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KR20030036591A - 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 및 그것의 제조와사용방법 - Google Patents

폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 및 그것의 제조와사용방법 Download PDF

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KR20030036591A
KR20030036591A KR10-2003-7000178A KR20037000178A KR20030036591A KR 20030036591 A KR20030036591 A KR 20030036591A KR 20037000178 A KR20037000178 A KR 20037000178A KR 20030036591 A KR20030036591 A KR 20030036591A
Authority
KR
South Korea
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chemokine
synthetic
synthetic chemokine
rantes
water soluble
Prior art date
Application number
KR10-2003-7000178A
Other languages
English (en)
Inventor
제임즈 에이. 브래드번
거드 지. 코첸도르퍼
질 지. 윌큰
Original Assignee
그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 filed Critical 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20030036591A publication Critical patent/KR20030036591A/ko

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Abstract

본 발명은 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인 및 그것의 제조와 사용방법에 관한 것이다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 폴리머 변형 폴리펩티드 키모카인 백본을 포함한다. 본 발명의 화합물과 방법은, HIV와 AIDS 관련 이상의 치료 및 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/죽상경화증, 기관이식 거부반응 및 류마티스성 관절염의 치료 같은, 천연발생 키모카인과 관련된 이상의 치료에 유용하다.

Description

폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 및 그것의 제조와 사용방법{POLYMER-MODIFIED BIOACTIVE SYNTHETIC CHEMOKINES, AND METHODS FOR THEIR MANUFACTURE AND USE}
키모카인은 백혈구 세포내이동(trafficking) 및 다양한 생물학적 과정에 관련된 작은 단백질이다(Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145-176, Rollins, BJ., Blood (1997) 90 (3): 909-928 및 Wells et al., Inflammation Res. (1999) 48: 353-362). 대부분의 키모카인은 편재되어, 주화성 유도에 의한 염증, 및 염증부위에 전형적으로 존재하는 상이한 유형의 염증세포의 세포 활성화를 증강시킨다. 몇몇의 키모카인은, 킬러 세포의 증식과 활성화를 유도함, 조혈 선구 세포형의 성장을 조절함, 염증 상태, 혈관신생 및 종양 성장에서 골수 안밖으로의 조혈 선구 세포의 세포내이동과 같은, 주화성과는 다른 성질을 가진다 (예를 들어,Baggiolini et al., Ann. Rev. Immunology (1997) 15 : 675-705; Zlotnik et al., Critical Rev. Immunology (1999) 19 (1) : 1-4; Wang et al., J Immunological Methods (1998) 220 (1-2) : 1-17; 및 Moser et al., Intl. Rev. Immunology (1998) 16 (3-4) : 323-344 참조).
다수의 키모카인의 아미노산 서열, 구조 및 기능이 알려져 있다. 키모카인은 약 8-10 kDa의 분자량을 가지고, 단백질 수준에서 서로 약 20-50 % 서열 상동성을 나타낸다. 단백질은 또한 공통의 3차 구조를 공유한다. 모든 키모카인은 분자내 이황화 결합 형성에 관여하는 다수의 보존적 시스테인 잔기를 갖는데, 이는 키모카인을 동정하고 분류하는데 이용된다. 예를 들어, 한개의 아미노산에 의하여 분리되는 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가지는 키모카인은 ("α" 키모카인이라고도 불리우는) "C-X-C" 키모카인이라 불린다. 서로 인접한 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가진 키모카인은 ("β" 키모카인이라고도 불리우는) "CC" 키모카인이라 불린다. "C" 키모카인은 시스테인 잔기 하나가 결여된 점에서 다른 키모카인과 다르다 ("γ" 키모카인이라고도 불린다). C 키모카인은 CC 키모카인의 몇몇의 구성원과 유사성을 나타내지만 CC 와 CXC 키모카인의 특징인 제 1 및 제 3의 시스테인 잔기가 없다. 세 개의 아미노산에 의하여 분리되는 제 1의 두개의 시스테인 잔기를 가지는 키모카인 소그룹의 구성원은 (또한 "CX3C" 또는 "δ" 키모카인으로도 불리우는) "CXXXC" 키모카인이라 불리운다. 키모카인의 서브그룹 또한 있다. 예를 들어, 두개의 추가의 보존적 시스테인 잔기를 함유하는 CC 키모카인이 알려져 있고, 종종 "C6-β" 키모카인이라는 용어가 이 서브그룹에 대하여 사용된다. 현재까지 동정된대부분의 키모카인은 CC 와 CXC 키모카인 부류의 구성원이다.
키모카인은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 암, 바이러스성 질병, 죽종/죽상경화증, 류마티스관절염 및 기관 이식 거부반응과 같은 중요한 질병 경로에서 관련되어 왔다. 그러나, 다수의 키모카인 및 그것의 치료법으로서의 잠재적 사용에 수반하는 일반적인 문제는 그것의 고유한 성질인 백혈구 염증 반응 및 감염의 촉진 또는 심화와 관련된다. 이런 결과에 대하여, 대응하는 야생형 키모카인의 길항제를 제조하려는 시도에서 키모카인의 다수의 변형이 수행되어 왔다. Proudfoot et al. (J Biol. Chem. (1996) 271 (5): 2599-2603); Simmons et al. (Science 276: 276-279); Gong et al. (J. Biol. Chem. (1996) 271 (18) : 10521-10527 ; Baggiolini etal. (J Exp. Med. (1997) 186 (8): 1189-1191), Polo et al. (Eur. J. Immunol. (2000) 30: 3190-3198), Nibbs et al. (J. Immunol. (2000) 164: 1488-1497) 및 Townson et al. (J. Biol. Chem. (2000) 276 (50): 39254-39261) 는 다양한 N-말단 변형 키모카인에 대하여 보고한다.
고전적이고 대표적인 예는 RANTES에 대한 상황이다. 특정 조건에서, 야생형 RANTES는 염증과 HIV 감염을 촉진할 수 있다 (Gordon et al., R Virol. (1999) 73: 684-694; Czaplewski et al., J Biol. Chem. (1999) 274 : 16077-16084). 반대로, RANTES 폴리펩티드 사슬의 위치 26 (E26A) 및 66 (E66S)에서의 치환은 분자를 그것의 비-염증성 형태로 전환시키고 그것의 HIV에 대한 수용체와 경쟁하는 그것의 능력을 향상시킨다 (Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512; 또한, HIV 감염을 저해하는 키모카인과 그것에 기초한 방법을 개시하는 미국 특허제 6,214,540호 참조). 게다가, N-말단 절단 [RANTES 9-68], 메티오닌 ("Met-RANTES"), 아미노옥시펜탄("AOP-RANTES"), 또는 논아노일 ("NNY-RANTES")의 부가를 포함하는 RANTES의 N-말단 변형은 HIV-1 감염을 막을 수 있는 길항제를 결과하였다. (Arenzana-Seisdedos, et al., Nature (1996) 383 : 400; Mack, et al., J Exp. Med. (1998) 187 : 1215-1224; Proudfoot, et al., J Biol. Chem. (1996) 271 : 2599-2603; Wells, et al., WO 96/17935; Simmons, et al., Science (1997) 276 : 276-279; Offord et al., WO 99/11666; 및 Mosier et al., J Virology (1999) 73 (5) : 3544-3550). 미국 특허 제 6,168,784 호는 키모카인 유사체 NNY-Rantes를 개시하고 C-말단에서 이 유사체를 PEG 사슬로 변형하는 것을 시사한다. Wilkin et al. (Curr. Opinion Biotech. (1999) 9 : 412426) 는 단백질의 화학적 합성을 검토한다.
키모카인의 생물학적 활성은 수용체에 의하여 매개된다 (Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145-176, Rollins, BJ., Blood (1997) 90 (3): 909-928 및 Wells et al., Infla aynation Res. (1999) 48: 353-362). 이것은 키모카인-특이적 수용체 뿐 아니라, CC 키모카인 또는 CXC 키모카인의 군에 속하는 몇몇의 상이한 키모카인과 특이적으로 결합하는 중복 리간드 특이성을 갖는 수용체를 포함한다. 예를 들어, CC 키모카인 SDF-lα는 CXCR4 수용체에 대하여 특이적인 반면, CXC 키모카인 RANTES는 CCR1, CCR3 및 CCR5 수용체에 결합한다. 다른 예는 키모카인 에오택신인데, 이것은 (CKR3로도 알려진) CCR3 수용체에 대한 리간드이다. (예를 들어, Cyster, J. G., Science (1999) 286 : 2098-2102; Ponath et al.,J Experimental Medicine (1996) 183 (6) : 2437-2448; Ponath et al., J Clinical Investigation (1996) 9 7 (3) : 604-12; 및 Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Communications (1997) 231 (2) : 365-368 참조.)
키모카인의 그것의 인지 수용체를 활성화시키는 능력은 키모카인의 N-말단 영역에 대한 변형에 의하여 크게 영향받는다. 이들 변화는 단백질 분해 과정, 돌연변이 유발, 또는 화학적 변형으로부터 결과될 수 있다. (예를 들어, Proudfoot, A. E. et al., J : Biol. Chem. (1996) 271: 2599; Grzegorzewski et al., Cytokine (2001) 13 (4): 209-219; Clark-Lewis et al., J Biol. Chem. (1991) 266 (34): 23128-23134; Moser et al., J : Biol. Chem. (1993) 268: 71257128; Harrison, J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1998) 95: 10896; Mack et al., J. Exp. Med. (1998) 187 : 1215; Gong et al., J Biol. Chem. (1996) 271: 10521; Struyf et al., Eur. J Immunol. (1998) 28: 1262; Weber et al., J. Exp. Med. (1996) 183: 681; Proot et al. (1998) J. Immunol., 160: 4034; Yang et al., J Virol. (1999) 73 (6): 45824589 ; Rusconi et al., Antivir Ther. (2000) 5 (3): 199-204; Wyuts et al., Immunol. (1999) 163 (11): 6155-6613; Detheux et al., J. Exp. Med. (2000) 192: 1501-1508; Nibbs et al., J Immunology (2000) 164: 1488-1497; McCole et al., Immunol. (1999) 163 (5): 2829-2835 ; Nufer et al., Biochemistry (1999) 38 (2): 636-642; 및 Wyuts et al., Eur J Biochem. (1999) 260 (2): 421-429 참조.)
이들 변형 단백질의 다수는 키모카인 수용체-매개 효과를 시험관내에서 길항작용하고, 바이러스 감염을 저해하고, 몇몇의 동물 모델에서 염증을 유의하게 감소시킬 수 있다. 몇몇 경우에서 그것은 그것의 수용체를 활성화하는 능력을 보유하고, 1차 세포에서 이 활성을 수용체 발현의 수준을 반영한다. N-말단 영역에 대한 몇몇 변형은 또한 키모카인 수용체의 세포내이동에 대하여 큰 영향을 끼친다. 그러므로, 이 같은 변형된 키모카인은 그것의 수용체 및 대응하는 야생형 키모카인에 대하여 길항작용할 수 있는 한편, 길항제, 작동제 또는 그것의 변이체에 대한 분류는 다를 수 있다.
키모카인이 치료제로서 제안되어 왔지만, 잠재적 주요 장애 중 하나는, 전형적으로 겨우 몇 분에 그치는, 그것의 생체내에서의 불량한 순환 반감기이다. 순환 반감기를 개선하기 위하여, PEG(폴리에틸렌글리콜) 같은 수용성 폴리머가 단백질에 부착할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 그것을 제어된 방식과 사용자-정의 정확성으로 부착하는 것의 어려움을 나타내는 결과들이 나타나 왔다 (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry (1995) 6: 150-165; Mehvar, R., J ; Pharm. Pharmaceut. Sci. (2000) 3 (1) : 125-136; 및 Monfardini et al., Bioconjugate Chem. (1998) 9: 418-450).
이런 관점에서, 성장인자 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)와 키모카인 IL-8에 대하여, PEG 사슬의 단백질 N-말단에 대한 부위-특이적 부착에 대한 기술이 개발되었고 설명되었다 (Gaertner et al., Bioconjug Chem. (1996) 7 (1) : 38-44). 둘 모두 대부분의 그것의 활성을 유지하는 것으로 보고되었다. 그러나, 효능은 바이러스 감염의 수용체-기초 저해제로서 사용되는 것과 같은 길항제로서 채용되는약물에서 특히 중요하다. 그러므로, N-말단 잔기의 감도 및 활성과 효능에 대한 그것의 기여를 고려하면, PEG 또는 다른 수용성 폴리머의 IL-8 외의 키모카인, 특히 키모카인 길항제의 N-말단 잔기에 대한 부착은 적당하지 않을 수도 있다. 국제 공개 번호 제 WO 00/53223 호는, 그것이 신규 키모카인을 보고적으로 개시하고 길항제가 제작될 수 있고 PEG나 다른 수용성 폴리머가 부착될 수 있음을 보고한다는 점에서 키모카인 문헌의 커다란 전체의 대표적인 것이지만, 그것은 어디에 어떤 유형의 사슬이 부착되야 한다는 특이성이나 그것에 연관되는 어떤 활성에 대하여도 개시하지 않는다.
치료제로서 야생종 키모카인을 사용하는 다른 잠재적 장애는 그것의 높은 농도에서 응집하는 경향성 및 키모카인 수용체의 무차별적 결합과 구별적 활성화이다(Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145-176), Rollins, BJ., Blood (1997) 90 (3): 909928; 및 Wells et al., Inflamination Res. (1999) 48: 353-362)). 응집은 제제화에서 문제가 될 수 있고 병리학을 악화시킬 수 있다(Czaplewski et al., J ; Biol. Chem. (1999) 274 (23): 16077-16084; Czaplewski et al.,"Engineering, Biology, and Clinical Development of hMIP-la," (1999) In: Chemokines in Disease: Biology and Clinical Research, Ed., C. A. Herbert, Humana Press Inc., Totwa, NJ; Trkola et al., J. Virol. (1999) 73 (8): 6370-6379 ; Appay et al., J ; Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512 ; Hunter et al., Blood (1995) 86 (12): 4400-4408; Lord et al., Blood (1995) 85 (12): 3412-3415; Lord et al., Brit. J Cancer (1996) 74: 1017-1022). 무차별적 결합은 키모카인의 특징이고, 몇몇의 치료적 세팅에서 덜 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 키모카인은 치료제로서 유의한 가망성을 보유한다(Murphy et al., Pharmacological Rev. (2000) 51 (1) : 145176), Rollins, BJ., Blood (1997) 90 (3): 909-928; 및 Wells et al., Inflanzmation Res.(1999) 48: 353-362).
이 같은 접근법은 몇몇 케이스에서 길항제-연관 효능을 개선시켰지만, 키모카인 길항제 제작에서의 과제 중 하나는 약물 생체 반응학 같은 다른 약물 성질을 개선하면서 효능을 증가시키는 것이다. 또한, 잠재적 저해제 및 대응하는 키모카인 저해제 화합물 및 질병의 예방 및/또는 치료에서 사용되기 위한 의약의 제조에서 사용에 대한 일반적 전략과 방법을 발견하는 것이 요구된다.
따라서, 개선된 순환 반감기 및 바람직한 활성과 효능을 포함하는 개선된 치료학적 특성을 갖는 신규의 키모카인과 변형 키모카인, 특히 천연 발생 키모카인의 활성을 저해하거나 길항적으로 작용할 수 있는 신규 키모카인과 변형 키모카인에 대한 필요성이 있다. 또한, 개선된 순환 반감기 및 변화된 수용체 활성과 효능을 갖는 키모카인 및 변형 키모카인을 제공할 필요가 있다. 본 발명은 이런 및 다른 요구를 겨냥한다.
(발명의 개요)
본 발명은 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 특히 N- 및/또는 C-말단 변형 키모카인, 및 그것의 제조와 사용방법에 관한 것이다. 본 발명의 N-말단 변형된 생물활성 합성 키모카인은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬과 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명의 C-말단 변형된생물활성 합성 키모카인은 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 폴리사이클릭으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명의 N- 및 C-말단 변형된 생물활성 합성 키모카인은 조합적으로 N 및 C-말단 모두에서의 변형을 포함한다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 제조 및 사용의 방법이 또한 제공된다. 본 발명은 그것이 대응하는 천연발생 야생형 키모카인 또는 그것의 수용체의 강력한 길항제인 화합물을 제조하기 위한 일반적 접근법을 제공한다는 점에서 유의하다.
본 발명은 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인, 특히 키모카인 길항제와 작동제 및 그것의 제조와 사용방법에 관한 것이다.
(관련 출원에 대한 상호참조:)
본 출원은 여기에 참고문헌으로써 수록된 미국 특허출원번호 제 60/217,683 호 (2000년, 7월 12일 출원)의 부분계속출원이다.
도 1A-1E는 본원발명의 폴리머-변형 합성 생물활성 단백질을 제조하는 방법의 도식을 도시한다.
도 2A-2C는 본원발명의 합성 생물활성 단백질을 제조하는 방법의 도식을 도시한다.
도 3A-3B는 세 개 이상의 비-중복 펩티드 단편의 화학적 라이게이션을 포함하는 다중-단편 라이게이션, 즉, 적어도 하나의 단편이 최종 전장 라이게이션 산물에 대응하는 중간 단편인 과정의 도식을 도시한다.
도 4A-4C는 자연적 화학적 라이게이션 및 결과의 측쇄 티올의 화학적 변형을 설명한다.
도 5A-5B는 본원발명의 분지 코어(B) 및 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J*의 고유한 화학선택적 관능기(U)를 생성하는 고체상 공정을 도시한다.
도 6A-6D는 다음의 U-B 코어에 대한 부착을 위한 본원발명의 바람직한, 실질적으로 비-항원성인 수용성 폴리아미드 폴리머-J* 성분을 생성하기 위한 고체상 공정을 도시한다.
도 7은 U-B 성분을 폴리-J* 성분에 커플링시켜 식 U-B-폴리머-J*의 본 발명의 바람직한 합성 폴리머 구성체를 생성하는 공정을 도시한다.
도 8은 본 발명의 생물활성 합성 단백질의 라이게이션 및 제작에 사용할 수 있는 수용성 폴리머의 펩티드 단편에 대한 정확한 부착의 대안적 경로를 도시한다.
도 9는 천연 발생 키모카인의 네가지 부류의 일반적 구조와, "C"가 시스테인에대한 한 문자 코드이고 "X"는 시스테인을 제외한 임의의 아미노산을 나타내는, 보존적 시스테인 패턴에 의하여 정의되는 바와 같은, 그것의 대응하는 N-말단, N-루프 및 C-말단 영역을 나타내는 도식이다.
도 10A-10D는 이들 키모카인의 대응하는 N-말단, N-루프 및 C-말단 영역을 포함하는 다양한 키모카인 폴리펩티드 사슬의 천연 발생 아미노산 서열의 예를 도시한다. 20 개의 유전적으로 코딩되는 아미노산에 대한 표준 한문자 아미노산 코드가 사용된다.
도 11은 Rantes의 폴리머-변형 유사체인 Rantes G1755-01로 표시되는 합성 키모카인을 도시한다.
도 12는 Rantes의 폴리머-변형 유사체인 Rantes G1755로 표시되는 합성 키모카인을 도시한다.
도 13은 Rantes의 폴리머-변형 유사체인 Rantes G1805로 표시되는 합성 키모카인을 도시한다.
도 14는 Rantes의 폴리머-변형 유사체인 Rantes G1806으로 표시되는 합성 키모카인을 도시한다.
도 15는 환원 조건(R) 및 비-환원 조건(N) 하에서의 야생형 Rantes와 합성 키모카인 유사체 Rantes G1806의 상대적 분자량을 비교하는 대표적 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. 상대적 분자량은 각 겔의 좌측에 도시되는데 이는 동일한 겔 상에서 전개된 분자량 표준에 대응한다.
도 16은 밀리리터당 피코그람(pg/ml)으로 나타낸 주어진 Rantes 유사체 대비 분으로 나타낸 시간을 비교한 혈장 농도 대표적 약물 생체 반응학 프로필을 나타낸다. 이 도에서 설명하는 화합물은 AOP-Rantes와 Rantes G1755, G1806, 및 G1805이다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 생물활성 합성 키모카인, 특히 N- 및/또는 C-말단 변형 키모카인 분자에 관한 것이다. 본 발명의 신규의 생물활성 합성 키모카인은 적당한 키모카인 생물학적검정에 의하여 측정될 때 천연 발생 키모카인의 활성을 바람직하게 저해한다. 이같은 분자는 결합하는 키모카인 수용체의 하나 이상의 성질에 대하여 길항작용함으로써 (예를 들어 바이러스 감염을 저해하거나, 수용체 하향조절을 유발하거나, 수용체 내재화를 유발함으로써) 세포 표면으로 재순환하여 회귀하는 수용체의 정상적인 순환에 대하여 "길항작용함"에 의하여 작동한다. 다른 생물학적 반응의 문맥에서, 이같은 분자는 수용체의 작동제로 작용할 수 있는데, 예를 들어 칼슘 흐름을 유도하거나 주화성을 개시시키는 등이 그것이다. 그러므로, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 (부분 길항제를 포함하는) 길항제로 작용할 수 있지만, 또한 (부분 작동제를 포함하는) 작동제 또는 둘의 혼합으로서도 작용할 수 있다. 적어도 하나의 길항제 특성, 즉 그것이 결합하는 키모카인 수용체의 하나 이상의 생물학적 성질에 대하여 (예를 들어 (1)바이러스 감염, (2) 주화성, (3) 수용체 순환 등을 차단 또는 부분적으로 차단하는 것과 같은) 길항작용할 수 있는 능력을 나타내는 분자가 바람직하다. 이 같은 분자는 키모카인 수용체에 결합(또는 관여)하지만 활성화시키지 않음으로써 작동하거나 다른 수단으로 그것의 작용을 매개한다.
A. 본 발명의 N- 및 C-말단 변형 생물활성 합성 키모카인
본 발명은 특히 대응 천연발생 키모카인의 활성을 저해하는 생물활성 합성 키모카인에 관한 것이다. 바람직하게는, 이같은 분자는 N- 및/또는 C-말단 변형을 가진다. 본 발명의 N-말단 변형 생물활성 합성 분자는 그것의 N-말단에서 지방족 사슬 및 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명의 N-말단 변형 생물활성 합성 분자는 N-말단에서 C-말단 방향으로 읽을 때 다음 식: J1-X1-Z1-CHEMOKINE을 갖는데, 식 중: J1은 지방족 사슬이고; XI은 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-말단 아미노산 서열의 0 개 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서이고; Z1은 아미노산 유도체이고; CHEMOKINE는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 나머지 아미노산 서열이며; 줄표 ("-")는 공유결합을 나타낸다. 이들 화합물은 폴리펩티드 사슬의 N-말단 영역의 전체 길이에 관련되도록 고안된다. 따라서, 소수성 지방족 사슬의 길이 및 아미노산 유도체의 위치에 따라서, N-말단 길항제는 대응하는 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬에 비교하여 N-말단에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.
본 발명의 C-말단 변형 생물활성 합성 분자는 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 폴리사이클릭으로 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이들 화합물은 N-말단에서 C-말단 방향으로 읽을때 다음 식: CHEMOKINE-X2-J2을 갖는데, 식 중: X2는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 C-말단 아미노산 서열의 0 개 이상의 아미노산을 포함하는 스페이서이고; J2는 지방족 사슬 또는 폴리사이클릭이고; CHEMOKINE는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 나머지 아미노산 서열이며; 줄표 ("-")는 공유결합을 나타낸다. 키모카인의 C-말단 영역은, 삽입, 결실 또는 C-말단에 하나 이상의 아미노산 또는 다른 화학적 부분을 추가하여 대응하는 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬에 비교하여 폴리펩티드 사슬의 C-말단 연장을 추가하는 것 뿐 아니라 형광 표지와 생물학적으로 허용되는 폴리머의 추가 및 작은 유기분자, 펩티드, 단백질 등과 같은 다른 화합물과의 접합을 포함하는 상당한 변형이 용이하다.
본 발명의 N- 및 C-말단 변형 생물활성 합성 분자는 그것의 N- 및 C-말단 모두에서 변형된 키모카인 폴리펩티드 사슬을 포함하는데, 그것은 구체적으로 지칭될 때, N-/C-말단 변형 생물활성 합성 분자라고 표시된다. 이들 화합물은 식: J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2을 갖는데, 식 중: J1, XI, Z1, CHEMOKINE, X2, J2 및 "-" 는 상기된 바와 같다. 이들 화합물은 주어진 최종 용도에 따라 상승적 방식으로 N-및 C-말단 변형의 이점을 조합한다.
"키모카인 폴리펩티드"에 의하여는 천연 발생 야생형 키모카인 폴리펩티드 사슬에 실질적으로 상동인 폴리펩티드 사슬을 의도한다. "N-말단 아미노산 서열"에의하여는, 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬의 제 1의 이황화-형성 시스테인에 인접하고 N-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 의도한다. "C-말단 아미노산 서열"에 의하여는, 천연발생 키모카인 폴리펩티드 사슬의 마지막 이황화-형성 시스테인에 인접하고 C-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 의도한다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 기초를 형성하는 키모카인 폴리펩티드 사슬, N-말단 아미노산 서열, C-말단 아미노산 서열, 및 제 1의 및 마지막 이황화-형성 시스테인은 대응하는 천연 발생 키모카인의 아미노산 서열로부터 뿐 아니라, 알려진 C, CC, CXC 및 CXXXC 키모카인의 아미노산 서열과의 비교와 같은, 동일한 부류의 다른 키모카인 상동성 모델링에 의하여 추론할 수 있다.
예를 들어, 다음: 6Ckine, 9E3, ATAC, ABCD-1, ACT-2, ALP, AMAC-1, AMCF-1, AMCF-2, AIF, ANAP, Angie, β-R1, β-트롬보글로불린, BCA-1, BLC, blr-1 리간드, BRAK, C10, CCF18, Ck-β-6, Ck-β-8, Ck-β-8-1, Ck-β-10, Ck-β-11, cCAF, CEF-4, CINC, C7, CKA-3, CRG-2, CRG-10, CTAP-3, DC-CK1, ELC, 에오탁신, 에오탁신-2, Exodus-1, Exodus-2, ECIP-1, ENA-78, EDNAP, ENAP, FIC, FDNCF, FINAP, 프랙탈카인, G26, GDCF, GOS-19-1, GOS19-2, GOS-19-3, GCF, GCP-2, GCP-2-like, GRO1, GR02, GR03, GRO-α, GRO-β, GRO-γ, H400, HC-11, HC-14, HC-21, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4 H174, 헤파린 중화 단백질, 휴미그, I-309, ILINCK, I-TAC, IfilO, IL8, IP-9, IP-10, IRH, JE, KC, 림포탁틴, L2G25B, LAG-1, LARC, LCC-1, LD78-α, LD78-β, LD78-γ, LDCF, LEC, Lkn-1, LMC, LAI, LCF, LA-PF4, LDGF, LDNAP, LIF, LIX, LUCT, 렁카인, LYNAP, 맨체스터 저해제, MARC, MCAF, MCP-1, MCP-2, MCP-3,MCP-4, MCP-5, MDC, MIP-1-α, MIP-1-β, MIP-1-δ, MIP-1-γ, MIP-3, MIP-3-α, MIP-3-β, MIP-4, MIP-5, 모노탁틴-1, MPIF-1, MPIF-2, MRP-1, MRP-2, M119, MDNAP, MDNCF, 거핵구-자극-인자, MGSA, Mig, MIP-2, mob-1, MOC, MONAP, NC28, NCC-1, NCC-2, NCC-3, NCC-4 N51, NAF, NAP-1, NAP-2, NAP-3, NAP-4, NAP S, NCF, NCP, 뉴로탁틴, 옹코스탁틴 A, P16, P500, PARC, pAT464, pAT744, PBP, PBP-like, PBSF, PF4, PF4-like, PF4-ALT, PF4V1, PLF, PPBP, RANTES, SCM-1-α, SCI, SCY A26, SLC, SMC-CF, ST38, STCP-1, SDF-1-α, SDF-1-β, TARC, TCA-3, TCA-4, TDCF, TECK, TSG-8, TY5, TCF, TLSF-α, TLSF-β, TPAR-1, TSG-1 은 기지의 천연발생 키모카인의 예인데, 이들중 다수는 상이한 명칭으로 기재되고 따라서 여러 차례 등장하였다.
설명하기 위한 것일 뿐 제한하지는 않는 의도로, 상기 열거된 야생형 키모카인 폴리펩티드 사슬의 몇몇 및 그것의 대응 N-말단, N-루프 및 C-말단 아미노산 서열은 도 10A -10D에 도시되어있다. 충분히 인식될 수 있는 바와 같이, 추가적 키모카인 폴리펩티드 사슬은 알려져 있고, Genome Database (Johns Hopkins University, Maryland USA), Protein Data Bank (Brookhaven National Laboratory & Rutgers University, New Jersey USA), Entrez (National Institutes of Health, Maryland USA), NRL 3D (Pittsburgh Supercomputing Center, Carnegie Mellon University, Pennsylvania USA), CATH (University College London, London, UK), NIH Gopher Server (NIH, Maryland USA), ProLink (Boston University, Massachusetts USA), The Nucleic Acid Database (Rutgers University, New JerseyUSA), Genebank (National Library of Medicine, Maryland USA), Expasy (Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva Switzerland), 등 같은 공중접근가능한 데이터베이스를 포함하는 다수의 상이한 공급원으로부터 구입할 수 있다. 또한, 데이터 베이스 및 이런 목적달성을 위한 관련 도구를 포함하는 당업계 공지의 표준 기술에 따라, 다양한 유전자 및 단백질 서열결정 프로그램으로부터 유래한 신규의 키모카인이 상동성 및 패턴 매치에 의하여 동정될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 증가된 수용체 특이성을 갖는 키모카인을 제작하는데 파지 디스플레이 또는 모듈 셔플링 같은 정의 진화 기술이 사용될 수 있다. 파지 디스플레이를 사용하여 키모카인 유도체 또는 유사체를 키모카인 수용체에 결합하는 능력에 대하여 시험하는 것은 HIV의 치료 및 예방에서 기술되었다(미국 특허 6,214,540 ; DeVico et al.). 파지 디스플레이는 CXC 키모카인 수용체 3 (CXCR3)에 대한 수용체 단백질의 리간드, 저해제 또는 촉진제를 검출 또는 동정하는데 또한 사용되었는데(미국 특허 6,140,064, Loetscher et al.), 그것은 세포 반응을 유도하는 능력을 가지는 하나 이상의 키모카인의 선택적 결합을 특징으로 한다(미국 특허 6,184,358, Loetscher et al.). 파지 디스플레이의 사용은 분자의 표지 및 선택(미국 특허 6,180,336, Osbourn et al.), 특이적 항원에 대한 결합 분자의 표지 및 뒤이은 정제(예를 들어, W092/01047 참조), 및 HIV 감염 및 면역 장애의 예방 및 치료를 위한 펩티드 조성물의 결정(미국 특허 6,090,388, Wang)에서 기술되었다.
N-루프 영역에서의 정의 진화를 위한 바람직한 부분 (Konigs, C,"2Monoclonal antibody screening of a phage-displayed random peptide library reveals mimotopes of chemokine receptor CCR5 : implications for the tertiary structure of the receptor and for an N-terminal binding site for HIV-1 gpl20,"Eur. J. Immunol. 2000 Apr; 30 (4): 1162-71; Sidhu, S. S. et al., "High copy display of large proteins on phage for functional selections," J Mol Biol 2000 Feb 18 ; 296 (2): 487-95; Fielding, A. K. et al.,"A hyperfusogenic gibbon ape leukemia envelope glycoprotein: targeting of a cytotoxic gene by ligand display," Hum Gene Ther 2000 Apr 10; 11 (6): 817-26), N-루프와 C-말단 사이의 영역, 및 C-말단 (Cain, S. A. et al. "Selection of novel ligands from a whole-molecule randomly mutated C5a library," Protein Eng 2001 Mar; 14 (3): 189-93; Heller, T. et al., "Selection of a C5a receptor antagonist from phage libraries attenuating the inflammatory response in immune complex disease and ischemia/reperfusion injury," J. Immunol. 1999 Jul 15; 163 (2): 985-94; Chang, C. et al., "Dissection of the LXXLL nuclear receptorcoactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta," Mol Cell Biol 1999 Dec; 19 (12) : 8226-39)과 함께 G-단백질-결합 수용체와 관련된 파지 디스플레이 방법 또한 기술되었다(예를 들어, Doorbar, J. et al.,"Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display,"J. Mol. Biol., 244: 361-9 (1994) 참조).
J1 과 J2의 적당한 소수성 지방족 사슬은 5(C5) 내지 22(C22) 탄소 길이인 소수성 지방족 사슬을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사슬은 불포화 및/또는 비분지이거나 다양한 정도의 포화 및/또는 분지의 정도를 갖는다. 소수성 지방족 사슬은 일반식 Cn(Rm)-을 가지는데, 식 중 Cn은 탄소수이고 Rm은 수소, 알킬, 아실, 방향족 또는 그것들의 조합으로부터 선택되는 치환기의 수이고 n과 m은 동일하거나 상이할 수 있다. J1과 J2 기는 X1, X2 또는 키모카인 폴리펩티드 사슬에 임의의 적당한 공유결합을 통하여 결합한다. 적당한 공유결합의 예는: 아미드, 케톤, 알데히드, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 티오에스테르, 티오졸리딘, 옥심, 옥시졸리딘, 쉬프-염기 및 쉬프-염기 유형 결합 (예를 들어, 히드라지드)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이같은 결합은:
-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(0)- ; -C(0)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)-; -C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-NH-(CH2)-C(O)-; -NH-(CH2)x-C(O)-; -NH-(CH2)-NH-C(O)-; -NH-(CH2)xNH-C (O)-; -NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -NH(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -NH-(CH2)- [NH-(CH2)]y-C(O)-;
-ONH-C(O)-; -ONH-(CH2)-C(O)-; -ONH-(CH2)x-C(O)-; -ONH-(CH2)-NHC(O)-; -ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -ONH-(CH2)x-NH-C(O)-; -ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C (O)-; -ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-OCH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-C(O)-; -OCH2-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-C(O)- ; -OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C (O)-; -OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)- ;-OCH2-NH-C (O)-; -OCH2-NH-(CH2)-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-;-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(0)-; -OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)- ;-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -OCCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-O-C(O)-C(O)-;-O-C(O)-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)x-C(O)-;-O-C(O)(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ;-0-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-NH-C(O)-; -O-C(O)NH-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C-(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-C (O)-; -O-C(O)N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-;-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O); -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-CH=CH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-C(O)-; -CH=CH-(CH2)x-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-NH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)x-NH-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -CH=CH(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -CH=CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -CH=CH-(CH2)[NH-(CH2)x]y-C(O)-;
-SCH2-N(CH3)-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-;-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-;
-S-C(O)-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-;-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -S-C(O)-NH-C(O)-; -S-C(O)NH-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)- ; -S-C (O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ; -S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]yC(O)-; -C3H6SN-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-;-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H6SN-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]yC(O)-; -C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)- ;-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-;-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]yC(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6SN-N(CH3)(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(0)-; -C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(0)-;
-C3H60N-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)x-C(O)-; -C3H60N-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-(CH2)-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-;-C3H60N-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H60N-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -C3H60N-NH-C(O)-; -C3H60N-NH-(CH2)-C(O)-; -C3H60N-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H60N-NH-(0)-; -C3H60N-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(0)-; -C3H60N-NH-(CH2)x-NH-C(O)-; -C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)- ;-C3H60N-NH [(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-C(O)- ;-C3H60N-N(CH3)(CH2)x-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(0)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(0)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-; -C3H60N-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-; -C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-; -O-C(O)-; -C(O)-, 또는 공유결합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 식중, x 및 y는 2,3,4 또는 그 이상이고 동일하거나 상이할 수 있다.
