JP2009047643A - バイオチップ及びバイオチップの温度検知方法 - Google Patents

Abstract

【課題】製造、輸送、保管、反応等の工程において試薬に加えられた熱を検知することができるバイオチップを提供する。
【解決手段】本発明は、基板２上に複数の反応室３を有するバイオチップ１であって、反応室３と同一の大きさの凹部１０に、所定の第１温度を融点とする第１温度検知体１２が配置された第１温度検知部８を備え、第１温度検知部８内の第１温度検知体１２の形状又は色彩によって反応室３が第１温度以上の環境下にあったかどうかを判定できることを特徴とする。
【選択図】図１

Description

本発明は、化学反応やＤＮＡ反応、タンパク質反応等を行うためのバイオチップ及びバイオチップの温度検知方法に関する。

近年、化学反応やＤＮＡ反応、タンパク質反応等をチップ上にて行うμ−ＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ技術や、Ｌａｂ‐ｏｎ‐Ｃｈｉｐ技術などが研究され実現されつつある。これにより、今まで大型の実験装置や大量の反応試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下のバイオチップを用いて少量の反応試薬で行えるようになってきている。

このバイオチップ上には、ウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが複数形成されており、それぞれが独立した反応容器として用いられる。複数のウェル状反応容器は、試液貯留部から延設された試液流路により接続されている（例えば、特許文献１参照）。
このバイオチップに試薬を封入するには予め試薬を各ウェル内に充填、保存する方法や、試薬貯留部から流路を通じて試薬を各ウェルに充填する方法が考えられる。
特表２００２−５０３３３６号公報

しかしながら、生化学でもちいられる試薬は熱に弱く、室温であっても酵素の機能低下や核酸の断絶など、致命的な被害を受けやすい。特にバイオチップ上で反応検出を行う場合、その試薬の劣化によるわずかな反応効率の低下でさえも許されない場合が多々ある。また、品質保証の観点からも、製造、輸送過程で、試薬にどの程度の熱がかかってしまったのか、把握、記録する必要がある。直接温度を測る方法としては、熱電対での測定を始め従来の様々な技術があるが、これらは破壊検査のため望ましくない。

また、温度によって化学反応をおこす色素層の組み込み等の非破壊検査および、保存容器外壁に市販されているような示温材を貼る、或いは示温材塗料を容器の内部又は外部に塗布するという方法も知られているが、バイオチップなどの小型チップに搭載する観点からは必ずしも適切とはいえない。また、試薬に加えられた熱を正確に把握するためには、基板ではなく、試薬保存部内の温度が測定されるのが望ましい。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、製造、輸送、保管、反応等の工程において試薬に加えられた熱を検知することができるバイオチップ及びバイオチップの温度検知方法を提供することを目的とする。
本発明の他の目的は、反応室に加えられた温度を簡便に検知することができるバイオチップの温度検知方法を提供することである。

本発明は、基板上に複数の反応室を有するバイオチップであって、前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部に、所定の第１温度を融点とする温度検知体が配置された温度検知部を備え、前記温度検知部内の前記温度検知体の形状又は色彩によって前記反応室が前記第１温度以上の環境下にあったかどうかを判定できることを特徴とする。

本発明のバイオチップによれば、温度検知部の温度検知体の形状や色彩を見ることによって、バイオチップが第１温度以上の温度にさらされたかどうかを容易に判断することができる。

本発明のバイオチップは、前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部に、前記第１温度と異なる第２温度を融点とする第２温度検知体が配置された第２温度検知部をさらに備えてもよい。この場合、反応中、製造時、輸送時等複数の環境において温度管理が適切に行われているかどうかを簡便に判断することができる。

前記複数の反応室の少なくとも１つには、試薬が配置されていてもよい。この場合、簡便に反応を行え、かつ試薬が適切な温度管理下にあったかどうかも容易に把握できるバイオチップを構成することができる。また、前記試薬は、酵素又は核酸を含むものでもよい。

