JP2006517415A5

JP2006517415A5 -

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Publication number: JP2006517415A5
Application number: JP2006508590A
Authority: JP
Filing date: 2004-01-08
Publication date: 2006-11-16

Description

しかしながら、これら技術は必ずしも全ての細胞内微生物タンパクに適用できるわけではなく、いずれも大量処理への応用に限界を有し、及び／又はその他の欠点を有している。例えば、トルエン及びクロロホルム等の溶媒が細胞内タンパク質の放出を促進するが、これらの物質は毒性及び／又は発癌性を有することが知られている（Windholtz等., The Merck Index 10th Edition: 300及び1364 (1983)）。ＳＤＳのようなイオン性洗浄剤は、単離されたタンパク質を不可逆的に変性させてしまうことが多い。非イオン性洗浄剤により通常変性は起こらないが、回収されたタンパク質がしばしば洗浄剤ミセルと関連し、洗浄剤を含まない細胞を得るためには追加の処理が必要となる。尿素及び塩酸グアジニンなどのカオトロピック剤は、完全な放出に必要な濃度において変性を起こす場合があり、その効果は培地の増殖相に依存する。リゾチームの使用は比較的穏やかなタンパク質遊離手段であるが、その原価が比較的高いこと、及びその後酵素試薬から対象タンパク質を生成する必要があることから、その使用には限界がある。加えて、リゾチーム又はトルエン抽出等の他の可溶化／放出技術を強化するためにしばしば用いられるキレート剤は、宿主タンパク質を非特異的に放出するという欠点を有している。
他のタンパク質放出法も欠点を有している。例えば、浸透圧ショックでは、細胞は浸透圧の高い培地に置かれ、回収され、その後浸透圧の低い緩衝液中に置かれることになり、他の抽出手段に対して処理段階が多くなる（Moir等, Bioprocess Technology, Asenjo eds: 67-94 (1990)）か、又は低温の液体を大量に扱うことが必要になる。この方法のこのような特徴は、大量処理にとって魅力的でない。

従来、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）はヒト血清及び血漿から精製されていた（Putnam, ed., The Plasma Proteins, vol. 1 (Academic Press, 1975)）。精製プロセスは１又は複数のステップを含むことが多い。ＩｇＧの回収に最も広く使用される沈降スキームは、コーンによる分画である（Cohn 等, J. Amer. Chem. Soc., 72: 465 (1950)）。しかしながら、他の沈降技術も報告されている（Niederauer及びGlatz, Advances in Biochemical Engineering Biotechnology, v. 47 (Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1992); Sternberg及びHershberger, Biochim. et Biophys. Acta, 342: 195-206 (1974)）。芳香及び陽イオン性の高い染料である６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩（ＵＳＡＮ名及び本明細書で乳酸エタクリジンと呼び、またETHODIN（登録商標）又はRIVANOL（登録商標）としても知られる）を用いて血漿からＩｇＧを精製する先駆的な作業がHorejsi及びSmetana, Acta Med. Scand., 155: 65 (1956)により報告された。続く１０年間に、６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン乳酸塩が持つ、血漿及び成長培地等の生物学的材料からのＩｇＧ及び他のタンパク質精製能が多数の文献に示された（Miller, Nature, 184: 450 (1959); Steinbuch及びNiewiarowski, Nature, 186: 87 (1960); Neurath及びBrunner, Experientia, 25: 668 (1969)）。乳酸エタクリジンの使用によるその他の出所からの抗体及びその他のタンパク質の回収が報告されている。例えば、Tchernov等, J. Biotechnol., 69: 69-73 (1999); 1982年7月28日公開のSU 944580; Franek 及びDolnikova, Biotech-Forum-Eur, 7: 468-470 (1990); 1987年12月23日公開のEP 250288; 1987年8月20日公開のDE3604947; Rothwell等, Anal. Biochem., 149: 197-201 (1985); Lutsik及びAntonyuk, Biokhimiya, 47: 1710-1715 (1982); 並びに、Aizenman等, Mikrobiol-Zh., 44: 69-72 (1982)を参照のこと。
微生物からポリペプチドを回収する第一段階は、多くの場合、細胞及び細胞片等の固体物質の除去に関与している。所望の産物を、それと特異的に相互作用する条件培地中の成分から分離する必要性を認識することが重要である。対象のタンパク質が正の電荷を有する場合、そこに存在する負の電荷を有するあらゆる分子に結合するので、従来の方法によりタンパク質の精製を行うことは非常に困難である。この段階で、未精製の微生物抽出物、例えば大腸菌ホモジネートからそれに混入している可溶性タンパク質を追加的に除去するには、単純にその後でクロマトグラフィーを行う。このような追加的除去は工業規模の生産に非常に有益であり、これによりクロマトグラフィーのカラムの大きさと生産時間を縮減できる。

