JP2006192271A

JP2006192271A - ウイルスおよびウイルス成分を液体、特に血液および血漿から除去するための吸着系

Info

Publication number: JP2006192271A
Application number: JP2006002966A
Authority: JP
Inventors: Goetz Nowak; ノヴァク、ゲッツ; Elke Bucha; ブーヒャ、エルケ; Ute Lange; ランゲ、ウテ; Sven Zeeb; ジーブ、シュヴェン; Alrun Schumann; シューマン、アルラン
Original assignee: Haemosys GmbH
Current assignee: Haemosys GmbH
Priority date: 2005-01-10
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2006-07-27
Also published as: US20070077555A1; CA2532354A1; DE102005001162A1; EP1679117A2; EP1679117A3

Abstract

【課題】体外で行われる吸着プロセスにより、ウイルスおよびウイルス成分、特にＣ型肝炎ウイルスを、生理的液体、特に全血または血漿から除去するための吸着系、ならびに吸着系に使用するための吸着材を提供する。
【解決手段】半径が２０〜１，０００ｍの貫通細孔を備え、気孔率が０．２５〜０．７５である、メタクリル酸由来の単位をモノマーとして含むポリマーマトリクスを有する、平均半径２０〜５００μｍの吸着材粒子を含む構成とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、体外で行われる吸着プロセスにより、ウイルスおよびウイルス成分、特にＣ型肝炎ウイルスを、生理的液体、特に全血または血漿から除去するための吸着系、ならびに本発明の吸着系に使用するための、多孔性ポリマー粒子を含む吸着材に関するものである。

ウイルス性感染症が健康にとって重大な脅威であることは周知の事実である。多くの場合、この分野において現在確立されている予防法や治療法は全く不十分である。

Ｃ型肝炎だけを例にとっても、全世界で２億人以上もの人々がこれに罹患している。現在に至っても、Ｃ型肝炎や、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のようなその他の一般的な感染症をワクチンによって予防する術はない。

ＰＥＧ−インターフェロンとリバビリンとを併用する治療が、現在用いられている標準的なＣ型肝炎の治療法であるが、治療効果が得られるのは患者の約５０％〜６０％に過ぎず、しかもこのような治療は時間がかかる上に高価である。また、このような治療には強力な副作用が多数存在するため、多くの患者が治療を中断するか、あるいは始めからこの治療に対して禁忌を示す。

全世界でウイルス性感染症が公衆衛生政策に及ぼす影響の大きさに鑑み、新規な抗ウィルス療法の開発には多大な学術的・商業的関心が寄せられている。このような関心は患者のウイルス性感染症の治療を可能にする治療方法のみにとどまらず、献血された血液または血漿を介して起こるウイルス性感染症の伝染の防止を可能にする方法にも及んでいる。

Ｃ型肝炎に対する新薬、例えば、ヌクレオシド類似体、ウイルス特異的酵素の阻害剤、または免疫反応モジュレーター等は、未だ臨床試験の初期の段階にある（例えば、非特許文献１：Dev. A. et al.: Infect. Med. 21:28-36, 2004参照）。Ｃ型肝炎ウイルスは、そのウイルスゲノムの高突然変異率により、迅速に耐性を獲得するが、このことが治療を制限する主な要因となっている。さらに、現時点では、これらの新規な治療アプローチの有効性および安全性を明確に予測することは不可能である。特に、Ｃ型肝炎の長期治療の場合、発癌の可能性や臓器毒性等、深刻な副作用が起こる危険性がある。

吸着作用を利用した体外治療方法は、現在、例えば、重症高コレステロール血症、ならびに、慢性関節リウマチや特発性血小板減少性紫斑病等の重症自己免疫疾患の治療に使用されている。これらの場合、リポ蛋白、免疫グロブリン、または免疫複合体の吸着は、吸着材表面に存在するプロテインＡ、抗体、または負電荷等の表面結合リガンドを介して行われることが好ましい。前記吸着材は細胞との適合性が悪いため、これらプロセスのほとんどは、全血中ではなく、血漿中でしか行えない。

