JPH0724596B2

JPH0724596B2 - インタ−フェロンの精製方法

Info

Publication number: JPH0724596B2
Application number: JP61500450A
Authority: JP
Inventors: 直樹東; 俊二郎杉本; 雅文辻本; 邦内白澤; 勉岡田; 和守山本; ナガブシャン，タッタナハリ・エル; トロッタ，ポール・フィリップ
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1984-12-27
Filing date: 1985-12-26
Publication date: 1995-03-22
Anticipated expiration: 2010-03-22
Also published as: JPS61500941A

Description

【発明の詳細な説明】（技術の分野）本発明は組み換えDNA技術によつて得られる生理活性を
有するポリペプチド、特に生理活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターによつ
て形質転換された大腸菌によつて生産されるポリペプチ
ドを変性することなく、かつプロテアーゼによつて分解
されることなく精製する方法に関する。本発明はインタ
ーフエロン、特にヒト免疫インターフエロン（または、
ガンマインターフエロン）活性を有するポリペプチド生
産大腸菌の培養物から目的ポリペプチドを精製するのに
有効な方法を提供するものである。

（技術背景）インターフエロン蛋白は抗原性及び構造の差異に基き
α，βおよびγの３種（各々、IFN−α,IFN−βおよびI
FN−γと略す）に分類されている。IFN−γはIFN−αお
よびIFN−βと区別される多くの特徴を持つている。そ
れらの差異としては抗原区別性と免疫調節および抗腫瘍
効果についてのより強い作用とである。ヒトIFN−γ
（以下、ｈ−IFN−γと略す）はＴ−リンパ球が感作さ
れる免疫原または抗原によつて刺激されたＴ−リンパ球
によつて生産することができる。更に、ヒト−IFN−γ
は従来技術で知られているクローニング及び発現技術に
より生産することもできる。

近年、遺伝子工学的手法の進展により、従来は生体から
の分離、精製に頼つていた多くの生理活性ポリペプチド
を微生物や動物細胞から生産することが可能となつた。
しかしながら、それらの目的物質を薬剤として使用する
のに十分な程純粋に、しかも変性や分解を受けることな
く抽出・精製する方法は未だ十分確立されているとは言
えない。

しかしながら、得られたIFN−γ含有細胞を集め、浸透
圧シヨツク、超音波振動、粉砕または高剪断力破砕のよ
うな種々の手段で破砕し、そして破砕された細胞/IFN−
γ混合物を次いで処理してIFN−γを単離している。不
溶性の破砕片は遠心分離によつて除去され、IFN−γを
含有する上清は精製のために集められる。

組換え微生物の生産するポリペプチドを塩酸グアニジン
や尿素などを用いて抽出、精製する方法（特開昭59−16
1321号公報および米国特許4,476,049）や、モノクロー
ナル抗体を用いた精製法（特開昭59−186995号公報）な
ど精製法に関する技術が開示されているが、これらの方
法においても、目的物質が変性を受けず、その活性が損
われることなく十分精製され得るとは限らない。

ヨーロツパ特許出願0,087,686は細胞を含まない上清か
らまた粗インターフエロン原料からの抽出液から、ヒト
免疫インターフエロンのための３工程精製法が開示され
ている。第１工程（天然産出インターフエロンについ
て）ではコンカナバリン−Ａセフアロースのようなアフ
イニテイーカラムが使用され、次いで増加塩濃度勾配を
用いるカルボキシメチルシリカカラムによるクロマトグ
ラフイーを行い、最後にシリカゲル透過カラムによるク
ロマトグラフイーを行う。もし十分な純度が得られない
場合、TSKまたはCMのいずれかのカラムによる濃縮およ
びクロマトグラフイーが用いられる。

ヨーロツパ特許出願0,063,482には１）制御された孔性
ガラスビーズ、２）コンカバリン−Ａセフアロース、
３）ヘパリン−セフアロースまたはプロシオンレツド−
アガロース、および４）ゲル過、を用いるクロマトグ
ラフイー技術を用いる精製法が開示されている。

ヨーロツパ特許出願0,107,498および0,077,670には１）
ポリエチレンイミン沈澱;2）細菌蛋白質のpH沈澱;3）濃
縮および透析；および４）ａ）カルボキシメチルセルロ
ース、ｂ）リン酸カルシウムゲル、ｃ）アルボキシメチ
ルセルロースおよびｄ）ゲル過樹脂、によるクロマト
グラフイー；を用いる精製方式が開示されている。

これらの精製法は複数工程を必要とし、インターフエロ
ン分子の分解または凝集によるインターフエロンの劣化
を生じるか、またはそうでなければ、低い収率でまたは
低い活性のIFN−γ生成物しか得られない。

特に目的物質の生理活性を損うことなく、あるいは変性
を伴うことなく目的物質生産微生物の培養物からの目的
ポリペプチドを抽出、精製する技術はそのポリペプチド
を医薬品として使用する場合に重要であり、その技術の
確立が産業上有用であることは言をまたない。

このような精製技術は、現在医薬品としての利用が進め
られているインターフエロンについて特に望まれてい
る。インターフエロンは抗ウイルス活性を有するが、そ
の中でもIFN−γは特に細胞増殖抑制作用が強いことか
ら、抗ウイルス剤の他、抗腫瘍剤、免疫調節剤としての
利用が期待される。また、インターフエロン活性は種特
異性があることから、例えばそれらを薬剤としてヒトに
用いる場合、ヒト由来のインターフエロンを用いること
が望まれる。遺伝子工学的に生産されるインターフエロ
ンでは特にその抽出、精製工程の確立が望まれている。

通常、組換え微生物からのポリペプチドの抽出、精製に
おいては、まず培養微生物を殺菌剤を用いて死菌とした
後（安全性の面から必須の工程）、菌体を破砕し、続い
て抽出操作に付す。これらの処理において目的とするポ
リペプチドが変性したり、その活性が損われることがあ
る。また、これらの処理は菌体に含まれるプロテアーゼ
の活性化をおこしやすく目的ポリペプチドが分解される
こともある。

これまで、組換え微生物から目的ポリペプチドを精製す
る場合、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤で変
性、可溶化させた蛋白を抽出し、精製過程で変性剤を除
く手法が開示されている（前掲、特開昭59−161321号公
報、米国特許4,476,049等）。しかしながら、変性剤を
除去しても目的ポリペプチドが完全に復元した保証を得
るのは困難である。従つて、この方法は目的ポリペプチ
ドを医薬品として使用する場合は好しいことではない。
なぜなら、一部変性したものが混在する場合は、抗原と
もなりうるからである。