（i）シグナル配列成分
ここで対象となるポリペプチドをコードするDNAは、直接発現されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合体としても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されたポリペプチドDNAの一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識しない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばｌａｍＢ、ｏｍｐＦ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換できる。酵母分泌については、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダ−、α因子リーダー（酵母菌属及びkluyveromyceα-因子リーダーを含む。kluyveromyceα-因子リーダーについては米国特許第5,010,182号を参照のこと）、又は酸性ホスファターゼリーダー、白体グルコアミラーゼリーダー（1990年4月4日公開のEP362,179）、又は1990年11月15日公開のWO90/13646に開示されているシグナルである。

Ｄ．宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを生産するのに使用される原核細胞は、当技術分野で既知の培地において成長させたもので、選択された宿主細胞の培養に適しており、一般的にSambrook等、上掲に記載の培地を含む。細菌に適した培地には、ＡＰ５培地、栄養ブロス、Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス、Neidhardt's最少培地、及びＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ．最少又は完全培地に必要な栄養を補ったものが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、培地は発現ベクターの構造に基づいて選択された選択剤も含み、よって発現ベクターを含む原核細胞を選択的に成長させることができる。例えば、アンピシリン抵抗性の遺伝子を発現する細胞を成長させるために、培地にアンピシリンを加える。炭素、窒素、及び無機リン酸塩の供給源に加え、必要な補充物は、単独で、或いは、別の補充物又は複合窒素源等の培地と組み合わせて導入され、適切な濃度で含有される。場合によっては、培養培地は、グルタチオン、システイン、システアミン、チオグリコール酸、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群から選択された１又は複数の還元剤を含んでよい。
適切な培地の例は、米国特許第5,304,472号及び同第5,342,763号に見ることができる。Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．リン酸塩制限培地は、３．５７ｇの（ＮＨ _４） _２（ＳＯ _４）、０．７１ｇのＮａＣｉｔｒａｔｅ−２Ｈ_２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５，３６ｇの酵母菌抽出物（認証済み）、５．３６ｇのＨｙｃａｓｅＳＦ（登録商標）−Sheffieldからなり、ＫＯＨによりｐＨを７．３に、ＳＱＨ _２Ｏによりｑｓを８７２ｍｌに調整したものをオートクレーブしてから５５℃に冷却し、１１０ｍｌの１ＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．３）、１１ｍｌの５０％グルコース、７ｍｌの１ＭＭｇ(ＳＯ _４ )を補ったものである。次いでカルベニシリンを５０ｕｇ／ｍｌの濃度で導入培地に添加してもよい。