体外治療方法の適用可能性を広げるため、これまでに多数のアプローチが行われてきた。例えば、毒素、抗体、免疫複合体、またはサイトカインの領域から、他の病原性高分子を除去することを目的とした研究が特に重要視されている。このような方法は、病原体を液体から除去するための手段としても認識されている。これに関しては、献血された血液または血漿から、インビトロで病原体を除去する非治療的なプロセスがこれまでに使用されている。この目的においては、濾過プロセスを使用することが好ましい。例えば、欧州特許第００２９４９号明細書（特許文献１）および欧州特許第０５１７５０１号明細書（特許文献２）は、特殊な構造の多孔性ポリマー膜を使用し、種々のタンパク質含有液体からウイルスを濾過して除去することを開示している。欧州特許第１４４４９９６号明細書（特許文献３）には、ウイルスと白血球とを同時に除去できるウイルスフィルターが記載されている。このフィルターの有効性は、濾過作用のみならず、前記フィルターの膜表面によって開始される血液試料中の補体系の活性化にも基づいている。インビトロでの使用のため、ウイルスに対して細胞受容体も安定化させており、前記細胞受容体が、その表面への固定化により、汚染された液体に対してウイルス吸着体として機能するようにしている（例えば、特許文献４：国際公開第８９／０１８１３号パンフレット参照）。これらの方法は、患者に対して直接行うことを意図したものではない。

濾過プロセスが主要な工程である液体、血漿、または血液の汚染除去のためのこれらインビトロでの方法とは対照的に、主として吸着技術に基づくウイルス性感染症治療用の体外プロセスの開発も試みられている。ここで、ウイルス表面における特殊な認識構造との特異的な相互作用に重点を置くことが好ましいが、このような特殊な認識構造は、獲得耐性の発生という問題を必然的に伴う。例えば、表面に結合しているモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体への吸着（例えば、特許文献５：独国特許発明第１０１１８１１５号明細書、特許文献６：米国特許第６，５２８，０５７号明細書参照）、またはウイルス表面の構造に特異的に向かう抗体の部位への吸着（例えば、特許文献７：中国特許第１４５７８９９号明細書参照）によってウイルスを除去することが提案されている。また、国際公開第２００４／０６４６０８号パンフレット（特許文献８）には、ウイルスコートのタンパク質（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＧＰ１２０）に対するある種のレクチンの親和性により、吸着作用を得ることが開示されている。さらに、表面に固定されたＣ１エステラーゼ阻害剤に対するＨＩＶの結合（例えば、特許文献９：欧州特許第０９６６９７６号明細書参照）またはＨＩＶについて、結合されたＣＤ４細胞受容体（例えば、特許文献１０：米国特許第６，１７４，２９９号明細書参照）についても従来技術で述べられている。

非特異的なウイルス吸着方法においては、化学修飾されたポリマー表面、例えばイオン交換樹脂内に存在するような、例えば硫酸基（例えば、特許文献１１：欧州特許第０６７９４３６号明細書参照）または若干酸性もしくは塩基性である基（例えば、特許文献１２：米国特許第５，０４１，０７９号明細書参照）が使用される。しかしながら、これらの場合、全血との接触により、血液または血漿成分との望ましくない相互作用が起こってしまうことが多い。これにより、このような吸着材の長期にわたる使用が制限されてしまう。なぜなら、吸着材表面の化学的性質により、凝血等の活性プロセスが促進され、これにより短時間使用しただけで液体が吸着装置を通過できなくなるからである。このため、吸着材と全血中の細胞成分との直接接触を、例えば、予め濾過を行い、赤血球、白血球、血小板等の血液成分を分離して血漿のみを残すこと等により、回避する必要がある。国際公開第０１／４０４４８号パンフレット（特許文献１３）は、一定の厚さおよび長さのポリマー側鎖を有し、表面に種々の官能基を有する膜を用いた濾過によってウイルスを除去する方法を開示しているが、このような方法もまた全血に対する治療目的での使用には適していない。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染患者の血液中におけるウイルス量の非特異的な減少が、適応症が異なるいくつかの体外プロセスとの関連において述べられている。例えば、顆粒球および単球をセルロースの粗粒子に吸着させて除去する潰瘍性大腸炎の治療に用いられる細胞アフェレーシスプロセスの最中に、前記ウイルス量の減少が見られる。サワダら（Sawada et al.）は、Therapeutic Apheresis 7: 547-553, 2003（非特許文献２）においては付加的に起こる、限られたＨＣＶ−ＲＮＡの減少について述べているに過ぎないが、米国特許第６，７１３，２５２号明細書（特許文献１４）においては、治療回数の増加に伴う治療効果を開示している。

