착은 AoSMC과 비교하여 약간 더 높은 것으로 밝혀졌다 (도 5). 이를 2 시간 후에 PA-YK 나노매트릭스 상에서의 HUVEC 및 AoSMC의 퍼짐을 평가함으로써 확인하였다 (도 6 및 7). 2 시간 후에, HUVEC는 AoSMC보다 3배 더 퍼짐되는 것으로 밝혀졌다. 결과는 HUVEC가 PA-YK 내로 혼입된 YIGSR을 인지할 수 있음을 나타내며, 이는 PA-YK 나노매트릭스가 HUVEC 부착 및 퍼짐을 조장함을 나타내는 것이다.
c. PA-YK 나노매트릭스 상의 혈소판의 부착의 평가
PA-YK-NO 및 PA-YK 나노매트릭스 상의 혈소판 부착을 메파크린-표지 전혈을 사용하여 평가하였다. 혈소판 부착은 포지티브 대조군 콜라겐 I과 비교하여 PA-YK 나노매트릭스 상에서 약 50배 더 낮았다. 더욱더, NO 방출 PA-YK-NO 나노매트릭스에 대한 혈액의 노출은 사실상 혈소판 부착을 결과하지 않았다 (도 8)
d. PA-YK-NO 나노매트릭스로부터의 NO 방출
1 개월을 초과하는 기간에 걸쳐 PA-YK-NO 나노매트릭스로부터의 NO 방출 프로파일을 도 10에 도시하였다. NO의 대부분은 첫 번째 24 시간 내에 방출된 후, 2 주를 초과하는 기간에 걸쳐 서서히 지속적으로 방출된 후에, 또 다시 연속 방출되어 53% NO의 회수를 결과하였다. 100% NO의 값 (8.6 μmol)을 PA-YK 중의 모든 리신 잔기가 NO의 2개의 분자와 반응함을 가정하여 계산하였다.
e. PA-YK-NO 나노매트릭스 상의 HUVEC 및 AoSMC의 증식의 평가
HUVEC 및 AoSMC에 대한 NO의 효과를 시험하기 위해, 세포 PA-YK-NO 나노매트릭스 코팅 배양 챔버 상에 씨딩하였다. 세포의 증식을 48 시간의 인큐베이션 후에 PCNA 염색을 사용하여 평가하였다. 유사한 증식 실험을 또한 대조로서 PA-YK 나노매트릭스 상에서 수행하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, PA-YK-NO에 대한 PCNA 양성 HUVEC의 비율 (66.8±94)%)는 PA-YK ((50.29±3.4)%)와 비교하여 현저히 높은 것으로 밝혀졌다. 반대로, PA-YK-NO에 대한 PCNA 양성 AoSMC의 비율 ((16.4±2.8)%)는 PA-YK ((34.8±1.9)%)에 대해서보다 현저히 더 낮았다.
2. 실시예 2: 천연 내피 모방 자체-조직 나노매트릭스의 생체내 평가
자체-조직 나노매트릭스 코팅 스텐트를 토끼 장골 동맥에 이식하고, 협착 및 혈전에 대한 증거를 위해 조직형태학적 측정에 의해 평가하였다.
i. 물질 및 방법
a. 스텐트 코팅 및 특징화
PA 용액에 의한 균일한 코팅을 위해, 시판용 스테인레스강 스텐트를 15 rpm의 속도록 회전하는 모터에 부착된 맨드릴 (스테인레스강 와이어 - 0.018 인치 직경) 상에 고정시켰다. 회전 스텐트를 도 11에 도시된 바와 같이 원톱 수용기 내에 함유된 PA 용액 중에 침지시켰다. 원톱 수용기는 스텐트의 표면 상에서 나노매트릭스로의 PA의 증발 유도 자체-조직을 용이하게 한다. 스텐트의 회전은 스텐트의 외부 및 내부 표면 전체에 걸쳐 PA 나노섬유의 균일한 코팅을 보장한다. 스텐트의 양말단에서의 마개는 스텐트가 맨드릴 위로 미끄러지는 것을 방지한다. 스텐트를 12 시간동안 PA 용액 중에서 회전시킨 후, 추가로 24 시간 동안 회전시켰다. 도 12는 임상의에 의한 취급 후에 0.1 중량% PAYK 코팅 스텐트의 SEM 이미지를 나타낸다. 매끄러운 균일한 코팅 표면이 취급 (혈관 형성 풍선 상에 고정 및 팽창) 후에 변형되지 않고 유지됨이 유의된다. 이 결과는 PA 나노매트릭스가 스텐트 상에 균일하게 코팅되고 취급 과정 동안 안정하게 유지될 수 있음을 제시한다.
b. 생체내 평가에 대한 연구 그룹
뉴질랜드 토끼 수컷을 본 연구에 사용하였다. 토끼당 2개이 스텐트가 이식된 그룹당 하나의 토끼를 사용하였다. 2가지 상이한 나노매트릭스 코팅 및 1개의 비코팅 일반 금속 스테인레스강 스텐트가 평가되었다. 각각의 스텐트 유형을 하기와 같이 2 주 및 4 주에서 평가하였다 : 대조군 (일반 금속 스텐트) 2 주, 4 주; 저투여량 (0.1 중량% PAYKNO 코팅) 2 주, 4 주; 및 고투여량 (1 중량% PAYKNO 코팅) 2 주, 4 주. 2 주 시점 동안, 스텐트를 모두 사전 팽창 손상 없이 이식하였다. 모든 토끼를 수술 전 2일 이상 동안 가두었다. 수술 프로토콜은 버밍험에 있는 알라바마 대학에서 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)에서 승인받았으며, 하기에 기술되어 있다.
c. 스텐트 이식
수술일에, 토끼를 케타민/크실라진 35/5 mg/kg으로 마취시켰다. 기관내관을 삽입하고, 분당 16 호흡의 속도로 400 ml의 조수 부피로 작동되는 인공호흡장치에 연결시켰다. 마취를 이소플루란 2%으로 지속시켰다. 심박동수 및 혈액 산소 포화를 동물의 현에 위치한 맥박산소계측기를 사용하여 관측하였다. 혈압을 뒷다리 상의 커프를 사용하여 연속적으로 관측하였다. 토끼를 배횡와위등 위치에서 테이블에 고정하였다. 81 mg/일의 아스피린을 안락사시킬 때까지 수술 전일에 시작하여 매일 입에 의해 제공하였다.
