JP2008521600A - 混合様式アニオン交換型分離材料 - Google Patents

Abstract

本発明は、リガンドが固定化される支持体から構成される、混合様式アニオン交換材料に関する。リガンドは、環式一塩基性誘導体に基づく少なくとも１つの塩基性領域が、アニオン交換領域としての２つまたは３つ以上の環および少なくとも１つの非イオン性結合領域と組み合わされている。塩基性領域は、使用の条件下でイオン化され、第二、第三または第四窒素を含み、弱（ＷＡＸ）または強（ＳＡＸ）塩基性のアニオン交換領域を形成することができる。非イオン性結合領域により、材料の全体的な疎水性／親水性の調整が可能になり、これは、分離されるべき溶質のための第２の結合部位を表す。この第２の結合部位への結合は、逆相（ＲＰ）、疎水性相互作用（ＨＩＣ）または親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）に基づいている。化学結合により、または疎水性部分、例えばアルキル（レン）鎖もしくは親水性部分、例えばアミド構造により表すことができるリンカー部位は、支持体を結合領域に、および結合領域を互いに結合させる。

Description

本発明は、分離科学に関し、特に化合物、例えば薬剤および他の医薬、毒素、薬剤および毒素の代謝産物、農薬、合成ペプチド、生体分子、例えばペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物の選択的認識および結合、並びに妨害性の、および不所望な共存する化合物、干渉物または不純物からのこれらの分離を可能にする、新規な収着材料および分離材料の発明に関する。該材料は、分析的、および調製的規模での分離において用いられるべきものである。調製用の下流の精製プロセスは、本発明の材料の他の主な目的である。

本発明の背景および従来技術
薬剤物質、農薬、診断薬、食品添加物、風味剤などとして用いるために製造された化学的化合物は、純度または化学的および立体化学的不純物の存在の観点における根本的な厳密な品質要求である。典型的な純度のレベルとして、＜０．１％の不純物を有する化合物が、薬化学において純粋であると言われる。従って、安全性の理由により、薬剤物質における不純物の報告されている限界は、０．０５％に設定されており、これは、品質の制御のために採用されている分析的手順が、不純物をこの百分率または定量限界まで検出し、定量することができる必要があることを、意味する。このような低い定量限界は、達成するのが困難であり、高い選択性を有し、これによりこれらの精度が確実になるアッセイを必要とする。クロマトグラフィー的方法がしばしば、特に高度に感受性であり、選択的な質量分析検出法と関連して、これを行うための好ましい方法である。

通常プロセスおよび薬剤に関連する有機化合物である不純物は、製造または貯蔵から発生し、出発物質、反応の副産物、分解産物、試薬、リガンド、触媒などに起因し得る。合成の後、生成物は、通常一般的な化学的手段、例えば抽出、結晶化、蒸留により精製される。しかし、結果として上記で特定した高度な薬学的品質（純度）とするために、最終的なクロマトグラフィー的精製工程が、現在ではしばしば用いられる。大部分の場合において、これは、化学的に改変された表面を有するクロマトグラフィーである。本発明の目的である材料は、分析的な、および調製的な用途の両方に適合し、塩基性、中性、酸性および両性化合物のために用いることができる。

未だ満足に解決されていない１つの精製の問題は、特に薬剤、薬剤輸送体、診断薬、放射性医薬品、合成ワクチン、生理活性研究化合物、構成要素、構造的プローブ、分析標準などとして格別に広い用途を有する合成ペプチドについて生じる。

一般的に、ペプチドの合成は、これが固相合成または液相の化学的方法によるものであっても、目的のペプチドのみならず、脱保護、カップリングの失敗（欠失した配列）、保護された側鎖（例えばＧｌｕのｔ−ブチルエステル）の加水分解、イミド生成、脱アミド化（例えばＧｌｕ、Ａｓｎ側鎖の）、ラセミ化（エピマーまたはジアステレオマーを生成する）、酸化、Ｓ−Ｓ交換、β脱離などによる複数のカップリングからもたらされ得る不純物をも生成する。最初の標準的な洗浄工程の後に、これらの不純物は尚存在する。従って、最終的なクロマトグラフィー的精製工程が、結果として所要の純度を得るために要求される。

現在では、この最終的なクロマトグラフィー的精製は、通常有機改変剤としてアセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）を用いて、通常オクタデシル改変シリカ（ＯＤＳ）を固定相として用いて、勾配溶離逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により行われる。この方法は、原理的に良好な選択性および高度な効率を提供するが、不都合なことに、これはしばしば、特に極めて親水性の、またはまた極めて疎水性のペプチド並びにしばしば不純物として存在する構造的に密接に関連するペプチドについて失敗する。このような副産物は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、共存する主要でないピークとして、主要な成分のピークの前端または後端に近接して出現し、不十分に分離される。これが、十分な生産性を達成するために過剰負荷が必須である調製的分離に達する場合には、これらは、主要成分と同時溶離する傾向があり、これは、特にペプチドを薬剤品質（０．１％より少ない不純物）において生産しなければならない場合に決定的に重要であり、妨害的である。

同様の問題および考慮が、また固相合成により調製される薬学的に関連する合成オリゴペプチドに有効である。

クロマトグラフィーの他の主要な適用分野は、生体高分子、特にタンパク質のこれらの精製のための下流での加工となった。クロマトグラフィー的に精製されるタンパク質には、酵素、ホルモン、レセプター、輸送体、血漿タンパク質、モノおよびポリクローナル抗体、膜タンパク質、組換えタンパク質などが含まれる。例えば発酵ブロスからの下流の加工は、いくつかの段階からなり、ここで、クロマトグラフィーは、初期の精製工程においても受け入れられる選択肢である。例えば、捕獲段階および／または細胞分離において、細胞ブロスの精製のための比較的新しい方法である膨張床クロマトグラフィーを、用いることができる。分離媒体は、カラム中にゆるく詰め込まれており、実行の間に流動化される。従って、細胞は、カラムを通って流れることができ、同時にタンパク質は、分離材料に結合することができる。媒体のイオン強度は、細胞が結合するのを防止するために、十分高くなければならない。

あるいはまた、安価なイオン交換媒体を、この最初の精製工程のためのバッチ吸着のために、用いることができる。典型的な精製工程は、通常イオン交換などの様式を用いたクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーリガンド、例えば錯化金属イオン、プロテインＡ、プロテインＧ、ヘパリンまたは染料を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、行われる。粒子状吸着剤床の代わりに、誘導体化された膜を用いることが、興味深い代替として知られている(M. Kastner編、Protein Liquid Chromatography, Journal of Chromatography Library, 第６１巻、Elsevier, Amsterdam, 2000)。さらに、逆相クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーおよびイオン交換が、タンパク質製品の最終精製（研磨(polishing)）のために、またはウイルスおよび内毒素除去のために、しばしば用いられる。しばしば、生体適合性の条件が、必要であるかまたは少なくとも好ましい。これは、変性をもたらし得る溶離条件を必要とする標準的なＲＰ材料および方法の顕著な欠点である。

さらに、低い試料負荷能力が、ＲＰクロマトグラフィーについて、例えば多くの他のタンパク質クロマトグラフィー様式、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）またはアフィニティークロマトグラフィー、例えばクロマトグラフィーリガンドとしてのプロテインＡ／Ｇについて、典型的である。生理活性を維持することが必要である場合には、イオン交換またはアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を採用することが、必要である。後者が低い能力を有する一方、高い試料負荷能力は、イオン交換の強度の１つである。これらのおよび他の利点および欠点は、タンパク質分離についてのテキストに（例えばM. Kastner（編）、Protein Liquid Chromatography, Journal of Chromatography Library, 第６１巻、Elsevier, Amsterdam, 2000中に）詳細に述べられている。

本発明者らは、本明細書中で、アニオン交換部位および非イオン性相互作用に基づく結合部位を共に含むリガンドで改変された種々の支持材料に基づく分離媒体についての概念を提案する。異なる結合領域は、それぞれの構造的要素の連続的な組み合わせ中のリガンド構造中に統合され、従って多重様式型の分離材料をもたらす。本発明の分離材料のアニオン交換部位は、２つまたは３つ以上の環を第二、第三または第四アミン基として有する環系中に、環内窒素を含む。このような環系の例は、キヌクリジンまたはトロパン系である。これにより、個別の化学的相互作用性基を担体の表面改変として用いる材料と比較して、大幅に増強された選択性および大いに改善された負荷能力などの驚異的な効果がもたらされる。新規な分離材料は、薬剤、薬剤中間体、毒素、薬剤および毒素の代謝産物、精製化学製品、医薬、合成ペプチド、生物学的化合物、例えばペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡおよび炭水化物並びに多くの他のものなどの化合物の分離および精製のために、用いるべきものである。

伝統的に指摘されているように、薬剤、医薬およびペプチドのための最も頻繁に用いられている分離および精製方法は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。分離を、長いアルキル鎖（Ｃ８もしくはＣ１８相）または疎水性ポリマー（ポリマーＲＰ固定相）により形成された疎水性表面領域または表面層を有する材料上で、行う（典型的な例について、H. Schlueter、M. Kastner（編）、Protein Liquid Chromatography, Journal of Chromatography Library, 第６１巻、Elsevier, Amsterdam, 2000, １５７頁、表３．１中またはV.R. Meyer, Practice of high-performance liquid chromatography, Salle + Sauerlaender, 1990, 付録、市販のカラムの概要を参照）。選択性は、分離されるべき溶質の親油性の差異に基づいており、これは、結果として溶質の区別された吸着となる。いくつかの新規なＲＰ相は、親水性末端キャッピング(end-capping)を有するかまたは、親水性基、例えばアミド、カルバミン酸もしくはスルホンアミドをアルキル鎖中に包含し、これは次に、極性の埋め込まれたＲＰ相と呼ばれる。

これらのＲＰ相により、これらの操作が、また純粋に水性の溶離剤を用いて可能になり、いくつかの例において、極性基は、追加の保持寄与を、例えば親水性溶質に付与する。このようなＲＰ型の固定相は、多様な変法において、多数の供給者から入手可能である。これらは、本発明の材料と、アニオン交換部位の欠如により異なる。同様に、典型的にフェニルまたはＣ１〜Ｃ８アルキルリガンドを相互作用性部分として担持し、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のために用いられる、適度に疎水性の分離材料（例えば、L.R. Jacob、M. Kastner（編）、Protein Liquid Chromatography, Journal of Chromatography Library, 第６１巻、Elsevier, Amsterdam, 2000, ２４０頁、表４．１中を参照）もまた、イオン（アニオン）交換のためのイオン性相互作用部位を有しない。同一のことが、この正に帯電した相互作用性部分（アニオン交換部位）が不足している親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）のための多くの固定相にも該当する。

対照的に、例えばP.H. Roos、M. Kastner（編）、Protein Liquid Chromatography, Journal of Chromatography Library, 第６１巻、Elsevier, Amsterdam, 2000, １８頁、表１．４中により要約された古典的なアニオン交換材料は、疎水性の長いアルキル鎖リガンドおよび従って疎水性相互作用寄与が不足している。一方、慣用のアニオン交換体はまた、ＨＩＬＩＣ材料に典型的である追加の親水性相互作用部位を欠いている。さらに、古典的なアニオン交換体およびＨＩＬＩＣ適合性アニオン交換体は、非環式アミンに基づいており、または言い換えると、構成要素として非環式の脂肪族アミン類から合成されており、従って本発明からこの基準により明確に区別することができることが、指摘される。

最近、少なくとも２つの相互作用の様式、即ちほとんどの場合においてイオン交換および疎水性相互作用に基づく混合様式のクロマトグラフィーが、一層一般的になった。その理由は、しばしば、達成された分離が、対応する別個の個別の単一様式のクロマトグラフィー分離より性能が優れていると見られるからである。このような混合様式のクロマトグラフィーを、多くの種々の変法において行うことができ、これは、L.W. McLaughlin (1989)により、Chem. Rev. 89, ３０９〜３１９頁において概説されている：

区分１：互いにいくらか直交している個別の慣用の単一様式分離材料が詰め込まれた、種々のカラムのオンライン(on-line)カップリング：例えば、逆相カラムを、イオン交換カラムにオンラインカップリングさせることができる。混合様式のアニオン−カチオン交換／親水性相互作用クロマトグラフィーは、例えばStregeら(Anal. Chem., 2000, 72, 4629-4633)により用いられた。この方法は、異なるカラム（個別の吸着剤、即ちアニオン交換体、カチオン交換体およびＨＩＬＩＣ材料を詰め込んだ）の連続的なオンラインの組み合わせにより得られた選択性を、個別のカラムのみにより得られた選択性と比較している。

区分２：混合床カラムを有する混合様式のクロマトグラフィー：異なる分離材料、例えばイオン交換体および逆相粒子の、単一のＨＰＬＣカラム中での配合により、個別の慣用の単一様式のクロマトグラフィー粒子が詰め込まれたカラムと比較して、補完的な選択性をもたらすことができる混合床カラムが得られる。例えば、２種のタイプの異なる材料、例えばＲＰ粒子およびアニオン交換体（例えば強力なアニオン交換体粒子）を単一のカラム中で配合することは、異なる保持機構を組み合わせることへの代案として提案され、このようなカラムは、例えばDuet（登録商標）の商品名でHypersilから商業的に入手できる。

区分３：異なる相互作用的な官能、例えばイオン交換体基および疎水性部分は、分離材料の異なる成分上に位置し、即ち、一方は専用のクロマトグラフィーリガンドに位置し、他方は支持体に位置し、従って空間的に分離している。しばしば、専用の、またはカスタマイズされた官能基よりむしろ不所望な残留する相互作用性の基である、支持体における相互作用部位は、分離体(separands)により十分に接近可能ではなく、従って対応する選択性が不足している。このような材料は、通常、特定の官能性または物理化学的特徴、例えば疎水性の性質を有する支持体が他の官能性、例えばイオン性基で誘導体化されている場合に、得られる。このような場合において、溶質の支持体との相互作用は、通常有害であると評価され、従って回避されるかまたは少なくとも最小化される（例えば、適切な移動相条件、末端キャッピング、被覆または遮蔽手順の選択により）、二次的な相互作用と見なされる。（アルキル）アミノ改変ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）材料は、この区分に分類されるべきものである(C. G. Huberら、LC-GC, 14, 1996, 114)。

