JP2008249712A - ヒスチジンタグ付きインチミン、ならびに免疫応答を刺激し、標的能力を有する抗原担体としてインチミンを使用する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 腸管出血性大腸菌(EHEC)又は腸内病原性大腸菌(EPEC)を検出するための診断キットを提供する。
【解決手段】 腸管出血性大腸菌(EHEC)又は腸内病原性大腸菌(EPEC)を検出するための診断キットであって、eae遺伝子によりコードされるタンパク質又はそれらの一部に特異的な抗体であってeae遺伝子を発現する細菌の上皮細胞への結合の遮断能を保持する前記抗体を含む抗体試薬、を含む、前記診断キット。
【選択図】 なし

Description

政府の利権
本明細書に記載される発明は、政府が使用する上では、それに対するいかなる使用料をも本発明者らに支払うことなく、製造し、認可を与え、かつ用いることができる。

発明の分野
本発明は、単離された機能的細菌タンパク質、すなわちインチミン、ならびに、大腸菌(Escherichia coli)の特定の病原性株等、インチミン様タンパク質を発現する細菌による感染または伝播(transmission)に対する防御のためにそれを抗原として使用することに関する。本発明はまた、他の抗原に対する免疫応答を増強するために、また体内の特定の細胞または箇所へ抗原または薬物の送達を標的化させるためにインチミンを使用することに関する。本発明はまた、ポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体、ならびに病原性大腸菌による感染の治療、診断、および予防におけるそれらの使用に関する。

病原性形態(virulent form)の出血性下痢は腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）によって引き起こされる。この病原体は、合衆国における出血性下痢（出血性大腸炎［ＨＣ］とも呼ばれる）の最も一般的な感染性要因である(疾患管理および予防センター（Centers for Disease Control and Prevention）(運営概要)．ＭＭＷＲ 43(Ｎｏ.ＲＲ-5):1-18(1994)；Griffin，Ｐ.Ｍ.らAnnals of Internal Med．109:705(1988))。血清型の1つ、とりわけＯ157：Ｈ7、は合衆国において最も一般的に単離されているＥＨＥＣの血清型であり、1982年に始まるＨＣの多数の突発に関連付けられている(Riley，L.WらN．Eng．J．Med．308:681(1983))。

主な様式のＥＨＥＣの伝播は、汚染された食物、とりわけ加熱が十分でないハンバーガーの摂取を介して生じる(Doyle，M．P.およびSchoeni，J．L．Appl．Environ．Microbiol．53:2394(1987)；Samadpour，M.らAppl．Environ．Microbiol．60:1038(1994))。ＥＨＥＣに感染した人々のうち、5−10％もが溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）と呼ばれる重篤な合併症に罹患し、ＨＵＳとは腎臓糸球体に存在するような血管の内層をなす細胞（内皮細胞）を標的として破壊する志賀毒素様毒素の作用によって引き起こされる症状である(Johnson，W.M.らLancet．i:76(1983)；O'Brien，A．D.らLancet．i:702(1983))。ＨＵＳは恒久的な腎臓の損傷、あるいは完全な腎不全さえ生じることがある。

ＥＨＥＣは健常な成人においてさえ非常に重篤な疾患を引き起こすことがあるが、とりわけ幼い子供はその感染によって死亡したり、恒久的な損傷を受けたりする、よリ大きな危険にさらされている。この感染が特に危険なものであり得るその他の者には、高齢者および免疫無防備状態の者が含まれる。ウシにおけるＥＨＥＣの罹患率および十分に加熱されたハンバーガーと加熱不十分なハンバーガーとを区別する上での主観的な特質によっては、ファーストフードレストランでの、もしくは家庭でのバーベキューの時ですら、そのご都合主義の加熱終了で、家庭の悲劇が生じ得る。

このＥＨＥＣの致命的な性質についての鍵の１つは、ノトバイオート・ブタにおいて示されるような、結腸に接着性／消滅性（attaching／effacing）(Ａ／Ｅ)腸管病変を生成するその細菌の能力である（Tzipori，S.らInfect．Immun．57:1142(1989))。ブタにおいて示されるこのＡ／Ｅ病変は、腸管内層の粘膜細胞への細菌の密接な付着および微絨毛の溶解を特徴とする(McKee，M．L.らInfect．Immun．63:3739(1995)；Tzipori，S.らInfect．Immun．57:1142(1989))。同様の病変は組織培養物中のヒト喉頭上皮（ＨＥｐ−2）(ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ23)細胞において見られる(McKee，M．L.らInfect．Immun．63:3739(1995)；Tzipori，S.らInfect．Immun．57:1142(1989))。

1990年に、Jerseらは関連する下痢性大腸菌株、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）において染色体遺伝子を同定した。eae(以前はeaeＡとして知られていた)と命名されたこの遺伝子は、組織培養においてＡ／Ｅ病変を生成する上でこの細菌に必須であることが見出された(Jerse，A．E.らProc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ．87:7839(1990))。このeae遺伝子は、eaeと呼ばれるＥＰＥＣのインチミンである94ｋＤａ外膜タンパク質(インチミン)をコードしていた。類似のタンパク質がＥＨＥＣ Ｏ157：Ｈ7株中に存在することが示された(Jerse，A．E.およびKaper，J．B．Infect．Immun．59:4302(1991))。

近年、研究者達は、ヒト上皮喉頭（ＨＥｐ−2）細胞およびヒト回腸上皮（ＨＣＴ−8）細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ244）へのＥＨＥＣの付着（McKee,M．L.らInfect．Immun．63:3739(1995)）ならびに子ブタ腸管におけるＡ／Ｅ病変の形成（Donnenberg，M．S.らJ．Clin．Invest．92:1418(1993)；McKee，M．L.らInfect．Immun．63:3739(1995)）にはインチミンが必要であることを示した。非倫理的でありかつ禁止されているため、ＥＨＥＣでのヒトに対する研究は行われてはいないが、ＥＰＥＣにおいて見出されるインチミンタンパク質はヒトボランティアにおける下痢および熱の生成に強く関連する(Donnenberg，M．S.らJ．Clin．Invest．92:1412(1993)；Levine，M．M.らJ．Infect．Dis．152:550(1985))。

ＥＰＥＣ Ｅ2348／69株を抗原投与したヒトボランティア（10人中10人）では、28日後にこの94ｋＤａタンパク質に対する注目に値する免疫応答が高まった(LevineらJ Infect．Dis．152:550，1985)。これらのヒトでの治験において、Ｅ2348／69の摂取の後に下痢を発症しなかった唯１人のボランティア（10人のうちの１人）は、抗原投与前に94ｋＤａタンパク質に対する検出可能な抗体を有していたグループの１人であった。

Ａ／Ｅ病変を誘発することが可能な他の2種類の細菌種がeae遺伝子座を有することが示されている：ハフニア・アルベイ（Hafnia alvei）(Albert，M．J.らJ.Med．Microbiol．37:310(1992))およびシトロバクター・ロデンチウム(Citrobacter rodentium)（以前は、シトロバクター・フロインディイ（Citrobacter freundii）バイオタイプ4280として知られていた）(Schauer，D．B.およびFalkow，S．Infect．Immun．61:2486(1993))。これらの細菌は一般にはヒトの病理に関係しないが、それらが通常関連する動物種においては重要な疾患を引き起こすことがある。例えば、シトロバクター・ロデンチウムはマウスにおける胃腸管疾患に関連する。マウスは、しばしば、実験における対照および被験対象としての役目を果たす。動物飼育施設におけるこの疾患の突発により、経済的で注意深く制御された実験が危険にさらされる可能性がある。加えて、このような細菌種は免疫無防備状態の患者、若年者および高齢者、に対して病原性となる可能性がある。

病原体、エンテロコリチカ菌(Yersina enterocolitic)および偽結核菌(Yersina pseudotuberculosis)は、培養された上皮細胞の細菌侵入(Isberg，R.Rら、Cell 60:769以下参照(9187))、およびin vivoでの腸上皮の効率的な侵入(Pepe，J.C.およびMiller，VL.，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ 90:6473以下参照(1993))を可能にする103ｋＤａ外膜タンパク質(インベージン(invasin))を発現する。インベージンも、インチミンタンパク質ファミリーの一員である。

インチミンを発現する細菌株に感染したウシのような動物は、他者へのその感染の源としての役目を果たすことに加えて、それら自身が罹患する可能性がある。抗生物質での治療を用いて動物におけるこれらのインチミン発現細菌の動物蓄積を根絶すること、またはそれを制限することさえも、非常に高価である。加えて、ヒトまたは動物におけるこの感染の抗生物質治療が高価であるだけでなく、これらの抗生物質自体が副作用に関連し、その副作用が危険なものである可能性がある。ＥＨＥＣと同様に、これらの副作用は幼い子供および高齢者にとって特に危険なものである可能性がある。したがって、インチミンを発現する細菌に対する防御免疫応答の増強により、この感染の重篤性を減少させ、またはそれらを完全に予防する別の手段が必要とされる。

さらに、抗原注射による免疫感作よりも時間を消費せず、高価ではなく、かつ痛みが少ない免疫感作形態が必要とされる。さらにまた、感染箇所、最も頻繁には胃腸管粘膜、に含まれる特定の組織において防御免疫応答を産生させることが必要とされる。

胃腸管組織に感染する他の生物（これらにはサルモネラ種および赤痢菌種が含まれるがそれらに限定されるものではない）が免疫応答を生じることが可能である抗原を有する。しかしながら、粘膜の免疫応答を刺激するために胃腸管粘膜をこれらの抗原の標的とする手段ならびに循環抗体を刺激する手段が必要とされる。

免疫無防備状態の個体は、病原体に関連する抗原に対して予め曝しても、病原体に対する防御免疫応答を蓄積しにくい。従って、病原体に曝された免疫無防備状態の個体には、受動免疫防御を付与する必要がある。これに関連して必要となるのは、インチミンに対する抗体の存在によって感染が防げるか否かを同定する能力である。

本発明は、野生型結合活性を保持するもしくは野生型結合活性を遮断する抗体を誘導するインチミンまたはインチミンの一部を含む富化タンパク質、ならびに、野生型結合活性を保持するもしくは野生型結合活性を遮断する抗体を誘導するインチミンまたはインチミンの一部を含む精製タンパク質に関する。本発明はまた、ヒスチジンタグを有するインチミン、インチミン様タンパク質、またはその一部を含むタンパク質に関する。本発明はさらに、インチミン、インチミン様タンパク質またはその一部が、該インチミン、インチミン様タンパク質またはその一部と化学的、物理的、もしくは組換え的に結合された少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、もしくはそれらの組合わせ物をさらに含んだ上記タンパク質に関する。

さらに、本発明は、精製されたインチミンまたは結合活性を保持する精製されたインチミンの一部を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミンまたはヒスチジンタグを有するインチミンの一部を含むタンパク質を発現し、該インチミンまたはインチミンの一部から該ヒスチジンタグを除去することを含む。本発明はさらに、精製されたインチミン様タンパク質またはその一部を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質またはその一部を含むタンパク質を発現し、精製の前または後に該インチミン様タンパク質またはその一部から該ヒスチジンタグを除去することを含む。

本発明はさらに、富化されたインチミンまたは富化されたインチミンの一部を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミンまたはヒスチジンタグを有するインチミンの一部を含むタンパク質を発現し、該インチミンまたはインチミンの一部を富化し、そして任意に、該富化されたインチミンまたは該富化されたインチミンの一部から該ヒスチジンタグを除去することを含む。同様に、本発明は、富化されたインチミン様タンパク質またはその一部を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質またはその一部を含むタンパク質を発現し、該インチミン様タンパク質またはその一部を富化し、そして任意に、該富化されたインチミン様タンパク質またはその一部から該ヒスチジンタグを除去することを含む。

本発明はまた、インチミンまたはインチミン様タンパク質を発現する細菌に対する防御免疫応答を増強する方法に関し、該方法は、インチミン、インチミン様タンパク質、または、野生型結合活性を保持する抗体もしくは野生型結合活性を遮断する抗体を誘導するそれらの一部を患者に投与することを含む。

本発明は、少なくとも１つの抗原に対して防御免疫応答を増強する方法に関し、該方法は、インチミン、インチミン様タンパク質、またはそれらの一部と化学的、物理的、もしくは組換え的に結合した少なくとも１つの抗原を含む組成物を患者に投与することを含む。

本発明はさらに、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、もしくはそれらの組合わせ物の送達を上皮細胞に標的化させる方法に関し、該方法は、インチミン、インチミン様タンパク質、または結合活性を保持し得るそれらの一部と結合した少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、またはそれらの組合わせ物を含む組成物を患者に投与することを含む。

本発明はさらに、受動免疫防御を付与する方法に関し、該方法は、抗−インチミン抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む。

本発明はさらに、インチミンを発現する宿主細菌に特異的な他の抗体を含有しない、抗−インチミン抗体を含む組成物に関する。

本発明はさらに、抗−インチミン抗体の調製方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミンまたはヒスチジンタグを有するインチミンの一部を発現し、該インチミンまたはインチミンの一部を患者に投与し、抗−インチミン抗体を回収することを含む。同様に、本発明は、抗−インチミン抗体の調製方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質またはその一部を発現し、インチミン様タンパク質またはその一部を患者に投与し、抗−インチミン抗体を回収することを含む。

本発明は、野生型結合活性を保持する、もしくは野生型結合活性を遮断する抗体を誘導するインチミンまたはインチミンの一部を含む富化タンパク質、ならびに、野生型結合活性を保持する、もしくは野生型結合活性を遮断する抗体を誘導するインチミンまたはインチミンの一部を含む精製タンパク質に関する。本発明はまた、ヒスチジンタグを有するインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質を含むタンパク質に関する。ヒスチジンタグ付きインチミン、ヒスチジンタグ付きインチミンの一部、またはヒスチジンタグ付きインチミン様タンパク質が富化または精製されることが好ましい。また、上記タンパク質が、インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質と化学的、物理的、または組換え的に結合された少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、またはそれらの組合わせ物をさらに含むことが好ましい。

本発明はさらに、精製されたインチミンまたは精製されたインチミンの一部を作製する方法に関し、該方法は、
−ヒスチジンタグを有するインチミンまたはインチミンの一部を含むタンパク質を発現し、
−該インチミンまたはインチミンの一部を精製し、
−精製の前または後に、該インチミンまたはインチミンの一部から該ヒスチジンタグを除去することを含む。

同様に、本発明は、精製されたインチミン様タンパク質を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質を含むタンパク質を発現し、該インチミン様タンパク質を精製し、精製の前または後に該インチミン様タンパク質から該ヒスチジンタグを除去することを含む。

本発明はさらに、精製されたインチミンまたは富化されたインチミンの一部を作製する方法に関し、該方法は、
−ヒスチジンタグを有するインチミン、またはヒスチジンタグを有するインチミンの一部を含むタンパク質を発現し、
−該インチミンまたはインチミンの一部を精製し、
−精製されたインチミンまたは富化されたインチミンの一部からヒスチジンタグを除去することを含む。

同様に、本発明は、富化されたインチミン様タンパク質を作製する方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質を含むタンパク質を発現し、インチミン様タンパク質を富化し、富化されたインチミン様タンパク質からヒスチジンタグを除去することを含む。

本発明はさらに、インチミンまたはインチミン様タンパク質を発現する細菌に対する防御免疫応答を増強する方法に関し、該方法は、インチミン、結合活性を保持するインチミンの一部、またはインチミン様タンパク質を患者に投与することを含む。インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質は精製されているか、富化されていることが好ましい。また、インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質はヒスチジンタグを有していることが好ましい。

本発明はさらに、少なくとも１つの抗原に対する防御免疫応答を増強する方法に関し、インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部と化学的、物理的、または組換え的に結合した少なくとも１つの抗原が精製または富化されることを含む。また、インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部がヒスチジンタグを有することが好ましい。

本発明はさらに、少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、もしくはそれらの組合わせ物の送達を上皮細胞に標的化させる方法に関し、該方法は、結合活性を保持する能力を有するインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部と結合した少なくとも１つの抗原、少なくとも１つの薬剤、またはそれらの組合わせ物を含む組成物を患者に投与することを含む。インチミン、インチミンの一部またはインチミン様タンパク質もしくはその一部は、精製または富化されていることが好ましい。また、インチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部がヒスチジンタグを有することが好ましい。