우측 경동맥을 외과적으로 노출시키고 혈관통로를 얻었다. 6개의 프렌치 시쓰 (French Sheath)를 경동맥 내에 삽입하고, 헤파린 (150 단위/kg)을 정맥내 투여하였다. 형광 투시경 하에서, 6개의 프렌치 JR4 관상동맥 유도 카테터를 0.014인치 관상동맥 유도 와이어 위로 하행대동맥까지 전진시켰다. 혈관조영술을 카테터를 통해 주입되는 약 8 cc의 메글루민 디아조트로에이트 대비제를 사용하여 수행하였다. 기저 동맥 조영도를 디지털 방식으로 기록하였다. 혈관조영술 후에, 운반 풍선 상에 고정된 스텐트를 유도 와이어 위로 하나의 장골 동맥 내로 전진시켰다. 스텐트를 1.1 대 1의 스텐트 대 동맥 비로 약간 과대 크기가 되도록 전개하였다. 제 2 스텐트를 나머지 장골 동맥에서와 유사한 방식으로 전개시켰다. 스텐트 이식 후에, 카테터, 유도 와이어 및 동맥 시쓰를 제거하였다. 경동맥을 결찰시켰다. 상처를 봉합하였다. 동물을 관찰 하에 회복되도록 하였다. 부프레넥스 (0.05 mg/kg)을 수술의 완결시에 출발하여 매 12 시간 마다 정맥내 투여하였다.
동물을 임의의 유의할 만한 식욕 손실/중량 손실 (20%를 초과하는 체중 손실), 및 하지에서의 혈액 순환에 대해 매일 관측하였다.
d. 스텐트 수확
스텐트 이식 2 주 및 4 주 후에, 안락사를 수행하고, 스텐트 삽입 장골 동맥을 포르말린으로 고정하여 가압 관류시켰다. 스텐트를 제거하고, 조직학적 연구를 위해 10% 완충 포르말린 중에 넣었다.
e. 조직 가공
모든 고정된 스텐트를 탈수시키고, 메틸메타크릴레이트 수지 중에 삽입하였다. 완전한 중합 후에, 관심있는 영역을 예비 분쇄에 의해 표면에 더 근접하게 하였다. 블록의 반대 측면을 Technovit 4000 (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK)을 사용하여 슬라이드 상에 고정시켰다. 단면 (약 100 마이크론 두께)을 이는 수냉각 및 수세용 시스템을 갖는 다이아몬드 코팅 절단띠를 이용하는 큰 띠톱관 어느정도 유사한 Exakt Diamond Saw (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK)를 사용하여 각각의 시편으로부터 절단시켰다. 단면을 정밀한 평행 표면을 발생시키고 사포의 증가 그릿을 사용하여 매끄럽게 하는 Exakt Grinding System (Exakt Technologies, Inc., Oklahoma City, OK)로 약 20-30㎛로 분쇄시켰다. 연구하려는 시편의 표면에 도달한 후에, 이를 4000 그릿 사포로 연마시켜서 가능한 한 매끄러운 표면을 발생시켰다. 단면을 스텐트의 25%, 50% 및 75% 영역으로 만들었다. 모든 단면을 Methylene Blue/Basic Fuchsin 염료로 염색시켰다.
조직학적 분석은 손상, 혈전 생성, 염증, 및 신생내막이 존재를 포함하였다. 스텐트 삽입 세그먼트를 분석하고, 쉬바르츠 (Schwartz) 손상 스코어를 사용하여 동맥 손상에 대해 등급화하였다. 염증 및 혈전을 또한 등급 스케일로 각각의 스트러트 둘레에서 평가하였다. 각각의 스트러트에서 신생내막 두께를 마이크론 단위로 측정하였다. 컴퓨터 유도된 형태 측정을 디지털 이미지 및 Bioquant 이미지 분석 소프트웨어 (Bioquant Image Analysis Corp, Nashville, TN)를 사용하여 수행하였다. 전산화된 면적 측정을 수행하였다.
ii. 결과
도 13a는 풍선 팽창이 토끼 장골 동맥에서 스텐트를 성공적으로 전개시킴을 나타낸다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 스텐트를 전체적으로 충분히 전개시키고, 치소 하부 조직 손상이 있다. 혈관은 온전하고 이용가능하였다. 나노매트릭스 코팅의 박리 및 벗겨짐은 관찰되지 않았다. 최소 염증이 스텐트 스트러트 둘레에서 발견되엇다. 현저하게, 신생내막 과형성은 거의 없고, 나노매트릭스 코팅 스텐트의 표면에서 혈전은 발견되지 않았다.
손상 스코어를 각각의 스텐트 스트러트 하기와 같이 0 으로부터 3으로 분할하였다 : 0 = 비손상; 1 = 내부 탄성 막에서의 파괴; 2 = 중막의 천공, 및 3 = 외막으로부터의 외부 탄성 막의 천공.
각각의 세그먼트에 대한 평균 손상 스코어를 시험된 단면에서 손상 스코어의 합을 스트러트의 총수로 나눔으로써 계산하였다. 4 주 그룹에서의 대조 스텐트 (평균 손상 스코어 ~0.02)를 제외하고, 임의이 스텐트에서 손상의 징후는 관찰되지 않았다.
신생내막 두께 (NI)를 마이크론 단위로 측정하였다. 도 14에 도시된 바와 같이 2 주에서, 대조군과 비교하여 고투여량 스텐트에서 NI 두께가 더 얇아지려는 경향이 있는 것으로 보인다. 도 15에 도시된 바와 같이 4 주에서 NI는 2 주에서보다 더 두껍지만, 저투여량 및 고투여량 그룹 둘 모두에서 NI가 더 얇아지려는 경향은 대조군과 비교하여 지속되는 것으로 보인다.
각각의 스트러트 둘레의 염증을 하기의 등급 스케일을 사용하여 평가하였다 : 0 = 스트러트를 둘러싸는 염증 없음; 1 = 스트러트를 둘러싸는 가벼운 비원주형 림프구 조직구성 세포 침윤; 2 = 스트러트를 비원주형으로 둘러싸는 편재된 완만 내지 조밀한 세포 응집; 및 3 = 스트러트의 원주형의 조밀한 림프구 조직구성 세포 침윤.