なお、「試薬」とは、バイオチップ上で反応液と反応させるために用いられるあらゆる物質を指し、基質、バッファー等も含まれる。

本発明のバイオチップは、前記複数の反応室の上面を覆う蓋材をさらに備えてもよい。この場合、反応室へのコンタミネーション等を防ぐことができる。

本発明のバイオチップの温度検知方法は、基板上に複数の反応室を有するバイオチップの前記反応室に加えられた温度を検知する温度検知方法であって、前記バイオチップに前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部を形成する工程と、前記凹部に所定の第１温度を融点とする温度検知体を配置する工程とを備えることを特徴とする

本発明のバイオチップによれば、製造、輸送、保管、反応等の工程において試薬に加えられた熱を検知することができるバイオチップを提供することができる。
また、本発明のバイオチップの温度検知方法によれば、反応室に加えられた温度を簡便に検知することができる。

以下、本発明の一実施形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本実施形態のバイオチップ１を示す平面図である。バイオチップ１は、略長方形状の基板２上に、複数の反応室３が設けられて構成されている。

基板２は、樹脂等からなる略長方形の板状部材である。材料となる樹脂としては、ポリプロピレン（ＰＰ）やポリカーボネート（ＰＣ）、アクリル樹脂（ポリメチルメタクリレート）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶ）、ポリスチレン（ＰＳ）等が、耐熱性、耐薬品性、成型加工性などに優れているため好ましい。

基板２の厚さは、使用中に容易に折れ曲がることのない程度の厚みとするのが好ましい。また、基板２は、２種類以上の樹脂が接合されて形成されてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を生かして基板２を作製することにより、反応試薬及び試料等の物性に応じた多様な基板２とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板２の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。さらに、基板２の素材として石英ガラスを用いることもできる。

反応室３は、図２（ａ）に示すように、断面が半球状（椀状）又は逆円錐状（鉢状）等の凹部であり、基板２上に整列している。反応室３は、基板２を構成する樹脂を切削加工し、又は基板２の材料樹脂を射出成形する等の方法で形成される。
反応室３の開口部の直径は０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下とするのが好ましい。このようにすると、後述する反応試液の供給が容易になり、気泡の混入が防止される。各反応室３内には、使用時に添加されるＤＮＡを含んだサンプルとの初期反応に必要な第１試薬（試薬）４が配置されている。バイオチップ１で複数種類の反応を行えるように、第１試薬４を一部の反応室３にのみ配置してもよい。

また、図１に示すように、基板２の他の部位には、反応室３における初期反応後の反応に使用する第２試薬５を保存する第２試薬留置部６が設けられている。第２試薬留置部６は、図２（ｂ）に断面で示すように、反応室３と略同一の形状の留置室７に第２試薬５が配置されて形成されている。第２試薬５は、必要となるタイミングで、定量分注器等を用いて各反応室３に添加される。

さらに、反応室３が設けられた領域の周辺の基板２上には、バイオチップ１に加えられた温度を検知するための第１温度検知部（温度検知部）８及び第２温度検知部９が設けられている。
図２（ｃ）は第１温度検知部８の、図２（ｄ）は、第２温度検知部９のそれぞれ断面図である。各温度検知部８、９は、反応室３と略同一の形状を有する凹部１０、１１と、それぞれ凹部１０、１１内に配置された第１温度検知体（温度検知体）１２及び第２温度検知体１３を有して構成されている。

第１温度検知部８は、バイオチップ１の製造時及び輸送時において、配置された第１試薬４及び第２試薬５の品質に影響するような温度が加えられたかどうかを検知する部分であり、配置される第１温度検知体１２として、例えば３５℃（第１温度）を融点とする物質が選択されている。
第２温度検知部９は、バイオチップ１上における反応時において、反応室３内の試薬に正常に反応温度が加えられたかどうかを検知する部分であり、配置される第２温度検知体１３として、例えば８０℃（第２温度）を融点とする物質が選択されている。
なお、第１温度検知部８、第２温度検知部９ともに、融点が異なる複数種類の第１温度検知体１２及び第２温度検知体１３をそれぞれ異なる凹部に配置して、複数の温度について判定できるように構成されてもよい。

