JP2007269799A - 「擬似」天然型化学的ライゲーション - Google Patents

Abstract

【課題】アミド結合を介し、より広範なペプチド、ポリペプチド、他のポリマーおよび他の分子のライゲーションを可能にするために天然型化学的ライゲーションの技法を拡大するための方法および組成物の提供。
【解決手段】側鎖が式−Ｓ−Ｒ_ａａを有し、該式中、Ｒ_ａａは、表Ｉの擬似Ａｓｐ、擬似Ｇｌｎ、擬似Ａｓｎ、擬似Ｓｅｒ、擬似Ｔｈｒ、擬似Ｌｙｓ、擬似Ａｒｇ、擬似Ｍｅｔ、擬似Ｐｈｅ、擬似Ｔｙｒ、擬似ホスホｔｙｒ、擬似Ｄｏｐａ、擬似Ｇｌａ、擬似Ｈｉｓ、擬似Ｔｒｐ、擬似Ｌｅｕ、擬似Ｖａｌ、擬似Ｉｌｅ、擬似Ｎ−（エチル）トリフルオロアセトアミド、擬似ＳＢＦ、及び擬似メチルＳＢＦ、から成る群より選択される擬似アミノ酸残基を含有する合成タンパク質。
【選択図】図１

Description

本発明は、アミド結合を介し、より広範なペプチド、ポリペプチド、他のポリマーおよび他の分子のライゲーションを可能にするために天然型化学的ライゲーションの技法を拡大するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、そのようなタンパク質および誘導化タンパク質のための方法および用途を提供する。

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／２３１３３０号（２０００年９月８日出願）および第６０／２３６３７７号（２０００年９月２９日出願）の一部継続出願であり、これら双方の出願全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

過去３０年の間に、疾患を治療するための治療用薬剤として天然に産生されたタンパク質を用いることの可能性に医学上の注目がますます向けられるようになった。

組換えＤＮＡ技法は、細菌および他の宿主細胞において多量に産生することができるので、多くのポリペプチドおよびタンパク質の商業的産生の主要な方法となっている。組換えタンパク質の産生には、所望の外生タンパク質をコード化するＤＮＡを用いて宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換すること、およびその組換えタンパク質の発現に有利な条件下で細胞を増殖することが含まれる。組換えタンパク質を高力価で産生させることができることから、大腸菌および酵母が宿主として好都合である（米国特許第５７５６６７２号（Ｂｕｉｌｄｅｒ他）を参照のこと）。

組換えＤＮＡコード化タンパク質の一般的な細菌の発現に関して、多数の米国特許が発行されている（たとえば、米国特許第４５６５７８５号、第４６７３６４１号、第４７３８９２１号、第４７９５７０６号、第４７１０４７３号を参照のこと）。残念ながら、組換えＤＮＡ技法は例外なく成功したわけではない。いくつかの条件下で、細菌宿主から多量に発現したある種の異種タンパク質は、細胞内で濃縮な凝集物として沈降し、位相差顕微鏡において細胞内部に可視の輝点として認識されることになる。これらの沈降タンパク質の凝集物は「屈折体」と呼ばれ、細胞タンパク質全体のかなり大きな部分を構成する可能性がある（Ｂｒｅｍｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８５）２４：７６６２）。

これらの物体からのタンパク質の回収は多数の問題を提起しており、たとえば細胞内に包含されたタンパク質を、それを収容している細胞材料およびタンパク質からどのように分離するのか、その封入体タンパク質を生体活性形態でどのように回収するのかなどの問題がある。屈折体に関する全般的な概説は、Ｍａｒｓｔｏｎ、上記；ＭｉｔｒａｋｉおよびＫｉｎｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：６９０（１９８９）；ＭａｒｓｔｏｎおよびＨａｒｔｌｅｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８２：２６４〜２７６（１９９０）；Ｗｅｔｚｅｌ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ａｍｙｌｏｉｄ」、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ＡｈｅｒｎおよびＭａｎｎｉｎｇ（編）（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９１）；Ｗｅｔｚｅｌ、「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｅｅｓ、Ａ．Ｒ．等（編）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９９１）を参照されたい。したがって、生物活性タンパク質を産生する別の方法が求められている。

タンパク質を組換え産生する別の方法の１つには、タンパク質を合成するために有機化学の原理を用いることが含まれる。現在、タンパク質を化学合成するための方法には、段階固相合成、および溶液中での、または固相でのフラグメント縮合が含まれる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）の古典的な段階固相合成には、所望のペプチド鎖のカルボキシ末端アミノ酸に対応するアミノ酸を固体支持体に共有結合すること、および活性化カルボキシル基を有する活性化アミノ酸誘導体の段階カップリングによってアミノ末端に向かってポリペプチド鎖を延長することが含まれる。完全に保護された固相結合ペプチド鎖のアセンブリが完了した後、ペプチド−固相共有結合を適切な化学方法によって開裂し、保護基を除去して生成物のポリペプチドを得る。

残念ながら、段階固相合成法には多くの欠点があり、それには各サイクルのカップリングおよび脱保護での不完全な反応に起因する生成物によって結合した固相の形成が含まれる。ペプチド鎖が長くなるにつれて、高純度の意図した生成物を得ることがより難しくなる。この方法によるタンパク質および大型のポリペプチドの合成は、時間のかかる困難な作業である。

固相フラグメント縮合アプローチ（セグメント縮合としても知られる）は、固相段階合成法で長いポリペプチドを得るときの困難を克服するように考案されたものである。このセグメント縮合法には、固相段階法によって数個のペプチドセグメントを調製すること、続いて、最大限に保護されたセグメントを固相から開裂し、精製することが含まれる。保護セグメントは、第１のセグメントに１つずつ縮合され、それが固相に結合する。しかしながら多くの場合、固相セグメント縮合の多くのステップで技術的問題が生じている。Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ等、「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ−Ｔｈｅ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」、Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １１〜２５（Ｒ．Ｅｐｔｏｎ等、１９９０）を参照されたい。たとえば、望ましくないライゲーション反応をブロックするためのセグメント上での保護基の使用によって、しばしば保護セグメントの可溶性はわずかとなり、カルボキシル基の有効な活性化が妨げられる可能性がある。保護セグメントの限定された溶解性はさらに、保護セグメントの精製を妨げる可能性がある。Ｋ．Ａｋａｊｉ等、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）３３：１８４〜１０２（１９８５）を参照されたい。保護セグメントは、純度、共有構造に関して特性付けが困難であり、高分解能分析ＥＳＭＳ（エレクトロスプレー質量分析法）（電荷に基づく）を施すことができない。ライゲーションがグリシン残基で行われる場合を除いて、各活性化ペプチドセグメントのＣ末端残基のラセミ化も問題である。さらに、完全にアセンブルされた固相結合ポリペプチドの固相からの開裂および保護基の除去は、しばしば、完全にアセンブルされたポリペプチドの分解をもたらす厳しい化学手法および長い反応時間を必要とすることになる。

セグメント縮合は、固相上ではなく、溶液中で行うことができる。Ｈ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｎ．２０３（２）：１１３１〜１１３９（１９９４）を参照されたい。しかしながら、溶液中のセグメント縮合は、ライゲーションに先立ってセグメントを精製する必要があり、且つ複数の望ましくない副反応を防ぐために一連の異なる側鎖官能基上で保護基を用いる必要がある。さらに、溶液中のライゲーションでは、固相ライゲーションで提供される簡便な精製および洗浄ステップが行えない。さらに、保護ペプチドセグメントおよび保護ペプチド中間反応生成物の溶解性に関する限定が悪化してくる。

最大限に保護されたペプチドでしばしば生じる溶解性の問題を克服するために、ペプチドセグメントの化学的ライゲーションが探求されてきた。化学的ライゲーションには、第１の化学成分と第２の化学成分との間の選択的共有結合の形成が含まれる。第１および第２の成分に存在する一意性の相互反応性官能基を用いて、ライゲーション反応化学選択性を付与することができる。たとえば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的ライゲーションには、適合性の、一意性の相互反応性Ｃ末端およびＮ末端アミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドセグメントの化学選択的反応が含まれる。この目的のために、いくつかの異なる化学方法が用いられており、その例としては、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３４）、チオエステル形成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５）、チオエーテル形成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１〜８８７４）、ヒドラゾン形成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ等、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３〜３３８）、ならびにチアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４〜９１８９；Ｔａｍ他、ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５５８９３５６号）、または他の方法によるもの（参照により本明細書に組み込むものとするＹａｎ、Ｌ．Ｚ．およびＤａｗｓｏｎ、Ｐ．Ｅ．の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５２６〜５３３；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ等、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３（９）：１３３１〜１３３４；Ｓａｘｏｎ、Ｅ．等、「Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ」Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２、２１４１〜２１４３）が挙げられる。

これらの方法のなかで、天然型化学的ライゲーション法のみが、ライゲーション部位に天然アミド（すなわちペプチド）結合を有するライゲーション生成物を生じさせる。初期の天然型化学的ライゲーション方法論（Ｄａｗｓｏｎ等、上記、およびＷＯ９６／３４８７８）は、ライゲーション部位で天然アミド結合を生じるための強固な方法を証明した。天然型化学的ライゲーションには、Ｃ末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第１のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応が含まれる。チオール交換反応は、最初のチオエステル結合中間体を生じさせ、これは自発的に転位して、ライゲーション部位に天然アミド結合をもたらし、同時にシステイン側鎖チオールを再生する。初期の天然型化学的ライゲーション法の主な欠点は、Ｎ末端システインを必要とすることであり、すなわちこの方法ではＮ末端システインを有するペプチドおよびポリペプチドセグメントの結合のみが可能となる。

このような欠点があるにもかかわらず、システイン以外のＮ末端アミノ酸を有するペプチドの天然型化学的ライゲーションが提案されている（ＷＯ９８／２８４３４）。この提案においては、ライゲーションは、Ｃ末端α−カルボキシチオエステルを有する第１のペプチドまたはポリペプチドセグメント、および式ＨＳ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−ＮＨ−［ペプチド］によって表されるＮ末端のＮ−｛チオール置換補助｝基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドセグメントを用いて行われる。ライゲーションに続いて、Ｎ−｛チオール置換補助｝基が、ＨＳ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−補助基の開裂によって除去され、ライゲーション部位に天然アミド結合が生じる。この方法の１つの限界は、メルカプトエトキシ補助基を使用すると、グリシン残基においてのみ、アミド結合が形成され得ることである。これは、開裂によって第２のペプチドまたはポリペプチドセグメントのＮ置換アミノ酸の位置にグリシン残基を生じるライゲーション生成物を産生することになる。そのため、この方法の実施は、反応後のライゲーション生成物がそのような位置にグリシン残基を含有することを所望する場合にのみ適しており、いずれにしても、ライゲーション収率、前駆体の安定性、およびＯ結合補助基を除去できる可能性が問題となり得る。反応をグリシン残基でのライゲーションに限ることなく、他の補助基、たとえばＨＳＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ−［ペプチド］を用いることができるが、そのような補助基は、結合された生成物から除去することができない。

したがって、有効で容易に除去可能なチオール含有補助基を用いることによって、天然型化学的ライゲーションを多種多様な異なるアミノ酸残基、ペプチド、ポリペプチド、ポリマーおよび他の分子に拡大し、且つライゲーション部位においてそのような分子を天然アミド結合で結合する、広い適用範囲を持った、強固な化学的ライゲーション法が求められている。本発明は、このような要望および他の要望に応えるものである。

本発明は、アミド結合を介するより広範なペプチド、ポリペプチド、他のポリマーおよび他の分子のライゲーションを可能にするために天然型化学的ライゲーションの技法を拡張するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、そのようなタンパク質および誘導化タンパク質のための方法および用途を提供する。本発明は、特に、随意ポリマー修飾された合成生物活性タンパク質、およびそのようなタンパク質を含有する薬剤組成物の合成における使用に好適なものである。

詳細には、本発明は、側鎖が式−Ｓ−Ｒ_ａａを有し、該式中、Ｒ_ａａは、表Ｉの擬似Ａｓｐ、擬似Ｇｌｎ、擬似Ａｓｎ、擬似Ｓｅｒ、擬似Ｔｈｒ、擬似Ｌｙｓ、擬似Ａｒｇ、擬似Ｍｅｔ、擬似Ｐｈｅ、擬似Ｔｙｒ、擬似ホスホｔｙｒ、擬似Ｄｏｐａ、擬似Ｇｌａ、擬似Ｈｉｓ、擬似Ｔｒｐ、擬似Ｌｅｕ、擬似Ｖａｌ、擬似Ｉｌｅ、擬似Ｎ−（エチル）トリフルオロアセトアミド、擬似ＳＢＦ、及び擬似メチルＳＢＦ、から成る群より選択される擬似アミノ酸残基を含有する合成タンパク質を提供する。

本発明は、実施態様として、特に、そのタンパク質がリボソーム特定生物活性タンパク質の持つ生物活性を有する前述の合成タンパク質を提供する。

本発明は、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有する前述のの合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、タンパク質の複数のアミノ酸残基の少なくとも１つが隣接アミノ酸残基に非アミド結合（たとえば、チオエステル結合、チオエーテル結合およびオキシム結合）によって結合している前述の合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、リボソーム特定生物活性タンパク質が哺乳動物のタンパク質（たとえば、ヒト、サル、ウシ、マウス、ブタ、ヒツジ、またはウマのタンパク質）である前述の合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、タンパク質が、タンパク質受容体もしくはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドもしくはそのフラグメント、またはサイトカイン（特に、インターロイキン、リンホカイン、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、赤血球産生刺激タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、増殖因子および単一ペプチドホルモンからなる群から選択されるサイトカイン）の選択された生物活性を有する前述の合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、合成生物活性タンパク質がＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３から選択される合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、１つまたは複数のそれらのアミノ酸残基が１つまたは複数のポリマー付加物によって修飾されているもの、特に合成タンパク質が、リボソームコード化生物活性タンパク質の少なくとも１つのグリコシル化部位に対応するアミノ酸残基において、１つまたは複数のポリマー付加物によって修飾されている１つまたは複数のアミノ酸残基を含むすべての前述の合成タンパク質に関する。

本発明は、さらに、タンパク質がリボソーム特定生物活性哺乳動物タンパク質に関連する生物活性を模倣する生物活性を有し、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有し、且つ側鎖が式−Ｓ−Ｒ_ａａを有し、該式中、Ｒ_ａａはリボソーム特定アミノ酸側鎖の随意置換された末端部分、またはその類似体からなる群から選択される擬似アミノ酸残基を含有する、合成タンパク質を含む分子的に均一な薬剤組成物を提供する。

本発明は、さらに、有効量の薬剤組成物を治療を必要としている個体に投与することを含む、ヒトの疾患または症状を治療する方法を提供するものであって、該薬剤組成物は、それぞれが合成タンパク質を含む１つまたは複数の分子的に均一な薬剤組成物を含み、該合成タンパク質は、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有し、且つ側鎖が式−Ｓ−Ｒ_ａａを有し、該式中、Ｒ_ａａは、リボソーム特定アミノ酸側鎖の随意置換された末端部分、またはその類似体からなる群から選択されるものである擬似アミノ酸残基を含有し、該合成タンパク質は、リボソーム特定生物活性ヒトタンパク質受容体もしくはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドもしくはそのフラグメント、またはサイトカインの生物活性を模倣する生物活性を有するものである。

本発明は、さらに、所望のポリペプチドを合成する方法およびそのような方法によって製造された所望のポリペプチドを提供し、該所望のポリペプチドは、以下の式を有し、
ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ａａ_ｙ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨ
該式中、ＱおよびＷは、それぞれ任意で存在する１つまたは複数の追加のアミノ酸残基を示し、ａａ_ＮＨ２は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示し、ａａ_ｘおよびａａ_ｙは、それぞれ側鎖ｘおよびｙを有する内部隣接アミノ酸残基を示し、ａａ_ＣＯＯＨは、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基を示し、該方法は、
（Ａ）式ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ＣＯＳＲを有し、該式中、Ｒは、アリール、ベンジルおよびアルキル基を非限定的に含むチオエステル基に適合する任意の基である第１のペプチドを、式Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨを有する第２のペプチドに結合し、それによりポリペプチドａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨを形成すること、および
（Ｂ）該ポリペプチドを試薬Ｒ_ａａ−Ｘの存在下でインキュベートすることを含むものであって、該式中、Ｒ_ａａは、アミノ酸残基ａａ_ｙの側鎖の末端部分を模倣する構造を有する基であり、Ｘは、良好な離脱基（特に、Ｆ、ＩまたはＢｒなどのハロゲン）であり、該インキュベーションは、所望のポリペプチドを形成するのに充分な条件下で行われる。

本発明は、さらに、アミノ酸残基ａａ_ｙが、擬似アルギニン、擬似アスパラギン、擬似アスパラギン酸塩、擬似ドパミン、擬似グルタミン酸塩、擬似グルタミン、擬似ヒスチジン、擬似イソロイシン、擬似ロイシン、擬似リジン、擬似メチオニン、擬似フェニルアラニン、擬似セリン、擬似トレオニン、擬似トリプトファン、擬似チロシンおよび擬似バリンからなる群から選択される前述の方法およびポリペプチドの実施態様を提供する。

本発明は、アミド結合を介するより広範なペプチド、ポリペプチド、他のポリマーおよび他の分子のライゲーションを可能にし、それによってそのような分子の化学合成を促進するために天然型化学的ライゲーションの技法を拡張するための方法および組成物に関する。本発明は、さらに、そのようなタンパク質および誘導化タンパク質のための方法および用途をも提供する。本発明は、特に、好ましくは約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有する随意ポリマー修飾された合成生物活性タンパク質およびそのようなタンパク質を含有する薬剤組成物の合成における使用にも好適である。

Ｉ．生物活性ペプチドおよびタンパク質の化学合成
一般的に、生物活性ペプチドおよびタンパク質の合成は、標準的な自動ペプチド合成装置を使用する１９６０年代初期に開発された「メリフィールド」化学反応の段階固相ペプチド合成プロトコルを用いる。そのような合成に固相もしくは液相ライゲーション方法を採用してもよい。そのような化学反応は、多くのポリペプチドを生成するために容易に用いることができるが、それに伴う収量損失、副生成物の生成、および不完全な反応のために、タンパク質または大きいポリペプチドの生成には適さない。

これらの制限に対処するために、化学的ライゲーションの技法は、より大きなポリペプチドおよびタンパク質の合成を達成するために、あらかじめ形成されたペプチドフラグメントを合わせて結合できるように開発されてきた。

化学的ライゲーションには、第１の化学成分と第２の化学成分との間の選択的共有結合の形成が含まれる。第１および第２の成分に存在する一意性の相互反応性官能基を用いて、ライゲーション反応化学選択性を付与することができる。たとえば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的ライゲーションには、適合性の、一意性の相互反応性Ｃ末端およびＮ末端アミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドセグメントの化学選択的反応が含まれる。この目的のために、いくつかの異なる化学反応が用いられており、その例としては、天然型化学的ライゲーション（Ｄａｗｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成化学的ライゲーション（Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３４）、チオエステル形成ライゲーション（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５）、チオエーテル形成ライゲーション（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ等、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１〜８８７４）、ヒドラゾン形成ライゲーション（Ｇａｅｒｔｎｅｒ等、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３〜３３８）、ならびにチアゾリジン形成ライゲーションおよびオキサゾリジン形成ライゲーション（Ｚｈａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４〜９１８９；Ｔａｍ他、ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５５８９３５６号）、または他の方法によるもの（参照により本明細書に組み込むものとするＹａｎ、Ｌ．Ｚ．およびＤａｗｓｏｎ、Ｐ．Ｅ．の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５２６〜５３３；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ等、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３（９）：１３３１〜１３３４；Ｓａｘｏｎ、Ｅ．等、「Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ」Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２、２１４１〜２１４３）が挙げられる。