本発明はさらに、受動免疫防御を付与する方法に関し、該方法は、抗−インチミン抗体をそれを必要とする患者に投与することを含む。

本発明はさらに、インチミンを発現する宿主細菌に特異的な他の抗体を含有しない、抗−インチミン抗体を含む組成物に関する。本明細書において、インチミンを発現する宿主細菌とは、細菌ゲノムまたはプラスミド中でコードされるインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部を発現するあらゆる病原性または非病原性細菌を指す。この宿主細菌はＥＨＥＣである。本方法で製造される抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。本方法で製造される抗体は、アフィニティー精製されていることが好ましい。

本発明はさらに、抗−インチミン抗体の調製方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミンまたはヒスチジンタグを有するインチミンの一部を発現し、該インチミンまたはインチミンの一部を患者に投与し、抗−インチミン抗体を回収するこを含む。本方法も、ヒスチジンタグを除去することを含んでいても良い。また、本方法は、インチミンまたはインチミンの一部を富化することを含むことが好ましく、そしてより好ましくはインチミンまたはインチミンの一部を精製することを含む。

同様に、本発明は、抗−インチミン抗体の調製方法に関し、該方法は、ヒスチジンタグを有するインチミン様タンパク質またはその一部を発現し、インチミン様タンパク質またはその一部を患者に投与し、抗−インチミン抗体を回収することを含む。本方法も、ヒスチジンタグを除去することを含んでいても良い。また、本方法は、インチミンまたはインチミンの一部を富化することを含むことが好ましく、そしてより好ましくはインチミンまたはインチミンの一部を精製することを含む。

本発明の目的は、上皮細胞を結合する能力を保持した、大量のインチミン、好ましくはＥＨＥＣインチミンを精製することである。本目的を達成するために、eaeの一部を、ヒスチジンタグ発現ベクターにクローン化し、発現させ、精製した。本発明の更なる目的は、免疫応答を誘発するために、his-インチミンを抗原として投与することである。

上記した、また以下の実施例に記載する特定のhis−タグ付きインチミンタンパク質をこの目的のために使用することができるが、当業者であれば、結合機能を保持するより小さい断片も望ましいことがわかるであろう。

当業者はまた、使用されるhis−タグ付きインチミンのサイズが、インチミンを投与する特定の目的によって変わり得ることがわかるであろう。例えば、his−タグインチミンが1つ以上の抗原と結合される場合、組み合わせた融合産物の安定性を向上するために小さい断片が選択される。ただし、決して大きな断片が除外されるわけではない。他の抗原のサイズまたは立体配置、ならびにそれに関係したエピトープの位置は、特定の長さのhis-タグ付きインチミンがエピトープを粘膜に非常に近づけることを示し得る。所望のサイズも、当業者に公知の材料および方法に基づいて、利用可能な制限部位の都合によって変わり得る。従って、本明細書中で使用するhis−インチミンおよびhis−タグ付きインチミンという用語は、ヒスチジンタグを有するインチミン(全長インチミン)の予測されるＣ末端アミノ酸935個のうち少なくとも900個を含むポリペプチドを指す。本発明はまた、結合機能を保持するhis−タグ付きタンパク質の小さい部分を含む。

組換え技術によりhis−タグ付きインチミンと１つ以上の抗原との間の結合を行い、インチミンの一部としてインチミン、および追加のタンパク質抗原を含む融合タンパク質を生成する。さらに、インチミンは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、および他の抗原と、当業者に公知の方法により化学的または物理的に結合され得る。当業者には、化学結合の方法が周知であり、これには部分的に、利用可能な官能基(アミノ基、カルボキシル基、チオ基、アルデヒド基等)を介して結合することが含まれる。S.S．Wong，Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking CRC Press(1991)；およびBrenkeleyら、Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes，Haptens and Cross-linking Agents，Bioconjugate Chemistry 3#1(1992年１月)を参照されたい。

結合機能の保持とは、インチミン、インチミン様タンパク質、および/またはそれらの一部が、上皮細胞または細胞系(Ｈｅｐ-2およびＨＣＴ-8等)に結合する能力を保持することを指す。このような結合は、当該分野において標準的なあらゆる技術を用いて測定することができる。例えば、微小コロニーアッセイにより(Frankelら、Infect．Immun．62(5):1835-1842(1994))、FAS（蛍光アクチン染色）により、または両方により(McKeeおよびO'Brien，Infect．Immun．63(5):2070-2074(1995))、細菌微小コロニー形成として結合を可視化することができる(これらの文献の開示は、本明細書において参考として援用する)。また、結合は、細菌毒力または病原性の関数として、あるいは死後組織学的試験により、in vivoで測定することができる。結合機能を決定するための上記方法のそれぞれの例は、実施例ＩＶに記載の接着アッセイを含み、以下の実施例において詳述する。

本発明の目的の１つは、ＥＨＥＣにより発現される特定のインチミンといくらかの相同性を有するタンパク質を介して上皮細胞に結合する能力を有するＥＨＥＣまたは他の病原体によって引き起こされる病気または疾患を防ぐために、インチミンもしくはその一部、またはインチミン様タンパク質もしくはその一部を投与することである。上記目的は、インチミンに対する免疫応答を刺激することにより、ＥＨＥＣおよび関連する病原体が上皮細胞に接着する能力を遮断することによって達成される。従って、本明細書において免疫感作という用語を使用する。

インチミンもしくはインチミンの一部、インチミン様タンパク質もしくはその一部は、対応する野生型タンパク質の結合を遮断する抗体を誘導できることが好ましい。抗体が立体障害または立体配置の変化によって結合を遮断するように、これらの抗体は結合部位そのものを指向、または直線状ポリペプチドの他のあらゆる部分を指向し得る。このような妨害は、例えば、実施例ＩＶのin vitro細菌接着アッセイにおける野生型結合パターンの損失によって視覚化され得る。

特に異なる種が治療されるのため、防御の程度は、インチミンとの相同性の程度、ならびに患者固有の特質により異なる。防御の正確な程度を定量することは、あらゆる特定の病原体に対して本発明を実施する上で重要ではない。

本明細書において使用する免疫感作とはまた、患者に感染を回避させる免疫応答をまとめて刺激することに加えて、病原体が胃腸管においてコロニー形成する能力を低下させ、感染の重度を軽減すること(死亡、ＨＵＳ、または慢性肝臓障害の発生率の低下、毒性レベルの低下、流体損失の低下、あるいは当業者に通常使用されている病気のその他の指標のいずれかにより測定される)も指す。

特に記載しないかぎり、本明細書に記載する使用および方法は概してヒトおよび動物に適用可能である。本明細書において、患者という用語は、ヒトおよび動物の両者に対して使用し、動物は、飼育動物だけに限らず、野生動物および実験動物も含まれる。

Ｈｉｓ−タグ付きインチミンの単離および精製
分子のＮ末端側1／3が欠失しているＨｉｓ−インチミン融合体（ＲＶＨｉｎｄＨｉｓ）が非接着性ＥＨＥＣ eae変異体の接着性を補完することが可能であったこと、すなわち、インチミンの発現を妨げる遺伝的変更の後にその結合能力を喪失したＥＨＥＣの株に結合能力を回復させたことが示されている。この回復した結合において示される接着のパターンは野生型86−24株において観察されるものと区別することができなかった(McKee，M．L.およびO'Brien，A．D．Infect．Immun．印刷中(1996))。上述の微小コロニーアッセイで測定した場合、野生型の活性は強く染色された局在化領域を有する点状パターンとして同定された。

しかしながら、部分的にはインチミンが常にＥＨＥＣの外膜と会合しているため、インチミンタンパク質の精製は困難であった。過剰発現した組換えインチミンの大部分は、宿主細菌の超音波破壊および抽出バッファーへの穏やかな界面活性剤の添加の後であっても細菌の膜画分と会合したままであった。97ｋＤａ範囲の他の多くの未変性大腸菌タンパク質と結合したインチミンタンパク質の不溶性が未変性タンパク質の精製を困難なものとした。

インチミン−マルトース結合タンパク質融合体（ＭＢＰ）を作製しようとする試みもまた、推定されるタンパク質産物が欠失および再構成を有していたため、不成功であった。他の研究者による試みはインチミンＣ末端の280個のアミノ酸へのＭＢＰ融合体の構築を示していたが、この融合体はＥＨＥＣ様の結合機能をもたらさなかった。このＭＢＰ−インチミン融合タンパク質によって付与される接着性の拡散パターンはＨＥｐ−2細胞へのＥＨＥＣの結合のパターンとは明らかに異なるものであった(Frankel，G.らInfect．Immun．62:1835(1994))。

280個のアミノ酸よりも大きい機能的ＭＢＰ−インチミン融合体を得ることができないことについての可能性のある説明の１つは、最後の280個のアミノ酸よりも大きいeaeの断片の過剰発現が不安定であり、したがって再構成する傾向がある、すなわち、そのクローンを単離することは、それが発現した際に細胞にとって致命的であるかまたは有害であるために、不可能である可能性がある。あるいは、280個のアミノ酸より大きいＭＢＰ−インチミン融合体の断片の過剰発現が細菌の膜を塞ぎ(plug up)、それがその細胞にとって致命的である可能性がある。

ＭＢＰを用いてインチミンを精製しようとする試みが失敗した後、そのタンパク質にヒスチジンタグを結合することを包含するＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡ expressionist Kitを用いて融合体を作製した。このヒスチジンタグは、小さく、免疫原性がなく、ニッケルアフィニティーマトリックスにしっかりと結合し、これがさらなる研究のために多量の物質を精製することを容易にした。加えて、この発現系により、Ｈｉｓ融合タンパク質の発現の厳重な制御を維持して、このタンパク質の過剰発現の結果としての大腸菌宿主株に対するこの組換えタンパク質の可能性のあるあらゆる致命的効果を防止することを可能となる。実施例Iではこのような融合タンパク質の作製について説明する。

実施例Ｉ
Ａ．935個の推定アミノ酸（図2）のうちの900個を含むＨｉｓ−タグ付きインチミンをコードするプラスミド、ｐＥＢ313（図１）の構築
eae遺伝子を、Griffin，P．M.ら,Ann．Intern．Med.109:705-712(1988)またはPhil Tarr（小児科病院および医療センター(Children's Hospital and Medical Center)、4800サンド・ポイント・ウエイＮＥ、シアトル、ＷＡ 98105、206−526−2521）から容易に入手可能なＥＨＥＣ 86−24株（血清型Ｏ157：Ｈ7）からクローン化する。そのＤＮＡを標準染色体プレップ技術(Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F．M.ら（編）第１:2.4.1巻におけるWilson，K．“Preparation of Genomic ＤＮＡ from Bacteria”)に従って抽出する。

この遺伝子を、2つの既知のＥＨＥＣ eae配列の複合体から設計されたプライマーを用いる、当該技術分野における標準技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてクローン化する。2種類のプライマーを構築する：Beebakhee，G.らＦＥＭＳ Microbiology．91:63(1992)によって配列決定されたＣＬ8株に由来する配列の塩基20−41にわたる、Ｓｎ20−ＣＧＴＴＧＴＴＡＡＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＡＣ(配列番号１)、5’プライマー(図3)；およびＹｕ，Ｊ．およびKaper，J．B．Mol．Microbiol．6:411(1992)によって配列決定された933株に由来する配列の塩基3061−3082にわたる、ＭＭ2−ＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴ(配列番号２)、3’プライマー(図4)。ＭＭ2は、さらに、3’末端にＸｂａＩ部位を含むように設計した。

ＰＣＲ反応を、AmpliTaq Kitを用いて、製造者であるパーキン・エルマー（Perkin Elmer）の指示に従って行う。このＰＣＲ増幅はeaeのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体をコードする3144bp断片（図5、eaeと示された領域）を生成し、かつ186bp上流を含む。このＰＣＲ産物を平滑末端が生じるように処理し、ベクターｐＢＲＫＳ（Schmittら，J．Bacteriol．176:368-377(1994)）のＥｃｏＲＶ部位に連結する。

この遺伝子を、適切な条件下において、Ｐ_lacｐＥＢ311（図6）およびＰ_T7ｐＥＢ310（図7）のいずれかからの転写が可能になるように両方向にクローン化する。このプラスミドで宿主株ＸＬ1BlueＦ'Ｔｎ5lacI_Q（ＱＩＡＧＥＮ社、9600デソト・アベニュー(DeSoto Ave.)、チャッツワース、ＣＡ．9131、1−800−362−7737から入手可能）を形質転換する。この組換え体をlacリプレッサーの構造的制御の下に維持する。これは、従来のeaeをクローン化しようとする試みの失敗がeaeの過剰発現が宿主大腸菌株にとって致命的であり得ることを示唆していたためである。lacリプレッサーによってもたらされる制御と共に、低コピー数のｐＢＲＫＳベクターによりこれらの問題が排除される。

ｐＥＢ310をEcoRIで消化し、クレノウ断片で充填(fill in)し、HindIIIで消化し、かつ生じる2895bpの断片を単離することによりhis−タグ付きインチミンプラスミドを構築する。このＤＮＡ断片はジーンクリーン・キット（Geneclean kit）Bio101（1070ジョシュア・ウエイ(Joshua Way)、ビスタ、ＣＡ．92083、1−800−424−61010）を用いて単離する。his−タグ発現プラスミドｐＱＥ32（図8）(ＱＩＡＧＥＮ社から入手可能)をSmaIおよびHindIIIで消化する。その後、2895bp断片をｐＱＥ32に連結してｐＥＢ313（図1）を作製する。

このプラスミドｐＥＢ313はＲＩＨｉｓＥａｅと呼ばれる101ｋＤａのhis−タグ付きＥａｅ断片をコードし、これは935個の推定アミノ酸のうちの900個をコードする。このhis−インチミン融合体は、潜在的なシグナル配列を除去するために、Ｎ末端の35個のアミノ酸が欠失するように構築される。シグナル配列は膜を標的としてこの融合タンパク質を移動させ、またはコードされたインチミンからのＨｉｓタグの開裂を導く可能性がある。

ｐＥＢ313を構築した後、これを用いて、lacリプレッサー(lacI_Q)、例えばＭ15 ｐＲＥＰ4（ＱＩＡＧＥＮ社によって供給される、多コピープラスミドｐＲＥＰ4に含まれるリプレッサー）(図9)またはＸＬ1BlueF'Tn5lacI_Q（同様にＱＬＡＧＥＮ社から入手可能な、単一コピーF’プラスミドに含まれるリプレッサー）を含む大腸菌のlab株を形質転換する。形質転換された大腸菌は、ｐＥＢ313によってコードされるhis−インチミン融合タンパク質を発現する。このタンパク質の精製は実施例IIIに説明される通りに行う。

Ｂ．Ｈｉｓ−タグ付き偽結核菌インベージン（invasin）をコードするプラスミド、ｐＨｉｓ−Inv１の構築、およびＮ末端の40個のアミノ酸が欠失しているＨｉｓ−タグ付き偽結核菌インベージンをコードするプラスミド、ｐＨｉｓ−Inv２の構築
プラスミドｐＲＩ203は、inv遺伝子およびそれを取り巻くヌクレオチド配列を含む、偽結核菌染色体ＤＮＡの4.6kb断片を含み、Ralph Isberg博士（分子生物学および微生物学部(Dept．Of Molecular Biology and Microbiology)、タフツ大学医学校（Tufts University School of Medicine)、ボストン、マース．02111；参考文献 R．R．Is berg，D．L．Voorhis，およびS．Falkow．Cell．50:769(1987)）から容易に入手することができる。ｐＲＩ203 ＤＮＡを、供給された細菌株からＱＩＡＧＥＮ ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、チャッツワース、ＣＡ）を用いて製造者に指示に従って抽出する。

ｐＨｉｓ−Inv1を構築するため、2種類のプライマー、Inv1（＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧ 3’(配列番号３))およびInv3（＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＧ 3'(配列番号４)）を（上記パートＡに説明される）ＰＣＲ反応において用いて所望のinv配列をｐＲＩ203から増幅する。生じた2960bpのinv断片をＢａｍＨＩおよびKpnIで消化し、アガロースゲルに流し、カミソリで切り出し、かつジーンクリーン（バイオ101、LaJolla、ＣＡ）を用いて精製する。精製したinv断片を、ＢａｍＨＩおよびKpnlで消化した、増幅したinv配列に対応する適切なリーディングフレームを含むＨｉｓ−タグ付きＱＩＡＧＥＮベクター（ｐＱＥ30、31または32、ＱＩＡＧＥＮ、チャッツワース、ＣＡ）に連結する。その後、連結したプラスミドでＤＨ5αＦ'Ｔｎ5lacI_Qを形質転換し、形質転換体を適切なサイズの挿入物の存在についてチェックする。