人工腎による定期的な治療を受けたＣ型肝炎患者は、透析を受けなかったＣ型肝炎患者に比べ、平均して、より少ないウイルス量を示した。しかしながら、ある種の透析ユニットの膜を用いて行うウイルスの直接的な除去は、依然として物議の対象となっている（例えば、非特許文献３：Fabrizi Fet et al.: J. Nephrol 16: 467-475, 2003参照）。脂質アフェレーシスプロセスに伴って起こり得るＨＣＶ感染患者の血液中におけるウイルス量の減少に関するデータもまた、物議の対象となっている（例えば、非特許文献４：Marson, P. et al.: Int. J. Artif. Organs 22: 640-644, 1999；非特許文献５：Schettler V. et al.: Eur. J. Clin. Invest. 31: 154-155, 2001参照）。これらのプロセスのいずれに関しても、既存のウイルス性感染症に対する治療効果は未だ立証されていない。
欧州特許第００２９４９号明細書欧州特許第０５１７５０１号明細書欧州特許第１４４４９９６号明細書国際公開第８９／０１８１３号パンフレット独国特許発明第１０１１８１１５号明細書米国特許第６，５２８，０５７号明細書中国特許第１４５７８９９号明細書国際公開第２００４／０６４６０８号パンフレット欧州特許第０９６６９７６号明細書米国特許第６，１７４，２９９号明細書欧州特許第０６７９４３６号明細書米国特許第５，０４１，０７９号明細書国際公開第０１／４０４４８号パンフレット米国特許第６，７１３，２５２号明細書 Dev. A. et al.: Infect. Med. 21:28-36, 2004 Sawada et al.: Therapeutic Apheresis 7: 547-553, 2003 Fabrizi Fet et al.: J. Nephrol 16: 467-475, 2003 Marson, P. et al.: Int. J. Artif. Organs 22: 640-644, 1999; Schettler V. et al.: Eur. J. Clin. Invest. 31: 154-155, 2001

上述のような当業界の現状において、ウイルスに感染した患者の血液または血漿からウイルスを特異的に除去するための方法であって、耐性を形成することなく、患者自身の体が持つ抵抗力との組み合わせにより、ウイルス性感染症を治癒ことができる、効率的で、簡便で、耐容性が良好で、かつ経済的に実現可能な方法が所望されている。

したがって、本発明は、従来の抗ウイルス治療アプローチにおける問題点、特に、その有効性や、耐性および毒性の形成に関する問題点を、可能な限り低コストで解消する、既存の治療法の代替となるウイルス性感染症の制御および予防のための新たな可能性を開発することを目的とする。治療法の選択肢は、長期にわたるウイルス血症に付随するウイルス性感染症に適用可能であるべきである。本発明は特に、血液に適合可能な吸着材を用いた吸着系であって、特異的な治療アプローチを考慮した場合に、目的とするウイルスおよびウイルス成分の除去に適してはいるが、その作用機構は１種または数種のウイルスの表面構造のみに作用することを目的としたものではない吸着系を提供することを目指していた。

この目的は、ウイルスおよびウイルス成分を、生理的液体、特に血液または血漿から除去するための、粒状の吸着材を含む吸着系によって達成される。前記吸着材は、貫通細孔を備えたポリマーマトリックスを有する平均直径２０〜５００μｍの粒子を含む。

ウイルスの種類によっては、２５〜１，０００ｎｍの細孔半径がウイルス除去に特に適していることがわかっている。

吸着は、ウイルスを含有する全血または血漿等の液体が、例えば、薬包または薬包状容器の充填物の形態で提供できる前記吸着材と接触している間に起こる。本発明の吸着系を使用してウイルス量を減少させることにより、ウイルス性感染症の治療および予防が可能となる。

感染患者の生体内におけるウイルス数を低減するため、前記吸着系を、体外プロセスを用いて患者の血液または血漿に接触させることが好ましい。前記吸着系は、例えば、体外循環によって、血液または血漿の循環に組み込むことができる。しかしながら、本発明の吸着系は、例えば、輸血された血液または血漿等、患者の生体へ再導入されないか、または直接的には再導入されない生理的液体の処理にも適している。

驚くべきことに、特殊な多孔質特性を備えたポリマー粒子によれば、水溶液、血漿、または血液から不可逆的にウイルスを除去できるようなウイルス吸着が可能であることがわかっている。欧州特許第１１１５４５６号明細書には、多孔性粒子を使用し、約３０，０００ダルトンまでの小、中程度の分子サイズを有する様々な病原物質または毒素を体外治療プロセスによって血漿または血液から除去することが開示されている。しかしながら、これまでのところ、多孔性の粒状吸着材により、ウイルスのような複雑な生物学的構造物を、例えば、表面に結合した抗原または抗体等の生物学的認識構造物を使用することなく、たとえ全血からであっても効率的に除去できるという報告はない。