別の種類の精製方法は濾過である。流体からの細かい粒子の混入物の濾過は、様々な多孔性フィルタにより行われており、そのようなフィルタを混入組成物が通過すると、フィルタにより混入物が捕捉される。混入物の滞留は、機械的な濾過又は電気運動による粒子の捕捉及び吸収により起こる。機械的な濾過では、粒子がそれよりも小さな孔を通過しようとしたときに物理的に捕捉される。電気運動による捕捉のメカニズムでは、粒子が多孔性フィルタの表面に衝突し、短距離引力により表面上に保持される。電気運動による捕捉を行うには、フィルタの表面電荷の特性を変化させるのに電荷変更システムを用いることができる（例えばWO 90/11814参照）。例えば、除去すべき混入物が陰イオン性の場合、陽イオン変化モディファイヤーを用いて、フィルタが混入物を保持するようにフィルタの電荷特性を変化させることができる。
従来の抗体精製手順、例えばゲル濾過又は電気泳動法、透析法、ＨＩＣ、アフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインＡSEPHAROSE（登録商標）、プロテインＧ、抗原親和性又は抗ＩｇＧ親和性クロマトグラフィー、均質化、濾過又は遠心分離による清澄、沈降、例えば硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール又はカプリル酸による処理、イオン交換クロマトグラフィー、例えばヒドロキシアパタイト等の樹脂、セラミック−ヒドロキシアパタイト及びBIOGEL HT（登録商標）等、リン酸カルシウムを含む樹脂、及びジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び四級アミノエタン（ＱＡＥ）等、正の電荷を有する成分を有するものを含む陰イオン交換樹脂を用いるもの、例えばQ-SEPHAROSE FAST FLOW（登録商標）樹脂(Pharmacia)、 DEAE-SEPHAROSE FAST FLOW（登録商標）樹脂、DEAE-TOYOPEARL（登録商標）樹脂、QAE-TOYOPEARL（登録商標）樹脂、POROS-Q（登録商標）樹脂、FRACTOGEL-DMAE（登録商標）樹脂、FRACTOGEL EMD-TMAE（登録商標）樹脂、MATREX CELLUFINE DEAE（登録商標）樹脂等により、モノクローナル抗体を沈殿物から適切に分離することができる。抗体の単離及び精製法については、さらに、Antibodies: A Laboratory Manual"; Harlow 及びLane, eds. (Cold Spring Harbor Laboratories, New York: 1988)を参照されたい。

実施例１
材料及び方法
Ａ．プラスミド、形質転換、発酵
１．ｒｈｕＦａｂ’２（ｘＣＤ１８）の生産
ａ．プラスミドの構築
コントロールプラスミドのｐＳ１１３０は、抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）_２のバイシストロン性の発現のために設計されたもので、Carter等によるBio/Technology, 10:163-167(1992)に記載のベクターに基づいている。この設計によって、単独のｐｈｏＡプロモーターの制御下においてＣ末端ロイシンジッパーを有する軽鎖及び重鎖断片両方について遺伝子の転写が行われる。転写は、重鎖−ロイシンジッパーのコード化配列の下流に位置するλｔ_０転写ターミネーターで終了する（Scholtissek及びGrosse, Nucleic Acids Res., 15(7):3185 (1987)）。熱安定性エンテロトキシンＩＩのシグナル配列（ＳＴＩＩ）は各鎖のコード化配列に先行し、周辺質へのポリペプチドの分泌を導く（Lee等、Infect. Immun., 42:264-268(1983; Picken等、Infect. Immun., 42:269-275 (1983))。ロイシンジッパーを重鎖断片のＣ末端端部に付着させ、２つのＦａｂ’アームの二量体化を促した。
２つの分離した翻訳ユニットを包含するデュアルプロモータープラスミドpxCD18-7T3は、重鎖配列の転写から軽鎖の転写の一時的な分離を可能ならしめる。pS1130の場合、軽鎖配列はphoAプロモーターのコントロール下にとどまる。しかし、pxCD18-7T3中では、λt₀転写終結因子が軽鎖コード化配列の後に配置される。この終結因子の下流に、tacIIプロモーターが重鎖断片／C末端ロイシンジッパーの転写をコントロールするために付加された（DeBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 80:21-25 (1983)）。第二のλt₀転写終結因子はこのコード化配列の後に配置される。STIIシグナル配列のサイレントコドン変異は、両鎖の分泌を導くために使用された（Simmons及びYansura, Nature Biotechnology, 14:629-634 (1996)）。
単一のプロモーターコントロールプラスミドと二重プロモータープラスミドとの簡単な比較を図１に示す。ｐｘＣＤ１８−７Ｔ３の発現カセット配列を図２（配列番号１）に、２つの翻訳単位のアミノ酸配列（配列番号２及び３）をそれぞれ図３Ａ（軽鎖）及び３Ｂ（重鎖）に示す。