一方、モノクローナル抗体を用いた精製法も報告されて
いるが（前掲、特開昭59−186995など）、使用するモノ
クローナル抗体の認識する抗原決定基によつては変性さ
れた好しくないポリペプチドや、二量体、三量体のよう
な重合したポリペプチドも結合し得ることが考えられ
る。最近、ポリペプチドのプロテアーゼによる分解を阻
止する目的で、プロテアーゼインヒビター共存下で組換
え大腸菌の生産するｈ−IFN−γを抽出する方法が前掲
米国特許に開示されたが、ここで用いられる塩酸グアニ
ジンは蛋白変性剤としても知られており（例えば、特開
昭59−161321号公報）、プロテアーゼによるポリペプチ
ドの切断は抑制し得るが、変性蛋白が生成されることが
予想される。

更に、１）ガンマインターフエロンが生産された細胞の
破砕の細胞片からガンマインターフエロンを分離する精
製方式を提供し;2）細胞不純物から高収率で、しかも高
純度、高活性のガンマインターフエロンを分離し;3）組
換えガンマインターフエロンを細胞不純物から分離し;
4）実質上インターフエロンを分解することなく細胞不
純物からガンマインターフエロンを分離する；ことが好
しいであろう。以下に述べる方法がその好しい分離方法
である。

本発明における精製方法はポリペプチドの変性を伴うこ
となく、また、プロテアーゼによるポリペプチドの分解
を抑えつゝ、効率良く、実質的に純粋な目的生理活性を
有するポリペプチドを提供しようとするものである。
尚、本発明は便宜上ｈ−IFN−γ活性を有するポリペプ
チドの精製について以下に説明するが、本発明の方法は
組換え大腸菌の産生するArg−LysやArg−Argなどのプロ
テアーゼ分解を受け易いような部位を含むｈ−INF−γ
以外のポリペプチドの抽出、精製にも適用できる。

本発明によれば、抽出工程において亜鉛または銅の塩類
の１種または２種以上とポリエチレンイミン（以下、PE
Iと略す）を添加することにより上記の問題点を解決し
た。更に詳細には、組換え大腸菌の培養菌体を亜鉛また
は銅の塩類の１種または２種以上を含む緩衝液で懸濁
し、菌体を破砕し、次にその遠心上清にPEIを添加し、
続いて適当な精製工程に移ることにより目的を達成する
ことができる。

使用される亜鉛または銅の塩類としては種々の化合物が
考えられるが、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、亜鉛ア
セチルアセトネート、硫酸銅等があるが、塩化亜鉛、酢
酸亜鉛、硫酸銅が好しい。また、これら塩類の添加量は
生産菌株によつて最適濃度に違いが認められるが、一般
的には亜鉛の塩類の場合、0.5〜5mM、好しくは１〜3mM
であり、銅の塩類では0.01〜3mM、好しくは0.25〜1mMの
濃度である。

これらの塩類を上記濃度で緩衝溶液に配合し、培養終了
後の菌体をこの溶液柱に懸濁後、菌体を破砕し、遠心に
より上清を得る。この上清にPEIを添加する。PEIは最終
濃度が0.5〜1.1％になるような量で添加される。PEI添
加は相当量の不純な蛋白を沈澱せしめる役割も有す。PE
I添加後上清液を充分低温（例えば、４℃前後）に放置
する。次に、生ずる沈澱を遠心・除去した後、常法によ
る精製工程に入る。精製は従来より用いられている種々
のカラム、透析法を適宜組み合わせて行なえる。場合に
より、塩析を工程中に含めることもある。詳しくは後述
する実施例で説明する。

本出願以前に、IFN−β生産に際して培養培地に亜鉛塩
類を添加するとIFN−βの生産性が上がるという報告が
あるが（特開昭59−146597号公報）、単に培養時の力価
向上を目的としたものであり、本発明のようにPEIと共
に抽出時に添加することについては何ら記載されていな
い。銅化合物の精製段階における使用については、特開
昭59−167597号公報で銅キレート樹脂カラムを使用する
例が報告されているが、その発明は予備精製したIFN溶
液の精製法に関するものである。これらの発明も含め、
終始蛋白を変性および分解させることなく精製すること
を目的に抽出時に、これら金属塩を添加することを特徴
とする本発明とは本質的に異なるものである。

本発明のもう１つの目的として、本発明の抽出、精製法
によつて得られたｈ−IFN−γ活性を有する実質的に純
粋なポリペプチドの提供があげられる。

本発明で述べるｈ−IFN−γ活性を有するポリペプチド
生産株の１つであるW3110/pIN5T4の造成についてはヨー
ロツパ特許出願0,134,673に開示されている。この生産
株によつて生産されるポリペプチドはGIF146と命名され
次のアミノ酸配列（Ｉ）で示される。

このGIF146生産株は下記のGIF146をコードするDNA配列
（II）で示すDNA断片を含むプラスミドベクター大腸菌W
3110を形質転換したものである。

一方、ｈ−IFN−γ活性を有し、次のアミアミノ酸配列
（III）で示されるポリペプチド（GIF143と言う）の生
産株（W3110/pIN5T4N143）は参考例で詳しく説明するが
以下のように造成することができる。

また、このポリペプチド（GIF143）をコードするDNA配
列で示されるDNA断片が目的プラスミドベクターの造成
に使用できる。

（図面の簡単な説明）第１図は本発明の精製方法が適用されるGIF143を生産す
るための大腸菌形質転換用プラスミドベクターpIN5T4N1
43の造成経路を説明する図である。

第２図は本発明のガンマインターフエロン精製方法の好
しい態様を示すフローダイアグラムである。

第３図は主としてクロマトグラフイー精製手段を示す本
精製方法のより好しい態様のフローダイアグラムであ
る。

第４図は本発明の特に好しい態様のフローダイアグラム
である。

第５図は、各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体
（W3110/pIN5T4N146）を破砕しその上清をSDS−PAGEに
かけて得られる蛋白バンドを示す写真である。

第６図は、塩化亜鉛に代えて硫酸銅を使用して得られる
SDS−PAGEの蛋白バンドを示す写真である。

第７図は各種濃度の塩化亜鉛を含む緩衝液中で菌体（W3
110/pIN5T4N143を破砕し、その上清をSDS−PAGEにかけ
て得られる蛋白バンドを示す写真である。