모든 연구 그룹에 대한 평균 염증 스코어는 4 주 스텐트 그룹에 대해 2 주 그룹의 임의의 것에서 현저한 차이 없이 0.5 이었다. 또한, 염증 스코어는 도 16 및 17에 도시된 바와 같이 2 주 및 4 주 그룹 둘 모두에 대해 유사한 것으로 밝혀졌다.
각각의 스트러트를 둘러싸는 혈전 스코어를 0으로부터 3으로 매겼다. 2 주에, 모든 스텐트에서 혈전이 최소이거나 발견되지 않았다. 4 주에서, 평균 혈전 스코어는 그룹들 사이의 현저한 차이 없이 모든 스텐트 그룹에 대해 0.1 미만이었다. 2개의 고투여량 스텐트 중 하나는 도 18에 도시된 바와 같이 4 주에서 혈전을 나타내지 않았다.
iii. 결론
전반적으로, 모든 동물은 생존하였으며, 모든 그룹에서의 스텐트 전개와 관련된 최소 조직 손상이 있다. 스텐트 코팅은 나노매트릭스 코팅의 박리 및 벗겨짐이 관찰되지 않음에 따라 안정한 것으로 보인다. 2 주 및 4 주 시점 둘 모두에서 염증은 최소이고 혈전은 거의 관찰되지 않았다. 그룹을 가로지르는 신생내막 두께의 비교는 비코팅 대조 스텐트 그룹과 비교하여 고투여량 및 저투여량 스텐트 그룹에서 감소 경향이 제시되었지만, 임의의 그룹 중에서 현저한 차이를 나타내지 않았다. 내피 세포가 고투여량 스텐트를 포함하는 조직학적 단면에서 관찰되었다. 섬유소 침착의 부재 및 스트러트를 둘러싸는 혈전의 부재는 표면 상의 내피 세포 라이닝의 존재로 인한 것일 수 있다.
3. 실시예 3: 전기방사 PCL 나노섬유와 천연 내피 모방 펩티드 양쪽성물질 (PA)의 조합에 의한 하이브리드 생물모방 나노매트릭스
i. 물질 및 방법
a. ePCL 나노섬유의 합성
PCL 펠릿 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO; Mn = 80,000)을 1:1 (v/v) 클로로포름:메탄올의 용매계 중에 용해시켜서 22.5 중량% 점성 중합체 용액을 수득하고, 25-G 무딘 첨단 바늘로 씌운 주사기로 옮겼다. 주사기를 1 ml/hr의 유속으로 설정된 주사기 펌프 (KD Scientific, Holliston, MA) 내에 위치시켰다. 바늘 첨단을 고전압원 (Gamma High-Voltage Research, Ormond Beach, FL)에 연결시키고, 이를 통해 +21 kV의 전압을 바늘 첨단에 인가시켰다. 생성된 전기방사 PCL (ePCL) 나노섬유를 바늘 첨단으로부터 28 cm에 위치한 분쇄 알루미늄 수집기 상에 침착시켰다. 위에 ePCL 시트를 갖는 수집기를 2-3 일 동안 진공 데시케이터 내에 저장하여 임의의 잔류 용매를 제공하였다. ePCL 나노섬유의 형태는 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하는 것을 특징으로 한다. 나노섬유를 금/백금으로 스퍼터 코팅시키고, 이들으 형태를 20 kV의 가속전압에서 Philips SEM 510 하에 관찰하였다. SEM 이미지를 섬유 직경의 측정을 위해 이미지 분석기 (Image-proplus, Media Cybernetics Co., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여 분석하였다.
b. 펩티드 양쪽성물질의 합성
펩티드를 상기 기술된 바와 같이 Aapptech Apex 396 펩티드 합성기에서 Fmoc 화학작용을 사용하여 합성할 수 있다 (Jun 등, 2005). 세포-부착성 서열 YIGSR or NO 공여 잔기 KKKKK와 함께 MMP-2 민감성 서열 (GTAGLIGQ)로 구성되는 2개의 13-아미노산 펩티드를 합성시켰다. 이들 펩티드를 16개의 탄소 팔미틸 사슬에 결합되도록 알킬화시켜서 양쪽성물질을 생성시켰다. 따라서, 2개의 상이한 PA, C16-GTAGLIGQ-YIGSR (PA-YIGSR) 및 C16-GTAGLIGQ-KKKKK (PA-KKKKK)를 합성시켰다.
c. 세포 유지
사람 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs)를 내피 성장 배지 (EGM) (2% FBS, 0.1% hEGF, 0.1% 하이드로코르티손, 0.1% 젠타마이신 A, 0.4% 소뇌 추출물)로 보충한 내피 기본 배지 (EBM) 중에서 성장시켰다. 이 세포 배지를 모든 HUVEC 실험에 사용하였다. 세포를 트립신화 (0.05% 트립신/EDTA)에 의해 통과시키고, 2500-5000 세포/㎠의 밀도로 이차배양시켰다. 사람 대동맥 평활근 세포 (AoSMCs)을 평활근 세포 성장 배지 (SmGM-2) SingleQuot® Kit (5% FBS, 0.1% 인슐린, 0.2% hFGF-B, 0.1% 젠타마이신 A, 0.1% hEGF)로 보충한 평활근 세포 기본 배지 (SmBM) 중에서 성장시켰다. 이 세포 배지를 모든 AoSMC 실험에 사용하였다. 세포를 트립신화 (0.05% 트립신/EDTA)에 의해 통과시키고, 3500 세포/㎠의 밀도로 이차배양시켰다. 모든 세포 배양액을 표준 배양 조건 (37℃, 95% 상대 습도, 및 5% CO2) 하에 유지시켰다. 모든 세포 및 배지는 Lonza Inc. (Walkersville, MD)로부터 구입하였다.
d. PA-YIGSR 및 PA-KKKKK의 비의 최적화