ライゲーションが、Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドの結合反応を含む場合、好ましくは天然型化学的ライゲーションの手順が用いられる（Ｄａｗｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９８／２８４３４；米国特許出願第０９／０９７０９４、これらすべてを参照により本明細書に組み入れるものとする）。天然型化学的ライゲーションには、Ｃ末端α−カルボキシチオエステル部分を有する第１のペプチドまたはポリペプチドセグメントと、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドとの間の化学選択的反応が含まれる。チオール交換反応は、最初のチオエステル結合中間体を生じ、これは自発的に転位して、ライゲーション部位で天然アミド結合をもたらし、同時にシステイン側鎖チオールを再生する。多くの場合、この天然タンパク質の配列は、Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが天然型化学的ライゲーション反応で合成され、用いられることができるように、適切に配置されたシステイン残基を含むことになる。

この方法は、大きいポリペプチドおよびタンパク質の合成に実用的で強固で有用であることが証明されたが、ライゲーション部位におけるシステイン残基に関する要件がその適応性を制限する。システインは、もっとも一般的でないアミノ酸の１つである。典型的なタンパク質ドメインは、１５０〜２００のアミノ酸を含み、多くのタンパク質は、システイン残基を含有しない長さ６０超のアミノ酸領域を含有する。この問題の１つの解決策には、タンパク質の１つまたは複数の天然アミノ酸残基がシステイン残基で置換された非天然タンパク質を設計し、それによって天然型化学的ライゲーション法の使用を可能にすることが含まれる。この解決策は多くの場合、システイン残基の導入がタンパク質の構造または機能に及ぼす可能性のある予測できない影響によって複雑なものとなる。そのようなシステイン残基は、合成されたタンパク質を共有的に固定化するのに用いることができる。

本発明は、個別に、または組み合わせて用いることのできる、この問題に対する２つの別の解決策を提供する。第１の解決策（本明細書では「擬似天然型化学的ライゲーション」と呼ぶ）には、タンパク質合成に用いられるペプチドのあらかじめ選択された位置で、非天然擬似アミノ酸残基を用いることが含まれる。そのような擬似アミノ酸の構造は、システインの構造、および合成されるタンパク質のあらかじめ選択された位置で天然に見出されるアミノ酸の構造の両方を模倣したものである。第２の解決策（本明細書では「拡張天然型化学的ライゲーション」と呼ぶ）は、参照により本明細書に組み込むものとする米国特許出願第６０／２３１３３９号（Ｋｅｎｔ他、２０００年９月８日出願）に記載されており、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第１の成分を、酸安定性Ｎ置換、好ましくはＮα−置換、２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む第２の成分と結合することを含む。これらの解決策は、それぞれ以下に詳しく説明する。

Ａ．擬似天然型化学的ライゲーション
擬似天然型化学的ライゲーションは、天然型化学的ライゲーションによってライゲーション部位に生じるシステイン側鎖のチオアルキル化を対象とする。好ましい態様は、少なくとも１つのペプチドが、適切な保護基で保護されたチオール側鎖を有する天然システインを含有する、システインライゲーション部位のチオアルキル化である。

本発明の好ましい実施形態において、システイン基のチオール部分は、所望の側鎖、たとえばリボソーム特定アミノ酸の側鎖、そのようなアミノ酸の類似体、非リボソーム特定アミノ酸に修飾されている。本明細書では、リボソーム特定アミノ酸とは、タンパク質翻訳のプロセスにおいてリボソームによって認識され、リボソーム生成タンパク質に組み込むことのできるアミノ酸である。相当数の公表された文献が存在し、システイン側鎖チオール部分の化学修飾を記載している（たとえば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ」Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ等編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２０００）を参照のこと）。Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．は、天然アミノ酸側鎖の化学特性を模倣するシステイン残基側鎖の変換を記載している（たとえば、Ｋａｉｓｅｒ、Ｅ．Ｔ．等、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４ Ｎｏｖ ２；２２６（４６７４）：５０５〜１１を参照のこと）。さらに、標識をペプチドまたはタンパク質に導入するためのシステイン側鎖の使用が記載されている。システイン側鎖修飾は、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｇａｒｙ Ｅ．Ｍｅａｎｓ等（１９７１、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｇｌａｚｅｒ、Ａ．Ｎ．等（１９７５、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＲＬ Ｌｕｎｄｂｌａｄ（１９９１、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）に概説されている。Ｔａｍ等（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９８）４６：３１９〜３２７）は、非システイン天然型化学的ライゲーションでのホモシステイン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＳＨ）の使用、それに続くメチルｐ−ニトロベンゼンスルホネート（メチル化試薬）を用いるチオアルキル化によるホモシステイン側鎖の天然メチオニン側鎖（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_３）への変換を開示している。本発明はまた、ホモシステインを擬似アミノ酸、すなわちメチオニン以外のアミノ酸に変換するために用いることもできる。しかしながら、本明細書に記載のシステインの変換と同様に、本発明によれば、変換を望まない少なくとも１つの天然システインを含有するペプチドの場合、ジスルフィドペアリングに関わる天然システインの分解を回避するために、保護基を用いる必要がある。適切な保護基は以下に記載する。

擬似天然型化学的ライゲーション法は、ある種のリボソーム特定アミノ酸の側鎖（たとえば、グリシン、アラニン、バリンおよびプロリンの側鎖）の模倣を促進しないが（しかしながら、アラニンの側鎖は脱硫反応によって形成され得る（参照により本明細書に組み込むものとするＹａｎ、Ｌ．Ｚ．およびＤａｗｓｏｎ、Ｐ．Ｅ．の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５２６〜５３３））、多くのリボソーム特定または非コード化アミノ酸を模倣する側鎖を形成するために用いることができる。本発明の擬似天然型化学的ライゲーション法によって生成されたアミノ酸は、チオエーテル結合を含有し、β分岐を持たない（それらのアミノ酸はすべてベータ位でメチル基を含む、すなわちａａ−βＣＨ_２−Ｓ−であるため）。したがって、β分岐アミノ酸、イソロイシンおよびトレオニンの擬似アミノ酸種は、β配置および付随の制約を有することなく、ペンダント側鎖構造を持たせることができる。

注目に値すべきなのは、本発明の方法は、リボソーム特定アミノ酸と同じ長さ、あるいはそれよりも長い、または短いアミノ酸側鎖を形成するために用いることができることである。側鎖長のそのような変更は、三次元配座（コンフォメーション）を安定にして（または、不安定にして）、タンパク質安定性を増大する（または、タンパク質がその配座を変え、それによって天然タンパク質に受容されるものと異なる範囲の基質、阻害因子、受容体、リガンドなどを受容する能力を高める）ために用いることができる。たとえば、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｂｒ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨは、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨを生じる（そのような「擬似グルタミン酸塩」は、１つの追加の側鎖原子、すなわち−Ｓ−基を有し、あるいはアスパラギン酸塩の代わりに用いられた場合、２つの追加の側鎖原子、すなわち−ＣＨ_２−Ｓ−基を有する）。他の側鎖は、側鎖に同じ数の原子を有するが、チオエーテル結合（−Ｓ−）を包含する点で異なる。たとえば、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｂｒ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＰＧ、それに続くＰＧの除去によって、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２が生じる。結果として生じた構造は、側鎖に追加の原子を持たないが、１つの−ＣＨ_２−基が、−Ｓ−で置換されている。メチオニンは別の例であり、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｉ−ＣＨ_２−ＣＨ_３によって、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_３が生じ（天然Ｍｅｔ構造、Ｍｅｔ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_３に対して）、したがってチオエーテルが置き換えられている。アルギニンも同様に、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｂｒ−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ_２）（＝ＮＨ_２ ^＋））によって、Ｃｙｓ−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ（（−ＮＨ_２）（＝ＮＨ_２ ^＋））が生じる。好ましくは、所望でない副反応を回避するために、特に擬似リジンを構成する場合は、反応性アミノ基の保護を用いることができる。ひとたびチオアルキル化反応が遂行されたら、その保護基を除去できる。

一般に、できる限り厳密に天然タンパク質を模倣することを望む場合、タンパク質のそのような位置に通常存在するリボソーム特定アミノ酸と同じ長さの側鎖長を有する擬似アミノ酸分子を用いるのがもっとも好ましく、リボソーム特定アミノ酸より１原子長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子の使用は好ましさに劣り、リボソーム特定アミノ酸より２原子長い側鎖長を有する擬似アミノ酸分子の使用はさらに好ましさに劣る。さらに、遺伝子変化が機能を崩壊する見込みがないか、あるいは関連タンパク質のその部位でアミノ酸が保存されているような位置のシステインライゲーション部位を選択することが好ましい。そのような部位は、アラニンスキャニング、ホモロジーモデリングおよび他の方法によって同定できる。

擬似天然型化学的ライゲーションでは、天然型化学的ライゲーションと同様に、アミノ末端システイン残基を含有するペプチドを、カルボキシ末端チオエステルを有するペプチドに結合する。その後、システインのチオール側鎖を、式Ｒ_ａａ−Ｘであって、該式中、Ｘは良好な離脱基であり、Ｒ_ａａは、その構造がリボソーム特定アミノ酸または合成アミノ酸の側鎖の末端部分を模倣する基である化合物と反応させる。

注目に値すべきなのは、擬似天然型化学的ライゲーション反応は、システイン側鎖の天然Ｌ立体配置、またはＤ立体配置を用いて作用することである。Ｄ立体配置の使用によって、そのライゲーション部位にプロテアーゼ耐性を付与することができ、したがってタンパク分解に対する高い安定性が所望であるとき、その使用が望ましい可能性がある。しかしながら、Ｄ−システインの使用においては、その側の主鎖構造が変更されることになる。そのような変更は、プロテアーゼ耐性に加えて、生物活性を変えるのに望ましい可能性がある。しかしながら、生物活性への影響力を最小にするために、その分子の無秩序末端の無秩序領域など可撓性の高い部位、たとえば結果として生じる折りたたまれた分子の表面に位置することになる無秩序ループなどにＤ−システインを配置することが好ましい。望ましくは、擬似天然型化学的ライゲーション反応は、合成分子の表面上に大きな荷電側鎖（たとえば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＧｌｕの側鎖）を配置するために用いることができる。

適切な良好な離脱基、Ｘ、の例には、ハロゲン、特にヨウ素および臭素が含まれる。Ｒ_ａａ基の例には、ＰＯ_４、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ、ＣＯＮＨ_２、グアニジニウム、アミン、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、イミダゾール、アルキル化イミダゾール、インドール、またはアルキル化インドール基が含まれる。

用いるＲ_ａａの選択は、特定の位置に存在することを所望するアミノ酸側鎖に応じて決まることになる。したがって、たとえば、
ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ａａ_ｙ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨ
であって、該式中、ＱおよびＷは、それぞれ任意で存在するか、または存在しない追加のアミノ酸残基を示し、ａａ_ｘおよびａａ_ｙは、内部隣接残基を示し（それぞれ側鎖ｘおよびｙを有する）、ａａ_ＮＨ２およびａａ_ＣＯＯＨは、それぞれポリペプチドまたはタンパク質のアミノ（Ｎ−）末端残基およびカルボキシ（Ｃ−）末端残基を示すアミノ酸配列を有する所望のポリペプチドまたはタンパク質は、それぞれ
ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ＣＯＳＲ および Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨ
であって、該式中、Ｃｙｓは、システインによるａａ_ｙの置換を示し、Ｒは、これに限定されるものではないが、アリール、ベンジルおよびアルキル基を含む、チオエステル基と適合する任意の基である上記の２つのペプチドフラグメントを調製することによって合成できる。Ｒの例には、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、ベンジルエステルおよびメルカプトプロピオン酸ロイシンエステルが含まれる（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｃａｎｎｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９９５）３６：１２１７〜１２２０；Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９６／３４８７８、Ｋｅｎｔ他、ＷＯ９８／２８４３４；Ｉｎｇｅｎｉｔｏ等、ＪＡＣＳ（１９９９）１２１（４９）：１１３６９〜１１３７４；Ｈａｃｋｅｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９９）９６：１００６８〜１００７３を参照のこと）。他の例には、同様によく知られているインテイン媒介の生物学的技法によって生成することのできるジチオトレイトール、あるいはアルキルまたはアリールチオエステルが含まれ（たとえば、Ｃｈｏｎｇ等、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７〜２８１；Ｃｈｏｎｇ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９〜５１１５；Ｅｖａｎｓ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６〜２２６４；Ｃｏｔｔｏｎ等、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（９）：２４７〜２５６を参照のこと）、次いでそれらのフラグメントを合わせて結合することによって以下が形成される。
ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨ

次いで、結合されたフラグメントを、式中、Ｒ_ｙは側鎖ｙの構造を模倣する側基であるＲ_ｙ−Ｘと反応させる。この反応は、システインのチオール基を「擬似ｙ」側鎖に変換するのに充分な条件下で行われる。たとえば、Ｒ_ａａがＣＨ_２−ＣＯＯＨまたは（ＣＨ_２）_２−ＣＯＯＨとなるように選択される場合、この反応は、アスパラギン酸塩（「擬似Ａｓｐ」）またはグルタミン酸塩（「擬似Ｇｌｕ」）の構造および機能を模倣するアミノ酸残基を形成することになる。理解されるように、上記の説明を考慮すれば、３つ以上のペプチドフラグメントを用いてより複雑な合成を行うことができる。

本発明による「擬似アミノ酸」を含む天然型化学的ライゲーションは、タンパク質を化学合成するための天然型化学的ライゲーション方法の適応性を著しく拡大する。「擬似アミノ酸」を含む天然型化学的ライゲーションは、ライゲーションステップにおいて同じ化学反応を用いて、天然チオール含有側鎖官能基とＣｙｓ残基でペプチド結合を形成し、一意性の第２のステップにおいて、ライゲーション部位のＣｙｓの天然チオール含有側鎖が化学選択的反応によって変換されて、遺伝コード化アミノ酸と同じ官能基を含有する非天然側鎖を生じる。

たとえば、ライゲーション部位のシステインは、水中、ｐＨ中性でブロモ酢酸（または他のハロ酢酸）と反応させることができ、ライゲーション部位のＣｙｓの非保護チオールのみがこのような条件下で反応して、ライゲーション部位にＳ−カルボキシメチル化残基を含有するポリペプチド、すなわち、
を生じる。

この非天然アミノ酸は、側鎖にカルボキシル成分、すなわちグルタミン酸残基およびアスパラギン酸残基と同様な官能基、を含有する。このＳ−カルボキシメチル化Ｃｙｓを、本明細書では、（１つの過剰な側鎖原子が存在し、チオエーテル結合を形成する−Ｓ−基である場合）「擬似グルタミン酸」（「擬似グルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）」「擬似Ｇｌｕ」）と呼ぶ（２つの過剰な側鎖原子が存在し、その１つがチオエーテル結合を形成する−Ｓ−基である場合、「擬似アスパラギン酸」と呼ぶことができる）。多くのタンパク質の場合、この「擬似アミノ酸」であっても荷電カルボキシル化側鎖の単純保存は、タンパク質に所望の特性を保持または付与するのに充分であろう。重要な相違は、それが、適切なシステインのない位置で天然型化学的ライゲーション部位として機能することである。

ライゲーション部位でＣｙｓ残基の側鎖チオールを修飾するために他の試薬を用いることによって、他の「擬似アミノ酸」残基が生じ得る。たとえば、チオールのハロアセトアミド、たとえばブロモアセトアミドとの反応によって、ライゲーション部位に「擬似グルタミン」、すなわち、
が生じる。
同様に、Ｎ−保護ハロアルキルアミン、たとえば、
との反応、それに続くアミノ保護基の除去によって、「擬似リジン」残基、すなわち、
が生じる。
ライゲーション部位のＣｙｓ残基の適切なハロアルカン、たとえば、
との反応によって、「擬似ロイシン」アミノ酸、すなわち、
が生じる。
Ｒは、Ｈ、ＯＨ、アリールなどであり得る、他の適切に選択されたアリール含有ハロゲン化物、たとえば、
を、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ残基に対応する擬似アミノ酸、すなわち、
を生成するために同様に用いることができる。

このアプローチの著しい特徴は、ライゲーション部位に存在するもの以外のＣｙｓ残基の化学修飾を防ぐために、反応セグメントの修飾を望まないシステイン残基が、たとえばＣｙｓ（Ａｃｍ）として側鎖保護されること、または反応セグメントの他のＣｙｓ残基が、ライゲーション後の化学修飾反応による同一「擬似アミノ酸」の同時形成に向けられることである。同じ原理がライゲーション部位でのホモシステインの使用に適用されることが理解されるであろう。さらに、セレノシステインがシステイン媒介天然型化学的ライゲーションによってライゲーション部位で用いられ、類似のアルキル化反応によって変換されて、セレノエーテル基がチオエーテル基に置き換わる本発明の擬似アミノ酸が生成されることも理解されるであろう。

本明細書では、記号φは、ベンジル基を示し、ＩＭは、イミダゾール基を示し、ＩＮは、インドール基を示し、ＰＧは、保護基を示す。以下は、本発明によって擬似アミノ酸残基を含有するペプチドの合成に用いることのできるＲ_ａａ側基の概要である（Ｘがハロゲン（Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ）である場合であり、ＩおよびＢｒは、ほとんどの場合に好ましく、Ｆは、φ結合に好ましい）。

塩基性アミノ酸：
Ｌｙｓ（余分な原子無し）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＰＧ、続いて脱保護することにより、−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２が得られる。
Ａｒｇ（余分な原子無し）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ_２）（＝ＮＨ_２ ^＋））により
−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（（ＮＨ_２）（＝ＮＨ_２ ^＋））が得られる。
Ｈｉｓ（余分な原子２個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＩＭ−ＰＧ、続いて脱保護することにより
−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＩＭが得られる。

酸性アミノ酸：
Ａｓｐ（余分な原子２個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨが得られる。
Ｇｌｕ（余分な原子１個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＯＯＨが得られる。

非荷電極性アミノ酸：
Ｔｙｒ（余分な原子無しまたは１個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｆ−φ−ｐＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−φ−ｐＯＨが得られる（余分な原子無し、同じ幾何配置）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ_２−φ−ｐＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−φ−ｐＯＨが得られる（余分な原子１個）。
Ｇｌｎ（余分な原子１個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ_２）により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ_２）が得られる。
Ａｓｎ（余分な原子２個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ_２）により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）（ＮＨ_２）が得られる。
Ｓｅｒ（余分な原子２ないし３個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２ＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２ＯＨが得られる（余分な原子２個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＨ_２ＯＨにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２ＯＨが得られる（余分な原子３個）。
Ｔｈｒ（余分な原子２ないし３個、β分岐が無い）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ_３）（Ｏ−ＰＧ））に続いてＰＧを除去することにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ_３）（ＯＨ））が得られる（余分な原子２個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＨ（（ＣＨ_３）（Ｏ−ＰＧ））に続いてＰＧを除去することにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（（ＣＨ_３）（ＯＨ））が得られる（余分な原子３個）。

非極性アミノ酸：
Ｌｅｕ（余分な原子１ないし２個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ（（ＣＨ_３）（ＣＨ_３））により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ（（ＣＨ_３）（ＣＨ_３））が得られる（余分な原子１個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−（（ＣＨ_３）（ＣＨ_３））により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（（ＣＨ_３）（ＣＨ_３））が得られる（余分な原子２個）。
Ｉｌｅ（余分な原子２ないし３個、β分岐無し）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３が得られる（余分な原子２個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｘ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３により−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３が得られる（余分な原子３個）
Ｐｈｅ（余分な原子１ないし２個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｆ−φにより−ＣＨ_２−Ｓ−φが得られる（余分な原子１個）。
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｂｒ／Ｉ−ＣＨ_２−φにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＨ_２−φが得られる（余分な原子２個）。
Ｍｅｔ（余分な原子無し）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｉ−ＣＨ_２−ＣＨ_３により−ＣＨ_２−ＳＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_３が得られる。
Ｔｒｐ（余分な原子１個）
−ＣＨ_２−ＳＨ ＋ Ｆ−ＩＮにより−ＣＨ_２−Ｓ−ＩＮが得られる。