前記吸着材の粒子は、貫通細孔が散在するポリマーマトリックスを有する粒子である。このような貫通細孔は、前記ポリマーマトリックス内を流路状に延びている。このような流路は、前記粒子内において、別々に延びていてもよいし、分岐および／または交差してもよい。処理対象の液体の流動挙動を考慮すると、分岐および／または交差した流路が好ましい。前記貫通細孔は、前記粒子の透過性が確保されるように、前記粒子の表面に向かって開口している。しかしながら、本発明の粒子として、多孔性の表面を有するマイクロカプセル、すなわち、比較的薄い外殻（総直径の約５％まで）が、マトリックス材料を含まない中空の中心部を覆っている粒子を用いるべきではない。

本発明で使用されている「細孔半径」という用語は、モデルを使用して標準的な測定方法（逆相サイズ排除クロマトグラフィー（inverse size-exclusion chromatography））によって求めることができる、全細孔とそれらの長さの平均値として表される円筒状流路の細孔幅を指す。したがって、除去する物質によっては、前記細孔半径は２５〜１０００ｎｍであることが好ましく、５０〜６００ｎｍであることが特に好ましい。ほとんどのウイルスに関し、８０〜４５０ｎｍの半径が用いられる。

ウイルスの除去を効果的に行うためには、前記細孔半径がそのウイルスの半径よりも大きいことが好ましいことがわかっている。Ｃ型肝炎ウイルスに関しては、その直径が４０〜７５ｎｍであるので、好ましい細孔半径は８０〜４５０ｎｍである。

ウイルスおよびウイルス成分を効率的に分離するためには、前記粒子の気孔率（マトリックスの体積と前記マトリックスに含まれる細孔の体積とを合計した全体積のなかで前記細孔の体積が占める割合として表される）は、０．２５〜０．７５であることが好ましく、０．４〜０．６であることがより好ましい。

本発明の吸着系は、平均直径２０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上の粒子を含み、例えば、８０μｍ以上または１００μｍ以上の粒子を含む。前記平均直径の上限は５００μｍであり、好ましくは３５０μｍまたは２５０μｍである。平均直径１００〜２５０μｍの粒子が特に好ましい。前記粒子は球形であることが好ましい。

上述の好ましい粒子サイズによれば、本発明の吸着系に含まれる吸着材の各粒子間に十分な大きさの空隙を確保できる。このことは、例えば、全血または異成分から成るその他の液体の処理において重要である。なぜなら、血漿はウイルスと共に粒子の貫通細孔を通過することが好ましいが、赤血球、白血球、血小板等のサイズの大きい血液成分は前記吸着系を通過するためにこのような空隙を必要とするからである。これに応じて粒子サイズを選択することにより、前記細胞血液成分がこれらの空隙を通過できると共に、この通過によって、前記ウイルス含有血漿を確実に前記細孔に通過させるだけの流動抵抗が発生するように、前記空隙を調整することが好ましい。

前記吸着材の粒子の比表面積は、通常５０〜１，０００ｍ²／ｇ、好ましくは５０〜５００ｍ²／ｇ、特に好ましくは５０〜３００ｍ²／ｇまたは５０〜１５０ｍ²／ｇである。

前記吸着系内に存在する多孔性粒子は、ポリマーマトリックスを含んでいる。ポリマーマトリックスという用語には、２種類以上の異なるモノマーからなるコポリマーも含まれる。本発明で使用される粒子は、ポリマー材料が生理的液体と接触した際に不適合生成物を放出しないか、またはポリマー材料自体が問題になっている生理的液体に対して不適合でなく、かつ多孔性マトリックスを形成する上で好適であるという要件を満たしている限り、好適なポリマーに関して何ら限定されない。例えば、フィブリノーゲン等のタンパク質成分または血小板等の細胞成分の前記粒子表面への非特異的な結合を妨げるため、前記マトリックスに使用するポリマーは、イオンの形態で存在している基または生理条件下でイオン化する可能性がある基を含有しないことが好ましい。

吸着材の粒子の多孔性ポリマーマトリックスに使用される材料は、透過する液体の圧力によって粒子が変形することがないように、十分な剛性を有していることが好ましい。前記ポリマーマトリックスとしては、水溶液中で寸法が安定している、すなわち、前記粒子の膨潤により、前記粒子または前記細孔のサイズが変化しないものを使用すべきである。