第１温度検知体１２及び第２温度検知体１３として用いる材料は、ある温度以上にすると状態変化を起こす物質であればどのようなものでもよい。中でもワックス類が扱いやすく好適であり、設定融点が１００℃以上であればポリエチレンワックス、設定融点が８０〜１００℃であればマイクロクリスタリンワックス、設定融点が８０℃以下であればパラフィンワックス等を用いることができる。

各温度検知体１２、１３の形状は、融解前後で異なることが容易に判別できるものが好ましい。例えば、通常融解すれば表面張力により球形に近い形状となるため、配置の時点では四角形の板状にしておくなどである。一方、反応室３に配置された第１試薬４への影響を正確に把握する観点からは、凹部１０、１１の底部に対する各温度検知体１２、１３の接触面積が、反応室３における第１試薬４と略同等であることが好ましい。また、第１試薬４と第２試薬５の形状が異なる場合は、各温度検知部８、９の一方の温度検知体１２、１３を第２試薬５と略同等の接触面積を有する形状にしてもよいし、上述のように、複数の温度を検知できるようにこれらが複数組設置されてもよい。

温度検知は、各温度検知体１２、１３の融解による形状変化のみによって判断してもよいし、各温度検知体１２、１３に色素を抱合させ、融解した場合に抱合されていた色素が凹部１０、１１内に拡散するようにして、より判別しやすく構成されてもよい。

再び図１に示すように、反応室３の右側には、各反応室３に供給される第２試薬が試液である場合に、当該試液が貯留されるための試液貯留部１４が設けられている。試液貯留部１４は、第２試薬の量が多い場合などにも使用することができる。

使用前において、基板２及び各反応室３、第２試薬留置部６、各温度検知部８、９、及び試液貯留部１４の上面は、図２（ａ）〜（ｄ）に示すように、コンタミネーション等を防ぐため、蓋材１５によって覆われている。蓋材１５はヒートシールやレーザーによる熱融着等の方法で基板２に接着されてもよい。そして、このような蓋材の固定工程でかかる熱によって試薬がダメージを受けたかどうかを判断するための温度検知体が、固定工程の前に予めチップに配置されてもよい。なお、蓋材１５は反応室に必要な試料等を添加した後、容易に再装着できるものが好ましい。

また、蓋材１５が製造時にヒートシールによって接着され、かつ輸送時の温度環境を検知する等の目的で、ヒートシール時の温度より低い融点を有する温度検知体が配置される場合は、当該温度検知体が配置される温度検知部を蓋材１５で覆わず、ヒートシール後に当該温度検知体を配置してもよい。温度検知部には試料は添加されないため、コンタミネーション等に関しても大きな問題はない。

以下、本発明のバイオチップについて、実施例を用いてさらに説明する。本実施例のバイオチップ２０は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法に用いられるバイオチップである。

（実施例１）
まず、ＰＰからなる基板２１上の図３に示すような位置に、切削によって半径１．５ｍｍの半球状の反応室２２を形成した。また、温度検知部を形成するため反応室２２と同一形状の凹部２３、２４を形成した（凹部形成工程）。反応室２２の容積は、理論値で７．７μＬ（マイクロリットル）である。反応室２２の内面にはプラズマ処理を施して親液化した。
加えて、第２試薬留置部となる留置室２５及び試液貯留部２６も基板２１上に形成された。