一般的な擬似化学的ライゲーション反応を図１に例示する。好ましい擬似アミノ酸を形成するために用いることのできる好ましいＲ_ａａおよびＸ基を表Ｉに示す。残基は非荷電として示すが、ＮＨ_２またはＣＯＯＨなどのイオン性基は、それらの荷電形態であるか、または塩として提供されてもよいことが理解されるであろう。擬似リジンを形成するために用いられる反応を除いて、すべての反応は水性であり、ｐＨ８〜９で行われ、反応の化学量および最適化は、標準的なプロトコルに従って調整することができる。擬似リジンは、ｐＨ８〜９で行われる水性反応、それに続くピペリジン／Ｈ_２Ｏ（トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））中の反応で形成される。

本発明のさらなる実施形態において、システイン残基のチオール基は、酸化するか（−ＳＨ→−ＳＯ_３ ⁻）、または酸素と置換してセリンを形成することができる（−ＳＨ→−ＯＨ）。そのような置換は、システインをトシル−Ｃｌ（Ｔｏｓ−Ｃｌ）と反応させ、それによってチオール基−ＳＨを、−Ｓ−Ｔｏｓ基に変換することによって達成できる。強塩基の存在下、ＯＨはＴｏｓ置換基に代わり、それによって所望の−ＯＨ基が形成される。

さらに、システインのチオール基は、以下に示すように、マイケル付加反応によって修飾することができ、
該式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、アルキルアリール、アミノであるか、またはポリマー分子であって、分岐または非分岐、ランダムまたはブロックであってよい。

本発明のさらなる態様は、アミノ末端システイン残基がアルキルアミノ（好ましくはメチルアミノ）部分を含むように修飾されたペプチドフラグメントの使用を対象とする。

アルキルアミノ部分のアミノ基を保護することによって、ペプチドＡを一般式ペプチドＢ−αＣＯＳＲを有する第２のペプチドと結合することができる。保護基の除去によって、一般式ペプチドＣ−αＣＯＳＲを有するさらなるペプチドを、前に結合したペプチドに結合し、分岐ペプチド複合体を形成することができる。

この分岐タンパク質は依然としてシステインのチオール基を含有するので、上に記載した様式でＲ_ａａ−Ｘと反応し、それによって側鎖のさらなる修飾が可能となる。特に、Ｒ置換基としてアルキルアミドを用いることによって、別のアミノ基を分子に導入することができ、それによってさらなる分岐、またはさらなるライゲーション反応が可能となる。

本発明のさらなる実施形態において、システイン側鎖の修飾を用いて、任意の種々の標識、または結合分子を導入することができる。たとえば、電子スピン共鳴、蛍光（たとえば、アンモニウム４−クロロ−７−スルホベンゾ−フラザン（ＳＢＦ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、または磁気画像法によって検出可能な標識を用いることができる。そのような標識付けは、疾患および症状の診断において、ならびに分子相互作用の分析（たとえば、内在性膜タンパク質における距離の測定）において有用である。本発明の方法は、標識および結合分子の使用に関して、いくつかの顕著な利点を有する。そのような置換基は、部位特異的、非ランダム様式で組み込むことができる。さらに、この標識部分は、続いて起こる化学的ライゲーションステップ（存在する場合）に対して安定であることだけが必要とされる。そのような反応は一般に、非常に穏やかな条件下で行われる（たとえば、天然型化学的ライゲーション、他のシステイン残基のチオール基を保護するために随意用いられる可能性のあるＡｃｍまたは他の保護基の除去（Ｈｇ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２など）、および逆相ＨＰＬＣ精製に用いられるものなど）。そのような追加のチオール基の保護は、Ｃｙｓ含有ペプチドの酸化性重合を妨げ、したがってそれらの精製および取扱いを容易にする。

Ｂ．拡張天然型化学的ライゲーション
上述したように、天然タンパク質の配列が適切なシステイン残基を含有せず、ポリペプチドのＮ末端にシステイン残基を導入するように天然タンパク質配列を修飾することが不都合であるか、または望ましくない場合、そのＮ末端がＮ置換、好ましくはＮα−置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含有し、それによってポリペプチド欠失システイン残基に天然型化学的ライゲーションの原理を用いることができるように修飾されたポリペプチドを結合するために、「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法を用いることができる（参照により本明細書に組み込むものとする米国特許出願第６０／２３１３３９号を参照のこと）。

「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法には、カルボキシルチオエステル、より好ましくはα−カルボキシルチオエステルを含む第１の成分を、酸安定性Ｎ置換、好ましくはＮα−置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含む第２の成分と結合することが含まれる。第１成分のカルボキシチオエステルと、第２成分のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールのチオールとの間の化学選択的反応は、チオエステル結合中間体を経て進み、最初のライゲーション生成物に分解する。より具体的には、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で起こるチオール交換は、チオエステル結合中間体ライゲーション生成物を生じ、これは自発転位の後、アミノアルキルチオール成分がそれぞれ式ＩまたはＩＩを有するかどうかに応じて、５員または６員環中間体を経て最初のアミド結合ライゲーション生成物を生じ、
該式中、Ｊ１は、随意保護された１つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に機能化された表面、リンカーまたは検出可能マーカー、あるいは化学ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合性の他の任意の化学部分であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、またはＣ１と共役した電子供与基であるが、ただしＲ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、Ｃ１と共役した電子供与基を含み、Ｊ２は、随意保護された１つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドまたはポリペプチド、あるいはそのようなペプチドまたはポリペプチドの部分、ポリマー、色素、適切に機能化された表面、リンカーまたは検出可能マーカー、あるいは化学ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合性の他の任意の化学部分である。

ライゲーション部位のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−（Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、生成物への損傷なしに、ペプチド適合性条件下で除去することができ、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式ＩＩＩの最終ライゲーション生成物を生じる。
該式中、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、上に定義したとおりである。

Ｒ１、Ｒ２およびＲ３基は、ペプチド適合性開裂条件下でＮ−Ｃ１結合の開裂を促進するように選択される。たとえば、電子供与基は、特にＣ１に共役している場合、Ｃ１で開裂を促進する共鳴安定化カチオンを形成するために用いることができる。この化学的ライゲーション反応は、好ましくは、賦形剤としてチオール触媒を含み、中性に近いｐＨ条件、水性または混合有機−水性条件で行われる。第１および第２成分の化学的ライゲーションは、５または６員環を経て進行することができ、５または６員環は自発転位を受けて、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物を生じる。第１および第２の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物は式ＩＶまたはＶを有し、
該式中、Ｊ１、Ｊ２およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、上に定義したとおりであり、Ｚ２は、アミノ酸側鎖、またはその側鎖の誘導体である。

Ｎ置換アミド結合ライゲーション生成物の共役電子供与基Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３は、Ｎ−Ｃ１結合の開裂、およびＮ置換アミド結合ライゲーション生成物からの２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの除去を促進する。ペプチド適合性開裂条件下でのＮのアルキルまたはアリールチオール鎖の除去によって、ライゲーション部位に天然アミド結合を有するライゲーション生成物が生じる。第１および第２成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、ライゲーション生成物は以下の式を有することになる。

式ＩのＲ１置換基の例を表ＩＩに示す。

式ＩＩのＲ１、Ｒ２およびＲ３置換基の例を表ＩＩＩに示す。

Ｎ置換２炭素鎖化合物と同様に、オルトまたはパラ位におけるベンジルおよびピコリル電子供与置換基Ｒ１’、Ｒ３’およびＲ５’の位置決定は、ライゲーションに続くＮα−Ｃ１結合の強固な開裂のためにＣ１炭素に対する電子共役を維持する必要がある。しかしながら、Ｒ２およびＲ３がＣ２およびＣ３と共にベンジル基を形成するとき、Ｒ１’およびＲ３’の少なくとも１つは、強い電子供与基を含み、ここでＲ１’またはＲ３’は、メトキシ（−ＯＣＨ３）、チオール（−ＳＨ）、ヒドロキシル（−ＯＨ）およびチオメチル（−ＳＣＨ３）から選択される。Ｒ２およびＲ３が水素であるＮ置換３炭素鎖チオールの場合、Ｒ１は、Ｒ１’、Ｒ３’およびＲ５’が強い電子供与基または中強度の電子供与基、あるいはそれらの組み合わせを含むベンジルまたはピコリル基を含む。Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールと同様に、強い電子供与基は、ライゲーションに続く開裂に対する３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの感受性を高める。したがって、特定の電子供与基またはその組み合わせはそれに応じて選択できる。

Ｎ置換２炭素鎖化合物と同様に、本発明のＮ置換３炭素鎖化合物は、対象となる構成において置換に利用できるとき、Ｒ１’およびＲ５’位のＲ１の置換基としてチオールを含むことができる。ここでも、電子供与チオール基はＣ１と共役し、これらの位置におけるその導入は、化合物が６員環のライゲーション事象形成のための２つの経路を有することを可能にする。これはさらに、α−カルボキシチオエステルとの反応に利用できるチオールの局所濃度を高め、構造的制約の点から別の配位を提供し、ライゲーションを向上することができる。

本発明のＮ末端Ｎ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の合成は、たとえばスキームＩおよびスキームＩＩによって本明細書に記載のとおり、且つ当分野で知られている標準的な有機化学技法に従って実行することができる。たとえば、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第４版、Ｊ．Ｍａｒｃｈ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２；「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ編、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８９を参照されたい。それらのアミノ酸は、溶液中で、ポリマー担持型合成によって、またはその組み合わせによって合成することができる。好ましいアプローチは、Ｎα−保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体を用いる。合成に用いられる試薬は、多くの製造業者から入手できる。さらに、出発成分および種々の中間体、たとえば個々のアミノ酸誘導体などは、キットなどで提供され、後の使用のために貯蔵できることが充分に理解されるであろう。

本発明のＮ末端Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸の調製において、保護基手順が用いられる。種々の合成手順一般において用いられる好ましい保護基（ＰＧ）は、固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）に適合性である。場合によってはさらに、異なる条件下で除去可能な直交性の保護基を用いる必要がある。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適している（たとえば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ編、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、１９９８；「Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；「Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；および「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ編、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９４を参照のこと）。例には、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、Ｂｐｏｃ、Ｔｒｔ、Ｎｐｓ、ＦｍｏｃＣｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、ＮＳＣ、ＭＳＣ、Ｄｄｅなどが含まれる。硫黄部分の場合、適切な保護基の例には、これに限定されるものではないが、ベンジル、４−メチルベンジル、４−メトキシベンジル、トリチル、ＡＣＭ、ＴＡＣＡＭ、キサンチル、ジスルフィド誘導体、ピコリルおよびフェナシルが含まれる。

より具体的には、このＮα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、スキームＩ（Ｎα−置換前駆体の固相調製）、スキームＩＩ（Ｎα−置換前駆体の液相調製）に従って調製することができる。スキームＩにおいて、Ｎα置換−２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、ポリマー担持型有機合成の標準方法を用いて固相上で直接組み上げされるが、一方スキームＩＩのＮα−保護、Ｎアルキル化、Ｓ保護、アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体は、標準的なカップリングプロトコルを用いて樹脂に結合される。ラセミまたはジアステレオマー生成物が生成される場合、拡張天然型化学的ライゲーションに用いる前に、標準的な方法によるこれらの分離が必要となる可能性がある。
スキームＩ
ＥＣＬ補助誘導化分子の固相合成
スキームＩＩ

α−カルボキシチオエステルは、実施例を含む本明細書で記載の技法など、当分野で知られている標準的な技法に従う化学または生物学法によって生成することができる。化学合成の場合、α−カルボキシチオエステルペプチドは、溶液中、またはチオエステル生成樹脂から合成することができ、その技法はよく知られている（たとえば、Ｄａｗｓｏｎ等、上記；Ｃａｎｎｅ等、上記；Ｈａｃｋｅｎｇ等、上記、Ａｉｍｏｔｏ等を参照のこと）。たとえば、化学合成チオエステルペプチドは対応するペプチドα−チオ酸から製造することができ、ペプチドα−チオ酸は、樹脂法が好ましいが、チオエステル樹脂上、または溶液中で合成することができる。このペプチドα−チオ酸は、対応する３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステル、対応するベンジルエステル、または任意の多様なアルキルチオエステルに変換することができる。これらのチオエステルはすべて、ライゲーション反応のための充分良好な離脱基を提供し、３−カルボキシ−４−ニトロフェニルチオエステルは、アルキルチオエステルに比べてより反応性である可能性のある、対応するベンジルチオエステルよりもいくらか速い反応速度を示す。別の例として、トリチル関連メルカプトプロピオン酸ロイシンチオエステル生成樹脂は、Ｃ末端チオエステルを構成するために用いることができる（Ｈａｃｋｅｎｇ等、上記）。Ｃ末端チオエステル合成も、ジアゾメタンまたはヨードアセトニトリルによる活性化、それに続く適切なチオールによる置換によって、３−カルボキシプロパンスルホンアミド安全捕捉（セイフティーキャッチ）リンカーを用いて達成することができる（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ他、上記；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ等）。

本発明のＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール成分の、第１カルボキシチオエステル成分とのライゲーションによって、ライゲーション部位にＮ置換アミド結合を有するライゲーション生成物が生じる。この反応のライゲーション条件は、チオエステルのＮ置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール部分との選択的反応性を維持するように選択される。好ましい実施形態において、ライゲーション反応は、ｐＨ６〜８を有する緩衝液中で実行され、好ましいｐＨの範囲は６．５〜７．５である。この緩衝液は、水性、有機性、またはその混合物であることができる。ライゲーション反応はさらに、１種または複数の触媒および／または１種または複数の還元剤、脂質、洗浄剤、他の変性剤または可溶化試薬などを含むことができる。好ましい触媒の例は、チオールおよびホスフィン含有部分、たとえばチオフェノール、ベンジルメルカプタン、ＴＣＥＰおよびアルキルホスフィンなどである。変性剤および／または可溶化剤の例には、グアニジニウム、尿素の水またはＴＦＥ、ＨＦＩＰ、ＤＭＦ、ＮＭＰなど有機溶媒溶液、水、またはグアニジニウムおよび尿素水溶液と混合したアセトニトリルが含まれる。温度もライゲーション反応の速度を調節するために利用することができ、通常は５℃から５５℃の間であり、好ましい温度は１５℃から４０℃の間である。例として、ライゲーション反応は、ｐＨ６．８から７．８の間で、６Ｍグアニジニウム中の２％チオフェノールを用いる反応系において良好に進行する。

Ｎ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオールの場合、ライゲーション事象は、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間に起こるチオール交換に起因する。この交換によってチオエステル結合中間体ライゲーション生成物が生成され、これは自発転位の後、５員環中間体を経て、ライゲーション部位に除去可能なＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］を有し、置換基は上に定義したとおりである式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１（Ｒ１）−Ｃ２−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２の最初のライゲーション生成物を生じる。このライゲーション部位のＮ置換２炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチド適合性条件下で除去することができ、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終ライゲーション生成物を生じる。

Ｎ置換３炭素鎖アリールまたはアルキルチオールの場合、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間のチオール交換によってチオエステル結合中間体ライゲーション生成物が生成され、これは自発転位の後、６員環中間体を経て、ライゲーション部位に除去可能なＮ置換３炭素鎖アルキルまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｎα（Ｃ１−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ３（Ｒ３）−ＳＨ）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｊ２の最初のライゲーション生成物を生じる。このライゲーション部位のＮ置換３炭素鎖アリールチオール［ＨＳ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−］は、ペプチド適合性条件下で除去することができ、ライゲーション部位に天然アミド結合を有する式Ｊ１−ＨＮ−ＣＨ（Ｚ１）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（Ｚ２）−ＣＯ−Ｊ２の最終ライゲーション生成物を生じる。

Ｎ置換アルキルまたはアリールチオール基の除去は、Ｎ−Ｃ１結合の開裂を促進し、ライゲーション部位に安定化非置換アミド結合を得るために、好ましくは酸性条件で行われる。「ペプチド適合性開裂条件」とは、ペプチドに適合性であり、ライゲーション生成物からのアルキルまたはアリールチオール部分の開裂に適した物理的化学的条件を意味する。一般にペプチド適合性開裂条件は、用いられるα−置換化合物に応じて選択され、これは通常のよく知られたアプローチによって容易に推測できる（たとえば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ編、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、１９９８；「Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；「Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；および「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ編、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９４を参照のこと）。

たとえば、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ３置換基が、メトキシ、ヒドロキシ、チオールまたはチオメチル、メチルなどを含む場合、除去のためのより普遍的な方法は、ペプチド合成化学に典型的な酸性開裂条件を含む。これには、還元試薬および／またはスカベンジャ系（たとえば、無水フッ化水素（ＨＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、またはトリメチルスルホニルフルオロ酢酸（ＴＭＳＦＡ）などの酸）を含むか、または含まない、強酸性条件または水−酸性条件下でのＮ−Ｃ１結合の開裂が含まれる。より具体的な酸性開裂系は、所与の構成体に関してアリールまたはアルキルチオール部分を除去するためにＮα−Ｃ１結合の開裂を最適化するように選択することができる。そのような条件はよく知られており、ペプチドの完全性の維持に適合する。特にペプチドまたはポリペプチド配列にトリプトファンが存在する場合、トリプトファン側鎖の遊離アリールまたはアルキルチオール部分との反応を回避するために、チオールスカベンジャを含むことができる。チオールスカベンジャの例には、エタンジオール、システイン、β−メルカプトエタノールおよびチオクレゾールが含まれる。

他の特殊な開裂条件には、ピコリル基が置換基であるときの光または還元型開裂条件が含まれる。例として、Ｒ１、またはＲ２およびＲ３置換基がピコリル部分を含むとき、光分解（たとえば、紫外光）、亜鉛／酢酸、または電気分解還元を、標準的なプロトコルに従って開裂のために用いることができる。Ｎ置換２炭素鎖チオールのＲ１がＲ１にチオメタンを含む場合、水銀またはＨＦ開裂を用いることができる。この開裂系はさらに、固体支持体からの同時開裂のために、および／または第１または第２ライゲーション成分が他の保護基を含むときの脱保護試薬として用いることができる。

本発明の一実施形態において、Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールは、合成生物活性タンパク質を生じる拡張化学的ライゲーションの基質として用いることのできる適切にＮ末端誘導化されたポリペプチドを得るためのペプチド合成ステップ（特に自動ペプチド合成、ならびに直交型および収斂型ライゲーションストラテジー）において用いられる。そのような化合物は、式（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２、または（ＰＧ１）Ｓ−Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−Ｎα（ＰＧ２）−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２の完全に保護された、または部分的に保護された、または完全に保護されていない酸安定性のＮα−置換２または３炭素鎖アミノアルキルまたはアリールチオールを含み、それらを以下の表ＩＶおよび表Ｖに示す。特に、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１つまたは複数はＣ１に共役した電子供与基を含み、これはＮα−置換アミノアルキルまたはアリールチオールのＮα置換−アミドアルキルまたはアリールチオールへの変換に続いて、ペプチド適合性開裂条件下でＮα−Ｃ１結合の開裂を促進する共鳴安定化カチオンをＣ１において形成することができる。Ｚ２が化学ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合性の任意の化学部分であり、Ｊ２が化学ペプチド合成または拡張天然型化学的ライゲーションに適合性の任意の化学部分である場合、ＰＧ１およびＰＧ２は個別にまたは組み合わせで存在するか、あるいは存在しない保護基であり、同一であるか、または異なることができる。ＰＧ１（またはＸ１）は、アミンを保護するための基である。ＰＧ２（またはＸ２）は、チオールを保護する基である。多くのそのような保護基が知られており、この目的に適している。（たとえば、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３版、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ Ｃａｔａｌｏｇ ２０００；「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ」、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２；「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ、Ｈ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ編、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、１９９８；「Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；「Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版」Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、Ａ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；および「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ」、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ編、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１９９４を参照のこと）。