添付の図面第１図を参照して説明すると、まずpGIF54
（特開昭58−201995中に開示されているpGIF4と実質的
に同じプラスミド）のAst IIとBgl II切断により得られ
るDNA断片を、さらにAva IIで処理し、第１図に示す様
なAva II−Bgl II断片を得る。次に、この断片のAva II
サイトと、pIN5T4（ヨーロツパ特許出願0,134,673に開
示）をBgl IIとEcoRIで処理して得られるテトラサイク
リン耐性遺伝子（Tcr）を持つ長い方のDNA断片のEcoRI
サイトの間に、両端にEcoRIとAva IIサイトを持つ合成
リンカー DNA断片をDNAリガーゼの存在下に挿入することにより、
目的とするプラスミドpIN5T4N143を得る。これは、GIF1
46のＮ末端側の３個のアミノ酸残基からなる配列、Cys
−Tyr−Cys配列が欠除したポリペプチドGIF143に対応す
る遺伝子を含んでいる。続いて、このプラスミドpIN5T4
N143により宿主（E.ColiW3110）を常法により形質転換
して、GIF143生産形質転換大腸菌株（W3110/pIN5T4N14
3）を得る。

全ての図面において、精製方法はホモジナイズされたガ
ンマインターフエロン含有細胞の遠心分離によつて生じ
る上清から、核酸を除去することから開始される。それ
以前の工程は説明のために示されている本発明の一部で
はない。

なお、実施例においては亜鉛の塩類として塩化亜鉛を用
いた精製例を述べるが、塩類としてはこれに限ることな
く、例えば硫酸亜鉛や酢酸亜鉛のような亜鉛の塩類、ま
た硫酸銅のような銅の塩類を用いてもよい。第１表は、
種々の金属塩化合物のプロテアーゼ阻害効果を、それら
の化合物を1mMと0.2mM含む緩衝溶液中で組換え菌体を破
砕し、その上清に含まれるｈ−IFN−γ活性を有するポ
リペプチドの安定性を指標にして調べたものである。第
１表から明らかなように塩化亜鉛の他に硫酸亜鉛、酢酸
亜鉛、亜鉛アセチルアセトネート、硫酸銅などが効果が
あることがわかる。

また、第５図（写真）はｈ−IFN−γ活性を有するポリ
ペプチド（図中GIF146と表示した矢印で示した蛋白のバ
ンド）の安定性を示すSDS−PAGEのパターンである。試
験サンプルは各種濃度の塩化亜鉛を含む望ましい緩衝溶
液中で菌体を破砕して調製された。第５図からｈ−IFN
−γ活性を有するポリペプチドは0.5mM〜2mMの塩化亜鉛
存在下で安定であり、塩化亜鉛を含まない場合または低
濃度の場合では分解を受け易いことを示している。矢印
Ｂで示す蛋白のバンドは、精製工程中プロテアーゼによ
つてGIF146が部分分解されたポリペプチドのバンドを示
す。尚、２−１で示されるサンプルは2mMのZnCl₂を使用
して同様に処理し、更に精製を進めた段階で得たサンプ
ルによるものである。また、２−２で示されるサンプル
はZnCl₂を使用せずに処理し、更に精製を進めた段階で
得たサンプルによるものである。

塩化亜鉛の代わりに硫酸銅を用いた同様な実験例を第６
図（写真）に示すが、この場合、0.1mM〜4mMで有効であ
ることを示している。これらの塩化合物は高い方が充分
なプロテアーゼ阻害作用を示すが、精製工程でこれらの
塩化合物は最終的にとりのぞく必要があるのでできるだ
け低くするのが好ましい。塩化亜鉛の場合、１〜3mM、
硫酸銅の場合、0.25mM〜1mMが好ましい。

第７図（写真）はGIF143生産菌について第５図について
行つたものと同様の処理して得た写真である。図中、GI
F143と表示した矢印で示した蛋白のバンドはｈ−IFN−
γ活性を有するポリペプチドであり、ＥはGIF143のプロ
テアーゼによる部分分解ポリペプチドを示す。

破砕された細胞／ガンマインターフエロン混合物中の主
たる不純物は微小サイズの粒子および水溶性画分であ
り、水溶性画分としては、核酸、蛋白分解酵素、細胞蛋
白、炭水化物、脂質、インターフエロン分解断片、イン
ターフエロン凝集物およびインターフエロンが生産され
た細胞の破砕によつて生じる他の断片等である。発明者
等は、インターフエロン含有混合物を下記の具体的順序
で処理してインターフエロンの分解を最少にし、混合物
から不純物を以下に特定する順に除去することにより、
高純度かつ生物学的活性を保持しながら、しかも良好な
収率でガンマインターフエロンを得ることができる。

十分に改善された純度および活性は、以下の順でインタ
ーフエロン含有混合物中の不純物を除去することによつ
て得られる。

１）核酸；２）負に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋
白；３）正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋
白；および４）分解および凝集インターフエロン。

この工程順序は本発明の所望の結果を得るためには必須
である。上に列挙した不純物を特定した順に除去するこ
とを前提として、高分子量疎水性物質のような他の不純
物が存在する場合、追加の工程によつてその不純物を除
去できる。これらの他の不純物は工程３）または工程
４）の後で除去するのが好都合である。

これらの分離のそれぞれについては多くの公知の方法が
ある。前述のように、最も穏かな条件で分離を行つてイ
ンターフエロンの分解を最も少くすることができるこれ
ら方法が最も望しい。

発明者等は、好しい方法としては最初にポリエチレンイ
ミン沈澱を行い、次いでいくつかのクロマトグラフイー
による分離を行うことにより上に特定した順序で不純物
を除去すること、であることを見出した。クロマトグラ
フイー分離で使用される樹脂およびそれらの使用順は次
の通りである。

１）陰イオン交換樹脂２）陽イオン交換樹脂３）分子ふるいクロマトグラフイー分離に加えて、沈澱、過、濃縮お
よび透析等の手法を用いることが有益である。

好しい方法において、ガンマインターフエロン含有混合
物に次の方法を行う。

１）ポリエチレンイミンを用いる核酸の除去；２）弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる負に荷電した
蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；３）弱酸性陽イオン交換樹脂を用いる正に荷電した蛋
白分解酵素および不純物細胞蛋白の除去；４）分子ふるいを用いる分解及び凝集インターフエロ
ンおよび細胞フラグメントの除去。