図４（ｂ）に断面で示すように、凹部２３には、第１温度検知体２７として、融点９８℃の粒状のクリスタリンワックス（日本精蝋社製 商品名「Ｈｉ−Ｍｉｃ−２０９５」）を配置して（温度検知体配置工程）、第１温度検知部２８を形成した。第１温度検知体２７は、凹部２３に配置した状態でＰＣＲ変性温度（９６℃）を３０秒間加えると熱によって変形し、ＰＣＲ変性温度より３度低い温度を同時間加えたときには変形しないことが確認されている。
なお、実施例１においては、第１温度検知部のみ設け、第２温度検知部は設けられなかった。

続いて、図４（ａ）に断面で示すように、各反応室２２の底部に各々異なる増幅部位のプライマー（第１試薬）２９を１．０μＬ配置して乾燥固定させ、基板２１の上面に蓋材（ＡＢＩ社製 ABI PRISM Optical Adhesive Cover）３２を装着してバイオチップ２０を作製した。

このようなバイオチップ２０を２枚用意し、テンプレートＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びｄＮＴＰにバッファーを加えて試液３０として調製し、蓋材３２をはがして、一旦試液貯留部２６に貯留してから、プライマー２９を配置した各反応室２２に３．５μＬずつ分注した。さらに、加熱中の蒸発防止のためにミネラルオイル３１を３μＬずつ分注した。その後、蓋材３２を再装着して上面をカバーした。

作業終了後のバイオチップ２０に対して、プレートＰＣＲを用いて熱履歴をかけた。ここで、一方のバイオチップ２０を温度調節正常サンプルＢとして、変性過程（９０〜９８℃）、アニーリング過程（４０〜６０℃）、及び伸長過程（７０℃前後）にしたがって、該当核酸増幅に最適な温度調節を行った。

一方、もう一方のバイオチップ２０を比較用の温度調節不備サンプルＡとした。温度調節不備サンプルＡに対しては、最も温度が高い変性過程において加える温度を温度調節正常サンプルより３℃低く設定し、他の過程は温度調節正常サンプルＢと同様とした。この温度調節不備サンプルＡは、ＰＣＲ法実行時において、反応効率を下げるほどの温度不調が発生した場合を想定している。

温度調節正常サンプルＢと温度調節不備サンプルＡとの比較結果を表１に示す。ＰＣＲ反応終了後、各サンプルの第１温度検知部を目視にて確認したところ、温度調節正常サンプルＢの第１温度検知部２８では、図５に示すように、凹部２３内の第１温度検知体２７が縁に向かって広がるように融解し、配置時と異なることが容易に識別可能な形状に変化していた。一方、温度調節不備サンプルＡの第１温度検知部においては、図６に示すように、第１温度検知体２７は配置時と同様の形状であり、融解していないことが確認された。

（実施例２）
次に、本発明のバイオチップを用いて、一遺伝子多型（ＳＮＰ）検出法の一つであるインベーダー法を行った例を説明する。
本実施例のバイオチップ４０を作製するために、まず、実施例１と同様の手順で基板２１上に反応室２２、凹部２３、２４、留置室２５、及び試液貯留部２６を形成する。

次に、図３に示すように、凹部２４内に、融点６２℃の高純度精製パラフィンワックス（日本精蝋社製 商品名「ＨＮＰ−５」）を第２温度検知体４１として配置して第２温度検知部４２を形成した。第２温度検知体４１は、６３℃で完全に融解することを予め確認した。
そして、凹部２３内には、上述の高純度精製パラフィンワックスをミネラルオイル（シグマ社製 商品名「Mineral oil, Light oil」）で２６倍希釈して融点を室温程度に調整したものを第１温度検知体４３として配置して第１温度検知部４４を形成した。第１温度検知体４３は、２５℃程度で数時間静置すると、融解を始めて形状が変化することを予め確認した。

インベーダー法においては、２種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、２種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ）、及びＤＮＡ構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（クリベース）が用いられる。インベーダー反応は約６３℃で数十分から４時間程度インキュベートすることによって行われる。