ＰＧ１およびＸ１の好ましい保護基の例には、これに限定されるものではないが、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルカルバメート）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルカルバメート）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルカルバメート）、Ｂｒ−ＺまたはＣｌ−Ｚ（Ｂｒ−またはＣｌ−ベンジルカルバメート）、Ｄｄｅ（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシル−イリデン）、ＭｓＺ（４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート）、Ｍｓｃ（２−メチルスルホエチルカルバメート）、Ｎｓｃ（４−ニトロフェニルエチルスルホニル−エトキシ−カルボニル）が含まれる。好ましいＰＧ１およびＸ１保護基は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）から選択され、もっとも好ましいのはＦｍｏｃおよびＮｓｃである。ＰＧ２の好ましい保護基の例には、これに限定されるものではないが、［Ａｃｍ（アセトアミドメチル）、ＭｅｏＢｚｌまたはＭｏｂ（ｐ−メトキシベンジル）、Ｍｅｂ（ｐ−メチルベンジル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｘａｎ（キサンテニル）、ｔＢｕｔｈｉｏ（ｓ−ｔ−ブチル）、Ｍｍｔ（ｐ−メトキシトリチル）、２または４ピコリル（２または４−ピリジル）、Ｆｍ（９−フルオレニル−メチル）、ｔｂｕｔ（ｔ−ブチル）、Ｔａｃａｍ（トリメチルアセトアミドメチル）］が含まれる。好ましい保護基ＰＧ２およびＸ２は、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）から選択され、もっとも好ましいのはＡｃｍ、Ｍｏｂ、ＭｅＢ、ピコリルである。

本発明のＮα−置換２または３鎖アルキルまたはアリールチオールの保護形態は上述のスキームＩおよびＩＩのように調製できる。

本発明の化合物は、任意の多様な手段によって生成することができ、ハロゲン媒介アミノアルキル化、還元アミノ化、および固相アミノ酸合成法に適合するＮα−保護Ｎアルキル化Ｓ保護アミノアルキルまたはアリールチオールアミノ酸前駆体の調製を含む。所望であるとき、許容されるキラル純度の化合物を得るために、生成されたラセミ体またはジアステレオマーの分割を標準的な方法によって行うことができる。

ＩＩ．本発明の生物活性ペプチドおよびタンパク質
Ａ．合成生物活性タンパク質
上述の方法は、合成生物活性ペプチドおよびタンパク質を合成するために用いることができる。本明細書では、そのアミノ酸残基のいくつか、もっとも好ましくはそのすべてを重合するために非組換え技術が用いられた場合、生物活性タンパク質は「合成」であると言う。「非組換え技術」という用語は、有機化学および他の合成重合アプローチを含む技術を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡのタンパク質への翻訳を含む技術と区別することを意図する。もっとも好ましくは、本発明の合成生物活性タンパク質は、有機化学の原理、特に本明細書に記載の「天然型化学的ライゲーション」および「拡張天然型化学的ライゲーション」の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される。そのような化学合成は、好ましくは、ポリペプチドフラグメントが合成され、次いで互いに結合されて合成生物活性タンパク質が形成される収斂型合成アプローチを用いて行われる。別法として、本発明の合成生物活性タンパク質は、単一の非収斂型合成で合成することができる。

上述したように、本発明の合成生物活性タンパク質は、好ましくは約２５ｋＤａを超える相当の分子量を有する。本発明の目的のために、そのような分子量の決定は、変性ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によってなされる。「モノマー分子量」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの複数のコピーを有する可能性のある合成タンパク質と区別して、モノマー合成タンパク質の分子量を指すことを意図する。

本明細書では、合成タンパク質の構造またはアミノ酸配列に依存し、そのような構造または配列の変化がタンパク質の生物活性を増強、修飾、または低減するような認識できる生物活性を有する場合、合成タンパク質は「生物活性」を有すると言う。限定するものではないが、そのような「生物活性」には、触媒、シグナル、または誘発反応を媒介するタンパク質の能力が含まれる。本明細書では、それ自体が消費されたり、永久的に修飾されたりすることなく、基質を生成物に変換することによって、タンパク質は「触媒反応を媒介する」と言う。タンパク質の存在が原因となって、生体、あるいはその組織または細胞が、遺伝子発現、細胞分化、または細胞増殖を開始、持続、増強、修飾、または低減する場合、タンパク質は「シグナルまたは誘発反応を媒介する」と言う。そのようなシグナルまたは誘発反応の例には、サイトカイン発現またはサイトカイン発現に対する応答の誘発、赤血球生成の誘発、炎症および／または炎症性過程の誘発または緩和、新脈管形成または血管新生の開始、アポトーシスの誘発、細胞周期への影響などが含まれる。

本発明の合成生物活性タンパク質の生物活性はさらに、タンパク質が特異的に受容体、リガンド、または抗体に結合する能力を含む。本明細書では、「特異的」結合という用語は、電荷、溶解度、疎水性などに基づく「非特異的」結合と区別して、ホルモンとその受容体との間、または抗体と抗原エピトープとの間に存在するものなど、構造に基づく結合相互作用を指すことを意図する。

本発明の合成生物活性タンパク質は、好ましくはアミノ酸残基の縮合によって合成される。そのようなアミノ酸残基は、核酸コード化リボソーム導入アミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンであることができる。一実施形態において、特定の所望の合成生物活性タンパク質のために選択されたアミノ酸配列は、そのタンパク質の天然のまたは自然の配列となる。別の実施形態において、選択されたアミノ酸配列は、そのタンパク質の天然のまたは自然の配列に存在するアミノ酸残基の代わりにＮ末端システイン残基を含有することのできるポリペプチドフラグメントからなり、すべて構成されることになる。そのような残基を含むことによって、そのポリペプチドが本明細書に記載の天然型化学的ライゲーションの原理を用いて（カルボキシチオエステル基を含有するように修飾された）別のポリペプチドと結合されることを可能にし、それによって合成生物活性タンパク質を生成する収斂型合成の使用が容易になる。

さらなる実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は、「不規則」アミノ酸残基を含有することができる。本明細書では、「不規則」アミノ酸残基という用語は、ＲＮＡによってコード化されておらず、リボソーム導入されていないアミノ酸を指すものである。この点に関して、本発明は、合成生物活性タンパク質の設計および／または構成において広い選択性および柔軟性が可能となる。本発明によって用いることのできる非リボソーム導入アミノ酸の例には、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、擬似グルタミン酸塩、γ−アミノ酪酸、オルニチン、ホモシステイン、Ｎ置換アミノ酸（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：９３６７〜７１；ＷＯ９１／１９７３５（Ｂａｒｔｌｅｔｔ他）、米国特許第５６４６２８５号（Ｂａｉｎｄｕｒ）、α−アミノメチレンオキシ酢酸（アミノ酸−Ｇｌｙジペプチド同配体）およびα―アミノオキシ酸などが含まれる。チオアミド、ビニル性アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換還元アミド同配体、ならびにβ−スルホンアミドを含むペプチド類似体を用いることができる。

特に、Ｒ鎖の修飾が合成タンパク質へのポリマー付加物の結合を可能にするので、擬似グルタミン酸塩の使用が有利である。同様に、Ｎ末端Ｎα−置換２または３炭素鎖アルキルまたはアリールチオールアミノ酸を用いることができる。そのような残基（末端またはポリペプチドに存在する）は、本明細書に記載の拡張天然型化学的ライゲーションの方法に従って、そのポリペプチドを、カルボキシチオエステル部分を有するポリペプチドに結合するために有利に用いることができる。

一実施形態において、合成生物活性タンパク質のアミノ酸残基すべては、ペプチド結合（すなわち、アミド結合）によって互いに結合することができる。別法として、２つのアミノ酸残基（または２つのポリペプチドのＣ末端およびＮ末端残基）を、非アミド結合（チオエステル結合、オキシム結合、チオエーテル結合、有向ジスルフィド結合、チオゾリジン結合など）によって互いに結合することができる（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、Ｍ．およびＫｅｎｔ、Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５；Ｒｏｓｅ、Ｋ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３３；Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ、Ｄ．Ｒ．等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６：８８７１〜８８７４；Ｂａｃａ、Ｍ．等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５）１１７：１８８１〜１８８７；Ｌｉｕ、Ｃ．Ｆ．等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：４１４９〜４１５３；Ｌｉｕ、Ｃ．Ｆ．等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６）１１８：３０７〜３１２；Ｄａｗｓｏｎ、Ｐ．Ｅ．等、（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６〜７７９）。したがって本発明は、生物活性タンパク質の調製における多様なペプチド結合の修飾、代用、および等配電子性置換の利用を可能にする。

本発明の合成生物活性タンパク質は、哺乳動物（ヒト、サル、ウシ、マウス、ブタ、ヒツジ、ウマなどを含む）、鳥類、または魚類タンパク質に関連する生物活性を模倣する生物活性を有するように設計できる。本明細書では、第１のタンパク質が、第２のタンパク質の生物活性に関して修飾、増強、または低減された生物活性を有する場合、第１のタンパク質が第２のタンパク質を模倣していると言う。生物活性は、その存在が直接または間接的にタンパク質のアミノ酸配列に依存している場合、そのタンパク質に「関連している」と言う。

別の実施形態において、本発明の生物活性タンパク質は、対応する天然生物活性相当物を参照せずに、全体的または部分的に操作することができる。本発明の好ましい合成生物活性タンパク質には、受容体、タンパク質受容体リガンドが含まれる。そのようなタンパク質の例には、副腎皮質刺激ホルモン受容体およびその生物活性フラグメント、アンギオテンシン受容体、心房性ナトリウム利尿受容体、ブラジキニニン受容体、成長ホルモン受容体、化学走性受容体、ジノルフィン受容体、エンドルフィン受容体、β−リポトロピンの受容体およびその生物活性フラグメント、エンケファリン受容体、酵素阻害因子受容体、フィブロネクチン受容体およびその生物活性フラグメント、消化管および成長ホルモン放出ペプチド受容体、黄体化ホルモン放出ペプチドの受容体、メラニン細胞刺激ホルモンの受容体、ニューロテンシン受容体、オピオイド受容体、オキシトシン受容体、バソプレッシン受容体、バソトシン受容体、副甲状腺ホルモンの受容体およびフラグメント、プロテインキナーゼ受容体、ソマトスタチン受容体、サブスタンスＰ受容体が含まれる。

本発明の合成生物活性タンパク質にはさらに、酵素、および構造分子、たとえばキチン、またはコラーゲンなどが含まれる。

さらなる実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質には、サイトカインが含まれる。サイトカインは、細胞によって放出され、細胞−細胞相互作用、連絡、および他の細胞の挙動への特異的影響を媒介する小タンパク質または生物因子（５〜２０ｋＤａの範囲）である。本明細書では、「サイトカイン」という用語は、インターロイキン（ＩＬ）（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４など）、リンホカインおよび信号分子、たとえば赤血球産生刺激タンパク質（たとえば、エリスロポエチン（ＥＰＯ））、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンなど、増殖因子、たとえばトランスホーミング増殖因子、神経発育因子、脳由来増殖因子、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、肝細胞増殖因子、Ｔ細胞増殖因子（ＴＧＦ、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３など）、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦなど）、上皮増殖因子（ＥＧＦ、ＬＩＦ、ＫＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−Ｉなど）、線維芽細胞増殖因子（αＦＧＦ、βＦＧＦなど）、およびホルモン、特に単一ペプチドホルモン、たとえば成長ホルモンなどを含むことを意図する。

サイトカイン、特に化学走性サイトカインはさらに、本発明の範囲内の合成生物活性タンパク質の設計を助けるためにそのアミノ酸配列を用いることのできる特に好ましいタンパク質の例を含む。サイトカインは、白血球補充を直接または間接的に媒介することによって、あるいは微生物侵入の特異部位に蓄積された白血球の活性化において重要なシグナルとして働くことによって、先天または後天免疫応答に関与する。炎症性サイトカイン、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）、媒介物質は、好中球補充および活性化をもたらし、可溶性細胞間接着分子、インターロイキン−８を含む（Ｋｏｔｅｃｈａ Ｓ．、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９９６）１５５、補遺２：Ｓ１４〜１７）。インターロイキン−６は、主として急性期応答、Ｂ細胞分化、および抗体産生に関わる多官能サイトカインである（Ａｋｉｒａ Ｓ．等、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９３）５４：１〜７８）。このサイトカインは、単球、マクロファージ、ＴおよびＢ細胞、内皮細胞、および線維芽細胞を含む多くの異なる細胞によって合成され、分泌される。ＩＬ−６は、しばしば多くの警告状態において炎症性サイトカインＴＮＦα、およびＩＬ−１によって誘発され、循環ＩＬ−６は、急性期反応の誘発において重要な役割を果たす（Ｘｉｎｇ Ｚ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）１０１（２）：３１１〜２０）。白血球補充および活性化の両方に、直接または間接的に影響を及ぼすサイトカインには、ＴＮＦ−α、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびケモカインファミリーのメンバーが含まれる。主として白血球活性化の状態を調節するサイトカインには、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）が含まれる。サイトカインはまた、他のエフェクタ分子の発現を誘発または調節することによって微生物クリアランスに影響を及ぼすことができ、これはオートクリンまたはパラクリンいずれかの様式で起こり得る。

コロニー刺激因子は、造血幹細胞の増殖および成熟に必要とされる多様な骨髄性細胞および間質性細胞によって産生されるサイトカインである。さらに、研究は、これらの因子が成熟白血球集団のエフェクタ細胞活性を高めることを示している。具体的には、Ｇ−ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球の生存を延長し、好中球食細胞活性を高め、好中球呼吸バーストを増大する（Ｓｔａｎｄｉｆｏｒｄ ＴＪ等、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．（１９０９７）４５：３３５〜３４５）。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦは、好中球およびマクロファージ両方の増殖および成熟を促進し、このサイトカインの活性化特性は、主として成熟マクロファージ集団に向けられる（Ｃｈｅｎ ＧＨ等、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１５２：７２４〜７３４）。

ケモカインと呼ばれる化学走性サイトカインの密接に関連する６種のサブファミリーが今では特徴づけられた。これらのなかで少なくとも２つのサブファミリーのメンバーが、肺の抗菌宿主防御に寄与する（Ｍａｎｄｕｊａｎｏ Ｊ等、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．（１９９５）１５１：１２３３〜１２３８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ Ｍ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５：６７５〜７０５）。ＩＬ−８、ＭＩＰ（マクロファージ炎症タンパク）−２、ＫＣ、ＥＮＡ−７８およびＮＡＰ−２を含むＣ−Ｘ−Ｃケモカインファミリーのメンバーは、優勢な好中球刺激活性および化学走性活性を有し、それに対してＭＣＰ（単球化学誘導タンパク）−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを含むＣ−Ｃファミリーは、マクロファージ、リンパ球および好酸球に優勢な化学走性および／または活性化作用を及ぼす（Ｈｕｆｆｎａｇｌｅ ＧＢ等、Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ Ｉｎ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｋｏｃｈ Ａ、Ｓｔｒｉｅｔｅｒ Ｒ編、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｔｅｘａｓ、Ｒ．Ｇ．Ｌａｎｄｉｓ Ｃｏ、１９９６：１５１〜１６８）。

インターフェロンγは、肺病原体の広域スペクトルに対する細胞媒介性免疫に寄与する、Ｔ細胞（α、β、およびγ、δ Ｔ細胞の両方）およびＮＫ細胞によって産生されるサイトカインである。このサイトカインは、呼吸バーストの刺激、抗原を提供する能力、マクロファージ由来ＴＮＦ放出のプライミング、および細菌、真菌、マイコバクテリア生体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏマクロファージ抗菌活性の強化を含むいくつかのマクロファージエフェクタ細胞機能を活性化する。

インターロイキン−１２は、Ｔｈ１型免疫応答を促進し、Ｔｈ２型免疫応答を阻害するサイトカインである。具体的には、ＩＬ−１２は、Ｔｈ１Ｔ細胞およびＮＫ細胞の発生を刺激し、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞の細胞溶解活性を増大する。もっとも重要なことに、ＩＬ−１２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ−γの主要誘発因子として働く。

ＩＬ−１２とは対照的に、ＩＬ−１０は、Ｔｈ２型免疫応答の発達を促進し、細胞媒介性（Ｔｈ１型）免疫を阻害する（Ｈｏｗａｒｄ Ｍ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１２：２３９〜２４７）。このサイトカインは、一部には好中球およびマクロファージを直接不活性化することによって、且つＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ならびにＣ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｃ両方のケモカインファミリーのメンバーの発現をダウンレギュレートすることによって、効力のある抗炎症特性を与えることが示された。ＩＬ−１０は、全身免疫細胞活性化の状態において炎症性サイトカインの望ましくない生成を減ずるのに寄与する。

ＥＰＯは、赤血球産生刺激活性を有する合成生物活性タンパク質の設計を助けるために、そのアミノ酸配列を用いることのできるタンパク質の特に好ましい例である。ＥＰＯは、定常状態における赤血球産生の調節、および出血後の赤血球塊回復の促進に関与する主要な因子である（Ｊｅｌｋｍａｎｎ、Ｗ．（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ７２：４４９；Ｋｒａｎｔｚ、Ｓ．Ｂ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７７：４１９；Ｐｏｒｔｅｒ、Ｄ．Ｌ．およびＭ．Ａ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９９３）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：３９９；Ｎｉｓｓｅｎｓｏｎ、Ａ．Ｒ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ Ｐｕｒｉｆ．１２：６）。ヒトＥＰＯの環状形態は、およそ３００００の分子量を有する１６５アミノ酸（ａａ）糖タンパク質である（Ｓａｗｙｅｒ、Ｓ．Ｔ．等（１９９４）Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎｉｃｓ ＮＡ ８：８９５；Ｊａｃｏｂｓ、Ｋ．Ｊ．等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：８０６；Ｌｉｎ、Ｆ−Ｋ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７５８０）。ＥＰＯのｃＤＮＡは、１６６アミノ酸残基を有する分子を予測するが、カルボキシ末端アルギニンは、翻訳後修飾において除去される（１２）。Ｎ結合グリコシル化のための３つの潜在的な部位があり、それらはすべて占められている。１つのＯ結合炭水化物部分も存在する（１３）。グリコシル化の作用は複雑である。非グリコシル化大腸菌由来ＥＰＯはｉｎ ｖｉｔｒｏで完全な生物活性を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏでの完全な活性のためにはグリコシル化が必要なようである。したがって、大腸菌産生、脱グリコシル化、天然ＥＰＯは、動物研究で非常に低い活性を示す（Ｋｒａｎｔｚ、Ｓ．Ｂ．（１９９１）Ｂｌｏｏｄ ７７：４１９；Ｓａｓａｋｉ、Ｈ．等（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２０５９；Ｌｏｗｙ、Ｐ．Ｈ．等（１９６０）Ｎａｔｕｒｅ １８５：１０２；Ｗｏｊｃｈｏｗｓｋｉ、Ｄ．Ｍ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９１０：２２４；Ｄｏｒｄａｌ、Ｍ．Ｓ．等（１９８５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １１６：２２９３）。

上記に矛盾することなく、可変のグリコシル化様式は、可変の効果を示す。たとえば、脱シアル化ＥＰＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増強された活性、およびｉｎ ｖｉｖｏでの低減された活性の両方を示し、肝細胞によって認識、結合、除去されるガラクトース残基の暴露に帰する作用である（Ｓｐｉｖａｋ、Ｊ．Ｌ．およびＢ．Ｂ．Ｈｏｇａｎｓ（１９８９）Ｂｌｏｏｄ ７３ｖ：９０；Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ、Ｅ．等（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：４２０２）。完全にシアル化されたＥＰＯの分岐パターンも、生物活性に違いをもたらす。主として４枝に分岐したＥＰＯは、「標準の」ＥＰＯと同等の活性を示し、一方、主として２枝に分岐したＥＰＯは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで標準の３倍の活性を示すが、ｉｎ ｖｉｖｏではわずか１５％の活性を示す（Ｔａｋｅｕｃｈｉ、Ｍ．等（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７８１９）。研究は、Ｏ結合糖ではなく、Ｎ結合糖のみがＥＰＯの機能に重要であることを示している（Ｈｉｇｕｃｈｉ、Ｍ．等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７７０３１９）。