결합 시스템에 적당한 화학은 주지이고 이 목적에 이용될 수 있다 (예를 들어,"Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking", S. S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993); Perspectives in Bioconjugate Chemistry, Claude F. Modres, Ed., ACS (1993) 참조).
J1과 J2를 XI, X2 또는 키모카인 폴리펩티드 사슬에 결합하는 것에 추가하여, 결과의 분자가 그것의 길항제 성질을 보유하는 한, 표적 분자의 물리화학적 및/또는 생물학적 성질을 조율하기 위하여, 채택된 결합 시스템이 선택될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 다양한 길이, 견고성, 전하 및/또는 광학구조의 결합 시스템을 이용함에 의하여, 한 유형의 조건하에서 다른 것에 비하여 반감기 등을 변화시키는데, 또는 효능, 특이성 등을 조정하는데 더 (또는 덜) 안정한 결합 시스템을 삽입함으로써 성취될 수 있다. 탄화수소 사슬을 키모카인 폴리펩티드 사슬에 연결시키는 결합 단위는, J1 및/또는 J2를 채우는 전체 길이와 간격은 가장 바람직하게는 천연 발생 키모카인에 근접한다면, 실질적으로 다양할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 소수성 지방족 사슬 Jl은 5 (C5) 내지 10 (C10) 탄소 길이의 탄화수소 사슬이고, 수수성 지방족 사슬 J2는 12 (C 12) 내지 20 (C20) 탄소 길이의 지질이다. J1 C5-C10 탄화수소 사슬의 예는: -C5H11, -C5H9, -C5H7, -C5H5,-C5H3, -C6H13, -C6H11, -C6H9, -C6H7, -C6H5, -C6H3, -C7H15, -C7H13, -C7H11, -C7H9, -C7H7, -C7H5, -C7H3, -C8H17, -C8H15, -C8H13, -C8H11, -C8H9, -C8H7, -C8H5, -C8H3, -C9H19, -C9H17, -C9H15, -C9H13, -C9H11, -C9H9, -C9H7, -C9H5, -C9H3, -C10H21, -C10H19, -C10H17, -C10H15, -C10H13, -C10H11, -C10H9, -C10H7, -C10H5, 및 -C10H3을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
적당한 J2 지질은 지방산 유래 지질과 폴리사이클릭 스테로이드 유래 지질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지방산은 포화 및 불포화 지방산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포화지방산의 예는 로릭산(C2), 미리스트산 (C14), 팔미트산 (C16), 스테르산 (C 18), 및 아라키드산 (C20)이다. 불포화지방산의 예는 올레산 (C18), 리놀레산 (C18), 리놀렌산 (C18), 엘레오스테르산 (C18), 및 아라키돈산 (C20)이다. 폴리사이클릭은: 알도스테론, 콜레스테롤, 콜산, 코프로스타놀, 코르티코스테론, 디하이드로콜레스테롤, 데스모스테롤, 디지토제닌, 에르고스테롤, 에스트라디올, 히드록시코르티코스테론, 라토스테롤, 프레드니손, 프레그네놀론, 프로게스테론, 테스토스테론, 자이모스테롤 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 지방산은 통상 키모카인 폴리펩티드 사슬에 산 성분을 통하여 연결됨으로써 아실-결합 부분을 형성하지만 다른 결합도 채택될 수 있다. 탄화수수 사슬을 키모카인 폴리펩티드 사슬에 연결시키는 결합 단위는, N-말단 영역을 채우는 전체 길이와 간격이 천연발생 키모카인에 근접하는한, 실질적으로 다양할 수 있다. 이 관점에서 C-말단 영역은 더 유연하여, 채우는 전체 길이와 간격은 N-말단 영역의 것보다 더 다양할 수 있는 것으로 발견되었다.
다른 바람직한 구체예에서, J1 과 J2 성분은 본 발명의 생물활성 합성 키모카인에서 포함될 때, 논아노일, 논에노일, 아미노옥시펜탄, 도데카노일, 미리스토일, 팔미테이트, 로릴, 팔미토일, 에이코사노일, 올레오일, 또는 콜일 같은 C5 내지 C20 포화 또는 불포화 아실 사슬을 포함한다. 예를 들어, J1 치환체는 논아오일 또는 아미노옥시펜탄일 수 있고, J2 치환체는 포화 또는 불포화 지방산, 바람직하게는 C12-C20 지방산, 또는 콜레스테롤 같은 폴리사이클릭 스테로이드 지질일 수 있다.
소수성 지방족 사슬의 형태와 길이에 따라서, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은, 특히 C-말단에서 폴리펩티드 사슬에 부가되어 스페이서 기 및/또는 소수성 지방족 부분에 대한 별개의 부착 부위를 제공하는 추가적 아미노산 또는 다른 부분을 함유할 수 있다.
"아미노산 유도체"에 의하여는 아미노산 또는 20 개의 유전적으로 코딩되는 천연 발생 아미노산을 제외한 아미노산-유사 화학물질을 의도한다. 특히, 아미노산 유도체 Z1은 20 개의 유전적으로 코딩되는 천연 발생 아미노산 이외의 것이고 식 -(N-CnR-CO)-을 가지는데, 식 중 Cn 은 1-22 탄소이고, R 은 수소, 알킬 또는 방향족이고 N과 Cn, N과 R, 또는 Cn 과 R은 고리 구조를 형성할 수 있다. 또한 N, Cn 및 R은 아미노산 유도체에 따라서 각각 그것의 환원 형태에서 하나 이상의 수소를 가질 수 있다. 알킬 부분은 치환되거나 비치환일 수 있고, 선형, 분지 또는 고리형일 수 있고 하나 이상의 헤테로 원자를 포함할 수 있다. 방향족은 치환 또는 비치환일 수 있고, 하나 이상의 헤테로 원자를 포함한다. 아미노산 유도체는 새로이 제작하거나 시중 공급원(예를 들어, Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Advanced Chemtech, Louisville, KY, USA; Lancaster Synthesis, Inc., Windham, NH, USA; Bachem California, Inc., Torrance, CA, USA; Genzyme Corp., Cambridge, MA, USA)으로부터 구입할 수 있다. 아미노산 유도체의 예는 아미노이소부티르산 (Aib), 히드록시프롤린 (Hyp), 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-COOH (Tic), 인돌린-2-카르복실산 (indol), 4-디플루오로프롤린 (P(4,4DiF)), L-티오아졸리딘-4-카르복실산 (Thz), L-호모프롤린 (HoP), 3,4-데하이드로프롤린 (△Pro), 3, 4디히드록시페닐알라닌 (F (3,4-DiOH)), pBzl,-3,4 디히드록시페닐알라닌 (F(3,4-DiOH, pBzl)), 벤조페논 (p-Bz), 스클로헥실-알라닌 (Cha), 3- (2-나프틸)알라닌 (βNal), 시클로헥실-글리신 (Chg), 및 페닐글리신 (Phg)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
XI, CHEMOKINE 및 X2에 관하여는, 이들 성분의 아미노산은 대응하는 천연발생 야생형 분자에 실질적으로 상동성이다. 용어 "실질적으로 상동성"은 여기에서 사용될 때, 주어진 서열과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 (바람직하게는 95-99%) 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이 용어는, 결과의 폴리펩티드가 대응하는 천연발생 키모카인의 길항제로서 역할을 하는한, 주어진 서열에 비교하여 1 내지 20, 1 내지 10 또는 1 내지 5 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 특정 아미노산이, 아미노산의 보존적 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 폴리펩티드의 성질이 실질적으로 변화하지 않는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다는 것은 당업계 주지이다. 이같은 가능성은 본 발명의 범위내에 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 종종 폴리펩티드의 성질을 실질적으로 변화시키지 않고 이루어질 수 있음 또한 주목하여야 한다. 본 발명은 (대응하는 천연 발생 키모카인의 특이적 길항제 서열의, 예를 들어, 10, 20 또는 50% 까지의 길이의) 이같은 결실 또는 삽입을 포함한다. 게다가, 키모카인은, 여기에 참고문헌으로써 전체가 수록된 WO 99/11655에 기재된 모듈 '크로스오버' 합성 접근법 같은, 상이한 키모카인 폴리펩티드 단편을 혼합 또는 결합시켜 추가적 다양성을 생성하는 것을 포함하는 실질적 변형을 받을 수 있다.
N- 및/또는 C-말단에서의 변형에 추가하여, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 또한 폴리펩티드 사슬의 다른 위치, 즉, 상기 식 CHEMOKINE으로 나타낸 폴리펩티드 사슬에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다.한 바람직한 구체예에서, 변형은 키모카인의 N-루프에서 이루어져 표적 수용체에 대한 그것의 특이성/선택성을 증가시킨다. 이런 방식으로, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 N-루프는 특이적 수용체를 차단하는 한편 그것의 다른 잠재적 공-수용체에 대한 길항제 효과를 최소화한다. "N-루프"에 의하여는 주어진 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-말단 영역을 정의하는 제 1의 보존적 시스테인 패턴에 인접하는/C-말단 20 내지 26 개의 아미노산 서열 영역을 의도한다(도 9 및 10A-lOD 참조). 예를 들어, 키모카인 폴리펩티드 사슬의 N-으로부터 C-말단 방향으로 읽을 때, CC 키모카인의 N-루프는 제 1의 및 제 2의 보존적 시스테인 아미노산 사이 및 그것에 인접하는/C-말단 및 제 3의 보존적 아미노산에 인접하는/N-말단에 위치하는 아미노산 영역이다.
다른 구체예에서, 치환과 삽입은 천연 아미노산 뿐 아니라 아미노산 유도체 또는 폴리머로 변형된 아미노산을 포함한다. 폴리머 부착의 바람직한 위치는 키모카인의 C-말단 부분에 있다. 천연 클리코실레이션 부위를 가지는 키모카인에 대하여, 폴리머는 글리코실레이션에 대하여 코딩하는 하나 이상의 아미노산, 예를 들어 N-연결 글리코실레이션 부위의 아르기닌에 부착될 수 있다. 폴리머 부착은 천연발생 아미노산, 천연발생 아미노산을 대체하는 아미노산 유도체의 측쇄 또는 표적 글리코실레이션 위치에서 아미노산의 측쇄에 부착되는 탄수화물 또는 다른 부분에 대하여 있을 수 있다. 이들 목적에 적당한 폴리머는 생물학적으로 허용되는, 즉, 생물학적 시스템에서 비독성이고, 다수의 이같은 폴리머가 알려져 있다. 이같은 폴리머는 원래 소수성 또는 친수성이고, 생분해성, 비생분해 또는 그들의 조합이다. 이들 폴리머는 콜라겐, 젤라틴, 셀룰로스, 하이알루론산, 다당, 및 폴리아미노산 같은 천연 폴리머 뿐 아니라 폴리에스테르, 폴리안히드라이드 등 같은 합성 폴리머를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 소수성 비생분해성 폴리머는 폴리디메틸 실록산, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐클로리드 및 폴리메틸 메타크릴레이트를 포함한다. 친수성 비생분해성 폴리머의 예는 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트),폴리비닐알콜, 폴리 (N-비닐 피롤리돈), 폴리알킬렌, 폴리아크릴아미드 및 그것의 공중합체를 포함한다. 바람직한 폴리머는 서열 반복 단위 에틸렌 옥사이드로서 식 -(CH2-CH2-O-)n-을 포함하는데, 식중 n=에틸렌 옥사이드 단위의 갯수이다. 폴리머를 함유하는 바람직한 에틸렌 옥사이드의 예는 하기 및 WO 00/12587에 각각 기재된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 및 폴리아미드 에틸렌 옥사이드이다.
예를 들어, PEG-기초 사슬은 지방족이고, 비-면역원성이며, 단백질분해효소에 의하여 절단되기 쉽지 않다. PEG 또는 PEG-기초 사슬에 의하여 변형된 물질의 제조는 면역원성 및 항원성이 감소되었다. 예를 들어, Abuchowski, et al, J Biol. Chem. (1977) 252 (11): 3578-3581 ; Tsutsumi, et al, Jpn. J Cancer Res. (1994) 85 : 9-12; Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series 680, J. M. Harris 및 S. Zalipslcy, Eds., American Chemical Society, 1997; 및 Poly (ethylene glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Topics in Applied Chemistry, J. M. Harris, Ed.,Plenum Press, New York, NY, 1992) 참조. PEG는 또한 물질의 분자량을 증가시키는 역할도 하는데, 이를 위하여 그것은 부착함으로써 그것의 생물학적 반감기를 증가시킨다. PEG-변형 물질의 이들 유리한 성질은 이들을 다양한 치료적 적용에 매우 유용하게 만든다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리펩티드를 단백질이 그것의 내재적 생물학적 활성을 보유하도록 할 것 같은 부위에서 폴리펩티드를 변형하거나 "PEG화" 함에 의하여, 본 발명의 폴리펩티드의 약물 생체 반응학을 개선하는 것을 고려한다. 이같은 부위는 폴리펩티드의 C-말단을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 단백질상의 PEG 사슬 또는 PEG-기초 사슬의 조각은 알려져 있다. 예를 들어, 그것의 N-숙신이미드 카르보네이트 유도체로 전환된 PEG를 기술하는 Zalipsky, 미국 특허 번호 제 5,122,614 호 참조. 단백질상으로의 이식을 용이하게 하기 위하여 반응성 기로 변형된 PEG 사슬이 또한 알려져 있다. 예를 들어, 분자상 및 표면의 티올 부분에 선택적으로 부착하기 위한 술폰 부분으로 활성화된 PEG 유도체를 기술하는 Harris, 미국 특허번호 제 5,739,208 호, 및 단일 프로피온산 또는 부타노산 부분을 가지는 PEG 산의 활성 에스테르를 개시하는 Harris, et al., 미국 특허 번호 제 5,672,662 호 참조. 이들 분야는 Zalipsky, Bioconjugate Chemistry (1995) 6: 150-165에 의하여 광범위하게 검토된다. PEG의 사용 외에도, Wright, EP 0 605 963 A2는, 단백질상에서 알데히드기와 히드라존 결합을 형성하는 수용성 폴리머를 함유하는 결합제를 기술한다. 상기된 모든 참고문헌은 여기에 참고문헌으로써 수록된다.
B. 본발명의 생물활성 합성 키모카인의 폴리머-변형
본 발명은 추가적으로 폴리머 부가물에 의하여 변형된 생물활성 합성 키모카인 및 그것의 제조와 사용방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 하나 이상의 그것의 N-말단 영역에서의 변형을 갖는 이같은 합성 키모카인에 관한 것이다. 이 같은 변형을 갖는 변형된 키모카인은 전형적으로 그것의 대응하는 수용체에 대한 강력한 길항제이다. 일반적으로, 현재까지 발견된 대부분의 강력한 변형은 예를 들어, 각 키모카인의 주요 카테고리의 N-말단에 대한 메티오닌(Met-), 아미노옥시펜탄- (AOP-) 및 논아노일(NNY-) 변형 같이 원래 소수성이었고; 효능의 더 나아간 증가는 N-말단 영역내의 야생형 아미노산을 아미노산 또는 소수성 유도체로 대체함으로써 이루어질 수 있다 (예를 들어, Rantes, MCP, 및 MIP 같은 CXC 키모카인 및 SDF1과 IL-8 같은 CXC 키모카인) ((여기에 참고문헌으로써 전체가 수록된) 미국특허출원번호 60/217,683 참조). 더구나, 키모카인의 C-말단 영역에 대한 소수성 변형의 도입은 효능을 더 증가시키며, 이는 N- 및 C-말단 영역 모두의 소수성이 효능에 영향을 미친다는 개념을 뒷받침한다(미국 특허출원번호 60/217,683 참조). 따라서, 하향조절이 주어진 키모카인의 N- 및 C-말단의 소수성 특성을 증가시킴으로써 증강될 수 있다면, 수용성 폴리머의 부착은 이같은 키모카인의 소망의 길항제 활성, 특히 폴리머-변형되 키모카인이 결합하는 대응하는 수용체의 하향조절을 유의하게 감소시키거나 파괴하기까지 할 것으로 통상 예상될 것이다. Zalipsky, S. (Bioconjugate Chemistry (1995) 6: 150-165), Mehvar, R. (J. Pharm. Pharoaaceut. Sci. (2000) 3 (1) : 125-136)와 Monfardini et al. (Bioconjugate Chem. (1998) 9: 418-450)은 다양한 수용성 폴리머, 그것의 펩티드와 단백질에 대한 부착, 및 생물학적 영향을검토한다.
본 발명의 한 양태는 생물활성 합성 키모카인에 수용성 폴리머를 부착시키는 것이 상기 상술된 일반론과 같이 효능에 영향을 끼치지만 효능과 수용체 특이성은 부착 부위, 부착된 폴리머의 형태 및 폴리머-변형에 대하여 표적화된 전구체 키모카인에 따라서 제어될 수 있다는 발견에서 비롯된다. 본 발명은 또한 생물활성 합성 키모카인의 효능은 소망의 길항제 성질과 순환 반감기 사이의 균형을 체계적으로 개선시킴으로써 증가될 수 있다는 발견에서 비롯된다. 이 최적화는, 성분들이 순차적으로 조합될 때 더 증가된 효능과 순환 반감기를 갖는 합성 키모카인을 생성하는 3-성분 과정이 관련된다. 이 과정은 일반적으로 모든 키모카인에 적용가능한데, 각 성분은 또한 부착된 수용성 폴리머를 가지는 생물활성 합성 키모카인의 생성에서 일반적 적용을 가지며, 합성 키모카인이 결합하는 대응 키모카인 수용체를 하향조절하는 시험관내 생물활성을 갖는다. 용어 "키모카인 수용체를 하향조절하는"은 여기에서 사용될 때, 키모카인 또는 키모카인 유사체의 결합 후에 하나 이상의 칼슘 신호화, 백혈구 주화성 및 바이러스 감염을 특징으로하는, 키모카인 수용체의 정상적 바닥수준 활성의 감소를 유발하는 것을 나타내려는 의도이고; 세포 표면으로부터 수용체를 장기적 또는 유도적으로 제거하는 것을 포함한다.
제 1의 성분은 전구체 생물활성 합성 키모카인을 전구체 생물활성 합성 키모카인의 시험관내 생물활성을 보유하는 하나 이상의 부위에서 관심의 수용성 폴리머로 정확하게 변형하는 것과 관련된다. 시험관내 생물활성은 기능을 평가하는 양호한 기준이고 이 목적을 위한 개별 키모카인에 대한 검정은 주지이다(예를 들어,Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim and M. Feldmann, Acedemic Press, 2001; 및 Cytokine Reference, Vol. 2, Receptors, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim and M. Feldmann, Acedemic Press, 2001 참조). 바람직한 부착 부위는 C-말단 부위, 응집 부위, 글리코실레이션 부위, 및 글리코사미노글리칸 ("GAG") 결합 부위에 대응하는 전구체 키모카인의 잔기로부터 선택된다. Kuschert et al. (Biochem. (1999) 38 : 12959-12968), Koppman et al. (J Immunol. (1999) 163: 2120-2127) 및 Proudfoot et al. (J. Biol. Chem. (2001) 276 (14): 10620-10626) 는 GAG 결합과 키모카인에 대하여 보고한다.
제 2 성분은 바람직하게는 식 U-B-폴리머-J를 갖는 부착된 폴리머의 형태와 관련되는데, 식중 U는 단백질에 부착된 관능기의 잔기이고, B는 3 개 이상의 팔을 가진 분지 코어이고 존재 또는 부존재할 수 있고, 폴리머는 1000 달톤("Da")과 같거나 큰 분자량을 갖는 실질적으로 비항원성 수용성 폴리머이며, J는 생리학적 조건하에서 소망의 음, 중성 또는 양전하를 갖는 펜단트기가다.
본 발명의 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인에 관한 예상외의 발견은 약 1000-1500 Da 만큼 작은 수용성 폴리머 구성체가 전구체 키모카인의 혈청 순환 반감기를 약 10배 만큼 증가시키기에 충분할 수 있다는 것이다. 다른 예상외의 발견은 작은 선형 폴리머 구성체와 훨씬 큰 분지 폴리머 구성체가 동일 부위에 부착한 때 효능과 수용체 하향조절에서 유사한 효과를 가질 수 있다는 것이다. 다른 발견은 구성체 상의 펜단트기 J의 형태와 수는 생물활성 합성 폴리머-변형 키모카인의 하향조절과 수용체 특이성에 영향을 줄 수 있다는 것이다.
예를 들어, 다수의 이온화성 펜단트기 J를 갖는 분지 폴리머 구성체의 사용은 고안에 의하여 GAG와 수용체 결합을 변화시킬 수 있다. 예로서, (생리학적 조건하에서) 분지폴리머가 음 하전기를 갖는 RANTES의 유사체인 합성 키모카인은, 음성인 전체 정전기적 표면을 갖는 CCR1과 반대로, 중성으로 나타나는 전체 정전기적 표면을 갖는 CCR5에 대한 결합을 선호한다. 그러므로, 다수의 음하전 펜단트기 J기를 포함하는 수용성 폴리머를 가지는 폴리머-변형 생물활성 합성 Rantes 유사체는 전체 중성 또는 전체 양성 표면을 갖는 수용체와 바람직하게 상호작용할 수 있다. 유사하게, GAGs는 전형적으로 전체 음전하를 나타내므로, 그것과의 상호작용이 조작될 수 있다. 상기된 바와 같이 물론, 관심의 생물활성 합성 폴리머-변형 키모카인의 주어진 사용목적에 따라 폴리머의 부착 부위는 수용체와 GAG 결합의 성분을 상세하게 조정하여 이용할 수 있다.
제 3 성분은 결합하는 키모카인 수용체의 하향조절을 특징으로 하는, 최적 시험관내 생물활성을 갖는 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인의 생성에 관한 것이다. 이는 (시험관내 세포-기초 검정법에서 EC50에 의하여 측정될 때) 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인의 소망의 효능 범위 보다 약 1-내지 5-배 이상, 더 바람직하게는 약 5- 내지 10-배 이상 큰 효능을 갖는 전구체 키모카인 (즉, 수용성 폴리머를 부착시키기 위하여 선택된 천연 또는 변형 키모카인)의 선택과 관련된다. 이 같은 전구체 키모카인의 선택은 소망의 효능의 균형과 시험관내 혈청 순환 반감기를 나타내는 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인을 생성하는 것으로 발견되었다. 용어 "EC50"은, 투여량-반응 (또는 농도-반응) 상에서 베이스라인과 최대 반응 사이의 중간의 반응을 유발하는 화합물의 농도를 나타내려는 의도이다. 예를 들어, EC50는 효능의 척도가 될 수 있는데, 주어진 반응에 대하여 작은 값의 EC50는, 더 큰 EC50 값을 갖는 화합물과 비교하여 더 강력한 화합물을 나타낸다. EC50는 ED50 또는 IC50로서 일반적으로 지칭되기도 하고, 바이러스 감염의 문맥에서는 바이러스 생산의 50%, 바이러스 감염도의 50%, 또는 바이러스-유도 세표병원성 효과의 50%를 저해하는 효과적 농도이다.
합성 키모카인은 이들 성분(즉, 폴리머 부착 부위, 폴리머의 형태, 및 폴리머 변형에 대한 전구체 키모카인의 선택) 단독 또는 조합으로부터 유래하여 제공될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 폴리머 부착 부위는 또한 예를 들어 응집 부위 및 GAG 부위가 인접하거나 동일한 곳에 위치한 곳에 중복되거나 동일할 수 있다. 게다가, 둘 이상의 폴리머가 부착된 합성 키모카인이 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 또한 키모카인 폴리펩티드 사슬과, GAG 부위에서 선택된 제 1 부위 및 응집 부위와 C-말단 부위로부터 선택된 제 2 부위에서 그것에 부착된 수용성 폴리머를 포함하는 생물활성 합성 키모카인을 포함할 수 있다. 본 발명의 이 양태는, 특히 폴리머 부착 부위에서 응집과 특정 형태의 GAG 결합 같은 덜 바람직한 성질이 제거된 반면, 분자량과 수용성을 증가시키도록 (따라서 순환 반감기 및 수용성 폴리머에 의하여 주어지는 폴리머 부착 부위에서의 바람직한 성질을 개선시키도록) 한다.
1. 폴리머 부착 부위
본 발명의 바람직한 생물활성 합성 키모카인은 본 발명의 생물활성 합성 키모카인 단백질을 C-말단 부위, 응집 부위, 글리코실레이션 부위 및 GAG 결합 부위로부터 선택된 하나 이상의 부위의 잔기에서 관심의 수용성 폴리머로 정확하게 변형함에 의하여 제조될 수 있다. 이들 부위에서의 잔기는, 그것들이 폴리머 부착이 적당한 곁사슬(즉, 관능기를 포함하는 아미노산, 예를 들어 리신, 아스팔산, 글루탐산, 시스테인, 히스티딘 등의 곁사슬)을 갖는 한, 부착에 사용될 수 있다. 대안으로, 이들 부위에서의 잔기는 폴리머 부착이 적당한 곁사슬을 가지는 상이한 아미노산으로 대체될 수 있다. 또한, 유전적으로 코딩되는 아미노산의 곁사슬은 폴리머 결합을 위하여 화학적으로 변형될 수 있고, 적당한 곁사슬을 갖는 비천연 아미노산이 채용될 수 있다. 부착의 바람직한 방법은 펩티드 합성 및 화학적 라이게이션의 조합을 채용할 수 있다.
이 같은 본발명의 생물활성 합성 키모카인은 아미노산 잔기의 축합에 의하여 바람직하게 합성된다. 이같은 아미노산 잔기는 핵산으로 코딩된, 리보솜에서 위치하는 아미노산: 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 그루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린이다. 한 구체예에서, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 특정 위치에 대하여 선택된 아미노산 서열은 천연, 또는 단백질의 서열에서 그 위치에서 발견되는 천연적으로 존재하는 아미노산 잔기일 것이다. 대안의 구체예에서, 선택된 아미노산 서열은, 천연 또는 그 단백질의 천연 서열에서 존재하는 아미노산 잔기 대신 N-말단 시스테인 잔기을 함유하는폴리펩티드 단편으로 이루어지거나, 또는 그것으로부터 구성될 것이다. 이 같은 잔기의 포함은, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 합성하기 위하여 바람직하게 채택되는 원리인, 천연 화학 라이게이션, 펩티드 합성 및/또는 수렴 합성의 원리와 방법을 사용하여 폴리펩티드를 (카르복시 티오에스테르기를 함유하도록 변형된) 다른 폴리펩티드에 라이게이션 시키도록 한다(여기에 참고문헌으로 수록된 미국 특허출원번호 60/231,339,60/236,377 및 09/097,094 참조).
더 나아간 구체예에서, 본 발명의 합성 생물활성 단백질은 "비정규적" 아미노산 잔기를 함유한다. 여기에서 사용될 때, "비정규적" 아미노산 잔기는 RNA에 의하여 코딩되지 않고 리보솜에서 합성되지 않는 아미노산을 지칭하려는 의도이다.
이 측면에서, 본 발명은 합성 생물활성 단백질의 고안 및/구성에 있어 광범위한 선택성과 유연성을 허용한다. 본 발명에 따라 사용되는 비-리보솜 합성 아미노산의 예는: D-아미노산, β-아미노산, 슈도-글루타메이트, γ-아미노부티레이트, 오르니틴, 호모시스테인, N-치환 아미노산 (R. Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1992) 89: 9367-71; WO 91/19735 (Bartlett et al.), 미국 특허 5,646,285 (Baindur), α-아미노메틸렌옥시 아세트산 (아미노산-Gly 디펩티드 이소스티어), α-아미노옥시산 등을 포함한다. 티오아미드, 비닐계 아미드, 히드라지노, 메틸렌옥시, 티오메틸렌, 포스폰아미드, 옥시아미드, 히드록시에틸렌, 환원 아미드 및 치환 환원아미드 이소스티어 및 β-술폰아미드를 포함하는 펩티드 유사체가 채용될 수 있다.
특히, 슈도-천연 화학적 라이게이션은 이로운데, 이는 R 사슬 변형이 폴리머부가물이 단백질을 합성하도록 하기 때문이다. 마찬가지로, N-말단 Nα-치환 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 아미노산이 채용될 수 있다. (말단 또는 폴리펩티드에서 존재하는) 이 같은 잔기는, 여기에 기술된 연장된 천연 화학적 라이게이션 방법에 따라, 폴리펩티드를 카르복시 티오에스테르 부분을 갖는 포릴펩티드에 라이게이션시키는데 유리하게 사용될 수 있다.
펩티드 합성은 바람직하게는 표준 자동화 펩티드 합성기를 사용하는, 1960년대 초에 개발된 "Merrifield"-화학 단계별 고체상 펩티드 합성 프로토콜에 기초한다. 펩티드 라이게이션 단계는 고체 또는 용액 상태 라이게이션 전략을 채용할 수 있다. 화학적 라이게이션은 제 1 의 화학적 성분과 제 2의 화학적 성분 사이의 선택적 공유결합의 형성이 관련된다. 제 1 및 제 2 성분 상에 존재하는 고유의 상호 반응성, 관능기가 화학선택성 라이게이션이 일어나도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩티드와 폴리펩티드의 화학적 라이게이션은 일치하는 고유한 상호-반응성 C-말단 및 N-말단 아미노산 잔기가 관련된 펩티드 또는 폴리펩티드의 화학선택적 반응이 관련된다.
한 구체예에서, 합성 생물활성 단백질의 모든 아미노산 잔기는 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)에 의하여 결합될 수 있다. 대안으로, 두 개의 아미노산 잔기 (또는 두 폴리펩티드의 C-말단 및 N-말단 잔기)는 (티오에스테르, 옥심 결합, 티오에스테르 결합, 정의 이황화 결합, 티오졸리딘 결합, 히드라존 형성 라이게이션, 옥사졸리딘 형성 라이게이션 등 같은) 비-아미드 결합(Schnlzer, M. and Kent, S. B. H., Science (1992) 256: 221-225; Rose, K., J. Amer. Chem Soc. (1994) 116: 30-33; Englebretsen, D. R. et al., Tetrahedron Lett. 36: 88718874; Baca, M. et al., J. Amer. Chem Soc. (1995) 117: 1881-1887 ; Liu, C. F. et al., J. Amer. Chem Soc. (1994) 116: 4149-4153; Liu, C. F. et al., J. Amer. Chem Soc. (1996) 118: 307-312; Dawson, P. E. et al. (1994) Science 266: 776-779; Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338 ; Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189; Tam, et al., WO 95/00846 ; 미국 특허번호 5,589,356) 또는 다른 방법 (Yan, L. Z. and Dawson, P. E.,"Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,"J Am. Chem. Soc. 2001,123,526-533, herein incorporated by reference; Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9): 1331-1334; Saxon, E. et al.,"Traceless"Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000,2, 2141-2143)에 의하여 다른 하나에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 펩티드 결합 변형, 대용물 및 입체이성질적 대체물이 생물활성 단백질의 제조에서 사용되도록 한다.
라이게이션이 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드의 연결과 관련되는 경우, 천연 화학적 라이게이션이 바람직하게 채용된다(Dawson, et al., Science (1994) 266: 776-779; Kent, et al., WO 96/34878; Kent, et al., WO 98/28434)). 이 방법학은 라이게이션 부위에서 천연 아미드 결합을 생성하기 위한 확립된 방법학을 증명한다. 천연 화학적 라이게이션은 C-말단 α-카르복시티오에스테르 부분을 갖는 제 1 펩티드 또는 폴리펩티드 단편 및 N-말단 시스테인 잔기를 갖는 제 2 펩티드 또는 폴리펩티드 사이의 화학선택적 반응과 관련된다. 티올 교환 반응은, 시스테인 곁사슬 티올을 생성하는 동안 라이게이션 부위에서 자발적으로 재배열하여 천연 아미노 결합을 생성하는, 최초 티오에스테르-결합 중간체를 생산한다. 다수의 예에서, N-말단 시스테인 잔기를 갖는 폴리펩티드 단편이 합성되어 천연 화학적 라이게이션 반응에서 사용될 수 있도록, 천연 단백질의 서열은 적당하게 위치하는 시스테인 잔기를 포함한다. 다른 예에서, 시스테인 잔기를 이 목적의 폴리펩티드 내로 도입하도록 펩티드 합성이 수행될 수 있다.
그러나, 폴리펩티드의 N-말단에 시스테인 잔기를 도입하도록 천연 단백질 서열을 변형하는 것이 불편하거나 바람직하지 않은 경우, 천연 화학적 라이게이션의 방법은, N-말단이 N-치환, 바람직하게는 Nα-치환, 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 함유한 폴리펩티드를 사용하는데 확장될 수 있다. 이같은 "확장된 천연 화학적 라이게이션"은 여기에 참고문헌으로 수록된 미국 특허출원번호 60/231,339 및 60/236,377에 기술된다.
요약하여 기술하면, 방법은 카르복실 티오에스테르, 더 바람직하게는 α-카르복실 티오에스테르를 포함하는 제 1 성분을 산 안정 N-치환, 더 바람직하게는 Nα-치환, 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올을 포함하는 제 2 성분과 라이게이션 하는 것과 관련된다. 제 1 성분의 카르복시티오에스테르와 제 2 성분의 N-치환, 2 또는 3 탄소 사슬 아미노 알킬 또는 아릴 티올의 티올 사이의 화학선택적 반응은 티오에스테르-결합 중간체를 통하여 수행되고 초기 라이게이션 산물로 변화된다. 더 구체적으로, COSR 티오에스테르 성분과 아미노알킬 티올 성분 사이에서 일어나는 티올 교환은, 자발적 재배열 후에, 아미노 알킬 티올 성분이 각각 다음 식:
J1-C(O)-N(C1(Rl)-C2-SH)-J2 I
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2 II
중 식 I을 갖느냐 식 II를 갖느냐에 의존하여 5-원소 또는 6-원소 고리 중간체를 통하여 아미노-결합 제 1 라이게이션 산물을 생성하는 티오에스테르-결합 중간체 라이게이션 산물을 생성하는데, 상기 식중 J1은 하나 이상의 선택적으로 보호되는 아미노산 곁사슬을 갖는 펩티드나 폴리펩티드, 또는 그와 같은 펩티드나 폴리펩티드의 부분, 폴리머, 염료, 적당하게 관능화된 표면, 링커나 검출 가능한 마커, 또는 화학적 펩티드 합성이나 확장된 천연 화학적 라이게이션과 조화되는 다른 화학적 부분이고; R1, R2 및 R3 중 적어도 하나가 C1에 접합된 전자공여기를 포함하는 경우; R1, R2 및 R3은 독립적으로 H, 또는 C1에 접합된 전자공여기이고; J2는 하나 이상의 선택적으로 보호되는 아미노산 곁사슬을 갖는 펩티드나 폴리펩티드, 또는 그와 같은 펩티드나 폴리펩티드의 부분, 폴리머, 염료, 적당하게 관능화된 표면, 링커나 검출 가능한 마커, 또는 화학적 펩티드 합성이나 확장된 천연 화학적 라이게이션과 조화되는 다른 화학적 부분이다.