各工程後の過、工程３および／または４の後の濃縮お
よび工程４の後の透析が有益な付加的工程である。

この新規方法では、５％以上の収率で少くとも95％の純
度を持つガンマインターフエロンが確実に生産された。

本発明の重要な特徴は新規な精製方式にあり、この方法
は組織培養によつて増殖されたヒトの細胞から、血液サ
ンプルから集められた白血球から、または当業界におい
てよく知られているクローニングの技術による等の多く
の方法のいずれかで生産されたガンマインターフエロン
への使用に適している。この精製方式は大腸菌細胞から
回収される組換えガンマインターフエロンの精製に非常
に適している。細胞は、例えばクロルヘキシジングルコ
ネートのような化学殺菌剤の添加による等の標準的ない
ずれかの方法により不活化される。不活化細胞を遠心
し、緩衝液に再懸濁し、そしてホモジナイズする。ガン
マインターフエロン含有細胞のホモジネーシヨンのため
の便利な方法はマントン−ガーリン（Manton−Gaulin）
ホモジナイザーを用いる高剪断破砕である。破砕された
細胞を遠心分離により沈澱物と上清とに分離する。この
方法で得た上清は以下に述べる方法によつて単離および
精製されるガンマインターフエロンの好適な原料であ
る。

溶解された細胞の懸濁液は蛋白、脂質、炭水化物および
核酸、並びに不溶性細胞破砕片を含んでいる。慣用の方
法を利用することにより、水不溶性成分は、上清中に残
つている細胞の水溶性成分から分離される。

細胞からのガンマインターフエロンの抽出に先立つて、
ある種の予備的処理、例えば処理中のインターフエロン
の分解を最少にするような方法を行うことがしばしば望
ましい。どのような予備処理も、それが本発明の精製方
式を妨害しないことを前提に、使用できる。

この多工程精製方式によれば、生物活性を保持しなが
ら、高純度インターフエロンについての高収率が達成さ
れる。分離工程の順序は非常に区別性があり、開示され
た所望の結果を達成するのに臨界的である。

インターフエロン含有混合物からの不純物の除去の順序
は次の通りである。

ａ）核酸の除去；ｂ）不に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白
の除去；ｃ）正に荷電した蛋白分解酵素および不純物細胞蛋白
の除去；ｄ）低および高分子量不純物、分解されたインターフ
エロンおよびインターフエロン凝集物の除去。

現在では未だ理由は知られていないが、前記の順序での
不純物の除去は、生物活性を保持した精製ガンマインタ
ーフエロンについて高い収率を達成するのに臨界的であ
る。それぞれの群の不純物の除去に使用される個々の工
程は慣用であり、当該技術分野において知られている。
ガンマインターフエロンが苛酷な条件下では分解または
凝集して不活性体になる傾向があるため、最も穏かな処
理条件で行うことができる精製工程が好しい。

インターフエロンの分解を最も少くできることが判つた
具体的処理工程および条件を用いて、この発明を更に説
明するが、不純物除去の順を記述のように維持すること
を前提にして、開示の方法を他の慣用の処理工程で置き
換えることができる。

以下の記述において、別途言及しないかぎり、与えられ
たpH値は一般に±0.5、好しくは±0.25、最も好しくは
±0.1の範囲で変わり得る。導電率の値は±5mSの範囲で
変え得るが、±3mSの範囲に維持することが好しい。操
作は約２〜約15℃の温度で行われる。

本処理方式の第１工程は核酸の除去である。溶解された
ガンマインターフエロン含有細胞の遠心した混合物から
の上清にポリエチレンイミンを添加することによつて、
この除去を行うことが好都合である。別法として、所望
により細胞のホモジナイズの前にポリエチレンイミン溶
液を添加することもできる。撹拌下にポリエチレンイミ
ンを最大濃度約0.8％にまでゆつくり添加し、そして混
合物を適当な期間、一般的には約30〜90分間静置する。
次いで混合物を遠心し、上清を集める。ポリエチレンイ
ミンを10％（v/v）水溶液として、溶液全量に対して約
0.7〜0.8％（v/v）となるような十分な量を添加する場
合に、優れた結果が得られる。溶液のpHは８±0.5、好
しくは±0.1であり、温度は約２〜15℃の範囲に保持さ
れる。上清中の蛋白濃度は、標準のコマージブルー結合
検定により、この工程および他の各処理工程において測
定される。

核酸除去の別法は、ヒドロキシアパタイトまたは固定化
PEIのクロマトグラフイーを用いることによる。プロタ
ミン硫酸塩による沈澱は別の有用な方法である。

核酸の除去後、ガンマインターフエロン含有混合物を第
一の除去工程にかける。蛋白分解酵素を除去する最も便
利な方法は陰イオン交換樹脂を用いて、核酸除去工程か
らの上清をクロマトグラフイーにかけることによる。第
四級アミノエチル、混合アミンまたはその他の中間体塩
基樹脂またはｐ−アミノベンジルセルロースのような弱
塩基樹脂が特に有用である。

第四級アミノエチルは好しい陰イオン交換樹脂である。
第四級アミノエチルは架橋デキスラン、セルロース、ア
ガロースまたはアクリル系支持体に結合することができ
る。上清のpHは水酸化ナトリウムまたは他のいずれかの
好しい塩基を用いることにより、8.7±0.5、好しくは±
0.1に調節する。溶液の導電率は脱イオン水を添加する
ことにより10mS以下、好しくは約４〜8mSの範囲に調節
する。

溶出緩衝液は20mMの４−（２−ヒドロキシエチル）−１
−ピペラジン−プロパン硫酸ナトリウムおよび0.1％（v
/v）２−メルカプトエタノールを含んでいる。この緩衝
液のpHは水酸化ナトリウムまたは他の塩基により約8.7
に調節される。同じpH範囲での使用に適する他の緩衝液
をピペラジン誘導体に代えることができ、しかも他の抗
酸化剤を上記メルカプトエタノールに代えることもでき
る。

第四級アミノエチルカラムは緩衝溶液で予じめ予備平衡
化し、ガンマインターフエロン含有溶液を添加し、そし
て吸着物質を同じ緩衝液で溶出する。溶出された蛋白溶
液の最初の2/3、すなわち全容積の最初の2/3を、次の精
製工程に移すために溜める。溶出された液の残りの1/3
は同じ方法で平衡化した同じカラムで再度クロマトグラ
フイーにかけることができる。残りの溶液は更に同じ方
法で処理できる。前に述べたように、蛋白濃度はコマー
ジブルー結合検定によつて測定される。