コロニー刺激因子、およびＲＡＮＴＥＳも、本発明の範囲内の合成生物活性タンパク質の設計を助けるためにそのアミノ酸配列を用いることのできる特に好ましいタンパク質の例を含む。

Ｂ．ポリマー修飾タンパク質およびポリペプチド
本発明の第２の特質は、あらかじめ選択された位置に構造の定義された１つまたは複数のポリマー付加物を含むように、タンパク質またはポリペプチドを修飾する能力に関する。ポリマー修飾タンパク質は以前に記載されているが、考えられる本発明のポリマー修飾の性質および方式は、そのような従来の研究とは著しく異なる。

本発明の合成生物活性タンパク質は、全体または部分的に化学合成されるので、ポリペプチド、タンパク質主鎖の、使用者が選択し、使用者が定義した１つまたは複数の特定の部位にポリマー（たとえばポリマーまたは糖、ポリエチレングリコール、グリコール、ヒアルロン酸など）を共有結合できるような方式でこのようなタンパク質を合成することが可能である。さらに、本発明のタンパク質の合成的生産は、調製品中の各分子の使用者選択、使用者定義部位のそれぞれに確実にそのような修飾を存在させることができる。合成のそのような一様性および制御は本発明を、従来技術の方法の使用によって可能となる無作為な修飾と明らかに区別する。注目に値すべきなのは、本発明は、任意の重要でない残基を誘導化してポリマー付加物を含有することのできる合成タンパク質の設計を可能にすることである。さらに、そのような使用者選択、使用者定義の各部位に関して、それを介して付加物がポリペプチドまたはタンパク質主鎖に結合される正確な結合（アミド、チオエステル、チオエーテル、オキシムなど）を使用者が定義することができる。さらに、存在するすべてのタンパク質またはポリペプチドが正確に同じ誘導部位に正確に同じ誘導付加物を含有する最終調製物が得られるように、特定の部位に存在を所望する特定のポリマー付加物を変更および制御することができる。したがって、本発明は、ポリマー修飾ポリペプチドおよびタンパク質の均一な調製物の形成を可能にする。

ポリマーが結合することのできる結合部位の位置および数を変更する手段を提供することに加えて、本発明は、結合ポリマーの性質を変えることを可能にする。使用者選択、使用者定義された任意の特定部位に組み込むことのできるポリマー付加物は、任意の定義された長さであることができる。同様に、本発明の方法に矛盾することなく、異なる部位において異なる長さのポリマーを用いることが可能である。したがって、一実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は、ポリマー付加物による「単一修飾」または「多修飾」であることができる。複数のポリマー付加物を特定のポリペプチドまたはタンパク質に導入した場合、その使用ポリマーは、「単一種分化」「多種分化」「一様に種分化」または「多様に種分化」されていることができる。本明細書では、「単一種分化」という用語は、単一のポリマー種によって修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を指すことを意図する。対照的に、「多種分化」という用語は、複数のポリマー種によって修飾されたポリペプチドまたはタンパク質を指すものである。そのような多種分化ポリペプチドまたはタンパク質は、そのポリペプチドまたはタンパク質の各修飾部位に同じ単一種のポリマーが存在する場合、「一様に種分化」されていると言う。対照的に、ポリペプチドまたはタンパク質の修飾部位が異なるポリマー種によって修飾されている場合、種分化ポリペプチドまたはタンパク質は「多様に種分化」されていると言う。

さらに、使用者定義、使用者選択されたそれぞれの部位において、ポリマー付加物の直線性または分岐性の程度を変えることが可能である。したがって、ポリマー付加物は、直線状、分岐状、または一様に分岐状であることができる。「一様に分岐状」という用語は、特定部位においてポリマーのすべての分岐が、同一の構造および長さを有することを意味するものである。本発明者等の理解のとおり、本発明は、個々の分岐の長さ、ならびにそのような分岐点に存在するポリマーの構造の両方を、独立して変更することを可能にする。

要約すれば、本発明は、ポリペプチドまたはタンパク質主鎖におけるポリマー修飾、使用者選択、使用者定義部位の（１）位置、および（２）頻度を定義すること、ならびにそのような各部位に存在する分岐の（３）長さ、（４）種、および（５）程度を制御することを可能にする。さらに、複数のポリマー修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明は、各部位について上に特定した５つの変数のそれぞれを独立して定義することを可能にする。さらに、分岐ポリマー修飾を有するポリペプチドおよびタンパク質に関して、本発明は、各分岐点について上に特定した５つの変数のそれぞれを独立して定義することを可能にする。したがって、本発明は、ポリマー修飾の実質的な適応性を提供する。

Ｃ．タンパク質およびペプチドのデリバリー
本発明の随意ポリマー修飾された合成生物活性ポリペプチドおよびタンパク質は、疾患および症状の治療を行うために薬剤として用いることができる。もっとも好ましくは、治療を必要としている患者または個体に投与されるとき、そのような合成生物活性ポリペプチドおよび／またはタンパク質は、薬剤デリバリーシステムを用いて投与される。そのようなシステムの使用は、患者が薬剤を受け入れることができ、且つ所望の生物活性の有効性を高めるような様式で患者に薬剤を提供することを可能にする。本発明の目的の好ましい薬剤デリバリーシステムには、経口、経鼻、または吸入経路によって、あるいは筋肉内、皮下、経皮、静脈内、耳内、または眼内に、ポリペプチドまたはタンパク質を投与できるシステムが含まれる。

そのような薬剤デリバリーシステムは、部位特異放出を提供する製剤、または腸粘膜の保護を増強する製剤を含むことができる。適切な製剤には、乾燥粉末製剤、ウイルス粒子カプセルによるデリバリー、リポソームカプセル、経皮パッチ、電気援用輸送（電気穿孔療法）、およびポリマー／ナイアゾン（ｎｉａｚｏｎｅ）複合体が含まれる。

好ましい実施形態において、そのような薬剤デリバリー装置は生物環境の変化に応答し、それらの変化に基づいて薬剤をデリバリーし、またはデリバリーを中止する。薬剤および他の活性剤の放出を制御するために一連の材料が用いられてきており、ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）、ポリ（メチルメタクリレート）、吸水性および強度のためのポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）などである。さらなる好ましい実施形態において、薬剤デリバリーを促進するために、生分解性ポリマーが用いられる。そのようなポリマーには、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ無水物、およびポリオルトエステルが含まれる。薬剤デリバリー装置、およびその使用のための方法は、米国特許第６０７２０４１号、第６０４１２５３号、第６０１８６７８号、第６０１７３１８号、第６００２９６１号、第５８７９７１２号、第５８４９３３１号、第５７９２４５１号、第５７８３２１２号、第５７６６６３３号、第５７５９５６６号、第５６９０９５４号、第５６８１８１１号、第５６５４０００号、第５６４１５１１号、第５４３８０４０号、第４８１０４９９号および第４６５９５５８号に記載されている。

ＩＩＩ．合成生物活性タンパク質の生成
本発明の合成生物活性タンパク質の生成は、以下のステップまたは構成要素、すなわち設計、合成、ペプチドライゲーション、タンパク質フォールディング（折りたたみ）、生物活性の評価、ポリペプチド主鎖のポリマー修飾を有するものとして考えることができる（図２）。

Ａ．好ましい合成生物活性タンパク質の設計
特に好ましい実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は、赤血球産生刺激タンパク質である。本明細書では、赤血球産生刺激タンパク質は、赤血球の生成を媒介するタンパク質である。タンパク質の赤血球産生刺激生物活性は、たとえばｉｎ ｖｉｖｏ投与後の赤血球生成を追跡する、ＥＰＯ依存細胞系の増殖を媒介するタンパク質の能力を検定するなど、多様な任意の手段によって判別することができる。

好ましい赤血球産生刺激タンパク質は、哺乳動物、もっとも好ましくはヒトのＥＰＯおよびその類似体である。エリスロポエチンは主として、腎臓の尿細管および尿細管近接毛細管内皮細胞および間質細胞によって合成および分泌される。慢性腎臓疾患は、腎臓のＥＰＯ産生細胞の破壊をもたらす。結果として生じるＥＰＯの欠乏は、しばしば貧血を誘発する。したがって、ＥＰＯの主要な臨床上の使用は、通常は輸血も受ける重篤な腎不全（ヘマトクリット０．３以下）を有する患者の治療、ならびに化学療法後の貧血患者の治療である。典型的に、ＥＰＯは臨床使用のためにハムスター卵巣細胞において組換えによって合成される。ＥＰＯは、その成熟形態で１６５アミノ酸残基を有する比較的熱安定性、且つｐＨ安定性の酸性（ｐＩ＝４．５）タンパク質である。ＥＰＯは、ＥＰＯ受容体を介してその活性を伝える。ＥＰＯの分子量のおよそ４０パーセントは、グリコシル化によるものである。グリコシル化は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＥＰＯの薬物動態挙動を決定する重要な要因である。非グリコシル化ＥＰＯは、極端に短い生物学的半減期を有する。これはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて依然として受容体に結合し、より高い特異的活性を有する可能性もある。しかしながら、最近の実験によって、ＥＰＯのＰＥＧ化はその寿命を著しく増大するが、細胞に基づくアッセイシステムにおいてＥＰＯ活性を著しく低減することが示された。

本発明の合成赤血球産生刺激タンパク質（「ＳＥＰ」）は、好ましくは、ヒト尿ＥＰＯの化学的に修飾された合成類似体である。好ましい実施形態において、ＳＥＰは、チオエステル結合、オキシム結合、アミド結合、または他の結合を介して、１つまたは複数のペプチド残基に結合している１つまたは複数ポリマー部分（もっとも好ましくはｐＰＥＧ部分）を含有する。非常に好ましい実施形態において、そのような結合は、ヒト尿ＥＰＯにおいて天然にグリコシル化されている１つまたは複数の位置に存在する（すなわち、２４、３８、８３および１２６位）。もっとも好ましくは、ＳＥＰ分子は、２つ以上のそのような位置にｐＰＥＧ部分を有する。別の実施形態において、他のタンパク質残基は、ポリマー部分によって修飾されることができる。本発明の合成生物活性タンパク質のための修飾位置には、タンパク質の無秩序ループ、領域、またはドメイン、あるいは潜在性プロテアーゼ開裂部位またはその近傍部位に位置する残基が含まれる。たとえば、ポリマー修飾は、ＥＰＯの９、６９、および／または１２５位の１つまたは複数の位置に導入することができる。本発明のＳＥＰ分子の全分子量は、約２５から約１５０ｋＤａ、より好ましくは約３０から約８０ｋＤａであることができる。分子量は、所与の類似体の修飾に用いられるポリマー（ｐＰＥＧなど）の数および構造を増大または低減することによって制御できる。より大きな構成体のｐＰＥＧ媒介流体力学ＭＷは約１００ｋＤａを超える。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトＥＰＯ受容体発現細胞でのアッセイは、本発明のＳＥＰが、組換えによって産生されたグリコシル化ヒトＥＰＯと同等のＥＤ５０を有することを示す。

オキシム結合ｐＰＥＧ類似体は、好ましくは、側鎖アミノオキシ、ケトン、またはアルデヒド官能基を有する非天然コード化アミノ酸において、ＳＥＰタンパク質に、アミノオキシ、ケトン、またはアルデヒド官能化ｐＰＥＧを結合することによって構成される。たとえば、ＳＥＰ−０およびＳＥＰ−１の８９および１１７位は、擬似グルタミン酸塩（（グルタミン酸塩側鎖−ＣＨα−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯＯＨに対して）式−ＣＨα−ＣＨ_２−Ｓ−ＣＯＯＨの側鎖を有する非天然コード化アミノ酸）を含有する。チオエーテル結合を用いるＳＥＰ類似体は、好ましくは、チオールを有する側鎖を備えたシステインまたは非天然アミノ酸によって提供されるチオール官能基を含有するように構成される。図３は、好ましい合成赤血球産生刺激タンパク質の１つの型の基本的な構造を示す。

別の実施形態において、本発明のＳＥＰ分子は、ＥＰＯの天然アミノおよびカルボキシ末端が再配置された「環状順列化」ＥＰＯ類似体を含むことができる。より好ましくは、そのような再配置は、アミノおよびカルボキシ末端を、無秩序ループなど、構造的制約の低い位置に移動する。１２５および１２６位（天然ＥＰＯ残基ナンバリングシステムを基準として）近くの無秩序ループは、そのような再配置部位の例である。もっとも好ましくは、そのようなＳＥＰはジスルフィドを含まず、あらかじめ選択された残基にポリマー部分を含有するように化学的に修飾される。

あるいは、ＳＥＰ分子は、天然グリコシル化部位、またはグリコシル化を施すことのできる他の部位、たとえば１２６および１２５位などに再配置されたアミノおよびカルボキシ末端を有することができる。ＳＥＰ分子は、電荷を除去または変更するためのアミノおよびカルボキシ末端の修飾（カルボキシアミド化などによる）を含むこともできる。

そのような環状順列化分子の好ましい例において、新しいＮおよびＣ末端は、それぞれ１２６および１２５位によって提供される。７、２９、３２および１６１位の天然ジスルフィド形成システインは、好ましくは、ジスルフィド架橋を形成することのできない非天然コード化アミノ酸、Ｌ−α−Ｎ−酪酸（Ａｂａ）に置換されている。残基Ｒ１６６、Ｅ３７およびＶ８２は、好ましくは、生成を向上させるためにアラニンに置換されている。さらに、好ましくは追加のシステインが、天然ＥＰＯナンバリングスキームを基準として１位と１６６位の間に挿入され、以下「０」と番号を付す。結果として生じた分子は、４つのシステインを含有し（１２６、０、３８および８３位（Ｎ末端からＣ末端方向に読み取り））、それらは（１）ライゲーション部位、および（２）チオエーテル形成ｐＰＥＧ結合部位として用いられる。随意、システインは、追加のｐＰＥＧ結合部位を提供するためにＡ１２５を置換することができる。本発明のそのようなＳＥＰ分子の全分子量は、約２５から約１５０ｋＤａ、より好ましくは約３０から約８０ｋＤａであることができる。分子量は、所与の類似体の修飾に用いられるポリマー（ｐＰＥＧなど）の数および構造を増大または低減することによって制御できる。より大きな構成体のｐＰＥＧ媒介流体力学ＭＷは約１００ｋＤａを超える。任意のｐＰＥＧ結合部位は、１２５、９および２４位（Ｎ末端からＣ末端方向に読み取り）に位置する。さらなるＳＥＰ類似体設計は、新しいＮおよび／またはＣ末端からの無秩序ループ、領域、および／または切断残基に代わりのＮおよびＣ末端を有する。好ましい循環順列化分子の基本構造を図４に示す。

別の実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は、哺乳動物、もっとも好ましくはヒトのＣ−ＧＳＦである。Ｇ−ＣＳＦは、好中球性顆粒球の急速な増殖および血流への放出を誘発し、それによって感染との戦いに治療的効果をもたらす。ヒトＧＣＳＦタンパク質は、アミノ酸長１７４であり（特許ＥＰ０４５９６３０（Ｃａｍｂｌｅ、Ｒ他）、その配列の変種がすでに単離されている。このタンパク質は４つのシステイン残基を有し、トレオニン１３３位にＯ−グリコシル化部位を有する。

そのような合成ＧＣＳＦ分子の一実施形態において、分子のアミノ酸配列は、１、２、または３位の１つまたは複数の位置に天然、またはより好ましくは非天然コード化疎水残基を含有するように、天然ＧＣＳＦの配列に対して変更される。随意、そのような分子は、ＧＣＳＦの５位、および／または１７３位および／または１７４位に追加の天然、より好ましくは非天然コード化疎水残基を含有するようにさらに修飾される。

さらなる好ましい実施形態において、合成ＧＣＳＦ分子は、６３、６４、および／または１３３位の１つまたは複数の位置、および／または１、および１７４位の１つまたは複数の位置でポリマー修飾（好ましくはｐＰＥＧ）される。このｐＰＥＧポリマーは、線状または分岐状、荷電、非荷電、または混合であることができ、約５から約８０Ｄａ、より好ましくは約４０から約７０ｋＤａの分子量の範囲であることができ、ｐＰＥＧ全ＭＷ寄与は修飾に用いられるｐＰＥＧの数および構造に依存する。流体力学半径は、ｉｎ ｖｉｖｏでより大きなＭＷ効果を示す（たとえば、１０ｋＤａ分岐ｐＰＥＧは約５５ｋＤａの有効分子量を示す）。推定ｐＰＥＧ媒介流体力学ＭＷは、１００ｋＤａを超える。

オキシム結合を用いる類似体の場合、ｐＰＥＧは、好ましくは、側鎖アミノオキシ、ケトン、またはアルデヒド官能基を有する非天然コード化残基に結合されている。チオエーテル結合を用いる類似体の場合、ｐＰＥＧは、好ましくは、チオールを有する側鎖を備えたシステインまたは非天然アミノ酸に結合されている。アミド結合を用いる類似体の場合、ｐＰＥＧは、反応性側鎖アミンを有する天然または非天然アミノ酸に結合されている。

合成生物活性ＧＣＳＦタンパク質の基本構造を図５に示す。この図において、「Ｊ」は、疎水性側鎖を有する非天然コード化残基を示す。

そのような合成生物活性ＧＣＳＦタンパク質の生物活性は、たとえば因子依存性ヒトまたはマウス細胞系（たとえばＮＦＳ６０細胞系）の増殖を媒介するそれらの能力を評価することによって、あるいは２０日超の半減期／放出をターゲットとするデリバリーシステムを用いて、または用いずに、ｉｎ ｖｉｖｏでの好中球刺激、半減期、および免疫原性を測定することによってなど、通常の手段で評価することができる。

別の実施形態において、本発明の合成生物活性タンパク質は、哺乳動物、もっとも好ましくはヒトのケモカイン、ＲＡＮＴＥＳである。ＲＡＮＴＥＳは、主要受容体ＣＣＲ５を経るマクロファージ親和性ＨＩＶ株の侵入を遮断し、さらに喘息、移植拒絶、および創傷治癒に関わる炎症経路をダウンモジュレートする（Ｋａｌｉｎｋｏｖｉｃｈ Ａ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．（１９９９）６８：２８１〜２８７）。本発明の合成ＲＡＮＴＥＳ分子は、好ましくは、（１）ＲＡＮＴＥＳ１〜６８の１位に認められるＮ末端セリンが、ｎ−ノナノイル（「ＮＮＹ」）基で置換されており、（２）３位のチロシンが、疎水性側鎖を有する非天然コード化アミノ酸で置換されているように化学修飾されている点でＲＡＮＴＥＳケモカインと異なる。そのような化合物は、組換え「Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ１〜６８」のミリモル範囲に比べて、ピコモル範囲のＥＤ５０を有し、極めて有効であることが見出されている。