区分４：他の変法において、２種の補完的な相互作用性官能が、２つの異なる空間的に分離したクロマトグラフィーリガンド上に存在し得るが、同一の支持粒子上に無秩序に固定され、２つの異なるリガンドの制御されていない空間的な分布をもたらす：シリカ基盤上のこのような吸着剤を、例えば各々相互作用性部分の１種を担持する２種の異なるシラン類の混合物を固定手順のために用いる場合に、合成することができる。２種の異なる相互作用機構、例えばアニオン交換および疎水性相互作用の、単一のクロマトグラフィー粒子上での、しかし２つの異なる相互作用性リガンド上での組み合わせ（例えば、トリメチルアンモニウムプロピルおよびシリカ上に固定されたＣ８またはＣ１８アルキル基）は、以前固相抽出において活用された(C.F. Poole, Trends Anal. Chem., 2003, 22, 362-373; M.-C. Hennion, J. Chromatogr. A, 856, 1999, 3-54)。

このような混合様式のＳＰＥ材料は、多くの供給者から商業的に入手でき、これには、Waters（Oasis（登録商標）MAX）およびInternational Sorbent Technology（Isolute（登録商標）HAX)が含まれる。混合様式逆相／アニオン交換体のこのようなタイプは、一方がＣ１８アルキル基を担持し、他方が第四Ｎ−ベンジルトリメチルアンモニウム基をビニル改変シリカ粒子の表面上に担持し、ここでイオン交換部位が電気浸透流の発生の機能を満たし、一方疎水性リガンドは、主に選択性および分離の原因となる、２種のタイプのモノマーの共重合により、毛管電気泳動（ＣＥＣ）のために特別に開発された(Schererら、J. Chromatogr., A 924, 2001, 197-209)。

区分５：最後のタイプの混合様式のクロマトグラフィー材料は、２種（または３種以上）の異なる相互作用部位を、単一のクロマトグラフィーリガンド中に有する。

本発明は、第５の区分に属する新規なタイプの混合様式のクロマトグラフィー媒体を提供する：異なる相互作用部位、例えばアニオン交換および疎水性または親水性部分が単一のクロマトグラフィーリガンド中にある。第５の区分に関連する従来技術の文献および商業的な製品を、以下に要約する。

WO 96/09116には、窒素含有複素芳香族塩基を含む混合様式吸着剤が開示されている。同様の混合様式吸着剤は、WO 00/69872に開示されている。WO 01/38228には、アニオン交換吸着のための方法並びに、正に帯電した構造および疎水性構造を含む複数の混合様式アニオン交換リガンドを担持する塩基性マトリックスを含むアニオン交換体が開示されている。この文献に開示されている多数の代替のリガンド構造の中で、数種の環状構造がまた述べられている。同一のことが、WO 97/29825の開示に該当する。

米国特許第5,147,536号には、アニオン性基が互いに２個の原子の距離において２つの正に帯電した基からなるアニオン交換材料が、開示されている。これらの正に帯電した基は、直線状構造または環状構造の一部であり得る。これらの中には、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）の誘導体がある。この文献に開示されている発明において、アニオン性基を不溶性支持体に結合させるスペーサーは、同一の分子と相互作用しないと想定される。従って、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）の誘導体を含む吸着剤は、本発明の一部ではない。

WO 02/053252には、種々のタイプの混合様式吸着剤を用いた分離方法が開示されており、このうちの数種は、支持体に結合した１種より多いタイプのリガンドを含み、これによりリガンドの少なくとも１種は、帯電されていてもよく（例えば正に帯電されている）、イオン交換が可能である。

前述のタイプの商品化された混合様式吸着剤またはこの用途を開示している文献を、以下に述べる：
ＨＰＬＣカラム（商品名BSC 17、Cluzeau Info Labo, Saint Foy la Grande, 33220 Franceから）は、Ehrenstorferから商業的に入手でき、これには、疎水性アルキル置換基を含む第四級アニオン交換体が詰め込まれている；リガンドは、３−（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム）−プロピルシリカである（このタイプの材料の用途は、J.-P. Steghensら(2003)、J.Chromatogr. B 798, ３４３〜３４９頁により記載されている）。同様に、Allsep Technologiesは、疎水性アルキル基で誘導体化された正に帯電した官能基を含むカラムを提供している（商品名Primesep（登録商標）B、Primesep（登録商標）B2）。

正確な構造は開示されていないが、当該出願指針のスキームにおいて、塩基性基は、非環式第四アンモニウムイオンである。D.M. Lubmanおよび共同研究者は、ペプチドのＣＥＣ質量分析のためにAlltech (Deerfield, IL)から得られた混合様式（Ｃ１８逆相／アニオン交換）の固定相の使用を記載している（Anal. Chem., 71, (1999), １７８６頁以降）。当該著者らによると、材料は、逆相（Ｃ１８）およびジアルキルアミンを共に固定された１：１の比率で含む単一のリガンドと結合した、球形のシリカ基材からなる。同様に、HayesおよびMalikは、塩化Ｎ−オクタデシルジメチル（３−トリヒドロキシシリルプロピル）アンモニウムリガンドがインサイチュでゾル−ゲルマトリックス中に導入されたシリカモノリスの開発およびこれらのＣＥＣについての評価に関して報告している（Anal.Chem., 72, (2000), ４０９０頁以降）。

J. Zhaoらは、アニオン交換および疎水性相互作用並びにルイス酸／塩基相互作用を有する混合様式保持機構を有するＨＰＬＣのための強力なアニオン交換材料としての、第四級化されたトリメチルアミン化されたポリスチレンジルコニアを記載した(Anal. Chem. 72, (2000), ４４１３〜４４１９頁)。Burtonらは、疎水性アミンリガンドをエピクロロヒドリン(epichlorohydrin)に付着させることにより得られた疎水性およびイオン性基を担持する、混合様式のセファロースおよびペルロザ(Perloza)ビーズセルロースマトリックスを調製した(Biotechnology & Bioengineering, (1997), 56, ４５〜５５頁)。B.-L. Johanssonらは、芳香族および非芳香族第一および第二アミン類（または両方）並びにさらにアニオン交換体部位に隣接した水酸基に基づくリガンドを有する、タンパク質を高い塩強度において発酵ブロスから捕集するための多様式アニオン交換分離媒体の合成および評価について報告した(J. Chromatogr. A, 1016, (2003), ２１〜３３頁)。

疎水性電荷誘導クロマトグラフィーのためのBioSepra（登録商標）製品（Ciphergenの）、例えばMEP HyperCel（登録商標）材料および混合様式クロマトグラフィーのためのMBI HyperCel（登録商標）材料はまた、１つより多い分離機構を単一のリガンドにおいて組み合わせる。MEP HyperCel（登録商標）材料は、４−ビニルピリジンをメルカプトアルキル化されたクロマトグラフィー支持体上に、ラジカル付加により固定することにより得られ、分離材料の表面上で４−［２−（アルキルチオ）−エチル］ピリジンリガンドが得られる。ピリジン基は、弱い塩基性であるに過ぎない（ｐＫ_ａ＝４．８）。基本原理は、リガンド（高いｐＨにおける、ｐＨ＞ｐＫ_ａ、即ちｐＨ＞５．８）と疎水性の、および正に帯電した基を共に含む溶質（生体分子、例えばタンパク質、特に抗体のために特別に設計された）との間の疎水性相互作用または正に帯電したクロマトグラフィーリガンド（低いｐＨにおける、ｐＨ＜ｐＫ_ａまたはｐＫ_ａの周辺、即ち４〜５．８のｐＨ）と正にイオン化された溶質との間の反発静電気的相互作用のいずれかを活用することである。

２種の異なるタイプの相互作用は、典型的には連続的に活用され、即ち例えば「高い」（中性周辺の）ｐＨにおける抗体の吸着または結合および低いｐＨ（ピリジンのｐＫ_ａ周辺）における脱着または溶離である。混合様式クロマトグラフィーのためのMBI HyperCel（登録商標）材料は同様に、芳香族窒素含有基に基づいているが、これは、MEP HyperCel（登録商標）材料とは対照的に、さらに強酸性のスルホン酸基を担持している。リガンドは、メルカプト基によりエポキシ官能化支持体に求核置換により結合している２−メルカプトベンズイミダゾール−５−スルホン酸である。

得られた材料を、混合様式カチオン交換体として分類することができる。追加の混合様式の相、例えば混合様式ＲＰ／カチオン交換体（例えば弱いカチオン交換体であるＡＢｘ液体クロマトグラフィーカラム：このシリカに基づく混合様式イオン交換マトリックスは、Rossら、J. Immunological Anatomy and Biology, (1987), 102, ２２７〜２３１頁により記載されているように、モノクローナル抗体の精製のために用いられた）、または固定された人工的膜クロマトグラフィー相（C.PidgeonのＩＡＭ相）、または混合様式両性イオンＨＩＬＩＣ材料(ZILIC, K. Irgum)が、文献中に開示されている。

従来技術の前述の文献のいずれにも、環内窒素を有し、第二、第三または第四アミン基として２個または３個以上の環を有する一塩基性環系に基づくアニオン交換基、例えばキヌクリジンおよびトロパン、並びにこれらの異性体または式Ｉｃ〜Ｉｆの一層複雑な構造を有する混合様式吸着剤は開示されていない。

キニン並びにこの異性体および誘導体、例えばキニジン、１０，１１−ジヒドロキニンまたは１０，１１−ジヒドロキニジンは、キラルなエフェクターとして用いられていた(J. Chromat. A. 741 (1996)、３３〜４８頁、およびTetrahedron Asymmetry 14 (2003)、２５５７〜２５６５頁)。良好なキラル分離を達成するために、キラルクロマトグラフィーのための吸着剤は、キラルな相互作用が圧倒的に最も顕著なものであり、他のタイプのキラルではない相互作用（例えばイオン性または疎水性）が可能な限り回避されるように、最適化される。これらのアルカロイドは、キナアルカロイドとして要約される。このようなキナアルカロイドを含む吸着剤は、本発明の一部ではない。

発明の概要
本発明は、単一官能相互作用リガンド中のモジュール相互作用／結合領域で構成された、多重様式アニオン交換型分離材料に関する（代表例について、以下の式Ｉを参照）。

式Ｉで表される混合様式アニオン交換材料は、少なくとも支持体（（ＳＵＰ）；担体、マトリックス）および使用の条件の下でイオン化され、従ってアニオン交換部位を表す弱い（ＷＡＸ）、または強い（ＳＡＸ）塩基性の官能性（ＡＸ）を含むリガンド、非イオン性相互作用に適する部位（ＮＩ）、およびこれらのモジュールの間のリンカー（Ｌ）から構成されている。非イオン性相互作用部位およびこの構造に依存してリンカーにより、吸着剤の全体的な疎水性／親水性の調整が可能になる。式Ｉにおけるリンカー部位（Ｌ）は、互いに独立して以下に詳細に記載するすべての意味を有することができる。本発明において、アニオン交換部位は、環系中に環内窒素を有し、第二、第三または第四アミン基として２個または３個以上の環を有する構造、例えば、例えばキヌクリジンおよびトロパン環系の導入により得られたものに基づいている。本発明のアニオン交換部位およびこれらの好ましい態様を、専用の章（「アニオン交換部位（ＡＸ）」）において以下に記載する。

相互作用性リガンド上の個別の相互作用領域の化学的および空間的配置（配列）は、可変であり、これにより結合効果の調節が可能になる。これらの多重結合部位の組み合わせおよび配列（アニオン交換および疎水性および／または親水性の、即ち水素結合する基）により、材料は、１つより多い相互作用および吸着の機構により化学的化合物を結合および分離することができる。

特に、本発明は、支持体および相互作用性リガンド部分を含み、これにより前記相互作用性リガンド部分が、モジュール結合領域の連続的な組み合わせを含み、これにより前記モジュール結合領域が、使用の条件下でイオン化可能な少なくとも１つのアニオン交換部位および少なくとも１つの非イオン性結合部位を含む、混合様式アニオン交換材料であって、前記アニオン交換部位が、環内窒素を有するオリゴ環式(oligocyclic)アザ化合物を含み、ただし、環内窒素を有する前記オリゴ環式アザ化合物が、前記支持体に結合した１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）の誘導体でもキナアルカロイドの一部でもないことを特徴とする、前記混合様式アニオン交換材料に関する。本発明はまた、本発明の混合様式アニオン交換材料の製造方法およびこれらの混合様式アニオン交換材料の、少なくとも２種の溶質のクロマトグラフィー分離への使用に関する。

発明の目的
本発明の目的は、新規な混合様式アニオン交換材料を提供して、従来技術の混合様式アニオン交換材料の性能を改善することにある。特に、改善は、以下のことに関する：
ａ）改善された混合様式アニオン交換体は、親水性の、および疎水性の塩基性、酸性、中性および両性溶質（分析体または分離体）の同時の分離を、単一の工程、調製的または分析的クロマトグラフィー実行において可能にしなければならない。

ｂ）これらは、薬剤、薬剤中間体、毒素、薬剤および毒素の代謝産物、殺虫剤、精製化学製品、中間体、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸、炭水化物およびこのような種の混合物などの化合物の、関連する化合物または不純物からの分離および精製のために、使用可能でなければならない。
ｃ）これらは、ａ）およびｂ）において述べた化合物の分離についての、もとの単一様式のクロマトグラフィー手法、例えば逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーと比較して、および従来技術の混合様式吸着剤と比較して補完的な、および／または改善された選択性を提供しなければならない。

ｄ）このような改善された材料は、改善された分離から生じ、イオン交換機構の存在による、増強された試料負荷能力を提供しなければならない。
ｅ）改善された分離および増強された試料負荷能力により、調製的またはプロセス規模の分離または精製における生産性における顕著な進歩がもたらされなければならない。