ｐＨｉｓ−Inv1より発現したタンパク質からシグナル配列（したがって、それに隣接するＨｉｓタグ）を開裂させる場合には、プラスミドｐＨｉｓ−Inv2を構築する。ｐＨｉｓ−Inv2を構築するため、2種類のプライマー、Inv2（＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧ 3'(配列番号５)）およびInv3（＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＡＴＴＧＡＣＡＧＣＧＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＧ 3'(配列番号４)）を（上記パートＡに説明される）ＰＣＲ反応において用いてｐＲＩ203から所望のinv配列を増幅させる。生じた2840bpのinv断片を上述の通りに精製し、Ｈｉｓ−タグＱＩＡＧＥＮベクターに上述の通りに連結して、同様の細菌宿主株を形質転換する。

あるいは、ｐＲＩ203を制限酵素消化し、次いでインベージン断片の5’末端に対する適切なリーディングフレームを含むＱＩＡＧＥＮＨｉｓ−タグベクター（ｐＱＥ30、31または32）に連結することにより同様のプラスミドを構築する。前述の例は、偽結核菌からのヒスチジン−タグ付きインベージンをコードするプラスミドの構築を説明しようとするものである。当業者は、代替ベクターおよび／または他のインチミン様タンパク質を用いて設計された類似構築体を当該技術分野における標準法に従って構築することができることを理解する。また、当業者は、上記his−タグ付きインベージンおよび他のhis−タグ付きインチミン様タンパク質が本明細書の他の箇所に開示される方法に適用可能であることも理解する。

Ｃ．935個の推定アミノ酸のうちの604個を含むＨｉｓ−タグ付きインチミンをコードするプラスミド（ｐＥＢ312）(図10)の構築
（パートＡに説明される通りにして得た）プラスミドｐＥＢ310をEcoRVおよびHindIIIで消化し、1971bp断片を単離して、その断片をＳｍａＩおよびHindIIIで消化したｐＱＥ32に連結する。プロトコルで用いられる制限酵素、リガーゼ、クレノウ断片は、New England BioLabs(32トザー・ロード(Tozer Rd.)、ベヴォリー、ＭＡ．01915−55991、1−800−ＮＥＢ−ＬＡＢＳ)またはGibco ＢＲＬ（P．O．Box681グランド・アイランド、Ｎ．Ｙ．14072−0068、1−800−828−8686）からのものである。得られるプラスミドをｐＥＢ312と呼ぶ。

このプラスミドｐＥＢ312はＲＶＨｉｎｄＨｉｓと呼ばれるhis−タグ付きeae断片をコードし、これは約65ｋＤａであって935個の推定アミノ酸のうちの604個をコードする。この構築体は野生型インチミンタンパク質のＣ末端の2／3を含む。

ｐＥＢ310が発現するインチミンと同様に、この融合タンパク質は、宿主大腸菌の超音波破壊の後に主として不溶性ペレット中に留まる。したがって、このタンパク質の不溶性ペレットからの抽出を可能にする尿素およびグアニジンＨＣｌを精製プロトコルに含める。

Ｄ．eaeの異なる断片を発現する追加プラスミドの構築
これらのプラスミドの各々を接着アッセイを用いて試験し、タンパク質断片が培養された細胞系に接着する能力を有することを確実なものとする。(下記実施例IVを参照)。加えて、インチミンのサイズの選択は、そのタンパク質が単独で発現するのかどうか、および既知のアミノ酸配列を有するインチミン様タンパク質との交差免疫性を所望するかどうかに応じて変化する。ＥＨＥＣおよびＦＰＥＣから発現するインチミンに加えて、インチミン様タンパク質の例にはシトロバクター・ロデンチウム(Citrobacter rodentium)、ハフィナ・アルベイイ（Hafina alveii）のインチミン様タンパク質並びにエンテロコリチカ菌および偽結核菌のインベージンが含まれるが、これらに限定されるものではない。

例えば、偽結核菌との交差免疫性に対する要望が高まった場合には、ＥＨＥＣインチミンがインベージンとして知られる偽結核菌タンパク質と31％の同一アミノ酸および51％の類似アミノ酸を共有する（Yu，J．およびKaper，J．B．Mol．Microbiol．6:411(1992)）ため、より大きな900aaインチミンが選択される。より大きな程度の相同性がそれぞれのタンパク質のアミノ末端の2／3に存在する。

インベージンは、培養上皮細胞への細菌の侵入（Isberg，R．R.らCell．60:769(1987)）およびin vivoでの腸管上皮への効率的な侵入（Pepe．J．C.およびV．L．Miller．Proc．Natl Acad．Sci．ＵＳＡ．90:6473(1993)）を可能にする、103ｋＤａの外膜タンパク質である。インテグリンとして同定されている腸管上皮上の細胞接着受容体は、細菌の内部移行に先立ってインベージンを結合する(Isberg，R．R.およびJ．M．Leong．Cell．50:861(1990))。インベージンの中心部分は外膜へのタンパク質の局在化に寄与し、これに対してＣ末端は受容体結合に必要である(Isberg，R．R．Mol．Microbiol．3:1449(1989))。

同様に、腸管病原性大腸菌(ＥＰＥＣ)、シトロバクター・ロデンチウム、またはハフニア・アルベイ(Hafniia alvei)との交差免疫性に対する要望が高まった場合にはより大きな900aaインチミンが選択される。ＥＰＥＣインチミンはタンパク質の全長にわたって83％の同一性をＥＨＥＣと共有する；これらのタンパク質のN末端側の75％が94％の同一性を共有し、これに対してタンパク質のＣ末端側の25％が49％の同一性を共有する(Yu，J.およびKaper，J．B．Mol．Microbiol．6:411(1992))。シトロバクター・ロデンチウム(Citrobacter rodentium)のインチミンは、ＥＨＥＣ eaeに対して、最初の2106bpに関しては84％のヌクレオチド同一性を、3’の702bpに対しては57％の同一性を共有する(Schauer，D．B.およびFalkow，S．Infect．Immun．61:2486(1993))。

eaeの異なる断片を発現するプラスミドは、以下の技術のうちの１つを用いて構築することができる：(1)eae内の都合のよい制限部位、例えば、ＳａｌＩおよびHindIIIで消化したｐＥＢ313の使用、1298bp断片の単離、およびＳｍａＩおよびHindIIIで消化したｐＱＥ30（ＱＩＡＧＥＮ社）への連結。得られるプラスミドはeaeのＣ末端の最後の432アミノ酸を発現する；(2)ヌクレアーゼＢＡＬ−31、エクソヌクレアーゼIII、またはリョクトウ(Mung bean)ヌクレアーゼ（全て、ニュー・イングランド・バイオラブス、32トザー・ロード、ベヴァリー、ＭＡ 01915から入手可能）を用いる所望の断片の5’または3’領域の欠失;(3)同様に上記技術を用いた、非隣接eae断片を用いたプラスミドの構築;および（4）以下により詳細に説明されるような、所望の特定の配列をコードするプラスミドの、それらの配列の5’および3’末端に特異的なＰＣＲプライマーを用いた構築。

第3の技術に関しては、Ｈｉｓ−タグ付き中間部1／3インチミン欠失変異体プラスミドを構築する(ｐＭＷ114)。プラスミドｐＭＷ106（以下に説明される）でdam ＤＭ1Ｆ'Ｔｎ5lacI_Q株を形質転換する。ＱＩＡＧＥＮキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡを作製し、ＢｃｌＩで消化する。このＤＮＡをアガロースゲルに流す。5178bpのバンドを切り出し、ジーンクリーン（バイオ101）を用いて精製し、連結した後、それでＤＨ5αＦ'Ｔｎ5lacI_Q（または、ＸＬ1BlueもしくはＭ15pＲＥＰ4のような他の適切な株）を形質転換する。形質転換体を、ＤＮＡの制限消化によりチェックする。この説明は、非隣接eae配列をコードする他のプラスミドの構築を排除するものではない。

第4の技術に関しては、eaeの特定の断片の増幅にＰＣＲを用いることができる；これらの断片を制限酵素消化により単離し、アガロースゲル電気泳動を行い、適切なＨｉｓ−タグ発現ベクター（すなわち、ｐＱＥ30、31または32；ＱＩＡＧＥＮ社）に連結する。

例えば、eaeの様々な領域をコードするクローンを構築する(図11および12を参照)。これらのクローンの接着機能を保持する能力を、(1)eae変異体を形質転換、次いでＨＥｐ−2細胞を用いて接着アッセイ（実施例III、第Ｃ節を参照）するか、または（2）細菌への外来性タンパク質の添加（実施例III、第Ｄ節を参照）のいずれかによりアッセイを行なう。選択された断片が完全な、または完全に近い野生型の結合活性を保持することが重要である。また、可能性としては分子のあらゆる部分からの許容可能なクローンは、野生型インチミンの結合活性を遮断する抗体を誘導し得るポリペプチドをコードするクローンである。

最も高い結合活性を有するクローンはこのタンパク質のＣ末端側1／3(第3の1／3)、おそらくは多くとも150個のＣ末端アミノ酸を含むという仮説を立てる。この仮説は、例えば、Frankelら，Infection & Immunity，62:1835(1994)、Frankelら，Infection & Immunity，63:4323(1995)、およびFrankelら，J．Biol．Chem.，271:20359(1996)によって支持される。タンパク質はアミノ酸の直線的な整列と考えることはできず、これらは、むしろ、三次元構造で存在する。タンパク質のl個のアミノ酸の変化またはその一部の欠失がこの構造を混乱させる可能性があることを心に留めることが重要である。したがって、十分な細胞の結合活性は、追加の非隣接配列の存在を、この第3の1／3推定結合ドメインと共に必要とする可能性がある。

さらに、高い結合活性を有するクローンは、仮定のジスルフィド結合の形成およびその結果生じるループの形成のための2つのＣ末端Ｃｙｓ（bp2780およびbp3002でコードされるもの、Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Brunton，ＦＥＭＳ Microbiology Letters 91:63(1992)を参照した番号付け）を含むという仮説を立てる。加えて、高い結合活性を有するクローンは１つまたは両者のアスパラギン酸（bp2819および2828でコードされるもの、Beebakheeを参照した番号付け）を必要とする可能性があるという仮説を立てる。この仮説は、例えば、Leong，J．M.，Embo．J．14:422(1995)に記述されるようなインベージンに対する類似性によって支持される。

全てのクローンは同様の方法で構築する。所望のeae断片の5’および3’領域を特定するＰＣＲプライマーを設計する。ｐＱＥ31へのクローン化を容易にするため、5’プライマー（ＭＷ1、ＭＷ3、ＭＷ5、ＭＷ7、ＭＷ8、ＭＷ9、ＭＷ10）の各々は5’ＢａｍＨＩ部位を含み、3’プライマー（ＭＷ2、ＭＷ4、ＭＷ6、ＭＷ11、ＭＷ12）の各々は5’ＫｐｎＩ部位を含む。各々のＰＣＲプライマーは、指定されたeae配列のリーディングフレームがｐＱＥ31への挿入に適するように設計する。以下のＨｉｓ−タグ付き構築物を示されるＰＣＲプライマーを用いてクローン化する。

（1）ｐＭＷ101 − eaeのＮ末端側1／3をコードする；27ｋＤａタンパク質(ＰＣＲプライマー：ＭＷ1（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧ 3’(配列番号６)；ＭＷ2（3’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＡＧ 3'(配列番号７))；
（2）ｐＭＷ102 − eaeの中間部1／3をコードする；42ｋＤａタンパク質(ＰＣＲプライマーＭＷ3（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＴＴＴＴＣＴＧＧＴＧ3'(配列番号８)；ＭＷ4（3’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＣＣＧＣ3'(配列番号９))；
（3）ｐＭＷ103 − eaeのＣ末端側1／3（282個のアミノ酸）をコードする；32ｋＤａタンパク質(ＰＣＲプライマー：ＭＷ5（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣ 3'(配列番号１０)；ＭＷ6（3’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＡＣＣＧＣＡＴＡＧ 3'(配列番号１１))；
（4）ｐＭＷ104 − eaeのＮ末端側の2／3をコードする；69ｋＤａタンパク質(ＰＣＲプライマー：ＭＷ1およびＭＷ4)；
（5）ｐＭＷ105 − eaeのＣ末端側の２／３をコードする；73ｋＤａタンパク質（ＰＣＲプライマー：ＭＷ3およびＭＷ6)；
（6）ｐＭＷ106 − Ｎ末端側に35個のアミノ酸の小さな欠失を有するeaeをコードする；100ｋＤａタンパク質(ＰＣＲプライマー;ＭＷ1およびＭＷ6)；
（7）ｐＭＷ108 − eaeのＣ末端側の150個のアミノ酸をコードする(ＰＣＲプライマー：ＭＷ7（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＴｇ3'(配列番号１２)；ＭＷ6)；
（8）ｐＭＷ109 − eaeのＣ末端側の140個のアミノ酸をコードする(ＰＣＲプライマー：ＭＷ8（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣ3’(配列番号１３)；ＭＷ６)；
（9）ｐＭＷ110 − eaeのＣ末端側の130個のアミノ酸をコードする(ＰＣＲプライマー：ＭＷ9（5’ＰＣＲプライマー）＝5’ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧ3’(配列番号１４)；ＭＷ6)；
(10)ｐＭＷ111 − eaeのＣ末端側の120個のアミノ酸をコードする（ＰＣＲプライマー：ＭＷ10（5’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧＣＡＧＴＧＴＣＧ3'(配列番号１５)；ＭＷ6)；
（11）ｐＭＷ112 − bp＃2560-2923（番号付けはＣＬ8株のeae配列を参照する、参考文献Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Brunton，ＦＥＭＳ Microbiology Letters 91:63）にわたるＣ末端を有する、eaeの120個のアミノ酸をコードする。（ＰＣＲプライマー：ＭＷ7；ＭＷ11（3’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＡＧ 3'(配列番号１６))；
（12）ｐＭＷ113 − ＰＣＲプライマーＭＷ12を用いてbp3002のＣｙｓがＳｅｒに変更されている、eaeのＣ末端側の282個のアミノ酸をコードする（番号付けはＣＬ8株のeae配列を参照する、参考文献Beebakhee G.，J．DeAzavedo，およびJ．Brunton,ＦＥＭＳ Microbiology Letters 91:63(1992)）(ＰＣＲプライマー：ＭＷ5；ＭＷ12（3’ＰＣＲプライマー）＝5' ＧＴＡＣＧＧＴＡＣＣＴＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＡＡＣＣＧＣＡＴＡＧ3'(配列番号１７))。

全てのクローンは、まず凍結乾燥したプライマーをｄＨ₂Ｏで10μＭに希釈することにより構築する。(全eae遺伝子をコードする)ＸＬ1blue ｐＥＢ310株からＱＩＡＧＥＮ prep（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて鋳型ＤＮＡを作製し、これをコーディング領域内またはその近傍を切断しない制限酵素、例えばHindIII、で消化することにより直線化し、分光光度計を用いて定量する。10μｌの10×Taqバッファー(パーキン・エルマー／ロッシュ(Perkin Elmer/Roche)、ブランチブルク、N.J.)、10μｌの2ｍＭ ｄＮＴＰミックス(ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)、インディアナポリス、ＩＮ)、10μｌの10μＭ 5’ＰＣＲプライマー、10μｌの10μＭ 3’ＰＣＲプライマー、６μｌの25ｍＭ ＭｇＣｌ₂(パーキン・エルマー／ロッシュ)、52μｌのｄＨ₂Ｏ、および1μｌ（1−10ng）の直線状鋳型ＤＮＡを合わせることによりＰＣＲ反応を行う。この混合物に鉱物油2滴を適用し、100℃で5分間加熱して鋳型を変性させる。1μｌ(5Ｕ）のAmphTaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー／ロッシュ）を添加し、ＰＣＲ反応を開始させる：95℃／1分、50℃／1分、72℃／3分を30サイクル、次いで72℃／10分、および4℃で保持。ＰＣＲ反応が完了した後、ＤＮＡをウィザードＰＣＲクリーンアップ・キット（Wizard ＰＣＲ clean-up kit）(プロメガ(Promega)、マジソン、Wis)に適用し、50μｌのＴＥバッファーに再懸濁する。ＰＣＲ増幅したＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、アガロースゲルで電気泳動して適切なサイズのバンドを切り出し、ジーンクリーン（バイオ101、LaJolla、ＣＡ）で精製する。次に、消化したＰＣＲ断片をＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＱＥ31に連結し、それでＤＨ5αＦ'Ｔｎ5lacI_Q（または他の適切な株、例えば、Ｍ15ｐＲＥＰ4もしくはＸＬ1Blue）を形質転換し、形質転換体を適切なサイズの挿入物の存在についてチェックする。