疎水性側鎖を有する非天然コード化アミノ酸で２位のプロリンを置換する、分子のＣ末端に脂肪酸を付加するなど、上記のＲＡＮＴＥＳに対して１つまたは複数の追加の変更を有する有効なＲＡＮＴＥＳ類似体が作られた。ＲＡＮＴＥＳ残基１２〜２０に対応するＮループ領域への修飾によって、効力と合わせて受容体特異性が向上した。さらなる好ましい実施形態において、本発明の合成ＲＡＮＴＥＳ分子は、特にｉｎ ｖｉｖｏ半減期を改善するためにＮまたはＣ末端にポリマー部分（ｐＰＥＧなど、あるいはノナノイル（「ＮＮＹ」）またはＹ３Ｘを組み込む。このｐＰＥＧ部分は、好ましくはオキシム結合を介して非天然コード化アミノ酸に結合され、これは６６、６７、６８位、または６８位のリンカーに導入され、６７位が好ましい。脂肪酸は、好ましくはオキシム結合（好ましくはリンカーを経て）を介して、アミノ−オキシ修飾アミノ酸ジ−またはトリ−ペプチドリンカーなど残基６８に結合される。他の結合化学を別法として用いることができる。そのような合成ＲＡＮＴＥＳ類似体のより大きな構成体の分子量は、ｐＰＥＧ付加物の性質および構造に応じて約２５ｋＤａから約４５ｋＤａの範囲であり、より大きい構成体では、６０ｋＤａを超えるｐＰＥＧ媒介流体力学ＭＷを有する。好ましい合成ＲＡＮＴＥＳ類似体の構造を図６に示す。

Ｂ．合成生物活性タンパク質およびペプチドの定義された特定のポリマー修飾
本発明のさらなる態様は、非修飾タンパク質に比べて改善された特性を有するタンパク質薬剤を生じるようにタンパク質を修飾するための化学部分およびポリマー、特に水溶性ポリマー、ならびにそれらの使用に関する。そのような修飾の予期される有益な効果には、これに限定されるものではないが、非修飾分子と比べて（ａ）効力の向上、（ｂ）タンパク分解安定性の増大、およびクリアランス速度の低減による循環におけるタンパク質薬剤存続期間の延長、（ｃ）免疫原性の低減、および（ｄ）識別的ターゲッティングの可能性が含まれる。

上に論じたように、タンパク質を修飾するためにポリエチレングリコールが用いられてきたが（たとえば、反応性アミン基によるポリエチレングリコール分子の結合を可能にするために、Ｇ−ＣＳＦのリジン残基を修飾することに関する米国特許第６０２７７２０号、Ｋｕｇａ等を参照のこと）、そのような修飾は分子異質性、および分子多様性を伴う。

本明細書では、「分子異質性」という用語は、タンパク質製剤の各タンパク質に結合されたポリマー分子の数のばらつきを指すものである。「分子多様性」という用語は、（ａ）そのポリマーによって修飾されるタンパク質の部位のばらつき、（ｂ）タンパク質製剤の同一タンパク質の異なる部位、または異なるタンパク質の同一部位のポリマー付加物の長さのばらつき、または（ｃ）タンパク質製剤の同一タンパク質の異なる部位、または異なるタンパク質の同一部位のポリマー付加物の、任意の分岐の程度および／または性質のばらつきを指すものである。本明細書では、「分子的に均一」という用語は、すべてのタンパク質分子が同じ位置にアミノ酸配列および同一のポリマー修飾を含有するタンパク質の製剤を指すものである。２つ以上の「分子的に均一」なタンパク質製剤の混合物は、本明細書では、「分子的に定義された」製剤と呼ぶ。

本発明のこの態様に従って、上に特定したポリマー異質性、多様性、および不適合性の問題の解決策には、ポリペプチド（厳密な長さ、好都合な合成）および「ｐＰＥＧ」（「精密ＰＥＧ」）（適応性、両親媒性、非免疫原性、プロテアーゼ感受性でないポリマー）両方の利点を兼ね備える新しい類の生体適合性ポリマーを製造することが含まれる（Ｒｏｓｅ、Ｋ．等、参照により本明細書に組み込むものとする米国特許出願第０９／３７９２９７号）。この新しい類の生体適合性ポリマーは以下の式を有し、
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］_ｎ−
ｎは、整数であって、好ましくは１〜１００、より好ましくは２〜１００であり、該式中、ＸおよびＹは、アミド結合によって結合した正確な構造の生体適合性反復要素である。好ましくは、ＸおよびＹは、反応性官能基を欠く２価有機基であるか、または不在であり、同一であるか、または異なり、且つ各反復単位によって独立して異なることができる。好ましくは、ｎ＝２であるとき、ＸまたはＹの少なくとも１つは、置換、非置換、分岐状、および線状脂肪族および芳香族基からなる群から選択される。より好ましくは、２価有機基ＸまたはＹの少なくとも１つは、フェニル、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン部分、Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル、ヘテロ原子含有Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ_１〜Ｃ_１０アルキル基、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

特に好ましいｐＰＥＧ部分は以下の式を有し、
−｛ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＣＨ_２−ＮＨ｝_ｎ−
該式中、ｎは、好ましくは１〜１００、より好ましくは２〜１００であり、または、
−｛ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ_２）_２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_３−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＣＨ_２−ＮＨ｝_ｎ−
を有し、該式中、ｎは、好ましくは１〜５０、より好ましくは２〜５０である。

そのようなｐＰＥＧ部分は、多様な方法のいずれかで合成することができる。しかしながら、そのような部分は、好ましくは、重合法よりも、単位の固相段階的鎖アセンブリ法を用いて生成される。そのようなアセンブリ法の使用によって、製剤のその部分が、それらの長さ、ＸおよびＹ置換基の性質、（もしあれば）分岐点の位置、ならびに分岐の長さ、ＸおよびＹ置換基、および位置に関して定義された均一な構造を有することが可能になる。

好ましくは、そのような部分は、
（ａ）式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨを有する２酸の誘導体のモル過剰量を用いて、該式中、Ｚは、Ｈ_２Ｎ−またはＨＯ−であり、Ｑは、リンカーまたは標的分子であり、支持体は、固相、マトリクス、または表面である式Ｚ−Ｑ−支持体の化合物のアミノまたはヒドロキシル基をアシル化するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の遊離カルボキシル基を活性化するステップ、
（ｃ）式ＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２を有するモル過剰量のジアミンを用いて、ステップ（ｂ）の生成物をアミノ分解するステップ、および
（ｄ）ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨおよびＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２を用いてステップ（ａ）〜（ｃ）を随意繰り返すステップであって、前記ＸおよびＹは、２価有機基であるか、または不在であり、同一であるか、または異なり、且つ前記の任意選択の各反復単位によって独立して異なることができ、且つ先のアシル化およびアミノ分解ステップのいずれかで用いたＸおよびＹ置換基と同じか、または異なっているステップなどのステップによって合成される。

好ましい実施形態において、上述の反復単位の６マー、１２マー、１８マー、および３２マーが用いられる。所望である場合、この反復単位は、たとえば分岐ｐＰＥＧ構造を形成するためにリジンのアミノ基と共に用いることができる。ｐＰＥＧは、チオエーテル、オキシム、およびアミド結合形成を含む多様な化学によって、本発明の合成タンパク質に結合することができる。

一実施形態において、単位の固相段階的鎖アセンブリは、以下のステップ１〜５を含む。
ステップ１： 保護または非保護２酸を樹脂上でアミノに結合して、結合部位にアミド結合を生じる（ＰＧは、用いられる２酸に応じて存在するか、または存在しない保護基である）：
ＰＧ−ＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨ ＋ ＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ２： 存在する場合、樹脂上で保護基（ＰＧ）を除去する：
ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ３： 保護または非保護ジアミノを樹脂上でカルボキシに結合して、結合部位にアミド結合を生じる（ＰＧは用いられるジアミノに応じて存在するか、または存在しない）：
ＰＧ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ ＋ ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ４： 存在する場合、樹脂上で保護基（ＰＧ）を除去する：
−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ５： 「ｎ」単位を付加するためにステップ１〜４を「ｎ」回繰り返し、次いで樹脂から−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−を開裂する。

上述したように、線状または分岐状ｐＰＥＧ構成体は、本発明の合成生物活性分子に結合するのに好ましい水溶性ポリマーである。用いられるｐＰＥＧは、生理的条件下で荷電または中性であり、用いるｐＰＥＧ構造に応じて結合化学、長さ、分岐、および溶解性を変えることのできるペンダント基を有する。上記のとおり、本発明の好ましいｐＰＥＧは、ＸおよびＹの１つまたは両方が水溶性反復単位、もっとも好ましくは「ＰＥＧ」ベースの反復単位を含む、反復単位−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−を有する水溶性ポリアミドを含む。アミノ樹脂、ＮＨ_２−樹脂、および対称ジアミンＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２の場合に関して下に示したように、原理的には簡単な２ステップ固相手順を用いてオリゴ尿素を利用でき、カルボニルジイミダゾールによる活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２によるアミノ分解→ＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
これら２つのステップを何度か繰り返して、反復単位−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−を有するオリゴ尿素を得ることができるが、このアプローチは好ましさに劣る。これは、上記ステップの収率が、室温において非常に過剰の試薬と長い反応時間を用いても、量的でない可能性があるためである。したがって、アミノ樹脂、ＮＨ_２樹脂の場合を以下に示した、ポリアミドを形成する３ステップの固相手順を用いることが好ましい。試薬ＨＯ_２Ｃ−Ｘ−ＣＯ_２Ｈ、およびＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２は、異性体生成物を回避するために、対称であるべきである。
二酸ＨＯ_２Ｃ−Ｘ−ＣＯ_２Ｈを用いたアシル化→ＨＯ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
カルボニルジイミダゾールを用いた活性化→ｉｍ−ＣＯ−ＯＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂
ジアミンＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ_２を用いたアミノ分解→ＮＨ_２−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−樹脂

これらの３ステップは、反復単位−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−を有するポリアミドを得るために、何度か連続して繰り返すことができる。このポリマーは、正確な数のモノマー単位を含有し、ＸおよびＹは、各ステップにおいて独立して異なることができ、末端基は、随意に選択できる。たとえば、アシル化ステップに無水コハク酸（「Ｓｕｃｃ」）を用い、アミノ分解ステップに４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジアミン（「ＥＤＡ」または「ＴＴＤ」とも呼ばれる）を用いることによって、Ｘが−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり、Ｙが−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＣＨ_２−ＮＨ−であり、反復単位が−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−である「ＰＥＧ」ベースのポリアミドが形成される。この手順には保護基を持たない２価の試薬が含まれるにもかかわらず、以下に言及する分岐構成体を製造するための分岐Ｌｙｓコアの場合を除いて、標準的な市販のペプチド合成樹脂が用いられるとき、架橋結合は問題とならない（Ｒｏｓｅ他、米国特許出願第０９／３７９２９７号、およびＲｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）。

たとえば、Ｒｏｓｅ他（米国特許出願第０９／３７９２９７号）、およびＲｏｓｅ、Ｋ．およびＶｉｚｚａｖｏｎａ、Ｊ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）に記載されている「化学抗体（ｃｈｅｍｏｂｏｄｙ）」構成体と類似の方法で、分岐ｐＰＥＧ構成体を製造することができる。したがって、分岐ｐＰＥＧ構成体はリジン分岐コアなどの分岐コアを有するように製造することができ、分岐コアはオキシムリンカーを介して−（ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_３−ＣＨ_２−ＮＨ）_ｎ−などの好ましい水溶性ポリアミドに結合している。たとえば、オキシム結合は、ポリアミドの他端にあるＬｙｓ側鎖のアミノオキシアセチル基と、リジンコア、たとえばテトラマーコア（Ｏ＝ＣＨＣＯ）_４Ｌｙｓ_２Ｌｙｓ−のグリオキシリル基との間に容易に形成できる。したがって、各リジン分岐点のオキシムリンカーは、構造−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ_２ＯＮ＝ＣＨＣＯ−）アミド−として調製することができる。別の構成は、以下に示す４価分岐構成体を生じるために、好ましくはモノ保護ジアミン、およびポリアミドカップリング後の脱保護を用いて、オキシム結合をポリアミドとポリアミドの遊離ペンダント基との間に配置することができる。
［Ｏ＝ＣＨＣＯ−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−［ＯＣＨ_２ＣＨ_２］_３−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）_ｎ］_４Ｌｙｓ_２Ｌｙｓ−

オキシム化学は、ダイマーおよびテトラマー分岐構成体の製造に用いるだけでなく、オクタマー分岐構成体のアセンブリにも適している（Ｒｏｓｅ、Ｋ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０；Ｒｏｓｅ、Ｋ．等、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）７：５５２）。当然ながら、そのようなｐＰＥＧポリアミドを用いるとき、その目的のために他の化学を用いることができる（たとえば図７を参照のこと）。さらに、ポリアミド形成は、ＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を含むペプチド合成のための合成スキームに組み入れることができるが、そのようなスキームを練り上げるとき、アミノ分解ステップはＦｍｏｃ基を除去し、Ｂｏｃ化学が用いられる場合にはインドールのホルミル保護を除去することを留意しなければならない。

したがって、そのようなｐＰＥＧは、好ましい結合（たとえばアミド、チオエーテル、オキシムなど）を介して線状水溶性ポリアミド（たとえば−（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）_ｎ−等）に結合した種々の分岐コアを有するように製造することができ、ここで各線状水溶性ポリアミドの自由端はそれぞれ所望のペンダント基（たとえばカルボキシレート、アミノ、アミド等）を用いてキャップして所望の電荷を提供することができる。さらに、本発明の線状および分岐状ｐＰＥＧは、ユニークで相互反応性の１つまたは複数の官能基を有する合成タンパク質に結合するためにユニークな官能基を含むように製造することができ、ｐＰＥＧのペンダント基は、好ましくは非抗原性である（たとえば図７を参照のこと）。

本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれると具体的に且つ個別に指示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込むものとする。本発明の内容を説明するために、本明細書において本発明の背景の考察が含まれる。これは、請求の範囲のいずれかの優先権主張日の時点で、参照された資料のいずれかが世界のいずれかの場所で公表されているか、知られている、あるいは従来技術または周知の事柄の一部であることを認めるものであるとみなされるものではない。ここに本発明を一般的に説明したが、例示的なものとして提供され、明記されない限り本発明を限定するものではない以下の実施例を参照することによって、本発明はより容易に理解されるであろう。

（実施例）
実施例１
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−０の合成
合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ）を合成した。完全長合成タンパク質（「ＳＥＰ−０（１〜１６６）」とする）の配列は以下のとおりであり、
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ （配列番号：１）
配列中、Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示す。このＳＥＰ−０タンパク質は、以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成された。
セグメントＳＥＰ−０：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：１の残基１〜３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル
セグメントＳＥＰ−０：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：１の残基３３〜８８からなる）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴＶＰ ＤＴＫＶＮＦＹＡＷＫ ＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥ
ＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥ ＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶ ＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ^３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：１の残基８９〜１１６からなる）：
ＣＰＬＱＬＨＶＤＫＡ ＶＳＧＬＲＳＬＴＴＬ ＬＲＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ^８９はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−０：４（ＧＲＦＮ１７１４、配列番号：１の残基１１７〜１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＳ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ
ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃ末端システイン（Ｃｙｓ^１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）

ペプチドＳＥＰ−０：１およびＳＥＰ−０：２およびＳＥＰ−０：３を、ＡＢＩ４３３Ａ自動ペプチド合成装置で、または手作業の鎖アセンブリで、Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）化学のためのｉｎ ｓｉｔｕ中和プロトコル、および確立されたＳＰＰＳ、側鎖保護、およびチオエステル樹脂法を用いる段階的固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（Ｈａｃｋｅｎｇ等、ＰＮＡＳ（１９９９）９６：１００６８〜１００７３、およびＳｃｈｎｏｌｚｅｒ等、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜１９３）によってチオエステル生成樹脂上で合成するか、あるいは供給業者に注文し、入手した。たとえば、ＢｏｃＳＰＰＳ保護基の標準セットを用い、すなわちＡｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（４ＭｅＢｚｌ）およびＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｇｌｕ（ｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、Ｌｙｓ（ＣＩＺ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ホルミル）、Ｔｙｒ（ＢｒＺ）であり、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎは非保護側鎖であった。セグメントＳＥＰ−０：４は、−ＯＣＨ_２−Ｐａｍ−樹脂上で同様に合成した。これらのペプチドを、標準的なＢｏｃ化学手順に従い、ＨＦ／ｐ−クレゾールを用いて脱保護し、同時に樹脂支持体から開裂したが、しかしながらＨＦ／ｐ−クレゾール中で除去されない保護基を含有するペプチドの場合、保護基は維持された。これらのペプチドを、分取Ｃ４逆相高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で精製した。純粋ペプチドを含有する分画を、ＥＳ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）を用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。

ステップ１：ライゲーション＃１ セグメントＳＥＰ−０：４およびセグメントＳＥＰ−０：３を、濃度１５ｍＭでＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウムおよび１％チオフェノールを含有する飽和リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーション混合物を、ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）２ｍｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム６ｍｌ、２５％β−メルカプトエタノールを含有する１００ｍＭリン酸塩の溶液に添加し、２０分間インキュベートした。その溶液を、１５ｍｇ／ｍｌのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ）氷酢酸溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラム（直径１インチ）に充填した。次いで、そのペプチドを分取勾配逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

ステップ２：Ａｃｍ除去＃１ Ａｃｍ除去のために、プールしたＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４分画を含有するアセトニトリル水溶液をＨＰＬＣグレードの水で１ｘ希釈し、最終濃度２モルで固形尿素を添加した。３倍モル過剰（予期される全システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ（酢酸）_２Ｈｇ溶液を添加し、その溶液を１時間攪拌した。次いで、その溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の生成物ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ３：ライゲーション＃２ 等量のＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４およびＳＥＰ−０：２を合わせて、１５ｍＭ濃度で純ＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウムおよび１％チオフェノールを含有する２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。１日のライゲーション後、ライゲーション混合物を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍｌ、および６Ｍ塩化グアニジニウム２０ｍｌ、ｐＨ４の溶液に添加し、２０分間インキュベートして、残存する保護基を除去した。その溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ４：カルボキシメチル化 ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４を、１５ｍＭ濃度でＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２倍過剰（ｖ／ｖ）の２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。最小量のメタノールに溶解した２５倍過剰のブロモ酢酸を添加し、その溶液を２時間反応させた。その溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望のカルボキシメチル化生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔを含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

ステップ５：ピコリル除去 亜鉛末を２ＭのＨＣｌ中で３０分間活性化した。ペプチドＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔを、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で純ＴＦＥに溶解した。その溶液を（新たに添加した）３５ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニンおよび３５ｍｇ／ｍｌのドデシルサルコシン（すなわちＮ−ドデカノイルサルコシンナトリウム）を含有する４ｘ（ｖ／ｖ、ＴＦＥに対して）の６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ４で希釈した。その溶液を、活性化Ｚｎ粉末に添加した。反応は〜１時間間隔でモニターし、５時間後に完了する。完了後、上澄みを除去し、残存するＺｎ粉末を、２０％ＴＦＥを含有する３５ｍｇ／ｍｌＬ−メチオニンおよび３５ｍｇ／ｍｌドデシルサルコシン含有６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ４、１００ｍＭ酢酸塩で５分間２回洗浄し、２０％β−メルカプトエタノールを含有する同じ溶液で１回洗浄した。混合生成物を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の修飾生成物ＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏを含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

ステップ６：Ａｃｍ除去＃２ プールしたＳＥＰ−０：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏの溶液を、ＨＰＬＣグレードの水で３ｘ希釈し、最終濃度２モルで固形尿素を添加した。３倍モル過剰（予期される全システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ（酢酸）_２Ｈｇ溶液を添加し、その溶液を１時間攪拌した。次いで、その溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の生成物ＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−Ｐｉｃｏを含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、２ｘ（ｗ／ｗ、ペプチド質量に対して）のＤＰＣ（ドデシルホスホコリン）を含有する水で２ｘ（ｖ／ｖ）希釈し、一晩凍結乾燥した。

ステップ７：ライゲーション＃３ 等量のＳＥＰ−０：２＋ＳＥＰ−０：３＋ＳＥＰ−０：４＋Ｅｔ−ＰｉｃｏおよびＳＥＰ−０：１を合わせて、１５ｍＭ濃度で純ＴＦＥに溶解し、６Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加した。その溶液に、１％チオフェノールを添加した。１日のライゲーション後、ライゲーション混合物を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍｌ、および６Ｍ塩化グアニジニウム２０ｍｌ、ｐＨ４の溶液に添加し、２０分間インキュベートして、残存する保護基を除去した。その溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−０（１〜１６６）（配列番号：１）を含有する分画をエレクトロスプレー質量分析法によって同定し、２ｘ（ｗ／ｗペプチド質量に対して）のドデシルサルコシンを含有する水で２ｘ（ｖ／ｖ）希釈し、凍結乾燥した。