ｆ）混合様式吸着剤を、ａ）およびｂ）において述べた化合物および特に低分子量化合物、薬剤およびペプチドのための従来技術の分離材料である典型的な逆相分離媒体と比較して、純粋に水性の溶離剤を伴って、いかなる有機改変剤をも伴わずに、または少なくとも比較的低い有機改変剤含量を伴って、使用可能であるように設計しなければならない。
ｇ）混合様式クロマトグラフィー機構は、分離の最適化並びに微妙な調整のための一層多いパラメーターおよび移動相変数を提供する。これにより、分離するのが困難である化合物混合物を分離することができる機会および一層多い化合物ピークを互いに単離することができる機会がもたらされる。

発明の詳細な説明
本発明は、単一官能相互作用リガンド中のモジュール相互作用／結合領域で構成された、多重様式アニオン交換型分離材料に関する（式Ｉを参照）。

式Ｉで表される混合様式アニオン交換材料は、以下のモジュールを含む：少なくとも支持体（（ＳＵＰ）；担体、マトリックス）および使用の条件の下でイオン化され、従ってアニオン交換部位を表す弱い（ＷＡＸ）、または強い（ＳＡＸ）塩基性の官能性（ＡＸ）を含むリガンド、非イオン性相互作用に適する部位（ＮＩ）、およびこれらのモジュールの間のリンカー（Ｌ）。非イオン性相互作用部位およびこの構造に依存してリンカーにより、吸着剤の全体的な疎水性／親水性の調整が可能になる。式Ｉにおけるリンカー部位（Ｌ）は、互いに独立して以下に詳細に記載するすべての意味を有することができる。本発明において、アニオン交換基は、環内窒素を有し、第二、第三または第四アミン基として２個または３個以上の環を有する一塩基性環系、例えば、例えばキヌクリジンおよびトロパン環系の導入により得られたものに基づいている。本発明のアニオン交換部位を、専用の章（「アニオン交換部位（ＡＸ）」）において一層詳細に記載する。

以下において、支持体（ＳＵＰ）、塩基性官能（（ＡＸ）、（ＷＡＸ）、（ＳＡＸ））、非イオン性相互作用部位（ＮＩ）およびリンカー（Ｌ）の選択に関して、詳細を示す。

支持体（ＳＵＰ）：
ほとんどの用途のために、本発明のリガンドを、固体上に、または時折支持体とも呼ばれる液体マトリックス液液相系中に固定する必要がある。すべての場合において、支持体は、別個の相を形成し、リガンドが選択的に認識されるべき目的の化合物を含む周囲の溶液に適切に曝露されるのを可能にし、これらの結合を可能にする。従って、担体の化学的および物理的性質は、可変であり、固定は、吸着性または共有結合性のいずれであってもよく、後者が強く好ましい。支持体は、目的の化合物の結合に関して不活性(inactive)（不活性(inert)）でなければならないが、吸着剤の化学的および物理的安定性を保証する機能を有する。流水式用途、例えばクロマトグラフィーにおいて、支持体および従ってこの物理的特性により、収着材料の動力学的特性が決定される。

本発明において、支持体は、無機、有機または混合された無機−有機複合型の多孔質または非孔質材料であってもよい。このような支持体材料には、商業的に入手できる、およびカスタマイズされた（自製の）ビーズ、モノリシックまたは連続性材料、ナノ粒子、膜、樹脂、表面が限定された層、不均一な表面、磁性ビーズが含まれる。支持体を本発明の主題であるリガンドで適切に改変した後に、これらの材料を、任意の形状で、容器または型、例えばカラム、毛細管、μチップ、ディスク、積み重ね層および同様の様式、封入物または支持媒体（基板）中に、材料の適用を可能にする技術的解決法として充填するか、詰め込むか、または堆積させる。

化学的には、支持体（マトリックス）を、シリカ（ＳｉＯ_２）、アルミナ（Ａｌ_２Ｏ_３）、ジルコニア（ＺｒＯ_２）、チタニア（ＴｉＯ_２）、グラファイト、セラミック材料、ゾル−ゲル誘導材料、有機−無機シリカ含有複合材料、随意に置換されている架橋および非架橋ポリシロキサン類、随意に置換されている、および非架橋のビニルモノマー、例えばポリ（メタ）アクリレート類、ポリ［ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート］類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、混合スチレン−（メタ）アクリレートポリマー類、（開環）メタセシスポリマー類、多糖類、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、ポリビニルアルコールから得られるポリマーのいずれか、並びに特定的に官能化されてセレクターの固定を可能にするこれらの材料のいずれかを含む群から採用する。

好ましい支持体の中には、多孔質シリカビーズ、ガラスビーズ、ポリ（メタ）アクリレートポリマービーズ、例えばポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンメタクリレート）およびポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート−コ−エチレンメタクリレート）、ポリ（メタ）アクリルアミドビーズ、シリカモノリス、ポリ（メタ）アクリレートおよびポリスチレンモノリス、ポリ（メタ）アクリルアミドモノリス、ポリスチレン樹脂があり、これは随意に、セレクターの固定のための張り出した反応性基で改変されている。支持体をまた、直線状合成もしくは天然ポリマー主鎖またはからませたポリマーマトリックスと見なすことができるため、従ってスペーサーおよびリガンドは、実際には、目的の化合物の選択的な分子認識の原因となるポリマーの張り出した基を表す。グラフトポリマー類は、他の群の有用な支持体である。

前述の区分の支持体は、当該分野において十分知られている。これらの支持体の多くは、商業的に入手できる。

アニオン交換部位（ＡＸ）：
リガンドの相互作用部位および結合領域の１つは、アニオン交換部位（ＡＸ）である。アニオン交換部位は、シントンに第二、第三および／または第四アミノ官能性またはアミジンもしくはグアニジン官能性を導入することから得られる。従って、本発明において、アニオン交換部位は、第二、第三および／または第四アミン基またはアミジンもしくはグアニジン基から選択された塩基性基を含む、２つまたは３つ以上の環構造を有する環式化合物のアザ誘導体である。環式化合物は、飽和であるかまたは（部分的に）不飽和であってもよいが、複素芳香族ではない。このような環系の例は、キヌクリジンおよびトロパン環の導入により得られた、１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン（キヌクリジン）、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン、８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］ノナン、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アザビシクロ［４．４．０］デカンである。

同様の一層複雑な環系、例えば三環系環系を、１−アザ−アダマンタンから誘導することができる。従って、オリゴ環式アザ化合物の用語を、第二、第三および／または第四アミン基として２個または３個以上の環を有する環状系中に環内窒素を含む環系についての一般的用語として用いる。上記で例示した二環式および三環式シントンの例を、式ＩＩに示す。これらの官能基は、材料が用いられ、従ってイオン化される条件の下でプロトン化される。従って、正に帯電した基は、慣用のイオン交換体材料と同様に、接触した溶質混合物中の溶質の補完的な負に帯電した基と、イオン性（静電気的）相互作用により相互作用し得る。１−アザ−アダマンタンまたは１，３−ジアザ−アダマンタンから誘導された三環系環系の例は、Angew.Chemie (1962) 74, ３６１〜３７４頁中に開示されている。他の三環系シントンは、商業的に入手できる：例えば３，５，７−トリメチル−１−アザ−アダマンタン−４，６，１０−トリオンまたは１，３，５−トリアザ−アダマンタン−７−イルアミン。

本発明において、アニオン交換部位は、２つまたは３つ以上の環を有し、少なくとも１つの第二、第三および／または第四アミノ基を有する複素脂環式(heteroalicyclic)アザ化合物から起因する。第二および第三アミン類を含むリガンドは、弱塩基性構造を形成する。これらのシントンの第二および第三アミノ基を、セレクター合成の最後の段階として容易に第四級化し、第四アミン類および強塩基性セレクターを得ることができる。

典型的に、脂肪族オリゴ環式アザ化合物中の環内窒素により、アニオン交換部位が付与される。好ましい態様において、ＡＸ部位の窒素原子は、２つの環構造の一部である。以下の環系は、このような構造の例である：キヌクリジン、トロパン、１−アザ−アダマンタン、ピロリジジン、およびキノリジジン、並びに１−アザ−アダマンタン環系。

環系の水素原子を、Ｒ、Ｘ、Ｎ（Ｒ’）_２、ＳＲ’、ＯＲ’、ＣＯＯＲ’から選択された１種または２種以上の残基により置換することができ、ここでＲは、Ｃ_１〜Ｃ_５アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_４アルケニルであってもよく、Ｘは、ハロゲン、特にＣｌまたはＢｒであり、Ｒ’は、ＨまたはＣ_１〜Ｃ_５アルキルである。ＲがＣ_１〜Ｃ_５アルキルである場合には、Ｒは、Ｘ、Ｎ（Ｒ’）_２、ＳＨ、ＯＨ、ＣＯＯＨにより置換されていてもよく、ここでＸおよびＲ’は、上記と同一の意味を有する。１つより多い置換がある場合には、置換基は、同一であっても異なっていてもよい。

立体中心またはすべての他のキラルな元素がリガンド中に存在する場合には、本発明は、すべての個別の立体異性体、およびすべてのラセミまたは非ラセミ混合物、および個別の立体異性体の混合物を、任意の比率で包含する。

式ＩＩは、本発明の材料のリガンド（セレクター）中のアニオン交換部位の発生のためのシントンの例を示す：式ＩＩ（ａ）〜（ｅ）：異なる置換基を有するキヌクリジン誘導体；（ｆ）：トロパノール；（ｇ）：アミノトロパン；（ｈ）：スコピン；（ｉ）：スコポリン；（ｋ）：プソイドペレチエリン；（ｌ）：１−アザ−アダマンタン；（ｍ）：１−アザビシクロ［３．３．０］オクタン（ピロリジジン）；（ｎ）：キノリジジン；（ｏ）：それぞれ２−アザビシクロ［４．３．０］ノナン−２−カルボン酸（ｎ＝１）、１−アザビシクロ［４．４．０］デカン−２−カルボン酸（ｎ＝２）；（ｐ）：１−アザビシクロ［４．４．０］デカン−３−カルボン酸；（ｑ）：１，３−ジアザ−アダマンタン−６−オール；（ｒ）：１，４−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナン；（ｓ）：１，４−ジアザビシクロ［４．４．０］デカン；（ｔ）：１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカン。

好ましい態様において、リガンドは、式ＩＩ（ａ）〜（ｐ）に例示したように、１個の環内窒素原子を有するオリゴ環式モノアザ化合物を含む。特に好ましいのは、オリゴ環式モノアザ化合物を含むリガンドであり、ここで環内窒素原子は、式ＩＩ（ａ）〜（ｎ）に例示したように、少なくとも２つの環系の一部である。主に、好ましいのは、環内窒素を有するオリゴ環式アザ化合物を含むリガンドであり、これは、１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン（キヌクリジン）、８−アザビシクロ［３．２．１］オクタン、８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］ノナン（トロパン）、９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アザビシクロ［４．４．０］デカンおよび１−アザ−アダマンタンから選択される。

比較実験により示されるように、脂肪族オリゴ環式アザ化合物を有するアニオン交換体部位は、明らかに、従来技術の非環式脂肪族類似体と比較して、本発明のリガンドの驚異的な優位性を生じる。これは、例Ｃ１により例証される。例Ｃ２において例証するように、本発明のアニオン交換体部位は、明らかにまた、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）シントンを含むリガンドと比較して、驚異的な優位性を生じる。

非イオン性相互作用部位（ＮＩ）：
非イオン性相互作用部位（ＮＩ部位、式Ｉを参照）により、第２の様式の相互作用を導入することが可能になる。分離されるべき溶質に依存して、この部位は、逆相（ＲＰ）様式において、疎水性相互作用（ＨＩＣ）様式において、または親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）により作用し得る。一層詳細には、本発明の材料は、混合様式逆相／アニオン交換（ＲＰ／ＡＸ）、混合様式疎水性相互作用／アニオン交換（ＨＩＣ／ＡＸ）、混合様式親水性相互作用／アニオン交換（ＨＩＬＩＣ／ＡＸ）セレクター、またはＨＩＬＩＣおよびＲＰ親油性尺度の２つの極限の間のいずれかの箇所にある疎水性特性を有するすべてのＡＸセレクター、および固体または液体（ポリマー）支持体（ここでまた担体またはマトリックスと呼ぶ）から構成されている。リガンド構造は、溶質を液相環境中で材料と接触させた際に、混合物中の溶質の選択性結合および従って分離をもたらす材料の表面上の相互作用性部分を表し、一方担体は、通常は分離されるべき溶質との相互作用の観点において不活性であるかまたは無効である定義による。

従って、本発明の中心的な重要性の中に、本発明を構成する異なるモジュール結合部位を単一のリガンド部分ですべて含み、これにより当該リガンド中の個別の結合領域の位置的、幾何学的および空間的配置が可変であり、すべての実現可能な組み合わせを採り得るリガンドの化学構造がある。この可変性は、（ＡＸ）および／または（ＮＩ）部位が１つより多い部分中に存在する一層複雑な構造において、尚一層進化している。このようなリガンド構造の例を、式Ｉｃ〜Ｉｆに示す。この可変性により、このような一層複雑なリガンドは、イオン交換基が当該分野においてすでに知られているものであっても、これ自体で発明を表す。

非イオン性相互作用モジュールにより、それぞれセレクターの、および従ってまた最終的な材料の全体的な疎水性および親水性の調整が可能になる。リンカー部位は、主に水素および／または電子供与体／受容体部位に寄与する。非イオン性相互作用部位として導入された化学的シントンが、高度に疎水性の基、例えば直鎖状または分枝状脂肪族アルキル鎖である場合には、混合様式ＲＰ／ＡＸ材料が得られる。一方、非イオン性相互作用部位が極めて親水性の基、例えばポリエーテル、ポリヒドロキシル化アルキル鎖、ポリアミドまたはオリゴペプチド鎖である場合には、混合様式ＨＩＬＩＣ／ＡＸ材料が得られる。本発明の混合様式アニオン交換体のＮＩ部位（１つまたは２つ以上）が適切に平衡を保持している場合には、単一の混合様式アニオン交換材料を、ＲＰ−ＡＸ、ＨＩＣ−ＡＸにおいて、およびＨＩＬＩＣ−ＡＸ様式において用いることができる。