タンパク質の抽出、富化、および精製の開示されている技術のいずれに関しても、精製したタンパク質から後でヒスチジンタグを除去する必要がある場合には、6ＸＨｉｓ配列とそのタンパク質のＮ末端（Ｎ末端タグ）またはＣ末端（Ｃ末端タグ）との間にプロテアーゼ開裂部位を挿入することができる。例えば、エンテロキナーゼは配列“ＤＤＤＫ”（Ａｓｐ₄−Ｌｙｓ）(配列番号２６)を認識し、リジンの後ろで開裂する。この配列をコードするＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて所望の遺伝子断片の部位特異的突然変異誘発を行う。あるいは、カルボキシペプチダーゼＡをＣ末端Ｈｉｓタグの除去に用いることができる。この酵素は塩基性残基に出会うまで効率的に芳香族Ｃ末端残基を除去し(Hoculi，E．Chemische Industrie．12:69(1989))、その位置で除去が停止する。加えて、ＰＣＲを用いて、コードされるタンパク質のＮ−もしくはＣ末端にプロテアーゼ部位がコードされるようにプライマーを設計することが可能であり；またはＰＣＲを用いてこれらの部位を含むベクターを設計することができ、かつ上述の技術を用いて前述のベクターにクローン化することができる。

インチミンの大規模な精製のため、ｐＥＢ312または他の構築物から発現されるインチミンの全ての断片を実施例IIに詳述されるプロトコルに類似するプロトコルを用いて精製する。当業者が、本発明の範囲および精神に留まりながら、さらなる制限部位を選択し、またはプロトコルを変更することができることは明らかである。

実施例II
ヒスチジンタグ付きインチミンの大規模な富化
大規模な発現培養物の増殖
100μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび40μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ（ルリア−バータイニ(Luria-Bertaini)）ブロス20ｍｌに白金耳一杯の（上記実施例Iに説明されるように調製した）Ｍ15 ｐＲＥＰ4 ｐＥＢ313を接種する。激しく振盪しながら、37℃で一晩（15−18時間）増殖させる。この一晩培養物20ｍｌを、100μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび40μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢブロス11に接種する。激しく振盪しながら、ＯＤ₆₀₀＝0.7−0.9になるまで（約3時間）37℃で増殖させる。ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)、P．O.Box 14508、セントルイス、ＭＯ.63178、1−800−325−3010）を最終濃度1ｍＭ（.476g）まで添加し、さらに3時間培養物の増殖を継続する。上清を500ｍｌ瓶（予め秤量）に分け、4000×gで10分間遠心分離にかける。上清を廃棄して細胞ペレットを秤量し、−７０℃で保存するか、または直ちに処理する。

細胞を15分間解凍し、渦撹拌(vortex)して5ｍｌ／湿重量gでバッファーＡ［6Ｍ ＧｕＨＣｌ、0.1Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、0.01Ｍトリス−ＨＣｌ．ｐＨ8.0］に再懸濁する。細胞を室温で1時間撹拌する。溶解物を10,000×gで15分間遠心分離し、上清を集める。予めバッファーＡで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社からのＮｉ−ＮＴＡスラリー）の50％スラリー5ｍｌを添加する。室温で45分間撹拌し、スラリーを沈殿させ、上清を除去し、5ｍｌのバッファーＡを添加し、スラリーを沈殿させ、上清を除去し、5ｍｌのバッファーＡを添加し、この樹脂をカラムに充填する。このカラムを10カラム容量のバッファーＡ、次いでＯＤ₂₈₀≦0.01（少なくとも5カラム容量）までバッファーＢ［8Ｍ尿素、0.1Ｍ ＮａＨ₂PＯ₄、0.01Ｍトリス−ＨＣｌ、ＰＨ8.0］で洗浄する。カラムを、ＯＤ₂₈₀≦0.01まで、バッファーＣ［6Ｍ尿素、0.1Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄、0.01Ｍトリス−ＨＣｌ、ＰＨ6.3］で洗浄する。バッファーＣに加えて250ｍＭのイミダゾールでタンパク質を溶離し、30の１ｍｌ画分を集める。

各々の画分のＯＤ₂₈₀を記録する。精製したタンパク質の内同様に高いＯＤ₂₈₀が読み取られたもののアリコートを、透析管（例えば、Spectra/Por Cellulose Ester Membrane）ＭＷカットオフ＝8000；スペクトラム・メディカル・インダストリーズ(Spectrum Medical Industries)、1100ランキン・ロード、ヒューストン、ＴＸ.77073−4716）にプールし、(8Ｍ尿素ではなく)6Ｍ尿素を含有する冷（4℃）バッファーＣで平衡化する。これらのアリコートの濃度を、標準市販タンパク質定量キット（バイオーラッド・マイクロアッセイ(Bio-Rad Microassay)、バイオーラッド・ラブス(Bio-Rad Labs)、2000アルフレッド・ノーベル・ドライブ、ハーキュルス、ＣＡ.94547、1-800−4ＢＩＯＲＡＤ）を用い、(6Ｍ尿素を含有する)バッファーＣで希釈したＢＳＡを標準として用いて≦1ｍｇ／ｍｌに調整する。冷却下（4℃）において、(6Ｍ尿素を含有する)バッファーＣで開始して尿素のモル濃度の減少が整数値で増加するタンパク質の段階透析を行う。各溶液中で１時間透析し、1×ＰＢＳで終了させる。ウェル当たり約2μｌのタンパク質を流す（10％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分析してタンパク質のサイズおよび品質を確認する。ＲＩＨｉｓＥａｅの分子量は101ｋＤａである。

あるいは、タンパク質を透析管に添加し、直に1×ＰＢＳで透析する。タンパク質を標準市販タンパク質定量キット（ピアスＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット(Pierce ＢＣＡ Protein Assay Kit)、ピアス(Pierce)、R.O.Box 117、ロックフォード、III．61105）を用いて定量し、等分して−20℃で保存する。第１の代替法と同様に、ウェル当たり約2μｌのタンパク質を流す（10％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分析してタンパク質のサイズおよび品質を確認する。

his−タグ付きインチミンの富化に際して、誘導された物質を純度の水準についてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに富化したhis−タグ付きインチミンのサンプル2μｌを流し、200Ｖで１時間電気泳動する。サイズの比較のため、分子量マーカーをゲル上に含める。このゲルをコロイド状クーマシー染色（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色すると、最も目立つバンドが約101ｋＤａ位に現れる。幾つかの他の顕著性に劣る高分子量バンドも現れる。このゲルを銀染色（バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）で製造者の指示に従って染色すると、非常にかすかな高分子量バンドが幾つかのより目立つ低分子量バンドに加えて出現し、最も目立つバンドは29ｋＤａ周辺に現れる。この富化生成物は、好ましくは、約70−80％の完全長（すなわち、935個の推定アミノ酸のうちの900個）のインチミンを含む。好ましくは、この富化生成物は25％を超える汚染物質（すなわち、非インチミン関連分子）を含まず、より好ましくは20％を超える汚染物質を含まず、さらにより好ましくは10％を超える汚染物質を含まない。

実施例III
富化したヒスチジン−タグ付きインチミンの精製
上記実施例IIにおいて説明される通りに作製したhis−タグ付きインチミンの富化調製品を当業者に公知の技術により精製する。これらの技術には高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、ゲルカラムクロマトグラフィー、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれるが、これらに限定されるものではない。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて、his−タグ付きインチミンの富化調製品を10％ポリアクリルアミドゲルで分離し、例えば分析レーンをコロイド状クーマシー染色（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色することにより、可視化する。高分子量完全長インチミンバンドをこの分離用ゲルからカミソリで切り出し、免疫感作に先立って4℃で保存することができる。インチミンの完全長より短い断片、すなわちインチミンの一部、および／または１以上の抗原に結合するインチミンを同様にゲルから切り出すことができる。

インチミンまたはその一部の精製に用いられる方法に関わりなく、本明細書中で用いられる精製タンパク質は、任意にヒスチジンがタグ付けされている、インチミンまたはその一部だけからなるポリペプチドの集団を指す。インチミン（およびインチミン様タンパク質）をコードする１つのオープンリーディングフレームのみを含むＤＮＡの断片から発現されたポリペプチドの集団が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で複数のバンドに分離し得ることは当該技術分野において認識されている。McKeeら，Infection & Ｉmmunity，64(6):2225-2233(1996)、Jerseら，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ 87:7839-7843(1990)およびIsberg，Cell 50:769-778(1987)。したがって、精製したインチミン、インチミンの一部、またはインチミン様タンパク質、およびインチミン、またはインチミン様タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で複数のバンドとして可視化することができる。

実施例IV
Ａ．接着アッセイ
ＨＥｐ−２またはＨＣＴ−８細胞のいずれかに対する大腸菌の接着を、Carviotoら，Curr．Microbiol．3:95-99(1979)の方法の改変法により評価した。具体的には、ＬＢブロス中の試験しようとする細菌の一晩培養物20μｌ／ｍｌ（ｖ／ｖ）を含む接着アッセイ培地（0.4％重炭酸ナトリウムおよび1％マンノースを補足したＥＭＥＭ、すなわちイーグル最少必須培地）と共に、ＨＥｐ−2細胞の半集密(semiconfluent)単層を24ウェル組織培養皿または8ウェルのパーマノックス・チャンバー・スライド（Permanox Chamber Slides）(ヌンク(Nunc)、ネイパービル、III)内のカバーガラス上にのせる。

接種物の各々は≧10⁷個の（以下に説明される）細菌を含み、これはおおよそ100：1の感染多重度を生じる。感染した単層を5％ＣＯ₂雰囲気内において37℃でインキュベートする。3時間後、非接着細胞を含む培地を吸引し、単層を無菌の10ｍＭリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ7.4（ＰＢＳ：塩化ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、および一塩基性リン酸カリウム）で１回洗浄する。

これらの細菌が接着した細胞に新鮮な接着アッセイ培地を添加した後、感染細胞をさらに3時間インキュベートする。次いで、単層をＰＢＳで6回洗浄して非接着細菌を除去する。各々の洗浄液は単層の攪乱の回避を試みながら吸引により穏やかに除去する。各々のアッセイを2回以上行い、結合および関連後遺症(associated sequelae)を可視化するためのギムザおよびＦＩＴＣ−ファロイジン（ＦＡＳ）染色が可能となるように２つのスライドを調製する。

ギムザ染色については、ＨＥｐ−2細胞および接着細菌を70％（v／v）メタノール（カバーガラス）または段階的なアセトン洗浄（チャンバースライド）で固定し、１：10ギムザ（シグマ）で20分間染色する。ＦＡＳ表現型を評価するには、Knuttonら，Infect．Immun．57:1290-1298(1989)のＦＩＴＣ-ファロイジン（シグマ）染色法を用いる。ファロイジンは、球状ではなく繊維状のアクチンに特異的に結合するキノコ・ファロトキシンである。ＦＩＴＣ−ファロイジン染色標品を、位相差顕微鏡検査およびモデルＢＨ2−ＲＦＬ反射型蛍光アタッチメント（オリンパス光学株式会社(Olympus Optical Co.，Ltd.)、東京、日本）を備えたオリンパス・モデルＧＨＳ顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡検査により検査する。

ＨＣＴ−8細胞を用いる接着アッセイをＨＥｐ−2細胞について上述される手順により行うが、最初の洗浄の前に2.5時間、アッセイを終了する前にさらに2.5時間細菌をＨＣＴ−8細胞と相互作用させる。ＨＣＴ−8細胞を用いるアッセイは、全て、8ウェル・パーマノックス・チャンバー・スライドにおいて行う。

Ｂ．アッセイで用いる細菌の構築：ＥＨＥＣ eae変異体
ＥＨＥＣの特定の株、86−24株においてeae遺伝子の染色体コピーにインフレーム(in-frame)欠失を作製するため、この遺伝子の野生型コピーをeaeの内部欠失コピーを用いる二重相同的組換えにより置換する(図13)。プラスミドｐＥＢ290（図14）はeae構造遺伝子の大部分を封入するもので、86−24染色体からプライマーＭＭ1（ＭＭ1＝ＡＴＡＡＣＡＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＧ(配列番号１８)；eae構造遺伝子の第2コドンから出発し、ScaＩ制限部位を含む）をプライマーＭＭ2（ＭＭ2＝ＴＣＴＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＣＧＴＧＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴＣＴ(配列番号２)）との組み合わせで用いて増幅されたＰＣＲ産物から構築される。ＰＣＲによって誘導される生じた2,953塩基対の断片をＳｃａＩおよびＸｂａＩで消化し、ＳｍａＩおよびＸｂａＩで制限消化したpBluescript ＳＫ⁺（ストラタジーン(Stratagene)）に連結する。このｐＥＢ290挿入物の末端のＤＮＡ配列決定により、3’の250塩基対が失われていることが明らかになる。

プラスミドｐＥＢ290で大腸菌ＧＭ119株［ｄａｍ−6、ｄｃｍ−3、[Arraj，J．A.およびMarinus，M.G.J.Bacteriol.153:562-565(1983)］を形質転換し、制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩに感受性である非メチル化ＤＮＡを得る。プラスミドＤＮＡを単離し（Maniatisら，分子クローニング:実験マニュアル（Molecular cloning:a laboratory manual）Cold Spring Harbor(1982))、ＢｃｌＩで制限消化して内部1125bp断片をこの遺伝子から除去する。生じた粘着末端を互いに連結してｐＥＢ300を作製する(図15)。

ｐＥＢ300をＸｂａＩおよびHindIIIで消化することにより欠失eae遺伝子を切り出し、eae配列を含む断片を自殺ベクターｐＡＭ450（図16）のＢａｍＨＩ部位に連結してｐＥＢ305を形成する。プラスミドｐＡＭ450はｐＭＡＫ705（Hamiltonら,J．Bacteriol.，171:4617-4622(1989)）の3つの特徴を有する誘導体である。第1に、これは温度感受性（ts）複製起点を有する。第2に、このプラスミドは枯草菌に由来するsacＢ／Ｒ遺伝子座を担持し、これは宿主株をショ糖に対して感受性にする（Gayら,J．Bacteriol 164:918-921(1985)；Lepesantら，Marburg．Mol．Gen．Genet．118:135-160(1972))。第3に、このプラスミドはアンピシリン耐性をコードする。これらの特徴は相同的組換え、およびベクター配列の回復および喪失を生じる第2の組換えに対する陽性選択を可能にする。(ｐＥＢ300からの)欠失eae遺伝子を自殺ベクター（ｐＡＭ450）に挿入することにより、ｐＥＢ305と呼ばれるプラスミドが生じる(図17)。

この自殺eae構築物、ｐＥＢ305を用いて、電気穿孔法（Sizemoreら，Microb．Pathog．10:493-499(1991)）により野生型ＥＨＥＣ86-24株を形質転換する。ベクター配列が矯正されている二重組換え体をショ糖を含む培地での増殖により選択した後、アンピシリン感受性についてスクリーニングする（Blomfieldら，Mol．Microbiol.，5:1447-1457(1991))。自殺ベクター配列が矯正されている形質転換体はショ糖に耐性であり、アンピシリンに感受性であり、かつ30℃および42℃で等しく増殖可能である。染色体eae配列の欠失を、(i)プライマーＭＭ1およびＭＭ2を用いるＰＣＲ増幅の後のeae断片のサイズの減少；(ii)変異染色体ＤＮＡのサザンブロット分析；(iii)eae遺伝子の欠失領域内の制限部位の喪失；および（iv）内部プローブの変異染色体の認識不能により確認する。