ステップ８：フォールディング（折りたたみ） 完全長結合ペプチドＳＥＰ−０（１〜１６６）を、６Ｍ塩化グアニジニウム、２０％ＴＦＥ、１０倍モル過剰（タンパク質のＣｙｓ残基に対して）のシステインを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した。この溶液を、３Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）溶液に対して、室温で一晩透析した。次いでその溶液を、１Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）溶液に対して、室温４℃で４時間透析し、最後に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、４℃で４時間透析して、最終フォールド生成物を得た。フォールディングは、エレクトロスプレーＥＳ−ＭＳおよびＣＤ（円偏光二色性）分光法によって確認した。

ステップ９：精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン濃縮バイアルで５ｘ濃縮し、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０で平衡させたＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカチオン交換カラムに充填した。折りたたまれたタンパク質を、５００ｍＭのＮａＣｌへの１０分の直線塩勾配で溶出した。所望の折りたたまれた生成物ＳＥＰ−０（１〜１６６）を含有する分画を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって同定、凍結し、−８０℃で貯蔵した。折りたたまれたタンパク質生成物の分析逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトル、ならびにＣＤスペクトルは、折りたたまれたタンパク質の存在を実証した。

実施例２
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
２番目の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ３０とする）を、ＳＥＰ−０の２４および１２６位にオキシム形成基を含有するように合成した。次いでこれらの基を用いて、線状（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８カルボキシレート（ＥＤＡ＝（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３ジアミンであり、ＴＴＤとも呼ばれる。Ｓｕｃｃ＝−ＣＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ−）ポリマーがそのタンパク質主鎖に結合しているＳＥＰ−１−Ｌ３０を形成した。完全長ＳＥＰ−１（１〜１６６）の配列は以下のとおりであり、
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ （配列番号：２）
配列中、Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し、Ｋ^ＯＸは、オキシム結合を介して指定の水溶性ポリマーにカップリングしたオキシムリンカー基でε−アミノ基において化学修飾されている非天然リジンを示す。

Ａ．ＧＲＦＮＰ３２によるＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
オキシム形成を行って、アミノオキシアセチル基を有する水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を有するペプチドに結合した。これを達成するために、以下のペプチドセグメントを合成した。
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６、配列番号：２の残基１１７〜１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ^１２６はε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾され、Ｃｙｓ^１１７はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１〜３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ^２４はレブリン酸残基で修飾されている）

実施例１のとおり、セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）をチオエステル生成樹脂上で、セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）を−ＯＣＨ_２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４および１２６を、初めにε−アミノ基においてＦｍｏｃ基で保護した。鎖アセンブリの完了後、Ｆｍｏｃを有するアミノ基を標準的なＦｍｏｃ脱保護手順に従って脱保護し、各ペプチド樹脂にそれぞれレブリン酸を結合することによって修飾した。次いでこれらのペプチドを、実施例１に記載のとおり、脱保護し、同時に樹脂支持体から開裂した。ペプチドを、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋ペプチドを含有する分画をＥＳ−ＭＳを用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。ＧＲＦＮＰ３２［−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８カルボキシレート］を、標準的なプロトコルに従って、Ｓａｓｒｉｎカルボキシル生成樹脂上でアセンブルした（Ｒｏｓｅ、Ｋ．他、米国特許出願第０９／３７９２９７号；Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）。５倍過剰の活性化Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸をカップリングすることによって、アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分をポリマーのＮ末端アミノ基に結合した。そのポリマー鎖を、典型的なＦｍｏｃ化学手順を用いて樹脂支持体から開裂した。ポリマー鎖を、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋なポリマーを含有する分画をＥＳ−ＭＳを用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。

セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ３２を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に合わせて溶解した。次いで、その溶液を凍結乾燥した。その乾燥粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを非修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、プール、凍結乾燥した。

セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ３２を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に合わせて溶解した。次いで、その溶液を凍結乾燥した。その乾燥粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プール、凍結乾燥した。

Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ３０の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ３０を以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した。
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１〜３２に対応）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ^２４はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３〜８８に対応）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ^３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９〜１１６に対応）：
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ^８９はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１１７〜１６６に対応）：
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ^１２６はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されており、Ｃ末端システインはピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）

追加のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、フォールディング、および精製を、実施例１に記載のとおり行い、完全長フォールドＳＥＰ−１−Ｌ３０を得た。フォールドタンパク質生成物の分析逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトル、ならびにＣＤスペクトルは、フォールドタンパク質の存在を実証した。

実施例３
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
３番目の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｌ２６とする）を、ＳＥＰ−０の２４および１２６位にオキシム形成基を含有するように合成した。次いで、これらの基を用いて、線状ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８カルボキシレートおよび（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_６−アミドが、それぞれ２４位および１２６位においてオキシム結合を介してタンパク質主鎖に結合しているＳＥＰ−１−Ｌ２６を形成した。完全長ＳＥＰ−１（１−１６６）の配列は以下のとおりであり、
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ （配列番号：２）
配列中、Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し、Ｋ^ＯＸは、オキシム結合を介して指定の水溶性ポリマーにカップリングしたオキシムリンカー基でε−アミノ基において化学修飾されている非天然リジンを示す。

ＳＥＰ−１−Ｌ３０と対照的に、ＳＥＰ−１−Ｌ２６構成体は、１２６位に結合されたより小さな非荷電水溶性ポリマーを有するように設計された。２４位に結合されたポリマーは、ＳＥＰ−１−Ｌ３０と同じである。完全長生成物のアセンブリは、実施例２に記載したとおりである。

Ａ．ＧＲＦＮＰ６によるＧＲＦＮ１７７６のオキシム化およびＧＲＦＮＰ３２によるＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
オキシム形成を行い、アミノオキシアセチル基を有する水溶性ポリマーを、ケトンカルボニル基を有するペプチドに結合した。これを達成するために、以下のペプチドセグメントを合成した。
セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６、配列番号：２の残基１１７〜１６６からなる）：
ＣＡＩＳＰＰＤＡＡＫ ＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤ ＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳ
ＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹ ＴＧＥＡＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ^１２６はε−アミノ基においてレブリン酸残基で修飾され、Ｃｙｓ^１１７はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１、配列番号：２の残基１〜３２からなる）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ^２４はレブリン酸残基で修飾されている）

実施例１のとおり、セグメントＳＥＰ−１：１（ＧＲＦＮ１７１１）をチオエステル生成樹脂上で、セグメントＳＥＰ−１：４（ＧＲＦＮ１７７６）を−ＯＣＨ_２−Ｐａｍ−樹脂上で合成した。これら２つのペプチドセグメントのリジン２４および１２６を、初めにε−アミノ基においてＦｍｏｃ基で保護した。鎖アセンブリの完了後、Ｆｍｏｃを有するアミノ基を標準的なＦｍｏｃ脱保護手順に従って脱保護し、標準的にカップリングプロトコルに従って各ペプチド樹脂にそれぞれレブリン酸を結合することによって修飾した。次いで、実施例１に記載のＢｏｃ化学手順によって、これらのペプチドを脱保護し、同時に樹脂支持体から開裂した。ペプチドを、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって個別に精製した。各ペプチドに関して、純粋ペプチドを含有する分画をＥＳ−ＭＳを用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。

水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８カルボキシレート（ＧＲＦＮＰ３２）を、標準的なプロトコルに従って、Ｓａｓｒｉｎカルボキシル生成樹脂上でアセンブルした（Ｒｏｓｅ、Ｋ．他、米国特許出願第０９／３７９２９７号；Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）。水溶性ポリマー（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_６−アミド（ＧＲＦＮＰ６）を、標準的なプロトコルに従って、Ｓｉｅｂｅｒアミド生成樹脂上でアセンブルした（Ｒｏｓｅ、Ｋ．他、米国特許出願第０９／３７９２９７号；Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）。５倍過剰の活性化Ｂｏｃ−アミノオキシ酢酸をカップリングすることによって、アミノオキシアセチル（ＡｏＡ）部分を樹脂結合ポリマーそれぞれのＮ末端アミノ基に結合した。その２つのポリマー鎖を個々に、典型的なＦｍｏｃ化学手順を用いてそれぞれの樹脂支持体から開裂した。各ポリマー鎖を、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。各ポリマーに関して、純粋ポリマーを含有する分画をＥＳ−ＭＳを用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。

セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ６を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に、合わせて溶解した。次いで、その溶液を凍結乾燥した。その乾燥粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを非修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ６を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プール、凍結乾燥した。

セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ３２を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に、合わせて溶解した。次いで、その溶液を凍結乾燥した。その乾燥粉末を溶解し、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによってポリマー修飾ペプチドを未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プール、凍結乾燥した。

Ｂ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｌ２６の合成
ＳＥＰ−１−Ｌ２６を以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した。
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ３２（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ３２、配列番号：２の残基１〜３２に対応）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ^２４はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ３２にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３〜８８に対応）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ^３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９〜１１６に対応）：
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ^８９はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ６（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ６、配列番号：２の残基１１７〜１６６に対応）
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ^１２６はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ６にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されており、Ｃ末端システイン（すなわち、Ｃｙｓ^１６１）はピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）

追加のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、フォールディング、および精製を、実施例１および２に記載のとおり行い、完全長フォールドＳＥＰ−１−Ｌ２６を得た。フォールドタンパク質生成物の分析Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトル、ならびにＣＤスペクトルは、フォールドタンパク質の存在を実証した。

実施例４
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
４番目の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−１−Ｂ５０とする）を合成した。完全長ＳＥＰ−１−Ｂ５０のアミノ酸配列は、ＳＥＰ−１−Ｌ３０の配列と同じであり、
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷΨＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫΨＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ （配列番号：２）
配列中、Ψは、スルフヒドリル基においてカルボキシメチル化されているシステインからなる非天然アミノ酸残基を示し、Ｋ^ＯＸは、オキシム結合を介して指定の水溶性ポリマーにカップリングしたオキシムリンカー基でε−アミノ基において化学修飾されている非天然リジンを示す。

しかしながら、このタンパク質は、ＳＥＰ−１−Ｌ３０の線状（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）_１８ポリマーではなく、４つの線状（Ｓｕｃｃ−ＥＤＡ）_１２部分を有する分岐ポリマー構成体で誘導化した。誘導化は、オキシム結合によって達成した。完全長生成物のアセンブリは、実施例２に記載のとおりであった。

Ａ．複数のチオール基を有するテンプレートＧＲＦＮＰ１７の合成
テンプレートＧＲＦＮＰ１７を、０．４ｍｍｏｌスケールのアミド生成（４−メチル）ベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で手作業によって合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを、標準的なカップリングプロトコルを用いてカップリングした（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、Ｍ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜９３）。２．１ｍｍｏｌアミノ酸、０．５ＭのＨＢＴＵ３．８ｍｌ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち５倍過剰のアミノ酸を用いた。Ｆｍｏｃ保護基を除去した後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−０Ｈを、標準的なアミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした（２．１ｍｍｏｌアミノ酸、０．５ＭのＨＢＴＵ３．８ｍｌ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち５倍過剰のアミノ酸）。第２のＦｍｏｃ除去ステップの後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−０Ｈを、標準的なアミノ酸カップリングプロトコルを用いてカップリングした（４．２ｍｍｏｌアミノ酸、０．５ＭのＨＢＴＵ７．６ｍｌ中の１０％ＤＩＥＡ、すなわち遊離アミンに対して５倍過剰のアミノ酸）。最後のＦｍｏｃ脱保護ステップの後、５倍過剰（遊離アミンに対して）のＤＭＦ中Ｓ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ｏＰｆｐ）を３０分間カップリングした。Ｃ末端リシル残基の側鎖のＢｏｃ保護基を、純ＴＦＡで１分のバッチ洗浄を２回行うことによって除去し、次いでＤＭＦ中１０％ＤＩＥＡで洗浄することによって樹脂を中和した。２ｍｍｏｌのＢｏｃ−アミノオキシ酢酸、および２ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を、ＤＭＦ３ｍｌに溶解した。２ｍｍｏｌのＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）を添加した後、この酸を３０〜６０分間活性化した。その溶液を中和樹脂に添加し、１時間カップリングした。最後に、Ｓ結合アセチル基を、３０分間ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによって除去した。遊離アルデヒドのスカベンジャとしてシステインの存在下、標準的なＢｏｃ化学手順に従って、ＨＦ／ｐ−クレゾールを用い、そのテンプレートを脱保護し、同時に樹脂支持体から開裂した（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ、Ｍ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜９３）。５０％Ｂ（すなわち、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液）中の回収ポリアミド（アルデヒドを含まない）を、凍結し、凍結乾燥した。精製のために、そのテンプレート粗生成物を２ｍｌの５０％Ｂに溶解し、１００ｍｌの１００％Ａ（すなわち、０．１％ＴＦＡ水溶液）を添加して試料を希釈した（アルデヒドの付加が確実であるため、塩化グアニジニウムまたはアセテートの添加は回避）。そのテンプレートを、３％Ｂ、Ｔ＝４０℃で平衡したＣ４分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填した。塩を定組成溶離し、所望のテンプレートＧＲＦＮＰ１７を直線勾配で精製した。所望の生成物を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プールし、凍結乾燥した。

Ｂ．分岐水溶性ポリマーＧＲＮＰ２９の合成
分子量１５ｋＤａの分岐（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１２ポリマーＧＲＦＮＰ２９を、精製チオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７、および線状ポリマーＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１２カルボキシレートのチオエーテル生成ライゲーションによって合成したが、ここでＧＲＦＮＰ３１は標準的なプロトコルに従ってＳａｓｒｉｎカルボキシ生成樹脂上で合成した（Ｒｏｓｅ、Ｋ．他、米国特許出願第０９／３７９２９７号；Ｒｏｓｅ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）。

１．３ｘモル過剰（全チオールに関して）の精製ＧＲＦＮＰ３１、Ｂｒ−アセチル化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１２、および精製チオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７を合わせて、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ／６Ｍ塩化グアニジニウムｐＨ８．７に濃度〜１０ｍＭで溶解した。溶解後、その溶液を０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．７緩衝液で３倍（ｖ／ｖ）に希釈した。ライゲーション混合物を室温で攪拌し、反応を逆相ＨＰＬＣおよびＥＳ／ＭＳでモニターした。追加のＧＲＦＮＰ３１反応物を、所望の反応生成物が主生成物となるまで必要に応じて添加した。仕上げとして、３ｘ（ｖ／ｖ、ライゲーション混合物に対して）の０．１Ｍ酢酸塩／６Ｍ塩化グアニジニウム、ｐＨ４を添加し、その溶液を分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填して、直線勾配で精製した。純粋ＧＲＦＮＰ２９構成体を含有する分画をＥＳ−ＭＳを用いて同定し、プール、凍結乾燥した。

Ｃ．ＧＲＦＮＰ２９によるＧＲＦＮ１７７６およびＧＲＦＮ１７１１のオキシム化
セグメントＳＥＰ−１：４およびセグメントＳＥＰ−１：１を、実施例２に記載のとおり合成した。セグメントＳＥＰ−１：４およびＧＲＦＮＰ２９を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に、合わせて溶解した。その溶液を凍結乾燥した。その乾燥粉末を、分取逆相ＨＰＬＣカラム（直径１インチ）に充填した。ポリマー修飾ペプチドを、分取勾配Ｃ４逆相ＨＰＬＣによって非修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：４＋ＧＰ２９を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

セグメントＳＥＰ−１：１およびＧＲＦＮＰ２９を等モル比で、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に、合わせて溶解した。その溶液を凍結および凍結乾燥した。その乾燥粉末を、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、分取ＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィ）カラム（直径１インチ）に充填した。ポリマー修飾ペプチドを、定組成溶離によって非修飾ペプチドおよび未反応ポリマーから分離した。所望のオキシム化生成物ＳＥＰ−１：１＋ＧＰ２９を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

Ｄ．合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−１−Ｂ５０の合成
ＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）を以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した。
セグメントＳＥＰ−１：１＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７１１＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号：２の残基１〜３２に対応）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＫ^ＯＸＩＴＴＧＣＡ
ＥＨ−チオエステル（Ｌｙｓ^２４はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ２９にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されている）
セグメントＳＥＰ−１：２（ＧＲＦＮ１７１２、配列番号：２の残基３３〜８８に対応）：
ＣＳＬＮＥＫＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＶＫＳＳＱＰＷ−チオエステル（Ｃｙｓ^３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：３（ＧＲＦＮ１７１３、配列番号：２の残基８９〜１１６に対応）：
ＣＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫ−チオエステル（Ｃｙｓ^８９はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−１：４＋ＧＰ２９（ＧＲＦＮ１７７６＋ＧＲＦＮＰ２９、配列番号：２の残基１１７〜１６６に対応）：
ＣＡＩＳ ＰＰＤＡＡＫ^ＯＸＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ
ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｌｙｓ^１２６はε−アミノ基において、Ｋ^ＯＸと示されるレブリン酸−アミノオキシアセチル（Ｌｅｖ−ＡｏＡ）オキシム結合を介してＧＲＦＮＰ２９にカップリングしているレブリン酸オキシムリンカー基で修飾されており、Ｃ末端システインはピコリル（ｐｉｃｏ）保護基を有する）

精製をＲｅｓｏｕｒｃｅＱカラムで行ったことを除いて、追加のペプチドの合成、ライゲーション反応、カルボキシメチル化、保護基除去反応、フォールディング、および精製を実施例１および２に記載のとおり行い、完全長折りたたみＳＥＰ−１−Ｂ５０（配列番号：２）を得た。折りたたみタンパク質生成物ＳＥＰ−１−Ｂ５０の分析Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラムおよびＥＳ−ＭＳスペクトル、ならびにＣＤスペクトルは、折りたたみタンパク質の存在を実証した。

実施例５
合成赤血球産生刺激タンパク質ＳＥＰ−３−Ｌ４２の合成
５番目の合成赤血球産生刺激タンパク質（ＳＥＰ−３−Ｌ４２とする）を合成した。完全長ＳＥＰ−３タンパク質のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥＣＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ
ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬ ＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＡＣＳＳＱＰＷＥＰ
ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ
ＰＰＤＡＡＣＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ （配列番号：３）

２４、３８、８３、および１２６位のシステイン残基を、マレイミド官能化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８（ＧＲＦＮＰ３２）ポリマー単位で修飾して（マイケル付加反応によって）、ＳＥＰ−３−Ｌ４２を形成した。

詳細には、ＳＥＰ−３を以下の４つのポリペプチドセグメントから溶液中で合成した。
セグメントＳＥＰ−３：１（ＧＲＦＮ１７４７、配列番号：３の残基１〜３７に対応）：
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲ ＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫ ＥＡＥＣＩＴＴＧＣＡ
ＥＨＣＳＬＮＥ−チオエステル（Ｃｙｓ^７、Ｃｙｓ^２９、Ｃｙｓ^３３はＡｃｍ保護されている）
セグメントＳＥＰ−３：２（ＧＲＦＮ１７７４、配列番号：３の残基３８〜８２に対応）：
ＣＩＴ ＶＰＤＴＫＶＮＦＹＡ ＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡ ＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬ ＬＡ−チオエステル（Ｃｙｓ^３８はＡｃｍ基で側鎖保護されている）
セグメントＳＥＰ−３：３（ＧＲＦＮ１７４９、配列番号：３の残基８３〜１２５に対応）：
ＣＳＳＱＰＷＥＰ ＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳ ＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲ
ＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳ ＰＰＤＡＡ−チオエステル（Ｃｙｓ^８３はＡｃｍ基で側鎖保護されている）
セグメントＳＥＰ−３：４（ＧＲＦＮ１７５０、配列番号：３の残基１２６〜１６６に対応）：
ＣＡＡＰＬ ＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫ ＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲ
ＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡ ＣＲＴＧＤＲ−カルボキシレート（Ｃｙｓ^１６１は、Ｐｂｏ（すなわち、４−（ＣＨ_３Ｓ（Ｏ）−）ベンジル−）保護されている）