前記吸着材の粒子の多孔性ポリマーマトリックスを形成する上で好適なポリマーの例としては、ビニル化合物、好ましくはメタクリル酸エステルもしくはスチレン、または好適な架橋剤を用いて得られる、エチレングリコールジメタクリレートまたはジビニルベンゼン等のこれらのコポリマーが挙げられる。

粒子表面にさらに血液適合性を付与するための作用物質で前記ポリマーマトリックスをさらに処理する必要が生じる可能性を考慮すると、欧州特許第０９７５６８０号明細書または欧州特許第１２８２６９５号明細書に記載されているようなポリマーを前記多孔性ポリマーマトリックスに使用することが好ましい。これらのポリマーの調製に際しては、重合可能な二重結合または重縮合可能な官能基に加え、さらにカルボニル基を前記重合反応に関与しないケトンまたはカルボン酸誘導体の形態で含むモノマーが用いられる。前記ポリマーは、式（Ａ）の構造要素を含んでいることが好ましい。

式中、基Ｒは同一でも異なっていてもよく、アルキル基、アリール基、または水素原子を表す。前記アルキル基は、直鎖状、分枝状、または環状であってもよく、１〜２０個の炭素原子からなるのが好ましく、１〜８個または１〜４個の炭素原子からなるのが特に好ましい。前記アリール基は、６〜１８個の炭素原子からなるのが好ましく、６〜１２個の炭素原子からなるのが特に好ましい。二価の基であるＸは任意の基であり、Ｏ、ＮＲ、またはＣＨ₂（Ｒは先に定義した通り）を表す。しかしながら、先に述べたように、構造要素（Ａ）内におけるこれらの略称で表される基は、イオンの形態で存在していないか、もしくは、生理条件下ではイオン化されないことが好ましい。したがって、基−Ｘ−Ｒとして特に好ましいのは、アルコキシ基であって、そのアルキル部分が先に定義した通りであり、好ましくはメチル基であるものである。

構造要素（Ａ）を形成する上で特に好ましいモノマーは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を有するメタクリル酸アルキルであり、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル等である。さらに、酢酸ビニル、メタクリル酸シクロヘキシル、もしくはメタクリル酸フェニル、または前記モノマーの混合物を使用することも可能である。しかしながら、前記吸着材の粒子のポリマーマトリックスには、メタクリル酸メチル由来の単位をモノマーとして含むポリマーを使用することが特に好ましい。

式（Ａ）の構造要素を有する前記ポリマーを何らかの割合で含有するか、またはさらに別のポリマー成分、例えばポリスチレン、ポリアクリロニトリル、もしくはポリアミドを１以上含有するコポリマーまたはポリマー混合物を使用することも可能である。重合後に構造要素（Ａ）を形成するモノマーが、総モノマー量の５モル％以上、例えば１０モル％または２０モル％、を占めることが好ましい。また、このようなモノマーの量が３０モル％以上であることがさらに好ましく、５０モル％以上であることが特に好ましい。

前記多孔性ポリマーマトリックスは、架橋ポリマーを含むことが好ましい。架橋ポリマーの製造においては、架橋剤、すなわち、網目を形成する二官能性または多官能性のモノマーが、前記モノマーと共に使用される。前記二官能性または多官能性のモノマーは、例えば２以上の重合可能な基を含み、重合中に添加される。このようなモノマーの例（ただし、単に説明のためだけに挙げる例である）としては、適切な網目形成可溶化剤と組み合わせたジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート、またはブチレングリコールジメタクリレートが挙げられる。ポリメチルメタクリレートコエチレングリコールジメタクリレート（polymethyl methacrylate co-ethylene glycol dimethacrylate）は、前記多孔性粒子を構成する上で特に好ましいコポリマーである。メタクリル酸メチルとエチレングリコールジメタクリレートのモル比は、４：２〜０．２５：１であることが好ましく、２：１〜１：２であることが特に好ましい。