本実施例においてはインベーダーアッセイキット（Third Wave Technologies社製）の構成に準じてバイオチップ４０を作製した。
まず、反応室２２の各底部に各々異なるインベーダープローブ及びそれぞれ対応するアレルプローブを、一対ずつ０．１５μＬ加えて乾燥させた。その上に蛍光物質としてＦＡＭ標識又はＲＥＤ標識が結合したＦＲＥＴプローブを各反応室２２に０．７５μＬずつ加えて乾燥させた。そしてクリベースを各反応室２２に０．１５μＬずつ配置し、これらを第１試薬（試薬）４６とした。そして、実施例１と同様に蓋材３２を装着してバイオチップ４０を作製した。
上記構成のバイオチップ４０を３枚用意し、そのうち１枚（以下、チップＡと称する。）を室温に４時間放置し（保存状態不備）、残り２枚（以下、チップＢ及びＣと称する。）を冷蔵保存した（保存状態良好）。

保存後のバイオチップ４０の蓋材３２をはがし、調製済みのＰＣＲ産物（QIAGEN社製 Multiprex PCR kit使用）に対してインベーダーバッファーを加え、全量が６０μＬとなるように調製して試液４７とした。この試液４７を、一旦試液貯留部２６に貯留してから、図４（ａ）に示すように、第１試薬４６が配置された各バイオチップ４０の各反応室２２に３．５μＬずつ分注し、さらに加熱中の蒸発防止のためにミネラルオイル４８を３．０μＬずつ分注した。

その後、蓋材３２を基板２１の上面に再装着して被覆してから、各バイオチップ４０にプレートＰＣＲにて熱履歴をかけた。このとき、反応温度としてチップＡ及びＣは６３℃（設定反応温度）、チップＢは５９℃（反応温度不備）でそれぞれ加熱した。

すなわち、チップＡは保存状態に不備があり、設定温度で反応が進められたサンプル、チップＢは、保存状態は良好であるが、反応温度に不備があったサンプル、チップＣは保存状態、反応温度とも問題ないサンプルとして設定、調整されている。各チップＡ、Ｂ、Ｃの比較結果を表２に示す。

インベーダー反応を開始する前に、チップＡ、Ｂ、Ｃの第１温度検知部４４に設置された第１温度検知体４３を目視にて観察したところ、チップＡでは第１温度検知体４３が変形しており、保存状態に不備があることが目視で容易に判定できた。一方、冷蔵保存されていたチップＢ及びチップＣの第１温度検知体４３には変化はなく、保存状態に問題がないことが判定できた。

インベーダー反応後、チップＡ、Ｂ、Ｃの第２温度検知部４２に設置された第２温度検知体４１を目視にて観察したところ、チップＡ及びＣでは第２温度検知体４１が変形しており、設定温度以上の温度で反応が行われたことが目視で容易に判定できた。一方、５９℃で加熱されたチップＢの第２温度検知体４１には変化はなく、反応温度に不備があることが判定できた。

各チップＡ、Ｂ、Ｃを蛍光イメージアナライザー（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製 商品名「モレキュラーイメージャーＦＸ４６６」）を用いて測定したところ、保存状態、反応温度共に問題のないチップＣと比較して、いずれか一方に不備のあるチップＡ及びＢはいずれも極端に蛍光値が低く、想定どおり反応効率が下がっていた。チップＡにおいては、保存状態に不備があったため試薬の劣化によって反応効率が低下し、チップＢにおいては、インベーダー反応時の温度調節に不備があったために反応効率が低下したものと推察された。

本発明のバイオチップによれば、所定の温度を融点とする第１及び第２温度検知体が反応室と略同一形状の凹部に配置されて第１及び第２温度検知部が構成されているので、反応室内の試薬等にかかった熱がほぼ同様に各温度検知体に作用する。従って、反応室内の試薬がどのような温度環境下にあったかについて、目視で簡便に判定をすることができる。