ペプチド合成： ペプチドＳＥＰ−３：１およびＳＥＰ−３：２およびＳＥＰ−３：３を、上述の特定のペプチドに示したように保護基方法を変更して、実施例１に記載の確立された側鎖保護法を用い、Ｂｏｃ化学ＳＰＰＳのためのｉｎ ｓｉｔｕ中和プロトコルによってチオエステル生成樹脂上で合成した。セグメントＳＥＰ−３：４を、−ＯＣＨ_２−Ｐａｍ−樹脂上で同様に合成した。これらのペプチドを、実施例１に記載のとおり脱保護し、同時に樹脂支持体から開裂した。上に記載の結果として生じたペプチドを、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋ペプチドを含有する分画を、ＥＳ−ＭＳを用いて同定し、続くライゲーションのためにプールし、凍結乾燥した。

ステップ１：ライゲーション＃１ セグメントＳＥＰ−３：４およびセグメントＳＥＰ−３：３を、濃度１５ｍＭでＴＦＥに溶解した。６Ｍ塩化グアニジニウムおよび１％チオフェノールを含有する飽和リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。ライゲーション後、ライゲーション混合物（１体積とする）を、２体積の｛ＴＦＥ２ｍｌ、６Ｍ塩化グアニジニウム６ｍｌ、２５％β−メルカプトエタノール含有１００ｍＭリン酸塩｝溶液に添加し、２０分間インキュベートした。その溶液を、１５ｍｇ／ｍｌのＴＣＥＰ氷酢酸溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含有する分画を、ＥＳ−ＭＳによって同定し、プールした。

ステップ２：Ａｃｍ除去＃１ Ａｃｍ除去のために、プールしたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４分画を含有するアセトニトリル水溶液をＨＰＬＣグレードの水で１ｘ希釈し、最終濃度２モルで固形尿素を添加した。３倍モル過剰（予期される全システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ（酢酸）_２Ｈｇ溶液を添加し、その溶液を１時間攪拌した。次いで、その溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の生成物ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ３：ライゲーション＃２ 等量のＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４およびＳＥＰ−３：２を合わせて、１５ｍＭ濃度で純ＴＦＥに溶解した。６Ｍグアニジニウムおよび１％チオフェノールを含有する２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。１日のライゲーション後、ライゲーション混合物（１体積とする）を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍｌ、および６Ｍグアニジニウム２０ｍｌ、ｐＨ４の２体積の溶液に添加し、２０分間インキュベートして、残存する保護基を除去した。その溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ４：Ａｃｍ除去 Ａｃｍ除去のために、プールしたＳＥＰ−３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４の分画を含有するアセトニトリル水溶液を、ＨＰＬＣグレードの水で１ｘ希釈し、最終濃度２モルで固形尿素を添加した。３倍モル過剰（予期される全システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ（酢酸）_２Ｈｇ溶液を添加し、その溶液を１時間攪拌した。次いで、その溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、Ｃ４半分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ５：ライゲーション＃３ 等量のＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４およびＳＥＰ−３：１を合わせて、１５ｍＭ濃度で純ＴＦＥに溶解した。６Ｍグアニジニウムおよび１％チオフェノールを含有する２５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、ペプチドセグメントの透明溶液を得た。１日のライゲーション後、ライゲーション混合物（１体積とする）を、ＴＦＥ１０ｍｌ、β−メルカプトエタノール１０ｍｌ、ピペリジン１０ｍｌ、および６Ｍグアニジニウム２０ｍｌ、ｐＨ４の２体積の溶液に添加し、２０分間インキュベートして、残存する保護基を除去した。その溶液を、２０％酢酸水溶液中の１５ｍｇ／ｍｌＴＣＥＰ溶液で酸性にし、分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望の結合生成物ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ６：ポリマーＧＲＦＮＰ３２の結合 ＧＲＦＮＰ３２−マレイミドと称するマレイミド官能化線状（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８ポリマーを、マレイミド官能化線状（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８ポリマー（すなわち、マレイミド−（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）_１８）を形成するための製造業者プロトコルに従って、ＧＲＦＮＰ３２をＢＭＰＳ（３−マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル、Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で機能化することによって調製した。ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４を、必要最小量のＴＦＥに溶解した。３倍過剰のＧＲＦＮＰ３２−マレイミドを、６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．５に溶解し、ＴＦＥ溶液に添加した。マイケル付加反応の進行を、分析逆相ＨＰＬＣによって追跡した。反応が完了した後、その溶液を分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、直線勾配で精製した。所望のポリマー修飾生成物ＳＥＰ３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ｐＰＥＧ（すなわち、Ｃｙｓ^２４、Ｃｙｓ^３８、Ｃｙｓ^８３、およびＣｙｓ^１２６の側鎖チオールに結合したＧＲＦＮＰ３２の４つの複製を有する結合完全長１６６残基ポリペプチド鎖であり、したがってＳＥＰ３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２とも呼ばれる）を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ７：Ｐｂｏ除去 Ｐｂｏ除去のために、ＳＥＰ３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２の凍結乾燥粉末を、５％エタンジチオールを含有する純ＴＦＡに溶解した。次いで、Ｐｂｏ基を、１０％チオアニソールおよび１５％ブロモトリメチルシランを添加することによって３０分間開裂した。その溶液を回転式エバポレータで乾燥し、０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル水溶液に取った。結果として生じた溶液を、半分取逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配によって精製した。所望のＣｙｓ^１６１脱保護生成物ＳＥＰ３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏを含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ８：Ａｃｍ除去 Ｃｙｓ^７、Ｃｙｓ^２９、およびＣｙｓ^３３の側鎖からの最終Ａｃｍ除去のために、プールしたＳＥＰ３：Ａｃｍ＋ＳＥＰ−３：１＋ＳＥＰ−３：２＋ＳＥＰ−３：３＋ＳＥＰ−３：４＋ＧＰ３２−Ｐｂｏの分画を含有するアセトニトリル水溶液をＨＰＬＣグレードの水で１ｘ希釈し、最終濃度２モルで固形尿素を添加した。３倍モル過剰（予期される全システイン濃度に対して）の３％酢酸水溶液中３０ｍｇ／ｍｌ（酢酸）_２Ｈｇ溶液を添加し、その溶液を１時間攪拌した。次いで、その溶液をβ−メルカプトエタノール中で２０％とし、半分取Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムに充填し、段階勾配で精製した。所望の結合ポリマー修飾生成物ＳＥＰ−３（１〜１６６）を含有する分画をＥＳ−ＭＳによって同定し、一晩凍結乾燥した。

ステップ９：フォールディング 完全長結合ポリマー修飾ペプチドＳＥＰ−３（１〜１６６）を、６Ｍ塩化グアニジニウム、２０％ＴＦＥ、１０倍モル過剰（ＳＥＰ−３のＣｙｓ残基に対して）のシステインを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した。その溶液を、３Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）溶液に対して、室温で一晩透析した。次いでその溶液を、１Ｍ塩化グアニジニウムを含有する２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．７）溶液に対して、４℃で４時間透析し、最後に１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して、４℃で４時間透析して、最終フォールド生成物を得た。フォールディングは、エレクトロスプレーＥＳ−ＭＳおよびＣＤ分光法によって確認した。

ステップ１０：精製 折りたたまれたポリペプチドを、セントリコン濃縮バイアルで５ｘ濃縮し、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０で平衡させたＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカチオン交換カラムに充填した。折りたたまれたタンパク質を、５００ｍＭのＮａＣｌへの１０分の直線塩勾配で溶出した。所望の折りたたまれた生成物ＳＥＰ−３−Ｌ４２を含有する分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定、凍結し、−８０℃で貯蔵した。

実施例６
合成赤血球産生刺激タンパク質の生物活性アッセイ
フォールド合成赤血球産生刺激タンパク質、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、ＳＥＰ−１−Ｂ５０、およびＳＥＰ−３−Ｌ４２の生物活性を、コントロール標準として市販の組換えエリスロポエチンを用いる因子依存細胞系増殖アッセイにおいて、ＵＴ／７および３２Ｄ１０３１９７細胞系を用い判定した。ＵＴ−７は、増殖および生存に関してインターロイキン−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）の１つに絶対依存性を有するヒト巨核芽球白血病細胞系である（Ｍｉｕｒａ Ｙ．等、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ（１９９８）９９：１８０〜１８４；Ｋｏｍａｔｓｕ Ｎ．等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９１）５１：３４１〜８）。３２Ｄ１０３１９７は、マウス造血細胞系である（Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９９２）１０：１１６〜２５）。

イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、グルタミン、およびＰｅｎｓｔｒｅｐ中でＳＥＰ構成体の保存溶液を作製し、その保存溶液の連続２ｘ希釈液をマルチウェルプレートに添加し、５０００細胞／５０μｌの濃度でヒトＵＴ／７ＥＰＯ細胞を加えた。プレートを５％ＣＯ_２の存在下、３７℃でインキュベートし、増殖を毎日モニターした。４日後、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）中の２．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ（メチルチアゾールテトラゾリウム）２０μｌを添加し、プレートを４時間インキュベートした。ＩＰＡ１５０μｌを加え、各ウェルの吸光度を５６２ｎｍで読み取った。ＳＥＰ化合物のＥＤ５０（最大効果の５０％に達する有効量）値を求め、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅハムスター卵巣）細胞産生ｒｈＥＰＯ（組換えヒトエリスロポエチン）の値と比較した。これらの実験の結果は、すべての合成赤血球産生刺激タンパク質が生物活性を示すことを実証した。ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１−Ｌ２６、ＳＥＰ−１−Ｌ３０、およびＳＥＰ−１−Ｂ５０のＥＤ５０の結果を表ＶＩに示す。

本発明をその特定の実施形態に関して述べたが、さらなる変更が可能であり、本出願が、一般に本発明の原理に従い、本発明の属する技術分野において知られ、慣例的に行われている範囲内であって、且つ本明細書に記載の本質的な特徴に適用できるような本発明の開示からの逸脱を含む本発明の変形、使用、または適応を含むものであることは理解されるであろう。

擬似天然型化学的ライゲーションの全体的な反応を例示する図である。 本発明の合成生物活性タンパク質を調製する全体的なプロセスを例示する図である。 合成赤血球産生刺激タンパク質の好ましい型の基本構造を示す図である。 遊離アミノ末端またはカルボキシ末端を持たない環状順列化ＳＥＰ類似体の一般的な構造を示す図である。ｐＰＥＧ（本明細書に記載の「精密ＰＥＧ」）結合部位は、ＳＥＰ類似体と位置的に同一である。ＳＥＰ類似体は、Ｐ１２６ＣおよびＡ１２５Ｘなどの、新しいＮ／Ｃ末端位置間のオキシム結合によって環化される。ＳＥＰ類似体の全分子量は、所与の類似体の修飾に用いられるｐＰＥＧに応じて約５０〜８０ｋＤａの範囲となり、ｐＰＥＧを介した流体力学分子量は約１００ｋＤａと推定される。 合成生物活性ＧＣＳＦタンパク質の基本構造を示す図である。この図において、「Ｊ」は、疎水性側鎖を有する非天然コード化残基を示す。 好ましい合成ＲＡＮＴＥＳ類似体の構造を示す図である。この図において、ＮＮＹ＝ノナノイル、Ｘ＝疎水性側鎖ｐＰＥＧを有する非天然コード化アミノ酸、ＦＡ＝脂肪酸である。 分岐鎖ｐＰＥＧポリマーの形成を図式的に示す図である。

Claims (42)

1. 側鎖が式−Ｓ−Ｒ_ａａを有し、該式中、Ｒ_ａａは、表Ｉの擬似Ａｓｐ、擬似Ｇｌｎ、擬似Ａｓｎ、擬似Ｓｅｒ、擬似Ｔｈｒ、擬似Ｌｙｓ、擬似Ａｒｇ、擬似Ｍｅｔ、擬似Ｐｈｅ、擬似Ｔｙｒ、擬似ホスホｔｙｒ、擬似Ｄｏｐａ、擬似Ｇｌａ、擬似Ｈｉｓ、擬似Ｔｒｐ、擬似Ｌｅｕ、擬似Ｖａｌ、擬似Ｉｌｅ、擬似Ｎ−（エチル）トリフルオロアセトアミド、擬似ＳＢＦ、及び擬似メチルＳＢＦ、から成る群より選択される擬似アミノ酸残基を含有する合成タンパク質。
2. 当該タンパク質は、リボソーム特定生物活性タンパク質の持つ生物活性を有する、請求項１に記載の合成タンパク質。
3. 当該合成タンパク質は、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有する、請求項２に記載の合成タンパク質。
4. 当該タンパク質の複数のアミノ酸残基の少なくとも１つは、隣接アミノ酸残基に非アミド結合によって結合している、請求項１に記載の合成タンパク質。
5. 当該非アミド結合は、チオエステル結合、チオエーテル結合およびオキシム結合からなる群から選択される、請求項４に記載の合成タンパク質。
6. リボソーム産生生物活性タンパク質は、哺乳動物のタンパク質である、請求項２に記載の合成タンパク質。
7. 当該哺乳動物のタンパク質は、ヒト、サル、ウシ、マウス、ブタ、ヒツジおよびウマの各タンパク質からなる群から選択される、請求項６に記載の合成タンパク質。
8. 当該哺乳動物のタンパク質は、ヒトのタンパク質である、請求項７に記載の合成タンパク質。
9. 当該タンパク質は、タンパク質受容体もしくはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドもしくはそのフラグメント、またはサイトカインからなる群から選択される、請求項１から８のいずれか１つに記載の合成タンパク質。
10. 当該合成生物活性タンパク質は、サイトカインの生物活性を有する、請求項１に記載の合成タンパク質。
11. 当該サイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、赤血球産生刺激タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、増殖因子および単一ペプチドホルモンからなる群から選択される、請求項１０に記載の合成タンパク質。
12. 当該サイトカインは、赤血球産生刺激タンパク質である、請求項１１に記載の合成タンパク質。
13. 当該赤血球産生刺激タンパク質は、エリスロポエチンである、請求項１２に記載の合成タンパク質。
14. 当該合成生物活性タンパク質は、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３からなる群から選択される、請求項１２に記載の合成タンパク質。
15. 当該サイトカインは、ＲＡＮＴＥＳタンパク質である、請求項１０に記載の合成タンパク質。
16. 当該サイトカインは、増殖因子である、請求項１０に記載の合成タンパク質。
17. 当該増殖因子は、Ｇ−ＣＳＦである、請求項１６に記載の合成タンパク質。
18. 当該リボソーム特定生物活性タンパク質は、１つまたは複数のグリコシル化部位でグリコシル化されている、請求項２に記載の合成タンパク質。
19. 薬剤組成物を必要としている人の治療の為の薬剤組成物の製造における、請求項１に記載の化合物の使用方法。
20. 当該合成タンパク質は、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有する、請求項１９に記載の使用方法。
21. 当該リボソーム特定生物活性タンパク質は、ヒトのタンパク質である、請求項１９に記載の使用方法。
22. 当該タンパク質は、タンパク質受容体もしくはそのフラグメント、タンパク質受容体リガンドもしくはそのフラグメント、またはサイトカインの生物活性を有する、請求項１９に記載の使用方法。
23. 当該合成タンパク質は、サイトカインの生物活性を有する、請求項２２に記載の使用方法。
24. 当該サイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、赤血球産生刺激タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、増殖因子および単一ペプチドホルモンからなる群から選択される、請求項２３に記載の使用方法。
25. 当該赤血球産生刺激タンパク質は、エリスロポエチンである、請求項２４に記載の使用方法。
26. 当該合成生物活性タンパク質は、ＳＥＰ−０、ＳＥＰ−１およびＳＥＰ−３からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用方法。
27. 当該サイトカインは、ＲＡＮＴＥＳタンパク質である、請求項２４に記載の使用方法。
28. 当該サイトカインは、増殖因子である、請求項２４に記載の使用方法。
29. 当該増殖因子は、Ｇ−ＣＳＦである、請求項２８に記載の使用方法。
30. 以下の式の所望のポリペプチドを合成する方法であって、
    ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ａａ_ｙ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨ
    該式中、ＱおよびＷは、それぞれ任意で存在する１つまたは複数の追加のアミノ酸残基を示し、ａａ_ＮＨ２は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基を示し、ａａ_ｘおよびａａ_ｙは、それぞれ側鎖ｘおよびｙを有する内部隣接アミノ酸残基を示し、ａａ_ＣＯＯＨは、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基を示し、
    該方法は、
    （Ａ）式ａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−ＣＯＳＲを有し、該式中、Ｒは、アリール、ベンジルおよびアルキル基を非限定的に含むチオエステル基に適合する任意の基である第１のペプチドを、式Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨを有する第２のペプチドに結合し、それによりポリペプチドａａ_ＮＨ２−Ｑ−ａａ_ｘ−Ｃｙｓ−Ｗ−ａａ_ＣＯＯＨを形成すること、および
    （Ｂ）該ポリペプチドを試薬Ｒ_ａａ−Ｘの存在下でインキュベートすることを含むものであって、該式中、Ｒ_ａａは、ＣＨ_２−ＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨＯＨＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、（ＣＨ_２）_２ＮＨ−ＰＧ、ＣＨ_２ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）_２、（ＣＨ_２）_２ＮＨ−Ｃ（ＮＨ_２）_２、ＣＨ_２ＣＨ_３、φ、ＣＨ_２φ、φ−ＯＨ、ＣＨ_２φ−ＯＨ、ＣＨ_２φ−ＯＰＯ_３、ＣＨ_２φ−（ＯＨ）_２、ＣＨ（ＣＯＯＨ）_２、ＣＨ_２−ＩＭ−ＰＧ、ＣＨ_２−ＩＮ、ＣＨ−（ＣＨ_３）_２、ＣＨ_２ＣＨ−（ＣＨ_３）_２、ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３、ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_２ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、アンモニウム４−クロロ−７−スルホベンゾ−フラザン、ＣＨ_２−アンモニウム４−クロロ−７−スルホベンゾ−フラザン、からなる郡から選択される基であり、
    Ｘは、良好な離脱基であり、
    該インキュベーションは、所望のポリペプチドを形成するのに充分な条件下で行われる方法。
31. Ｘは、ハロゲンである、請求項３０に記載の方法。
32. 当該ハロゲンは、Ｆ、ＩまたはＢｒである、請求項３１に記載の方法。
33. 当該アミノ酸ａａ_ｙは、擬似アミノ酸である、請求項３０に記載の方法。
34. 当該ポリペプチドは、リボソーム産生生物活性タンパク質により所有されている生物活性を有する、請求項３０に記載の方法。
35. 当該ポリペプチドは、約２５ｋＤａを超えるモノマー分子量を有する、請求項３０に記載の方法。
36. 当該ポリペプチドは、複数のアミノ酸残基から成り、該アミノ酸残基の少なくとも１つが、チオエステル結合、チオエーテル結合およびオキシム結合からなる群から選択される結合により、隣接アミノ酸残基に結合される、請求項３０に記載の方法。
37. 当該リボソーム産生生物活性タンパク質は、哺乳動物のタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
38. 当該哺乳動物のタンパク質は、ヒト、サル、ウシ、マウス、ブタ、ヒツジおよびウマの各タンパク質からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
39. 当該ポリペプチドは、サイトカインである、請求項３０から３８のいずれか１つに記載の方法。
40. 当該サイトカインは、インターロイキン、リンホカイン、ＲＡＮＴＥＳタンパク質、赤血球産生刺激タンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、増殖因子および単一ペプチドホルモンからなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
41. 当該赤血球産生刺激タンパク質は、エリスロポエチンである、請求項４０に記載の方法。
42. 当該ポリペプチドは、１つまたは複数のグリコシル化部位でグリコシル化されている、請求項３０に記載の方法。