HUVEC를 ePCL-YK 90 (90% PA YIGSR, 10% PA KKKKK), ePCL-YK 75 (75% PA YIGSR, 25% PA KKKKK), ePCL-YK 50 (50% PA YIGSR, 50% PA KKKKK) 및 ePCL-YK 25 (25% PA YIGSR, 75% PA KKKKK)로서 설계된 ePCL 상에 코팅된 상이한 몰비의 PA-YIGSR 및 PA-KKKKK 상에 30,000 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 비코팅 ePCL을 대조군으로서 사용하였다. 2 시간 인큐베이션 기간 후에, 배지를 흡인시키고; 세포를 30분 동안 400 ㎕의 0.25% 맑은 트립신을 사용하여 트립신화시켰다. 트립신화된 세포를 1.5 ml 에펜도르프 튜브 내로 PBS와 함께 1:1 희석으로 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 수집된 샘플을 피코그린 DNA 검정 처리하여 세포수에 비례하는 DNA 함량을 평가하였다.
세포를 반복된 동결-융해 주기에 의해 투과시켰다. 그 다음, 피코그린 염료를 세포 샘플에 첨가하였다. 피코그린 염료는 세포 중의 이중 가닥 DNA에 결합하고, 이의 정량화를 허용한다. 공지된 부피의 송아지 흉선 dsDNA를 표준으로서 사용하였다. 형광을 마이크로플레이트 형광 판독기 (Synergy HT, Bio-Tek Instruments, VT)에서 측정하였다. DNA의 양은 세포당 8 pg DNA의 실험값에 의해 세포수에 상관한다.
e. NO 방출 하이브리드 나노매트릭스의 제조 및 특징화
NO 방출 PA를 PA 용액을 고압하에 순수 NO와 밤새 반응시킴으로써 합성시켰다. 순수 NO를 세척 공정에 의해 수득하였다. 시판용 NO 기체를 5 M 수산화칼륨을 통해 통과시켜서 고급 산화질소 종과 같은 불순물을 제거하였다. NO 세척 전에, 장치를 아르곤을 시스템을 통해 통과시킴으로써 탈기시켰다.
PA-YIGSR 및 PA-KKKKK의 9:1 비가 최선의 비로 선택되었다. 이후에, 상기 혼합물은 PA-YK를 의미한다. 따라서, PA-YK를 NO와 반응시켜서, PA-YK-NO로 불리우는 NO 방출 PA를 수득하였다. PA-YK 및 PA-YK-NO의 자체-조직은 투과 전자 현미경에 의해 특징화된다. 이는 NO 반응이 자체-조직 공정에 간섭하지 않음을 확인하기 위해 수행하였다. PA-YK-NO를 16 mm 직경 ePCL 디스크 상에 코팅시켜서, ePCL-YK-NO로 불리우는 NO 방출 하이브리드 나노매트릭스를 수득하였다. 이는 하기와 같이 수행되었다
훔볼트 보링 머신 (Fisher Scientific)을 사용하여, ePCL 시트를 16 mm 직경 디스크로 절단하였다. 이들 디스크를 감소 농도의 에탄올로 살균하였다. 이들 디스크를 200 ㎕의 0.1 중량% PA로 코팅시켰다. 그 다음, 이들 스캐폴드를 24 시간 동안 진탕기 상에 위치시킨 후, PA를 48 시간 동안 화학적 후드에서 건조에 의한 용매 증발을 통해 ePCL 나노섬유 상으로 자체-조직시켰다. ePCL 나노섬유 상으로의 PA의 성공적인 자체-조직을 TEM에 의해 확인하였다. PCL을 600 메쉬 육각형 TEM 그리드 상에서 전기방사시키고, 48 시간 동안 진공 데시케이터에서 건조시켰다. 그 다음, 이들을 5 ㎕의 0.1 중량% PA로 코팅시켰다. 그 다음, 그리드를 화학적 후드에서 밤새 건조시켰다. 그 다음, 이들 그리드를 30 초 동안 2% PTA로 염색하였다. 그 다음, 그리드를 60 kV 가속전압에서 FEI Technai T12 TE 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 또한, PA가 ePCL 네트워크에 간섭하지 않음을 보장하기 위해, PA 코팅 ePCL을 SEM을 사용하여 이미지화하였다.
NO 방출 연구를 위해, 16 mm ePCL 스캐폴드를 200 ㎕의 1 중량% PA-YK-NO로 코팅시켰다. 이들 디스크를 24 시간 동안 진탕기 내에 넣은 후, 48 시간 동안 화학적 후드 내에 넣어서, ePCL 나노섬유 상으로의 PA의 자체-조직을 가능하게 하였다. 이들 스캐폴드를 48 웰 조직 배양 플레이트에서 400 ㎕의 HEPES 완충 식염 (HBS) 중에서 인큐베이팅시켰다. 샘플을 0 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 4 일, 6 일, 10 일, 14 일, 21 일 및 28 일 시점에서 수집하였다. 대조군으로서, ePCL 스캐폴드를 PA-YIGSR-NO로 코팅시켰다. PA-YIGSR-NO를 PA-YIGSR을 순수 NO와 반응시킴으로써 수득하였다. 이는 PA에 대한 NO의 비-특이적 결합에 대해 설명된다. 샘플을 수집한 후에, 아질산염 함량을 술파닐아미드 및 N-1 나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드를 사용하는 그레이쓰 어쎄이 (Promega)를 사용함으로써 측정하였다. 아질산염이 NO의 일차 분해 생성물이다. 50 ㎕의 샘플을 50 ㎕의 술파닐아미드 및 50 ㎕의 N-1 나프틸에틸렌디아민 디히드로클로라이드로 처리하였다. 15분 동안의 인큐베이션 후에, 흡수도를 마이크로플레이트 판독기 (EL x 800, BIO-TEK Instrument, VT)를 사용하여 540 nm에서 판독하였다. ePCL-PA-YK-NO와 ePCL-PA-YIGSR-NO 사이의 아질산염 함량의 차이는 PA-KKKKK의 리신 잔기로부터 방출되는 NO에 대해 설명된다. 이를 시간에 대한 방출되는 NO의 측정값으로서 플롯팅하였다.