２．抗組織因子Ｆ（ａｂ’）_２の製造
ａ．プラスミドの構築
上記の二重プロモータープラスミドｐＸＣＤ１８−７Ｔ３に類似の二重プロモータープラスミドｐｘＴＦ７Ｔ３を作成し、抗組織因子軽鎖及び重鎖の発現の一時的分離を可能にするために使用した。また、プラスミドｐＭＳ４２１由来のｌａｃＩ配列をｐｘＴＦ７Ｔ３に組み入れて、新規二重プロモータープラスミドｐＪＶＧ３ＩＬを作成した。
ｂ．発酵
これら発酵に使用する宿主株は、大腸菌Ｗ３１１０の派生体であり、これを６０Ｈ４と呼ぶ。６０Ｈ４の完全遺伝子型は、Ｗ３１１０ΔｆｈｕＡΔｍａｎＡｐｈｏＡΔＥ１５ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ｄｅｏＣ２ｄｅｇＰ４１ｉｌｖＧ２０９６（Ｖａｌ^ｒ）Δｐｒｃｐｒｃ−抑制因子である。６０Ｈ４宿主細胞をｐＪＶＧ３ＩＬを用いて形質転換し、形質転換が成功したものを選択して培養物中で成長させた。
発酵は、上記の抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）_２に用いたものと同様な条件下で行い、但し実行時間を約７２〜１１４時間とし、培養物ＣＤ５５０が２２０に達した後、約４〜１２時間、ＩＰＴＧを用いて重鎖配列を誘発した。

３．完全長抗ＴＦ抗体の製造
ａ．プラスミドの構築
プラスミドｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬの発現カセットは、５’〜３’に、（１）ｐｈｏＡプロモーター（Kikuchi等、Nucleic Acids Res., 9(21):5671-5678 (1981)）、（２）ｔｒｐＳｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ（Yanofsky等、Nucleic Acids Res., 9:6647-6668 (1981)）、（３）ＳＴＩＩシグナル配列のサイレントコドン変異体（ＴＩＲ相対強度約７）（Simmons及びYansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996)）、（４）抗組織因子軽鎖コード化配列、（５）λｔ_０ターミネーター（Scholtissek及びGrosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)）、（６）ｔａｃＩＩプロモーター（DeBoer等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)）、（７）第二ｔｒｐＳｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ、（８）ＳＴＩＩシグナル配列の第二サイレントコドン変異体（ＴＩＲ相対強度約３）、（９）抗組織因子完全長重鎖のコード化配列、及び（１０）第二λｔ_０ターミネーターを含む。この発現カセットを大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のフレームワークにクローニングした（Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)）。
よって、ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬのベクター設計は、同一ではなく、異なる２つのプロモーターを使用するので、各鎖の一時的な分離発現が可能になる。このプラスミドにおいて、軽鎖配列はｐｈｏＡプロモーターの制御下にある。しかし、重鎖配列の転写の制御には、ｔａｃＩＩプロモーターが使用される。当技術分野で既知であるように、ｐｈｏＡ及びｔａｃＩＩプロモーターは実質的に異なる条件下で誘発される。単独プロモータープラスミドｐａＴＦ１３０とｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬとの概略的な比較を図４に示す。ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ（配列番号４）の発現カセットの核酸配列を図５に、及びそれによってコードされるポリペプチド配列（配列番号５及び６）を図６Ａ（軽鎖）及び図６Ｂ（重鎖）に、それぞれ示す。以下の宿主細胞を、ｐｘＴＦ−７Ｔ３ＦＬ及びｐＪＪ２４７を用いて同時形質転換した。ｐＪＪ２４７は、ＤｓｂＡ及びＤｓｂＣ両方の発現をまずＤｓｂＡから連続的に駆動するｔａｃＩＩプロモーターをコードする。その作成方法はWO02/061090に開示されている。