得られたＥＨＥＣ86−24株のインフレーム欠失変異体を86−24eaeΔ10と命名する。86−24eaeΔ10からのＰＣＲ誘導産物のin vitro転写および翻訳分析により、変異がフレーム内にあることを確認する。予想されたサイズ、約68,000Ｄａの末端切断された(truncated)タンパク質産物を、翻訳産物の［³⁵Ｓ］メチオニン標識により同定する。eae変異株は全ての特徴において野生型86−24と同一であり、これらの特徴にはＬＢブロスにおける増殖、Ｏ157およびＨ7抗血清との凝集、ソルビトールを発酵させることが不可能であること、および37℃でのマッコンキー（MacConkey）寒天上での増殖が含まれる。

当業者は、eaeにおいて突然変異により生じ、かつ結合活性を保持しないＥＨＥＣの株を作製する他の方法が可能であり、代替可能であることを認めるであろう。

Ｃ．in vitroでのＥＨＥＣの接着におけるeaeの役割
同質遺伝子型(isogenic)の株、86−24、86−24eaeΔ10およびｐＥＢ310を担持する86−24eaeΔ10をＨＥｐ−2およびＨＣＴ−8細胞への接着性について試験する。野生型86−24は、それらの細菌がＨＥｐ−2またはＨＣＴ−8細胞と相互作用すると微小コロニーを形成する。M．L．McKee ＆ A．D．O'Brien，Infection ＆ immunity 63:2070(1995)。この局在化した接着はＦＡＳ（蛍光アクチン染色）陽性であり、これは細菌接着部位でのＦ−アクチンの重合（すなわち、期待される結果）を示す。変異体86−24eaeΔ10はＨＥｐ-2細胞に接着することができない。ｐＥＢ310またはｐＥＢ311のいずれかでeaeを86−24eaeΔ10に導入した場合、ＬＡ／ＦＡＳ（ＬＡ＝局在化接着、すなわち微小コロニー形成）表現型は完全に回復し、その観察はインチミンが単独でeaeの突然変異を補完することを示す。これらのクローンの両者がeae変異体を補完することから、eaeの本来のプロモーターはＰＣＲ増幅配列中に存在する。

Ｄ．外来性Ｈｉｓ−インチミン融合タンパク質の添加の効果
接着アッセイは、86−24eaeΔ10の結合能および野生型86−24株の結合能に対する外部から添加されたＨｉｓ−インチミン融合タンパク質の効果の評価にも用いることができる。この場合、各実験において示されるように、細菌を添加する前に精製Ｈｉｓ−インチミン融合タンパク質を上皮細胞単層に添加する。

86−24を単層に添加する前に、ＨＥｐ−2細胞を20ng−20μｇのＲＩＨｉｓＥａｅと共に30分間インキュベートする。その後、感染した単層を丁寧に洗浄し、ＦＩＴＣ−ファロイジンで染色して顕微鏡で観察する。これらの融合体は86−24の野生株のＨＥｐ−2細胞への結合を強化する。86−24の微小コロニーの大きさは、微小コロニーが接着したＨＥｐ−2細胞の総数と同様に、ＲＩＨｉｓＥａｅの濃度の増加に伴って増加する。高用量（20μg）では、この融合タンパク質により、ＨＥｐ−2細胞は異常な付加物および処理を示すようになる。このため、1−2μｇがさらなる研究に最も好ましい用量である。

ＨＥｐ−2細胞に外部から添加した場合、ＲＩＨｉｓＥａｅは86−24eaeΔ10のＨＥｐ−2細胞結合欠陥を補完する(すなわち、結合能を回復させる)。より短い融合タンパク質、ＲＶＨｄＨｉｓＥａｅも接着性を補完する。マウス・ジヒドロ葉酸レダクターゼへのヒスチジン残基のアミノ末端融合（Ｈｉｓ−ＤＨＦＲ）は86−24の接着性を増強することはない。さらに、インチミン融合タンパク質をコードするプラスミド、ｐＥＢ312およびｐＥＢ313は、in vitroでの接着について86−24eaeΔ10を補完することが可能である。したがって、このような研究は、ｐＥＢ312およびｐＥＢ313によってコードされるタンパク質が接着性を付与するのに十分であることを示す。

上記実施例Iにおいて述べられるように、これらの融合タンパク質は宿主株の超音波破壊の後の不溶性ペレット画分に局在し、これは、これらのタンパク質が膜に局在することを示す。Ｈｉｓ−ＤＨＦＲ融合体をコードするプラスミドｐＱＥ16は86−24eaeΔ10を補完することはない(データは示さない)。この不適切なヒスチジン残基との融合タンパク質がeae変異体にＨＥｐ−2細胞への接着性を付与しないことは、インチミンに付加されたヒスチジン残基が外部から添加されたＨｉｓ−インチミン融合体で観察される活性の原因ではないことを示す。外来性ＲＩＨｉｓＥａｅおよびＲＶＨｄＨｉｓＥａｅで観察されるＨＥｐ−2細胞へのＥＨＥＣの結合の強化または補完は、インチミンが細菌および上皮細胞の両者と相互作用することを示す。

実施例Ｖ
in vivoでのeaeの役割−ノトバイオート・子ブタ感染モデル
ノトバイオート・子ブタの腸管コロニー形成、Ａ／Ｅ病変形成、ならびにＥＨＥＣ介在大腸炎および下痢におけるインチミンの役割を、Francisらの方法（Francisら，Infect．Immun．51:953-956(1986)）により評価する。野生型親株、86−24を接種した子ブタの対の両者は下痢を発症し、剖検時にらせん状結腸の腸間膜に浮腫を有している。

組織学的には、86−24株は主として盲腸およびらせん状結腸にコロニーを形成する。組織学的に、および培養によっては、肝臓、腎臓、肺または脳への細菌の蔓延の証拠は検出されない。ＥＰＥＣについてStaley（Staleyら，Vet．Pathol．56:371-392(1969)）およびMoon（Moonら，Infect．Immun．41:1340-1351(1983)）によって記述されるような密接な細菌の接着およびＡ／Ｅ病変が、86−24に感染した子ブタの盲腸および結腸の光およびＥＭ検査の両者によって立証される。Ａ／Ｅ病変は接着部位での高電子密度の物質の集積を含む。幾つかの領域では、腸管内腔内では脱落した腸細胞断片および細菌が接着した微絨毛が認められた。86−24に感染した子ブタの盲腸およびらせん状結腸の組織切片においては、炎症性の浸潤が見られる。炎症は、固有層内に散乱した好中球、ならびに粘膜下組織における漿液および血管周囲リンパ球およびマクロファージの中程度の拡散集積を特徴とする。

変異体株、86−24eaeΔ10を接種した子ブタの両者が、剖検時に形作られた糞便を有する。組織学的に、およびＥＭ検査では、86−24eaeΔ10株が子ブタの腸管にコロニーを形成し、Ａ／Ｅ病変を引き起こすことが可能である証拠はない。光およびＥＭ検査によって盲腸およびらせん状結腸の粘膜上皮を覆う粘膜中に観察される細菌はほとんどない。86−24eaeΔ10を接種した2匹の子ブタのうちの1匹には僅かな結腸間膜の浮腫があるが、他の著しい病変または顕微鏡的な病変はいずれの子ブタにも見られない。McKeeら、Infection and Immunity63：3739以下(1995)を参照されたい(本明細書において参考として援用する)。

86−24eaeΔ10（ｐＥＢ310）を接種した子ブタは、剖検時にペースト状の糞便および結腸間膜浮腫を有する。86−24eaeΔ10（ｐＥＢ310）株は粘膜腸細胞に密接に接着し、盲腸およびらせん状結腸にＡ／Ｅ病変を引き起こす。組織学的には、野生型86−24によって引き起こされるものに類似する血管周囲リンパ組織球増多性盲腸大腸炎（typhlocolitis）も見られる。

同様の実験が初乳欠乏新生仔ウシモデルにおいて行われ、これは、インチミンが大腸菌Ｏ157：Ｈ7 86−24株介在性の下痢の他に腸内のＡ／Ｅ病変の誘発に必要であることを示す(A．D．O'Brien、M．R．Wachtel、M．L．McKee、H．W Moon、B．T．Bosworth、C．Neal Stewart，Jr.、およびE．A．Dean-Nystrom．「インチミン：大腸菌Ｏ157：Ｈ7抗伝播ワクチンの候補(Intimin:Candidate for an Escherichia coli Ｏ157：Ｈ7 Anti-Transmission Vaccine)」第32回コレラおよび関連下痢疾患に関する共同会議（the 32nd Joint Conference on Cholera and Related Diarrheal Diseases）の抄録、長崎、日本、1996年11月14−16日、この開示は本明細書に参考として援用する)。また、これらの実験は、感染後2日で、下部腸における感染性生物の数が、野生型または補完クローンを有するeae変異体を給餌された仔ウシよりもeae変異体または非病原性大腸菌株を給餌された動物において大きく低下することも示す。

実施例VI
ＨＣ患者血清によるＥＨＥＣタンパク質の認識
出血性大腸炎患者からの試験済みの回復期免疫血清（疾患管理および予防センター、アトランタ、ＧＡのT．Barrettから快く提供されたもの）をウェスタン免疫ブロットにおいてP_T7−発現インチミン標品（すなわち、ｐＥＢ310およびｐＥＢ311によって発現されるhis−インチミン）と反応させる。出血性大腸炎患者血清と発現系における大腸菌タンパク質との反応性を低下させるため、血清サンプルをｐＧＰ1−2およびｐＢＲＫＳ^-（発現ベクター）で形質転換したＤＨ５αの全細胞抽出物に吸着させる。吸着後、正常な血清対照はインチミン標品の硫酸アンモニウム濃縮画分中のタンパク質のみを認識するが、ｐＥＢ310、すなわちベクター対照から発現されるタンパク質とはそれ以上反応しない。吸着後、ＨＣ患者の血清は依然として多くの大腸菌タンパク質を認識するが、インチミンとの反応は強いままである。

実施例VII
患者へのＨｉｓ−インチミンの投与
以下の例は、防御免疫応答を刺激するための患者へのhis−インチミンの投与を提供する。防御免疫応答は、患者が感染を回避するのを可能とするに十分な抗体を誘導し、感染の重大性もしくは重篤性を減少させ、または胃腸管にコロニーを形成する細菌の能力を低下させるものである。

his−インチミンの投与方法には、his−インチミンを患者に直接注射（腹腔内、静脈内、皮下、および筋肉内を含むが、これらに限定されるものではない）して免疫応答を誘発すること、his−インチミンの単独もしくは食物との摂取または強制給餌、および上咽頭における上皮細胞の受容体へのインチミンの結合を増強する、his−インチミンを用いる鼻腔内接種が含まれるが、これらに限定されるものではない。

his−インチミンを接種する場合、このタンパク質をゲルカプセルもしくはリポソーム内に納めるか、または不活性物質に結合させて接種物が胃を通過するのを助ける。この融合タンパク質は酸安定性であるため、それ自体でも摂取され、または食物製品に混合してもよい。好ましい投与方法は、his−インチミンおよびＳＬＴ（志賀毒素様毒素）の融合タンパク質でのものである。his−インチミン−ＳＬＴ融合タンパク質は、ＳＬＴの受容体を有するＳＹＮＳＯＲＢ（シンソーブ・バイオテック社(SynSorb Biotech，Inc.)、1204ケンジントン・ロード、Ｎ．Ｗ.、カルガリー、アルバータ、カナダ、Ｔ2Ｎ3Ｐ5）にＳＬＴ−受容体相互作用により結合する。このＳＹＮＳＯＲＢ構築物をチョコレートプディングと混合し、子供に与える。

精製ＲｉＨｉｓＥａｅ（Ｈｉｓ−タグ付きＥａｅ、900／935アミノ酸）は、(ｐＭＷ103によってコードされる)インチミンの第3の1／3部分と同様に、ｐＨ2.0、37℃で24時間のインキュベーションの後でも安定である。これは、Ｈｉｓ−Ｅａｅ融合体が無傷で、または分解されることなく胃を通過することが可能であることを示す。さらに、自然状態においては、eaeは細菌の外膜上に発現し、かつ胃を通過した後であっても依然としてインチミンの接着を増強するが、これは酸性環境に対するその耐性を示す。

摂取または鼻腔内接種は局部的な免疫を刺激し、これはＥＨＥＣおよびＥＰＥＣによる将来的なコロニー形成を妨げる。相同性による交差免疫は、ハフィナ・アルベイ(Hafnia alvei)およびシトロバクター・ロデンチウム(Citrobacter rodentium)、エルシニア種(Yersinia sp.)およびインチミン様タンパク質を有する他の細菌種に対して刺激される。インチミン関連タンパク質を発現するＥＨＥＣ以外の細菌による感染に対する防御免疫応答から利益を得るためにインチミンの投与によってもたらされる交差免疫の程度を定量する必要はないが、そのような防御のアッセイは実施例IXに説明している。このアッセイは、インチミン様の結合タンパク質を有することが知られる病原体による上皮細胞との相互作用の遮断に対するインチミン抗体の効力の評価を可能にする。

別の態様においては、雌ウシの乳房へhis−インチミンを注射することにより雌ウシの免疫応答が生じる。このタンパク質に対する抗体はその雌ウシの乳中に存在する。この乳を飲む仔ウシは、それらを選り抜きの方法で能動的に免疫感作できるようになるまで受動的に免疫感作される。あるいは、his−インチミンを雌ウシに給餌、または雌ウシの餌に導入することができる。このように導入されるhis−インチミンの存在により雌ウシにおける抗体応答が刺激され、それにより抗体が産生されてその雌ウシの乳中に現れる。

別の態様は核酸ワクチンの投与を包含する。Ｈｉｓ−インチミンを裸のeae ＤＮＡとして患者に注射し、またはそのＤＮＡをレトロウイルス、アデノウイルス、もしくは当該技術分野において公知の他の担体等の担体系により身体に送達する。投与の後、患者は一時的に発現する外来抗原に対する免疫応答を高める。

現在、一般に、核酸ワクチンは臨床試験に近づいている。このワクチンへのアプローチは、所望の抗原をコードするＤＮＡを、この遺伝子を非複製プラスミドベクターに挿入することによって宿主に送達することを包含する(Marwick，C．JAMA 273:1403(1995)；Vogel，F．R．およびN．Sarver．Clin．Microbiol．Rev．8:406(1995)に略述されている)。

このようなワクチンの防御効力の最初に公開された例証は、インフルエンザＡウイルス（Ａ／ＰＲ／8／34）核タンパク質（ＮＰ）をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内注射がＢＡＬＢ／cマウスにおいてインフルエンザウイルスの異種株（Ａ／ＨＫ／６８）に対する防御免疫応答を誘発することを示している（Ulmer，J．B.ら，Science 259:1745(1993))。免疫感作された動物は、抗原投与された対照マウスと比較して、それらの肺におけるウイルスカ価が減少し、体重の喪失が低下し、かつ生存率が増加していた。NP−特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＮＰ抗体の両者が生成した。ＮＰ抗体は防御の付与では無効であったが、ＣＴＬはウイルス感染細胞および割り当てられた主要組織適合複合体クラスI制限ペプチドエピトープでパルス処理された細胞を殺した。

別の研究は、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／8／34血球凝集素をコードするプラスミドＤＮＡの筋肉内注射が、異種致死的インフルエンザウイルスの抗原投与に対してマウスを防御する中和抗体の産生を生じることを示している(Montgomery，D．L．らＤＮＡ Cell Biol．12：777(1993))。

この方法による本発明の実施は、本明細書に参考として援用する前述の文献、特にMontgomery，D．L．らＤＮＡ Cell Biol．12:777(1993)を参照することにより達成することができる。eae遺伝子座は、制限部位に基づいて、およびＣＬ8株については図3におけるその配列に基づき、かつ図4に示される933株におけるその配列に基づいて、図5に示される。