精製のこの時点で任意の濃縮工程が使用できる。溶液を
濃縮する１つの便利な方法は硫酸アンモニウムによる沈
澱である。第四級アミノエチルカラムからの溶出液を0.
2μフイルターを通過させ、硫酸アンモニウムを撹拌
下、５〜10分間にわたつて添加し、最終濃度約40〜60％
飽和にする。懸濁液を氷浴中で数時間放置する。次い
で、沈澱物遠心分離で集め、更に処理が必要なときまで
約−20℃で保存できる。

必要な場合、20mMトリス−HClおよび0.1％２−メルカプ
トエタノールからなる溶液（pH、約7.5）で予じめ10,00
0分子量カツトオフフイルターを通したものに沈澱物を
溶解する。溶液の導電率を、10mMトリス−HClおよび0.1
％２−メルカプトエタノールから成る溶液（pH、約7.
5）を添加することにより約３〜5mSに低下させる。この
溶液を0.2μフイルターに通し、後続の処理に供する。
同一のpH範囲での使用に適する他の緩衝液をトリス−HC
lに代え、他の抗酸化剤を前記メルカプトエタノールに
代えて使用できる。

溶液中の正に荷電した蛋白分解酵素およびその他の蛋白
は、陽イオン交換樹脂を用いることにより好都合に実施
される次の処理工程において除去される。

カルボキシメチル陽イオン交換樹脂（カルボキシメチル
結合架橋デキストラン、セルロース、アガロースまたは
アクリル支持体）を用いることにより優れた結果が得ら
れる。前の工程で得られた溶液のpHは、HClまたは他の
適当な酸を用いることにより約7.5に調節される。２−
メルカプトエタノールまたは他の適当な抗酸化剤を約0.
1％（v/v）の濃度に添加する。0.1％（v/v）の２−メル
カプトエタノールを含有する脱イオン水を添加し、導電
率を20mS以下、好しくは約３〜5mSに低下させる。この
溶液を0.2μフイルターを通して過し、後のクロマト
グラフイーに備える。

陽イオン交換樹脂カラムを20mMトリス−HClおよび0.1％
２−メルカプトエタノールから成る溶液（pH、約7.5）
のような適当な緩衝液で平衡化する。平衡化カラムを同
じ緩衝液で２〜３回洗浄し、ガンマインターフエロン含
有溶液を添加した後、この溶液を、平衡化に使用した緩
衝液中に溶解した塩化ナトリウムの勾配（カラム容積の
約13〜15倍量）で溶出する。塩化ナトリウム含量は緩衝
液中０ないしほぼ0.5Mの濃度に増加される。

適当な画分を集め、ゲル電気泳動（SDS−PAGE）、分析H
PLCおよび抗ウイルス活性について分析することもでき
る。最も純度の高い画分を以後の処理のためにプールす
る。低濃度のインターフエロン含有画分はほぼ40〜60％
飽和度の硫酸アンモニウムで沈澱し、再溶解し、過
し、前述のようにカルボキシメチルカラムにより再度ク
ロマトグラフイーにかける。

再クロマトグラフイー溶液から回収した画分を分析し、
最も純度の高い画分を第一のカルボキシメチル溶出液か
ら得た画分と共にプールする。

もし、高分子量の疎水性不純物の存在がSDS−PAGEまた
はその他の適当な方法で検出される場合には、溶出液を
任意のクロマトグラフイーにかけて精製方法におけるこ
の時点で前記不純物を除去する。フエニル樹脂によつて
満足すべき結果が得られることが判明した。また、オク
チルおよびブチル樹脂も使用できる。前工程で得た溶液
を0.2μフイルターを通して過し、塩化ナトリウム
（0.5〜0.75M）を加えて溶液の導電率をほぼ50〜75mSに
上昇させる。

緩衝液は20mMトリス−HCl、0.1％（v/v）２−メルカプ
トエタノールおよび導電率を適切な範囲に上昇させるた
めのNaClを500〜850mM、好しくは500〜700mMである。

カラムは緩衝液で予備平衡化し、サンプルをカラムにか
ける。カラム容積の約２〜４倍量の緩衝液をカラムに添
加する。次いで吸着された物質を、2mMトリス−HCl、10
0mM NaClおよび0.1％（v/v）２−メルカプトエタノール
から成る溶液（pH、ほぼ7.5）のカラム容積の少くとも
１倍以上、好しくは約５〜約10倍量で溶出する。適当な
サイズの画分を集め、SDS−PAGE、分析HLPCおよび抗ウ
イルス活性について分析し、最高純度の画分をプールす
る。

インターフエロン含有溶液を、フエニルカラムクロマト
グラフイーの後で濃縮することが一般に好しい。また、
任意工程である疎水性カラムクロマトグラフイーが用い
られない場合の事例では、この時点でインターフエロン
含有溶液を濃縮することが一般的に望しい。

溶液の蛋白濃度はコマージブルー結合検定によつて決定
される。蛋白濃度が0.2mg/ml以下である場合、その溶液
を10,000分子量カツトオフ膜を用いる限外過によつて
濃縮することが好しい。

この溶液に最終濃度約40〜約60％飽和度となるように硫
酸アンモニウムを撹拌下に５〜10分間に亘つて添加する
ことにより、更に濃縮を行うことができる。懸濁液を氷
浴中に放置し、その後沈澱物を遠心分離で集める。この
沈澱物を、20mMトリス−HCl、500mM NaClおよび0.1％２
−メルカプトエタノールから成り予じめ10,000分子量カ
ツトオフフイルターを通して過した溶液（pH、約7.
5）に溶解する。この濃縮液を0.2μフイルターを通過さ
せ、次の精製工程に供する。

低分子量および高分子量不純物、および分解されたガン
マインターフエロンおよびインターフエロン凝集物を最
終クロマトグラフイー精製工程で除去する。この工程は
前の処理工程からのガンマインターフエロン含有溶液を
ゲル過樹脂を通過させることによつて行われる。親水
性過ゲルは分子ふるいとして働き、溶液中に含まれる
低および高分子量不純物から適当なサイズの画分を分離
する。特に有用な過ゲルはフアルマシアフアインケミ
カル社製の商標名セフアデツクスＧ−100として特定さ
れる架橋デキストランをベースとするゲルである。この
樹脂は球状蛋白およびペプチドについて4,000〜150,000
の分画分子量および多糖類について1,000〜10,000の分
画分子量を持つ。蛋白について約1,000〜約200,000のカ
ツトオフ範囲を持つ他の樹脂も使用できる。