このことは、使用例Ｂ１、Ｂ４およびＢ５に示すように、例Ａ１の材料に該当する。いずれの場合においても、結合および分離機構は、個別の領域単独の性能をはるかに超える、連続的に結合した個別の領域の共同的効果の結果である。混合様式逆相／アニオン交換（ＲＰ／ＡＸ）材料の製造のために、非イオン性相互作用部位を、長い疎水性の、随意に置換された脂肪族直鎖状または分枝状Ｃ_３〜Ｃ_３０アルキル鎖により表し、これにより１つまたは２つ以上の隣接していない（−ＣＨ_２−）基を、硫黄（−Ｓ−）により置換することができる。アルキルらせんは、ＲＰ／ＡＸ材料が末端アニオン交換部位を界面において有するように、アニオン交換基と支持体との間に位置している（例えば式Ｉａ）か、またはこれは、アニオン交換部位が内部にあるように表面に直接露出している（例えば式Ｉｂ）。

疎水性相互作用／アニオン交換（ＨＩＣ／ＡＸ）材料の場合において、非イオン性相互作用部位を、適度に疎水性の脂肪族Ｃ_１〜Ｃ_６、好ましくはＣ_３〜Ｃ_４または芳香族もしくは複素芳香族基により表し、ここですべての他の定義は、ＲＰ／ＡＸ材料についてと同一である。
親水性相互作用／アニオン交換（ＨＩＬＩＣ／ＡＸ）材料の場合において、非イオン性相互作用部位を、親水性基により表す。好適なシントンの例を、式ＩＩＩに示す。

式ＩＩＩにおいて、ＨＩＬＩＣ／ＡＸ材料のＨＩＬＩＣ領域のための構成要素として用いるべき親水性基についてのシントンの例を、示す（ｎは、０〜１００、好ましくは０〜２０の整数を表す）：

親水性非イオン性相互作用部位のための典型的な構成要素は、アミド、スルホンアミド、尿素、カルバメート、チオエーテル、スルホキシド、スルホンおよび／またはエーテル基である。

リンカー（Ｌ）：
両方の一次結合領域（アニオン交換部位および非イオン性相互作用部位）は、適切な化学的リンカー（スペーサー）により一緒に結合している必要があり、次に得られたリガンドはまた、好適なリンカーおよびスペーサーにより、担体に結合している（式Ｉを参照）。本発明において、リンカーはまた、２つの隣接するモジュール間の化学的結合であってもよい。リンカーの長さおよび化学的官能性は、共に可変である。これは、ある程度まで、リガンド−溶質結合に、全体的な選択性に関する正の、しかしまた負の効果を伴って関与し得る。これは、リガンド部位の剛性および接近可能性に影響し、これによりまた結合特性に対して効果を奏し得る。最後に、しかし最小にではなく、これは、官能性材料の化学的安定性を決定し、溶質とのこれらの相溶性、生体分子分離に特に重要な因子に影響し得る。

それぞれ個別の結合領域およびモジュールに結合するスペーサーは、一緒に、最終的なリガンドに必要な全体的な親油性特性に依存して、疎水性または親水性基のいずれであってもよい。疎水性スペーサーについての典型的な例は、アルキル鎖であり、これは、随意に、例えばアルキルもしくはアリール部分での置換により、または１つもしくは２つ以上の隣接していない−（ＣＨ_２）−基の−Ｓ−での置換により官能化されていてもよい。親水性リンカーに適するシントンの例は、随意にすべての他の極性鎖または官能性との組み合わせでの、アミド、スルホンアミド、カルバメート、エーテル、スルホン、尿素、チオエーテルおよびスルホキシド基である。逆相／アニオン交換材料の場合において、親水性リンカー、例えばアミド、尿素、カルバメートまたはスルホンアミドは、水素結合が可能な追加の相互作用部位、モジュールまたは結合領域を添加する極性の埋め込まれた基を表し得る。このような基は、極性の溶質に、およびまた有機溶媒を含まないか、または低い濃度の有機溶媒を含む水性媒体との相溶性の観点において、有利であり得る。

式ＩＩに示すアニオン交換シントンを、アルキルらせんと、極性の官能基、例えば式ＩＶに示すものにより連結することができる。この親水性官能性リンカー基は、極性の埋め込まれた結合領域を表し、これは、本発明の材料の使用を、有機改変剤を伴わずに、または低い有機溶媒含量を伴って容易にする。イオン交換部位と共に、これは、水性の支配された移動相系中の親油性層の厚さを安定化するが（張り出した側方のアルキル鎖は、１００％水性媒体においても崩壊しない）、極性の相互作用性領域として、また溶質の相補性部位との水素結合または双極子−双極子相互作用により生じる新たな選択性を導入する。

式ＩＶにおいて、疎水性らせんをアニオン交換シントンと連結する極性のリンカー要素（Ｌ）についてのシントンを示す（ｎは、０〜２０の整数を表す）；式Ｉをも参照。

本発明のリガンド（官能性セレクター）の種々の支持体上での固定のために、クロマトグラフィー的固定相を作成するためのすべての一般的な固相リンカー概念および方法を、用いることができる。当該目的のために、種々の官能化された反応性支持体を、用いることができ、これには、特にチオール、アミノ、ヒドロキシル、活性化されたヒドロキシル、カルボン酸、活性化されたカルボン酸、アルデヒド、エポキシ、ビニルおよびハロゲンで改変されたマトリックスが含まれる。本発明の材料を合成するために好ましい固定のいくつかの方法を、以下に記載する：

ｉ）特にチオールプロピル改変シリカおよびチオール改変Fractogel（登録商標）を含むチオール改変支持体上での：
−ビニル改変セレクターとの反応による（ラジカル付加反応、共重合またはマイケル付加反応による）
−ハロゲン、特にクロロ、ブロモおよびヨード改変セレクターとの求核置換による反応による
ｉｉ）支持体、例えばFractogel（登録商標）エポキシ、ポリ（グリシジルメタクリレート−コ−エチレンジメタクリレート）モノリス、エポキシ改変シリカを含むエポキシ基上での、
−その後の段階におけるセレクター（リガンド）の固定を可能にするリガンドまたは反応性スペーサーを含むチオール、アミノ、ヒドロキシ基との反応による

ｉｉｉ）アミノ改変支持体、例えばアミノ−プロピルシリカまたはアミノ改変Fractogel（登録商標）上での、
−エポキシ、ハロゲン、活性化ヒドロキシ基含有セレクターまたはリガンドとの求核置換反応による
−リガンドもしくは改変されたリガンドのカルボン酸、またはリガンドの活性化されたカルボン酸とのカップリング反応、例えばペプチド結合の結合を形成するカルボジイミドカップリングによる
−リガンドのアルデヒド基での、続いてシッフ塩基中間体の還元による

ｉｖ）カルボン酸改変支持体または活性化されたカルボン酸改変支持体上での、
−リガンドまたは改変されたリガンドのアミノ基とのカップリング反応、例えばペプチド結合の結合を形成するカルボジイミドカップリングによる
ｖ）マトリックスを含む水酸基上での、
−水酸基の炭酸Ｏ，Ｏ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）またはビス−イミダゾリルカルボニル（ＢＩＣ）での活性化、続いてリガンドのアミノ基との反応による
−リガンドまたは改変されたリガンドのイソシアネート基との反応による

ｖｉ）マトリックス、例えばトレシル活性化ビーズを含む活性化された水酸基上での、
−リガンドを含むアミノまたはチオール基との求核置換による
ｖｉｉ）ビニル改変支持体上での、
−ビニル改変リガンドとの共重合による
−リガンドのチオール基のラジカル付加による

用いることができる他の固定化の概念には、以下のものが含まれる。
ｖｉｉｉ）アミノまたはヒドロキシ改変セレクター部分と非対称的なジイソシアネートリンカーの単一反応(mono-reaction)、続いてアミノまたはヒドロキシ改変支持体との反応、
ｉｘ）ビス官能性シラン類、例えば３−イソシアナトプロピルトリエトキシシランのセレクターの末端反応性アミノまたはヒドロキシ基との反応、続いて活性化されたセレクターをシリカマトリックスに結合させるシリカとのシリル化反応、

ｘ）アルコキシまたはクロロヒドロシランのビニル基含有セレクターとのヒドロシリル化反応、続いて活性化されたセレクターをシリカマトリックスに結合させるシリカとのシリル化反応、
ｘｉ）アミノ改変支持体およびアミノ改変セレクターの、２種の成分のいずれかの無水ジカルボン酸スペーサー成分との反応によるカップリング、並びに得られたカルボン酸官能のその後の活性化および第２のアミノ成分との反応、

ｘｉｉ）セレクター、タンパク質およびペプチドを固体支持体および表面に固定化するために一般的に用いられる、他の固定化方法、
ｘｉｉｉ）あるいはまた、クロマトグラフィーリガンドを、ポリマーマトリックス中に、また適切な官能を担持するリガンドの直接のインサイチュでの共重合により導入することができる。この方法を、ビーズを得る懸濁液重合において、または例えばモノリスの調製におけるバルク重合もしくは相分離を伴うバルク重合において、進行させることができる。
式Ｖ（次頁）は、本発明を例示する好ましい混合様式ＲＰ／ＡＸおよびＨＩＬＩＣ／ＡＸ材料の概観を示す。

本発明のリガンドの合成および前述のリガンドの結合を、例中に記載した。同様の合成プロトコルのための他のプロトコルは、標準的な手引き書中に記載されており、当業者に知られている。

本発明のアニオン系交換基および非イオン系相互作用モジュールの組み合わせを実施することにより、新たな驚異的な分子認識能力および大幅に増強された、または補完的な選択性を、達成することができる。従って、以前は観察されなかった構造的に関連する化合物の分離が、可能である。
本発明の混合様式アニオン交換材料は、イオン交換材料の高い負荷能力を活用し、同時に尚「非イオン性相互作用」モジュールの区別的な認識能力および／または反発性静電気的イオン−イオン相互作用（イオン排除）の存在による、等しく帯電した種についての識別能力を有する。
また、本発明の専用のリガンド（セレクター）の設計により、純粋に水性の媒体、特に非変性条件下での生体高分子（タンパク質）分離に好ましい条件を用いることが、可能になる。

本発明の混合様式材料は、単一のカラム、例えば逆相／アニオン交換（ＲＰ／ＡＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー／アニオン交換（ＨＩＣ／ＡＸ）（または一層正確には疎水性相互作用クロマトグラフィー／イオン排除クロマトグラフィー）および親水性相互作用クロマトグラフィー／アニオン交換（ＨＩＬＩＣ／ＡＸ）様式において、いくつかの異なるクロマトグラフィー様式またはいくつかの混合様式クロマトグラフィー分離様式において用いることが可能であり得る。言い換えると、本発明の混合様式アニオン交換材料の１種で充填された単一のカラムを、いくつかの異なる作動様式、即ちＲＰ／ＡＸ、ＨＩＣ／ＡＸ、ＨＩＬＩＣ／ＡＸにおいて作動させることができ、ここで達成された選択性は、異なる場合がある。これは、本発明の材料の好ましい特徴であり、従来技術の材料については示されていなかった。これは、使用例Ｂ１（ＲＰ／ＡＸ）、Ｂ４（ＨＩＬＩＣ／ＡＸ）およびＢ５（ＨＩＣ／ＡＸ）により明確に実証されている。

さらなる詳述を伴わずに、当業者は、上記の記載を用いて、本発明をこの最も完全な範囲に用いることができると、考えられる。従って、好ましい特定の態様および例は、単に例示的であり、完全にいかなる方法においても開示の残りを限定するものではないと、解釈するべきである。

本明細書中で引用したすべての出願明細書、特許明細書および刊行物、並びに２００４年１２月１２日出願の対応する出願EP 04028798.9の開示全体を、参照により本明細書中に導入する。

例
Ａ 合成例
例Ａ１：チオール改変シリカに基づくＲＰ／ＷＡＸ
合成を式ＶＩに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

ａ）セレクターの合成
３−アミノキヌクリジン二塩酸塩（２６ｍｍｏｌ）を、２倍モル過剰の、メタノールに溶解した新たに調製したナトリウムメトキシド溶液で３時間処理して、遊離塩基を遊離させる。沈殿した塩化ナトリウムを濾過により除去し、濾液を蒸発乾固する。クロロホルムを加え、混合し、冷却した懸濁液に、１０−ウンデセン酸塩化物（クロロホルム中２２ｍｍｏｌ）の溶液を、滴加によりゆっくりと加える。反応を、室温で１８時間放置して進行させる。

反応混合物から、Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンセレクターを、水性２Ｍ水酸化ナトリウムおよびクロロホルムで抽出する（３回）。混ぜ合わせた有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次に蒸発乾固させる。減圧下で乾燥した後に、油状の帯黄色の生成物が、７３％の収率で得られる。
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性様式）：293.4 amu [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 5.80 (m, 1H); 5.55 (d, 1 H), 4.98 (d, 1 H), 4.93 (d, 1 H), 3.95 (m, 1 H), 3.35 (q, 1 H), 2.80 (m, 4 H), 2.43 (m, 1 H), 2.20 (t, 2 H), 2.05 (m, 2 H), 1.90 (m, 1 H), 1.65 (m, 5 H), 1.47 (m, 1 H), 1.30 (s, 10 H) ppm.