라이게이션 부위에서의 N-치환 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 또는 아릴 티올 [HS-C2-C1(R1)-] 또는 [HS-(C3(R3)-C2(R2)-Cl(Rl)-]는 펩티드-조화 조건에서 산물을 손상시키지 않고 제거되어, 라이게이션 부위에서 천연 아미노 결합을 갖는 다음식 III:
J1-C(O)-HN-J2 III
의 최종 라이게이션 산물을 생성하기 쉬운데, 식중, J1, J2, R1, R2 및 R3은 상기 정의된 바와 같다.
R1, R2 및 R3기는 펩티드 조화 절단 조건에서 N-C1 결합의 절단을 용이하게 하기 위하여 선택된다. 예를 들어, 특히 C1에 접합되는 경우의 전자 공여기는 절단을 용이하게 하는 C1에서의 공명 안정화 양이온을 형성하는데 사용될 수 있다. 화학적 라이게이션 반응은 부형제로서 티올 촉매를 바람직하게 포함하고, 중성 pH 근처에서 수성 또는 혼합 유기-수성 조건에서 수행된다. 제 1 및 제 2 성분의 화학적 라이게이션은 5- 또는 6-원소 고리를 통하여 진행되는데, 그것은 자발적 재배열을 수행하여 N-치환 아미노 결합 라이게이션 산물을 생성한다.
제 1 및 제 2 성분이 펩티드나 폴리펩티드인 경우, N-치환 아미노 결합 라이게이션 산물은 식 IV 또는 V:
J1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2IV
Jl-C(O)-Nα(Cl(Rl)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2V
을 갖는데, 식 중, J1, J2 및 R1, R2, R3 상기 정의된 바와 같고 Z2는 아미노산 곁사슬 또는 그 같은 곁사슬의 유도체이다.
N-치환 아미노 결합 라이게이션 산물의 접합된 전자 공여기 R1, R2 또는 R3은 N-C1 결합의 절단 및 N-치환 아미노 결합 라이게이션 산물로부터의 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 및 아릴 티올의 제거를 용이하게 한다. 펩티드 조화적 절단 조건 하에서의 N의 2 또는 3 탄소 사슬 알킬 및 아릴 티올의 제거는, 라이게이션 부위에서의 천연 아미노 결합을 갖는 라이게이션 산물을 생성한다. 제 1 및 제 2 성분이 펩티드나 폴리펩티드인 경우, 라이게이션 산물은 다음 식:
J1-CONaH-CH(Z2)-C(O)-J2 VI
을 가질 것이다.
C-말단 부위에 대한 부착의 이점은 대부분 키모카인의 기지 작용 영역으로부터의 최대 분리에 의한 활성의 잠재적 손실을 최소화할 수 있다는 것이다. 하나 이상의 응집 부위를 갖는 키모카인에 대한 부착의 이점은, 활성의 잠재적 손실을 최소화하면서 수용성 폴리머가 응집을 붕괴시키고 취급/제제화와 생체내 효능을 개선시킬 수 있다는 것이다. 글리코실레이션 부위에 대한 결합은 천연적 폴리머 부착 부위에서의 합성 폴리머의 부착에 의한 잠재적 활성 손실을 최소화하면서, 그 부위에서 정상적으로 발견되는 당 사슬의 긍정적 효과를 모방하는 것의 이점을 갖는다. 글리코실레이션 부위에서의 폴리머-변형의 다른 이점은 프로드러그 형태에서, 특히 N-말단 약물작용발생단 영역에서 또는 근방에서 글리코실레이션 부위가 발생하는 경우, 합성 키모카인을 제공하도록 절단 링커를 포함하는 폴리머가 채택될 수 있다는 것이다. GAG 결합 부위에 대한 부착의 이점은 폴리머가 그 부위에서 GAG 결합을 붕괴시키도록 이용될 수 있고, 이같은 부위가 중복되는 경우 어느정도 응집이, 활성의 잠재적 손실을 최소화하면서, GAG 부분에 연관된 바람직하지 않은 표면에 대한 결합을 감소시킴으로써 순환 반감기를 개선시키고 취급/제제화 및 생체내 효능을 개선시킬 수 있다는 것이다. 대안으로, 부착을 위하여 채택되는 수용성에 따라서, GAG 결합은 증강되거나 GAG 결합의 특정 유형의 결합은 증강될 수 있다. 물론변형을 위한 표적 키모카인에 따라서, 한 폴리머 부착 부위는 다른 것에 비하여 바람직할 수 있는 한편, 모든 키모카인은 C-말단 영역 및 하나 이상의 GAG 결합 부위를 갖고, 모든 키모카인이 응집과 글리코실레이션 부위를 갖는 것은 아니다.
유리하게, 수용성 폴리머의 부착은 특히 단백질의 N-말단 영역에서의 생분해성 링커를 통할 것이다. 이같은 변형은 전구체 형태의 단백질(또는 "프로드러그")이 링커의 분해 후 폴리머 변형 없는 단백질을 배출하도록 작용한다. 에스테르 결합 같은 생분해성 결합에 의한 부착 및 그것의 사용은 하기에 더 상세히 기술된다.
a. C-말단 부위
본 발명의 바람직한 생물활성 합성 키모카인은 C-말단 부위에서 부착된 수용성 폴리머를 갖는다. "C-말단 부위"에 의하여는 키모카인의 C-말단 α-헬릭스에 대한 C-말단인 키모카인 폴리펩티드 사슬의 잔기를 의도한다. 이것은 자유 α-카르복실레이트 및 그것에 인접한 잔기와 연관된 부가 C-말단 잔기를 포함한다. 모든 키모카인에서 두드러지는 2차구조상의 특징은 소수성 C-말단 α-헬릭스에 대하여 시트 플로어를 형성하여 교차하여 놓이는 3중-가닥 역평행 β 시트이다. 그러므로, C-말단 α-헬릭스는, 예를 들어 상동성 모델링과 비교에 의하여, 예를 들어 1차 서열 및/또는 기지 키모카인의 3-차원적 구조를 비교하거나 분자 대체와 에너지 최소화 알고리즘을 통하여 구조를 예상함으로써 동정되기 쉬운 키모카인의 일관된 특징이다 (예를 들어, Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001) 참조).
바람직한 C-말단 부위는, 폴리머 변형을 위하여 표적화되는 전구체 키모카인의 부가 C-말단 잔기에 인접한 것이다. 한 예는 Rantes의 유사체이다. 야생형 Rantes의 C-말단 잔기(1-68)는 위치 68에서의 세린(즉, Ser68 또는 S68)이다. NNY-Rantes (2-68) 같은 전구체 키모카인의 부가 C-말단 잔기에 인접한 잔기에 대한 수용성 폴리머의 부착은 위치 67 (M67)에서의 메티오닌 뿐아니라 M67 및/또는 S68에 대응하는 잔기에 부착된 링커 부분을 포함한다. 예를 들어, 수용성 폴리머를 관심의 키모카인의 C-말단에 결합시키기 위한 관능성 곁사슬을 갖는 링커나 스페이서 성분의 첨가는 그 위치 또는 근처의 원래의 C-말단기의 기능에 대한 잠재적 충격을 최소화한다. 예를 들어, 디펩티드 링커 Lys69-Leu70 같은, Rantes의 위치 S68 에 대한 링커의 첨가는 Rantes ((1-68)-(K69-L70))를 제공하고 링커 부분 Lys69의 곁사슬 상의 ε질소에 대한 폴리머 부착을 위한 관능성 결합기, 및 새로이 형성된 C-말단에 자유 α-카르복실레이트를 가지는 아미노산을 제공한다. 위치 67에 대응하는 잔기에 대한 스페이서나 링커의 첨가 (예를 들어, Met67을 Lys67로 대체하는 것 및 ε곁사슬 아미노기에 대한 링커의 부착) 또한 가능하다. 둘 모두 생물활성을 유지하는 것으로 증명되었고, 이 고안은 다른 키모카인에 대한 일반적 적용되는 것으로 보인다. 예를 들어, SDF-lα 또는 SDF-1β의 유사한 변형은 바람직한 생물활성을 보유하는 폴리머-변형 SDF-1 유사체를 생성할 수 있다. 또 다른 예에서, 합성 키모카인이 MCP-1 또는 Eotaxin의 유사체일 때, 및 수용성 폴리머가 C-말단에 인접한 잔기에서 부착되는 경우, 폴리머 부착 부위는 MCP-1의 D68나 Eotaxin의 D66 에 대응하는 아미노산을 포함한다. 여기서도 역시, 이들 위치에 인접한 C-말단 부위에서의 잔기는 MCP-1의 K69나 Eotaxin의 K68 같은 폴리머 부착을 위하여 사용될 수 있다. 게다가, 링커나 스페이서 부분의 첨가는 지질이나 폴리사이클릭 같은 소수성 부분 같은 C-말단에서 또는 근처에서의 다른 부분의 첨가에 있어서의 더 나아간 유연성을 허용한다. 따라서, 본 발명의 추가적 바람직한 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인은 링커나 스페이서 부분의 곁사슬을 통하여 C-말단에서 부착된 수용성 폴리머를 포함한다.
b. 응집 부위
특히 관심있는 것은 하나 이상의 응집 부위에 부착된 수용성 폴리머를 갖는 합성 키모카인이다. "응집 부위"에 의하여는 단백질 단량체의 자기-회합을 유발하는 잔기를 의도한다. 대부분의 키모카인은, 다수의 3량체 및 약간의 더 큰 다량체를 형성할 수 있는 가능성과 함께 상동 2량체를 형성하는 능력을 갖는다(Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001). 키모카인의 응집 부위는 전형적으로 높은 농도로 이량체와 다량체를 형성할 수 있는 키모카인에서 발견된다 (Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001). 예를 들어, Rantes와 MIP1β 같은 키모카인은 높은 농도에서의 단량체의 자기-회합을 통하여 응집체를 형성하는 반면, IL-8, SDFIα및 vMIP 같은 키모카인은 유의한 정도로 이와 같은 경향을 갖지 않는다. 응집 부위는 상동성 모델링, 알라닌 검색 및 용액내 농도 증가에 따른 활성 화합물의비교 같은 다수의 주지 방법 및 당업계에 알려진 다양한 방법을 사용한 응집, 자기-회합에 대한 모니터링에 의하여 동정 가능하다 (예를 들어, Czaplewski et al., J Biol. Chem. (1999) 274 (23): 16077-16084; Czaplewski et al.,"Engineering, Biology, and Clinical Development ofhMIP-la," (1999) In: Chemokines in Disease: Biology and Clinical Research, Ed., C. A. Herbert, Humana Press Inc., Totwa, NJ; Trkola et al., J Virol. (1999) 73 (8): 6370-6379 ; Appay et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512; Hunter et al., Blood (1995) 86 (12): 4400-4408; Lord et al., Blood (1995) 85 (12): 3412-3415; Lord et al., Brit. J Cancer (1996) 74: 1017-1022 참조). 또한 상기된 바와 같이, 다수의 키모카인의 응집 부위는 알려져 있고, 후보 응집 부위를 동정하기 위한 기술은 주지이다 (또한, Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001 참조). 그러므로, 키모카인의 응집 부위는 검색이나 공지된 정보를 통하여, 상동성 모델링 또는 각각의 조합으로부터 확인될 수 있다. 그러므로, 여기에 나타낸 예는 발명의 설명이고, 따라서 발명을 제한하려는 의도가 아니다.
예로서, 응집 부위는 다수의 키모카인에서 상기된 바와 같은 다수의 기술에 의하여 동정되었다. 예를 들어, 야생형 Rantes는 응집 관련의 적어도 두 개의 잔기: 잔기 위치 26과 66에서의 글루탐산 (즉, Glu26 과 Glu66 ; 또는 E26 과 E66)를 갖는다. 그러므로, 합성 키모카인이 Rantes의 유사체인 경우, 및 수용성 폴리머가응집 부위에서 부착된 경우, 응집 부위는 E26과 E66으로부터 선택되는 Rantes의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, Rantes의 E66 에 인접한, 즉 메티오닌 67 (즉 Met67 또는 M67)에 대응하는 위치에서 수용성 폴리머를 부착하였다. 이 폴리머 변형은 응집을 붕괴시키고 전체 취급특성을 개선시키는데, 이는 아마도 인접 글루탐산 잔기의 응집 특성을 붕괴시키는 폴리머에 의하여 기여되는 큰 소수성 껍질 때문일 것이다. 그러므로 본 발명의 문맥에서 Rantes의 응집 부위는 E26 및 E66에 대응할 뿐 아니라, 그것에 인접하는 아미노산에도 대응한다. 그러므로, Rantes의 응집 부위는 M67을 포함하는 E26과 E66으로부터 선택되는 Rantes의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다.
다른 예로서, 합성 키모카인이 MIP1α의 유사체이고, 수용성 폴리머가 그것의 응집 부위에서 부착된 경우, 응집부위는 D26과 E66으로부터 선택되는 MIP1α의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. 유사하게, 합성 키모카인이 MIP1β의 유사체이고, 수용성 폴리머가 그것의 응집 부위에서 부착된 경우, 그 같은 응집부위는 위치 D27과 E67로부터 선택되는 MIP1β의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 합성 키모카인이 MCP-1이나 Eotaxin의 유사체이고, 수용성 폴리머가 그것의 응집 부위에서 부착된 경우, 응집부위는 각각 MCP-1의 잔기 P8과 D68나 Eotaxin의 D66 에 대응하는 아미노산을 포함한다. 여기에서도 역시, MCP-1의 K69 또는 Eotaxin의 K68 같은 이들 위치에 인접한 잔기는 응집을 붕괴하기 위하여 폴리머 부착을 채용할 수 있고, 따라서 그것의 응집 부위에서 부착된 수용성 폴리머를 같는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인으로 구체화된다. 이해할 수 있는 바와 같이, 응집 부위는 동정되기 쉽고 폴리머-벼형에 대한 바람직한 부위이며, 바람직한 생물활성에 대한 일상적인 검색을 통하여 바람직한 부착을 위하여 선택될 수 있다.
더 바람직한 구체예에서, 수용성 폴리머는 관심의 키모카인의 C-말단 영역에 위치하는 응집부위에 부착된다. 더욱 더 바람직한 폴리머 부착을 위한 응집 부위는, Rantes의 M67, MIPlα의 E66, MIPlβ의 E67, MCP-1의 D68 또는 Eotaxin의 D66 같은, 키모카인의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단의 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 생물활성 합성 키모카인은 그것의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단인 C-말단 응집 부위에 부착된 수용성 폴리머를 갖는 것을 포함한다. 본 발명의 이 양태의 가장 바람직한 생물활성 합성 키모카인은 그것의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단이고 전구체 키모카인의 부가 C-말단 잔기에 인접한 C-말단 응집 부위에 부착된 수용성 폴리머를 갖는 것이다.
c. 글리코실레이션 부위
다른 바람직한 구체예에서, 글리코실레이션 부위에 부착된 수용성 폴리머를 갖는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인이 제공된다. "글리코실레이션 부위"에 의하여는 N-결합 및 O-결합 글리코실레이션 부위 같은 탄수화물(올리고당) 사슬의 효소적 부착을 코딩하는 잔기를 의도한다. 더 바람직한 글리코실레이션 부위는 키모카인의 C-말단에서 나타나는 것이다. N-결합 글리코실레이션 부위는 가장 바람직하다. 글리코실레이션 부위는 천연 부위이거나 또는 표적 단백질에 대하여 조작될 수 있다. 그것은 당의 존재와 그것의 부착 부위에 대한 분석적 시험, 상동성 비교, 또는 보존적 서열 및/또는 유전자와 단백질 데이터베이스에 대한 구조에 대한 검색에 의하여 야생형 분자에서 동정될 수 있다. 표적 단백질에 대한 글리코실레이션 부위를 조작하는 것의 이점은, 조작 부위가 소망의 관심의 생물활성을 붕괴하지 않는다면, 폴리머 부착의 추가적 바람직한 부위를 동정할 수 있다는 것이다.
특히, 조면소포체의 리보솜에 의하여 합성되는 대부분의 단백질은 탄수화물(올리고당)의 짧은 사슬을 함유하며 당단백질이라 불린다 (예를 들어, Van den Steen et al., Critical Rev. Bioche7l. Mol. Biol. (1998) 33 (3): 151-208 참조). 그리고, 다수의 키모카인은 글리코실화되어 있거나 N-결합 및/또는 O-결합 글리코실화를 위한 보존적 부위를 함유하는 것으로 알려졌다. 사실, 많은 천연 생산 키모카인은 많이 글리코실화되어 있다. 이것은 폴리머-변형에 대하여 특히 관심있는 키모카인의 글리코실레이션 부위가 된다. 예를 들어, 글리코실레이션은 단백질(예를 들어, pI, 분자 크기, 용해도, 안정성, 구조 및 정전기적 표면 전하)과 진핵 세포 표면(예를 들어, 세포-세포 인식 및 접합, 소모에 대항한 세포표면 전하 보호, 혈 군 특이적 항원, 바이러스, 박테리아 및 원생동물 수용체, 이식(조직적합성)항원, 이온 채널 등등)의 다수의 중요한 성질에 영향을 끼친다. 그러므로, 이같은 부위에서의 수용성 폴리머의 그같은 부착은 유리한 성질(예를 들어 pI, 크기, 용해도, 안정화도, 항원성 감소, 순환반감기 연장)을 모방하기 위하여 이용될 수 있는 한편, 다른 성질(예를 들어, 이형성, 당-매개 제거 및 바람직하지 않은 접합)을 제거하여 개선된 성질을 갖는 의약 화합물을 생성한다.
게다가, 하나 이상의 글리코실레이션 부위에서의 수용성 폴리머의 부착은 일반적으로 생물활성에 대한 충격을 줄이고, 자연은 이 같은 큰 수용성 폴리머의 부착을 위한 부위를 선택하여 왔으므로 생물활성을 개선시킬 수 있다. (종종 전체 중량의 50 % 이상인) 당단백질의 탄수화물 성분은 전형적으로 4 내지 15 개의 당을 함유하는 올리고당 곁사슬로서 폴리펩티드에 공유적으로 부착된다. 몇몇의 곁사슬은 동일한 폴리펩티드상에서 발생하고 사슬은 분지될 수 있다. 그리고, 글리코실레이션 부위는 폴리머 부착, 특히 글리코실레이션을 통하여 부착된 올리고당 사슬의 순 전하 분포를 모방하는 부가 하전기를 갖는, 상대적으로 고분자량의 분지 수용성 폴리머 부착에 조화되는 부위의 상대적으로 양호한 지표임을 발견하였다.
글리코실레이션 부위의 동정에서, 당단백질의 올리고당은 두가지 주요 유형: O-결합 및 N-결합 중 하나이다. O-결합 올리고당은 일반적으로 세린과 트레오닌 곁사슬의 OH기에 대하여 O-글리코시딕 결합을 통하여 단백질에 부착된다. N-결합 올리고당은 X가 프롤린과 아스파르테이트를 제외한 임의의 단백질인 경우의 서열에서 아스파라긴이 나타나는 아스파라긴 사슬의 NH2기에 대하여 N-글리코시딕 결합을 통하여 단백질에 부착된다.
N-글리코실화 탄수화물 사슬은, 상기 언급한 바와 같이, 폴리펩티드에서 Asn-X Ser/Thr(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산) 서열의 Asn 잔기에 결합한다. 그러나, 다수의 단백질은 글리코실화되지 않은 Asn-X-Ser/Thr 서열을 함유하고 이들 서열의 존재가 탄수화물 사슬의 첨가를 항상 결과하는 것은 아니다. 그러나, N-글리코실레이션의 존재나 부재는 시험되기 쉬울수 있다(Biller, M. et al., JVirol Methods 1998 Dec; 76 (1-2) : 87-100; Taverna, M. et al., JBiotechnol 1999 Feb 5; 68 (1) : 37-48; Friedman, Y. et al., Anal Biochem 1995 Jul 1; 228 (2): 221-5). 다른 한편, O-글리코실화 탄수화물 사슬은 폴리펩티드의 Ser 또는 Thr 잔기에 결합하지만, N-글리코실화의 경우와는 달리 글리코실화에 필요한 아미노산 서열에 대한 법칙은 없다. 그러나, 예를 들어 서열 Pro-Thr/Ser, Thr/Ser-Pro 및 Thr/Ser-X1-3-Pro (X는 임의의 단백질)에서와 같이 근처에 Pro가 나타날 때 글리코실화 경향이 증가하는 것이 알려져 있다. (Takahashi et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 2021). 여기에서도 역시 O-결합 글리코실화는 시험되기 쉬울 수 있다.
다수의 키모카인이 글리코실화되거나 후보 글리코실화 부위를 함유하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001 참조). 그와 같은 키모카인의 글리코실화 부위는 공개된 정보로부터 확인할 수 있다. 예상되는 부위에 대하여, N-및/또는 O-결합 글리코실화 부위를 확인하는 방법은 상동성 비교 (예를 들어, 이 목적에 적당한 데이터베이스와 패턴 매칭을 사용하여, 예를 들어, Xiang, Y. et al., Virology 1999 May 10; 257 (2): 297-302; Hoops, T. C. et al., JBiol Chem 1991 Mar 5; 266 (7): 4257-63); Apweiler, R. et al., Biochim Biophys Acta 1999 Dec 6; 1473 (1) : 4-8 참조) 후, 효모나 포유동물 세포 발현 시스템에서의 전구체 키모카인의 시험 및 당 함유 및 부착 부위를 특성결정하기 위한 분석 시험을 수행하는 것이다. 대안으로, 상동성 비교에 의하여 동정된 후보 부위는 관심의 수용성 폴리머로 변형된 후, 이 목적에 적당한 표준 프로토콜에 따라서 관심의 생물활성(예를 들어 칼슘 흐름, 주화성, 및/또는 바이러스 침입의 저해)에 대한 적당한 시험관내 생물검정에서 단순히 검색할 수 있다.
예로서, 상동성 모델링은, 글리코실화 형태가 2-10 nM 범위로 주화성 활성을 갖는 것을 보인 다른 연구(Kameyoshi et al., JExp Med (1992) 176 (2): 587-592)에 의하여 뒷받침되는 Rantes 상의 위치 5의 세린에서의 후보 O-결합 글리코실화 부위를 동정한다. NNY-Rantes 유사체 같은 길항제인 Rantes 유사체에 대하여, 바이러스 감염/접합에 대한 세포-기초 분석에서 측정할 때, Rantes의 위치 5 세린을 Glu 나 Lys 같은 하전, 수용성기 부분으로 바꾸는 것은 효능을 감소시키는 한편, t-부틸 알라닌 (tBuA) 같은 아미노산 부분의 도입은 효능을 유지한다. Rantes 길항제에 대하여, 야생형 Rantes의 S5 위치에 대응하는 부위에서의 수용성 폴리머의 부착은 바람직하게는, 실질적으로 프로드러그 형태로 Rantes 길항제 화합물을 제공하는 생분해성 링커, 예를 들어, 세린의 곁사슬 히드록시 또는 유사 기에 대한 에스테르 결합을 통한다. 생체내 세팅에서 수용성 폴리머로부터 Rantes의 분해나 배출은 그 후 활성화 형태를 생성한다. 에스테르 결합 같은 생분해성 결합을 통한 부착이나 그것의 사용은 주지이고 하기에 더 상세하게 기재된다.
둘 모두 하나 이상의 잠재적 O-결합 글리코실화 부위를 갖는 MIP-lα와 MIP-lβ 같은 다른 키모카인에 대하여도 유사한 상황이 발견되었다. 예를 들어, MIP-lα는 잔기 T7에 대응하는 아미노산을 포함하는, 예상되는 글리코실화 부위를 갖고,MIP-lβ에 대하여는 잔기 S5에 대응하는 아미노산을 포함하는 글리코실화 부위가 있다. 이들 두 가지 예는, O-결합 글리코실화 부위가 예상되고, 따라서 폴리머의 생체내 배출 후 활성화 형태의 형성을 허용하도록 MIP의 길항제 유사체에 대하여 바람직한 부착이 생분해성 결합을 통하여 있다는 점에서 Rantes와 유사하다.
다수의 다른 키모카인이 글리코실화 부위를 가지며, 본 발명에 따라서 합성되고 하나 이상의 수용성 폴리머로 변형될 수 있다. 그러므로, 여기에 나타난 예는 본 발명의 예시적 설명이고, 따라서 본 발명을 제한하려고 의도되지 않는다. 예를 들어, 리포택틴은 8 개의 O-결합 글리코실화 부위를 함유하는 93-잔기 키모카인이다. 이 화합물은 표준 Fmoc-화학 (Marcaurelle et al., Chemistry (2001) 7 (5): 1129-1132)을 사용하여 각 글리코실화 부위에서 단일 GaINAc 잔기가 삽입된, 천연 화학 라이게이션을 사용하여 합성되었다. MCP-1 같은 다른 키모카인에서, 글리코실화 부위는 MCP-1의 잔기 T71에 대응하는 아미노산을 포함한다. 정규의 N-글리코실화 서열은 MCP-1에서 위치 N14에서 존재하지만, 검출 가능한 N-결합 당은 없다. 오히려, 단백질의 C-말단에 작은 양의 시알화 O-결합 탄수화물이, 예상부위 T71로서, 첨가된다(Zhang et al., J. Biol. Che7n. (1994) 269: 15918-15924). 글리코실화된 형태는 시험관내 단핵구 주화성 검정에서 비-글리코실화 MCP-1보다 오직 2 내지 3배 덜 강력한 것으로 보고되었다 (Proost et al., J ; Immunology (1998) 160: 40344041). 다른 글리코실화 키모카인은, 인간 혈장에서 나노몰 농도로 순환하는, 지금까지 알려진 유일한 CC 키모카인인 HCC-1이다 (Richter et al., Biochemistry (2000) 39 (35): 10799-10805). HCC-1은, 두 개의 N-아세틸뉴라민 산과 디사카라이드 N-아세틸갈락토스아민 갈락토스를 갖는, 위치 7 (Ser7)에서 O-글리코실화를 갖는 것이 전장 74 아미노산인데, 다양하게 프로세싱된 형태로 존재한다.
더 바람직한 구체예에서, 수용성 폴리머는 관심의 키모카인의 C-말단 영역에 위치한 글리코실화 부위에서 부착된다. 폴리머 부착을 위한 바람직한 글리코실화 부위는 키모카인의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단의 것이다. 예를 들어, 합성 키모카인이 MCP-1인 경우, 수용성 폴리머는 바람직하게는 야생 MCP-1의 위치 T71 잔기에 대응하는 글리코실화 부위에 결합될 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 생물활성 합성 키모카인은 그것의 C-말단 α-헬릭스의 C-말단인 C-말단 글리코실화 부위에 부착된 수용성 폴리머를 가지는 것을 포함한다.
d. GAG 결합 부위
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 그것의 GAG 결합 부위에 결합된 수용성 폴리머를 갖는 생물활성 합성 키모카인을 제공한다. "GAG 결합 부위"에 의하여는 GAG 결합을 코딩하는 잔기; 전형적으로 단백질의 표면에서 포지티브 하전 덩어리를 형성하는 리신과 아르기닌, 때때로 히스티딘 같은 일차나 이차 아민을 갖는 잔기를 의도한다. 키모카인은 천연적으로 상피세포 표면과 세포외 간질에 존재하는 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 더마탄 술페이트를 포함하는 GAG에 결합하는 것으로 알려져 있다 (예를 들어, Wells et al., Inflamm. Res. (1999) 48: 353-3362; Lalani et al., J. Virol. (1997) 71: 4356-4363; Rot, A., Eur J Immunol (1993) 23: 303-306; Witt et al., Curr Biol (1994) 4: 394-400; Hoogewerf et al., Biochem (1997) 36: 13570-13578; Marquezini et al.,Cardiology (1995) 86: 143146; Wasty et al., Diabetologia (1993) 36: 316-322 참조). Kuschert et al. (Biochem. (1999) 38: 12959-12968), Koppman et al. (J. Immunol. (1999) 163: 2120-2127) 및 Proudfoot et al. (J Biol. Chem. (2001) 276 (14): 10620-10626) 는 GAG 결합과 키모카인에 대하여 보고한다.
기능에 본질적인 것은 아니지만, 키모카인의 GAG-결합 능력은 수용체 상호작용 및 간질 단백질과 세포 표면에 걸친 수용체-연관 세포의 헵토택틱 이동을 변형시키는 것으로 보고된다 (예를 들어, Rot, A., Eur J Immunol (1993) 23: 303-306; Witt et al., Curr Biol (1994) 4: 394-400; Hoogewerf et al., Biochem (1997) 36: 13570-13578; Marquezini et al., Cardiology (1995) 86: 143-146; Wasty et al., Diabetologia (1993) 36: 316-322; Kuschert et al., Methods Enzymol. (1997) 287: 369-378; Kuschert et al., Biochem. (1998) 37: 11193-11201; Kuschert et al., Biochem. (1999) 38 : 12959-12968 참조). 가용성 GAG 에 대한 키모카인의 결합은 대부분의 경우 키모카인의 그것의 수용체에 대한 결합을 방해한다(Kuschert et al., Biochem. (1999) 38: 12959-12968). 그러나, 키모카인과 GAG 사이의 상호작용은 몇몇 경우에 활성을 강화시키는 것으로 보고되었다(Wbb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 7158-7162 ; 및 Wagner et al., Arteriosclerosis (1989) 9: 21-32)). 그러므로, 그것의 GAG 결합 부위에 결합된 수용성 폴리머을 갖는 합성 키모카인은, GAG 결합을 감소시키거나 부착을 위한 선택 부위와 그것의 의도된 용도에 따라 특정 GAG의 결합을 변화시킴으로써, 생물학적 기능을 변형시키기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 구체예는, GAG 결합 부위에 결합된 수용성 폴리머을 갖고, 결합된 키모카인 수용체를 하향조절하는 시험관내 생물활성을 갖는 생물활성 합성 키모카인에 관한 것이다.
상기된 바와 같이, 모든 기지의 키모카인은, 비록 친화도는 다양하겠지만, 헤파린을 결합시킬 수 있고, 따라서 모두 GAG 부위를 가진다. 폴리머 변형을 위한 GAG 부위를 선택할 때, 다수의 상이한 기술이 이 목적에 적당할 수 있다. 예를 들어, BBXB와 BBBXXB 모티프는 키모카인을 포함하는 몇몇의 단백질에서 공통의 헤파린-결합 모티프인 것으로 나타났는데(예를 들어, Cardin et al., Arteriosclerosis (1989) 9: 21- 32; Hileman et al., Bioessays (1998) 20 (2): 156-167; 및 Proudfoot et al., J. Biol. Chez7Z. (2001) 276 (14): 10620-10626 참조), 상기 식 중 B는 염기성 잔기를 나타낸다. 그러나, GAG 결합 부위는 BBXB 나 BBBXXB 모티프에 제한되지 않는다. 예를 들어, Rantes(44RKNR47및55KKWVR59), SDF-1 (24KHLK27), MIP-lα (45KRSR48) 및 MIP-1 β (45KRSK48) 에서의 GAG 결합부위는 BBXB 모티프를 갖는 반면, IL-8(Lys20, Lys64, 및 Arg68), 및 MCP-1 (Lys59 와 Arg66)에서의 GAG 결합부위는 간헐적으로 분리되지만 단백질 표면에서 염기성 하전 덩어리를 형성한다. 그러므로, 이들 리간드의 염기성 하전은 그것의 헤파린-결합 성질에 기여한다.
GAG 부위는 염기성 잔기(예를 들어, Lys, His 및 Arg)의 알라닌 검색, NMR, 및 GAG/헤파린 결합 검정에서 활성 화합물의 비교 뿐 아니라 이 목적으로 변형된 NMR 연구에 의하여 또한 동정가능하다 (예를 들어, Proudfoot et al., J Biol. Chem. (2001) 276 (14): 10620-10626; Trkola et al., J. Virol. (1999) 73 (8):6370-6379; Appay et al., J Biol. Chem. (1999) 274 (39) : 27505-27512; Hunter et al., Blood (1995) 86 (12): 4400-4408; Lord et al., Blood (1995) 85 (12): 3412-3415; Lord et al., Brit. J Cancer (1996) 74: 1017-1022 참조). 그리고, 상기된 바와 같이 다수의 키모카인의 GAG 결합 부위는 알려졌고, 후보 GAG 부위를 동정하는 기술 또한 주지이다(또한, Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001 참조). 그러므로, 키모카인의 GAG 결합 부위는 공개된 정보, 상동성 모델링, 스크리닝을 통하여, 또는 각각의 조합으로부터 동정될 수 있다. 게다가, GAG 결합에 관련된 잔기의 곁사슬의 적어도 하나는 분자의 표면상에, 그리고 N-말단 약물작용발생단 영역에서 먼곳에 위치할 것이고 이들 부위는 수용성 폴리머의 부착에 일반적으로 적합하다.
예로서, 야생형 Rantes는 적어도 두 가지의 주요 GAG 결합 부위를 갖는데, Lys44, Lys45, Arg47, Lys55, Lys56, 및 Arg59 (즉, K44, K45, R47, K55, K56, 및 R59)로부터 선택되는 Rantes의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. 그러므로, 합성 키모카인이 Rantes의 유사체이고 그것의 GAG 결합 부위에 수용성 폴리머가 부착된 경우, GAG 결합 부위는 K44, K45, R47, K55, K56, 및 R59로부터 선택되는 Rantes의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 수용성 폴리머는 K44, K45 및 R47로부터 선택되는 Rantes의 잔기에 대응하는 위치에서 부착되는데, 위치 K45가 바람직하다. 이 구체예에서, 위치 45 에서의 폴리머 부착은 합성 Rantes 키모카인 유사체의 CCR1 수용체에 대한 결합을 감소시키면서 CCR5에 대한 결합은 실질적으로 유지하는 이점을 갖는다.
다른 예로서, 합성 키모카인이 MIPlα의 유사체이고 그것의 GAG 결합부위에서 수용성 폴리머가 결합된 경우, GAG 결합 부위는 R17, R45, 및 R47로부터 선택되는 MIPlα의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. 유사하게, 합성 키모카인이 MIPlβ의 유사체이고 그것의 GAG 결합부위에서 수용성 폴리머가 결합된 경우, 그와 같은 응집 부위는 R18, R45, 및 R46으로부터 선택되는 MIPlβ의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. 이들 두가지 예에서, 바람직한 폴리머 부착 부위는 MIPlα의 R45와 MIPlβ의 R46이다. Rantes에서와 마찬가지로, 이들 변형은 CCR5에 대한 키모카인 유사체의 결합을 변화시키도록 고안된다.
또 다른 예에서, 합성 키모카인이 SDFl-α의 유사체이고 수용성 폴리머가 GAG 결합 부위에 부착되는 경우, GAG 결합 부위는 SDFl-α의 잔기 K24, H25 및 K27에 대응하는 아미노산을 포함한다. 여기에서도 역시, 실질적으로 동일한 결과를 얻기 위하여, N22, N30 또는 N33, 특히 N33 같은, 이들 위치에 인접한 잔기가 폴리머 부착에 사용될 수 있고, 따라서 GAG 결합 부위에서 부착된 수용성 폴리머를 갖는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인으로 구체화된다.