セフアデツクスＧ−100樹脂カラムは20mMのトリス−HC
l、500mM NaClおよび0.1％２−メルカプトエタノールか
ら成る緩衝溶液（pH、約7.5）で予じめ平衡化される。
吸着された物質を上記緩衝液で溶出し、次いで適当な画
分を集める。各画分の蛋白濃度をコマージブルー結合検
定で測定する。画分は、SDS−PAGE、分析HPLCおよび抗
ウイルス活性により判断した純度に基いていつしよにさ
れる。

別法として、硫酸アンモニウム濃縮工程での沈澱物を、
20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、および0.1％（v/
v）２−メルカプトエタノールから成る溶液（pH、約7.
5）に溶解することができる。このガンマインターフエ
ロン含有溶液を予じめ上記緩衝液で平衡化したセフアク
リルＳ−200ゲル過カラムにかける。（尚、セフアク
リルＳ−200アクリルアミドで架橋されたアガロース樹
脂であるフアルマシアフアインケミカル社の商標名であ
る。）最終生成物は透明ないし僅かに曇つた溶液で、無
色ないし淡黄色である。SDS−PAGEで決定された見かけ
分子量は17,000〜19,500である。

精製されたガンマインターフエロンは前に用いた緩衝液
に対して透析する。適当な緩衝液は20mMのリン酸ナトリ
ウムおよび6mM L−シスラインから成り、pH約6.8であ
る。他の適当な緩衝液は15mMのリン酸ナトリウム、8mM
のクエン酸ナトリウムおよび6mMのＬ−システインHClか
ら成るpH5.0の溶液である。８時間以上透析を継続し、
系中に窒素を連続的に通して酸化を最低に押えることが
好しい。

必要に応じて、精製ガンマインターフエロン溶液は上記
の方法で濃縮できる。

以下参考例および実施例１−３で本発明をさらに詳しく
説明する。

参考例（GIF143発現ベクターの作製） GIF143発現ベクターを以下の手順に従つて作製した。

dcm大腸菌（シトシンのメチル化反応が欠損した株）形
質転換体であるWA802/pGIF54より常法に従つてpGIF54
（GIF146に相当する遺伝子を含むpGIF4と実質的に同等
なプラスミド）を得た。５μｇのpGIF54を20unitのAat
II及び20unitのBal IIで処理し、約600塩基対の、GIF14
6遺伝子の一部とlacUV5プロモーターを含むDNA断片を得
た。次に、このDNA断片約0.5μｇを5unitのAva IIを用
いて切断し、GIF146遺伝子の一部を含む約400塩基対のD
NA断片を得た。一方pIN5T4 5μｇを、20unitのEcoRIと2
0unitのBgl IIを用いて切断し、テトラサイクリン耐性
遺伝子、lppプロモーター、及び複製起点を含むDNA断片
を得た。この両DNA断片と第１図に示した化学合成リン
カー（DNA synthesizer;Applid,Biosystems380Aを用い
て合成）0.5μｇを混合ライゲーシヨンすることによ
り、pIN5T4N143を得た。さらに得られたpIN5T4N143を常
法例えば、特願昭56−163303記載の方法によりW3110に
形質転換し、W3110/pIN5T4N143を得た。

得られた形質転換体がGIF143生産株であることは、以下
に示す手順で確認した。

W3110/pIN5T4N143をポリペプトン３％、酵母エキス２
％、グルコース２％、KH₂PO₄0.5％、MgSO₄・7H₂O0.01％
およびテトラサイクリン20μg/mlを含む培地1.5mlと共
に、16.5mm試験管で30℃、24時間振盪培養した。培養終
了後（OD₆₆₀≒８）培養液0.5mlを1.5ml溶液エツペンド
ルフカツプにとり、遠心分離（10,000rpm,5分間）する
ことにより集菌した。これを、1mg/mlリゾチーム・1mM
−EDTAを含むPBS溶液（0.8％NaCl、0.02％KCl、0.115％
Na₂HPO₄、0.02％NaH₂PO₄）0.5mlに懸濁し０℃、30分間
反応後、凍結融解を３回繰り返すことにより細胞を破壊
し、遠心分離（10,000rpm,10分間）して上清画分を回収
した。この上清画分を特開昭58−201995に記載の方法に
従つて抗ウイルス活性を検討した。その結果６×10⁴uni
t/mlの抗ウイルス活性を認めた。一方、同様に集菌し得
られた菌体をSDSサンプル溶液（7M尿素、１％SDS、１％
２−メルカプトエタノールを含んだ10mMリン酸緩衝液pH
7.2）200μに溶解後、沸騰水浴中で10分間加熱した。
このサンプル20μを13％SDS/PAGEで分離後、コマージ
ブルーR250で淡白染色を行つた。その結果、大腸菌総蛋
白の約20％に相当するGIF143蛋白（分子量約18Kd）の生
産を認めた。

実施例１ GIF146の抽出・精製 GIF146生産株であるW3110/pIN5T4をポリペプトン３％、
酵母エキス２％、グルコース２％、KH₂PO₄0.5％、MgSO₄
・7H₂O0.01％およびテトラサイクリン20μg/mlを含む培
地で、24時間通気撹拌培養した。培養液の菌体をグルコ
ン酸クロルヘキシジンで完全に殺菌後、遠心分離し（8,
000rpm、10分間）、W3110/pIN5T4の湿菌体800gを得た。
これを1mM ZuCl₂を含む冷却した20mMトリス塩酸バツフ
アー（以下THB）pH7.4 5.1に懸濁し、氷冷したManton
Gualin社製ホモジナイザーM15にて、ホモジナイズした
後、遠心分離し（7,000rpm,20分間）上清を得た。これ
に、15％ポリエチレンイミン（以下PEI）水溶液（pH8.
0、HClで調整）を最終濃度0.75％となる様に加え10分間
撹拌後、４℃で２時間放置した。生じた沈澱を遠心分離
（7,000rpm、20分間）で除去し、上清4.7を得た。こ
の上清を、20mM N−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−３−プロパンスルフオン酸バツフアー（EPPSバツ
フアー）pH8.6で平衡化したQAEセフアデツクスＡ−25
（フアルマシア社製）カラムにかけ、素通り画分を得
た。次に、0.1％の２−メルカプトエタノール（以下２
−ME）を含む20mM THB pH7.4で平衡化したCMセフアロー
スCL6B（フアルマシア社製）カラムに、この素通り画分
をかけ吸着した活性画分を０〜0.5MのNaCl直線濃度勾配
で溶出し、インターフエロン活性の高い区分を集めた。
なお、インターフエロン活性は特開昭58−201995号公報
に記載した方法に準じて測定した。続いてこの画分に50
％飽和となる様に硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行
い、7000rpm、20分間遠心分離して沈澱を得た。沈澱部
を0.3M NaCl及び0.1％2MEを含む20mMリン酸ナトリウム
バツフアー（以下、20mM PBS）pH7.4に溶解し、同バツ
フアーで平衡化したセフアクリルＳ−200（フアルマシ
ア社製）カラムにかけ、最終精製品として298mgのGIF14
6に対応するポリペプチドを得た（インターフエロンの
比活性1.6〜1.7×10⁶U/mg蛋白）。このポリペプチドのS
DS/PAGEによる純度検定では純度99％以上であり、また
同SDS/PAGEのバンドの位置は分解を受けていないGIF146
の位置と一致した。更に、アミノ酸分析より得られたポ
リペプチドが前記アミノ酸配列（Ｉ）と同じアミノ酸配
列を有することも確認し、本発明の抽出精製方法が有用
であることが認められた。