また、第１温度検知体として、製造や運搬時に試薬等への影響が懸念される温度を融点とする物質が選択され、第２温度検知体として、反応時の設定温度を融点とする物質が選択されているので、試験前の試薬等の状態と反応中の温度調節との２ポイントについて、監視することができる。従って、測定の品質をより向上させることができる。

以上、本発明の実施形態について説明してきたが、本発明の技術範囲は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。

例えば、上述の実施形態においては、各反応室がそれぞれ独立している例を説明したが、これに代えて、図７に示す変形例のバイオチップ５０のように、各反応室５１が溝状の流路５２で接続され、流路５２は、試液貯留部５３と接続されるように構成されてもよい。このようにすると、試液貯留部５３に圧力を加えることによって、すべての反応室５１に一括して試液を供給することができる。

また、温度検知部を第１温度検知部の１種類のみ設ける場合は、反応時の設定温度、製造、輸送時の温度のいずれのインジケータとしても構わない。どちらを設けるかは、配置される試薬等の特性に応じて適宜決定することができる。

さらに、上述の実施形態においては、反応室の大きさがすべて同一である例を説明したが、これに代えて、大きさの異なる複数の反応室が基板上に形成されてもよい。この場合、それぞれの反応室と同一の大きさの凹部を設けて温度検知体を配置すれば、それぞれの大きさの反応室に対応する温度検知部を構成することができる。

加えて、上述の各実施例においては、ＰＣＲ法又はインベーダー法に使用するバイオチップに適用される例を説明したが、本発明はこれには限定されない。本発明は、適切な温度管理を必要とする試薬等が反応室に配置されたあらゆるバイオチップに適用することができる。

本発明の一実施形態のバイオチップを示す平面図である。 （ａ）は同バイオチップの反応室、（ｂ）は同バイオチップの第２試薬留置室、（ｃ）は同バイオチップの第１温度検知部、（ｄ）は同バイオチップの第２温度検知部をそれぞれ示す断面図である。 本発明の一実施例のバイオチップを示す平面図である。 （ａ）は同バイオチップの反応室、（ｂ）は同バイオチップの第１温度検知部をそれぞれ示す断面図である。 同バイオチップの第１温度検知部内の第１温度検知体が変形した状態を示す図である。 同バイオチップの第１温度検知部内の第１温度検知体が変形しなかった状態を示す図である。 本発明のバイオチップの変形例を示す平面図である。

符号の説明

１、２０、４０、５０ バイオチップ
２、２１ 基板
３、２２、５１ 反応室
４、４６ 第１試薬（試薬）
８、２８、４４ 第１温度検知部（温度検知部）
９、４２ 第２温度検知部
１０、１１、２３、２４ 凹部
１２、２７、４３ 第１温度検知体（温度検知体）
１３、４１ 第２温度検知体
１５、３２ 蓋材
２９ プライマー（試薬）

Claims (6)

1. 基板上に複数の反応室を有するバイオチップであって、
   前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部に、所定の第１温度を融点とする温度検知体が配置された温度検知部を備え、
   前記温度検知部内の前記温度検知体の形状又は色彩によって前記反応室が前記第１温度以上の環境下にあったかどうかを判定できることを特徴とするバイオチップ。
2. 前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部に、前記第１温度と異なる第２温度を融点とする第２温度検知体が配置された第２温度検知部をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
3. 前記複数の反応室の少なくとも１つに、試薬が配置されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。
4. 前記試薬は、酵素又は核酸を含むことを特徴とする請求項３に記載のバイオチップ。
5. 前記複数の反応室の上面を覆う蓋材をさらに備えることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のバイオチップ。
6. 基板上に複数の反応室を有するバイオチップの前記反応室に加えられた温度を検知する温度検知方法であって
   前記バイオチップに前記複数の反応室のいずれかと同一の大きさの凹部を形成する工程と、
   前記凹部に所定の第１温度を融点とする温度検知体を配置する工程と、
   を備えることを特徴とするバイオチップの温度検知方法。

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