또 다른 예에서, 합성 키모카인이 IL-8의 유사체이고 수용성 폴리머가 GAG 결합 부위에 부착되는 경우, GAG 결합 부위는 K20, R60, K64, K67 및 R68로부터 선택되는 IL-8의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다. IL-8의 합성 유사체에 대한 폴리머 부착의 바람직한 부위는 그것의 위치 K64에 대응한다. 다른 예는 MCP-1이고, 합성 키모카인은 MCP-1의 유사체이고 수용성 폴리머가 GAG 결합 부위에 부착되는 경우, GAG 결합 부위는 K58 과 H66로부터 선택되는, 바람직하게는 K58인 MCP-1의 잔기에 대응하는 아미노산을 포함한다.
이해될 수 있는 바와 같이, GAG 결합 부위는 동정되기 쉽고 폴리머 변형에 대한 바람직한 부위이며, 소망의 생물활성에 대한 일상적 스크리닝을 통한 바람직한 부착을 선택할 수 있다. 이 목적에 적당한 생물검정은 주지이고 논문들에 풍부하게 기재되어 있다(Cytokine Reference, Vol. 1, Ligands, A compendium of cytokines and other mediators of host defense, Eds. J. J. Oppendheim 및 M. Feldmann, Acedemic Press, 2001).
2. 수용성 폴리머
바람직하게는, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인에 부착되는 본 발명의 폴리머 변형은 수용성 폴리머이다. 용어 "수용성 폴리머"는 여기에서 사용될 때, 물에 가용성인 실질적으로 비-항원성 폴리머 구성체를 나타내려는 의도이다. 생물활성 수용성 폴리머의 예는 (a) 덱스트란, 덱스트란 술페이트, 카르복시메틸 덱스트린; (b) 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 더마탄 술페이트 같은 글루코스아미노글리칸; (c) 하이알로로닌 및 하이알루론산; (d) 폴리락티드 및 올리고락틸-아크릴레이트; (e) 셀룰로스, 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스; (f) 콜라겐; (g) 겔라틴; (h) 아르지네이트; 및 (i) 녹말을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 수용성 폴리머는 선형, 분지, 또는 별 모양, 또는 그와 같은 입체구조의 혼합이고, 광범위한 분자량 및 폴리머 서브유니트를 갖을 수 있다. 이들 서브유니트는 생물학적 폴리머, 합성 폴리머, 또는 그것들의 조합일 수 있다.
이 같은 생물학적 수용성 폴리머의 다수의 유도체가 알려져 있고 여기에 구체화된다. 합성 수용성 폴리머의 예는 (a) 폴리에틸렌 글리콜, 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 및 그것의 유도체 같은 그것의 호모폴리머 및 공중합체로서, 그 같은 호모폴리머 및 공중합체는 한 쪽 말단에서 알킬기로 비치환되거나 치환된 것을 포함하는, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 에틸렌/말레익 안히드리드 공중합체 및 그것의 유도체를 포함하는 폴리머; (b) 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르; (c) 폴리비닐피롤리돈; (d) 프루로닉 폴리올을 포함하는 폴리옥시에틸레이트화 폴리올; (e) 폴리(글리콜산); 폴리 (L-젖산); 폴리 (D-젖산); 폴리 (DL-젖산); 락티드/글리콜리드 공중합체; 폴리-1,3,6-트리옥산; 폴리-1,3-디옥소란; 폴리 (p-디옥사논) 및 공중합체; 폴리카프로락톤; PEG-폴리에스테르 공중합체; 폴리 (포스페이트에스테르) 같은 폴리에스테르; (f) 폴리 (오르토에스테르) ; (g) 폴리안히드리드; (h) 슈도폴리 (아미노산) (호모폴리머 또는 무작위 공중합체); (i) 폴리글리세롤; (j) 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스; 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기된 바와 같은 수용성 폴리머는 주지이고, 다양한 부착 화학, 결합 시스템 및 생안정성, 생분해성으로서의 구조 뿐 아니라 펩티드에 대한 결합, 폴리펩티드 및 다른 화합물에 대한 결합을 위한 프로드러그 구성체와 함께 채용되었다. (예를 들어, 국제특허출원: WO 90/13540, WO 92/00748, WO 92/16555, WO 94/04193, WO94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28937, WO 95/11924, WO 96/00080, WO 96/23794, WO 98/07713, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/30727, WO 99/32134, WO 99/33483, WO 99/53951, WO 01/26692, WO 95/13312, WO 96/21469, WO 97/03106, WO 99/45964, 미국 특허번호 4,179,337; 5,075,046; 5,089,261; 5,100,992; 5,134,192; 5,166,309; 5,171,264; 5,213,891; 5, 219,564; 5,275,838; 5,281,698; 5,298,643; 5,312,808; 5,321,095; 5,324,844; 5,349,001 ; 5,352,756; 5,405,877; 5,455027; 5,446,090; 5,470,829; 5,478,805; 5,567,422; 5,605,976; 5,612,460; 5,614549; 5,618,528; 5,672,662; 5,637,749; 5,643,575; 5,650,388; 5,681,567; 5,686,110; 5,730,990; 5,739,208; 5,756,593; 5,808,096; 5,824,778; 5,824,784; 5,840,900; 5,874,500; 5,880,131; 5,900,461; 5,902,588; 5, 919,442; 5,919,455; 5,932,462; 5,965,119; 5,965,566; 5,985,263; 5,990,237; 6,011,042; 6,013,283; 6,077,939; 6,113,906; 6,127355; 6,177,087; 6,180,095; 6,194,580; 6,214,966 참조). 적당한 폴리머에 대한 추가적 정보는 Turnbull, W. B. et al. (Calbiochem (2000), Toward the Synthesis of Large Oligosaccharide-Based Dendrimers,"1: 70-74), van Duijvenbode, R. C. et al. (Macromolecules (2000)"Synthesis and Protonation Behavior of Carboxylate-Functionalized Poly (propyleneimine) Dendrimers,"33: 4652), Marcaurelle, L. A. ("Recent Advances in the Synthesis of Mucin-Type Glycoproteins,"http ://www. chem. unt. edu/acs/pdf/marcaur. pdf), Domenek, S. ("The Human Genome Project: Challenge for Society and Chemistry," http ://www. orgc. tugraz. at/orgc/poegroup/chem ges/domenek.PDF), Imperiali, B. et al. ("Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure," Current Opinion in Chemical Biology 1999,3: 643-649), Rudd, P. M. et al. ("Glycosylation and the Immune System,"Science (2000) 291: 2370-2376), Van den Steen, P. et al. ("Concepts and Principles of O-Linked Glycosylation,"Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 33 (3): 151-208 (1998)), Knischka, R. et al. ("Star-Shaped Polymers Based On Polyglycerol Cores: Synthesis, Characterization And Crosslinking,"http ://www-ics. ustrasbg. fr/-equipe3/Postcr4. pdf). Rudd, P. M. et al. ("Roles for Glycosylation of Cell Surface Receptors Involved in Cellular Immune Recognition, J. Mol. Biol. (1999) 293,351-366), 및 Davis, B. G. ("Recent developments in glycoconjugates,"J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1999, (22), 3215-3237)에 의하여 제공된다.
본 발명의 수용성 폴리머는 바람직하게 10,000 달톤 ("Da"), 더 바람직하게는 약 20,000 내지 500,000 Da, 가장 바람직하게는 약 40,000 내지 300,000 Da의 효과적인 유체역학적 분자량을 갖을 것이다. "효과적 유체역학적 분자량"에 의하여는 수성-기초 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의하여 측정할 때 폴리머 사슬의 효과적인 수용 크기를 의도한다. 수용성 폴리머가 에틸렌 옥시드 반복단위를 갖는 폴리머를 함유하는 경우, 각 사슬은 원자 분자량 약 200 내지 약 80,000 Da 및 바람직하게는 약 1,500 내지 약 42,000 Da, 가장 바람직하게는 2,000 내지 약 20,000 Da을 갖는다. 구체적으로 지시하지 않는다면, 분자량은 원자 분자량을 지칭한다.
이 같은 수용성 폴리머는 생안정성 또는 생분해성 폴리머 사슬을 포함한다. 예를 들어, 반복 결합을 갖는 폴리머는 결합불안정성에 따라서 생리학적 조건에서 다양한 정도의 안정도를 갖는다. 이 같은 결합을 갖는 폴리머는 작은 분자량 유사체의 기지의 가수분해 속도에 기초한 생리학적 조건하에서의 그것의 상대적 가수분해 속도에 의하여 분류될 수 있는데, 예를 들어 덜 안정한 것부터 더 안정한 것 순서로 폴리카르보네이트(-O-C(O)-O-) > 폴리에틸렌 (-C(O)-O-) > 폴리우레탄 (-NH-C(O)-O-) > 폴리오르토에스테르 (-OC((OR)(R'))-O-) > 폴리아미드 (-C(O)-NH-)로 분류될 수 있다. 유사하게, 수용성 폴리머를 표적 분자에 부착시키는 결합 시스템은 생안정성 또는 생분해성일 수 있고, 예를 들어 덜 안정한 것 부터 더 안정한 순서로 카르보네이트 (-O-C(O)-O-) > 에스테르 (-C(O)-O-) > 우레탄 (-NH-C(O)-O-) > 오르토에스테르 (-O-C((OR)(R'))-O-) > 아미드 (-C(O)-NH-)이다. 이들 결합은 예로서 제공된 것이고, 폴리머 사슬 또는 본 발명의 수용성 폴리머의 결합 시스템에서 채용될 수 있는 결합의 유형을 제한하려는 의도는 아니다. 상기된 바와 같이, 본 발명의 합성 단백질의 생물활성은 부착된 수용성 폴리머의 형태를 바꿈으로써 변형될 수 있다.
이 목적을 위한 바람직한 수용성 폴리머는 식:
U-B-폴리머-J
를 갖는데, 식 중 U는 표적 분자에 부착할 수 있거나 부착한 관능기의 잔기이고, B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 세 개 이상의 팔을 가진 분지 코어이고, 폴리머는 1000 Da 이상의 분자량을 같는 실질적으로 비항원성 수용성 폴리머이고, J는 생리학적 조건에서 음성, 중성 또는 양성으로부터 선택되는 순 전하를 갖는 펜단트기가다. 이 같은 폴리머는, 여기에 그 전체가 수록된 미국 특허출원 번호 60/236,377에 기재된 것을 포함한다.
성분 U, B, 폴리머 및 J는 하나 이상의 스페이서나 링커 부분에 의하여 수용성 폴리머의 다른 기로부터 분리될 수 있다. 그러므로, 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J는 다음 식:
U-s1-B-s2-Polymer-s3-J
으로서 나타낼 수 있고, 식 중 s1, s2및 s3은 동일하거나 상이할 수 있고, 개별적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 스페이서 또는 링커 부분이다. 바람직한 스페이서나 링커는 수용성 폴리머, 디아미노 및/또는 디에시드 단위, 천연 또는 비천연 아미노산 또는 그것의 유도체 뿐 아니라, 바람직하게는 18 개까지의 탄소 원자 또는 추가적 폴리머 사슬을 포함하는 알킬, 아릴, 체테로알킬, 헤테로아릴, 알콕시 등을 포함하는 지방족 부분에서 채용되는 하나 이상의 반복 단위를 포함하는 선형 또는 분지 부분을 포함한다.
상기된 바와 같이, 성분 U는 펩티드나 폴리펩티드 같은 표적 분자에 부착될 수 있거나 부착되는 관능기의 부분이다. U가 표적 분자에 대한 접합을 위한 관능기의 잔기인 경우, 각각 U는 친핵기 또는 친전자기를 포함하고 표적 분자는 상호 반응성 친전자기 또는 친핵기를 포함한다.
상기 폴리머는 식: 단백질-W 을 포함하는 수용성 폴리머-변형 단백질을 생산하는데 사용될 수 있고, 식 중 W는 식:-sO-U-sl-B-s2-폴리머-s3-J의 수용성 폴리머기이며, 식 중 U는 직접 또는 s0을 통하여 단백질에서 단백질에 부착된 관능기의 잔기이고, B는 3 개 이상의 팔을 갖는 분지코어이고 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 폴리머는 1000 Da 이상의 분자량을 같는 실질적으로 비항원성 수용성 폴리머이고, J는 생리학적 조건에서 음성, 중성 또는 양성으로부터 선택되는 순 전하를 갖는 펜단트기이고, 식 중 s1, s2 및 s3은 동일하거나 상이할 수 있고, 개별적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 스페이서 또는 링커 부분이다.
많은 이 같은 상호 반응성 관능기가 알려져 있고 펩티드와 폴리펩티드에 대한 공통의 곁사슬 관능기 또는 유도화 곁사슬 관능기에 대하여 부착할 수 있다 (Zalipslcy et al., Bioconjugate Chemistry (1995) 6: 150-165;"Perspectives in Bioconjugate Chemistry", C. F. Meares, Ed., ACS, 1993 ;"Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", S. S. Wong, Ed., CRC Press, Inc. (1993)). 관능기의 예는 (a) p-니트로페닐 같은 카르보네이트, 또는 숙신이미딜; (b) 카르보닐 이미다졸 ; (c) 아즈락톤 ; (d) 시클릭 이미드 티온; 및 (e) 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 같은, 아미노기와 반응할 수 있는 기를 포함한다. 카르복실산기 및 반응성 카르보닐기와 반응할 수 있는 관능기의 예는 (a) 1차 아민; 또는 (b) 아실 히드라지드, 카르바제이트, 세미카르바메이트, 티오카르바제이트, 아미노옥시 등과 같은 히드라진과 히드라지드 관능기를 포함한다. 메르캅토 또는 술프히드릴 기와 반응할 수 있는 관능기는 페닐 글리옥살, 말레이미드, 및 할로겐을 포함한다. (카르복실) 산과 같은 히드록실기와 반응할 수 있는 관능기, 또는 친전자 중심과반응할 수 있는 다른 친핵기는 히드록실, 아미노, 카르복실, 티오기, 활성 메틸렌 등을 포함한다.
예를 들어, 수용성 폴리머는 표적 분자에 부착하기 위한 관능기로서 성분 U를 운반하도록 제조될 수 있는데, 관능기는 아크릴레이트, 알데히드, 케톤, 아미노옥시, 아민, 카르복실산, 에스테르, 티오에스테르, 할로겐, 티올, 시아노아세테이트, 디칼미토일 포스파티일에탄올 아민, 디스테고일 포스파티딜에탄올아민, 에폭시드, 히드라지드, 아지드, 이소시아네이트, 말레이미드, 메타크릴레이트, 니트로페닐 카르보네이트, 오르토피리딜 디술파이드, 실란, 술프히드릴, 비닐 술폰, 숙신이미딜 글루타레이트, 숙시미딜 숙시네이트, 숙신산, 트레실레이트 등이다. U는 또한 아민 같은 친핵기와 반응할 수 있는 그것의 활성 에스테르로 전환될 수 있는 카르복실산 같은, 활성가능한 형태로 제공될 수 있다.
바람직한 구체예에서, U는 표적 분자 상의 유일한 관능기와 선택적으로 반응성인 유일한 관능기의 잔기이다. 본 발명의 이 양태는 펩티드 합성(보호기 전략), 및 화학적 라이게이션(부분적 또는 비보호기 전략)의 원리를 구체화한다. 보호기 전략에 대하여는, U에 대한 것을 제외한 모든 잠재적으로 반응성인 관능기와 표적 분자상에 존재하는 그것의 상호 반응성 관능기가 적당한 보호기로 차단된다. 다수의 보호기가 알려져 있고 이 목적에 적당하다 (예를 들어, "Protecting Groups in Organic Synthesis", 3rd Edition, T. W. Greene 및 P. G. M. Wuts, Eds., John Wiley & Sons, Inc., 1999; NovaBiochem Catalog 2000;"Synthetic Peptides, A User's Guide,"G. A. Grant, Ed., W. H. Freeman & Company, New York, NY,1992;"Advanced Chemtech Handbook of Combinatorial & Solid Phase Organic Chemistry,"W. D.. Bennet, J. W. Christensen, L. K. Hamaker, M. L. Peterson, M. R. Rhodes, 및 H. H. Saneii, Eds., Advanced Chemtech, 1998;"Principles of Peptide Synthesis, 2nd ed.,"M. Bodanszky, Ed., Springer-Verlag, 1993;"The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed.,"M. Bodanszlcy 및 A. Bodanszky, Eds., Springer-Verlag, 1994 ; 및 "Protecting Groups,"P. J. Kocienski, Ed., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1994 참조).
그러므로, U는 상기 기술한 것과 같은 다양한 범위의 관능기의 잔기를 나타낼 수 있다. 부분적 또는 비보호기 전략에 대하여는, U와 표적 분자 상의 그것의 상호 반응성 관능기는, 다른 관능기가 반응계에 존재하지만 비반응성일 수 있는 화학선택 반응짝을 채용한다. 이것은 아민 포획 전략(예를 들어, 헤미아민성 형성, 이민 형성, 및 Michael 첨가에 의한 라이게이션), 티올 포획 전략(예를 들어, 메르캅티드 형성, 디술파이드 교환에 의한 라이게이션), 천연 화학적 라이게이션 전략(예를 들어, 시스테인이나 티올 함유 곁사슬 아미노산 유도체가 관련된 티오에스테르 교환에 의한 라이게이션), 및 직교 라이게이션 커플링 전략(예를 들어, 티아졸리딘 형성, 티오에스테르 교환, 티오에스테르 형성, 디술파이드 교환 및 아미드 형성에 의한 라이게이션)과 조화되는 U 기를 포함한다 (예를 들어, Coltart, DM., Tetrahedron (2000) 56: 3449-3491 참조).
바람직한 U는 천연 화학 라이게이션(Dawson, et al., Science (1994) 266: 776-779; Kent, et al., WO 96/34878), 확장 일반 화학적 라이게이션 (Kent, etal., WO 98/28434), 옥심-형성 화학적 라이게이션 (Rose, et al., J. Amer. Chem. Soc. (1994) 116: 30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer, et al., Science (1992) 256: 221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen, et al., Tet. Letts. (1995) 36 (48): 8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 및 옥사졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189 ; Tam, et al., WO 95/00846) 같은 수성 조화성 라이게이션 화학에서, 또는 다른 방법에 의하여 (여기에 참고문헌으로써 수록되는 Yan, L. Z. and Dawson, P. E.,"Synthesis of Peptides and Proteins without Cysteine Residues by Native Chemical Ligation Combined with Desulfurization,"J Anz. Chem. Soc. 2001,123,526-533; Gieselnan et al., Org. Lett. 2001 3 (9): 1331-1334; Saxon, E. et al.,"Traceless"Staudinger Ligation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds. Org. Lett. 2000,2,2141-2143) 채용되는 고유한 관능기의 잔기를 포함한다.
다양한 부착 화학이 상기된 바와 같으므로, U가 표적 분자에 접합된 관능기의 잔기일 때, U는 카르보네이트, 에스테르, 우레탄, 오르토에스테르, 아미드, 아민, 옥심, 이미드, 요소, 티오요소, 티오에스테르, 티오우레탄, 티오에스테르, 에테르, 타이졸리딘, 히드라존, 옥사졸리딘 등으로부터 선택되는 결합의 잔기를 포함할 수 있다. 바람직한 결합은 옥심과 아미드 결합이다.
상기된 바와 같이, B는 세 개 이상의 팔을 갖는 분지 코어 부분이고, 존재하거나 부존재할 수 있다. B가 존재할 때, 한 팔은 U 또는 U에 부착된 스페이서나 링커에 연결되고, 각 다른 팔은 폴리머나 폴리머에 부착된 스페이서나 링커에 연결된다. 분지 코어 B의 예는 아미노, 아미드, 카르복실릭 및 그것의 카르보네이션을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들은 리신 및/또는 아르기닌의 올리고아미드, 또는 그것의 카르보네이션, 또는 후자가 분지 코어에 전체 양전하를 제공하는, 알칸 디아민과 아크릴 산으로부터 제조된 올리고머 ("폴리아미도아민")을 포함한다 (예를 들어, Zeng et al., J Pept. Sci. (1996) 2: 66-72; Rose et al., Bioconjugate Chem., (1996) 7 (5): 552-556; NovoBiochem Catalog and Peptide Synthesis Handbook, Laufelfingen, 2001 ; Wells et al., Biopolymers (1998) 47: 381-396 ; Mahajan et al., (1999) 40: 4909-49-12; Judson et al. (1998) 39: 1299-1302; Swali et al., (1997) 62: 4902-4903; 미국 특허번호 5,932,462, 5,919,455, 5,643,575, 5,681,567 참조). 치환 디아민, 치환 디에시드, 글리콜, 및 다가 알킬, 아릴, 헤티로알리실, 헤테로아릴, 및 알콕시 부분 등을 포함하는 세 개 이상의 관능 또는 활성기를 갖는 다른 부분 같은 알킬산, 및 올리고당을 포함하는, 다수의 상이한 분지 코어가 사용될 수 있고, 이 목적에 적당하다(예를 들어, Nierengarten et al., Tetrahedron Lett. (1999) 40: 5681-5684; Matthews et al., Prog. Polym. Sci. (1998) 1-56; Suner et al., Macromolecules (2000) 33: 253; Fischer et al., Angew. Chem. 17it. Ed. (1999) 38: 884; Sunder et al., Adv. Mater. (2000) 12: 235; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38 : 631-634 ; Mulders et al., Tetrahedron Lett. (1997) 38: 30-3088; 및 Turnbull et al.,Chembiocehm (2000) 1 (1) : 70-74).
바람직한 분지코어는 아미노, 카르복실릭 및 혼합 아미노 카르복실릭이다. 게다가, 바람직한 분지 폴리머 구성체는 올리고아미드나 폴리아미도아민 코어 같은 단일 분지 코어로부터 분지 방사된 것이다. 그러나, 폴리머 백본을 따라 분포된 다분지 코어의 서열로부터 분지 방사된 충-유사 구조 같은 다른 부류의 분지 구성체가 채용될 수 있다.(Schluter et al., Chem. Int. Ed. (2000) 39: 864). 폴리머 백본과 반복 단위의 화학적 조성 및/또는 부피가 큰 정도에 따라서, 결과의 충-유사 구조는, 송달 적용, 안정성 및 작용의 내구성에 유리하도록 수용성 또는 액정 구성 경향이 되도록 고안될 수 있다(Ouali et al., Macromolecules (2000) 33: 6185). 본 발명의 다른 분지 폴리머 구성체에서, 충-유사 구성체는 U 를 포함하는 부가 작용기를 함유하도록 제작된다.
식 U-B-폴리머-J의 수용성 폴리머의 성분 폴리머는 상기된 수용성 폴리머를 포함한다. 바람직한 폴리머 성분은 (a) 폴리에틸렌 글리콜, 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 및 그것의 유도체 같은 그것의 호모폴리머 및 공중합체로서, 그 같은 호모폴리머 및 공중합체는 한 쪽 말단에서 알킬기로 비치환되거나 치환된 것을 포함하는, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리에틸렌 옥사이드, 에틸렌/말레익 안히드리드 공중합체 및 그것의 유도체를 포함하는 폴리머; (b) 폴리비닐 알콜 및 폴리비닐 에틸 에테르; (c) 폴리비닐피롤리돈; (d) 프루로닉 폴리올을 포함하는 폴리옥시에틸레이트화 폴리올; (e) 폴리(글리콜산); 폴리 (L-젖산); 폴리 (D-젖산); 폴리 (DL-젖산);락티드/글리콜리드 공중합체; 폴리-1,3,6-트리옥산; 폴리-1,3-디옥소란; 폴리 (p-디옥사논) 및 공중합체; 폴리카프로락톤; PEG-폴리에스테르 공중합체; 폴리 (포스페이트에스테르) 같은 폴리에스테르; (f) 폴리 (오르토에스테르) ; (g) 폴리안히드리드; (h) 슈도폴리 (아미노산) (호모폴리머 또는 무작위 공중합체); (i) 폴리글리세롤 등으로부터 선택된다. 이들 중 바람직한 폴리머는 폴리알킬렌 옥시드, 특히 식 (CH2-CH2-0)n 또는 (O-CH2-CH2)n 의 폴리에틸렌 옥시드를 포함하는 폴리알킬렌 옥시드 및 그것의 호모폴리머 및 공중합체를 포함하는 그것의 유사체를 포함하는데, 식중 n은 2 이상이다 (예를 들어, "Poly (ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications", J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York, NY (1992) ; 및 "Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications", J. M. Harris 및 S. Zalipsky, Eds., ACS (1997) 참조).
더 바람직한 폴리머 성분은 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J 가 단계적 합성에 의하여 전체적으로 제조되는 경우이다. 이는 이 폴리머가 정확한 분자량과 정의된 구조를 갖을 것이라는 것을 의미한다. 반대로, 중합 방법인 일반적 폴리머 합성은 사슬이 상이한 길이이고 따라서, 분리하기 불가능하지는 않더라도 분리하기 어렵게 분자량과 크기가 분포하는 혼합물을 결과한다. 분자 순수성을 제어할 수 있는 능력은, 부착된 수성 폴리머를 갖고 단일분광되는 합성 단백질이 제작될 수 있다는 점에서 유리하다. 이형 화합물로부터 결과한 다양한 특성을 피할 수 있고, 비교적 쉽게 오직 가장 바람직한 특성을 가진 화합물만 제작하여 분리할 수 있다는 점에서 이것은 유의한 이점이다.
가장 바람직한 폴리머 성분은 WO 00/12587에 기재된 바와 같은 식 -[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n- 의 폴리아미드를 포함하는데, 식중 n은 1-100, 바람직하게는 2-100의 양의 정수이고, X 와 Y는 명확한 구조 결합된, 예를 들어 아미드 결합된 생물학적으로 조화되는 반복 요소이다. X 와 Y는 2가의 라디칼 등이다. X 와 Y는 동일하거나 다르고 분지 또는 선형이다. 고도로 바람직한 예에서 X 와 Y 중 적어도 하나는 수용성 폴리머 반복 단위를 포함한다.
X, Y에 대한 바람직한 수용성 반복 단위는 폴리알킬렌 옥시드, 폴리에틸렌 옥시드 및 그것의 호모폴리머와 공중합체를 포함하는 그것의 유사체를 포함하는데, 그같은 호모폴리머와 공중합체는 비치환 또는 치환, 선형 또는 분지이고, 예를 들어 프루로닉 폴리올 및 C1 내지 C18 지방족 인접기를 포함하는 폴리옥시에틸화 폴리올 같은, 알킬, 아릴, 아릴알킬기 등을 포함하는 인접기를 포함할 수 있다. 부차적 변형은 식 -[C(O)-X-NHC(O)-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-C(O)NH-X-C(O)]n 의 폴리아미드를 포함한다는 것이 이해될 것이다. X'와 Y'는 X와 Y의 하위체로서, X = X'-NH 또는 NH-X' 이고 Y=Y'-NH 또는 NH-Y'이다. X'와 Y'에 대한 바람직한 수용성 반복 단위는 식 (-CH2-CH2-O-)n 또는 (O-CH2-CH2-)n의 폴리에틸렌 옥시드를 포함하는데, n은 2 내지 50, 3 내지 25, 3 내지 10, 더 바람직하게는 3 내지 5이다.
상기된 바와 같이, 성분 J는 생리학적 조건에서 중성, 양성 또는 음성으로부터 선택되는 순 전하를 갖는 임의의 기일 수 있다. 이는 치환 또는 비치환 알킬, 아릴, 아릴알킬, 아실 및 카르보닐기 뿐 아니라 그것의 염을 포함한다. 이같은 기는 아미노산, 핵산, 지방산, 탄수화물 및 그것의 유도체 및 키틴, 키토산, 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴, 콘드로이틴 술페이트, 더마탄 및 더마탄 술페이트, 시클로덱스트린, 덱스트린, 덱스트란, 하이알유로닉 산, 포스포리피드, 시알릭 산 등 같은 부분의 성분일 수 있다. J는 바람직하게는 카르복실, 아미노, 티올, 히드록실, 포스포릴, 구아니디늄, 이미다졸 및 그것의 염으로부터 선택되는 이온화 가능한 부분을 포함한다. 가장 바람직한 것은 J가 이온화가능한 카르복실화 부분을 포함하고 생리학적인 조건하에서 전체 음전하를 갖는 것이다.
본 발명에 따라, 폴리머 이형성, 다양성 및 비적합성의 문제에 대한 바람직한 해결책은, (정확한 길이의, 편의 합성) 폴리펩티드와 글리코실화-모방기("글리코-모방기", 단백질 분해 효소에 의한 공격을 받기 쉽지 않은, 유연하고, 양쪽 친매성, 비면역원성, 폴리머) 둘 모두의 장점을 조합한, 신규 부류의, 생물학적으로 조화되는 폴리머를 생산하는 것과 관련된다. Rose, K. et al. (여기에 참고문헌으로써 수록된 미국 특허번호 09/379,297).
이 같은 바람직한 폴리머의 바람직한 구체예 -[C(O)-X-NHC(O)-Y-NH]n- 또는 - [NH-Y-C(O)NH-X-C(O)]n에서, X와 Y는 반응성 관능기를 결여한 2가의 유기 라디칼이거나 없을 것이고 동일하거나 상이할 수 있고 각각 반복 단위 (n)을 갖고 독립적으로 변화할 수 있을 것이다. 바람직하게는, n=2일 때, X 또는 Y 중 적어도 하나는 치환, 비치환, 분지 및 선형 지방족 및 방향족기로 구성된 군으로부터 선택될 것이다. 더 바람직하게는, 2가 유기 라디칼은 페닐, Cl-Cl0알킬렌 부분, Cl-Cl0알킬기,헤테로원자-함유 페닐, 헤테로원자-함유 Cl-Cl0알킬렌 부분, 헤테로원자-함유 Cl-Cl0알킬기, 및 그것의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 것이다.
특히 바람직한 글리코-모방 부분은 식:
-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-
식중 n은 바람직하게는 1-100, 더 바람직하게는 2-100에 의하여 나타낼 수 있거나, 식;
- {CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-
식 중 n은 1-50, 더 바람직하게는 2-50에서 변화할 수 있는 것을 특징으로 하는 식에 의하여 나타낼 수 있다. 특히 바람직한 글리코-모방기는 n=12를 갖고, X는 -(CH2)2- 이고, Y는:
-(CH2)3O (CH2)20(CH2)20(CH2)3-
이다.
본 발명의 글리코 모방 부분은 다양한 방법 중 어떤 것에 의하여도 합성될 수 있다. 그러나, 이 같은 부분은 중합 방법보다는 단위체의 고체상 단계 연쇄를 사용하여 바람직하게 제조된다. 이같은 조합 과정의 사용은 제조된 부분이, 그 길이, X 및 Y 치환체의 형태, (만약 있는 경우) 분지 위치, X 및 Y 치환체, 및 어떤 분지의 위치에 있어서 정의되고 균질의 구조를 갖도록 한다. 바람직하게는, 이 같은 부분은 다음 단계:
(a) 식 HOOC-X-COOH 를 갖는 디에시드의 유도체 몰 과량으로, 식 Z-Q-지지체 의 화합물의 아미노산 또는 히드록실기를 아실레이션시키는 단계로서, 식 중 Z는 H2N- 또는 HO- 이고; Q는 링커나 표적 분자이고; 지지체는 고체상, 기질 또는 표면인 것을 특징으로 하는 아실레이션 단계;
(b) 단계 (a)의 산물의 자유 카르복실기를 활성화시키는 단계;
(c) 단계 (b)의 산물을 과량 몰농도의 식 NH2-Y-NH2를 갖는 디아민으로 아미노 용해시키는 단계; 및
(d) 선택적으로 HOOC-X-COOH 및 NH2-Y-NH2를 사용하여 단계 (a)- (c)를 반복하는 단계로서, X와 Y는 2가 유기 라디칼이거나 또는 존재하지 않고, 동일하거나 다르며, 각 상기 선택적 반복 단위에 따라 독립적으로 다양할 수 있고, 이전의 어떤 아실레이션과 아미노 용해 단계에서 사용된 X와 Y 치환체와 동일하거나 상이한 것을 특징으로 하는 반복 단계에 의하여 합성될 것이다.
바람직한 구체예에서 상기 반복 단위의 6-량체, 12-량체, 18-량체, 및 32-량체가 채용된다. 바람직한 경우, 반복 단위는 (예를 들어, 리신의 아미노기와 인접하여) 분지 글리코-모방 구조를 형성하는데 사용될 수 있다. 글리코-모방기는, 티오에스테르, 옥심 및 아미드 결합 형성을 포함하는 다양한 화학에 의하여 본 발명의 합성 단백질에 부착될 수 있다.