尚、上記の精製過程中で用いたセフアクリルＳ−200の
代りにセフアデツクスＧ−100（フアルマシア社製）を
用いても同様な結果を得た。

実施例２ GIF143の抽出および精製実施例１と同様に、W3110/pIN5T4N143（参考例参照）を
培養の後、グルコン酸クロルヘキシジンで殺菌し、集菌
して得られた湿菌体300gを3mM ZnCl₂を含む冷却した20m
M THB pH7.4 2.1に懸濁し、ホモジナイズした後、遠
心分離し（7000rpm、20分間）、上清画分を得た。これ
を実施例１と同様にPEI処理して、上清1000mlを得た。
次に、この上清を0.1％2MEを含む20mM THB（pH7.4）で
平衡化したCMセフアロースCL6Bカラムに吸着させた後、
0.1〜0.8M NaClの直線濃度勾配で溶出した。活性画分を
0.1％2MEを含む20mM THBで10倍稀釈し、同バツフアーで
平衡化したCM−トーヨーパールカラム（東洋曹達社製）
に吸着させ、洗浄後、0.1〜0.8M NaCl直線濃度勾配で溶
出した。インターフエロン活性を有する区分を集め、硫
酸アンモニウムを加てえ20％飽和とした後、ブチルトー
ヨーパールカラム（東洋曹達社製）を通過させ、通過区
分を蒸留水に対して透析した。これにより最終的に396m
gの蛋白を得た（インターフエロン比活性:4.8×10⁶U/mg
蛋白）。

実施例１の場合と同様にアミノ酸分析及びSDS/PAGEの結
果から、純度99％以上で前記アミノ酸配列（III）と同
じアミノ酸配列を有するポリペプチド（GIF143）が得ら
れた。更に、抽出時に添加した亜鉛化合物は原子吸光分
析を行つても検出できなかつた。

実施例３ I.細胞の回収、蛋白の遊離およびポリエチレンイミンに
よる沈澱組換えガンマインターフエロンを含む不活性化した大腸
菌（W3110/pIN5T4）細胞を遠心分離によつて集める。細
胞を1mM ZnCl₂を含有する20mMトリス−HCl緩衝液（pH7.
5）中に懸濁する。細胞は高圧ホモジナイザー中で破砕
し、細胞破砕物を遠心分離し、上清を回収する。塩酸で
pH8に調節した10％（v/v）ポリエチレンイミン（PEI）
水溶液を上清に添加し、最終PEI濃度を最大0.8％にす
る。混合物を遠心分離し、上清を集める。

II.第四級アミノエチル（QAE）カラムクロマトグラフイ
ー PEI上清のpHを4N NaOHにより8.7に調節する。脱イオン
水を添加して導電率を10mS以下に減じる。このバツチを
ゲル１当り蛋白質50g以下の負荷でQAEカラムにかけ
る。カラムにかける前に、20mMの４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジン−プロパンスルホン酸ナトリ
ウムおよび0.1％の２−メルカプトエタノールの緩衝液
（pH8.7）でカラムを平衡化する。溶出は同じ緩衝液で
行う。蛋白溶液を集め、次の第III工程でクロマトグラ
フイーにかける。

III.カルボキシメチル（CM）カラムクロマトグラフイー工程２から蛋白溶出液のpHを4N HClで7.5に調節し、２
−メルカプトエタノールを最終濃度0.1％となるように
添加する。0.1％の２−メルカプトエタノールを含有す
る限外過水で稀釈することにより導電率を20mS以下に
調節する。この溶液を0.2μフイルターに通し、次いで
ゲル１当り蛋白35g以下の負荷でCMカラムに加える。
カラムにかける前に、pH7.5であり、NaClで導電率を20m
S以下に調節した20mMトリス−HClと0.1％２−メルカプ
トエタノールとから成る緩衝液でカラムを平衡化する。
この平衡化緩衝液をカラム容量の少くとも２倍でカラム
を洗浄する。平衡化緩衝液に溶解した０〜0.5M NaClの
塩濃度勾配でガンマインターフエロンを溶出する。ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）で決定される画分をいつしよにする。

IV.フエニルカラムクロマトグラフイー SDS−PAGEによつて高分子量不純物が検出された後、フ
エニルカラムによるクロマトグラフイーが行われる。Na
Clを添加して導電率を50〜75mSにし、その後溶液を、ゲ
ル１当り蛋白15g以下の負荷でフエニルカラムに添加
する。カラムにかける前に、20mMトリス−HCl、0.5M Na
Clおよび0.1％２−メルカプトエタノール（pH7.5）で平
衡化する。サンプルをカラムに負荷した後、少くともカ
ラム容積量の平衡化緩衝液を加える。カラムを20mMトリ
ス−HCl、0.15M NaCl、0.1％２−メルカプトエタノール
（pH7.5）で溶出する。SDS−PAGEおよび抗ウイルス検定
によつて決定される活性画分をいつしよにする。

V.硫酸アンモニウム沈澱いつしよにしたカルボキシメチル（工程III）またはフ
エニル（工程IV）画分の蛋白濃度が0.2mg/ml未満の場
合、この溶液を10,000M.W.カツトオフ膜を用いる限外
過により濃縮する。硫酸アンモニウムを最終濃度40〜60
％飽和度となるように添加する。必要であれば沈澱物を
遠心分離で集め、約−20℃で保存する。