f. 하이브리드 나노매트릭스에 대한 세포 작용의 평가
HUVEC 및 AoSMC를 각각 30,000 세포/㎠ 및 15,000 세포/㎠의 밀도로 ePCL-PA-YK-NO 및 ePCL-PA-YK 상에 씨딩하였다. 2 시간의 인큐베이션 후에, 세포를 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Molecular Probes, Eugene, OR)로 형태학적으로 염색하였다. 초기 세포 부착을 3가지 상이한 기재 상에 HUVEC 및 AoSMC를 씨딩함으로써 분석하였다 : ePCL-PA-YK-NO; ePCL-PA-YK 및 ePCL. HUVEC를 30,000 세포/㎠로 그리고 AoSMC를 15,000 세포/㎠로, 48 웰 조직 배양 플레이트의 웰에서 유지되는 기재 상에 씨딩하였다. 2 시간의 인큐베이션 기간 후에, 배지를 흡인시키고; 세포를 30분 동안 400 ㎕의 0.25% 맑은 트립신을 사용하여 트립신화시켰다. 트립신화된 세포를 1.5 ml 에펜도르프 튜브 내로 PBS와 함께 1:1 희석으로 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 이와 같이 수집된 샘플을 피코그린 DNA 검정 처리하여 세포수에 비례하는 DNA 함량을 평가하였다.
세포 증식에 대한 NO의 효과를 평가하기 위해, 0.1 중량% PA-YK-NO 및 PA-YK를 16mm ePCL 디스크 상에 코팅시켰다. HUVEC 및 AoSMC를 각각 30,000 세포/㎠ 및 15,000 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. HUVEC 및 AoSMC의 증식을 증식 세포핵 항원 (PCNA) 염색에 의해 평가하였다. 48 시간의 인큐베이션 후에, 세포를 10% 포르말린 중에 고정시키고, 메탄올 중에 투과시키고, 3% 과산화수소 용액을 사용하여 차단시켰다. 그 다음, 세포를 트리스-완충 식염으로 인큐베이팅시킨 후, 3% FBS에 의해 PBS 중에서 1:100으로 희석시킨 마우스 IgG 항-PCNA 일차 항체 (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시켰다. 그 다음, 세포를 3% FBS에 의해 PBS 중에서 1:100으로 희석시킨 항-마우스 IgG HRP (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시킨 후, 아미노에틸카르바졸 색원체 (Dako Corp., Carpinteria, CA)로 인큐베이팅시켰다. 세포를 마이어 헤마톡실린으로 대비염색시키고, 37mM 수산화암모늄으로 세정하였다. 시계 (20 X) 당 증식 세포의 비율을 상 대비 현미경을 사용하여 적색 증식 세포 및 청색 비증식 세포를 계수함으로써 결정하였다. 모든 세포 정량화를 위해, 5개의 랜덤 시계를 이미지화시키고 각각의 웰에 대해 평균을 내었다. 더욱더, 4개의 샘플을 실험을 구성하는 각각의 조건에 대해 시험하였다. 그래프로 도시된 결과는 3개의 독립적 실험으로부터 120개를 초과하는 이미지의 평균을 나타낸다 (n=12).
g. 통계적 분석
모든 실험을 3회 이상 독립적으로 수행하였다. 모든 데이터를 일방 ANOVA 시험과 비교하여 SPSS 소프트웨어를 사용하여 통계적 유의성을 평가하였다. ANOVA 분석 내에서, 터키 (Tukey) 다중 비교 시험을 수행하여 쌍들 사이의 유의할 만한 차이를 발견하였다. p<0.05의 값이 통계적으로 유의할 만한 것으로 고려된다.
ii. 결과 및 논의
심혈관 이식체 표면 상에 천연 내피의 특성을 재구성하도록 설계된 하이브리드 생물모방 나노매트릭스가 본원에 기술되어 있다. 생물 의학 분야에 대해 바람직한 특징을 갖는 것으로 공지된 ePCL 나노섬유를 성공적으로 제조하였다. 도 20a에서 SEM 이미지가 나타내는 바와 같이, ePCL 섬유는 비교적 균일한 형태를 갖고, 200 nm - 700 nm의 나노스케일 직경을 가지며, 비드가 없다. 모든 ePCL 나노섬유의 대표적인 무작위 직포간 성질은 또한 이미지로부터의 명백한 증거이다. 부가적으로, 섬유의 대부분은 300 nm - 400 nm의 범위 내에 있는 것으로 측정된 직경을 가졌으며, 이는 천연 ECM에서 발견된 콜라겐 섬유 다발과 유사하다 (Elsdale T and Bard J: 1972). ECM 모방 나노섬유 표면형태의 상기 면은 세포에 의해 선호된다. 그러나, 상이의 바람직한 형태학적 특징은 ePCL에서 생체활성의 결여에 의해 부정된다. ePCL 상의 세포 인식 자리의 이러한 결여는 스캐폴드가 세포와 활성적으로 상호작용하는 것을 예방하며, 따라서, 숙주 조직과 효과적으로 통합될 수 없다. 이와 같이, 본원에 기술된 바와 같이, 이들 ePCL 나노섬유에 생체활성이 제공되었다.