実施例VIII
Ａ．eaeおよび結合した抗原の両者に対する免疫応答を誘発するための、His−インチミンへの様々な病原体に由来する抗原の結合
様々な病原体に由来する抗原（Ａｇ）およびハプテンを、ヒスチジン−タグ付きインチミン分子に結合する。この融合タンパク質を、インチミンが腸上皮細胞への結合を標的とする担体として機能する接種物として用いる。この結合体タンパク質は以下の配置のいずれかで設計することができる：Ｎ−Ｈｉｓ−インチミン−Ａｇ−Ｃ、Ｎ−Ａｇ−インチミン−Ｈｉｓ−Ｃ、Ｎ−Ｈｉｓ−Ａｇ−インチミン−Ｃ、Ｎ−インチミン−Ａｇ−Ｈｉｓ−Ｃ、Ｎ−インチミン−Ｈｉｓ−Ａｇ−Ｃ、またはＮ−Ａｇ−Ｈｉｓ−インチミン−Ｃ。

当業者によって認識されるように、インチミンのサイズは融合させようとする抗原のサイズおよびインチミンが融合する抗原の数に応じて変化する。このような融合タンパク質の設計において考慮される可変要素は：（1）外来抗原；（2）用いられるインチミンのサイズ、これは、上述のように、結合機能を保持するいかなるサイズであってもよい；（3）融合順序Ｎ→Ｃ；および（4）結合方法、例えば、さらなる方法が当業者に容易に明らかではあるが、融合タンパク質のクローン化および発現におけるもののような遺伝的方法、および化学的方法である。(D．V．Goeddel,「異種遺伝子発現のための系(Systems for Heterologous Gene Expression)」，Meth．Enzymol.，第185巻，Academic Press，New York，1990；K．Itakura，「大腸菌におけるホルモン・ソマトスタチンの化学的に合成された遺伝子の発現(Expression in E．coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin)」，Science，198:1056-1063(1977)；およびD．V．Goeddelら，「ヒトインシュリンの化学的に合成された遺伝子の発現(Expression of chemically synthesized genes for human insulin)」，Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，281:544-548(1979))。

この結合抗原の送達は、上記実施例VIIで説明するヒスチジン−タグ付きインチミン単独でのものと同じ機構を用いてなされる。

ハプテンおよび抗原は、細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生虫、薬物、または化学物質から誘導することができるが、これらに限定されるものではない。これらには、例えば、ペプチド、オリゴ糖、および毒素のような小分子が含まれる。粘膜表面に吸収される能力を有する特定の抗菌剤、化学療法剤もインチミンに結合させることができる。インチミンに結合し、防御免疫応答を刺激するために投与することができる抗原および多糖には、下記表1に示されるものが含まれ得る。

表1に見られる抗原に結合させることができるhis−インチミンおよびインチミンの一部、ならびにインチミン様タンパク質およびその一部のサイズには、上記実施例Iに示されるように、ＲＩＨｉｓＥａｅ（900／935aa、ｐＥＢ313のEcoRI−HindIII断片)およびＲＶＨｉｎｄＨｉｓ（604／935aa、ｐＥＢ313のEcoRV-HindIII断片）が含まれる。当業者は、本発明の思想および範囲内で接着活性を有する様々な長さの断片をさらに選択することができることを認めるであろう。選択対象となる断片の効力は実施例IVに説明する手順に従って評価することができる。

Ｂ．Ｎ−Ｈｉｓ−ＩｃｓＡ−インチミン−Ｃを発現するプラスミドの構築
フレクスナー赤痢(Shigella flexneri)は、ヒトの結腸粘膜の上皮細胞に侵入することにより桿菌性赤痢を引き起こす（LabrecらJ．Becteriol．88:1503-1518，(1964))。ＩｃｓＡと呼ばれる120ｋＤａ外膜タンパク質がこの微生物の細胞内および細胞間伝播に必要である（BernardiniらProc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ．86:3867-3871(1989)；LettらJ．Bacteriol．171:353-359，(1989))。経口感染したマカクザルはｉｓｃＡ変異体（ＳＣ560）に適度に十分寛容であり、この変異体は相同抗原投与に対する防御を誘発した(SansonettiらVaccine 9:416-422,1991)。

以下のプロトコルを用いることができる(図18)：
ｐＥＢ313でｄａｍ宿主、例えばＤＭ1（Gibco ＢＲＬ、Ｐ.Ｏ．Box 68、グランドアイランド、Ｎ．Ｙ．14072、1−800−828−6686）を形質転換する。ｐＥＢ313／Clal／HindIIIを消化し、1796bpの断片を単離する(この断片はインチミンの最後の547個のアミノ酸をコードする)。pBluescriptＳＫ＋／ＣｌａＩ／HindIII（pBluescriptＳＫ＋はストラタジーン、11011Ｎトレイ・パインス・ロード、ラヨラ、ＣＡ．92037、1−800−424−5444）に連結する。これをプラスミドｐＥａｅ1と呼ぶ。ｐＨＳ3192をＡｖａＩで消化し、その末端をクレノウ断片で充填し、ＣｌａIで消化し、2490bpの断片を単離する［この断片は塩基対＃706−3629の2923bp、すなわち974aaをコードする；ｉｃｓＡのＯＲＦはbp＃574−3880にわたり、これは3306bpで1102aaをコードする；ｉｃｓＡの配列についての参考文献はLettら,J．Bacteriol．171:353(1989)である］(ｐＨＳ3192はP.Sansonetti（参考文献Bernardini，M．L.らProc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ．86:3876(1989)）から入手可能である)。2490bp断片をＣｌａＩおよびHincIIで消化したｐＥａｅ1に連結して、ｐＥａｅ2と呼ばれるプラスミドを生成する。これらの制限酵素を用いると、ｉｃｓＡのリーディングフレームおよびeaeがフレーム内に残る。ｐＥａｅ2をＸｈｏＩおよびHindIIIで消化し、4286bpの断片を単離する；ＳｍａＩおよびHindIIIで消化したｐＱＥ32（ＱＩＡＧＥＮ）に連結する。この連結は両遺伝子の適切なリーディングフレームをプロモーターと共に維持する。生じるプラスミドをｐＩｃｓＡ−Ｅａｅと呼ぶ。

あるいは、ＰＣＲを用いるクローン化により2つの遺伝子をフレーム内で融合した後、適切なｐＱＥベクターに連結することができる。この技術は当業者に公知である。

Ｃ．Ｈｉｓ−インチミンをタンパク質担体として用いる結合ワクチンの調製
いかなる多糖をも用いることができるが、このワクチンにおいてはチフス菌のカプセル状Ｖｉ多糖を用いる。Ｈｉｓ−インチミンを実施例IIと同様に精製する；これをＶｉ（確立された手順（ＳｚｕらJ．Exp．Med．166:1510(1987)）に従ってチフス菌から精製したもの）に結合させる。この結合は、当業者に公知の標準タンパク質−多糖結合技術を用いて処理する。結合方法は当業者に公知であり、Brunswick，M.ら,J．Immunol．140:3364，1988のヘテロ連結（heteroligation）技術が含まれる。タンパク質結合体の化学および架橋ＣＲＣ Press，ボストン（1991）も参照のこと。

分子の一部を一次もしくは二次担体に結合する技術は当業者に公知であり、部分的には、利用可能な官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオおよびアルデヒド基）を介したカップリングが含まれる。S．S．Wong，タンパク質結合体の化学および架橋ＣＲＣ Press，ボストン(1991)；およびBrenkeleyら，染料とのタンパク質結合体を調製する方法の概略的な調査、ハプテンおよび架橋剤，Bioconjugate Chemistry 3#1（1992年1月号）を参照。

本実施例に説明するもののようなワクチンは、インチミン（またはインチミン様タンパク質）を発現する生物、およびＶｉを発現する下痢病原体の両者を含む下痢病原体の予防をもたらす。

インチミンと、他の下痢病原体からの他の抗原とのいかなる組み合わせも合わせることができる。加えて、他の疾患を生じる生物に由来する多糖、例えば肺炎球菌多糖、が用いられた場合、そのインチミン−多糖ワクチンは複数の疾患の予防に有用である。呼吸器病原体に対するワクチンは、好ましくは、気道に直接送達される；摂取された病原体は摂取による。

実施例IX
接着遮断抗−インチミン抗体の産生および試験：ポリクローナルおよびモノクローナル
ＲＩＨｉｓＥａｅを、マウス、ウサギ、およびヤギに腹腔内注射することで高力価ポリクローナル抗−インチミン抗血清が誘導される。抗体力価の試験および抗体の有効性のアッセイを示す。また、モノクローナル抗体の産生も説明する。

Ａ．ポリクローナル抗体の産生
様々な動物における全長インチミンまたはそれらの様々な部分に対する抗体の調製に様々な技術を用いることができる。これらの技術のうちの幾つかを以下に説明する。当業者によって認識されるように、ポリクローナル抗体は、インチミンおよびhis−タグ付けされていないインチミンの一部から、ならびにインチミン様タンパク質およびそれらの一部から産生することができる。

1．マウス抗−ＲＩＨｉｓＥａｅポリクローナル抗体の産生
Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアル（Antibodies-a Laboratory Manual）Cold Spring Harbor，New York(1988)の技術に従うことができる。一般的な手順は本明細書に略述されている。免疫感作するマウスの各々から予備採血する：尾の静脈からエッペンドルフ管に出血させる。37℃で30分間インキュベートし、（血塊をほぐすために）無菌の爪楊枝で穏やかに撹拌し、4℃で一晩保存する。その朝、微量遠心管中で10分／10,000ｒｐｍ回転させ、血清（すなわち、上清；赤血球はペレットである）を集める。この血清を−20℃で保存する。得られた血清は、マウスを免疫感作した後の陰性対照として用いる。

ＢＡＬＢ／cマウスに、25μｇのＲＩＨｉｓＥａｅを腹腔内注射する(タイタマックス（Titremax）アジュバントを、製造元（シトリックス社(CytRyx Corp.)、154テクノロジー・パークウェイ、ノークロス、GA．30092、800−345−2987）の指示に従って用いる)。2週間待って同一の注射で追加免疫感作し、7日待って尾の静脈からエッペンドルフ管に出血させる。37℃で30分間インキュベートし、(血塊をほぐすため)無菌の爪楊枝で穏やかに撹拌して4℃で一晩保存する。その朝、微量遠心管中で10分／10,000ｒｐｍ回転させ、血清を回収する。この血清を−20℃で保存する。

2．マウス抗−インチミンポリクローナル血清第3の1／3部分の産生：
上述の実施例IX、パートＡに説明するように、マウスを尾の静脈から予備採血する。上記実施例IIに説明するように、インチミンの第3の1／3部分を富化して透析する。実施例IX、パートＡに説明するように、タイタマックスアジュバントと混合したインチミンの第３の1／3部分をマウスに注射する。3回の追加免疫感作の後、後眼窩洞（retro-orbital sinus）を介してマウスから採血し、実施例IX、パートＡに説明する通りに血清を調製する。血清を、下記第4節においてヤギポリクローナル血清について説明する通りに、ウェスタンブロット分析により試験する。上記実施例IX、パートＣに説明するように、ＨＥｐ−2細胞へのＥＨＥＣの接着を遮断する能力について血清をアッセイする。

3．ウサギポリクローナル抗−インチミン抗体の産生
ウサギポリクローナル血清を、インチミンの（1）第1の1／3、（2）第2の1／3、および（3）第3の1／3部分に対して産生させる。各々の特異的血清を、ＨＥｐ−2接着性アッセイにおいて、ＨＥｐ−2細胞へのＥＨＥＣの接着を遮断する能力について別々にアッセイする。

ウサギの免疫感作のための、インチミンの第１の1／3部分の調製
クローンｐＭＷ101でＤＨ5αＦ'lacI^Q株を形質転換する。タンパク質の発現の誘発、およびＮｉ−ＮＴＡアフィニティー樹脂でのＨｉｓ−タグ付きインチミン断片の精製を、ＱＩＡエクスプレッショニストＮｉ−ＮＴＡ樹脂精製キット（QIAGEN社、チャッツワース、ＣＡ）に付属するＱＩＡＧＥＮマニュアルに記述される通りに行う。溶出した画分を、Ａ₂₈₀、およびバイオーラッド（エルキュール(Hercules)、ＣＡ）からの染料試薬を用いるブラッドフォード分析により、タンパク質含量についてモニターする。Ｎｉ−ＮＴＡカラム（250ｍＭイミダゾールを含む）から溶出したピーク画分を、分析および精製のため、ＳＤＳを含む15％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。分析のためにゲル上のタンパク質を可視化するのに、銀（バイオーラッド）およびクーマシーブル−Ｇ−250（シグマ）染色の両者を用いる。

動物の免疫感作用のタンパク質を精製して抗血清を得るため、ピークカラム画分を分離用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流し、タンパク質を銅染色（バイオ−ラッド）で可視化する。インチミン断片に相当するタンパク質のバンドを清浄なカミソリの刃でゲルから切り出し、そのゲル薄片を銅染色試薬と共に提供される指示に従って脱染する。その後、エレクトロ−エリューター（Electro-Eluter）モデル422（バイオーラッド）を製造元の指示に従って用いてタンパク質をゲル薄片から溶出する。次いで、このタンパク質を、アミコン(Amicon)(ベヴァリー、ＭＡ)からのセントリコン−10(Centricon-10)濃縮器を用いて濃縮する。溶出したタンパク質サンプル中のＳＤＳの大部分を2つの方法のうちの一方で除去する。第1の方法はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をタンパク質サンプルに添加することを包含し、これはＳＤＳの沈殿を引き起こす。タンパク質の大部分は沈殿せず、どのイオンが同様に沈殿し得たのかを決定するためにこの沈殿を分析することはない。ＳＤＳを遠心によりペレット化し；大部分のタンパク質および、おそらくは、幾らかの残留ＳＤＳを含む上清を除去し、アミコン（ベヴァリー、ＭＡ）からのセントリコン−10濃縮器を用いて濃縮する。

ＳＤＳを除去するための第2の方法は、ピアス（ロックフォード、ＩＬ）から購入したエクストラクティーゲル^RＤデタージェント・リムービング・ゲル（Extracti-Gel^RＤ Detergent Removing Gel）のカラムを調製することを包含する。このエクストラクティーゲル^RＤデタージェント・リムービング・ゲルは製造元の指示に従って用いる。精製したタンパク質を上述の通りに濃縮する。タンパク質の濃度を、バイオーラッドから購入した染料試薬を用いるブラッドフォード分析により、および様々な量の元のカラム画分のアリコートに隣接したゲル上で異なる容量の精製タンパク質を流し、タンパク質の量を視覚的に比較することによっても決定する。この精製タンパク質の画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、銀およびクーマシー染色の両者を用いて分析する。

ウサギの免疫感作のための、インチミンの第2の1／3部分の調製
クローンｐＭＷ102から発現されたインチミンタンパク質のＨｉｓ−タグ付き中間部1／3断片の精製を、Ｎ末端1／3に用いられるものと同じ方法を用いて、以下の指示に従って行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、12.5％アクリルアミドゲルを用いて行う。タンパク質のゲル精製および電気溶出（electrolution）のため、この分離用ゲルの大部分を上述のように銅染色で染色し；ゲルの1つは、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor,New York(1988)に記述されるように水に溶解したクーマシーブリリアントブルーで染色する。ＰＢＳバッファを添加することにより、電気溶出タンパク質画分中の多量のＳＤＳを沈殿させる。タンパク質を濃縮するには、アミコン・セントリコン−30濃縮器を用いる(アミコン)。

ウサギの免疫感作のための、インチミンの第3の1／3部分の調製
上記実施例IIに説明するように、第3の1／3インチミンタンパク質を富化して透析する。1ｍｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、４つのバイオラッド・ミニプロテアンII（BioRad MiniProtean II）ゲル上に流す。タンパク質を、銅染色（バイオラッド、カタログ番号161−0470、リッチモンド、ＣＡ）を用いて、製造元の指示に従って以下のように負に染色する：ゲルをｄＨ₂Ｏで45秒間すすぎ、1×銅染色で5分間染色してｄＨ₂Ｏで3分間すすぐ。このゲルを黒色背景で可視化し、約37ｋＤａのタンパク質バンドをゲルからカミソリで切断する。その後、精製したゲル薄片をバッファ（25ｍＭトリス塩基、192ｍＭグリシン、3×／10分）で脱染し、プラスチックラップに包み、免疫感作に先立って−20℃で保存する。

ウサギの免疫感作
ニュージーランド白色雌ウサギ（5ないし6ポンド）を、上述の通りに調製した抗原を用いて、当業者が容易に決定することができるスケジュールに従って別々に免疫感作する。このようなスケジュールの例は以下のようなものである：
日 手順
0 予備採血／初回接種、完全フロイントアジュバントと混合した100μｇＡｇ
14 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合
21 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合
35 試験採血
45 追加免疫感作、50μｇ、不完全フロイントアジュバントと混合
56 試験採血