ｂ）ＲＰ−ＷＡＸリガンドのチオール改変シリカ上での固定化
Kromasil（登録商標）１００−５μｍおよび３−メルカプトプロピルトリメトキシシランをトルエン中で還流させることにより得られた３−メルカプトプロピルシリカゲル６ｇ（４．２７％のＣ、０．８９％のＨ、＜０．０５％のＮおよび２．６２％のＳ、０．８５ｍｍｏｌのＳ／ｇのチオール基の計算された被覆度に相当する）を、上記の段階ａ）の３．０ｇのセレクターを含む、メタノールに溶解した溶液中に懸濁させる。５０ｍｇのＡＩＢＮを、ラジカル開始剤として加え、反応を、窒素の連続的な流れの下で還流において６時間放置して進行させる。改変されたシリカゲルを、メタノールで数回洗浄し、７２時間乾燥する。元素分析により、以下の結果が得られる：１４．５０％Ｃ、２．４０％Ｈおよび１．３２％Ｎ。これは、０．４６ｍｍｏｌ／ｇの改変されたシリカの平均セレクター被覆度に相当する。

残りのチオール基を、ｎ−ヘキセン（３．２ｍｌ）のラジカル付加により、セレクター付加について前に記載したように、他の点では同一の条件の下で、キャッピングする。ゲルを、メタノール、メタノール中の３％酢酸およびジエチルエーテルで洗浄し、７２時間乾燥し、ステンレススチールＨＰＬＣカラム中に詰め込んだ。
末端キャッピングの後のＲＰ／ＷＡＸ固定相の元素分析により、以下の結果が得られる：１４．２６％Ｃ、２．３２％Ｈ、１．２３％Ｎおよび２．１２％Ｓ。

例Ａ２：チオール改変ポリグリシジルメタクリレートビーズ上でのＲＰ−ＷＡＸの固定化
５ｇのポリグリシジルメタクリレートビーズであるFractogel（登録商標）EMDエポキシ（Ｍ）(Merck, Darmstadt, Germany) （１．５ｍｍｏｌのエポキシ基／１ｇのビーズ）またはSuprema（登録商標）１０００(Polymer Standard Services, Mainz, Germany)を、５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ８および２−プロパノール（４：１、ｖ／ｖ）の混合物に溶解した８．２ｇの硫化水素ナトリウムを含む試薬溶液１６０ｍＬに懸濁させる。懸濁液を超音波処理し、Ｎ_２をパージする（各々５分間）。懸濁液を、２０時間６０℃で機械的に攪拌する。濾過後、誘導体化したビーズを、０．１ＭのＨＣｌ、水および次にＭｅＯＨで洗浄する。チオール改変粒子を、真空下で一晩乾燥し、元素分析を行い、以下の結果が得られる：

これは、Fractogel（登録商標）材料について１．２５ｍｍｏｌのスルフヒドリル基／１ｇの改変されたビーズおよびSuprema（登録商標）材料について２．３１ｍｍｏｌのスルフヒドリル基／１ｇの改変されたビーズのチオール負荷に相当する。
ＲＰ／ＷＡＸセレクター（Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジン）の固定化を、例Ａ１に記載したのと同一のプロトコルにより行う。

例Ａ３：モノリシックシリカ上へのＲＰ−ＷＡＸの固定化
反応スキームを式ＶＩＩに概説する。上方の左側のシリカ構造は、シリカに基づく支持体のシラノール基を示す。波線は、シリカに基づく支持体を表す：

ａ）チオール改変シリカモノリスの調製（カラムシラン化における）
ＰＥＥＫプラスチックカバー中に入れた、Chromolith（登録商標）Si Performance１００−４．６ｍｍカラム（長さ１０ｃｍおよび内径４．６ｍｍ、約０．５ｇのシリカゲルを含む）(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)を、真空の下で１００℃で５時間乾燥する。０．２ｍｌの乾燥ピリジンを含む乾燥トルエンに０．７ｍｌの３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン(ABCR-GmbH Karlsruhe, Germany)を溶解した溶液１０ｍｌを、乾燥Chromolith（登録商標）Ｓｉカラムを通して０．２ｍｌ／分の体積流量でポンプ輸送する。反応（１時間）の間、モノリシックシリカカラムを、ＨＰＬＣカラムオーブンの内側に８０℃で貯蔵する。メルカプトプロピル改変シリカモノリスを、トルエンで１時間８０℃で、０．５ｍｌ／分の体積流量で、および０．５ｍｌ／分の体積流量で周囲温度でさらに１時間洗浄する。この手順を、他のChromolith（登録商標）カラムで繰り返し、これを、改変の後にＰＥＥＫハウジングから取り外し、真空において乾燥し、元素分析を行う。元素分析により、４．３％の炭素含量が得られ、これは、４．５４μｍｏｌのチオール基／ｍ^２の表面被覆度に相当する。

ｂ）ＲＰ−ＷＡＸリガンドのチオール改変シリカモノリス上への固定化（カラム誘導体化における）
ＲＰ／ＷＡＸセレクター（Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジン；例Ａ１を参照）を、上記のチオール改変モノリシックシリカカラム（１００×４．６ｍｍ内径）上に、粒子について例１に記載したプロトコルと同様にラジカル付加反応を用いてカラム内改変により、固定化する。従って、０．０７ｇのＮ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンおよび１０ｍｇのＡＩＢＮを、６ｍｌのエタノールに溶解する。この溶液を、チオール改変モノリシックシリカカラムを通してゆっくりとポンプ輸送し、これを、エタノールで、８０℃で１００分の時間にわたり予備状態調整する(pre-conditioned)。未反応の試薬を除去するために、カラムをその後、エタノールで０．５ｍｌ／分の体積流量でさらに６０分間洗浄する。カラム上での試験が完了した後に行う元素分析により、０．７μｍｏｌのＲＰ／ＷＡＸセレクター／ｍ^２の表面被覆度が得られる。

例Ａ４：ＲＰ−ＷＡＸの有機ポリマーに基づくモノリシック支持体上への固定化
ａ）ポリ（ＧＭＡ−コ−ＥＤＭＡ）タイプのモノリシック毛細管のインサイチュ調製
重合混合物を、３０重量％のシクロヘキサノールおよびポロゲン性(porogenic)溶媒としての３０重量％の１−ドデカノール、官能性モノマーとしての２４重量％のグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）およびラジカル開始剤としての１重量％のα，α’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を含む架橋剤としての１６重量％のエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）（合計のモノマー含量に対して）（すべてSigma-Aldrichから得られる）から調製する。混合物を超音波処理し、窒素でパージする（各々１０分間）。合計の長さが約４０ｃｍの、ビニル化された（即ち、３−メタクリロイルオキシプロピルトリメトキシシリルで改変された）溶融シリカ毛細管に、３０ｃｍの長さに、Hamiltonシリンジを用いて重合混合物を充填し、両方の末端をゴム製ＧＣ隔膜で密封する。重合を、水浴中で６０℃の温度において２０時間行う。その後、毛細管を、アセトニトリルで洗浄して、ＨＰＬＣポンプを用いてポロゲン性溶媒および未反応モノマーを除去する。

ｂ）反応性スルフヒドリル基を有するポリメタクリレートモノリスの製造のための手順
硫化水素ナトリウム(Sigma-Aldrich)をメタノールと０．１Ｍの水性リン酸二水素ナトリウムとの混合物（２０：８０、ｖ／ｖ）に溶解した２Ｍ溶液を、新たに調製した。ｐＨを、８．１５に調整し、試薬溶液を５分間超音波処理し、ナイロン膜（Iso-Disc（登録商標）フィルター、Ｎ−１３−２；１３ｍｍ×０．２μｍ；Supelco）を通して濾過する。

次に、メタノール／水（２０：８０、ｖ／ｖ）で予備状態調整した反応性ポリ（ＧＭＡ−コ−ＥＤＭＡ）モノリス毛細管に、６０μｌの硫化水素ナトリウム溶液を、Hamiltonシリンジおよびシリンジポンプを用いて３０μｌ／時の流量で流す。反応後、毛細管を、ＨＰＬＣポンプに取り付け、メタノール／水（２０：８０、ｖ／ｖ）で、次にアセトニトリルで洗浄する。

ｃ）ＲＰ−ＷＡＸリガンドのラジカル付加反応によるカラム内固定化
ラジカル開始剤としてα，α’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（０．０２５Ｍ）を含むエタノールにＲＰ／ＷＡＸセレクター（Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジン；例Ａ１を参照）を溶解した０．２５Ｍ溶液を、新たに調製する。混合物を超音波処理し（５分間）、次にナイロン膜を通して濾過する。窒素を１０分間パージした後、チオール官能化毛細管に、３０μｌのセレクター溶液を、Hamiltonシリンジおよびシリンジポンプを用いて流す。毛細管を、ＧＣ隔膜で密封し、水浴に移送し、ここでクロマトグラフィーリガンドのラジカル付加を、６０℃で一晩行った。２４時間後、毛細管を、水浴から取り外し、メタノールで洗浄し、次にクロマトグラフィー試験のために、ＨＰＬＣポンプを用いて移動相と平衡にする。

例Ａ５：有機ポリマーに基づくモノリシックディスク上のＲＰ−ＷＡＸ
２−プロパノールと０．１Ｍの水性リン酸二水素ナトリウム（２０：８０、ｖ／ｖ）との混合物に硫化水素ナトリウムを溶解した２Ｍ溶液を、新たに調製する。ｐＨを、８．１５に調整し、試薬溶液を５分間超音波処理し、ナイロン膜を通して濾過する。この溶液中に、２−プロパノール／水（２０：８０、ｖ／ｖ）で予備状態調整したエポキシ基含有ポリメタクリレートタイプのモノリシックディスク（CIM（登録商標）Epoxy, BIA Separations, Ljubljana, Slovenia）を浸漬し、硫化水素によるエポキシド開環反応を、周囲温度で３時間放置して進行させる。その後、ディスクを、数回メタノール／水（２０：８０、ｖ／ｖ）で洗浄する。

ラジカル開始剤としてα，α’−アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）（０．０２５Ｍ）を含む２−プロパノールにＲＰ／ＷＡＸセレクター（Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジン；例Ａ１を参照）を溶解した０．２５Ｍ溶液を、新たに調製する。混合物を超音波処理し（５分間）、次にナイロン膜を通して濾過する。窒素を１０分間パージした後、チオール官能化ポリメタクリレートタイプのモノリシックディスクをこのセレクター溶液に浸漬し、６０℃に加温する。Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンセレクターのチオール基へのラジカル付加を、反応混合物を６０℃に保持して、窒素の下で、一晩行う。ディスクを反応混合物から取り外した後に、これをその後２−プロパノール、２−プロパノール／水（２０：８０、ｖ／ｖ）およびメタノールで洗浄し、次に減圧下で乾燥する。

例Ａ６：チオール改変シリカに基づく混合様式逆相（ＲＰ）／強アニオン交換（ＳＡＸ）材料
反応スキームを式ＶＩＩＩに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

５ｍｍｏｌのＮ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンセレクター（例１を参照）を、５０ｍＬのニトロメタンに溶解する。２．５ｍｍｏｌの硫酸ジメチルを加え、反応混合物を周囲温度で一晩放置する。反応混合物を蒸発乾固させ、残留物を石油エーテルで洗浄する。粗製の生成物をエタノール／水に溶解し、例Ａ１に記載したようにチオール改変シリカ上に固定化する。

例Ａ７：末端疎水性領域および内部イオン交換部位を有するＲＰ／ＷＡＸ材料の調製
反応スキームを式ＩＸに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

ａ）（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−アミノメチル−５−ビニル−キヌクリジンのｔ−ＢＯＣ誘導体
６．６２ｇ（４０ｍｍｏｌ）の（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−アミノメチル−５−ビニル−キヌクリジンを、５５ｍｌのジクロロメタンに溶解する。５５ｍｌの炭酸ナトリウム（１００ｍｌの蒸留水中８．０６ｇ）および９．７９ｇ（４５ｍｍｏｌ）のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ）_２Ｏを、さらに加える。反応を、室温で攪拌しながら一晩放置して進行させる。

反応混合物を分液漏斗に移送し、上方の水性相を廃棄する。下方の有機相を炭酸ナトリウム溶液で繰り返し抽出する。混ぜ合わせた有機留分を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させる。
収率：６７％
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 5.8 (m, 1H), 5.2 (s, 1H), 4.97 (d, 2H), 3.27 (m, 1H), 3.13 (q, 1H), 2.9 (m, 2H), 2.82 (m, 1H), 2.60 (m, 2H), 2.26 (m, 1H), 1.85 (t, 1H), 1.7 (m, 1H), 1.47 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 0.85 (m, 1H)

ｂ）（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−アミノメチル−５−［（２−オクチルチオ）エチル］−キヌクリジンのｔ−ＢＯＣ誘導体
７ｇ（２６．５ｍｍｏｌ）の（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−２−アミノメチル−５−ビニル−キヌクリジンを、クロロホルムに溶解する。５倍モル過剰のオクタンチオールおよびＡＩＢＮ（キヌクリジン誘導体に対して１０ｍｏｌ％）を、加える。反応を、２４時間還流下で一晩放置して進行させる。反応混合物を凝縮させて乾燥し、粗製の生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、先ずクロロホルム、次にクロロホルム−メタノール（５：１、ｖ／ｖ）、最後にクロロホルム−メタノール（２０：１、ｖ／ｖ））により精製する。生成物を含む混ぜ合わせた溶離液を蒸発乾固させ、次の段階に直接用いる。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 5.5 (s, 1H), 3.4 (s, 1H), 3.25 (t, 1H), 3.1 (t,s, 3H), 2.73 (s, 1H), 2.50 (m, 5H), 1.91 (t, 1H), 1.80 (s,s, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.58 (m, 4H), 1.45 (s, 9H), 1.38 (t, 2H), 1.28 (s, 9H), 1.02 (m, 1H), 0.90 (t, 3H)

ｃ）保護基の切断
フラッシュクロマトグラフィーにより得られた８．２ｇ（２０ｍｍｏｌ）の（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−２−アミノメチル−５−［（２−オクチルチオ）エチル］−キヌクリジンを、１００ｍｌのジクロロメタンに溶解し、１５ｍｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、磁石での攪拌の下で加える。反応を、３時間周囲温度で放置して進行させる。
反応混合物を蒸発乾固させ、１ＭのＮａＯＨ／ジクロロメタンで抽出する。混ぜ合わせた有機留分を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させる。黄色油状物が得られ、これをさらに精製せずに次の段階において用いる。
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性様式）：313.3 amu [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 3.04 (q, 1H), 2.77 (m, 1H), 2.60 (d, 2H), 2.47 (m, 2H), 2.34 (m, 4H), 2.25 (dd, 1H), 1.67 (m, 1H), 1.53 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.32 (m, 2H), 1.20 (t, 2H), 1.10 (s, 10H), 0.71 (t, 4H)

ｄ）ビニル酢酸と（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−アミノメチル−５−［（２−オクチルチオ）エチル］−キヌクリジンとのカップリング
３．９９ｇ（１２．７９ｍｍｏｌ）の（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−アミノメチル−５−［（２−オクチルチオ）エチル］−キヌクリジンを、ジクロロメタンに溶解する。等モル量のビニル酢酸（１２．７９ｍｍｏｌ）および１４．７ｍｍｏｌのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を滴加し、同時に反応混合物を氷冷下で保持する。反応を、一晩（１２時間）室温で放置して進行させる。懸濁液が生成する。沈殿を濾過により除去し、反応混合物を減圧下で凝縮させて乾燥する。

粗製の生成物を、ジクロロメタンおよび１ＭのＮａＯＨでの抽出により精製する。採集した有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固させる。最後に、未加工の生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、先ずクロロホルム、次にクロロホルム／メタノール、５：１）により精製する。
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性様式）：381.5 amu [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 6.29 ppm (s, 1H), 5.94 ppm (m, 1H), 5.20 (s, 1H), 5.16 (d, 1H), 3.55 (m, 1H), 3.17 (q, 1H), 2.98 (d, 2H), 2.87 (m, 3H), 2.60 (m, 1H), 2.49 (q, 4H), 2.37 (d, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.71 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.51 (m, 2H), 1.37 (t, 2H), 1.28 (s, 9H), 0.93 (m, 1H), 0.88 (t, 3H).