상기 생체활성을 PA의 사용을 통해 ePCL 나노섬유에 도입시켰다. 2개의 상이한 PAs, C16-GTAGLIGQ-YIGSR (PA-YIGSR) 및 C16-GTAGLIGQ-KKKKK (PA-KKKKK)를 성공적으로 합성시켰다. PA는 YIGSR 또는 폴리리신 (KKKKK) 기와 함께 효소 매개된 분해성 MMP-2 민감성 서열 (GTAGLIGQ)를 함유하여 NO 공여 잔기를 생성시킨다. PA-YK를 또한 상이한 몰비의 PA-YIGSR 및 PA-KKKKK를 혼합시킴으로써 설계하였다. 이와 같이, 세포 부착성 리간드 및 NO의 밀도를 PA-YIGSR와 PA-KKKKK의 비를 변동시킴으로써 변할 수 있다. 이들 PA-YK를 ePCL 상에 코팅시켜서 SEM에 의해 특징화되는 하이브리드 나노매트릭스 (ePCL-PA-YK)를 생성시켰다 (도 20b). PA-YK에 코팅이 ePCL 나노섬유 형태에 영향을 주지 않음이 명백하다. ePCL-PA-YK는 또한 TEM에 의해 특징화된다 (도 21a). TEM 이미지로부터, 중심 나노섬유 (약 300 nm 직경)을 관찰하였으며, 이를 측면 중 어느 하나에서 PA로 코팅시켰다 (7-8 nm 직경). TEM 이미지화에서 깊이의 결여로 인해, 균일한 코팅을 가로축에서 전자 현미경의 스테이지를 기울임으로써 확인하여 이미지를 얻었다 (도 21b). 상기 이미지는 기울어지지 않은 이미지와 유사하며, 따라서, ePCL 나노섬유 상의 PA의 코팅이 균일함이 현저히 덜 할 수 있다. 최적 매트릭스 조성을 결정하기 위해, 내피 세포를 다양한 비의 ePCL-PA-YK 상에 씨딩하고, 세포 부착은 PA-YIGSR 농도의 증가에 따라 유의할 만큼 더 높은 것으로 밝혀졌다 (도 22). 이와 같이, 하기에서 ePCL-PA-YK로서 언급되는 ePCL-PA-YK90 (9:1 몰/몰)을 모든 추가의 연구를 위해 사용하였다.
PA-YK를 NO와 반응시켜서 PA-YK-NO를 수득하였다. 그 다음, 이를 ePCL 상에 코팅시켜서, NO 방출 생물모방 하이브리드 나노매트릭스인 ePCL-PA-YK-NO를 제조하였다. ePCL-YK-NO는 SEM에 의해 특징화되고 (도 19c), PA-YK-NO가 ePCL 나노섬유의 형태에 영향을 주지 않음이 확인되었다. 균일한 코팅을 확인하기 위해, ePCL-PA-YK-NO를 TEM에 의해 이미지화하였다 (도 21c). PA-YK-NO의 균일한 코팅은 ePCL 나노섬유의 측면 중 어느 하나에서 가시적이며, 이는 다시 가로축에서 스테이지를 기울인 후에 이미지화에 의해 확인되었다 (도 21d).
ePCL-PA-YK-NO 하이브리드 나노매트릭스로부터의 NO 방출 프로파일을 그레이쓰 어쎄이를 사용하여 평가하였다. 성공적인 NO 방출을 28 일 넘게 관찰하였다. 첫 번째 48 시간 내에 초기 연속 방출이 일어난 후, 4 주를 초과하는 기간에 걸쳐 느린 지속석 방출이 일어나서 NO의 48% 회수를 결과하였다 (도 23). 초기 연속 방출은 국부적 전달을 위해 쉽게 접근할 수 있는 ePCL-PA-YK-NO 나노섬유 매트릭스의 표면으로부터 NO 방출로서 설명될 수 있다. 이는 재협착에서 주요 사건 중 하나인 평활근 세포의 증식을 제한하기 위해 특히 중요하며, 손상 1일 후 만큼 빠르게 시작한다 (Weintraub WS: 2007). 따라서, NO의 48 시간 연속 방출은 신생내막 과형성을 억제하는 데에 중요하다. 후속적 지속 방출은 확산 및 효소 분해의 조합에 의해 하이브리드 나노섬유 매트릭스의 벌크로부터 방출되는 NO에 기인할 수 있다. 시간 경과에 따라, MMP-2 분해성 자리로 인해, ePCL-PA-YK-NO는 서서히 분해되며, 이는 매트릭스의 벌크로부터의 NO의 지속 방출을 보조하는 것으로 믿어진다. 효소 중개 분해성 자리의 존재는 또한 하이브리드 나노매트릭스에서의 농도 기울기를 발생시키는 것으로 예측된다. 연구로부터, 3.8 μmol의 NO가 16 mm 직경의 ePCL-PA-YK-NO 디스크로부터 4 주를 초과하는 기간에 걸쳐 방출되는 것으로 관찰될 수 있다. 상기 양은 1x10-10mol cm-2 min-1의 속도로 내피 세포에 의해 방출되는 축적 NO에 필적할 수 있다 (Vaughn MW 등, 1998). 더 긴 기간에 걸친 느린 지속 방출은 평활근 세포의 비-증식성 상태, 혈관벽의 항-트롬보겐성 성질을 유지하고, 대표적으로 수 주의 회수 기간 동안 내피화를 조장하는 것이 필요하다. 하이브리드 나노매트릭스의 추가의 특징은 방출되는 NO의 양이 PA-KKKKK 중의 리신 잔기의 수를 변동시킴으로써 미래의 응용에서 쉽게 변할 수 있다는 점이다. 이와 같이, PA-KKKKK (예를 들어, PA-KKKKKKK) 중의 리신의 수를 증가시키거나 PA-YK 중의 PA-KKKKK의 비율 (예를 들어, 9:2, 3:1, 9:4, 2:1, 9:5, 3:2, 9:7, 9:8, 1:1, 3:4의 PA-YIGSR 대 PA-KKKKK 비)를 증가시킴으로써 리신의 수를 증가시키면, NO 방출의 속도가 증가하고 NO 방출의 지속기간이 증가할 수 있다.