VI.セフアデツクスＧ−100カラムクロマトグラフイー硫酸アンモニウム沈澱物を20mMトリス−HCl、0.5M NaC
l、0.1％２−メルカプトエタノールから成る緩衝液（pH
7.5）に溶解する。この溶液を0.2μフイルターに通過さ
せる前に遠心分離する。液を、予じめ上記の緩衝液で
平衡化したセフアデツクスＧ−100カラムに供給する。
負荷はゲル１当り蛋白3.5g以下である。カラムを上記
緩衝液で溶出し、画分をSDS−PAGEで決定していつしよ
にする。

VII.精製したガンマインターフエロンの透析セフアデツクスＧ−100画分をいつしよにしたものを15m
Mリン酸ナトリウム、8mMクエン酸ナトリウム、6mM L−
システイン塩酸塩から成る液（pH5.0）で透析する。透
析は、短くとも５時間の間隔で緩衝液を２回交換し、緩
衝液中を通して窒素を連続吹込みして行う。必要であれ
ば、透析溶液を10,000分子量カツトオフ膜を用いる限外
過により、蛋白濃度1mg/ml以上に濃縮する。精製ガン
マインターフエロン溶液を0.2μフイルターに通し、約
−20℃以下で保存する。

精製ガンマインターフエロンは、その溶液に50％グリセ
ロールを添加することにより、ほぼ−20〜約−30℃の温
度で少くとも数ケ月保存できる。

ガンマインターフエロンは0.2μフイルターを通す過
および20mMリン酸ナトリウムおよび6mM L−システイン
から成る溶液（pH、約6.8）に対して透析することによ
つて使用に供せられる。別法としては、透析液を、15mM
リン酸ナトリウム、8mMクエン酸ナトリウムおよび6mM L
−システイン塩酸塩から成る溶液（pH、約５）にする。
連続窒素吹込み下で少くも８時間透析を行つた後、溶液
を、10,000分子量カツトオフ膜により過することが好
しい。

得られる生成物は少くとも95％のガンマインターフエロ
ン純度を持ちおび約５％以上の収率である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者岡田勉京都府京都市北区衣笠西御所の内町38番２号 (72)発明者山本和守大阪府三島郡島本町若山台１丁目５番18号 104 (72)発明者ナガブシャン，タッタナハリ・エルアメリカ合衆国ニュージャージー州07054, パーシッパニー，サンセット・レイン３ (72)発明者トロッタ，ポール・フィリップアメリカ合衆国ニュージャージー州07070, ラザーフォード，パーク・アベニュー 405 (56)参考文献特開昭59−39297（ＪＰ，Ａ) 米国特許4476049（ＵＳ，Ａ) 欧州特許出願公開77670（ＥＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，Ｖｏｌ．63，Ｎｏ．５（1981）Ｐ．397−401

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えDNA技術によって得られる生理活性
を有するポリペプチドの生産大腸菌を培養して得られる
培養物から、該ポリペプチドの抽出または精製工程にお
いて亜鉛又は銅の塩及びポリエチレンイミンを添加する
ことを特徴とする生理活性を有するポリペプチドの精製
方法。
【請求項２】前記生産大腸菌の培養物から得られる菌体
を亜鉛又は銅の塩を含む溶液に懸濁して破砕し、その遠
心上清にポリエチレンイミンを添加することを特徴とす
る請求の範囲第１項記載の精製方法。
【請求項３】前記生理活性を有するポリペプチドがイン
ターフェロン活性、好ましくはヒトガンマインターフェ
ロン活性を有するポリペプチド、特にGIF146またはGIF1
43である請求の範囲第１項又は第２項記載の精製方法。
【請求項４】前記亜鉛の塩の添加量が0.5〜5mMの範囲で
あり；または前記銅の塩の添加量が0.05〜3mMの範囲で
あり；かつポリエチレンイミンを0.5〜1.5％濃度となる
ように添加することを特徴とする請求の範囲第１項、第
２項または第３項のいずれかの項に記載の精製方法。
【請求項５】ガンマインターフェロン含有溶液から負に
荷電した不純物蛋白、正に荷電した不純物蛋白、並びに
低分子量及び高分子量物質を除去する工程から成り、該
工程は、（１）弱塩基性陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラ
フィーにより負に荷電した不純物蛋白を除去し、（２）弱酸性陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフ
ィーにより正に荷電した不純物蛋白を除去し、ついで（３）ゲル過樹脂による透過クロマトグラフィーで
低及び高分子量物質を除去する、から成ることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４
項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】正に荷電した蛋白を除去した直後か又は低
又は高分子量物質を除去した直後にガンマインターフェ
ロン含有溶液から高分子量疎水性物質を除去する工程を
更に含むことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方
法。
【請求項７】前記陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチ
ル樹脂であり；および／または前記陽イオン交換樹脂が
カルボキシメチル樹脂であり；および／またはゲル過
樹脂が架橋デキストランをベースとするゲルまたはアク
リルアミドで架橋されたアガロース樹脂から選択され；
および／またはガンマインターフェロン含有溶液を、工
程１、すなわち硫酸アンモニウムによる沈澱の後に濃縮
することを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項８】当該方法が、酸素を含まない環境でのシス
テイン含有緩衝液に対するガンマインターフェロン含有
溶液の透析を最終工程として包含する請求の範囲第５な
いし７項のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】（１）ポリエチレンイミンおよび亜鉛ま
たは銅塩を含有する混合物を遠心分離し、得られた沈澱
物を上清から分離し；（２）上記（１）からの溶液を陰イオン交換樹脂を含
むカラムに吸着させ；（３）吸着物質を溶出し；（４）陽イオン交換樹脂を含むカラムに上記（３）で
得た溶出液を吸着させ；（５）吸着物質を溶出し；（６）ゲル過樹脂を含むカラムに上記（５）の溶出
液を吸着させ；そして（７）吸着された物質を溶出する；の各工程を更に含
む請求の範囲第１ないし４項のいずれかの項に記載の方
法。
【請求項１０】工程２からの吸着物質を４−（２−ヒド
ロキシエチル）−１ピペラジン−プロパンスルホン酸ナ
トリウムと抗酸化剤、好ましくは２−メルカプトエタノ
ールとから成る緩衝液で溶出し；および／または工程４
からの吸着物質をトリス−HClおよび抗酸化剤から成る
緩衝液で溶出し；および／または工程６からの吸着物質
をトリス−HClから成る緩衝液で溶出する、ことを特徴
とする請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】陰イオン交換樹脂が第四級アミノエチル
樹脂であり；陽イオン交換樹脂がカルボキシメチル樹脂
であり；ゲル過樹脂が架橋デキストランをベースとす
るゲルである、ことを特徴とする請求の範囲第10項記載
の方法。