Claims

抗体である所望の異種ポリペプチドを、それが生成されて可溶化された微生物発酵ブロス又はホモジネートから精製する方法であって、ポリペプチドの大部分が可溶性のまま維持されるような条件下でブロス又はホモジネートに有効量の乳酸エタクリジン溶液を添加することにより宿主細胞不純物を沈降させ、所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離することを含んでなり、該ブロス又はホモジネートは発酵に用いられた発酵糟から直接取り出した未加工のものであり、沈降される宿主細胞不純物として細胞細片、宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものである方法。
ブロス又はホモジネートが酵母又は原核生物である、請求項１に記載の方法。
ブロス又はホモジネートが細菌に由来する、請求項１又は２に記載の方法。
ブロス又はホモジネートが真正細菌に由来する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
ブロス又はホモジネートがグラム陰性細菌に由来する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
ブロス又はホモジネートが大腸菌に由来する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチドがホモジネートから分離される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチドのｐＩが、宿主細胞不純物に含まれる宿主のタンパク質の平均ｐＩよりも高い、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチドのｐＩが少なくとも約７である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンの濃度が約０．１〜５重量％／容積である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンの濃度が約０．４〜５重量％／容積である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンの濃度が約０．６〜５重量％／容積である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの伝導率が約１〜１５ｍＳ／ｃｍである、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートのｐＨが約５〜９である、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートのｐＨが約６〜９である、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を室温〜約７０℃とする、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を約１〜６０分間、室温〜約６５℃に保つ、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度を約１〜６０分間、約５０〜６５℃に保つ、請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の方法。
遠心分離又は濾過により分離を行う、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
ブロス又はホモジネートから分離した後、クロマトグラフィー又は濾過により更にポリペプチドを精製する、請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジンの添加に先立って、ポリペプチドを溶解性断片に製造する、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチドが非溶解性であり、乳酸エタクリジンの添加に先立って可溶化剤に接触させることによりポリペプチドを溶解する、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の方法。
乳酸エタクリジン及び細胞に対して異種性の抗体であるポリペプチドを含有してなり、発酵に用いられた発酵糟から直接取り出した未加工のものであり、細胞細片、宿主細胞のタンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むものである微生物細胞発酵ブロス又はホモジネート。
細菌細胞に由来する、請求項２４に記載のブロス又はホモジネート。
大腸菌に由来する、請求項２４又は２５に記載のブロス又はホモジネート。
ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項２４ないし２６のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
乳酸エタクリジンの濃度が約０．１〜５重量％／容積である、請求項２４ないし２７のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
ポリペプチドがブロス又はホモジネートに溶解性である、請求項２４ないし２８のいずれか１項に記載のブロス又はホモジネート。
抗体である所望の異種ポリペプチドを、それが生成されて可溶化された微生物発酵ブロス又はホモジネートから精製する方法であって、ポリペプチドの大部分が可溶性のまま維持されるような条件下でブロス又はホモジネートに有効量の乳酸エタクリジン溶液を添加することにより宿主細胞不純物を沈降させ、所望のポリペプチドをブロス又はホモジネートから分離することを含んでなり、該乳酸エタクリジンを添加した後のブロス又はホモジネートの温度が約１〜６０分間、約５０〜６５℃に保たれる方法。