한 구체예에서, 단위체의 고체상 단계 연쇄 결합은 다음:
단계 1: (PG가, 채용된 디에시드에 따라 존재 또는 부존재하는 보호기인 경우) 보호 또는 비보호된 디에시드를 결합 부위에서 수지상 아미노에 결합시켜 아미노 결합을 생성시킨다:
PG-OOC-X-COOH + NH2-Y-NH-수지
단계 2: 수지 상의 보호기 (PG)를, 만약 존재한다면, 제거한다
HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지
단계 3: PG가, 채용된 디에시드에 따라 존재 또는 부존재하는 보호기인 경우) 보호 또는 비보호 디아미노를 수지상의 카르복시에 결합시켜 결합 부위에 아미노 결합을 생성시킨다
PG-NH-Y-NH + HOOC-X-CO-NH-Y-NH-수지
단계 4: 수지 상의 보호기 (PG)를, 만약 존재한다면, 제거한다
-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-수지
Step 5: 단계 1-4를 'n' 번 반복하여 'n' 단위를 첨가시킨 후 수지로부터 절단한다
- [CO-X-CO-NH-Y-NH]- [CO-X-CO-NH-Y-NH]- [CO-X-CO-NH-Y-NH]- [CO-X-CO-NH-Y-NH]-
3. 본 발명의 수용성 폴리머의 합성
본 발명의 수용성 폴리머는 다양한 어떤 방법에 의하여도 합성될 수 있다. 도 lA-lE는 라이게이션 전이나 후, 또는 그 조합에 (여기에 정의된 바와 같은 U-B-폴리머-J*) 수용성 폴리머를 부분적으로 또는 전체적으로 보호된 펩티드 단편 () 에 부착하는 것을 포함하는 라이게이션 전략을 도시한다. 도 1A-1D에서, Yaa는, Yaa와 화학선택적 화학적 라이게이션을 할 수 있는 고유의 및 상호 활성 N-말단 아미노산 Xaa(예를 들어, 아미노 말단 시스테인) 부분을 함유하는 제 2의 펩티드 단편에 대한 화학적 라이게이션을 위한 고유의 화학선택적 부분(예를 들어, α-카르복실 티오에스테르를 함유하는 아미노산)을 함유하는 제 1의 펩티드 단편 상의 C-말단 아미노산을 나타낸다. Yaa와 Xaa사이의 화학선택적 반응은 그들 사이에서의 공유결합(예를 들어 아미노 결합)을 생성한다. 그러므로, Yaa와 Xaa는 화학선택성 라이게이션 짝짓기를 형성한다. Un- 은, 도에서 나타나는 바와 같이, 아미노산의 곁사슬 상의 정확한 유저-정의 부위에서 삽입되었고 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J*의 기 U-에 대하여 화학선택적이고 그것과 상호 반응성인, 제 2의 고유의 화학선택성 부분을 나타낸다. 예를 들어, Un이 케톤기를 함유하기 위하여 변형된 곁사슬일 때, 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J*의 기 U는 케톤과 반응하는데 화학선택적인 기, 예를 들어 그 사이에 옥심 결합을 생성하는 아미노옥시기이다. Un의 아래첨자 "n"은 아미노산의 수를 나타내고 그것의 곁사슬은 화학선택성 기 U를 함유하도록 고안되는데, 예를 들어, 두 가지 특이적 유저-정의 부위가 폴리머 변형 n=2이면, U2나 Un=2로 또한 나타낼 수 있다. 모든 경우에서, n는 고안에 의하여 정확하게 제어되는 양의 정수이다. 그러므로, Un와 U 는, Yaa와 Xaa의 화학선택성 기와 조화할 수 있고 비반응성인, 제 2의 화학선택성 라이게이션 짝짓기를 나타낸다. 도1A와 1B는 두 가지 다른 잠재적 반응을 나타낸다. 제 1의 도시된 반응에서는, Un관능성을 함유하는 폴리펩티드 사슬이 제 2의 폴리펩티드에 라이게이션되었고, 그 후에 폴리머-변형 폴리펩티드를 얻기 위하여 U-B-폴리머-J* 부분과 반응시킨다. 제 2의 도시된 반응에서는, Un관능성을 함유하는 폴리펩티드 사슬이 폴리머-변형 폴리펩티드를 얻기 위하여 U-B-폴리머-J* 부분과 반응하였고, 그 후에 제 2의 폴리펩티드에 라이게이션된다. 도 1A에서는 Xaa잔기를 함유하는 폴리펩티드가 폴리머 변형을 받기 위한 것인 한편, 도 2B에서는 Yaa잔기를 함유하는 폴리펩티드가 폴리머 변형을 받는다는 점에서 두 도면은 상이하다. 도 1C는, 큰 폴리펩티드를 형성하기 위한 라이게이션 전후의 다중 폴리펩티드 사슬을 변화시키기 위한 본 발명의 능력을 도시한다. 도 1D에서, PG'는 직교 보호기를 나타내는 경우, PG 와 PG'는 보호기를 나타내는데, 즉 PG 와 PG'는 상이한 조건에서 제거가능하고, 상이한 수용성 폴리머가 동일한 화학에 의하여 Un에 부착될 때, 또는 Un기가 폴리머로 변형시키고 싶지 않은 곁사슬 (예를 들어, 수용성 폴리머의 U기가 1차 아미노 또는 곁사슬 티올과 배타적으로 반응하도록 고안되는 경우에 반응성 -NH2또는 -SH기를 함유하는 곁사슬) 관능기를 나타낼 때 유용하다. 도 1D는 본 발명의 방법에 따라 라이게이션된 폴리펩티드의 소망의 곁사슬을 보호하기 위하여 보호기가 채용될 수 있음을 나타낸다.
도 1E는 도 1A-1D에 따라서 라이게이션과 폴리머 변형에서 채용되는 펩티드단편에서 존재하거나 부재할 수 있는 기의 다양성을 설명한다.
도 2A-2C는 본 발명의 합성 생물활성 단백질을 제조하기 위한 방법의 추가적 전략을 도시한다. 특히, 도 2A-2B는 라이게이션 부위에서의 아미노 말단기 Xaa의 곁사슬(예를 들어, 시스테인의 티올 곁사슬)에 대한 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J* 의 부착이 관련된 라이게이션 전략을 도시한다. 도 2C는 도 2A-2B에 따르는 라이게이션과 폴리머 변형에서 채용되는 펩티드 단편에서 존재하거나 부재할 수 있는 기의 다양성을 설명한다.
도 3A-3B는 3 개 이상의 비중복 펩티드 단편의 화학적 라이게이션, 즉, 적어도 한 개의 단편은 최종 전장 라이게이션 산물의 중간 단편이 되는 경우가 관련되는 다-단편 라이게이션을 성취하기 위한 방법의 추가적 전략을 도시한다. 이 방법으로 제조된 펩티드는 다른 라이게이션 반응, 예를 들어 도 lA-lE, 도 2A-2C, 및 도 4A-4C에 관련된 펩티드 단편을 제조하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 다단편 라이게이션에 대하여, 채용된 라이게이션 화학에 따라 펩티드의 고리화 또는 연쇄체 형성을 피하기 위하여, 중간 단편은 보호된 Xaa 기 또는 보호된 Yaa 기를 갖는다. 순차적 또는 일련의 라이게이션을 위하여, 중간 단편의 Xaa 기 (예를 들어 Cys (Acm))는 보호되는 반면 Yaa 기는 보호되지 않을 (예를 들어, Yaa-COSR, 식중 COSR은 α-카르복실 티오에스테르) 수 있다. 여기에서 Yaa 기는, 제 2의 펩티드가 자유 Yaa기가 없는 경우 비보호 Xaa기를 함유하는 제 2의 펩티드와 반응하기 자유롭다. 라이게이션 후, 보호기는 제거되어 다음 라이게이션 반응을 위하여 Xaa기를 재생성한다. 필요한 만큼 이 과정은 연속됨으로써 연장된 폴리펩티드 사슬을 생성할 수있다. Yaa 기의 보호는 4 개 이상의 단편으로 구성된 최종 라이게이션 산물의 생산과 관련된 수렴성 화학적 라이게이션에 특히 유용하다. 예를 들어, 4-단편 라이게이션(즉, 3 개의 라이게이션 반응)으로부터 생성되는 단백질 표적에 대하여, 단백질의 한쪽 말단에 대응하는 두 단편과 단백질의 다른쪽 말단에 대응하는 두 단편은, 순차적으로가 아니고, 동시에 따로 라이게이션되고 두 말단이 최종 라이게이션 반응에서 연결될 수 있다. 이 같은 수렴성 화학적 라이게이션 전략은 티오에스테르-매개 화학적 라이게이션 반응(예를 들어 천연 및 확장 천연 화학적 라이게이션)에 대하여 참고문헌으로써 수록된 미국 특허 출원 번호 60/231,339에 기재된다. 여기에서도 역시 이같은 펩티드 단편에서 존재 또는 부재하는 기의 다양성이 도 1E, 2C 및 4C에 설명된다.
도 4A-4C는 본 발명의 원리에 따라서 어떻게 결과의 곁사슬 티올의 천연 화학 라이게이션 및 화학적 변형이 달성될 수 있는지 설명한다. 특히, 도 4A-4B는 티오에테르를 포함하는 티오알킬레이션과 화학적으로 변형된 (ψ로 표시되는) 곁사슬을 통하여 (ψXaa로 표시되는) "슈도 아미노산"을 형성하기 위한, 라이게이션 부위에서의, 결과의 시스테인 곁사슬 티올의 천연 화학 라이게이션과 화학적 변형의 사용을 도시한다. 도시되지 않은 대안적 구체예에서는, 곁사슬 티올은 디술프화 반응에서 알라닌으로 전환될 수 있다 (Liang et al, J. Amer. Chem. Soc. (2001) 123 (4): 526-533). 두 반응에 대한 유의한 양태는, 카르복시 말단 Yaa기를 함유하는 단편이 보호된 아미노 말단 Xaa기를 포함할 때, 즉, 도 4B에서 제공되는 예로서 PG-Xaa-펩티드, 바꾸거나 변형하고 싶지 않은 어떤 다른 곁사슬 티올은 적당한 보호기(PG) 또는 다단편 라이게이션 및 직교 보호기(PG')로 보호된다는 것이다. 도 4C는 도 4A-4B 뿐 아니라 도 lA-lE, 도 2A-2C, 및 도 3A-3B에 따르는 라이게이션과 폴리머 변형에서 채용되는 펩티드 단편에서 존재 또는 부재하는 기의 다양성을 설명한다.
도 5A-5B 는 본 발명의 수용성 폴리머 U-B-폴리머-J*의 분지 코어 (B)와 고유의 화학선택적 관능기 (U)를 제조하기 위한 고체상 방법을 도시한다. 이 방법은 나타난 바와 같이 고체상 접근법이 바람직하지만, 용액에서도 수행될 수 있다. 특히, 도 5A는 반응성기()를 갖는 직교 보호되는 U-B 전구체 부분을 나타내고, 이같은 구조체의 기초적 기하학적 구조가 결합으로 연결된 도트()에 의하여 도시되는데; 이 기초적 기하학적 구조는 채용되는 화학적 결합 또는 기의 유형을 제한하려고 의도되는 것은 아니고, 단지 본 발명의 U-B 부분의 생성에 적당한 조립 구조와 화학적 세밀 점의 기하학적인 상대적인 점의 도시일 뿐이다. 직교 보호 U-B 전구체는, U-B 전구체:
에 공유결합 가능한 활성화에 따른, 적당한 절단가능 링커와 공-반응성 기()를 포함하는 폴리머 지지체/수지에 결합된다.
이 시스템은 폴리머-지지되는 유기 화학의 원리를 채용한다. 결합 후, 분지코어는 (오직 제 1의 분지점만 나타냈고, 추가적 분지점은 존재 또는 부재할 수 있는) 설명한 바와 같이 화합되어, 실질적으로 비-항원성, 수용성 선형 폴리머 같은소망의 폴리머 성분의 뒤이은 부착에 적당한 분지점을 생성한다. 직교 보호되는 U-B 전구체의 부분으로서 합성의 시작에서 제공되거나 분지 코어 B의 화합 동안 또는 후에 화합될 수 있는 U 기가 또한 나타난다. 폴리머 성분의 부착은 수지 상에서, 즉 절단 전에 달성될 수 있는 한편, 바람직한 경로는 폴리머 성분의 뒤이은 부착을 위하여 정제될 수 있는 U-B 코어를 생성하도록 폴리머 지지체/수지로부터 U-B 부분을 절단하는 것이다. 설명된 바와 같이, 코어기 B의 부가 분지점은 동일하거나 상이할 수 있는 관능기 (Func)를 포함하도록 구성되고, 가역적으로 보호되거나 (PG, PG' 또는 PG") 비보호된다. 각 경우에서, 폴리머 성분의 부착 최종 단계는 부가 분지점에서의 관능기(Func)의 형성 및 기 U의 형성이 관련된다 (도 7 참조). 도 5B는, 절단후 소망의 보호 또는 비보호 U-기를 형성하는 링커를 함유하는 폴리머 지지체와 조합하여, 보호되는 U-B 전구체가 채용되는 대안적 방법을 도시한다. 도 5B는 또한 사전-조립된 분지 코어 B의 폴리머 지지체에 대한 부착, 및 뒤이은 폴리머 성분의 부착을 위한 U-B 부분을 제작하기 위한 성분을 형성하는 U-기의 사용을 도시한다.
도 6A-6D 는 U-B 코어에 뒤이은 부착을 위한 본 발명의 바람직한 실질적으로 비항원성, 수용성 폴리아미드 폴리머-J* 성분을 형성하기 위한 고체상 과정을 도시한다. 고체상 과정은 바람직한 과정으로 설명되지만, 동일한 최종 결과를 얻기 위하여 용액상 과정이 적용될 수 있다. 도 6A와 6B에서, 디에시드와 디아민 단위체는 고체상 유기 화학을 사용하여 결합된다. 선택적으로, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위체가, 식 -[NH-Y-NHCO-X-CO]-의 폴리아미드 구조를 갖는 최종 절단 산물의 기 X 와 Y 추가적 다양성을 위하여 삽입될 수 있다. 도 6A는 N- 에서 C- 말단 방향으로의 합성을 도시하는 한편, 도 6B는 C-에서 N- 말단 방향으로의 합성을 도시한다. 도 6C와 6D에서, 보호된 아미노-X'-산 및/또는 아미노-Y'-산 단위체는 고체상 유기 화학의 원리를 사용하여 결합된다. 도 6C는 N- 에서 C- 말단 방향으로의 합성을 도시하는 한편, 도 6D는 C-에서 N- 말단 방향으로의 합성을 도시한다. 도 6C와 6D에서 명백한 바와 같이, 최종 폴리아미드 산물의 형태는 정교하게 제어될 수 있고, 이는 합성을 위하여 수행될 주기의 수에 의존한다. 게다가, 펜단트기 J* 는 실질적으로 어떤 유저-정의 특이성에 대하여 제작될 수 있다. 단일-분산 반복 단위 X, Y, X' 및 Y'가 채용될 때, 최종 폴리아미드 산물의 정확한 분자 구조가 정확하게 제어될 수 있다.
U-B 성분을 폴리-J*에 결합시켜 식 U-B-폴리머-J*의 본 발명의 바람직한 합성 폴리머 구성체를 위한 바람직한 방법은 도 7에 도시된다. 설명된 바와 같이, 다양한 보호기가 제공될 수 있고, 주어진 구성체의 의도된 최종 사용에 선택적으로 의존 한다. 고체상 접근법 및 용액상 접근법을 포함하는, 소망의 U-B-폴리머-J* 구성체를 제작하기 위한 다양한 경로가 또한 설명된다.
도 8은 본 발명의 생물활성 합성 단백질의 라이게이션 및 제작에 채용할 수 있는 펩티드 단편을 수용성 폴리머에 정확하게 부착하기 위한 대안적 경로를 도시한다. 제 1 단계는, 폴리머 부착을 위하여 표적화되는 아미노산 곁사슬이 직교 보호기로 보호되는 고체상 펩티드 합성 ("SPPS") (예를 들어, Fmoc 또는 Boc SPPS)을 채용한다 (예를 들어, Fmoc SPPS를 사용할 경우, Boc기가 폴리머 부착 부위를 보호하기 위하여 사용될 수 있거나, 또는 Boc SPPS를 사용할 경우, Fmoc 기가 직교 보호기로서 채용될 수 있다). 펩티드 합성에 이어서, 직교 보호기는 선택적으로 제거되는 한편, 나머지 펩티드는 보호되어 남는다. 이것은 다음 단계-고체상 폴리머 합성을 위한 단일 부착 부위를 가져온다. 일단 직교 보호기가 제거된 다음, 폴리머 사슬은 전구체로서 부착된다. 더 바람직하게는, 폴리머 사슬은 도 6A-6D에 도시된 과정을 사용한, 이어지는 주기의 폴리머 합성을 통하여 제작된다. 단일 폴리머 부착 부위가 나타났으나, 하나 이상이 제공될 수 있다.
4. 전구체 키모카인
제 3의 성분은, 결합하는 키모카인 수용체의 하향조절을 특징으로 하는, 시험관내 생물활성을 선택적으로 갖는 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인의 형성과 관련된다. 이것은 효능이, (효능은 적당한 시험관내 세포-기초 분석에서의 EC50에 의하여 측정될 때) 폴리머 변형 생물활성 키모카인의 소망의 효능 범위보다 약 1 내지 5 배, 더 바람직하게는 약 5 내지 10 배 큰 전구체 키모카인(즉, 수용성 폴리머의 부착을 위하여 선택되는 표적 키모카인)의 선택과 관련된다.
예로서, 바이러스 감염의 저해에 대하여 소망의 ED50을 갖는 폴리머-변형 Rantes 유사체를 포함하는 합성 키모카인을 동정함에 있어, HIV 감염에 대한 세포-융합 분석에서 일련의 비폴리머 변형 전구체 유사체를 합성하고 스크리닝하였다. 폴리머-변형 형태의 표적 항-융합 효능은 약 20 nM 이상인 야생형 Rantes에 비하여 10 nM 이하의 범위에서 결정하였다. 소망의 전구체 Rantes 키모카인을 생성하는데 있어서, (1) N 말단 잔기; (2) N- 말단 영역의 내부; 및 (3) C-말단 영역에 대하여일련의 변형을 수행하였다. 특히 강력한 전구체 유사체는 야생형 Rantes의 위치 1에 대응하는 세린이 논아노일 부분으로 치환되고, 야생형 Rantes의 위치 3에 대응하는 티로신이 L-시클로헥실 글리신으로 치환되고, 지방산 부분이 C-말단 잔기에 디펩티드(Lys69-Leu70) 결합 부분을 통하여 부착된 것으로 발견되었고; 더욱 강력한 유사체는 이들 변형에 조합하여 야생형 Rantes의 위치 2의 프롤린이 L-티오프롤린으로 치환된 것으로 발견되었다. 하나 이상의 이들 변화를 함유하는 이같은 Rantes 유사체의 C-말단에서의 선형 또는 분지 수용성 폴리머를 부착할 때, 폴리머-변형 형태의 소망의 표적 항-접합 효능이 성취 가능하다는 것이 발견되었다. 즉, 10 nM 이하의 범위에서 바이러스 감염의 저해를 위한 ED50 값을 가지는 Rantes의 유사체를 포함하는 일련의 합성 키모카인이 얻어졌다. 특히, 선형 및 분지 모두의 수용성 폴리머 구성체를 야생형 Rantes에서의 기지의 응집 부위(위치 66, 야생형 Rantes의 위치 66에 대응)에 인접한 C-말단 부위(위치 67, 야생형 Rantes의 위치 67에 대응)에 부착하였다. 수용성 폴리머의 이 부위에의 첨가는 원치않는 응집을 붕괴시킬 뿐 아니라, 폴리머 변형 형태가 10 nM 이하의 표적 범위에서 효능 범위를 갖도록 한다. 이 같은 지금까지 관찰된 바는 폴리머변형을 위하여 표적화된 전구체 키모카인은 (효능이 적당한 시험관내 세포-기초 검정에서 EC50에 의하여 측정될 경우) 바람직하게는 폴리머 변형된 생물활성 합성 키모카인의 소망의 효능 범위보다 약 1 내지 5 배, 바람직하게는 약 5 내지 10 배 큰 개시 효능을 갖을 것이라는 발견과 일치한다. 게다가, Rantes의 폴리머-변형 유사체 각각은, 적당한 동물 모델, 예를 들어 래트나 마우스에서 측정될 때 유의하게 개선된 순환 반감기를 가진다는 것이 발견되었다. 전구체 키모카인의 효능을 향상시키는 변화를 삽입하는 이 체계적 접근법은 다른 키모카인에 대하여 일반적으로 적용 가능하다. 따라서, 이 같은 전구체 키모카인의 선택은, 효능 및 시험관내 혈청 순환 반감기의 바람직한 균형을 나타내는 폴리머-변형 생물활성 합성 키모카인을 생산하기 위하여 이용될 수 있다.
C. 본 발명의 키모카인의 검출 가능한 표지
본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 또한, 형광단, 및 특이적, 선택 부위에 도입된 다른 치환체를 포함하는, 분자를 키모카인 작용, 바이러스 저해 등과 연관되는 막 및 세포-생물학적 사건의 프로브로 전환시킬 뿐 아니라 약물 생체 반응학을 모니터링하기 위한 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 C-말단 영역에 바람직하게 부착된다. 검출가능한 표지는 키모카인 폴리펩티드 사슬의 합성동안 또는 합성 후에 삽입될 수 있다. 한 예로서, 검출가능한 표지는 사슬 조립동안 사전-라이게이션 펩티드 단편에 삽입될 수 있고, 예를 들어, 다른 보호기의 제거 및 수지로부터 표지 펩티드의 배출 전에 형광단를 수지-결합 펩티드 상의 비보호 반응성기에 접합시키는 것이 편리하다. 검출가능한 표지를 포함하는 아미노산 유도체 및 펩티드나 폴리펩티드 서열 내에 삽입하기 위하여 사용되는 화학적 합성 기술은 주지이고, 이 목적을 위하여 사용될 수 있다. 이 같은 방법으로 결과의 키모카인 폴리펩티드 사슬 라이게이션 산물은 선택의 사전 정의 위치에 하나 이상의 검출 가능한 표지를 함유하도록 고안될 수 있다. 대안으로, 검출 가능한 표지는, 펩티드 단편 라이게이션전 또는 라이게이션후 폴리펩티드 사슬의 주어진 아미노산 상에 존재하는, 부위-특이적 부착을 허용하는 케토 또는 알데히드기 같은 반응성기, 바람직하게는 화학선택성 반응성기에 첨가될 수 있다.
이 목적에 적당한 검출 가능한 표지는 광활성기 뿐아니라, 형광단과 다른 염료를 포함하는 발색단, 또는 비오틴 같은 헵톤을 포함한다. 이 같은 표지는 다수의 상이한 시중 공급처로부터(예를 들어, Molecular Probes, Oregon USA; Sigma and affiliates, St. Louis MO, USA; 등) 구입가능하다. 수지 상의 표지를 위하여는, 플로레신, 에오신, 오레곤 그린, 로다민 그린, 로돌 그린, 테트라메틸로다민, 로다민 레드, 텍사스 레드, 쿠마린 및 NBD 형광단, 다드실 발색단 및 비오틴이 모두 플루오르화 수소(HF) 뿐아니라 대부분의 다른 산에 대하여 적당하게 안정적이고, 따라서 고체상 합성 과정을 통한 삽입에 적당하다. (Peled, et al., Biochemistry (1994) 33 : 7211; Ben-Efraim, et al., Biochemistry (1994) 33: 6966). 쿠마린외의 이들 형광단은 또한 Fmoc 화학을 사용하여 합성된 펩티드의 보호기 제거에 사용되는 시약에 대하여도 안정하다 (Strahilevitz, et al., Biochemistry (1994) 33: 10951). ε-도데실-L리신의 t-Boc 과 α-Fmoc 유도체는 또한 답실 발색단을 폴리펩티드 서열 내 선택의 부위에 삽입시키는데 사용될 수 있다. 답실 발색단은 넓은 가시적 흡수성을 가지며, 소광기로서 사용될 수 있다. 답실기는 또한 답실 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 N-말단에 삽입될 수 있다 (Maggiora, et al., JMed Chem (1992) 35 : 3727). EDANS 는 FRET 실험에서 답실 소광체와 짝짓기 위한 일반적 형광단이다. 이 형광단은 5-((2-t-Boc)-γ-글루타밀아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산을 사용하는 펩티드의 자동화 합성 중에 편리하게 도입된다 (Maggiora, et al., J Med Chem. (1992) 35 : 3727). (α-t-Boc)-ε-답실-L-리신은 화학적 합성 동안 답실 형광단의 폴리펩티드 내로의 삽입에 사용될 수 있다 (Gauthier, et al., Arch Biochem. Biophys. (1993) 306 : 304). EDANS 형광과 함께 사용될 때, 이 형광단의 형광은 답실의 흡광과 중복된다. 펩티드의 부위-특이적 비오틴화는 비오시틴의 t-Boc-보호된 유도체 또는 다른 주지의 NHS-비오틴 등 같은 비오틴화 유도체를 사용하여 달성될 수 있다 (Geahlen, et al., Anal. Biochem. (1992) 202: 68). 라세미 벤조페논 페닐알라닌 유사체는 또한 그것의 t-Boc 또는 Fmoc 보호에 이어 펩티드 내로 삽입될 수도 있다(Jiang, et al., Intl. J Peptide Prot. Res. (1995) 45 : 106). 디아스트로머의 분해는 산물의 HPLC동안 성취될 수 있고; 비보호된 벤조페논 또한 당업계 표준 기술에 의하여 분해될 수 있다. 옥심 결합을 위한 케토-함유 아미노산은, 아자/히드록시 프립토판, 비오틸-리신 및 D-아미노산이 수지상 표지 용도로 사용될 수 있는 아미노산의 다른 예이다. 자동화 펩티드 합성 용도로 당업계 표준기술을 따라 관용 합성법에 의하여 다른 보호된 아미노산이 제조될 수 있다는 것이 이해될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 융합된 약물을 포함 할 수 있다 (예를 들어, WO 00/04926 참조).
D. 본 발명의 키모카인의 합성 및 수용성 폴리머의 부착
본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 제조하는 방법 또한 제공된다. 방법은 (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단, N-루프 및 C-말단 중 하나 이상에서 지방족 사슬 및 아미노산 유도체로부터 선택되는 부분으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
특히, 본 발명의 N-말단 변형 생물활성 합성 키모카인의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬 또는 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 C-말단 변형 생물활성 합성 키모카인의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 폴리사이클릭으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 본 발명의 N-/C-말단 변형 생물활성 합성 키모카인의 제조방법은: (i) 천연 발생 키모카인에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드 사슬을 포함하는 천연 발생 키모카인의 유사체를 합성하는 단계로서, 폴리펩티드 사슬은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬 또는 하나 이상의 아미노산 유도체로 변형되고, 그것의 C-말단에서 지방족 사슬 또는 폴리사이클릭으로 변형된 것을 특징으로 하는 합성 단계: 및 (ii) 대응 천연 발생 키모카인과 비교하여 길항제 활성에 대하여 키모카인 유사체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 합성은 화학적 합성(즉, 무-리보솜 합성), 또는 생물학적 (즉, 리보솜 합성) 및 화학적 합성의 조합에 의하여 달성된다. 화학적 합성을 위하여, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은, Fmos과 tBoc 접근법을 사용한 고체상 또는 용액상 펩티드 합성 같은, 전체적 단계적 사슬 조립 또는 단편 축합 기술에 의하여, 또는 전체적 사슬 조립으로 제조된 펩티드 단편의 화학적 라이게이션, 또는 사슬 조립 및 생물학적 제조의 조합에 의하여 제조될 수 있다. 이같은 단계적 사슬 조립 또는 단편 축합 및 라이게이션 기술은 당업계에 주지이다 (예를들어, Kent, S. B. H., Ann. Rev. Biochem. (1988) 57 : 957-989; Dawson et al., Methods Enzymol. (1997) 287 : 34-45; Muir et al., Methods Enzymol. (1997) 289 : 266-298; Wilken et al., Current Opinion In Biotechnology (1998) 9 : 412-426; Ingenito et al., J Amer. Chem. Soc. (1999) 121 (49): 11369-11374 ; 및 Muir et al., Chemistry & Biology (1999) 6 : R247-R256 참조).
화학적 라이게이션에 대하여는, N-말단 관능기를 갖는 제 1의 펩티드 단편은 N-말단 관능기와 반응하는 C-말단 관능기를 갖는 제 2의 펩티드 단편과 라이게이션되어 그들 사이에서 공유결합을 형성한다. 선택되는 관능기에 따라서, 라이게이션 반응은 라이게이션 부위에서 천연 아미드결합 또는 비-천연 공유결합을 갖는 산물을 생성한다. 화학적 라이게이션용으로 채용되는 제 1 또는 제 2의 펩티드 단편은단계적 사슬 조립 또는 단편 축합을 사용하여 전형적으로 제조된다. 특히, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 펩티드 단편의 라이게이션에 의하여 제조되고, 단편은 라이게이션에 사용될 의도된 화학선택성 반응 화학에 관하여 적당한 부가 화학선택성 반응기를 함유하도록 제조된다. 이들 화학은 천연 화학적 라이게이션 (Dawson, et al., Science (1994) 266: 776-779; Kent, et al., WO 96/34878), 연장된 일반적 화학적 라이게이션 (Kent, et al., WO 98/28434), 옥심 형성 화학적 라이게이션 (Rose, et al., J. Amer, Chem. Soc. (1994) 116 : 30-33), 티오에스테르 형성 라이게이션 (Schnolzer, et al., Science (1992) 256 : 221-225), 티오에테르 형성 라이게이션 (Englebretsen, et al., Tet. Letts. (1995) 36 (48): 8871-8874), 히드라존 형성 라이게이션 (Gaertner, et al., Bioconj. Chem. (1994) 5 (4): 333-338), 및 티아졸리딘 형성 라이게이션 (Zhang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1998) 95 (16): 9184-9189; Tam, et al., WO 95/00846)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
주어진 라이게이션 화학에 대한 반응 조건은 라이게이션 성분의 소망의 상호작용을 유지하기 위하여 선택된다. 예를 들어, pH와 온도, 펩티드와 성분의 용해도, 펩티드의 비율, 물 성분과 각 펩티드의 조성은 라이게이션을 최적화하기 위하여 변화시킬 수 있다. 펩티드를 상이한 정도로 용해시키는 시약의 첨가 또는 배제가 더 사용되어 특이성 및 소망의 라이게이션 반응의 속도를 제어할 수 있다. 반응 조건은 하나 이상의 내인적 및/또는 외인적 대조 표준에 비교한 소망의 화학선택적 반응 산물에 대한 검정에 의하여 결정될 수 있다.
화학적 합성의 바람직한 방법은 Kent et al., WO 96/34878에 개시된 천연 화학 라이게이션을 채용하고, N- 및/또는 C-말단에서 화학적으로 변형된 단백질을 제조하는 방법은 여기에 참고문헌으로 수록된 Offord et al., WO 99/11666에 개시된다. 일반적으로, C-말단 티오에스테르를 함유하는 제 1 펩티드는 비산화 술프히드릴 곁사슬을 갖는 N-말단 시스테인을 갖는 제 2 펩티드와 반응한다. 촉매적 양의 티올, 바람직하게는 벤질 메르캅탄, 티오페놀, 2-니트로티오페놀, 2-티오벤조산, 2-티오피리딘 등의 존재하에서, N-말단 시스테인의 비산화 술프히드릴 곁사슬은 C-말단 티오에스테르와 축합된다. 제 1 및 제 2의 펩티드를 β-아미노티오에스테르 결합에 의하여 결합함으로써 중간체 펩티드가 생성되고, 이것은 재배열되어 제 1 및 제 2 펩티드가 아미노 결합으로 결합된 것을 포함하는 펩티드 산물이 생성된다.
화학적 및 생물학적 제조의 조합에 관하여는, 하나의 펩티드 단편이 화학적 합성에 의하여 제조되는 한편, 다른 하나는 재조합 접근법을 사용하여 제조되는데, 단편들은 그 후 화학적 라이게이션을 사용하여 연결되어 전장 산물을 생성한다. 예를 들어, intein 발현 시스템은 'intein' 단백질-스플라이싱 원소의 유도적 자기-절단 활성을 이용하여 C-말단 티오에스테르 펩티드 단편을 생성하도록 사용될 수 있다. 특히, intein은 DTT, β-메르캅토에탄올 또는 시스테인 같은 티올의 존재하에서, C-말단 티오에스테르를 함유하는 펩티드 단편을 생성하는 특이적 자기-절단을 수행한다 (예를 들어, Muir et al., Chemistry & Biology (1999) 6 : R247-R256; Chong et al., Gene (1997) 192 : 277281; Chong et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26 : 5109-5115; Evans et al., Protein Science (1998) 7: 2256-2264; 및Cotton et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (9): 247-256 참조). 그후 이 C-말단 티오에스테르 함유 펩티드 단편은, 천연 화학적 라이게이션에서 채용될 때 N-말단 시스테인을 갖는 펩티드 단편 같은 N-말단 티오에스테르-반응성 관능성을 함유하는 제 2의 펩티드를 라이게이션 하는데 사용될 수 있다.
소수성 지방족 사슬과 아미노산 유도체는 사슬 조립, 사슬 조립 이후 또는 그것의 조합 동안 삽입될 수 있다. 사슬 조립 동안의 삽입을 위하여는, 아미노산 유도체 및/또는 부착된 지방족 사슬을 갖는 아미노산은 단계적 또는 단편 축합, 및/또는 라이게이션 사슬 조립 과정으로 삽입된다. 이들 아미노산은 펩티드 합성 동안 성장하는 펩티드 사슬, 라이게이션을 위하여 표적화되는 조립된 펩티드 단편에 단계적 방식으로 첨가될 수 있어서, 어느 정도 부가 N- 또는 C-말단 변형은 폴리머 지지체로부터 절단에 의하여 제공될 수 있고, 그로써 절단 산물은 소망의 소수성 지방족 사슬을 생성한다. 사슬 조립 후에는, 반응성 관능기를 갖는 아미노산 또는 그것의 유도체가 (보호 또는 비보호 형태로) 사슬 조립 동안 삽입되고, 그것은 그 후 비보호 반응성 형태로 소망의 소수성 부분의 부착에, 즉, 펩티드 합성후 접합 반응에 사용된다. 사슬 조립 후 부착은 변성 선형 펩티드 사슬 상에서, 또는 폴리펩티드 사슬의 폴딩에 이어 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 아미노산 유도체는 펩티드 합성 동안 소망의 아미노산 위치에서 첨가되는 한편, N-, C- 및/또는 N-/C-말단 소수성 지방족 사슬은 펩티드 삽성 후에 접합 반응에 의하여 첨가된다. 어떤 다수의 접합 화학 (예를 들어, Plaue, S et al., Biologicals. (1990) 18 (3): 147-57; Wade, J. D. et al., Australas Biotechnol. (1993) 3 (6): 332-6; Doscher, M. S., Methods Enzymol. (1977) 47 : 578617; Hancock, D. C. et al., Mol Biotechnol. (1995) 4 (1) : 73-86; Albericio, F. et al., Methods Enzymol. (1997) 289 : 313-36 참조) 뿐 아니라, 라이게이션 화학도 소망의 공유결합에 따라서 사용될 수 있다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 폴딩은 당업계 표준 기술을 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, WO 99/11655 ; WO 99/11666; Dawson et al., Methods Enzymol. (1997) 287 : 34-45 참조.
길항제 활성에 대한 합성된 키모카인 성분의 스크리닝을 위하여, 화합물을 대응 수용체에 대한 키모카인 리간드의 직접 또는 간접 결합을 특징으로 하는 시험관내 또는 생체내 기초 검정에 의하여 시험한다. 키모카인 수용체와 그것의 대응하는 야생형 키모카인 리간드의 예는 CXXXCR1 (프랙탈카인); XCR1 (SCM-1); CXCR2 (GRO, LIX, MIP-2); CXCR3 (MIG, IP-10); CXCR4 (SDF-1); CXCR5 (BLC); CCR1 (MIP-lα, RANTES, MCP-3); CCR2 (MCP-1, MCP-3, MCP-5); CCR3 (Eotaxin, RNATES, MIP-lα) ; CCR4 (MDC, TARC); CCR5 (RANTES, MIP-lα, MIP-lβ ; CCR6 (MIP3α) ; CCR7 (SLC, MIP-3 β) ; CCR8 (TCA-3); 및 CCR9 (TECK)를 포함한다. 이 시스템에 대한 시험관내 및 생체내 검정은 주지이고, 바로 이용가능하거나 새로이 만들 수 있다. 예를 들어, US 5,652,133; US 5,834,419; WO 97/44054; WO 00/04926; 및 WO 00/0492 참조. 예를 들어, 하나 이상의 키모카인 수용체를 발현하는 천연, 형질전환, 및/또는 트렌스제닉 세포주는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인에 노출되었을 때, 키모카인-유도 주화성의 효과나 이 사건의 저해를 모니터링하는데 전형적으로 사용된다. 동물 모델 또한, 예를 들어, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인으로의처리와 조합한 반응 프로필을 모니터링하거나, 화합물의 약물 생체 반응학과 약물 생체 역학적 특성을 특성결정하는데 채용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 바이러스 감염의 저해제로서 특성결정하기 위하여, 표적 세포주와 외피 세포주가 채용되는, 외피-매개 세포 융합 검정이 본 발명의 생물활성 합성 키모카인에 대하여 HIV 감염을 막는 능력에 대하여 채용될 수 있다. 물론, 무-세포 바이러스 감염 검정 또한 이 목적으로 채용될 수 있다.