초기 세포 부착을 ePCL-PA-YK-NO 및 ePCL-PA-YK 상에 HUVEC 및 AoSMC를 씨딩함으로써 연구하였다. 비코팅 ePCL을 대조군으로서 사용하였다. 이들 세포를 형태학적으로 이미지화시켰으며, ePCL-PA-YK-NO 및 ePCL-PA-YK가 ePCL과 비교하여 HUVEC의 부착 및 퍼짐을 개선시키면서 (도 24), ePCL-PA-YK-NO 및 ePCL-PA-YK가 AoSMC 퍼짐을 지지하지 않음 (도 25)이 관찰될 수 잇다. 도 26a로부터, ePCL-PA-YK-NO (15576±2414) 및 ePCL-PA-YK (16685±808)이 비코팅 ePCL (12490±639)와 비교하여 유의할 만하게 더 높은 HUVEC 부착을 나타냄이 관찰될 수 있다. 도 26b로부터, ePCL-PA-YK-NO (9123±1344) 및 ePCL-PA-YK (9404±1259)가 ePCL (9310±561)과 유사한 부착을 나타내며, 따라서 AoSMC 부착을 지지하지 않음이 명백하다. 이들 결과는 하이브리드 나노매트릭스 (ePCL-PA-YK-NO 및 ePCL-PA-YK)가 내피 세포 부착 및 퍼짐을 조장하면서, 평활근 세포 부착 및 퍼짐을 동시에 지지하지 않음을 명백히 나타낸다. 이는 라미닌 유도 YIGSR 세포 부착성 잔기의 형태로 ePCL 나노섬유에 내피 세포 특이적 생체활성을 제공하는 PA로 인한 것이다.
HUVEC 및 AoSMC의 증식에 대한 NO의 효과를 48 시간의 인큐베이션 후에 그레이쓰 어쎄이를 사용함으로써 연구하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, ePCL-PA-YK-NO 나노매트릭스에 대한 PCNA 양성 HUVEC의 비 (70±2%)는 ePCL-PA-YK 나노매트릭스 (57±3 %)와 비교하여 현저히 더 높은 것으로 밝혀졌다. 그러나, ePCL-PA-YK-NO에 대한 PCNA 양성 AoSMC의 비 (41±3%)은 ePCL-PA-YK (58±4%)에 대해서보다 현저히 더 낮았다. 이들 결과는 ePCL-PA-YK-NO 나노매트릭스가 내피 세포 성장을 향상시키지만 평활근 세포를 제한함을 제시한다. 평활근 성장을 방지하면서 내피화의 향상은 과형성 및 재협착을 방지함으로써 그라프트 효능을 개선시키려는 중요한 단계이다.
따라서, 상기 하이브리드 나노매트릭스는 생물모방 심혈관 이식체로서 사용하기 위한 높은 잠재성을 갖는다. 통상적인 심혈관 이식체는 구조적 지지체를 제공하는 것으로 제한되며, 천연 내피를 밀접하게 모방하는 능력으로 인해 숙주 세포와 효과적으로 통합할 수 없다. 부가적으로, 이들은 재내피화, 재협착 및 혈전의 결핍을 특징으로 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 전기방사 PCL 및 PA 나노섬유 내로 구성된 하이브리드 생물모방 스캐폴드가 개발되었다. ePCL은 규칙적 박동력에 노출되는 심혈관 그라프트에 대해 바람직한 기계적 강도 및 표면형태 구조를 제공한다. PA 나노섬유는 내피 세포 부착성 YIGSR 잔기로 구성되며, 전단 흐름에 대한 내피 세포의 부착을 보충하고 조장하는 것으로 예측된다. NO는 하이브리드 나노매트릭스 평활근 세포 증식으로부터 방출되고, 나노매트릭스에 항-혈전 성질을 제공하면서, 동시에 내피 세포 증식을 조장한다. PA 중에 존재하는 효소 중개 분해성 자리는 매트릭스의 느린 세포 유도 분해를 유발시키는 것으로 예측되며, 이는 NO의 지속 방출을 보조한다. 따라서, 상기 하이브리드 나노매트릭스에 대한 응용의 일례로서, 나노매트릭스는 맥관 그라프트 및 심장판막과 같은 이식성 기기에 사용될 수 있다.
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I. 서열
서열 번호:1
Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln
서열 번호:2
Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
서열 번호:3
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
서열 번호:4
Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
서열 번호:5
Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
서열 번호:6
Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
서열 번호:7
Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
서열 번호:8
Arg-Gly-Asp
서열 번호:9
Arg-Gly-Asp-Ser
서열 번호:10
Asp-Gly-Glu-Ala
서열 번호:11
Val-Ala-Pro-Gly
서열 번호:12
Arg-Glu-Asp-Val
서열 번호:13
Asp-Gly-Glu-Ala
서열 번호:14
Lys-Arg-Ser-Arg
서열 번호:15
Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly
서열 번호:16
Gly-Pro-Gly-Ile-Trp-Gly-Gln
서열 번호:17
Cys-Cys-Cys-Cys-Cys
발명의 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명에서 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있음이 당업자들에게 명백해질 것이다. 본 발명의 다른 구현은 본원에 기술된 발명으 명세서 및 실시의 고려로부터 당업자들에게 명백해질 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 대표적인 것이며, 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기의 특허청구범위에 의해 제시된다.