粒子サイズまたは細孔サイズが上述の要件を満たすポリマーマトリックスを含む粒子は、公知の方法で製造できる。好適な方法の例としては、懸濁重合が挙げられる。この懸濁重合においては、第１のモノマー、さらに任意で架橋剤と第２（外側）の相とが必要であり、前記モノマーと前記架橋剤は、前記外側の相に溶解しないものでなければならない。重合開始剤として用いられる遊離基を、前記モノマーに溶解させる。得られたモノマー混合物は、力学的エネルギーを加えられると（攪拌が最も簡便である）、前記外相（例えば、水）に細かく分散される。水溶性保護コロイドを添加することにより、前記モノマー相の合体や破壊が防止される。懸濁重合の最中に、球状のポリマービーズが形成される。ここで、攪拌速度、保護コロイドの種類や量等の調製条件を変更することにより、個々の粒子のサイズを大まかに調整することができる。重合時の混合熱力学に影響を与える、いわゆるポロゲン（porogen）を添加することにより、前記材料に意図した通りの細孔を設けることができる。このようなポロゲンの例としては、シクロヘキサノール、オクタノール、およびその他の第一級アルコール、ならびに６個以上の炭素原子を有するアルカン、酢酸ブチル、トルエン、シクロヘキサノン、ブタノン、キシレン、トリクロロメタン、酢酸エチル、線状ポリメタクリル酸メチル（linear polymethyl methacrylate）、またはこれらの成分の混合物が挙げられる。ここで、反応が進むにつれて前記ポリマーがそのモノマーに溶解しなくなり、析出するということが基本的な前提条件となる。このことは、例えば、架橋モノマーを添加することによって可能である。不活性膨潤剤の添加により、意図的にゲル化点を遅らせることができ、よって析出点を遅らせることができる。これにより、細孔サイズを所望の値に調整することが可能となる。また、不活性析出剤を添加することによっても、前記材料に影響を与えることができる。ポロシメトリーのパラメーターは、逆相サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される（これに関しては、Gorbunov, A et al.; J Chromatogr 448, 307 (1988)を参照されたい。細孔半径は、通常、円筒状の細孔幾何学的形状を想定した細孔径分布の体積加重平均（volume weighted average）として求められる。多孔性粒子の調製に関しては、以下に挙げる文献を参照されたい。Seidl, J., Malinstky, J.; Dusek, K; Heitz, W.; Adv. Polym. Sci.; 5; 113-213 (1967); Logemann, H. et al.; in: Houben/Weyl; Methoden der Organischen Chemie [methods in organic chemistry]; Vol. 14; 133-438 (1967); Polymerisation der Acryl- und Methycrylseure, ihrer Salze, Halogenide und Anhydride [polymerization of acrylic and methacrylic acid, their salts, halides and anhydrides]; Voelker, T. et al.; ibid; 1018-1072; Synthesis and characterization of porous polymers; Sherrington, D.C.; Makromol. Chem., Macromol. Symp.; 70/71, 303 (1993); Porous Poly-HEMA beads prepared by suspension polymerization in aqueous medium; Horak, D.; Ledniki, F.; Rehak, V.; Svec, F.; J. Appl. Polym. Sci.; 49, 2041 (1993); Chromatographic properties of macroporous beads from poly (GMA-co-EDMA); Horak, D.; Svec, F.; Tennikowa, T. B.; Nahunek, M.; Angew. Makromol. Chem.; 195, 139 (1992); Dispersion copolymerization of methyl methacrylate and acrylic acid in polyr media; Huang, J. X.; Yuan, X. Y.; Yu, X. L.; Zhang, H. T.; Polym. Int; 52, 819 (2003); Preparation and porosity characterization of highly cross-linked polymer resins derived from multifunctional methacrylate monomers; Rohr, T.; Knaus, S.; Grber, H.; Sherrington, D. C.; Macromolecules; 35, 97 (2002); Preparation by suspension polymerization of porous beads for enzyme immobilization; Skovby, M. H. B.; Knops, J.; J. Appl. Polym. Sci.; 39, 169 (1990); Reactive polymers XXXIII; The influence of the suspension stabilizer on the morphology of a suspension polymer; Horak, D.; Pelzbauer, Z.; Svec, F.; Kalal, J.; J. Appl. Polym. Sci.; 26, 3205 (1981); New designs of macroporous polymers and supports; from separation to biocatalysis; Svec, F.; Frechet, J. M. J.; Science; 273, 205 /1996）

血小板または血球の活性化抑制剤等の表面不動態化剤（surface-passivating agents）を前記粒子表面に塗布することにより、特に、処理対象の液体として好ましい血液と接触した場合に、前記粒子の血液適合性をさらに高めること、および／または前記ウイルス吸着能を向上させることが可能となる。使用の際には、このような表面不動態化剤を前記多孔性ポリマーマトリックスの外表面および内表面（すなわち、前記細孔の内表面）に塗布することが好ましい。血液適合性という用語、およびこれを向上するための作用物質は、当業者には公知である。例えば、以下の文献を参照されたい。Vienken J: Biological processes related to blood-biomaterial interaction; in: Blood-Material Interaction, International Faculty For Artificial Organs (INFA), Glasgow, Krems, 1998