예로서, 일반적으로 주화성의 길항제 성질을 평가하기 위하여, 단핵구, T 림프구 및 호중구의 정제에 대한 확립된 프로토콜에 따라 정상 공여자로부터 분리된 것과 같은 말초혈 백혈구가 채용될 수 있다. 일련의 C, CC, CXXXC 및 CXC 키모카인 수용체-발현 시험 세포가 제작되고, 본 발명의 개별 화합물의 일련의 희석물에 노출된 후, 평가될 수 있다. 천연 키모카인이 대조표준으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 키모카인 수용체를 코딩하는 발현 카세트로 트렌스펙션된 일련의 세포들이 이 목적에 적당하다. 예를 들어, RANTES, SDF-1α나 SDF-1β 및 MIP 같은 키모카인 길항제가, 형질전환체 발현 CXCR4/융합/LESTR, CCR3, CCR5, CXC4 (이같은 세포는 다양한 시중 및/또는 학술적 공급원으로 부터 입수가능하고 표준 프로토콜에 따라 제조할 수 있는데; 예를 들어, Risau, et al., Nature 387: 671-674 (1997); Angiololo, et al., Annals NYAcad. Sci. (1996) 795 : 158-167; Friedlander, et al., Science (1995) 870: 1500-1502 참조)를 사용하여 스크리닝 될 수 있다. 결과는, 대조 표준 배지에 비한 자극된 세포 이동의 증가된 배수를 나타내는 주화성 지수("CT") 및 결정된 통계학적 유의수준으로서 표현될 수 있다.
예를 들어, 경쟁적 저해 대 수용체 순환 효과를 평가하기 위하여, 수용체 결합 검정 또한 수행될 수 있다 (모두가 참고문헌으로써 수록된 Signoret, N. et al., "Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5,"J Cell Biol. 2000 151 (6): 1281-94; Signoret, N. et al.,"Analysis of chemokine receptor endocytosis and recycling,"Methods Mol Biol. 2000; 138: 197-207; Pelchen-Matthews, A. et al., "Chemokine receptor trafficking and viral replication,"Immunol Rev. 1999 Apr; 168: 33-49; Daugherty, B. L. et al.,"Radiolabeled chemokine binding assays," Methods Mol Biol. 2000 ; 138 : 129-34; Mack, M. et al."Downmodulation and recycling of chemokine receptors,"Methods Mol Biol. 2000; 138: 191-5 참조). 이 접근법은 주지이고, 표준 프로토콜에 따라 비표지 천연 키모카인이 농도가 증가되면서 존재하는 중에 본 발명의 표지된 생물활성 합성 키모카인을 전형적으로 채택할 것이다. 물론 표지는 리간드 중 어느 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 이 유형의 검정에서, 결합 데이터는, 예를 들어, LIGAND (P. Munson, Division of Computer Research and Technology, NIH, Bethesda, MD) 같은 컴퓨터 프로그램으로 분석될 수 있고, 천연 백혈구 또는 표적 키모카인 수용체를 발현하는 수용체-트렌스펙션 세포에 비교한 "1 부위" 및 "2 부위" 모델 모두에 의한 스케쳐드 플롯 분석을 받을 수 있다. 비표지 리간드에 의한 결합 경쟁률을 그 후 다음 식: % 저해 = 1 - (비표지 키모카인 존재하의 결합/배지 단독 존재하의 결합) x 100 에 따라 계산할 수 있다.
화합물을 그것의 바이러스 감염과 질병을 예방하거나 완화시키는 능력에 대하여 스크리닝하기 위하여, 화합물은 다양한 바이러스 균주와 대조표준에 노출된, 적당한 수용체를 안정하게 발현하는 일련의 세포에 대하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, CCR3, CCR5, CXC4 또는 CXCR4 수용체를 발현하는 U87/CD4 세포는 M-반응, T-반응, 및 양쪽 반응성 HIV 균주의 감염을 스크리닝하는데 채용될 수 있다. 바이러스 감염의 저해는 키모카인 농도와 대조표준 농도에 대한 감염의 백분율로서 평가될 수 있다. 예를 들어, McKnight, et al., Virology (1994) 201 : 8-18) ; 및 Mosier, et al., Science (1993) 260 : 689-692; Simmons, et al, Science (1997) 276: 276-279; Wu, et al., J. Exp. Med. (1997) 185 : 168-169; 및 Trkola, et al., Nature (1996) 384 : 184-186 참조.
칼슘 이동 검정은, 예를 들어, 호중구와 호산구에 대하여 주화성인 천연 키모카인을 동정하기 위한 (Jose, et al., J. Exp. Med 179 : 881-887 (1994)), 수용체 결합의 길항제에 대한 스크리닝에 유용한 다른 한 예이다. 다른 예로서, 본 발명의 화합물의 맥관형성 활성은 병아리 융모막요막(CAM) 검정 (Oikawa, et al., Cancer Lett, (1991) 59 : 57-66)에 의하여 평가될 수 있다.
본 발명의 생물활성 합성 키모카인은, 연구 도구로서, 진단제 및 치료제로서의 용도를 포함하는 다수의 용도를 갖는다. 특히, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 가치있는 약학적 성질을 갖는 것으로 발견되었고, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염을 포함하는 다양한 이상과 관련된 - 대응 야생형 분자와 관련된 염증 효과를 효과적으로 막는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 그것은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증, 기관 이식 거부반응 및 류마티스성 관절염의 치료에 유용하다. 예를 들어, RANTES 및 SDF-lα나 SDF-1β 길항제 같은 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 몇몇은 HIV-1 감염을 저해하는 것으로 또한 밝혀졌고, 길항제(예를 들어, vMIP-II 유사체)는 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 RANTES, 또는 SDF-lα나 SDF-1β 길항제와 vMIP-II 유사체는 포유동물에서 HIV-1을 저해하는데 유용할 수 있다. 방법에 의하여 측정되는 화합물의 HIV-1에 대항한 사용에의 잠재성은 다음 실시예에서 기재된다. 염증 효과에 대항한 사용에의 잠재성은 당업계 숙련자에게 주지인 방법에 의하여 측정된다. 게다가, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 단독으로, 또는 서로 조합하여 뿐 아니라, 주어진 이상을 치료하는데 상승적인 다른 비-키모카인 약물과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
이에 제한되지 않는 예로서, 다음은 야생형 키모카인 분자의 몇몇의 특이적 예 및 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 제조하는 일반적 이용법을 설명하기 위한 관련 생물학적 성질이다. 예를 들어, SCM-1은 비장에서 발현되는 C-키모카인이다. 이것은 CC- 및 CXC-키모카인과 실질적으로 관련되는데, 그것이 이들 단백질에서 보존적인 네개의 시스테인 중 오직 두번째 및 네번째 것만을 갖는다는 점에서 다르다 (Yoshida et al. FEBS Letters (1995) 360 (2): 155-159; Yoshida et al. J. Biol. Chem. (1998) 273 (26): 16551-16554). 인간에서, 두개의 고도로 상동적인 SCM-1 단백질인, 두 개의 아미노산 치환 만큼 상이한 SCM-1α 및 SCM-1β가 있다. SCM-1은 마우스의 림프구 특이적 키모카인인 림포탁신과 약 60 % 동일한 것으로 나타난다. SCM-1과 림포텍틴은 그러므로 C-키모카인 또는 γ-키모카인의 인간과 마우스의 전구형태일 수 있다. SCM-1 분자 둘 모두, 다양한 인간 조직 중 태반에서 주로 발현되고 비장 및 흉선에서 약하게 발현되는 고아 수용체인 GPR5를 발현하도록 조작된 마우스 L1.2 세포에서 특이적으로 이동을 유도한다. 따라서, SCM-1의 길항제는 GPR4의 정상적인 기능을 막는 것에서 용도를 찾는다.
다른 예로서, 76 개 아미노산으로 이루어진 CXXXC-키모카인인 프랙탈카인의 용해성 형태는 T-세포와 단핵구에 대한 강력한 화학유인물질이지만 호중구에 대하여는 그렇지 않다. 프랙탈카인은 TNF 또는 IL1에 의한 자극 후에 현저하게 증가한다. 프랙탈카인에 대한 인간 수용체는 CX3CR1으로서 표시된다. 수용체는 프랙탈카인의 점착 및 이동 기능 둘 모두를 매개한다. 인간 수용체는 호중구, 단핵구, T-림프구, 및 뇌를 포함하는 몇몇 실질 기관에서 발현된다. 수용체는 HIV-1의 주요 분리체로부터의 외피 단백질에 대한 공수용체로서 CD4와 함께 기능하는 것으로 밝혀졌다. 세포-세포 융합 검정은 프랙탈카인이 융합을 실질적으로 및 특이적으로 저해하는 것을 나타낸다. (예를 들어, Bazan et al Nature (1997) 385 (6617): 640-644; Combadiere et al. J. Biol. Chem. (1998) 273 (37): 23799-23804; Rossi et al. Genomics (1998) 47 (2): 163-170; 및 Faure et al. Science (2000) 287 : 2274-2277 참조). 그러므로, 프랙탈카인의 갈항제는, 관절염 같은, TNF 나 IL1 경로와 관련된 다양한 관절염성 이상의 치료에서 용도를 발견할 수 있을 뿐 아니라 HIV 감염의 차단제로서의 용도를 발견할 수 있다는 것이 자명하다.
에오탁신은 추가적 예이다. 이 단백질은 74 아미노산 길이이고, 그것의 특징적 시스테인 패턴 때문에 CC-키모카인으로서 분류된다. 알레르기 염증의 모델로서 사용되고, 천식-관련 이상에서 관련되는 기니아피그의 기관지꽈리 세척에서 발견되었다. 에오탁신은 피부에서 호중구의 축적에 있어서 유의한 영향 없이 1-2pM 투여량에서의 실질적인 호산구 축적을 유도한다. 에오탁신은 시험관내에서 기니아피그와 인간 호산구 둘 모두의 강력한 자극제이다. 이 인자는 기니아 피그 호산구 상의 RANTES와 결합부위를 공유하는 것으로 보인다. 에오탁신은 정상 인간 호산구에서 칼슘 흐름 반응을 유도하지만, 호중구나 단핵구에서는 그러하지 않는다. 반응은 호산구를 다른 CC-키모카인으로 사전처리함에 의하여 둔감화될 수 없다. 호염구에서 에오탁신은 RANTES보다 더 높은 수준의 주화성 반응을 유도하지만, 오직 히스타민 배출이나 류코트리엔 C4 형성에 대한 이동성 효능을 갖을 뿐이다. 그것은 또한 B세포 림프종 세포의 주화성에서 역할을 할 수 있다. 에오탁신의 주요 수용체는 CCR3이다. (예를 들어, Bartels et al., Biochem. Biophys. Res. Comme (1996) 225 (3): 1045-51) ; Jose et al., J Exp. Med. (1994) 179 : 881-887); Ponath et al., J. Clin. Investigation (1996) 97 (3): 604-612); Ponath et al., J. Exp. Med. (1996) 183 (6): 2437-2448); Yamada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1997) 231 (2): 365-368 참조). 따라서, 에오탁신의 길항제는 천식과 다른 호산구 관련 알레르기 이상의 강력한 조절제로서 사용될 수 있다.
RANTES는 길항제가 특히 관심있는 표적 키모카인의 다른 예이다. 그것은 염증, 기관 거부반응으로부터 HIV 감염에 이르는 범위의 다수의 이상에 관련되는 CC-키모카인이다. RANTES의 합성은 TNF-α 및 IL1-α에 의하여 유도되지만, TGF-β,IFN-γ 및 IL6에 의하여는 유도되지 않는다. RANTES는 배양물내 순환 T-세포 및 T-세포 클론에 의하여 생산되지만, 지금까지 시험된 T-세포주에 의하여는 생산되지 않는다. RANTES의 발현은 T-림프구의 자극에 따라 저해된다. RANTES는 T-세포, 인간 호산구 및 호염구에 대하여 주화성이 있고, 백혈구를 염증부위에 보충하는데 능동적 역할을 한다. RANTES는 또한 호산구가, 예를 들어, 호산구성 양이온 단백질을 배출하도록 활성화한다. 그것은 호산구의 밀도를 변화시켜 저밀도로 만들며, 그것은 일반화된 세포 활성화의 상태를 나타내고 천식과 알레르기성 비염과 같은 질병과 가장 빈번하게 연관되는 것으로 생각된다. RANTES는 또한 산화 기작의 강력한 호산구-특이적 활성화제이다. RANTES는 단핵구의 상피세포에 대한 점착을 증가시킨다. 그것은 세포표면 마커 CD4와 UCHL1을 발현하는 단핵구와 T-림프구의 이동을 선택적으로 지지한다. 이들 세포는 기억 T-세포로 헬퍼 T-세포를 사전-자극하는 것으로 생각된다. RANTES는 몇몇의 선택 호염구 공여자로부터 인간 호염구를 활성화시키고 히스타민의 배출을 야기한다. 다른 한편, RANTES는 또한 가장 강력한 히스타민 유도제 중 하나인 MCAF를 포함하는 몇몇의 시토카인에 의하여 유도되는 히스타민의 배출을 저해할 수도 있다.
RANTES는 최근 주화성 이외의 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그것은 CHAK (C-C-키모카인-활성화 킬러)로 알려진 킬러 세포의 증식과 활성화를 유도할 수 있는데, 이는 IL2에 의하여 활성화되는 세포와 유사하다. RANTES는 인간 윤활 섬유모세포에 의하여 발현되고, 류마티스성 관절염에서 진행성 염증 과정에 참여할 수 있다. RANTES에 대한 고친화성 (약 700 결합부위/세포; Kd=700 pM) 수용체는 인간 단핵구 백혈구 세포주 THP-1에서 동정되었는데, 이는 주화성과 칼슘 이동 검정에서 RANTES에 반응한다. THP-1 세포의 RANTES에 대한 주화성 반응은 MCAF(단핵구 주화성 및 활성화 인자)나 MIP-1-α(마크로파지 염증 단백질)로 사전-인큐베이션함으로써 현저하게 저해될 수 있다. 단핵구에 대한 RANTES의 결합은 MCAF와 MIP-1-α에 의하여 경쟁된다. RANTES에 대한 수용체는 CCR1, CCR3 및 CCR5 이다. RANTES의 길항제의 임상적 사용이나 유의성은 다양하다. 예를 들어, 천연 RANTES에 대한 항체는 실험적 사구체간질증식성 신염과 관련된 세포 침윤을 현저하게 저해할 수 있다. 추가로, 천연 RANTES는 신장의 이식 거부반응과 관련된 세포 거부반응을 겪는 인간 신장 동종이식편에서 고도로 발현되는 것으로 보인다 (Pattison et al., Lancet (1994) 343 (8891): 209-11 (1994)). RANTES의 화학적 변형 형태(아미노옥시펜탄-RANTES 또는 AOP-RANTES ; 및 n-논아노일 RANTES 또는 NNY RANTES)는 키모카인의 CCR-5 수용체에 대하여 길항제로 작용하며 HIV-1감염을 저해하는 능력을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명에 따른 RANTES의 길항제 N-, C- 및 N-/C-말단 변형 유사체는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 기관이식, 죽상종/중상 경화증 및 류마티스성 관절염 같은 질병의 치료에서 항-염증제로서 유용하다.
키모카인 SDF-1α 및 β의 길항제는 추가적 예인데, 이는 키모카인의 CXC 부류에 속한다. SDF-1β는 C-말단에서 4 개의 추가적 아미노산을 갖는다는 것이 다르다. 이들 키모카인은 비-인간 대응체와 92 % 초과로 동일하다. SDF-1은 혈세포를 제외하고 도처에 존재한다. SDF-1은 림프구와 단핵구에 작용하지만 시험관내에서 호중구에 작용하지 않고 생체내에서 단핵구에 대하여 고도로 강력한 화학유인물질이다. 그것은 또한 림프구에서 세포내 액틴 중합반응을 유도한다. SDF-1은 시험관내 및 생체내에서 인간 조혈 전구체 세포에 대한 화학유인물질로서 작용하여 전구체의 혼합된 형태 및 더 원시적 유형을 제공한다. SDF-1은 또한 심실격막 형성에 관여하는 것으로 보인다. CD34+ 세포의 주화성은 SDF-1와 IL-3의 조합에 반응하여 증가된다. SDF는 또한 이들 세포에서 세포질 칼슘의 일시적 증가를 유도하는 것으로도 밝혀졌다. SDF-1에 대한 주요 수용체는 CXCR4인데, 이는 또한 HIV1에 대한 주요 T-림프구 공수용체로서도 기능한다. 예를 들어, Aiuti et al, J. Exp. Med. (1997) 185 (1) : 111-120 (1997); Bleul et al., J Exp. Med. (1996) 184 (3): 1101-1109 (1996) Bleul et al., Nature (1996) 382 (6594): 829-833; D'Apuzzo et al. European J. Immunol. (1997) 27 (7): 1788-1793 ; Nagasawa et al., Nature (1996) 382 : 635-638); Oberlin et al., Nature (1996) 382 (6594): 833-835 참조.
그러므로, 예를 들어, 본 발명의 SDF-1α 또는 SDF-1β 길항제는 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 죽상종/중상 경화증 및 류마티스성 관절염 같은 질병의 치료에서 항-염증제로서 유용하다. 게다가, 본 발명의 SDF-1α 또는 SDF-1β 길항제는 단독으로, 또는 본 발명의 RANTES 길항제 유사체 같은 다른 화합물과 조합하여, 염증전 세포의 보충 및/또는 활성화, 또는 HIV-1 감염의 치료나 차단에 관하여 포유동물에서 SDF-1, RANTES, MIP-1α, 및/또는 MIP-1β의 효과를 차단하기 위하여 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 약제학적 조성물 및 본 발명의 하나 이상의키모카인 또는 약제학적으로 허용되는 그것의 염을 포함하는 치료학적 유효량의 화합물을 투여함으로써 그것이 필요한 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. "약제학적으로 허용되는 염"에 의하여는 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 유효성 및 특성을 유지하며, 생물학적으로나 그외의 바람직하지 않은 것이 아닌 염을 의미하려는 의도이다. 염은 산이나 염기에서 유래한다. 산 부가염은 염산, 브롬화수소산, (술페이트와 비술페이트 염을 생성하는) 술프산, 질산, 인산 등 같은 무기산, 및 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피르브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸말산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 시남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 살리실산, p-톨루엔술폰산 등 같은 유기산으로부터 유래한다. 염기 부가염은 무기산으로부터 유래하고, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등을 포함한다. 유기 염기로부터 유래한 염은 1차, 2차, 및 3차 아민, 천연-발생 치환 아민 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메트아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로케인, 히드라바민, 클로린, 베테인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루코사민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘 등을 포함하는 시클릭 아민을 포함하는 치환 아민으로부터 형성된 것을 포함한다. 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 피페리딘, 트로메트아민 및 콜린이다.
용어 "치료"는 여기에서 사용될 때, 표유동물, 특히 인간에서의 질병의 어떤 치료를 포괄하고: (i) 환자에서 잠복되었지만 아직 가진 것으로 진단되지는 않은질병의 발생을 막는 것; (ii) 질병을 저해하는 것, 즉 그것의 진행을 정지시키는 것; 또는 (iii) 질병을 완화시키는 것, 즉 질병의 퇴행을 야기시키는 것을 포함한다.
용어 "본 발명의 생물활성 합성 키모카인으로 치료함으로써 예방되거나 완화되는 포유류에서의 질병 상태"에 의하여는 여기에서 사용될 때 일반적으로 본 발명의 생물활성 합성 키모카인으로 유용하게 치료될 당업계에서 일반적으로 인정되는 모든 질병 상태 및 본발명의 특이적 화합물로 치료함으로써 유용하게 예방되거나 완화될 것으로 발견된 질병상태를 포괄하려는 의도이다. 이들은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 바이러스성 질병, 죽상종/중상 경화증, 류마티스성 관절염 및 기관 이식 거부반응을 설명으로서 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용될 때, 용어 "치료학적 유효량"은 포유동물에 투여될 때, 예를 들어 포유동물에서 항-염증제, 항 천식제, 항 면역억제제, 또는 포유동물에서 바이러스 감염을 저해하는 항 자가면역 질환제로서, (상기 정의된 바와 같은) 효과적 치료에 충분한 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"을 구성하는 양은 키모카인 유도체, 상태나 질병 및 그것의 중한 정도, 및 치료될 포유동물, 그것의 체중, 연령 등에 따라 다양할 것이지만, 현재 지식과 그 개시를 고려하여 당업자에 의하여 일상적으로 측정될 수 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "q.s."는 기재된 기능을 달성하기에, 예를 들어 소망의 부피(예를 들어 100mL)의 용액을 생성하기에 충분한 양을 첨가하는 것을 의미한다.
본 발명의 키모카인과 그것의 약제학적으로 허용되는 염, 즉 활성 성분은,상기된 바와 같이 치료학적 유효 투여량, 즉, 그것이 필요한 포유동물에 투여되었을 때 효과적 치료에 충분한 양으로 투여된다. 여기에 기재된 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 투여는 유사한 용도에 기능하는 작용제의 투여에 허용되는 어떤 방식에 의할 수도 있다. 여기에서 사용될 때, 용어 "본 발명의 생물활성 합성 키모카인" "본 발명의 폴리펩티드[의 약제학적으로 허용되는 염]과 "활성 성분"은 호환적으로 사용된다.
제제에서 존재하는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인의 수준은 당업자에 의하여 채용되는 전범위 내, 예를 들어, 전체 제제에 기초하여 약 0.01 중량 백분률 (%w) 내지 약 99.99%w의 본 발명의 생물활성 합성 키모카인과 약 0.01 %w 내지 99.99%w 부형제 범위내에서 다양할 수 있다. 더 전형적으로, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 약 0.5%w 내지 약 80%w 수준으로 존재할 것이다.
인간 투여량 수준은 본 발명의 생물활성 합성 키모카인에 대하여 아직 최적화되어야 하지만, 일반적으로 하루 투여량은 하루에 kg 체중 당 약 0.05 내지 25 mg, 가장 바람직하게는 하루 kg 체중 당 약 0.01 내지 약 10 mg 이다. 그러므로, 70 kg인 사람에 대한 투여는, 투여량 범위가 하루에 약 0.07 mg 내지 3.5 mg, 바람직하게는 하루에 약 3.5 mg 내지 1.75 g, 및 가장 바람직하게는 하루에 약 0.7 mg 내지 0.7 g이다. 투여되는 길항제의 양은, 물론 예방과 경감을 위하여 표적화되는 환자와 질병 상태, 고통의 형태와 심한 정도, 투여의 방식과 일정 및 처방 의사의 판단에 따를 것이다. 이같은 사용 최적화는 충분히 당업자의 범위내에 있다.
투여는 어떤 허용되는 전신이나 국소 경로, 예를 들어, 주사, 경구(특히 영아 제제에 있어), 정맥내, 비내, 기관지 흡입 (즉, 에어로졸 제제), 경피나 국소 경로를 통하여, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 가루약, 액체, 용액, 에멀젼, 주사제, 현탁액, 좌약 등 같은 고체, 반고체 형태 또는 액상 또는 에어로졸 투여 형태에 의할 수 있다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 또한, 사전 결정된 속도에서의 폴리펩티드의 지속적 투여를 위하여, 바람직하게는 정확한 투여량의 단일 투여에 적당한 단위 투여 형태로서, 저장 주사, 삼투 펌프, 알약, (전기전달을 포함하는) 경피 부착포 등을 포함하는 유지 또는 제어 배출 투여 형태로 투여될 수 있다. 조성물은 종래 약제학적 담체나 부형제 및 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 포함할 것이고, 추가로, 다른 의학적 작용제, 약제학적 작용제, 담체, 아주반트 등을 포함할 수 있다. 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 다양한 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 콩기름, 미네랄 오일, 참깨 오일, 등으로부터 선택될 수 있다. 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 및 글리콜은, 특히 주사제 용액을 위한 바람직한 수성 담체이다. 적당한 약제학적 담체는 녹말, 셀룰로스, 탈릭, 포도당, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 마그네슘, 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 글레세롤 모노스테아레이트, 염화 나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 다른 적당한 약제학적 담체 및 그것의 제제는 E. W. Martin에 의하여 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기재된다.
바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 소르비톨 모노로레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등 같은 습윤제나 에멀젼화제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수 있다.
더 많은 활성 성분이 요구될 수 있지만, 경구 투여는, 소망의 예방의 정도에 따라서나 고통의 경감에서, 편리한 매일 투여 섭생을 사용하여 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 송달하는데 사용될 수 있다. 이같은 경구 투여를 위하여, 약제학적으로 허용되는 비독성 조성물은, 예를 들어, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 녹말, 포비돈, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카라인, 탈컴, 셀룰로스, 크로스칼멜로스 소듐, 포도당, 젤라틴, 수크로스, 탄산 마그네슘 등 같은 정상적으로 채용되는 어떤 부형제의 삽입에 의하여 제조된다. 이 같은 조성물은 용액, 현탁액, 확산가능한 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속 배출 제제 등의 형태를 취한다. 경구 제제는 위장관 이상의 치료에 특히 적당하다. 일반적 전신 목적을 위한 경구적 생물학적 이용가능성은 아세틸화 아미노산을 포함하는 제제 같은 전신 순환으로의 섭취를 개선하는 부형제를 사용함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, US 5,935,601 및 US 5,629,020 참조.
조성물은 캡슐, 알약 또는 정제의 형태를 취할 수 있고, 따라서 조성물은 활성 성분과 함께 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등과 같은 희석제; 크로스칼멜로스 소듐, 녹말 또는 그것의 유도체와 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등 같은 윤활제; 및 폴리비닐피롤리돈, 검 아카시아, 젤라틴, 셀룰로스 및 그것의 유도체 등 같은 바인더를 함유할 것이다.
액상의 약제학적으로 투여 가능한 조성물은, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인 및, 예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올, 보존제 등 같은 담체 중의 선택적 약제학적 아주반트를, 예를 들어 용해, 확산 등에 의하여 제조함으로써 용액이나 현탁액을 형성시킬 수 있다. 바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한 습윤제, 분산제, 에멀젼화제, 또는 용해제, pH 완충제 등, 예를 들어, 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 시클로덱스트린 유도체, 폴리옥시에틸렌, 소르비톨 모노로레이트 또는 스테아레이트 등 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수 있다. 이같은 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 알려져 있거나, 당업계 숙련자에게 명백할 것인데; 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 참조. 투여될 조성물이나 제제는 어떤 경우에도 치료되는 환자의 증상을 예방하거나 완화시키는데 효과적인 양으로 활성 성분의 양을 함유할 것이다. 영아에 대한 경구 투여를 위하여는, (시럽이나 현탁액 같은) 액상 제제가 바람직하다.
액체를 함유하는 고체상 투여 형태를 위하여, 예를 들어 프로필렌 카르보네이트, 야채 오일이나 트리글리세리드 중의 용액, 또는 현탁액이 바람직하게 젤라틴 캡슐 내에 캡슐화된다. 액상 투여 형태를 위하여는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액은 충분한 양의 약제학적으로 허용되는 액상 담체, 예를 들어 물로 희석되어 투여를 위하여 용이하게 측정될 수 있다.
대안으로, 액상 또는 반고체 경구 제제는 활성 성분을 야채 오일, 글리콜, 트리글리세리드, 프로필렌 글리콜 에스테르 (예를 들어, 프로필렌 카르보네이트) 등 중에 용해시키거나 확산시키고 이들 용액 또는 현탁액을 경 젤라틴 또는 연 젤라틴 캡슐 껍질에 캡슐화함으로써 제조될 수 있다.
상기 상태의 치료에 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 적용할 때, 여기 기재된 활성성분의 투여는 비경구적으로 바람직하게 투여된다. 비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하고, 경피 또는 복막내 주사 뿐아니라 복장내 주사나 주입 기술을 포함할 수 있다. 주사제는 액상 용액 또는 현탁액, 주사 전 액체내 용액 또는 현탁액화에 적당한 고체 형태, 에멀젼 또는 생물학적 조화성 폴리머-기제 마이크로구형(예를 들어, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 폴리(D,C) 락티드 등) 으로서의 종래 형태로 제조될 수 있다. 적당한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 바람직하다면, 투여될 약제학적 조성물은 또한, 습윤제나 에멀젼화제, pH 완충제, 용해도 증강제, 단백질 담체 등, 예를 들어 아세트산 나트륨, 폴리옥시에틸렌, 소르비탄 모노로레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 시클로덱스트린, 혈청 알부민 등 같은 소량의 비독성 부수적 물질을 함유할 수도 있다.
본 발명의 생물활성 합성 키모카인은, 예를 들어, 이같은 분자를 (물이나 식염수 같은) 적당한 용매에 용해시킴으로써, 또는 다음의 리포좀 제제에 삽입함으로써, 허용되는 주입액 내로 분산함에 의하여 비경구적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 전형적인 매일 투여량은 한번 주입, 또는 일정 간격을 둔 일련의 주입에 의하여 투여될 수 있다. 비경구적 투여를 위하여, 수용성 형태, 예를 들어, 점도-증가 물질, 예를 들어 카르복시메틸 셀룰로스 나트륨, 소르비톨 및/또는 덱스트란, 및 바람직하다면, 안정화제를 함유하는 수용성 염, 또는 수성 주사 현탁액 형태의 활성 성분의 특히 적당한 수성 용액이 있다. 활성성분은, 선택적으로 부형제와 함께 또한 동결건조물의 형태일 수 있고 적당한 용매의 첨가에 의하여 비경구적 투여 전에 용액으로 제조될 수 있다.
비경구적 투여에 대하여 더 최근에 고안된 접근법은 서방성 또는 지속-배출 시스템의 주입을 채택하여, 투여량의 일정한 수준이 유지된다. 예를 들어, 참고문헌으로써 여기에 수록된 US 3,710,795, US 5,714,166 및 US 5,041,292 참조.
이 같은 비경구적 조성물에서 함유되는 활성 성분의 백분률은 그것의 특이적 형태 뿐 아니라, 폴리펩티드의 활성과 환자의 필요성에 고도로 의존한다. 그러나, 용액내 0.01 % 내지 10 %의 활성성분 백분률이 채용 가능하고, 조성물이 그후 상기 농도로 희석될 것인 고체인 경우 더 높을 것이다. 조성물은 0.02 %-8 %의 용액내 활성성분을 포함할 것이다.
본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 투여하는 다른 방법은 환약 주사 및 연속 주입 둘 모두를 이용한다. 이는 치료학적 처방이 HIV-1 감염의 예방에 대한 것일 때 특히 바람직한 방법이다.
에어로졸 투여는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인을 호흡기에 직접 송달하는 효과적 수단이다. 이 방법의 몇가지 이점은: 1) 그것이 효소적 분해, 위장관으로부터의 불량한 흡수, 또는 간의 제1통과 효과에 의한 치료제의 손실에 의한 영향을 방해한다는 것; 2) 그것이, 그렇지 않으면 분자량, 전하 또는 폐외 부위에 대한 친화성 때문에 호흡기 내 그것의 표적 부위에 도달하기를 실패할 활성 성분을 투여한다는 것; 3) 그것이 폐포를 통하여 체내로의 신속한 흡수를 제공한다는 것; 및 4) 그것이, 노출이 바람직하지 않은 부작용을 야기할 수도 있는 경우에 중요한, 다른 기관 시스템이 활성 성분에 노출되는 것을 막는다는 것이다. 이런 이유 때문에, 에어로졸 투여는 천식, 폐의 국소 감염, 및 폐와 호흡관의 다른 질병 또는 질병 상태 특히 이롭다.
세가지 종류의 약제학적 흡입 장치, 분무기, 흡입기, 측정-투여량 흡입기 및 건조분말 흡입기가 있다. 분무기 장치는 (액체 형태로 조제된) 키모카인 유도체를 환자의 호흡관 내로 운반시키는 연무로서 분무하도록 하는 고속 공기의 증기를 발생시킨다. 측정-투여량 흡입기는 전형적으로 압축 기체를 갖춘 제제를 갖고, 시동되면 측정된 양의 폴리펩티드가 압축 기체에 의하여 배출되고, 따라서 정한 양의 약을 투여하는 신뢰성 있는 방법을 제공한다. 건조분말 흡입기는 기구에 의하여 호흡하는 동안 환자의 기류로 분산될 수 있는 자유 유동 분말 형태의 폴리펩티드를 투여한다. 자유 유동 분말을 달성하기 위하여, 키모카인 유도체는 락토스 같은 부형제와 함께 조제된다. 키모카인 유도체의 측정 가능한 양이 캡슐 형태로 저장되고 각 시동에 따라 환자에게 분배된다. 상기 방법 모두는 본 발명을 투여하기 위하여 사용될 수 있다.
리포솜에 기초한 약제학적 제제 또한 본 발명의 키모카인과 사용하기에 적당하다. 예를 들어, US 5,631,018, US 5,723,147, 및 5,766,627 참조. 리포솜의 이점은 조직 분포의 유리한 변화 및 약물의 리포솜 포획으로부터 야기되는 약물 생체 반응학적 매개변수와 관련되는 것으로 믿어지고, 당업자에 의하여 본 발명의 폴리펩티드에 적용될 수 있다. 주사 또는 경구 투여를 위한 제어되는 배출 리포솜 액체 약제학적 제제가 또한 사용될 수 있다.
좌약을 통한 전신 투여를 위하여, 전통적 바인더와 담체는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜이나 트리글리세리드, 예를 들어 PEG 1000 (96 %) 및 PEG 4000 (4 %)을 포함한다. 이 같은 좌약은 활성 성분을 약 0.5 w/w% 내지 약 10 w/w%; 바람직하게는 약 1 w/w% 내지 약 2 w/w%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.
상기되고 다음의 구체적 실시예에서 더 설명되는 바와 같이, 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 천연 발생 키모카인의 길항제로서 용도를 발견한다. 특히, 길항제로서 증강된 효능을 갖는 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 기관 이식 거부반응, 바이러스성 질병, 죽상종/죽상경화증, 류마티스성 관절염 및 기관이식 거부반응 같은 다양한 질병 상태의 분석과 치료에서 용도를 발견한다. 본 발명의 생물활성 합성 키모카인은 또한 그것의 인지 수용체의 소분자 길항제를 고안하고 스크리닝하는데에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물내로 조작된 구조적 다양성은 키모카인 수용체의 천연 활성과 관련된 질병의 치료에서 의약 용도의 더 양호한 소분자 화합물의 고안, 스크리닝 및 정밀 제어에 있어 더 논리적인 접근법을 용이하게 한다.
다음 조제물과 실시예는 당업자가 본 발명을 더 명백하게 이해하고 실시하게 하기 위하여 제공된다. 그것은 본발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안되고 단지 그것의 설명적인 것과 대표적인 것으로 여겨져야 한다.