ｅ）ＲＰ／ＷＡＸセレクターのチオール改変シリカ上への固定化
ＲＰ／ＷＡＸセレクターの共有結合およびその後の末端キャッピング段階を、Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンセレクターについて例Ａ１に記載したのと正確に同一のプロトコルに従って行う。

例Ａ８：ＰＥＧシントンに基づくＨＩＬＩＣ／ＷＡＸ固定相の合成
反応スキームを式Ｘに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表し、ここでｎ＝３である：

３−アミノキヌクリジン二塩酸塩（３ｍｍｏｌ）を、２倍モル過剰の新たに調製したメタノールに溶解したナトリウムメトキシド溶液で３時間処理して、遊離塩基を平衡にする。沈殿した塩化ナトリウムを濾過により除去し、濾液を蒸発乾固させる。残留物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、等モル量のHuenig塩基を加える。混合した冷却した溶液に、ＤＭＦに溶解した等モル量の３−［２−（Ｎ−マレイミド）エチル−トリエチレングリコール］−プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＡＬ−ｄＰＥＧ_４−ＮＨＳエステル）を加え、反応混合物を室温で一晩攪拌する。反応混合物を蒸発乾固させ、DOWEX（登録商標）弱カチオン交換体上で精製する。次に、ＰＥＧ誘導体化アミノキヌクリジン（１ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ−５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５（２０：８０；ｖ／ｖ）の混合物に溶解する。２ｇのメルカプトプロピル改変シリカを、この溶液に懸濁させ、室温で一晩放置して反応させ、式Ｘに示す混合様式ＨＩＬＩＣ／ＷＡＸ固定相が得られる。

この例を、種々の鎖の長さ：１≦ｎ＜１００（特に１≦ｎ＜２０）を有するＰＥＧ誘導体を用いて繰り返すことができる。

例Ａ９：ペプチドシントンに基づくＨＩＬＩＣ／ＷＡＸポリマーゲルの合成
反応スキームを式ＸＩに概説し、ここで（ＳＵＰ）は支持体を表す：

３−アミノキヌクリジン二塩酸塩（３ｍｍｏｌ）を、２倍モル過剰の新たに調製したメタノールに溶解したナトリウムメトキシド溶液で３時間処理して、遊離塩基を平衡にする。沈殿した塩化ナトリウムを濾過により除去し、濾液を蒸発乾固させる。残留物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ＤＭＦに溶解した等モル量のＦｍｏｃ保護（β−アラニル）_３−β−アラニン（標準的なＦｍｏｃ化学により合成した）並びにＤＩＣおよびＨＯＢｔを加える。反応を、室温で一晩放置して進行させる。次に、ＦＭＯＣ基を、２０％のピペリジンで切断する。Ｃ末端３−キヌクリジニルアミドおよび遊離のＮ末端を有する得られたテトラペプチドを、水およびアセトニトリル（共に０．１％ＴＦＡを含む）を用いて、固定相としてLiChrospher（登録商標）Ｃ１８、１５μｍ（２５０×２０ｍｍ内径）上で勾配ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。純粋なテトラペプチドを含む採集し、混ぜ合わせた留分を、蒸発乾固させ、１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９）に溶解する。Fractogel（登録商標）エポキシをこの溶液に懸濁させ、懸濁液を４０℃で一晩攪拌する。

例Ａ１０：短い間隔のＲＰ−ＷＡＸ有機ポリマー材料
反応生成物を式ＸＩＩに示し、ここで（ＳＵＰ）は支持体を表す：

３−アミノキヌクリジン二塩酸塩（３ｍｍｏｌ）を、２倍モル過剰の新たに調製したメタノールに溶解したナトリウムメトキシド溶液で３時間処理して、遊離塩基を平衡にする。沈殿した塩化ナトリウムを濾過により除去し、濾液を蒸発乾固させる。３−アミノキヌクリジン塩基をメタノールに溶解し、Fractogel（登録商標）ＥＭＤエポキシをメタノール（１ｇ／２０ｍｌ）に懸濁させた懸濁液を、加える。反応混合物を、一晩６０℃で攪拌する。アミノキヌクリジン改変Fractogel（登録商標）ビーズを濾過し、メタノールおよびアセトンで数回洗浄する（被覆度１ｇあたり０．６８ｍｍｏｌのキヌクリジン部分）。

例Ａ１１：３−α−アミノトロパンおよびチオール改変シリカに基づくＲＰ／ＷＡＸ
反応スキームを式ＸＩＶに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

ａ）ＲＰ／ＷＡＸセレクターの合成

乾燥３−α−アミノトロパン二塩酸塩（１当量）を、３つ首丸底フラスコ中で、機械的攪拌の下で、乾燥テトラヒドロフラン（１ｍｍｏｌのアミンあたり５ｍＬ）に懸濁させる。フラスコを、窒素で１０分間一掃し、氷浴中で冷却する。厳密に無水の条件の下で（ステンレススチール移送毛細管を用いる）、ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液（ヘキサンに溶解した；３．１５当量）を、反応混合物にゆっくりと加える（５０ｍｍｏｌのアミンについて、添加を５分にわたり行わなければならない）。その後、乾燥テトラヒドロフラン（１ｍｍｏｌの酸塩化物あたり０．５ｍＬ）で希釈した塩化１０−ウンデセノイル（０．９当量）を、滴加する。氷浴を取り外し、混合物をさらに３０分間攪拌する。

反応混合物の揮発性留分を蒸発させることにより（４０℃、２０ｍｂａｒ）得られた粗製の生成物を、酢酸エチル（１ｍｍｏｌのアミンあたり５ｍＬ）および１Ｍの水性水酸化ナトリウム溶液（１ｍｍｏｌのアミンあたり２ｍＬ）の混合物に再び溶解し、分液漏斗に移送する。水性相を除去した後、残留有機相を、１Ｍの水性水酸化ナトリウム溶液（１ｍｍｏｌのアミンあたり２ｍＬ）でさらに１回、および水（各々１ｍｍｏｌのアミンあたり２ｍＬ）で２回抽出する。
有機相を炭酸カリウムで乾燥し、蒸発させ、高度の減圧において乾燥する。収率は、９５％程度である。

特徴づけ
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性様式）307.4 amu [M+H]⁺。
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): 5.80 (m, 2 H), 4.99 (dd, 1 H), 4.93 (dd, 1 H), 4.07 (q, 1 H), 3.14 (m, 2 H), 2.28 (s, 3 H), 2.20 (m, 2 H), 2.14 (m, 4 H), 2.04 (m, 2 H), 1.71 (m, 2 H), 1.61 (m, 4 H), 1.41-1-25 (m, 10 H) ppm.

ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づくＲＰ−ＷＡＸリガンドのチオール改変シリカ上への固定化
Prontosil（登録商標）１２０−５μｍおよび３−メルカプトプロピルトリメトキシシランをトルエン中で還流させることにより得られた３−メルカプトプロピルシリカゲル６ｇ（４．６２％Ｃ、１．１０％Ｈ、＜０．０５％Ｎおよび２．８８％Ｓ、約０．９ｍｍｏｌのＳ／ｇに相当する）を、３．０ｇの上記段階ａ）のセレクターを含むメタノールに溶解した溶液に懸濁させる。５０ｍｇのＡＩＢＮをラジカル開始剤として加え、反応を、６時間窒素の連続的流れの下で還流において放置して進行させる。改変されたシリカゲルをメタノールで数回洗浄し、７２時間乾燥する。元素分析により、以下の結果が得られる：１１．５７％Ｃ、２．１３％Ｈ、０．９９％Ｎおよび２．４８％Ｓ。これは、０．３６ｍｍｏｌ／ｇの改変されたシリカの平均セレクター被覆度に相当する。

残留するチオール基を、他の点ではセレクター添加について前に記載したのと同一の条件の下で、１−ヘキサン（３．２ｍｌ）のラジカル付加によりキャッピングする。ゲルを、メタノール、メタノール中の３％酢酸およびジエチルエーテルで洗浄し、７２時間乾燥し、ステンレススチールＨＰＬＣカラム中に詰め込む。
末端キャッピングの後のＲＰ／ＷＡＸ固定相の元素分析により、以下の結果が得られる：１１．５５％Ｃ、２．１１％Ｈ、０．９６％Ｎおよび２．４０％Ｓ。

Ｂ 使用例
例Ｂ１：ＲＰ−ＷＡＸの合成ペプチドの精製への適用
ラジカル付加反応によりチオール改変シリカ粒子（５μｍ、１００Åの孔直径）上に共有結合的に固定化された、Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンセレクターに基づく例Ａ１のＲＰ／ＷＡＸ固定相を、合成ＮおよびＣ保護テトラペプチド（１Ａ）のこの副産物（１Ｂ）からの分離および精製について試験する。本発明の分離材料の有益な効果は、ＮおよびＣ末端が保護されたテトラペプチドＮ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドの副産物からの精製により、例示される。得られたクロマトグラムを、図１（曲線（ａ））に示す。曲線（ｂ）は、商業的なＲＰ吸着剤を用いた分離を示す。以下のクロマトグラフィー的条件を用いる：

（ａ）ＲＰ／ＷＡＸ（例１の）、５μｍの粒子、カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（有機改変剤を含まない）、アンモニアで調整してｐＨ４．５。
（ｂ）Ｃ１８Beckman Ultrasphere（登録商標）、５μｍの粒子、カラム寸法、１５０×４．６ｍｍ内径；移動相、水中の０．１％ＴＦＡ（Ａ）およびＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ（Ｂ）、２０分における５％〜６０％のＢの直線状勾配。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；保護、ＵＶ３１６ｎｍ。

ＲＰ／ＷＡＸ材料についての分離は、標準的な勾配逆相ＨＰＬＣによる試験混合物の分離（Ｒ_Ｓ＝１．９）と比較して大幅に増強される（Ｒ_Ｓ＝１０．０）ことが、明らかである。酢酸塩を用いた負荷能力(loadability)研究において、２００ｍｇまでのペプチド質量を、分析的２５０×内径４ｍｍのＲＰ／ＷＡＸカラム（５μｍ粒子）上に、主要な不純物のバンドおよび目的のペプチドのピークに接触せずに注射することができ、一方ギ酸塩を用いた試験は尚、５０ｍｇの未加工のペプチドの注射を可能にしていた。精製されたペプチドの、ＲＰ１８カラムを用いるＵＶおよびＥＳＩ−ＭＳ検出を伴うＲＰ−ＨＰＬＣによる分析により、既知の主要な不純物は、ＲＰ／ＷＡＸ固定相を用いる単一のクロマトグラフィー段階により除去されることが、明らかになった。ＲＰ−ＨＰＬＣと比較して良好な選択性および増強された試料負荷能力の両方により、新たな精製プロトコルの改善された生産性がもたらされた。例えば、所定のペプチドについて、収率は、ＲＰ／ＷＡＸ精製方法について、標準的なＲＰ精製プロトコルと比較して約１５倍高い。

例Ｂ２：酸性の、および弱い塩基性の、または中性の化合物（クロルピリホスおよびこの代謝産物）の単一の試行における同時の分離
クロルピリホスは、弱塩基性の、広範囲に用いられている有機ホスホロチオエート殺虫剤であり、イオン化されておらず、従ってシリカに基づく固定相上で適合した典型的なクロマトグラフィー条件の下で本質的に中性である。不慮の摂取による中毒は、まれではない。ヒトおよび他の哺乳類において、これは、芳香族エステル結合の代謝的加水分解および酸化的脱硫により迅速に解毒され、チオリン酸ジエチル、リン酸ジエチル、３，５，６−トリクロロ−２−ピリジノールが主要な代謝産物として生成する。代謝産物の酸性度は、対照的に強酸性（チオリン酸ジエチルおよびリン酸ジエチルのｐＫ_ａは、約１．４である）と弱酸性（３，５，６−トリクロロ−２−ピリジノールのｐＫ_ａは、約５．９である）との間で変化する。リン含有代謝産物の低いｐＫ_ａ値および強力な親水性により、合理的な保持が妨げられ、従ってシリカに基づく材料において用いることができる典型的な酸性条件での逆相ＨＰＬＣにより分離する。他方、本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ固定相（例Ａ１の）において、もとのクロルピリホスおよびこの主要な代謝産物のすべて並びに内部標準物質（リン酸ジブチル）は、容易に保持され得、ベースラインはＨＰＬＣによりいくらか等しいバンド間隔で分離している。