従来技術において公知である好適なプロセスとしては、高分子ポリ（Ｎ−トリフルオロアルコキシ）ホスファゼン（poly(N-trifluoroalkoxy)phosphazene）を塗布すること、前記多孔性粒子をホスファゼンの有機溶媒溶液で処理した後、前記溶媒を蒸発させること、または、例えばヘパリン等の好適な表面不動態化剤を、適切に官能化された表面に静電結合または共有結合によって結合させることが挙げられる。

しかしながら、本発明の範囲内においては、血液適合性向上剤は、欧州特許第０９７５６８０号明細書および欧州特許第１２８２６９５号明細書に記載されているように、ある種のポリマーと特殊なリンカーとの相互作用を利用して、前記多孔性ポリマーマトリックスに塗布されることが好ましい。欧州特許第１２８２６９５号明細書には、本発明で使用できる血液適合性粒子の調製に好適な血液適合性のポリマー表面が既に開示されている。この文献では、前記構造要素（Ａ）とメタクリル酸アルキル由来の特に好ましい単位とを含む多孔性ポリマー粒子を、先に挙げた特許文献に記載のようにリンカーを担持した血液適合性を向上する作用物質に接触させている。

ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンイミン、ポリアルキレンアミン、またはポリアルキレンスルフィドと、ポリオキサゾリン（polyoxazolines）とをリンカーとして用いることが好ましい。なかでも、ポリアルキレングリコールが特に好ましい。これらのポリマーリンカーの平均重合度は、３００未満であることが好ましく、１５０未満であることが特に好ましい。前記平均重合度の下限値は、通常５であり、好ましくは１０であるが、好ましい重合度は、前記リンカーの基本繰返し単位の選択に基づき、上述の範囲内で変更することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をリンカーとして用いることが特に好ましい。最適な安定性を確保するために、前記リンカーは、血液適合性を向上させるための作用物質に共有結合されている。前記リンカーが結合した前記作用物質を前記必要な構造要素を有するポリマー表面と直接接触させることにより、生理条件下において非常に安定な、リンカーによって媒介された前記作用物質と前記ポリマーとの結合が得られる。

よって、本発明においては、前記粒子表面と血液成分との相互作用を防止すると同時に、ウイルス吸着能を維持または向上させるため、欧州特許第０９７５６８０号明細書および欧州特許第１２８２６９５号明細書に開示された技術的可能性を利用することが好ましい。欧州特許第０９８９８５６号明細書および欧州特許第１２８２６９５号明細書に報告されている知見によると、リンカーが結合したポリオルガノシロキサンおよび表面の血液適合性を向上させるその他の物質が、単純なインキュベーションプロセスの最中に、所定の濃度で粒子表面に固定されている。ここで、特に好適なのは、ある種のリンカー（例えば、ＰＥＧ）に化学的に結合した後、好ましくは２０℃の温度下で、０．１μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの水溶性を示すポリオルガノシロキサンである。

好適な血液適合性向上物質としては、例えば、ＰＥＧ等の前記リンカーのいずれか１つと結合したコレステロールもしくはポリジメチルシロキサン、またはＰＥＧとポリプロピレングリコールのコポリマーが挙げられる。さらに、ＰＥＧ、またはＰＥＧ／ポリプロピレングリコールコポリマーを含有する物質、例えば、多価アルコールの脂肪酸エステルのＰＥＧ誘導体（例えば、ＰＥＧグリセリン脂肪酸エステル）、ＰＥＧソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ｔｗｅｅｎ系の商品）、ＰＥＧ脂肪酸エステル、ＰＥＧ脂質、もしくはＰＥＧタンパク質（例えば、ＰＥＧアルブミン）等を、血液適合性向上物質として使用することも可能である。さらに、表面の血栓形成を特異的に減少させる抗凝血剤、例えば、ＰＥＧトロンビン抑制剤等を使用して血液適合性を向上することもできる。

ウイルスまたはウイルス成分の効率的な除去のため、本明細書に記載の多孔性粒子は、その表面に固定化された認識構造物を必要としない。処理対象の液体との接触前は、前記多孔性粒子は、ウイルスまたはウイルス成分の結合を促進し得るタンパク質または核酸を基本的に含まないことが好ましい。ここで、「基本的に含まない」とは、考えられる不純物／このような生体分子の残基が、ウイルスまたはウイルス成分の吸着に貢献しないことを意味する。前記粒子は、タンパク質および核酸を全く含まない構成であってもよい。