약자
DIEA디이소프로필에틸아민
DMFN, N-디메틸포름아미드
DNP 2,4-디니트로페닐
GuHCl 구아니디늄 히드로클로리드
HBTU O-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-
테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트
TFA 트리플루오로아세트산
Aib 아미노이소부티르산
Hyp 히드록시프롤린
Tic 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-COOH
Indol 인돌린-2-카르복실산
P(4,4DiF) 4-디플루오로-프롤린
Thz L-트리아졸리딘-4-카르복실산
Hop L-호모프롤린
△Pro 3,4-디히드로-프롤린
F(3,4-DiOH) 3,4디히드록시페닐알라닌
F (3,4-DiOH, pBzl)) pBzl,-3,4디히드록시페닐알라닌
p-Bz 벤조페논
Cha 시클로헥실-알라닌
βNal 3-(2-나프틸)-알라닌
Chg 시클로헥실-글리신
Phg 페닐글리신
HoF 호모페닐알라닌
F (F)5펜타플루오로페닐알라닌
tBuA 테르트-부틸알라닌
F(4-Me) 4-메틸페닐알라닌
tL 테르트-류신
CycP 1-아미노-1-시클로펜탄카르복실산
CycH 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산
Nle 노르류신
아미노옥시펜탄-RANTE (2-68) AOP-RANTES
n-논아노일-RANTES (2-68) NNY-RANTES
실시예 1: 본 발명의 키모카인에 대한 일반적 합성 접근법
본 발명의 생물활성 합성 키모카인에 대한 펩티드를 고체상 펩티드 합성에 의하여 제작하였다. 고체상 합성은 단계적 Boc 화학 사슬 연장을 사용하여, 원위치 중화/2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,1,3,3-테트라메틸루로늄 헥사 플루오로 포스페이트 활성화 프로토콜을 사용하여 Applied Biosystems 유래 주문-변형 430A 펩티드 합성기 상에서 수행하였다 (Schnolzer, et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1992) 40 : 180-193). N-말단 펩티드 단편은 티오에스테르-생성 수지상에서 합성하였다. 수지는 관찰되는 위치에 선행하는 잔기의 부착 후에 분리하고 펩티드는0.03 mmol 스케일 상에서 수동적으로 연장하였다. 각 합성 주기는 순수한 TFA로 1 내지 2 분 동안 처리함에 의한 Nα-Boc-제거, 1분간 DMF유동 세척, 10-20 분간 과량의 DIEA 존재하에서 1.0 mmol 사전활성화 Boc-아미노산으로 결합시킴, 및 제 2의 DMF 유동 세척으로 구성된다. Nα-Boc-아미노산 (1.1mmol)을 3 분 동안 과량(3 mmol)의 DIEA 존재하에서 1 mmol HBTU (DMF 중의 0.5 M)로 사전활성화시켰다. 각각의 수동적 결합 단계 후에, 잔여 자유 아민을 닌히드린 검정으로 평가하였다(Sarin, et al., Anal. Biochem. (1981) 117 : 147-157). 아미노산을 포함하는 C-말단 단편을 표준 -O-CH2-페닐아세트아미도메틸 수지 상에서 합성하였다. 사슬 조립이 완성된 후, 1 시간동안 0 ℃에서 세척제로서 5 % p-크레졸과 함께 무수 HF로 처리함으로써 펩티드를 보호제거하고 수지로부터 절단하였다. 모든 경우에, DNP-제거 과정이 C-말단 티오에스테르기와 일치하지 않으므로 이미다졸 곁사슬 DNP 보호기는 His 잔기 상에 남았다. 그러나, DNP는 라이게이션 반응 동안 티올에 의하여 점차 제거되어 비보호 His를 생성하였다. 절단 후, 두 펩티드는 빙냉 디에틸에테르, 수성 아세토니트릴 중에 용해시키고 동결건조하였다. 펩티드를 완충액 A (H2O/0.1% 트리플루오로아세트산) 중의 완충액 B(아세토니트릴/10% H20/0.1 % 트리플루오로아세트산)의 선형 구배 및 214nm에서 UV 검출기를 사용하여 Water로부터의 C18 컬럼을 갖는 RP-HPLC에 의하여 정제하였다. 샘플은 Platform II 인스트루먼트 (Micromass, Manchester, England)와 함께 전자분무 질량분석기로 분석하였다. 천연 화학적 라이게이션을 사용하여, 펩티드를 라이게이션에 사용하여 전장 키모카인 폴리펩티드 사슬을 생성하였다 (Dawson, et al., Science (1994) 266 : 776-779); Wilken, et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 43-51 ; 및 Camarero, et al., Current Protocols in Protein Science (1999) 18.4.1-18.4.21). Cys-SH/(Cys-S)2의 존재하에서 표준 기술(Wilken et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 43-51)에 따라 폴리펩티드 사슬의 폴딩을 달성하였다.
실시예 2: NNY-RANTES, AOP-RANTES, 및 SDF-1의 N-, C-, 및 N-/C-말단 유사체의 합성
실시예 1에서와 본 발명의 CC 및 CXC 키모카인을 제조하는 일반적 접근방법을 설명하는 여기에 기재된 바와 같이 RANTES (1-68) 와 SDF-1 β (1-72)의 유사체를 제조하였다. 특히, N-말단, C-말단, 및 N-/C-말단 변형 RANTES 유사체는 논아노일-RANTES (2-68) 나 "NNY-RANTES"로도 역시 지칭되는, 키모카인 화합물 CH3-(CH2)7-C(O)-RANTES(2-68) 및 아미노옥시펜탄-RANTES나 "AOP-RANTES"로도 또한 지칭되는 CH3-(CH2)4-O-N=CH-CO-RANTES(2-68)에 대한 변형에 기초한다. 이 목적을 위하여 사용되는 NNY-RANTES, AOP-RANTES 및 추가적 RANTES 유도체 분자가, 여기에 참고문헌으로써 수록되는 WO 99/11666에 기재된다. SDF-1의 N-, C-, 및 N-/C-말단 유사체가 RANTES 유사체에 대한 접근법의 기초적 고안을 사용하여 제작되었다.
RANTES 에 대한 NNY 및 AOP 변형 같은, 제공된 표적 키모카인에 대한 N-말단 변형을 위하여, 상기되고 WO 99/11666 와 Wilken et al., Chem. Biol. (1999) 6 : 4351에서 기재된 바와 같이, 라이게이션용으로 채용된 N-말단 펩티드 단편의 수지상 화합을 사용하여 화학적 변이체를 제작하여 부가 N-말단 변형(예를 들어, NNY 및 AOP)을 생성한 후, 비보호 N-말단 변형 펩티드 α-티오에스테르의 절단/보호제거, 정제 및 사용으로 이어졌다. 실시예 1에서 기재한 바와 같이, 아미노산 유도체를 포함한 펩티드를 합성하고 아미노산 치환체를 펩티드 합성 동안 삽입시켰다. 실시예 1에서와 같은 천연 화학적 라이게이션을 사용하여 선형 산물을 생성하였는데 라이게이션은 RANTES 유사체에 대하여는 Lys31-Cys32부위에 존재하고 SDF-1 유사체에 대하여는 Asn33-Cys34부위에 존재한다. 동일 몰 분량(2-2.5 mM)의 펩티드 단편을 6M GuHCl, 100 mM 포스페이트, pH 7.5, 1% 벤질메르캅탄, 및 3% 티오페놀에 용해시켰다. 반응은 통상 하룻밤 동안 수행하였다. 결과의 폴리펩티드 산물을 정제하고 상기된 바와 같이 펩티드 단편에 대하여 분석하였다. 폴딩된 단백질을 생성하기 위하여, NNY-RANTES 유사체(약 0.5 내지 1 mg/mL)의 정제된 폴리펩티드 사슬을 8mM 시스테인, 1mM 시스틴 및 10mM 메티오닌이 함유된 2M GuHCI, 100mM Tris, pH 8.0에 용해시켰다. 하룻밤 온화한 교반 후, 단백질 용액을 RP-HPLC에 의하여 상기된 바와 같이 정제하였다. SDF-1 유사체의 경우 다른 폴딩 조건을 사용하였다: SDF-1 와 Met0-SDF-1 을 실온의 0.5 mg/mL 의 1M GuHCI, 0.1M Tris, pH8.5 에서 기중 산화시켰다. 하룻밤 온화한 교반 후, 폴딩을 완성시켰다. AOP-, 카프로일- 및 NNY-SDF-1을 2M GuHCI가 존재한다는 점을 제외하고는 동일한 완충액을 사용하여 산화시켰다.
제공된 폴딩된 단백질에 대한 지방산의 화학적 융합을 위하여, 두 가지 기초 단계가 관련되었다. 첫번째로, 지방산을 아미노 옥시기로 관능화시켰다. 두번째로,반응성 카르보닐기를, 키모카인의 활성에 중요하지 않다고 믿어지는 단백질의 카르복실-말단 도메인에 특이적으로 도입시켰다. 이 목적을 위하여, C-말단 지방산 변형을 위하여 표적화된 키모카인 유사체를 C-말단 Lys (Ser) Gly 서열 연장에 의하여 합성하였다. 그러므로, 예를 들어, NNY-RANTES (2-68)를 합성하여 C-말단에서 Lys (Ser) Gly 서열 연장을 함유하도록 하였다. 재폴딩 단백질의 NaI04처리에 의하여 반응성 카르보닐기를 생성하였고, 따라서 안정한 옥심 결합을 통한 지방산 부분의 부위-특이적 부착이 야기되도록 하였다.
지방산 관능화를 위하여, 0.2 mmol 지방산 (팔미테이트, 올레이트, 아라키도네이트, 콜레이트)을 0.5 ml DMF/DCM 혼합물 (1:1, v:v) 내의 동일몰량의 DCC 및 HOAt로 활성화시켰고, 0.5ml의 0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2DMF 용액을 첨가시켰고, 겉보기 pH 는 N-에틸모르폴린을 사용하여 pH. 8.0 으로 조정하였다. 콜레스테릴 유도체를 위하여는, 0.2 mmol 콜레스테릴클로로포르메이트를 0.5ml DCM에 용해시키고 0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2에탄올 용액을 첨가시켰고, 겉보기 pH 는 트리에틸아민 사용하여 pH. 9.0 으로 조정하였다. 하룻밤 인큐베이션 후, 휘발성 물질을 진공에서 제거하였고 산물을 C4 컬럼 상에서 순간 크로마토그래피나 준비 HPLC에 의하여 분리하였다. Boc 기를 TFA 처리에 의하여 제거하고 산물을 ESI-MS에 의하여 확인하였다.
단백질 산화를 위하여, 표적 단백질 (2mg/mL)을 pH7.5의 6 M 염화 구아니딘을 함유하는 0.1 M 인산나트륨 완충액에 용해시켰고, 메티오닌을 첨가하여 단백질에 비하여 100 배 몰 과량의 스케빈저를 얻었다. 10 배 과량의 소듐 페리오데이트를 그 후 첨가하여 용액을 10 분간 어두운 곳에서 인큐베이션 하였다. 반응은 페리오데이트에 비하여 1000 배 몰과량의 에틸렌 글리콜을 첨가하여 정지시켰고 용액을 실온에서 15 분간 더 인큐베이션시켰다. 용액을 0.1 % 아세트산에 대하여 투석시킨 후 최종적으로 동결건조하였다. 예를 들어, C-말단 곁가지 세린의 산화는 ESI-MS에 의하여 거의 정량적인 것으로 나타났는데, 글리옥실일 유도체를 형성하기 위한 31 Da 손실에 대응하여 AOP-RANTES-K (S) G의 경우 8141.1±0.7 Da이 얻어졌고 시작물질의 질량에 대응하는 정점은 관찰되지 않았다.
지방산의 키모카인에 대한 융합은 0.1 % 살코실, 20 mM 메티오닌과 단백질에 비교하여 20배 과량의 관능화 지방산 존재하의 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.3에서 달성되었다. 16-20 시간동안 37 ℃에서 교반 후, 지방산의 아미노-옥시기와 키모카인 알데히드 사이에서 옥심결합이 형성되었을 때, 융합체를 역상-HPLC를 사용하여 정제하였고 산물을 ESI-MS 에 의하여 특성결정하였다. 모든 유사체에 대하여, 아미노옥시-관능화 지방산의 산화된 단백질에 대한 결합은, 분석 HPLC에 의하여 제어될 때, 거의 정량적이었다.
실시예 3: NNY- 및 AOP-RANTES의 N-말단 유사체
N-말단 RANTES 유도체에 대하여, 최초 8 개 아미노산이 다음 서열 -PYSSDTTP-을 갖는, NNY-RANTES (2-68) 또는 AOP-RANTES (2-68)의 최초 8 개 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산의 N-말단 영역의 하나 이상에 대하여 변형을 수행하였다. 천연 발생 RANTES(1-68)의 첫째 잔기 (Ser)가 NNY-RANTES (2-68)에서 n-논아노일 치환체로, AOP-RANTES (2-68)에서 아미노옥시펜탄으로 대체되었기 때문에, 이들은 도 10A-10D에 나타난 68 개의 아미노산 잔기 야생형 RANTES 폴리펩티드 사슬 (즉, RANTES (1-68))의 아미노산 잔기 2-9에 대응한다. 그러므로, 예를 들어, NNY-RANTES (2-68)에서의 아미노산 위치 2에서 치환은 다음 일반 화학식 "NNY P2X- RANTES (3-68)"에 의하여 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일 이고, X는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 2의 프롤린에 대하여 치환된 아미노산이고, RANTES (3-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 66 개의 아미노산을 나타낸다. 다른 예로서, NNY-RANTES (268)에서의 아미노산 위치 3에서 치환은 일반식 "NNY-P-Y3X-RANTES (4-68)"로 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일이고, X 는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 3의 티로신(Y)에 대하여 치환된 아미노산이고, RANTES (4-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 65 개의 아미노산을 나타낸다. 다중 치환된 NNY-RANTES 유사체를 위하여는, 다음 예의 NNY-RANTES (2-68)의 아미노산 위치 2, 3, 및 9에서의 3개 치환에 대한 화학식이 일반 화학식 "NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES (10-68)"에 의하여 지시되고, N- 에서 C-말단 방향으로 읽을 때, 식 중 NNY 는 n-논아노일이고, X 는 NNY-RANTES (2-68)의 위치 2의 프롤린(P), 위치 3의 티로신(Y), 및 프롤린 (P)9에 대하여 치환된, 동일하거나 상이한 아미노산이고, SSDTT 는 NNY-RANTES (2-68)의 아미노산 4-8에 대응하고, RANTES (10-68)는 NNY-RANTES (2-68)의 잔여 59 개의 아미노산을 나타낸다.
다음은 제조된 NNY-RANTES (3-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-P2Aib- RANTES (3-68) 1
NNY-P2Hyp- RANTES (3-68) 2
NNY-P2Tic- RANTES (3-68) 3
NNY-P2Indol- RANTES (3-68) 4
NNY-P2P(4,4DiF)- RANTES (3-68) 5
NNY-P2Thz- RANTES (3-68) 6
NNY-P2HoP- RANTES (3-68) 7
NNY-P2△Pro- RANTES (3-68) 8
NNY-P2A- RANTES (3-68) 9
다음은 제조된 NNY-P-Y3X-RANTES(4-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-P-Y3P- RANTES (4-68) 10
NNY-P-Y3A- RANTES (4-68) 11
NNY-P-Y3L- RANTES (4-68) 12
NNY-P-Y3V- RANTES (4-68) 13
NNY-P-Y3F(3,4-DiOH)- RANTES(4-68) 14
NNY-P-Y3F(3,4-DiOH,pBzl)- RANTES(4-68) 15
NNY-P-Y3pBz- RANTES (4-68) 16
NNY-P-Y3Cha- RANTES (4-68) 17
NNY-P-Y3βNal- RANTES (4-68) 18
NNY-P-Y3Chg- RNATES (4-68) 19
NNY-P-Y3Phg- RANTES (4-68) 20
NNY-P-Y3Hof- RANTES (4-68) 21
NNY P-Y3F(F)5- RANTES (4-68) 22
NNY-P-Y3tbuA- RANTES (4-68) 23
NNY-P-Y3F(4-Me)- RANTES (4-68) 24
NNY-P-Y3tL- RANTES (4-68) 25
NNY-P-Y3CycP- RANTES (4-68) 26
NNY-P-Y3CycH- RANTES (4-68) 27
NNY-P-Y3Nle- RANTES (4-68) 28
다음 화합물은 제조된 NNY-PY-S4X-RANTES (5-68) 유사체의 예이다.
화합물
NNY-PY-S4A- RANTES (5-68) 29
NNY-PY-S4tbuA- RANTES (5-68) 30
다음 화합물은 제조된 NNY-PYS-S5X-RANTES (6-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-PYS-S5tbuA- RANTES (6-68) 31
다음 화합물은 제조된 NNY-PYSS-D6X-RANTES (7-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-PYSS-D6tbuA- RANTES (7-68) 32
다음 화합물은 제조된 NNY-PYSSD-T7X-RANTES (8-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES (8-68) 33
다음 화합물은 제조된 NNY-PYSSDT-T8X-RANTES (9-68) 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-PYSSDT-T8tBuA- RANTES (9-68) 34
다음 화합물은 NNY PYSSDTT-P9X- RANTES 유사체의 예이다.
화합물 번호
NNY-PYSSDTT-P9Hyp- RANTES (10-68) 35
NNY-PYSSDTT-P9Aib- RANTES (10-68) 36
NNY-PYSSDTT-P9△Pro- RANTES (10-68) 37
NNY-PYSSDTT-P9Thz- RANTES (10-68) 38
다음 화합물은 제조된 이중 치환 유사체 NNY-P2X-Y3X-RANTES (4-68), 및 삼중 치환 유사체 NNY P2X-Y3X-SSDTT- P9X-RANTES (10-68) 의 예이다.
화합물 번호
NNY-P2Hyp-Y3tButA- RANTES (4-68) 39
NNY-P2Thz-Y3tButA- RANTES (4-68) 40
NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES (4-68) 41
NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES (4-68) 42
NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES (10-68) 43
실시예 4: NNY-RANTES의 N-말단, N-루프 유사체
다음 화합물은, N-루프(RANTES의 잔기 12-20)가 CCR1과 CCR3를 통한 신호전달에 영향을 끼치지 않고 CCR5에 대한 효능을 증가하도록 변형된 추가적 NNY 치환-RANTES 유사체의 설명으로 의도되었다.
N-말단, N-루프 RANTES 유사체를 위하여, NNY-RANTES (2-68)에 대하여 N-루프 변형이 이루어졌는데, N-루프는 아미노산 12-20에 대응한다. RANTES의 N-루프는 아미노산 서열 -FAYIARPLP- (SEQ ID NO.: 29)을 갖는다. 그러므로 예를 들어, NNY-RANTES (2-68) 아미노산 위치 12에서의 치환은 N-으로부터 C-말단 방향으로 읽을 때, 일반 화학식 "NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz- RANTES (13-68)"을 갖고, 식 중 NNY 는 n-논아노일이고, PYSSDTTPCC 는 RANTES (1-68)의 아미노산 2-11에 대응하고, F12pBz는 RANTES (1-68)의 위치 12에서 페닐알라닌 (F)이 아미노산 유도체 pBZ로 치환된 것을 가리키고, RANTES (13-68)는 RANTES (1-68)의 잔여 아미노산 잔기 13-68을 나타낸다.
화합물 번호
NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES (13-68) 44
NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RANTES (13-68) 45
NNY-PYSSDTTPCC-F12F (4-Me)-RANTES (13-68) 46
NNY-PYSSDTTPCC-F12 (4-F)-RANTES (13-68) 47
NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES (14-68) 48
NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES (14-68) 49
NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES (15-68) 50
NNY-PYSSDTTPCCFA-Yl4Cha-RANTES (15-68) 51
NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES (16-68) 52
NNY-PYSSDTTPCCFAY-Il5S-RANTES (16-68) 53
NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES (17-68) 54
NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES (18-68) 55
NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES (18-68) 56
NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES (19-68) 57
NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES (20-68) 58
NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-Ll9Cha-RANTES (20-68) 59
NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES (21-68)60
실시예 5 : NNY-RANTES의 N-말단 RANTES 유사체
다음 화합물은 NNY 치환체 대신 상이한 지방족 사슬이 채용된 추가적 NNY 치환-RANTES 유사체의 설명을 위하여 의도되었다.
화합물 번호
CH2=CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES (2-68) 61
Nle-Met-RANTES (1-68) 62
화합물 번호
도데카노일-RANTES (3-68) 63
로릴-Hyp-RANTES (3-68) 64
화합물 번호
미리스토일-RANTES (4-68) 65
도데카노일-Hyp-RANTES (4-68) 66
실시예 6 : NNY 및 AOP-RANTES의 C-말단 및 N/C-말단 유사체
세린 잔기로 아실화된 Lys의 ε아미노기를 갖는, Lys-Gly C-말단 연장을 갖는 AOP-및 NNY-RANTES를 제조하였다. 이 유도체는 세린 연장의 페리오데이트 산화 후, 형광단(FITC, NBD, Cy5 및 BODIPY-Fl)이나 지질을 포함하는 아미노옥시아세틸-관능화 화합물과 융합시켰다. 이 C-말단 표지 키모카인은 그것의 생물학적 특성을 유지하면서, CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-0-NH2같은 지방족 부분의 도입은 키모카인의 효능을 개선시키는 것으로 나타났다. 가장 효과적인 화합물을 발견하기 위하여, 상이한 지방산과 지질을 Boc-AoANH-(CH2)2-NH2와 결합시킴으로써 아미노옥시기로 관능화시킨 후, 로레이트, 팔미테이트, 오에이트, 에이코사노에이트, 콜산 및 콜레스테릴-클로로포름을 Boc 제거시켰다. 이들 유도체의 하나 이상은 산화 NNY-RANTES-K (S) G 또는 AOP-RANTES-K (S) G에 융합시켰는데, 상기에서 AOP 유도체는 하기 예시된다:
화합물 번호
AOP-RANTES-K(로릴)-G 67
상기 중 "(로릴)"은 글록실일=AoA-에틸렌 디아민-로레이트 등에 대한 약어이다.
AOP-RANTES-K(팔미토일)-G 68
AOP-RANTES-K(에이코사노일)-G 69
AOP-RANTES-K (올레오일)-G 70
AOP-RANTES-K (콜일)-G 71
AOP-RANTES-K (콜레스테릴)-G 72
지질성 부분의 화학적 변이체 또한 다른 전략에 의하여 제조하였다. 이 같은 화합물은, 전장 폴리펩티드를 형성하기 위한 절단, 정제 및 화학적 라이게이션의 사용 전에, Fmoc-보호제거된 Boc-펩티드-Lys-Gly-수지에 대하여 지질을 부착함으로써, C-말단 단편의 수지상 화합에 의하여 합성하였다.
이들 화합물의 고안에서, 지질 결합을 사용한 두가지 주된 이유가 있었다. 첫째로, RANTES 화합물의 항 HIV-1 저해 활성이 수용체의 하향조절능과 관련된다는 점증하는 증거가 현재 있다. 이는 수용체의 재순환과 함께 초기 엔도좀에서 정상적으로 해리되어야 할 리간드-수용체 복합체가 일단 내재화되면 원형질막이나 세포질 지방산 결합 단백질과 또한 상호작용할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 리간드의 지질 변형은 단순히 소수성 상호작용에 의하여 복합체를 특이적 세포내 서브도메인으로 재표적화할 수 있고, 따라서 수용체의 재순환을 지연시킬 수 있다. 세포내 단백질 이동을 다룬 몇몇의 최근 논문은 아실화가 단백질의 계면활성제 내성 막에 대한 친화성을 증가시키는 일반적 기작이고 막을 통과하지 않는 단백질의 주요한 표적화 기작일 수 있다는 생각을 뒷받침한다. (예를 들어, Melkonian et al., JBiol. Chem. (1999) 274 : 3910-3917; Zlatkine et al., J. Cell Sci. (1997) 110 : 673-679; Zhan et al. Cancer Immunol. Immunother. (1998) 46 : 55-60 참조). 둘째로, 변형은 또한 화합물의 약물 생체 반응학적 특성을 변화시키기 위하여 수행될 수 있다. 몇몇 최근 논문은 이 개념을 뒷받침한다 (예를 들어, Honeycutt et al. Pharm. Res. (1996) 13 : 1373-1377; Kurtzhals et al. J. Pharm. Sci. (1997) 86 : 1365-1368; Marlcussen et al. Diabetologia (1996) 39 : 281-288 참조).
다음의 실시예에서 설명하는 바와 같이, 변형은 약물생체 반응학의 변화를 의도한 것이었으므로, 활성의 증강은 놀랍고도 예상치 못한 것이었다. 예상된 결과는 활성이 감소하는 것이었지만, 약물 생체 반응학의 기대한 개선은 허용되는 중간체로서 제공되었다.
실시예 7: SDF-1β의 N-말단 유사체 SDF-lα
다음 N-말단 SDF-1β(1-72) 유도체는 본 발명의 CXC 키모카인을 제조하는 일반적인 방법을 설명하기 위하여 제조하였다. 예로서, SDF-1β의 N-말단을 변형하여 N-말단에 소수성 지방족 사슬을 갖는 화합물을 생성하였다. N-말단 영역에 아미노산 유도체를, 및/또는 C-말단 영역에 지방족 사슬을 더 포함하는 화합물을 상기 RANTES 화합물에 대하여 기술한 바와 같이 제조하였다. 특히, 제한으로서가 아닌 설명으로서, Lys, Met-Lys, 카프로일-Lys, CH3-(CH2)7-C(O) 및 CH3-(CH2)4-0-NH-글리옥실일을 포함하는 적당한 N-말단 치환체를 제조하고 시험하였다. 다음 화합물은 제조된 SDF-1α와 SDF-1β 유사체의 몇몇 예이다.
화합물 번호
Lys-SDF-1 (2-72) 73
Met-Lys-SDF-1 (2-72) 74
카프로일-Lys-SDF-1 (2-72) 75
NNY-SDF-1 (2-72) 76
AOP-글리옥실일-SDF-1 (2-72) 77
실시예 8 : 스크리닝 검정
RANTES 와 SDF-1가 용도를 발견하는 특정 지시에 대한 차단 기능을 특성 결정하는 HIV-기초 검정을 사용하여, 실시예 3-7에서 제조된 RANTES 와 SDF 유사체의 몇몇과 다른 것을 길항제 활성에 대하여 스크리닝하였다. 일반적으로, 화합물을 그것의 HIV 외피-매개 세포 융합을 저해하는 능력에 대하여 예비적으로 스크리닝하는 것을 통과시켰다. 이들 화합물 중 가장 유력한 것은, 그것의 표적 세포주의 무세포 바이러스 감염을 저해하는 능력에 대하여 그에 이어서 시험하였다. SCID 마우스 모델에서 결정된 바 (Mosier et al., J. Virol. (1999) 73: 3544-3550)와 같이 세포융합 검정과 시험관내 무세포 바이러스 감염 검정이 생체내 효능의 유용한 지표인 것으로 발견되었으므로, 이들 검정을 선택하였다. 게다가, AOP-RANTES에 비교한 NNY- RANTES의 항-바이러스 효능의 증가가 CCR5에 대한 친화도의 증가 이외의 요인에 의한 것임을 발견하였으므로, 화합물을 CCR5에 대한 친화도가 아닌 세포 융합 검정에서의 능력 관점에서 평가하였다.
실시예 9: 외피-매개 세포융합 검정
CD4와 CCR5를 함유하고 수용체 시스템을 갖는 세포외 융합된 바이러스 외피 단백질에 대하여 조작된 세포를 사용하여, 실시예 3-7에서 제공된 일련의 화합물의 CCR5-의존 세포융합을 저해하는 능력을 측정하였다. M. Alizon (Paris)에 의하여 친절하게 제공된 HeLa-PSL 과 HeLa-Env-ADA 세포주를 사용하여, 본질적으로 Simmons et al. (Science (1997) 276: 276-279)에 기재된 바와 같이 CCR5-반응성 바이러스 외피-매개 세포 융합 검정을 수행하였다. 요약하여 기재하면, HeLa-P5L 세포를 96-웰 플레이트에 접종하였다(100 ㎕에 104개 세포). 24 시간 후에 배지를 제거하였고 웰당 104HeLa-Env-ADA 세포와 키모카인을 함유하는 배지를 첨가하였다 (최종농도 200 ㎕). 추가적 24 시간 배양 후, 세포를 PBS에서 세척하였고, 50 ㎕의 PBS/0.5 % NP-40에서 15 분 동안 실온에서 용해시켰다. 세포용해물을 50 ㎕ 2X CPRG 기질(16 mM 클로람페니콜 레드-p-D-갈락토피라노시드 ; 120 mM Na2HP04, 80 mM NaH2P04, 20 mM KCI, 20 mM MgS04, 및10 mM β 메르캅토에탄올)의 첨가에 의하여 β-갈락토시다제 활성에 대하여 검정한 후, 어두운 곳에서 실온에서 1-2 시간동안의 인큐베이션을 수행하였다. 그 후 575 nm에서의 흡광도를 Labsystems 마이크로플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 이들 값으로부터, 각 저해 농도에서 저해 백분률[100 x (OD(test)-OD(네거티브 대조표준)/ OD(포지티브 대조표준)-OD(네거티브 대조표준))]을 계산하였다. 저해 농도에 대한 백분률 융합 제해의 플롯팅에 의하여 각 화합물에 대한 IC50값의 계산이 허용된다.
유의하게, 대부분의 시험된 화합물은 야생형 RANTES에 상대적으로 더 큰 효능을 나타내었다. 선택된 RANTES 길항제 유사체에 대한 결과는 하기 표 1에 나타낸다.
세포융합 스크리닝
N-말단 변형 NNY-RANTES
화합물 번호 평균 상대 효능
19 7
23 7
40 4
42 2
NNY-RANTES(대조 표준) 18-25
N-루프 변형 NNY-RANTES
화합물 번호 평균 상대 효능
54 15
57 15
58 13
59 14
NNY-RANTES(대조표준) 18-25
C-말단 변형 AOP-RANTES
화합물 번호 평균 상대 효능
68 45
AOP-RANTES(대조표준) 100
표 1에서, 평균 상대 효능에 대하여, 서로 다른 날에 수행된 실험에 따라 비록 활성의 순위는 일정하게 유지되지만, 융합 검정에서의 IC50의 절대값은 변화한다. 결과를 표준화하기 위하여, AOP-RANTES를 대조표준으로 각 실험에서 사용하였다. 그러므로, 각 실험에서 IC50은 AOP-RANTES의 값에 대하여 샹대적으로 표현하였는데, 100에 대한 임의값으로 제공하였다. 시험된 대부분의 모든 화합물은 야생형 RANTES에 비하여 상대적으로 더 큰 효능을 보였지만, 화합물 번호 19, 23, 40 및 42 같은 어떤 화합물의 효능은 일련의 희석중 가장 낮은 희석에서 조차도 50 % 저해 이상이 되었다.
실시예 10: 무세포 바이러스 감염 검정
외피 세포주를 살아있는 R5-반응성 바이러스로 대체한 것을 제외하고는 외피-매개 세포 융합 검정에서와 같은 방식으로 무세포 바이러스 검정을 수행하였다. (T. Schwartz, Copenhagen에 의하여 친절하게 제공된, 7) HEK293-CCR5 세포를 24 웰 플레이트에 접종하였다(1.2 x 105세포/웰). 하룻밤 인큐베이션 후, 4 ℃에서 0.5 ml의 '결합 완충액'(1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, and 0.5% (w/v)소 혈청 알부민으로 보충된 50 mM HEPES, pH 7.4)내에서 12 pM [125I] MIP-l-α (Amersham) 더하기 다양한 양의 비표지 리간드를 사용하여 3 시간 동안 전체 세포에 대하여 경쟁적 결합을 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 0.5 M NaCl로 보충된 빙냉의 결합 완충액으로 신속하게 네 차례 세척하였다. 세포를 1 ml의 3 M 아세트산, 8 M 요소 및 2% NP-40에서 용해시켰다. 용해물을 Beckman Gamma 4000 신틸레이션 카운터를 사용하여 1 분간 계수하였다. 두차례 반복 측정을 하였고, Prism 소프트웨어를 사용하여 적합화된 1차원적 농도 저해 곡선으로부터 IC50값을 구하였다. 표 2는 화합물 번호 19와 23에 의한 예비적 스크리닝에서 나타난 NNY-RANTES에 대비한 효능의 증가를 나타낸다.
무세포 바이러스 감염 검정으로부터 선택된 화합물에 대한 시험관내 감염 데이터
AOP-RANTES NNY-RANTES 화합물 23 화합물 19
실험 IC50감염도 결과 140 32 17 15
47 8 3.8 34
260 26 28 9.9
135 30 14 12
평균 감염도IC50 145 pM 24 pM 14 pM 12 pM
비교를 위한 세포융합 결과 480 pM 97 pM 38 pM 26 pM
실시예 11: 항 CCR5 및 항-CXCR4 화합물에 의한 처리의 조합
다음 예는 HIV 감염을 차단하고 HIV 균주인 R5의 X4 균주로의 잠재적 전환을 차단하기 위하여 항 CCR5(예를 들어, NNY-RANTES) 및 항-CXCR4(예를 들어, SDF-1 길항제 또는 AMD 3100)를 조합하여 채용하는 것의 보호 효과를 설명한다. SCID 마우스 모델을 이 목적에 사용하였다. 특히, NNY-RANTES 와 (작은 유기분자 항-X4 약제인) AMD 3100의 보호 효과는 Mosier, Adv. Immunol. (1996) 63: 79-125; Picchio, et al., J Virol. (1997) 71: 7124-7127; Picchio, et al., J. Virol. (1998) 72: 2002-2009; 및 Offord et al., WO 99/11666에 기재된 방법을 따라, SCID 마우스에서 시험하였고, 인간 말초혈 백혈구로 재집단화하였고, HIV-1으로 항원자극하였다. NNY-RANTES는 표 X와 같이 투여하였고, AMD 3100은 200 mg/ml 용액으로서 사용하였다. 항원자극은 AMD 3100 군 단독에 대한 경우를 제외하고는 R5 HIV 바이러스로 수행하였다. 조합 치료에서는 탈출 변이체는 관찰되지 않았고, 적합하게 치료된 마우스 모두가 실험 전 과정을 통하여 바이러스가 없는 상태였다. 이는 본 발명의 N-, C- 및 N-/C-말단 RANTES 유도체가, 포유 동물에서 HIV 감염을 차단하기 위하여 여기에 기재된 것과 같은 AMD 3100이나 SDF-1 길항제 같은 항-X4균주 화합물과 조합하여 사용될 수 있다는 것을 가리킨다.
실시예 12: RANTES 유도체 G1755-01의 제조
도 11에 도시된 RANTES 유도체 G1755-01는 다음과 같이 제조하였다.
1. AOP-[RANTES (2-33)]-티오에스테르의 제조
서열 : 아미노옥시펜탄-글리옥tkf일-PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GK-티오에스테르 (SEQ ID NO. : 30)
티오에스테르 형성 수지(Hackeng, et al., PNAS (1999) 96: 10068-10073)상의 RANTES (2-33) 서열의 조립에 의하여, N-말단 아미노옥시펜탄-글리옥살일 옥심 부분(AOP)을 함유하는 N-말단 펩티드 단편 AOP- [RANTES (2-33)]-α티오에스테르 (-C(O)SR라고도 표시되는 티오에스테르)를 합성하였고, 그 후 표준 프로토콜(Wilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (1) : 43-51)에 따른 아미노옥시펜탄-글리옥살일 옥심 부분[즉, CH3 (CH2) 4-O-N=CHCOOH]의 수지에의 직접 결합에 의하여 N-말단에서 변형되었다. 펩티드-수지는 불화수소로 절단되고 역상 HPLC에 의하여 정제되어 α-카르복시 티오에스테르 펩티드 AOP-RANTES(2-33)-티오에스테르를 생성하였다. 관측 질량 = 4179.64 Da이고; 계산 질량 = 4178.57 Da (평균 동위원소 조성물)이다.