注射経路は、複数の部位の皮下および／または筋内であり得る。試験採血から誘導される血清を、下記第4節においてヤギポリクローナル血清について説明するように、ウェスタンブロット分析により抗原の特異的認識について試験する。抗原の高力価認識が達成された場合、当業者によって認められるように、ウサギから全血を採取して抗体を回収する。多量の血液サンプルをウェスタンブロット分析により抗原の特異的認識について実証する。

ウェスタンブロットによるウサギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミンまたはインチミン様タンパク質に特異的ではない交差反応性抗体をその血清から除去する。（Harlowe，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor,New York(1988)，498頁またはS．H．LillieおよびS．S．Brown．Yeast．3:63(1987))。ＲＩＨｉｓＥａｅ（0.250ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッド・ミニプロテアンIIミニゲル、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電気泳動し、ニトロセルロースに移してポンソーＳ(Ponceau Ｓ)(シグマ、セントルイス、ＭＯ)で染色する。完全長Ｈｉｓ−インチミンバンド（約100ｋＤａ）を含むニトロセルロース細片をカミソリで切り出し、そのタンパク質を含むニトロセルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Tween中において4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートする。このニトロセルロース細片をＴＢＳ−Tweenで簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム(Parafilm)(アメリカン・ナショナル・キャン(American National Can)、グリニッチ、Conn.)断片の上に置く。ウサギ血清をこのミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ(適した量だけ、約400−500μｌ)、湿ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に接触しないようにかけ、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏やかに5時間振盪した後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれる）を取り出して分析用に保存する。細片をＰＢＳで10分間、3回洗浄し、グリシンバッファ（150ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ2.3−ＨＣｌを含む）を（この細片上に適した量だけ）添加して30分間おく。アフィニティー精製抗体をピペットで取り出し、1／10容量のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0を添加する。その後、このようにして回収された抗体を1Ｎ ＮａＯＨで中和し、以下に説明するようにウェスタンブロット分析によって試験する。

抗原アフィニティーカラムによるウサギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製して、インチミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそれらの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、当業者に公知の技術、例えば、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようなものを用いて精製する。

抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精製することができる。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることができる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後、活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成するため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となることがある。

抗原へのカップリングに適した活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられている）幾つかの特性(カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リガンドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば、精製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を、製造元の指示に従ってアフィゲル（Affigel）ビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングさせる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビーズの製造元の指示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow，Ｅ.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される方法に従って洗浄する。

硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳへの再懸濁、ＰＢＳに対するその溶液の透析、およびその溶液を清澄化するための遠心はHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される通りに行う。

硫酸アンモニウム沈殿およびＰＢＳに対する透析によって部分的に精製されている抗血清を、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通す。抗血清をこのカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し得る。その後、Harlow，E.およびD.Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティー精製抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。

接着性アッセイ
アフィニティー精製ポリクローナル血清を、ＨＥｐ−2細胞接着性アッセイにおいて、ＨＥｐ−2細胞への細菌結合を遮断する能力について、下記実施例IX、パートＣに説明する方法を用いてアッセイする。

4．ヤギ抗−ＲＩＨｉｓＥａｅポリクローナル抗体の産生
免疫感作しようとする可能性のあるヤギから予備採血する。間接真空を用いて、頸静脈から血液を集める。上記実施例IX、第Ａ節に説明するように全血から血清を分離し、（下記実施例IX、第Ｂ節でＥＬＩＳＡについて、および上記実施例IIでＲＩＨｉｓＥａｅの富化について説明するように）ＲＩＨｉｓＥａｅを吸着剤として用いるＥＬＩＳＡにより、または以下に説明するようなウェスタンブロット分析により試験する。免疫感作のために選択されるヤギは、(a)ウェスタンブロット分析による最低のインチミン認識および（b）ＥＬＩＳＡによるインチミンに対する最低力価の両者を備える予備免疫血清を有し、放牧地を飛び出す習性のないヤギである。

ヤギ抗−ＲＩＨｉｓＥａｅポリクローナル血清のウェスタンブロット分析
a．全細胞溶解物の生成
所望の株（例えば、86−24、86−24eaeΔ10、ＤＨ5α、Ｍ15ｐＲＥＰ4ｐＥＢ313）を、適切な抗生物質を含むＬＢ中で、37℃で一晩、振盪しながら増殖させる。細胞（4.5ｍｌ）をエッペンドルフ管内でペレット化し、500μｌの超音波処理バッファ（50ｍＭ Ｎａ−リン酸ｐＨ7.8、300ｍＭ ＮａＣｌ）を添加する。細胞を氷上において15秒パルスで超音波処理し、等分して−20℃で凍結する。

b．ウェスタンブロット分析
上述の通りに生成した全細胞溶解物（2−5μｌ）または精製ＲＩＨｉｓＥａｅ（2μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移し、ヤギ血清のウェスタンブロット分析に用いる。この目的のため、血清（一次抗体）を典型的には1：500または1：1000に希釈する。用いられる二次抗体は、１：2000に希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合したブタ抗−ヤギＩｇＧ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）である。予備採血のヤギ血清は通常数種類の交差反応性バンドを含んでおり、これらは後にアフィニティー精製によって除去する。

ヤギを免疫感作するための精製ＲＩＨｉｓＥａｅ（抗原）の調製
上記実施例IIに説明する通りに産生させたＲＩＨｉｓＥａｅ 1ｍｇを、分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。小さな分析レーンをコロイド状クーマシー染色（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色し、残りの分離用ゲルとの比較に用いる。（染色されておらず、約100ｋＤａに達する）高分子量の完全長インチミンバンドを分離用ゲルからカミソリで切り出し、免疫感作に先立って4℃で保存する。

抗原でのヤギの免疫感作
雌ヤギ（約1歳半、サーナン（Saanan）純血種またはサーナンＸ ＬａＭＡＮＣＨＡ）を、上述の通りに調製した抗原を用いて、当業者が容易に決定することができるスケジュールに従って別々に免疫感作する。例えば、完全フロイントアジュバントと混合した調製ＲＩＨｉｓＥａｅ 500μｇの一次免疫感作をヤギに行う。2週間隔で、不完全フロイントアジュバントと混合したＡｇ 250μｇでヤギに追加免疫感作する。ヤギを1ケ月間免疫感作した後に試験採血を開始し、上述のウエスタンブロット分析による決定で高抗−インチミン力価が達成されるまで継続する。血清がウェスタンブロットによりインチミンを認識する場合、2週間間隔で各セッション毎に多量の血液サンプルを採取する(500ｍｌ、これから約250ｍｌの血清が生じる)。得られる大量血清サンプルを、上述のように、ウェスタンブロット分析により、インチミン認識について立証する。

ウェスタンブロットによるヤギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
ヤギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する（Harlowe，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)，498頁またはS．H．LillieおよびS．S．Brown．Yeast．3:63(1987))。ＲＩＨｉｓＥａｅ（0.250ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッド・ミニプロテアンIIミニゲル、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電気泳動し、ニトロセルロースに移し、ポンソーＳ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色する。完全長Ｈｉｓ−インチミンバンド（約100ｋＤａ）を含むニトロセルロース細片をカミソリで切り出し、そのタンパク質を含むニトロセルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Tween中において4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートする。このニトロセルロース細片をＴＢＳ−Tween中で簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム（アメリカン・ナショナル・キャン、グリニッチ、Conn.）断片の上に置く。ヤギ血清をこのミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ(適量だけ、約400−500μｌ）、湿ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に接触しないようにかけ、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏やかに5時間振盪した後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれる）を取り出して分析用に保存する。細片をＰＢＳ中で10分間、3回洗浄し、グリシンバッファ（150ｍＭ ＮａＣｌ、 ｐＨ2.3−ＨＣｌを含む）を（この細片上に適した量だけ）添加して30分間おく。アフィニティー精製抗体をピペットで取り出し、1／10容量のトリス−ＨＣｌ、pH8.0を添加する。その後、抗体を1Ｎ ＮａＯＨで中和し、上述のようにウェスタンブロット分析によって試験する。

抗原アフィニティーカラムによるヤギ抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
ヤギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製してインチミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそれらの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、当業者に公知の技術、例えば、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるような技術を用いて精製する。

抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精製することができる。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることができる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後に、活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成するため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となることがある。

抗原へのカップリングに適した活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられている）幾つかの特性(カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リガンドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば、精製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を製造元の指示に従つてアフィゲルビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングさせる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビーズの製造元の指示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される方法に従って洗浄する。

硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳへの再懸濁、およびＰＢＳに対するその溶液の透析、ならびにその溶液を清澄化するための遠心はHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される通りに行う。

硫酸アンモニウム沈殿およびPBSに対する透析によって部分的に精製されている抗血清を、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通す。抗血清をカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し得る。その後、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティー精製抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。

接着性アッセイ
アフィニティー精製ポリクローナル血清を、ＨＥｐ−2細胞接着性アッセイにおいて、ＨＥｐ−2細胞への細菌結合を遮断する能力について、下記実施例IX、パートＣに説明する方法を用いてアッセイする。

Ｂ．抗体の力価を試験するためのＥＬＩＳＡ
Harlow，E．およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)の技術に従うことができる。一般的な手順を以下に略述する：
（1）RIHisEaeを、プラスチックマイクロタイタープレートに、ＰＢＳ中50ng／ウェルで結合させる。2時間／ＲＴ（室温）、または4℃で一晩インキュベートする。
（2）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。
（3）100μｌのブロッキング溶液［ＰＢＳ中の3％ウシ血清アルブミン(シグマ・ケミカル、セントルイス、ＭＯ)、0.02％ナトリウムアジド(シグマ)、4℃で貯蔵］を用いてＲＴで1−2時間ウェルをブロックする。
（4）プレートをＰＢＳで２回洗浄する。
（5）一次Ａｂ＝ブロッキング溶液で、例えば、1：50から出発して1：2希釈を11回、または1：50から出発して1：10希釈を11回行って希釈した50μｌ試験血清)、2時間／ＲＴでインキュベートする。
（6）ＰＢＳで4回洗浄する。
（7）二次Ａｇ＝アフィニティー精製したヤギセイヨウワサビ結合抗−マウス(またはその他の試験される動物)Ig(ベーリンガー・マンハイム社、9115ハーグ・ロード、Ｐ．Ｏ.Box 50414、インディアナポリス、ＩＮ．46250、800−262−1640)。アジドを含まないブロッキング溶液で1：500に希釈した二次Ａｂを添加する。1時間／ＲＴでインキュベートする。
（8）ＰＢＳで4回洗浄する。
（9）各ウェルに100μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質（製造元のバイオラッド・ラブス、3300レガッタ・ブルバード、リッチモンド、ＣＡ．94804の指示に従って調製）を添加する。青色を発色させる(10分以下)。100μｌのＨ₂ＳＯ₄で反応を停止させる。プレートを450ｎｍで読みとる。

力価を、吸光値≧マウス予備免疫血清について得られるものを0.2単位以上上回るものと定義する。

抗−インチミン抗体を投与して、受動免疫防御を必要とする患者にそれらをもたらすことができる。さらに、動物から得られた抗−インチミン抗体をヒトに対して臨床的に用いることができる。このような場合、その抗体をヒト化することが好ましい。そのような技術は当業者に公知である。例えば、G．Winterら，「人造抗体（Man-made antibodies）,」Nature，349:293-299(1991);P．T.Jonesら，「ヒト抗体における相補性決定領域のマウス由来のものでの置換（Replacing the complementarity-determing regions in a human antibody with those from a mouse）,」Nature，321:522-525(1986);P．Carterら，「ヒト癌治療のための抗−p185^HER2抗体のヒト化（Humanization of an anti-p185^HER2 antibody for human cancer therapy）,」Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，89:4285-4289(1992)を参照されたい。このような抗体を感染患者の兄弟に投与して兄弟の感染の危険を減らすことができる。

Ｃ．抗−ＲＩＨｉｓＥａｅポリクローナル血清のウェスタンブロット分析
ポリクローナル血清をウェスタンブロット分析によってアッセイしてインチミン認識を立証する。

1．全細胞溶解物の産生
所望の株（例えば、86−24、86−24eaeΔ10、ＤＨ5α、Ｍ15 ｐＲＥＰ4 ｐＥＢ313）を適切な抗生物質を含むＬＢ中において、37℃で一晩、振盪しながら増殖させる。細胞（4.5ｍｌ）をエッペンドルフ管内でペレット化し、500μｌの超音波処理バッファ（50ｍＭ Ｎａ−リン酸ｐＨ7.8、300ｍＭ ＮａＣｌ）を添加する。細胞を氷上において15秒パルスで超音波処理し、等分して−20℃で凍結する。

2．ウェスタンブロット分析
上述の通りに生成した全細胞溶解物（2−5μｌ）または精製ＲＩＨｉｓＥａｅ（2μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースに移し、血清のウェスタンブロット分析に用いる。この目的のため、血清（一次抗体）を典型的には1：500または1：1000に希釈する。二次抗体は一次抗体の源である動物に特異的であり、かつセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合している。予備採血の血清は数種類の交差反応性バンドを含んでいることがあり、これらは後にアフィニティー精製によって除去する。

Ｄ．ウェスタンブロットによる抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製し、インチミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する(Harlowe，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988),498頁またはS．H．LillieおよびS．S．Brown．Yeast．3:63(1987))。ＲＩＨｉｓＥａｅ（0.250ｍｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（サイズ：バイオラッド・ミニプロテアンIIミニゲル、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）により電気泳動し、ニトロセルロースに移してポンソーＳ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で染色する。完全長Ｈｉｓ−インチミンバンド（約100ｋＤａ）を含むニトロセルロース細片をカミソリで切り出し、そのタンパク質を含むニトロセルロース細片を2％乳／ＴＢＳ−0.2％Tween中において4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートする。このニトロセルロース細片をＴＢＳ−Tween中で簡単に洗浄し、容器内のパラフィルム（アメリカン・ナショナル・キャン、グリニッチ、Conn.）断片の上に置く。血清をこのミニ−ウェスタンブロット上にピペットでのせ(適量だけ、約400−500μｌ)、湿ったペーパータオルを収容されるニトロセルロース細片上に接触しないようにかけ、続いてプラスチックラップをかける。このブロットを穏やかに5時間振盪した後、血清（この時点で「欠乏血清」と呼ばれる）を取り出して分析用に保存する。細片をＰＢＳで10分間、3回洗浄し、グリシンバッファ(150ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ2.3-ＨＣｌを含む）を（この細片上に適した量だけ）添加して30分間おく。アフィニティー精製抗体をピペットで取り出し、1／10容量のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ8.0を添加する。その後、抗体を１Ｎ ＮａＯＨで中和し、上述のようにウェスタンブロット分析によって試験する。

Ｅ．抗原アフィニティーカラムによる抗−インチミンポリクローナル血清のアフィニティー精製
ウサギ抗−インチミンポリクローナル血清をアフィニティー精製してインチミンに特異的ではない交差反応性抗体を血清から除去する。インチミンまたはそれらの様々な部分に対して生じた抗血清を、抗原アフィニティーカラムを用い、当業者に公知の技術、例えば、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される技術を用いて精製する。

抗原（インチミンまたはインチミンの一部）を上記実施例IIに説明するように富化する。抗原を、下記パート4に説明するように、アクリルアミドゲル上での電気泳動、続いてそのタンパク質を含むゲル薄片からの電気溶出によりさらに精製することができる。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂から溶出した後にそのタンパク質をさらに精製するために、ゲル精製および電気溶出の代わりに他の方法を用いることができる。これらの方法には、イオン交換カラムクロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されるものではない。精製後、活性化ビーズにカップリングして抗血清精製用のアフィニティー樹脂を形成するため、インチミンタンパク質を適切なバッファに透析することが必要となることがある。

抗原へのカップリングに適する活性化ビーズは、（Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に挙げられている）幾つかの特性(カップリング試薬、結合性基またはマトリックス、リガンドの結合、および最終マトリックスの安定性)に基づいて選択する。例えば、精製インチミン（またはインチミンの一部）タンパク質抗原を製造元の指示に従ってアフィゲルビーズ（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）にカップリングさせる。この抗原に結合した活性化ビーズのカラムを調製し、ビーズの製造元の指示に従って洗浄する。その後、このカラムをHarlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述される方法に従って洗浄する。