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  13. 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질 각각은 독립적으로 친수성 펩티드 서열 및 소수성 꼬리를 포함하며,
    상기 제1 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열이 분해 서열 및 내피 세포 부착성 서열을 포함하며, 제2 펩티드 양쪽성물질의 친수성 펩티드 서열이 분해 서열 및 산화질소 생성 공여체 서열을 포함하는, 제1 및 제2 펩티드 양쪽성물질을 포함하며,
    상기 세포 부착성 서열이 YIGSR (서열 번호: 2), RGD (서열 번호: 8), RGDS (서열 번호: 9), DGEA (서열 번호: 10), VAPG (서열 번호: 11), REDV (서열 번호: 12), DGEA (서열 번호: 13), 또는 LRSR (서열 번호: 14)을 포함하며,
    상기 분해 서열이 매트릭스 금속단백질 분해효소 (MMP) 특이적 분열 자리를 포함하며,
    상기 산화질소 생성 공여체 서열이 폴리리신, 또는 폴리시스테인 서열을 포함하는, 조성물.
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  15. 청구항 13에 있어서, 나노섬유를 추가로 포함하며, 상기 제1 및 제2 상기 양쪽성물질이 상기 나노섬유 상에 코팅되는, 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 나노섬유가 폴리에스테르를 포함하는, 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 폴리에스테르가 폴리카프로락톤인, 조성물.
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  43. 청구항 13에 있어서, 상기 세포 부착성 서열이 YIGSR (서열 번호: 2)을 포함하며, 상기 산화질소 생성 공여체 서열이 폴리리신을 포함하는 조성물.
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Patent event date: 20160420

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20161223

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20170726

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20161223

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

Patent event date: 20160420

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20171012

PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20170726

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20170316

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20160818

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20171023

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20171012

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20170726

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20170316

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20160818

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20180119

Patent event code: PR07011E01D

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