これは、図２に示す分離により例示され、これは、５種の成分すべての標準的な混合物のＬＣ−ＭＳ試行を示す。実験的な詳細は、以下の通りである：Ｎ−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンに基づく混合様式ＲＰ／ＷＡＸ（例Ａ１のＲＰ／ＷＡＸ）上のクロルピリホス（２Ａ）およびこの代謝産物（２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ）並びに内部標準（２Ｄ）の同時分離。（２Ｂ）リン酸ジエチル、（２Ｃ）チオリン酸ジエチル、（２Ｄ）リン酸ジブチル（内部標準）、（２Ｅ）３，５，６−トリクロロ−２−ピリジノール。実験条件：ＨＰＬＣ系、Agilent（登録商標）１１００；ＭＳ系、ＥＳＩを有するＡＰＩ ３６５トリプル四重極、ＭＲＭ様式での分析；ＨＰＬＣ条件、カラム寸法、１００×４ｍｍ内径；シリカ（５μｍ、１２０Å）上に固定化された混合様式ＲＰ／ＷＡＸセレクター；流量、１．００ｍＬ・分^−１；温度、２５℃；注射、１５μＬ；移動相、Ａ：２０ｍＭの酢酸を含み、ｐＨを６．３５に調整した（アンモニアで）ＡＣＮ／水＝３０／７０（ｖ／ｖ）、Ｂ：２０ｍＭの酢酸を含み、ｐＨを７．４５に調整した（アンモニアで）ＡＣＮ／水＝８０／２０（ｖ／ｖ）；勾配溶離、０％から１００％までのＢの直線状勾配で１０分、次に１００％のＢで１２分、次に０％のＢで８分の再平衡。

結論として、新規に発明された混合様式二環式アニオン交換体を用いる新規なＲＰ／ＷＡＸ ＨＰＬＣ法は、Ｃ_１８相における標準的なＲＰ−ＨＰＬＣより大幅に性能が優れている。溶離図式を図２に示す。

例Ｂ３：Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づくＲＰ−ＷＡＸの合成ペプチドの精製への適用
ラジカル付加反応によりチオール改変シリカ粒子（５μｍ、孔径１２０Å）上に共有結合的に固定化されたＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づく例Ａ１１のＲＰ／ＷＡＸ固定相を、合成ＮおよびＣ保護テトラペプチドのこの副産物からの分離および精製について試験する。以下のクロマトグラフィー条件を用いる：固定相：例Ａ１１のＲＰ／ＷＡＸ材料、５μｍの粒子；カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ３１６ｎｍ；ピークの記載：（１）未知の主要なペプチド不純物、（２）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。

得られたクロマトグラムを、図４に示す。
実験的詳細：Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのこの副産物からの、３−α−アミノトロパン（例Ａ１１の材料）に基づく混合様式アニオン交換材料を用いた分離。カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ３１６ｎｍ；ピークの記載：（４Ａ）未知の主要なペプチド不純物、（４Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。

例Ｂ４：ＨＩＬＩＣ／ＷＡＸ様式におけるＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく混合様式固定相の適用
例Ｂ４は、例Ａ１の混合様式アニオン交換材料の親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）様式における適用性および有用性を例証する。ＨＩＬＩＣ様式において、高い比率の有機改変剤、特にアセトニトリルまたはメタノールを含む溶離剤を用い、極性相互作用は、これらの条件の下での保持のための支配的な力である。極性分析物の溶離は、溶離剤における水性留分により、または溶離剤の水分の増大（それぞれ有機改変剤勾配の減少もしくは水および緩衝液勾配の増大）により起こる。分析物は、これらの増大する極性により溶離する。即ち、溶質が一層極性になると、これらの保持は一層強力になる。

図５は、４種のペプチドＧｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ａｓｐ、Ａｒｇ−ＬｅｕおよびＡｒｇ−Ａｓｐの分離を示す。アセトニトリル（ＡＣＮ）を、有機改変剤として用い、分離を、アセトニトリルの低下する直線状勾配を有する勾配溶離様式で行う。最も親油性のペプチドＧｌｙ−Ｌｅｕが先ず溶離し、一方最も親水性のペプチドが４種の溶質の最後として溶離することが、明らかである。ＲＰ系において、溶離順序は異なる（図６を参照）。このクロマトグラフィー挙動は、親水性相互作用クロマトグラフィーについて典型的であり、従って本発明の混合様式アニオン交換材料は、親水性相互作用クロマトグラフィーに、またはさらに正確に言うと混合様式ＨＩＬＩＣ／ＷＡＸクロマトグラフィーに有用であると、結論づけることができる。

実験的詳細：ＨＩＬＩＣ／ＷＡＸ（図５）およびＲＰ（図６）様式によるペプチド分離の比較。固定相：（ａ）例Ａ１の材料（またＢ１をも参照）。（ｂ）ベックマンＯＤＳ（例Ｂ１を参照）。実験条件：（ａ）移動相、水（Ａ）、ＡＣＮ（Ｂ）、２００ｍＭのリン酸、ｐＨ３．０（トリエチルアミンで調整した）（Ｃ）；勾配、Ｃ、５％において一定、Ｂ、０〜５分は９０％において一定、次に６０分間９０％から５０％のＢまで直線状勾配において降下させる；（ｂ）移動相、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水（Ａ）、０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ（Ｂ）；勾配、Ｂ、０〜５分は５％において一定、次に６０分間５％から９０％のＢまで直線状勾配において上昇させる。同一の他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出波長、２１５ｎｍ。

例Ｂ５：Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく混合様式固定相のＨＩＣ／ＷＡＸ様式における適用
例Ｂ５は、混合様式疎水性相互作用／アニオン交換（ＨＩＣ／ＷＡＸ）クロマトグラフィー様式において用いるべき例Ａ１の材料の適用性を例示する。

ｈＶＩＰ、即ち２８個のアミノ酸からなり、３３２５．８の分子量および約１０のｐＩを有するペプチドを、ＲＰ／ＷＡＸ様式においてクロマトグラフィーに適用した。実験的条件（溶離剤ｐＨ３）の下で、ペプチドおよび固定相は共に、正味の正の電荷を担持しており、反発性静電気的相互作用が発生する。従って、比較的疎水性であるペプチド（ｔ_Ｒ＝６．００分）が、ボイド時間に近接して、またはさらに早く（ｔ_０＝７．３８分）溶離する。２種の追加の主要なピークが、比較的大きい溶離時間においてクロマトグラム中に観察され、これは、ｈＶＩＰのミセル凝集体から生じていると考えられる。アセトニトリルの百分率が３％に増大し、リン酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＰ）緩衝液が１ｍＭの合計濃度に減少した場合には、凝集体は部分的に崩壊し、これらの条件はまた、高い溶離強度を有し、従ってｈＶＩＰ（ｔ_Ｒ＝６．４０分）が再び、ボイド時間（ｔ_０＝９．０３分）の前に溶離する。従って、これらのクロマトグラフィー分離様式の両方を、ＲＰ／ＷＡＸ混合様式クロマトグラフィーとして分類することができる。

対照的に、種々の分離条件を、混合様式ＨＩＣ／ＷＡＸ機構により説明することができる。溶離剤中のＴＥＡＰ緩衝液濃度のそれぞれ５０および１００ｍＭへの増大の結果、アニオン交換部位の実際の電位の低下がもたらされ、これにより疎水性相互作用への道が開かれる。増大した緩衝液濃度はまた、１種の塩析効果を生じ、これにより、ｈＶＩＰの強力な吸着がもたらされる。ペプチドは、緩衝液濃度を約２５ｍＭより高く保持する限りは、溶離しない。しかし、１００ｍＭから１０ｍＭへのＴＥＡＰの急峻な負の勾配を２分以内に行うと、ｈＶＩＰは、合計のＴＥＡＰ濃度が約１０ｍＭのレベルに達した後に、鋭いバンドとして溶離する。同様の挙動が、同様の条件の下で見出される：１００ｍＭのＴＥＡＰから０ｍＭへの負の直線状勾配を、典型的なＨＩＣ実験に従って行う。再び、ＴＥＡＰ濃度が２０ｍＭより低く低下すると、ｈＶＩＰが溶離する。両方のクロマトグラムは、ＨＩＣ機構の存在を明確に証明する。

例Ｂ６：Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく混合様式ＲＰ−ＷＡＸモノリシックシリカの適用
図７は、Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンセレクターに基づく混合様式ＲＰ／ＷＡＸモノリシックシリカカラム（例Ａ３の材料）上の酸性基の数が異なる酸性ペプチドの分離を示す。混合様式ＲＰ／ＷＡＸモノリシックシリカカラムは、これらの電荷の差異により５種のペプチドの良好な分離をもたらす（図７）。この例は、ＲＰ／ＷＡＸセレクターの有効性が粒子状シリカ材料に限定されず、他の支持体にも同様に有用であることを示す。

例Ａ３のＲＰ／ＷＡＸシリカモノリスカラム上の酸性ペプチドについて得られたクロマトグラム。実験条件：移動相、水（Ａ）、ＡＣＮ（Ｂ）、２００ｍＭのリン酸、ｐＨ３．０（トリエチルアミンで調整した）（Ｃ）；勾配、Ｂ、１０％において一定、５〜６０分は０％から３０％のＣの直線状勾配；他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出波長、２１５ｎｍ。試料：（７Ａ）Ｇｌｙ−Ａｓｐ、（７Ｂ）Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、（７Ｃ）Ａｓｐ−Ａｓｐ、（７Ｄ）Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、（７Ｅ）Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ。

Ｃ 比較例
例Ｃ１：環式および非環式アニオン交換シントンに基づくＲＰ／ＷＡＸ固定相類似体の比較
反応スキームを式ＸＩＩＩに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

ａ）リガンドの合成
２−ジメチルアミノエチルアミン（２６ｍｍｏｌ）をクロロホルムに溶解し、攪拌および冷却した溶液に、１０−ウンデセン酸塩化物（クロロホルム中２２ｍｍｏｌ）を、滴加によりゆっくりと加える。反応を、室温で１８時間放置して進行させる。

反応混合物から、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−１０−ウンデセノイル−１，２−エタンジアミンセレクターを、水性２Ｍ水酸化ナトリウムおよびクロロホルムで抽出する（３回）。混ぜ合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次に蒸発乾固させる。真空下で乾燥した後、油状の帯黄色生成物が９４％の収率で得られる。
ＥＳＩ−ＭＳ（陽性様式）：255.4 amu [M+H]⁺。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): 6.11 (s, 1 H), 5.80 (m, 1H), 4.96 (dd, 2 H), 2.32 (q, 2 H), 2.23 (s, 6 H), 2.17 (t, 2 H), 2.14 (t, 2H), 2.03 (q, 2 H), 1.61 (t, 2 H), 1.37 (t, 2 H), 1.30 (s, 8 H) ppm。

ｂ）ＲＰ／ＷＡＸリガンドのチオール改変シリカ上への固定化
Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−１０−ウンデセノイル−１，２−エタンジアミンセレクターの３−メルカプトプロピル改変シリカ（Kromasil（登録商標）１００−５μｍ；４．０２％Ｃ、０．９０％Ｈ、０．０３％Ｎ、２．３５％Ｓ）上への固定化は、例Ａ１に記載したプロトコルに従う。末端キャッピングの前および後のＲＰ／ＷＡＸ固定相の元素分析により、以下の結果が得られる：１１．５７％Ｃ、２．１６％Ｈ、１．３６％Ｎ、１．９８％Ｓ（末端キャッピング前）および１２．６２％Ｃ、２．２１％Ｈ、１．２７％Ｎ、１．８６％Ｓ（末端キャッピング後）。

ｃ）環式および非環式ＲＰ／ＷＡＸの比較のクロマトグラフィー的評価
例Ａ１の環式Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンセレクターに基づくＲＰ／ＷＡＸ固定相および例１０ａの非環式Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−１０−ウンデセノイル−１，２−エタンジアミンに基づくＲＰ／ＷＡＸ固定相の両方を、目的のペプチドから勾配ＲＰ−ＨＰＬＣにより分離するのが困難である未知の不純物を含む、合成のＮおよびＣ末端が保護されたテトラペプチド（Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド）を用いてクロマトグラフィー的に試験する。ＨＰＬＣ分離について、本発明の吸着剤（環式Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンに基づく（例Ａ１）；（ａ））を、非環式ＲＰ−ＷＡＸ吸着剤（非環式Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−１０−ウンデセノイル−１，２−エタンジアミン（上記の段階ａ）およびｂ）を参照）；（ｂ））と比較した。他の実験的条件は、以下の通りである：カラム寸法、２５０×４ｍｍ内径；移動相、１Ｍギ酸アンモニウム、ｐＨ４．５−水−アセトニトリル（１．８：８８．２：１０；ｖ／ｖ／ｖ）（Ｃ_ｔｏｔ＝１８ｍＭ）；流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出波長、３１６ｎｍ。

図３におけるクロマトグラムから、環式第三アミンに基づくＲＰ／ＷＡＸ相は、驚異的なことに、非環式第三アミンに基づくこの類似体よりもはるかに高い分離能力を示すことが、明らかである。分離係数は、環式ＲＰ／ＷＡＸ相について５．２であり（図３ａ）、一方これは、非環式類似体についてわずか３．５である（図３ｂ）。選択性のこの劇的な損失は、主に環式ＲＰ／ＷＡＸにおける３２から非環式ＲＰ／ＷＡＸにおけるわずか１９までの分離の降下に起因する。環式ＲＰ／ＷＡＸについての顕著に高い分離はまた、これを、合成の目的ペプチドのこの不純物からのクロマトグラフィー精製のために用いる場合には、結果として非環式類似体と比較してはるかに良好な試料負荷能力および従って生産性となる。

従って、本発明のＲＰ／ＷＡＸ固定相は、従来技術のこの非環式類似体と比較して、驚異的に高い選択性を示す。
同様の発見が、他の試験溶質について観察された。

例Ｃ２：ＤＡＢＣＯシントンに基づくアニオン交換部分を有するＲＰ／ＷＡＸ固定相を用いた比較実験
反応スキームを式ＸＶＩに概説し、ここで波線はシリカに基づく支持体を表す：

ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づくアニオン交換セレクターの合成

１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）（１当量）をニトロメタン（１ｍｍｏｌのアミンあたり０．５ｍＬ）に溶解した十分攪拌した溶液に、１１−ブロモ−１−ウンデセン（０．９８当量）を、反応フラスコを水浴中で〜２５℃に維持しながら加える。攪拌を１６時間継続し、その後反応混合物の揮発性留分を蒸発させる。残留油状物の結晶化が、石油エーテルで攪拌した後に得られる（中間体生成物：臭化１０−ウンデセン−１−イル−４−アザ−１−アゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン；収率８７％）。１２時間真空中で乾燥した後に、この中間体生成物（１当量）を、硫酸ジメチル（２当量）と共にニトロメタン（硫酸ジメチル１ｍｍｏｌあたり０．２５ｍＬ）中で２５℃で１６時間攪拌する。揮発性留分を蒸発により除去する。残留する粗製の生成物を石油エーテルと共に攪拌することにより、白色固体が得られ、これを真空中で乾燥する；収率８２％。

特徴づけ
臭化１０−ウンデセン−１−イル−４−アザ−１−アゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン（中間体生成物）
¹H-NMR (400 MHz, MeOD): 5.80 (m, 1 H), 4.97 (dd, 1 H), 4.91 (dd, 1 H), 3.37 (m, 6 H), 3.21 (m, 8 H), 2.05 (q, 2 H), 1.82-1.71 (m, 2 H), 1.45-1.30 (m, 12 H) ppm.
ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づくセレクター
¹H-NMR (400 MHz, MeOD): 5.80 (m, 1 H), 4.97 (dd, 1 H), 4.91 (dd, 1 H), 4.00 (m, 12 H), 3.55 (m, 2 H), 3.37 (s, 3 H), 2.04 (m, 2 H), 1.89-1.78 (m, 2 H), 1.47-1.29 (m, 12 H) ppm.