硫酸アンモニウム沈殿を用いて、このアフィニティーカラム用の調製中の血清を部分的に精製する。硫酸アンモニウム沈殿、そのタンパク質ペレットのＰＢＳへの再懸濁、およびＰＢＳに対するその溶液の透析、ならびにその溶液を清澄化するための遠心はHarlow，E.およびD.Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるように行う。

硫酸アンモニウム沈殿およびＰＢＳに対する透析によって部分的に精製されている抗血清を、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるように抗原アフィニティーカラムに通す。抗血清をカラムに複数回通すことで、抗体がカラムへより完全に結合し得る。その後、Harlow，E.およびD．Lane（編）抗体−実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に記述されるようにカラムを洗浄し、アフィニティー精製抗体を溶出させてＰＢＳに対して透析する。

Ｆ．インチミンに対する抗体による細菌結合の遮断についてのアッセイ
ＥＨＥＣ接着に対する抗−インチミン抗体の効果を評価するため、マウス、ウサギ、またはヤギ抗−インチミン抗血清（または対照として正常血清）を接着培地に懸濁したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細菌−抗血清混合液をＨＥｐ−2細胞の感染に先立って37℃で30分間インキュベートする。抗血清はアッセイを通してその接着培地中に維持する。接着および関連後遺症を、上述のようにギムザ(ＧＩＥＭＳＡ)およびＦＩＴＣ-ファロイジン（ＦＡＳ）を用いて顕微鏡で観察する。

インチミン様タンパク質を有する他の細菌の接着に対する抗−インチミン抗体の効果を評価するため、マウス、ウサギ、またはヤギ抗−インチミン抗血清（または対照として正常血清）を接着培地に懸濁したＥＨＥＣ細菌に添加し、その細菌−抗血清混合液をＨＥｐ−2細胞の感染に先立って37℃で30分間インキユベートする。

本発明の他の態様は、本明細書およびここに開示される本発明の実施を考慮することにより当業者には明らかであろう。本明細書および例は例示するだけのものであると見なされ、本発明の真の範囲および思想は以下の請求の範囲によって示されるものであることが意図されている。

Ｇ．インチミンに特異的なモノクローナル抗体の産生
インチミンに対するモノクローナル抗体を、ＥＨＥＣ（またはインチミン様タンパク質を発現する細菌）によるコロニー形成に対する患者の受動防御に用いる。モノクローナル抗体をマウス細胞から産生させ、これらの抗体の特異性をヒトにおいて用いるために変更する。G．Winterら，「人造抗体,」Nature，349:293-299(1991)；P．T．Jonesら，「ヒト抗体における相補性決定領域のマウス由来のものでの置換,」Nature，321:522-525(1986)；P．Carterら，「ヒト癌治療のための抗−p185^HER2抗体のヒト化,」Proc．Natl．Acad．Sci．ＵＳＡ，89:4285-4289(1992)。モノクローナルＡｂは患者に投与するためのより「純粋な」抗体を表す。

1．抗−Ｅａｅモノクローナル抗体の産生
抗-インチミンモノクローナル抗体の産生方法の2つの例を以下に説明する。

a．方法1
抗−Ｅａｅ ｍＡｂの産生
Harlow，E.およびD．Lane,抗体，実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に略述される手順を修正してそれに従う。9週齢雌ＢＡＬＢ／ｃ（ハーラン・スプラーク−ドーリー(Harlan Spraque-Dawley)、インディアナポリス、ＩＮ）をモノクローナル抗体の作製に用いる。免疫感作に先立ち、各々のマウスから後眼窩洞を介して血清サンプルを得る。この全血を微量遠心管に入れて4℃で4ないし16時間冷却する。全血を1000−1200×gで15分間、10−15℃で遠心することにより血清を調製する。この血清をマイクロピペッタおよび無菌のピペットチップを用いて新たな微量遠心管に移す。血清を使用時まで−20℃で保存する。

上記実施例IIに説明するように得たＲＩＨｉｓＥａｅのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから抗原を得る。上記実施例IX、Ａ節、パート4に説明するように、高分子量インチミンバンドをカミソリで切り出す。この目的のため、1ｍｇのＲＩＨｉｓＥａｅを４つのミニプロテアンIIゲル（バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）上に流す。これらのゲルから切り出したタンパク質を、乳鉢および乳棒を用いて、約8ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のスラリーとする。実験日第0日に、このスラリーの0.8ｍｌを1.2ｍｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合し、0.2ｍｌアリコートを4匹のマウスの各々に皮下注射する。このスラリーの0.5ｍｌを0.5ｍｌのＲＩＢＩＴ−700アジュバント（ＲＩＢＩイムノケム(ＲＩＢＩ Immunochem)、ハミルトン、モンタナ州）と混合し、0.2ｍｌを4匹のさらなるマウスの各々に注射する。

実験日第21日および42日に、マウスに追加免疫感作注射を施す。ＣＦＡの代わりに不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を用いることを除いて、上述の通りに抗原を調製する。

実験日第14日、第35日および第49日に、上述の通りに血清サンプルを得る。

血清サンプルを（以下に説明する）イムノアッセイにより試験し、当業者に認識されるように、Eaeに対して最も強く応答する血清を産生するマウスを同定する。上記実施例IX、Ａ節、パート4に説明するように、血清サンプルの反応性をウェスタンブロット分析により立証する。融合の3日前（実験日第59日）に、融合のために選択されたマウスを、ＰＢＳ中のインチミンスラリーからの上清の50％混合物で免疫感作する。合計で0.1ｍｌのこのスラリーを尾の静脈を介して静脈注射する。

選択されたマウスからの脾臓細胞をＳＰ2／0ミエローマ細胞（カタログ＃ＣＲＬ1581アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、ロックビル、ＭＤ 20850、301−881−2600）と融合させる。この融合のためには、脾臓細胞10個に対してミエローマ1個の割合を用いる。融合はポリエチレングリコール（カタログ＃783 641 ベーリンガー−マンハイム社、9115ハーグ・ロード、ＰＯ Box 50414、インディアナポリス、ＩＮ．46250、800−262−1640）を用いることにより達成する。融合した細胞を増殖させるために96ウェル組織培養皿に分配する。この培養物をヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地において10日間増殖させることによりハイブリドーマを選択する。以下に説明するように、イムノアッセイにより、抗−インチミン特異的抗体を分泌するハイブリドーマを96ウェル組織培養皿から同定する。Eaeと反応する抗体について陽性である培養物を24ウェル皿に移すことにより増大させ、イムノアッセイによりEaeとの反応性について再試験して、限界希釈により2回クローン化する。

マウスポリクローナル抗−インチミン血清およびハイブリドーマ上清（抗−インチミンモノクローナル抗体）のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
免疫感作に用いたインチミンスラリー3ｍｌ部分を約1000×gで15分間、室温で遠心する。得られた清澄化上清のサンプルを用いてイムノアッセイプレートをコートする。簡単に述べると、このインチミン含有上清をＰＢＳ中に1：300に希釈し、コーティング抗体として用いる。ヌンク・マキシソープ・ストリップウェル（Nunc Maxisorp Stripwell）を、室温で2−24時間100μｌ／ウェルの希釈上清でコートする。

0.5％Tween−20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で4回洗浄して、未結合物質をウェルから洗浄する。血清サンプルのアッセイについては、各サンプルのＰＢＳ−Ｔ中での複数の希釈液を調製し、複製ウェルに加える。96ウェル皿培養物からの培養上清のアッセイについては、各上清をＰＢＳ−Ｔ中で1：2に希釈し、1つのウェルに加える。24ウェル皿培養物からの上清もＰＢＳ−Ｔ中で1：2に希釈し、二通り試験する。血清サンプルのアッセイには、バッファ対照、培地対照および既知のポリクローナル抗−インチミン対照が含まれる。上清のアッセイには、バッファ対照、培地対照、および既知のポリクローナル抗-インチミン対照が含まれる。

血清および上清を通気のない環境において、室温で30−60分間、インチミンでコートされたウェル上でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで4回洗浄して未結合抗体および（血清タンパク質等の）外来性物質をウェルから洗浄する。その後、各ウェルに、ＰＢＳ−Ｔ中で1：4000に希釈したウサギ抗−マウスＩｇＧ（ガンマ特異的）−ＨＲＰ（ジムド(Zymed)、サウスサンフランシスコ、ＣＡ）100μｌを加える。

プレートを、再度、通気のない環境において室温で30−60分間インキュベートする。その後、各ウェルに100μｌの1成分ＴＭＢ基質溶液（カークガードおよびペリー・ラブス(Kirkegaard and Perry Labs)、ゲーサーズバーグ、ＭＤ20878、301−948−7755）を加える。反応を暗所において15分間進行させた後、80μｌ／ウェルのＴＭＢ停止試薬（カークガードおよびペリー・ラブス、ゲーサーズバーグ、ＭＤ20878、301−948−7755）を添加することにより停止させる。

b．方法2
Harlow，E.およびD．Lane,抗体、実験マニュアルCold Spring Harbor，New York(1988)に略述される手順に従う：5匹の4ないし5週齢雌ＢＡＬＢ／cJマウスを予備採血し、100μｌのタイタマックス（TiterMax）に懸濁したＲＩＨｉｓＥａｅ25μｇを腹腔内投与して免疫感作する。2週間隔で2回、100μｌのタイタマックスに懸濁したＲＩＨｉｓＥａｅ 25μｇを腹腔内投与することでマウスを追加免疫感作する。各追加免疫感作の7日後、血液（約300−500μｌ）を尾の静脈から採取する。ＥＬＩＳＡにより、抗−ＲＩＨｉｓＥａｅ抗体の存在について血清をアッセイする（上述の通り）。

高力価の抗−ＲＩＨｉｓＥａｅを産生するマウスを、ＰＢＳ 100μｌ中のＲＩＨｉｓＥａｅ 25μｇを静脈内および腹腔内の両者で投与することで追加免疫感作し、3日後に屠殺して血清を回収する。脾臓細胞を単離し、Sp2／0-Ａｇマウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ1581）にミエローマ細胞1個について脾臓細胞10個の割合で融合させる。融合した細胞を微量希釈プレートに分配し、培養上清を3−4週間の培養の後にＥＬＩＳＡによりＲＩＨｉｓＥａｅ抗体についてアッセイする。抗−ＲＩＨｉｓＥａｅ抗体の産生について陽性の培養物を増大させ、限界希釈により2回クローン化する。

2．抗−ＲＩＨｉｓＥａｅ ｍＡｂが立体配置的エピトープを認識するのか、または直線状エピトープを認識するのかの決定
ｍＡｂの反応性を、1）天然ＲＩＨｉｓＥａｅを吸着剤として用いるＥＬＩＳＡ；および2）変性させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＲＩＨｉｓＥａｅの免疫ブロットによって比較する。ｍＡｂの幾つかのプールを得る：1）立体配置的なエピトープのみを認識し、かつＥＬＩＳＡでは陽性反応を示すが免疫ブロット分析では示さないもの；2）直線状エピトープを認識し、かつ両アッセイにおいて反応するもの；および3）直線状エピトープを認識し、かつ免疫ブロット分析では陽性反応を示すがＥＬＩＳＡでは示さないもの。加えて、非溶解細胞のコロニー免疫ブロットを行い、ｍＡｂが野生型86−24株の表面上に発現するＥａｅを認識するかどうかを決定する。

3．ＨＥｐ−2細胞への86-24株の接着を遮断する能力についての抗−Ｅａｅ ｍＡｂの試験
86−24株をＨＥｐ−2細胞に関する定量的接着性アッセイに処し、並行して、抗−ＲＩＨｉｓＥａｅ ｍＡｂの様々な希釈液と予備インキュベートした細菌を用いて試験する。

選択された接着遮断性の立体配置的ｍＡｂをアイソタイプ決定（イムノピュアｍＡｂタイピングキット(immunopure mAb Typing Kit)、ピアス、ロックフォード、III.)に処す。その後、独特の抗体を、プロテインＧセファロースカラム（ファルマシア、ピスカタウェイ、Ｎ.Ｊ.）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。得られたアフィニティー精製ｍＡｂをＨＥｐ−2細胞への86−24株の接着を遮断する能力について再試験し、その抗体が精製後に機能的なままであることを確かなものとする。

Ｈ．診断キットにおけるポリクローナルおよびモノクローナル抗−インチミン抗体の使用
インチミン発現性細菌、好ましくはＥＨＥＣの検出に診断キットを用いることができる。このようなキットの調製および使用の一般的な説明は1995年3月10日出願の同時係属米国出願番号08／412,231号に示されており、この特許出願の開示は本明細書において参考として援用する。

本発明の他の態様は、本明細書およびここに開示される本発明の実施を考慮することにより当業者には明らかであろう。本明細書および例は例示のためのみのものであると見なされ、本発明の真の範囲および思想は以下の請求の範囲によって示されるものであることが意図されている。

図１は、ＲＩＨｉｓＥａｅをコードするプラスミドｐＥＢ313を示す。このプラスミドは、935個の推定アミノ酸のうちの900個にわたるヒスチジンタグ付きインチミンをコードする。 図２は、完全なＥＨＥＣ933 eae遺伝子の推定タンパク質配列(配列番号１９)を示す。 図３は、Beebakhee，G.らによって配列決定された、ＥＨＥＣ ＣＬ8株からのＤＮＡ配列(配列番号２０)を示す。 図４は、YuおよびKaperによって配列決定された、ＥＨＥＣ 933株からのＤＮＡ配列(配列番号２１)を示す。 図５は、eaeと表示された領域においてポリメラーゼ連鎖反応増幅によって製造されたeaeの3144bp断片を示す。 図６は、lacプロモーターによって駆動(drive)されるＥＨＥＣ 86−24 eae株（全コーディング配列）をコードするプラスミドｐＥＢ311を示す。 図７は、ＰＴ7プロモーターによって駆動されるＥＨＥＣ 86−24 eae株（全コーディング領域）をコードするプラスミドｐＥＢ310を示す。 図８は、ヒスチジンタグ付き発現プラスミド(それぞれ配列番号２２〜２４)（ＱＩＡＧＥＮ社）を示す。 図９は、リプレッサープラスミド(配列番号２５)（ＱＩＡＧＥＮ社）(多コピー)を示す。 図１０は、ＲＶＨｉｎｄＨｉｓをコードするプラスミドｐＥＢ312を示す。このプラスミドは、935個の推定アミノ酸のうちの604個にわたるヒスチジンタグ付きインチミンをコードする。 図１１は、his−タグ付きベクター中にクローン化されたeaeの異なる断片、およびこれらのプラスミドの対応名を示す。 図１２は、his−タグ付きベクター中にクローン化されたeaeの異なるＣ末端断片およびこれらのプラスミドの対応名を示す。 図１３は、対立遺伝子交換によるeae変異体、86−24eaeΔ10の構築を示す。 図１４は、eae構造遺伝子の大部分をコードするプラスミドｐＥＢ290を示す。eaeの3'の250bpはｐＥＢ290によってはコードされない。 図１５は、eaeの1275bp内部Ｂｃｌ I断片が欠失している欠失変異体の構築に用いるｐＥＢ300を示す。 図１６は、クローン化遺伝子を細菌染色体に導入するための自殺ベクター(suicide vector)ｐＡＭ450を示す。 図１７は、相同的組換えのための、ｐＡＭ450ベクターにおいて欠失しているeae遺伝子をコードするプラスミドｐＥＢ305iを示す。 図１８は、Ｎ−Ｈｉｓ−IcsＡ−インチミン−Ｃを発現するプラスミドを構築するためのクローニングスキームを示す。

Claims (2)

1. 腸管出血性大腸菌(EHEC)又は腸内病原性大腸菌(EPEC)を検出するための診断キットであって、
   eae遺伝子によりコードされるタンパク質又はその一部に特異的な抗体であって、eae遺伝子を発現する細菌の上皮細胞への結合の遮断能を保持する、前記抗体を含む抗体試薬、
   を含む、前記診断キット。
2. 上記タンパク質が腸管出血性大腸菌(EHEC)インチミン又は腸内病原性大腸菌(EPEC)インチミンである、請求項１記載の診断キット。

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