2. [RANTES (34-68)]-Lys69(GP6)-Leu70 의 제조
서열 :
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK (GP6) L (SEQ ID NO. : 31)
서열 중 GP6 은 Lys 69의 εN:
에 결합한다.
a. 고체상 펩티드 및 {펩티드 수지}-상 수용성 폴리머 합성
C-말단 펩티드 단편 [RANTES (34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70 을, Schnolzer, et al, Int. J. Pep. Protein Res. 40: 180-193에 기재된 Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 원위치 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여 종래 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상 고체상 펩티드 합성에 의하여 합성하였다.
사슬 조립의 완성 후에, DMF 중 20 % 피페리딘 처리로 Lys 69의 ε질소상의 Fmoc 기를 보호 펩티드-수지로부터 제거하였다. 그 후 숙신산 안히드리드 (Succ)를 DIEA를 함유하는 DMF 중의 HOBT (히드록시벤조트리아졸) 용액에서 Lys 69의 ε질소에 결합시켰다. 세척 후, 수지-결합 숙신산의 자유 카르복실기를 DMF 중의 카르보닐디이미다졸의 첨가에 의하여 활성화시켰다. 다른 한차례 세척 순환 후, DMF중 HOBT중 50 %(4, 7, 10)-트리옥사트리데칸-1,13디아민(TTD)을 첨가하였다. 세척후, 수지-결합 폴리머를 다음 주기의 숙신산 안히드리드 결합/CDI 활성화/TTD 결합을 위하여 준비하였다. 6 차례 주기 후, 숙신산 안히드리드를 HOBT/DMF=DIEA 용액 중에서 마지막 TTD 아민에 결합시켜 아미드 결합 (Succ-TTD)6-Succ-OH 폴리머를 갖는 Lys69 변형 화합물을 제조하였다.
펩티드/선형 수용성 폴리머 수지를 불화 수소로 수지로부터 절단하였고, 산물을 역상 사전준비 HPLC로 정제하여 [RANTES (34-68)]-Lys69 (GP6)-Leu70를 제조하였다. 관측 질량 = 6253 Da이고 ; 계산 질량 = 6252 Da (평균 동위원소 조성물)이다.
3. G1755-01의 제조
서열 :
아미노옥시펜탄-글리옥살일-PYSSDTTPCC
FAYIARPLPR AHIKEYFYTS GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA
NPEKKWVREY INSLEMSK (GP6) L (SEQ ID NO. : 32)
상기된 N-말단 및 C-말단 모두 비보호된 펩티드 단편을, Dawson et al, Science 266: 776-779 (1994)에 기재된 바와 같이 천연 화학 라이게이션에 의하여 함께 연결하였다. 환원형의 전장 폴리펩티드 산물을 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 대 물의 선형 구배로 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 관측 질량 = 10,060 Da이었다.
GP6가 부착된 전장 폴리펩티드를, 시스테인-시스틴 산화환원 짝을 함유하는 수성 완충액 내에서 부수적인 2 개의 이황화 결합의 형성으로 폴딩시켰고, 역상 HPLC에 의하여 표준 프로토콜(Wilken et al., Chemistry & Biology (1999) 6 (1) : 43-51)에 따라 정제하였다. 폴딩된 산물은 HPLC 상에서 균질이었다. 관측 질량 = 10,056 Da이고; 계산 질량 = 10,058 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
실시예 13: RANTES 유사체 G1755의 제조
도 12에 도시된 G1755 화합물을 다음과 같이 합성하였다.
1. n-논아노일-RANTES (2-33)의 제조
서열:
n-논아노일-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-티오에스테르 (SEQ ID NO. : 33)
상기한 바와 같이 티오에스테르-제조 수지 상에서 n-논아노일-RANTES (2-33)를 제조한 후, n-논아노익산의 수지에 대한 직접 결합에 의하여 N-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고 역상 HPLC에 의하여 정제하여 n-논아노일-RANTES (2-33)를 제조하였다. 관측 질량 = 4177 Da이고; 계산 = 4177.62 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
2. RANTES (34-68)-Lys69(GP6)-Leu70 의 제조
서열:
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEMSK (GP6) L (SEQ ID NO. : 34)
a. 고체상 펩티드 및 {펩티드 수지}-상 수용성 폴리머 합성
상기된 바와 같이, C-말단 펩티드 단편 [RANTES (34-68)]-Lys69(Fmoc)-Leu70 을, Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 원위치 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여 종래 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상 고체상 펩티드 합성에 의하여 합성하였다.
사슬 조립의 완성 후에, Lys 69의 ε질소상의 Fmoc 기를 보호 펩티드-수지로부터 제거하였고 GP6 구성체를 상기한 바와 같이 펩티드 수지상에서 합성하였다. 펩티드/선형 수용성 폴리머 수지를 불화 수소로 수지로부터 절단하였고, 산물을 역상 사전준비 HPLC로 정제하여 [RANTES (34-68)]-Lys69 (GP6)-Leu70를 제조하였다. 관측 질량 = 6252.87 Da이고 ; 계산 질량 = 6252.24 Da (평균 동위원소 조성물)이다.
3. G1755의 제조
서열:
논아노일-PYSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY
INSLEMSK (GP6) L (SEQ ID NO. : 35)
a. 천연 화학 라이게이션에 의한 전장 폴리펩티드의 조립
N-말단 및 C-말단 모두 비보호된 펩티드 단편을 실시예 18에서 상기된 바와 같이 천연 화학 라이게이션에 의하여 함께 연결하였다. 환원형의 전장 폴리펩티드 산물을 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 대 물의 선형 구배로 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 관측 질량 = 10060.74 Da; 계산 질량 = 10058.67 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
b. 수용성 폴리머에 의하여 변형된 폴리펩티드의 폴딩과 정제
GP6가 부착된 전장 폴리펩티드를, 시스테인-시스틴 산화환원 짝을 함유하는 수성 완충액 내에서 부수적인 2 개의 이황화 결합의 형성으로 폴딩시켰고, 상기된 바와 같이 역상 HPLC에 의하여 표준 프로토콜에 따라 정제하였다. 폴딩된 산물은 HPLC 상에서 균질이었다. 관측 질량 = 10057.43 Da이고; 계산 질량 = 10054.67 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
실시예 14: RANTES 유사체 G1805의 제조
도 13에서의 G1805 화합물을 다음과 같이 제조하였다.
1. n-논아노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)-티오에스테르의 제조
서열:
논아노일-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-thioester (SEQ ID NO. : 36)
서열 중 X= L-시클로헥실글리신 (Chg)
상기한 바와 같이 티오에스테르-제조 수지 상에서 n-논아노일-RANTES(2-33)(Tyr3Chg)를 제조한 후, n-논아노익산의 수지에 대한 직접 결합에 의하여 N-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고 역상 HPLC에 의하여 정제하여 n-논아노일-RANTES (2-33)(Tyr3Chg)를 제조하였다. 관측 질량 = 4151.98 Da이고; 계산 = 4152.6 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
2. RANTES (34-68) (Met67Lys (Lev))-Lys69-Leu70의 제조
서열:
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK (Lev) SKL (SEQ ID NO. : 37)
상기된 바와 같이 RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Fmoc)-Leu70 을 Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 원위치 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여 종래 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상 고체상 펩티드 합성에 의하여 합성하였다.
사슬 조립의 완료 후에, DMF 중 20 % 피페리진 처리로 Lys 67의 ε질소상의Fmoc 기를 보호 펩티드-수지로부터 제거하였다. 레불린산을 대칭 1,3-디이소프로필카르보디-이미드로 활성화시키고 Lys 67의 ε질소에 결합시켰다. 펩티드-수지를 불화 수소로 수지로부터 절단하였고, 산물을 역상 사전준비 HPLC로 정제하여 RANTES (34-68) (Met67Lys (Lev))-Lys69-Leu70을 제조하였다. 관측 질량 = 4433.22 Da이고 ; 계산 질량 = 4434.19 Da (평균 동위원소 조성물)이다.
3. G1805의 제조
서열:
논아노일-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY
INSLEK (Lev-GP29) SKL (SEQ ID NO. : 38)
서열 중, X= L-시클로헥실글리신 (Chg)이고, GP29 = 도 13과 14에 도시된 분지 옥심-결합 수용성 폴리머 구성체이다.
a. 천연 화학 라이게이션에 의한 전장 폴리펩티드의 조립
N-말단 및 C-말단 모두 비보호된 펩티드 단편을 상기된 바와 같이 천연 화학 라이게이션에 의하여 함께 연결하였다. 환원형의 전장 폴리펩티드 산물을 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 대 물의 선형 구배로 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 관측 질량 = 8213.62 Da; 계산 질량 = 8216.64 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
b. 수용성 폴리머 GP29의 합성
i. 다중 티올기를 함유하는 주형 GRFNP17의 합성
아미드 생성 (4-메틸)벤즈히드릴아민(MBHA)-수지상에서 0.4mmol 규모로 분지 코어 주형 GRFNP17을 수동적으로 합성하였다. 표준 결합 프로토콜(Schnolzer, M., Int J PeptProtein Res. (1992) 40: 180-93)을 사용하여, Boc-Lys(Fmoc)-OH를 결합시켰다. 2.1 mmol 아미노산, 3.8 ml 0.5 M HBTU 중의 10% DIEA; 즉, 5-배 과량의 아미노산. Fmoc 보호기 제거 후, 표준 아미노산 결합 프로토콜(2.1 mmol 아미노산, 3.8 ml 0.5 M HBTU 중의 10% DIEA; 즉, 5-배 과량의 아미노산)을 사용하여, Fmoc-Lys (Fmoc)-OH를 결합시켰다. Fmoc 제거 단계 후, Fmoc-Lys (Fmoc)-OH 를 표준 아미노산 프로토콜 (4.2 mmol 아미노산, 7.6 ml 0.5 M HBTU 중의 10% DIEA; 즉, 자유 아민에 비교하여 5-배 과량의 아미노산)을 사용하여, 결합시켰다. 최종 Fmoc 보호제거 단계 후, DMF 중의 (자유 아민에 비교하여) 5-배 과량 S-아세틸 티오글리콜산 펜타플루오로페닐 에스테르(SAMA-oPfp)에서 30 분간 결합시켰다. 순수한 TFA로 1회분씩 두 차례 세척하여 C-말단 리실 잔기의 t-Boc 보호기를 제거한 후, DMF 중의 10% DIEA로 세척함에 의하여 수지를 중화하였다. 2 mmol Boc-아미노옥시아세트산과 2 mmol N-히드록시숙신이미드 (NHS)를 3 ml DMF에 용해시켰다. 2 mmol DIC (디이소프로필카르보디이미드)의 첨가 후, 산을 30 - 60 분 동안 활성화시켰다. 용액을 중화된 수지에 첨가시켜서 1 시간 동안 결합시켰다. 마지막으로, S-결합 아세틸기를 DMF 중의 20 % 피페리딘에서 30 분 동안 제거하였다. 주형을 보호제거시키고 동시에 HF/p-크레졸을 사용하여 표준 Boc-화학 과정에 따라 자유 알데히드에 대한 스케빈저로서 시스테인의 존재하에서 수지 지지체로부터 절단시켰다 (Schnolzer, M., Int JPept Protein Res. (1992) 40: 180-93). (알데하이드 없는) 50% B [즉, 0.1%TFA 중의 50% 수성 아세토니트릴] 중의 회복 폴리아미드를 동결시키고 동결건조하였다. 정제를 위하여, 주형 미정제 산물을 2 ml 50 % B에 용해시켰고, 100% A [즉 수중 0.1% TFA]를 첨가하여 샘플을 희석시켰다 (알데히드의 첨가가 보장되므로, 구아니디늄 클로리드나 아세테이트 첨가를 피할 것). T = 40 ℃, 3 % B에서 평형화된 C4 사전준비 역상 HPLC 컬럼상에 주형을 로딩하였다. 염을 등용매 용리시키고 소망의 주형인 GRFNP17 을 선형구배에서 정제하였다. 소망의 산물을 함유하는 분획을 ES-MS에 의하여 확인하고, 수집하여 동결건조시켰다.
ii. 분지된 수용성 폴리머 GRNP29의 합성
정제된 티올-함유 주형 GRFNP17과 선형 폴리머 GRFNP31,Br-아세틸-(TTD-Succ)12의 티오에스테르-생성 라이게이션에 의하여, 분자량 15kD의 분지(TTD-Succ)12폴리머인 GRNP29를 티오에테르-생성 라이게이션에 의하여 합성하였는데, GRFNP31은 표준 프로토콜 (Rose, K. et al., U. S. Patent Application Serial No. 09/379,297 ; Rose, et al., JAm Chem Soc. (1999) 121: 7034)에 따라 사스린 카르복실-생성 수지 상에서 합성시키고, 브로모아세틸화시키고, 정제하였다.
(전체 티올에 비교하여)1.3x 몰 과량의 정제된 GRFNP31, Br-아세틸화 (EDA-Succ)12과, 정제된 티올-함유 주형 GRFNP17을 약 10 mM 농도에서 0.1 M Tris-HCl/6 M 염화구아니듐, pH 8.7에 함께 용해시켰다. 용해 후, 용액을 0.1 M Tris-HC1, pH 8.7 완충액에서 3배(v/v) 희석시켰다. 라이게이션 혼합물을 실온에서 교반하였고 반응물은 역상 HPLC와 ES/MS에 의하여 모니터링 하였다. 소망의 산물이 주요 산물이 될 때까지, 추가적 GRFNP31 반응물질을 주성분에 필요에 따라 첨가하였다. 정밀검사를 위하여, 3x (라이게이션 혼합물에 대하여 v/v) 0. 1M 아세테이트/6 M 염화 구아니듐, pH 4 을 첨가하였고, 용액을 사전준비 C4 역상 HPLC 컬럼에 로딩하고, 선형구배로 정제하였다. 순수한 GRFNP29 구성체를 함유하는 분획을 ES-MS를 사용하여 확인하고, 수집하여 동결건조시켰다.
c. 라이게이션된, 전장 폴리펩티드를 GP29에 부착
동결건조된 전장 폴리펩티드를 50 % 수성 에세토니트릴 함유 0.1% TFA 중의 동일몰량의 아미노옥시아세틸(AOA)-함유 분지 수용성 폴리머 구성체 GP29에 용해시키고 공-동결건조시켰다. 건조 분말을 용해시키고 역상 HPLC에 의하여 정제한 후, 위치 67의 리신의 변형된 곁사슬상 케토 관능기에 옥심결합에 의하여 GP29가 공유부착된 전장 폴리펩티드를 생성하였다. 사전준비 구배 C4 역상 HPLC에 의하여 폴리머-변형 펩티드를 비변형 펩티드와 비반응 폴리머로부터 분리하였다. 소망의 폴리머-변형 산물을 함유하는 분획은 ES-MS를 사용하여 확인하고, 수집하였다. 관측 분자량 = 23,835.92 Da이고; 계산 분자량 = 23,844.64 Da (평균 동위원소 조성물)이었다. 대안으로, GP29를 폴리펩티드 폴딩 후 공유적으로 부착하였지만, 이것은 낮은 수율을 야기하였다.
d. 옥심-결합 GP29을 함유하는 폴리펩티드의 폴딩과 정제
GP29 부착된 전장 폴리펩티드를, 상기한 바와 같이 시스테인-시스틴 산화환원 짝을 함유하는 수성 완충액 내에서 부수적인 2 개의 이황화 결합의 형성으로 폴딩시켰고, 역상 HPLC에 의하여 정제하였다. 폴딩된 산물은 HPLC 상에서 균질이었다. 관측 질량 = 23,832 Da이고; 계산 질량 = 23,840 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
실시예 15: RANTES 유사체 G1806의 제조
도 14에 도시된 RANTES 유사체인 G1806을 다음과 같이 합성하였다.
1. n-논아노일-RANTES (2-33)(Tyr3Chg)-티오에스테르의 제조
서열:
논아노일-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GK-티오에스테르 (SEQ ID NO. : 39)
서열 중 X= L-시클로헥실글리신 (Chg)
상기한 바와 같이 티오에스테르-제조 수지 상에서 n-논아노일-RANTES (2-33) (Tyr3Chg)-티오에스테르 (티오에스테르는-COSR라고도 표시되고, 식중 R는 알킬기이다)를 제조한 후, n-논아노익산의 수지에 대한 직접 결합에 의하여 N-말단에서 변형시켰다. 펩티드 수지를 불화수소로 절단하고 역상 HPLC에 의하여 정제하여 n-논아노일-RANTES (2-33)Tyr3Chg를 제조하였다. 관측 질량 = 4151.98 Da이고; 계산 = 4152.6 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
2. RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69(Palm)-Leu70의 제조
서열:
CSNPAVVFVT RKNRQVCANP EKKWVREYIN
SLEK (Lev) SK (Palm) L (SEQ ID NO. : 40)
서열중 K(lev)는 야생형 RANTES로부터 Met67Lys 변화된 Lys67의 레불린산-변형 ε질소이고; K (Palm)은 구조:
[ε질소 Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3
를 갖는 아미노-옥타노 부분을 통하여 부착된 Lys69의 팔미테이트-변형 ε질소이다.
상기된 바와 같이 RANTES(34-68)(Met67Lys)-Lys69(Palm)-Leu70 을 Boc 화학 고체상 펩티드 합성에 대한 원위치 중화/HBTU 활성화 프로토콜을 사용하여 종래 Boc-Leu-OCH2-Pam-수지 상 고체상 펩티드 합성에 의하여 합성하였다. 위치 69에서 Boc-Lys(Fmoc)-OH를 결합 한 후에, DMF 중 20 % 피페리진 처리로 Fmoc 기를 제거하였다. Fmoc-8-아미노-옥타노산을 HBTU/DIEA 로 활성화시켰고 Lys69의 ε질소에 결합시켰다. Fmoc기 제거 후, 팔미트산을 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HATU)과 1,3-디이소프로필카르보디-이미드로 활성화시켜 수지에 결합시켰다. 그 후, 상기 표준 Boc 화학 SPPS 방법을 사용하여 사슬 조립을 완료하였다. 사슬조립 완료 후, Lys 67의 ε질소상의 Fmoc기를 DMF 중 20 % 피페리진 처리로 제거하였다. 레불린산을 대칭 1,3-디이소프로필카르보디-이미드로 활성화시키고 Lys 67의 ε질소에 결합시켰다. 펩티드/선형 수용성 폴리머 수지를 불화 수소로 수지로부터 절단하였고, 산물을 역상 사전준비 HPLC로 정제하여 RANTES(34-68)(Met67Lys(Lev))-Lys69 (Palmitate)-Leu70을 제조하였다. 관측 질량 = 4813.72 Da이고 ; 계산 질량 = 4813.81 Da (평균 동위원소 조성물)이다.
3. G1806의 제조
서열:
논아노일-PXSSDTTPCC FAYIARPLPR AHIKEYFYTS
GKCSNPAVVF VTRKNRQVCA NPEKKWVREY INSLEK (Lev-
GP29) SK (Palm) L (SEQ ID NO. : 41)
서열 중 X= L-시클로헥실글리신 (Chg), 팔미테이트 ("Palm") 지방산은 아미노-옥타노 부분:
[ε질소 Lys69]-C(O)-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-C(O)-(CH2)14-CH3
을 통하여 부착된다.
a. 천연 화학적 라이게이션에 의한 지방산 변형 전장 폴리펩티드의 조립
N-말단 및 C-말단 모두 보호 제거된 펩티드 단편을 실시예 18에서 상기된 바와 같이 천연 화학 라이게이션에 의하여 함께 연결하였다. 환원형의 전장 폴리펩티드 산물을 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유하는 아세토니트릴 대 물의 선형 구배로 역상 HPLC를 사용하여 정제하였다. 관측 질량 = 8598.21 Da; 계산 질량 = 8596.27 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
b. 수용성 폴리머 GP29를 라이게이션된, 지방산 변형 전장 폴리펩티드에 부착
동결건조된 전장 폴리펩티드를 동일 몰량의 AOA-함유 분지 폴리머 GP29에 용해시키고 공-동결건조시켰다. 건조 분말을 용해시키고 역상 HPLC에 의하여 정제한 후, 위치 67의 리신의 변형된 곁사슬상 케토 관능기에 옥심결합에 의하여 GP29가공유부착된 전장 폴리펩티드를 생성하였다. 관측 분자량 = 24217 Da이고; 계산 분자량 = 24,224 Da (평균 동위원소 조성물)이었다. 대안으로, GP29를 폴리펩티드 폴딩 후 공유적으로 부착하였지만, 이것은 낮은 수율을 야기하였다.
c. 옥심 결합 GP29 와 지방산을 함유한 폴리펩티드의 폴딩과 정제
GP29 부착된 전장 폴리펩티드를, 상기한 바와 같이 시스테인-시스틴 산화환원 짝을 함유하는 수성 완충액 내에서 부수적인 2 개의 이황화 결합의 형성으로 폴딩시켰고, 역상 HPLC에 의하여 정제하였다. 폴딩된 산물은 HPLC 상에서 균질이었다. 관측 질량 = 24210.10 Da이고; 계산 질량 = 24,220.17 Da (평균 동위원소 조성물)이었다.
도 15는 최종 폴딩된, 전제된 합성 Rantes 유사체의 대표적 분석 데이터를 나타낸다. 특히, 환원(R) 및 비환원(N) 조건 하에서의 야생형 (Wt) RANTES 대 합성 키모카인 유사체 RANTES G1806의 상대적 분자량을 비교하는 대표적 SDS-PAGE 겔이 도 15에 나타난다. 상대적 분자량은 각 겔의 좌측에 도시되는데, 이는 동일한 겔상에 전개되는 분자량 표준에 대응한다(나타내지 않음). 폴딩된, 정제 G1806 산물의 전형적 RP-HPLC 크로마토그래피가 또한 나타난다. 이는 야생형, 천연 RANTES에 비교하여 정의 폴리머-변형 구성체의 순도와 증가된 상대 분자량을 나타낸다
실시예 16: G1755-01, G1755, G1805 및 G1806에 대한 세포 융합 검정
다양한 폴리머-변형 RANTES 유사체의 항-HIV 활성을 시험하기 위하여 세포융합 검정을 수행하였다. 채용된 방법은 실시예 9에 기재된다. 대표적인 결과가 하기 표 3 에 도시된다.
HeLa P4-CCR5/HeLa-Env-ADA 세포융합 데이터
화합물 EC50
AOP-RANTES (2-68) 1.81 x 10-9M
NNY-RANTES (2-68) 3.23 x 10-10M
RANTES G1755-01 11. 00 x 10-9M
RANTES G1755 1.87 x 10-9M
RANTES G1805 1.40 x 10-9M
RANTES G1806 2.98 x 10-10M
이들 결과는 선형 또는 분지 수용성 폴리머 구성체에 의한 부위-특이적 변형에 이은 항-융합 활성의 실질적인 유지를 나타낸다. 지방산 같은 소수성 부분이 C-말단에 부착하였을 때 다양한 RANTES 유사체의 활성의 증가가 관찰되는 것을 감안한다면, 이 결과는 놀라운 것이었고, 이는 RANTES 유사체의 소수성 정도를 증가시키는 것이 일반적으로 항-융합 활성을 증가시킬 것이라는 것을 뒷받침하였다. 반대로, 변형을 위하여 사용된 수용성 폴리머, 특히, 분지 수용성 폴리머는 매우 친수성이고 음전하를 띠지만, 생체내 활성을 추구하는 표적 효능 범위 내에 충분히 들어가는 아주 소량의 활성 감소가 관찰되었다. 작고, 선형인 수용성 폴리머 구성체에 비교하여 크고 음전하를 띤 분지 수용성 폴리머 구성체로 변형된 RANTES 유사체의 상대적 활성 유지, 및 작은 선형 폴리머 및 큰 분지 폴리머 변형된 유사체가 활성에 대하여 실질적으로 동일한 효과를 가졌다는 것은 더 예상치 못한 것이었다. 이 후자의 관찰은 부분적으로는 수용성 폴리머 변형이, 고안될 때, 야생형 RANTES 응집부위의 부가 C-말단 잔기에 대한 내부에 만들어질 때의 항-응집 특성 및/또는 수용성 폴리머의 편재된 항-융합 특성 때문인 것으로 믿어진다.
추가적 효능-증가 변화는, AOP-RANTES 와 NNY-RANTES에 비교한 수용성 폴리머의 부착으로부터의 소량의 활성 손실을 보상하였다. 이들 변화는 N-말단에 하나 이상의 소수성 아미노산 유도체의 도입, 및 C-말단에 소수성 지방산의 첨가를 포함한다. 이들 결과는 단일확산 폴리아미드 에틸렌 폴리머(또는 다른 수용성 폴리머)와 조합한 추가적 변화가, N-말단에 대한 조합된 Pro2Thz 와 Tyr3Chg 변화 및/또는 C-말단에 지질 부분의 첨가를 갖는 AOP-나 NNY-RANTES 같은 AOP-형 변형 키모카인 분자의 전체적 효능을 개선시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 17: G1755, G1805, 및 G1806 에 대한 약물 생체 반응학
수컷 Sprague-Dawley 래트에 대하여 다음과 같이 폴리머-변형 RANTES 유사체의 약물 생체 반응학을 수행하였다. (대조군으로서 AOP-RANTES와 함께) 상기한 바와 같이 제조된 RANTES 유사체 G1755, G1805, 및 G1806를 pH 7.0에서 인산 완충 식염수 중의 동결건조 단백질 스톡으로부터 접종 직전에 정맥내 (IV) 주사용으로 조제하였다. 동일 몰투여량의 RANTES 유사체가 각 시험 동물에 제공되도록 제제를 제조하였다 [400 ㎍/kg (AOP-RANTES); 510 ㎍/kg (G1755) ; 1210 ㎍/kg (G1805) ; 및 1225 ㎍/kg (G1806) (㎍ 유사체/kg 동물)]. 최종 농도는 각 동물에 대하여 전체 투여 부피 1ml/kg을 제공하는 것이 필요한 경우(즉, 투여 부피가 일정하게 유지되었던 경우)에 조정하였다. 각 조제 유사체를 실험 제 1 일에 래트의 꼬리를 통하여 정맥내 투여하였고, 각 동물은 단일 투여량을 받았다.
주사 후에, 실험 진행에 따라 각 샘플 채집 시점에 꼬리 정맥/동맥으로부터 약 0.25 ml 혈을 수집하였고, 표준 프로토콜과 국립위생연구소 동물 보호 지침서및 추천되는 시험방법에 따라 EDTA를 항응집제로서 사용하여 혈장과 형청 샘플을 제작하였다. 샘플 채집 시각을 최초 데이터 수집에 기초하여 조정하여 (국립위생연구소 동물보호 지침서에 의하여 확립된 바와 같이) 어떤 동물에서도 3 주 이내에 0.25 ml 샘플 14 개 초과의 수집은 피하였다. 검출성 혈 수준이 최초 샘플 이상으로 유지될 때, 매주 간격으로 추가적 샘플을 수집하였다. 각 RANTES 유사체의 혈장 농도는 각 시점에서 QuantikineElisa, Human RANTES Immunoassay, (R & D Systems Catalog#DRN00)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 실험 전과정을 통하여, 체중, 식습관, 배설, 외양 등 동물의 전반적 건강을 모니터하였고, 겉보기 부작용은 관찰되지 않았다. 대표적인 결과는 도 16에 도시된다.
이들 결과는, 다양한 전구체 RANTES 유사체에 대한 수용성 폴리머 부착에 의하여 순환 반감기의 실직적 증가를 나타내고, 겉보기 반감기의 증가는 G1805 > G1806 > G1755 > AOP-RANTES 순서였다. AOP-RANTES에 비하여, 증가는 G1805의 경우 40 배, G1806의 경우 20 배, G1755의 경우 10 배였다. 일괄하여, 수용성 폴리머 변형 RANTES 유사체에 대한 높은 효능의 유지와 유의한 순환 반감기의 증가의 균형은, 이들 화합물의 치료적 효율을 증강시키고 치료에 필요한 투여의 횟수와 양을 감소시킬 것으로 예상된다.
본원 명세서에 언급된 모든 간행물과 특허 출원은, 각 간행물과 특허출원이 구체적으로 개별적으로 참고문헌으로써 수록되도록 지시된 것처럼, 여기에 참고문헌으로써 수록된다.
본 발명은 여기에 완전히 기재되고 있고, 첨부된 청구범위의 요지와 범위에서 벗어나지 않고 그것에 대하여 많은 변화와 변형이 가해질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (47)

  1. 부착된 수용성 폴리머를 갖고, 결합하는 키모카인 수용체의 하향조절을 특징으로 하는 시험관내 생물활성을 갖는 합성 키모카인.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 상기 수용성 폴리머가 없는 상기 키모카인에 비교하여 10 배보다 더 큰 생체내 혈청 순환 반감기를 갖는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 (A) 그것의 N-말단에서 지방족 사슬, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로; 또는 (B) 그것의 C-말단에서 지방족 사슬, 폴리사이클릭, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로; 또는 (C) 그것의 N-말단에서 지방족 사슬, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분 및 그것의 C-말단에서 지방족 사슬, 폴리사이클릭, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 변형되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 변형되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 그것의 C-말단에서 지방족 사슬, 폴리사이클릭, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 변형되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 그것의 N-말단에서 지방족 사슬, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분 및 그것의 C-말단에서 지방족 사슬, 폴리사이클릭, 아미노산, 및 아미노산 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 부분으로 변형되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위, 응집 부위, 글리코실레이션 부위, 및 글리코스아미노글리칸("GAG") 결합 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 부위에서 상기 합성 키모카인에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  8. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 Rantes, MIP1α, MIP1β, SDF-1, IL-8 또는 MCP-1의 유사체인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 Rantes의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 Rantes의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 응집 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 Rantes의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 글리코실레이션 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 Rantes의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1α의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1α의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 응집 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  15. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1α의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 글리코실레이션 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  16. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1α의 유사체이고, 상기 수용성폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  17. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1β의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  18. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1β의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 응집 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  19. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1β의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 글리코실레이션 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  20. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MIP1β의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  21. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 SDF-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  22. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 SDF-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  23. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 IL-8의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  24. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 IL-8의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  25. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MCP-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 C-말단 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  26. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MCP-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 응집 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  27. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MCP-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 글리코실레이션 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  28. 제 8 항에 있어서, 상기 합성 키모카인은 MCP-1의 유사체이고, 상기 수용성 폴리머는 GAG 부위에 부착되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  29. 제 1 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 식:
    U-B-폴리머-J
    를 갖으며, 식 중:
    U는 상기 합성 키모카인에 공유 결합된 관능기의 잔기를 포함하고;
    B는 3 개 이상의 팔을 갖는, 존재하거나 존재하지 않는 분지 코어이고;
    폴리머는 실질적으로 비항원성 수용성 폴리머이고;
    J는 생리적 조건하에서 음성, 양성 및 중성으로 구성된 군으로부터 선택되는 순 전하를 갖는 펜단트기의 잔기인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  30. 제 29 항에 있어서, U, B, 폴리머 및 J 중 하나 이상은 스페이서나 링커에 의하여 분리되고; 상기 스페이서나 링커는 식:
    U-s1-B-s2-폴리머-s3-J
    를 갖으며, 식중 s1, s2 및 s3는 동일하거나 상이할 수 있는 스페이서나 링커 부분이고, 개별적으로 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  31. 제 29 항에 있어서, U는 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 및 타이졸리딘으로부터 선택되는 결합의 잔기인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  32. 제 29 항에 있어서, B의 한 팔은 U에 연결되고, B의 제 2의 팔은 폴리머에 연결된 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  33. 제 29 항에 있어서, B는 네 개 이상의 팔을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  34. 제 33 항에 있어서, 둘 이상의 상기 팔은 옥심, 아미드, 아민, 우레탄, 티오에테르, 에스테르, 히드라지드, 옥사졸리딘, 및 타이졸리딘으로부터 선택되는 결합의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  35. 제 33 항에 있어서, B는 아미노, 카르복실, 및 혼합된 아미노-카르복실로부터 선택되는 분지 코어 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  36. 제 29 항에 있어서, 폴리머는 폴리알킬렌 옥시드 및 폴리아미드 알킬렌 옥시드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  37. 제 29 항에 있어서, 폴리머는 식 -[C(O)-X-C(O)NH-Y-NH]n- 또는 -[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-의 폴리아미드이고, 식중 X와 Y는 동일하거나 상이할 수 있으며, 분지 또는 선형인 2가 라디칼이고, n은 1 내지 100의 정수인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  38. 제 37 항에 있어서, X와 Y 둘 중 하나 또는 모두는:
    -(O-CH2-CH2)n- 및 -(CH2-CH2-O)n- 으로부터 선택되는 반복단위를 포함하며, 식중 n은 1 내지 100의 정수인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  39. 제 29 항에 있어서, J는 이온화가능기인 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 이온화가능기는 카르복실, 아민, 및 히드록실로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 전체 음전하를 띠는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  42. 제 39 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 전체 양전하를 띠는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  43. 제 39 항에 있어서, 상기 수용성 폴리머는 전체 중성전하를 띠는 것을 특징으로 하는 합성 키모카인.
  44. 부착된 수용성 폴리머를 포함하고, 바이러스 감염의 저해를 포함하는 생물학적 반응에 관하여 대응 야생형 키모카인과 같거나 더 작은 시험관내 EC50을 갖는 생물활성 합성 키모카인으로서, 상기 EC50은 상기 생물활성 합성 키모카인이 하나이상의 대응 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 시험관내 세포-기초 검정에서 측정되고, 하나 이상의 상기 수용체가 바이러스 감염에 대한 공-수용체인 것을 특징으로 하는 생물활성 합성 키모카인.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 EC50은 1000 nM, 700 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 10 nM, 및 1 nM로 구성된 군으로부터 선택되는 농도보다 작은 것을 특징으로 하는 생물활성 합성 키모카인.
  46. 부착된 수용성 폴리머를 포함하며:
    (1) 대응 야생형 키모카인과 같거나 더 작은 시험관내 EC50로서, 상기 EC50은 생물활성 합성 키모카인이 하나 이상의 대응 수용체에 결합하는 것을 특징으로 하는 시험관내 세포-기초 검정에서 측정되고, 하나 이상의 상기 수용체가 바이러스 공-수용체인 것을 특징으로 하는 EC 50, 및
    (2) 상기 수용성 폴리머가 없는 상기 합성 키모카인에 비하여 10 배보다 더 큰 혈청 순환 반감기를 갖는 생물활성 합성 키모카인.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 EC50은 1000 nM, 700 nM, 500 nM, 400 nM, 300 nM, 200 nM, 100 nM, 10 nM, 및 1 nM로 구성된 군으로부터 선택되는 농도보다 작은 것을 특징으로 하는 생물활성 합성 키모카인.
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