ｂ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づくセレクターのチオール改変シリカ上への固定化
例Ｃ２、段階ａ）のビス第四級ＤＡＢＣＯに基づくセレクターを、例Ａ１１、ｂ）に記載した手順に従って、同一のチオール改変シリカ上に固定化する。
改変されたシリカゲルをメタノールで数回洗浄し、７２時間乾燥する。末端キャッピング前の化学的に改変された粒子の元素分析により、以下の結果が得られる：１１．２７％Ｃ、２．２５％Ｈ、０．９４％Ｎおよび４．２９％Ｓ。

残りのチオール基を、他の点ではセレクター付加について前に記載したのと同一の条件の下で、１−ヘキセン（３．２ｍｌ）のラジカル付加によりキャッピングする。ゲルを、メタノール、メタノール中の３％酢酸およびジエチルエーテルで洗浄し、７２時間乾燥し、ステンレススチールＨＰＬＣカラム中に詰め込む。
末端キャッピングの後のＲＰ／ＳＡＸ固定相の元素分析により、以下の結果が得られる：１１．８０％Ｃ、２．３３％Ｈ、０．８８％Ｎおよび４．０１％Ｓ。

ｃ）ＤＡＢＣＯシントンに基づくアニオン交換固定相および本発明の相の比較のクロマトグラフィー的評価
上記のＤＡＢＣＯに基づく材料を、テトラペプチドＮ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドについてのこの吸着能力に関して、本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料、即ちＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づく例Ａ１１の混合様式アニオン交換材料およびＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく例Ａ１の材料に対する比較において、評価する。以下のクロマトグラフィー条件を用いる：カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（７０：３０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２３０ｎｍ；ピークの記載：（８Ａ）ウラシル、（８Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。得られたクロマトグラムを、図８に示す。

実験条件：（ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づく従来技術のアニオン交換材料（５μｍ粒子に基づく上記の材料）並びに（ｂ、ｃ）（ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンセレクター（５μｍ粒子に基づく例Ａ１１の材料）および（ｃ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジン（１０μｍ粒子に基づく例Ａ１の材料）に基づく本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ材料を用いた、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのウラシルからの分離について得られたクロマトグラム。カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（７０：３０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２３０ｎｍ；ピークの記載：（８Ａ）ウラシル、（８Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。得られたクロマトグラムを、図８に示す。

ｄ）モノカチオン系（３−アミノキヌクリジンおよび３−α−アミノトロパン）並びにビスカチオン系（ビス第四級ＤＡＢＣＯ）シントンに基づくアニオン交換固定相の比較のクロマトグラフィー的評価
上記のＤＡＢＣＯに基づく材料を、テトラペプチドＮ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドについてのこの吸着能力に関して、本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料、即ちＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づく例Ａ１１の混合様式アニオン交換材料およびＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく例Ａ１の材料に対する比較において、評価する。（ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づく従来技術のアニオン交換材料（５μｍ粒子に基づく上記の材料）並びに（ｂ、ｃ）（ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンセレクター（５μｍ粒子に基づく例Ａ１１の材料）および（ｃ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジン（１０μｍ粒子に基づく例Ａ１の材料）に基づく本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ材料を用いた、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのウラシルからの分離について得られたクロマトグラム。

カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２３０ｎｍ；ピークの記載：（１）ウラシル、（２）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドに基づく例Ａ１のもの。以下のクロマトグラフィー条件を用いる：カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２３０ｎｍ；ピークの記載：（９Ａ）ウラシル、（９Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。得られたクロマトグラムを、図９に示す。

実験的詳細：（ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づく従来技術のアニオン交換材料（５μｍ粒子に基づく上記の材料）並びに（ｂ、ｃ）（ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンセレクター（５μｍ粒子に基づく例Ａ１１の材料）および（ｃ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジン（１０μｍ粒子に基づく例Ａ１の材料）に基づく本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ材料を用いた、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのウラシルからの分離について得られたクロマトグラム。カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２３０ｎｍ；ピークの記載：（９Ａ）ウラシル、（９Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。

ｅ）モノカチオン系（３−アミノキヌクリジンおよび３−α−アミノトロパン）並びにビスカチオン系（ビス第四級ＤＡＢＣＯ）シントンに基づくアニオン交換固定相の比較のクロマトグラフィー的評価
上記のＤＡＢＣＯに基づく材料（即ち最も近い従来技術の材料）を、テトラペプチドＮ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドについてのこの吸着能力に関して、本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料、即ちＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づく例Ａ１１の混合様式アニオン交換材料およびＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく例Ａ１の材料に対する比較において、評価する。以下のクロマトグラフィー条件を用いる：カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ３１６ｎｍ；ピークの記載：（１０Ａ）未知の主要なペプチド不純物、（１０Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。得られたクロマトグラムを、図１０に示す。

実験的詳細：（ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づく最も近い従来技術のアニオン交換材料（５μｍ粒子に基づく上記の材料）並びに（ｂ、ｃ）（ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンセレクター（５μｍ粒子に基づく例Ａ１１の材料）および（ｃ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジン（１０μｍ粒子に基づく例Ａ１の材料）に基づく本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ材料を用いた、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのこの副産物からの分離。カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、１％（ｖ／ｖ）水性酢酸（ｐＨ４．５、アンモニアで調整した）−アセトニトリル（８０：２０；ｖ／ｖ）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ３１６ｎｍ；ピークの記載：（１０Ａ）未知の主要なペプチド不純物、（１０Ｂ）Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド。

ｆ）モノカチオン系（３−アミノキヌクリジンおよび３−α−アミノトロパン）並びにビスカチオン系（ビス第四級ＤＡＢＣＯ）シントンに基づくアニオン交換固定相の比較のクロマトグラフィー的評価
上記のＤＡＢＣＯに基づく材料（即ち従来技術の材料）を、ブチルベンゼン、ペンチルベンゼン、Ｏ，Ｏ−ジエチルホスホロチオエートおよびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−プロリル−フェニルアラニンからなる試験混合物についてのこの分離力に関して、本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料、即ちＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンに基づく例Ａ１１の混合様式アニオン交換材料およびＮ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジンに基づく例Ａ１の材料に対する比較において、評価する。以下のクロマトグラフィー条件を用いる：カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、アセトニトリル−水（４０：６０；ｖ／ｖ）の混合物中の５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０（アンモニア）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２５０ｎｍ。得られたクロマトグラムを、図１１に示す。

実験的詳細：（ａ）ビス第四級ＤＡＢＣＯに基づく従来技術のアニオン交換材料（５μｍ粒子に基づく上記の材料）並びに（ｂ、ｃ）（ｂ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−α−アミノトロパンセレクター（５μｍ粒子に基づく例Ａ１１の材料）および（ｃ）Ｎ−（１０−ウンデセノイル）−３−アミノキヌクリジン（１０μｍ粒子に基づく例Ａ１の材料）に基づく本発明の混合様式ＲＰ／ＷＡＸ材料を用いた、ブチルベンゼン（ＢｕＢ）、ペンチルベンゼン（ＰｅＢ）、Ｏ，Ｏ−ジエチルホスホロチオエート（ＤＥＴＰ）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−プロリル−フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）からなる混合物の分離。カラム寸法、１５０×４．０ｍｍ内径；移動相、アセトニトリル−水（４０：６０；ｖ／ｖ）の混合物中の５０ｍＭ酢酸、ｐＨ６．０（アンモニア）。他の条件：流量、１ｍｌ／分；温度、２５℃；検出、ＵＶ２５０ｎｍ。

（ａ）は、Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンに基づくＲＰ固定相（例Ａ１）上での、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドおよびこの合成からの副産物のＨＰＬＣ分離を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ１を参照。（ｂ）は、商業的に入手できるＲＰ固定相上での、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドおよびこの合成からの副産物のＨＰＬＣ分離を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ１を参照。 Ｎ−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンに基づく混合様式ＲＰ／ＷＡＸ上でのクロルピリホス（２Ａ）およびこの代謝産物（２Ｂ、２Ｃ、２Ｅ）並びに内部標準（２Ｄ）の同時分離（例１のＲＰ／ＷＡＸ）を示す図である。（２Ｂ）リン酸ジエチル、（２Ｃ）チオリン酸ジエチル、（２Ｄ）リン酸ジブチル（内部標準）、（２Ｅ）３，５，６−トリクロロ−２−ピリジノール。実験的詳細について、例Ｂ２を参照。

（ａ）Ｎ−１０−ウンデセノイル−３−アミノキヌクリジンに基づくＲＰ／ＷＡＸ固定相（例Ａ１）および（ｂ）非環式Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−１０−ウンデセノイル−１，２−エタンジアミンに基づくＲＰ／ＷＡＸ固定相上での、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドおよびこの合成からの副産物のＨＰＬＣ分離を示す図である。実験的詳細について、例Ｃ１を参照。 Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのこの副産物からの、３−α−アミノトロパンに基づく混合様式アニオン交換材料を用いた分離を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ３を参照。

ＨＩＬＩＣ／ＷＡＸ様式によるペプチド分離の比較を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ４を参照。 ＲＰ様式によるペプチド分離の比較を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ４を参照。 ＲＰ／ＷＡＸシリカモノリスカラム上での酸性ペプチドの分離を示す図である。実験的詳細について、例Ｂ６を参照。

本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料およびＤＡＢＣＯシントンに基づく従来技術の材料による、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのウラシルからの分離の比較を示す図である；実験的詳細について、例Ｃ２ｃ）を参照。 本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料およびＤＡＢＣＯシントンに基づく従来技術の材料による、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのウラシルからの分離の比較を示す図である；実験的詳細について、例Ｃ２ｄ）を参照。 本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料およびＤＡＢＣＯシントンに基づく従来技術の材料による、Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドのこの副産物、（１０Ａ）：主要な副産物；（１０Ｂ）：Ｎ−アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドからの分離の比較を示す図である；実験的詳細について、例Ｃ２ｅ）を参照。 本発明のＲＰ／ＷＡＸ材料およびＤＡＢＣＯシントンに基づく従来技術の材料による、ブチルベンゼン（ＢｕＢ）、ペンチルベンゼン（ＰｅＢ）、Ｏ，Ｏ−ジエチルホスホロチオエート（ＤＥＴＰ）およびＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−プロリル−フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）からなる混合物の分離の比較を示す図である；実験的詳細について、例Ｃ２ｆ）を参照。

Claims (7)

1. 支持体および相互作用性リガンド部分を含み、これにより前記相互作用性リガンド部分が、モジュール結合領域の連続的な組み合わせを含み、これにより前記モジュール結合領域が、使用条件下でイオン化可能な少なくとも１つのアニオン交換部位および少なくとも１つの非イオン性結合部位を含む、混合様式アニオン交換材料であって、前記アニオン交換部位が、環内窒素を有するオリゴ環式アザ化合物を含み、ただし、前記支持体に結合した前記オリゴ環式アザ化合物が、キナアルカロイドの一部でも１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）の誘導体でもないことを特徴とする、前記混合様式アニオン交換材料。
2. 前記アニオン交換部位が、環内窒素を有するオリゴ環式モノアザ化合物を含む、請求項１に記載の混合様式アニオン交換材料。
3. アニオン交換部位が、キヌクリジン環系を含む、請求項１または２に記載の混合様式アニオン交換材料。
4. 非イオン性結合モジュールが、混合様式親水性相互作用クロマトグラフィー／アニオン交換材料が得られるように、アミド、スルホンアミド、尿素、カルバミン酸塩、チオエーテル、スルホキシド、スルホンおよび／またはエーテル官能基を含む極性基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の混合様式アニオン交換材料。
5. 非イオン性結合モジュールが、４〜３０個の炭素原子を有する長い疎水性アルキル鎖を含み、これにより１つまたは２つ以上の隣接していない（−ＣＨ_２−）基が、混合様式逆相／アニオン交換材料が得られるように、硫黄（−Ｓ−）により置換されていてもよい、請求項１〜３のいずれかに記載の混合様式アニオン交換材料。
6. 非イオン性結合モジュールが、混合様式疎水性相互作用クロマトグラフィー／アニオン交換材料が得られるように、１〜４個の炭素原子を有する短いアルキル鎖またはフェニルもしくはベンジル残基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の混合様式アニオン交換材料。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載の混合様式アニオン交換材料の、少なくとも２種の溶質を分離するための使用。

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