本発明の吸着系は、処理対象の液体が通過でき、かつ前記多孔性粒子を吸着材として収容する、剛直または柔軟な外被を備えることが好ましい。前記外被内の多孔性粒子は、互いに結合した状態ではなく、ばらばらの状態で存在していることが好ましい。透過する液体が前記粒子の周りを確実に均一に流れるようにすべきである。前記外被の幾何学的形状および材料は、それらの血液適合性に関する配慮がなされている限り、特に制限されない。例えば、前記外被は薬包であってもよい。前記外被はどのような形状であってもよく、例えば、円筒形であってもよい。絶え間ない流れを確保するため、前記外被は、液体、特に、血液または血漿等の体液を前記外被へと侵入させ、前記液体を前記ポリマー粒子に確実に接触させる流入口と、前記ポリマー粒子との接触後に前記外被から前記液体を排出させる流出口とを備えていることが好ましい。前記吸着系は、前記粒子が前記外被から放出されるのを防止するのに好適な、例えば、フィルターまたはフリット等の仕組み（device）を１以上備えていることがさらに好ましい。これらの仕組みにより、前記粒子は前記外被内に保持され、さらに同時に、前記処理対象の液体の間断ない流れが確保される。前記吸着系は、体外循環に組み込むことが可能なように設定することができる。

本発明の吸着系は、体外回路によって、血液または血漿の循環に組み込むことができる。しかしながら、輸血された血液もしくは血漿、または生体から採取されたその他の生理的液体であって、前記ユニット通過後に、前記生体に戻されないか、すぐには戻されない生理的液体の処理にも好適である。本発明の吸着系は、単独で用いることもできるし、例えば、血液透析ユニット等の他のユニットと組み合わせて用いることもできる。前記吸着系における液体の流動は、ポンプを使用して引き起こすこともできるし、ポンプを用いることなく引き起こすこともできる。

一例として挙げた上述の体外循環システムを使用し、適切にカニューレ挿入した血管を介し、患者の血液または血漿を前記吸着系に導入する。前記血液または血漿中に存在するウイルスは、前記吸着材の多孔性粒子に吸着され、これにより、前記血液または血漿が前記生体へと再導入される前に液流から除去される。感染症が改善および治癒される程度のウイルス量の低減が達成されるまで、このプロセスを、一定の時間間隔で繰り返すことができる。また、その他の治療方針との併用も可能である。

本発明の吸着系を用いることにより、ウイルスおよびウイルス成分を処理対象の生理的液体から不可逆的に除去することができる。すなわち、生理条件下において、濾過された成分は前記吸着材に確実に結合する。

驚くべきことに、本発明の吸着系を使用することにより、種々の生理的液体、血液からですら、例えば、血液の濾過により血漿を得ること等による細胞血液成分の分離を予め行うことなく、ウイルスおよびウイルス成分を高効率で除去することができる。前記吸着系を１回通過させただけで、９０％を上回る血液試料のウイルス力価の低減を達成することができる。

本発明の吸着系および吸着材は、生理的液体からのウイルスおよびウイルス成分の除去に非常に適している。ウイルスおよびウイルス成分の例としては、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、およびレトロウイルス科に属するものが挙げられる。本発明は、Ｃ型肝炎だけでなく、例えば、Ｂ型肝炎、ＡＩＤＳ、またはウイルス性出血熱等の疾患の治療にも特に使用すべきである。生理的液体からのその除去に本発明の吸着ユニットおよび吸着材を適合させることが可能なその他の生体物質としては、例えば、ＲＮＡフラグメント、プリオン、プラスミド、またはその他の生体ナノ粒子が挙げられる。

本発明によれば、本明細書において述べた吸着系および吸着材を、先に挙げた病原体によって引き起こされる疾患、特に、ウイルス性感染症の治療に使用することができる。さらに、前記吸着系および前記吸着材を、これらの疾患を治療するための薬剤／医薬品の調製に使用することができる。

本発明を以下に挙げる例を参照しながら詳細に説明する。しかしながら、これらの例は本発明を何ら限定しようとするものではない。

以下において、細孔半径は、ＰＳＳＰＯＲＯＣｈｅｃｋ(登録商標）ソフトウエアを用いて、Gorbonovらの文献（Gorbunov, A et al.; J Chromatogr 448, 307 (1988)参照）に記載の方法に従い、得られたデータを分析して測定した。

平均直径および気孔率等のポロシメトリーのパラメーターは、Gorbonovらの文献（Gorbunov, A et al.; J Chromatogr 448, 307 (1988)参照）に記載の方法に従い、得られたデータを分析して測定した。

［調製例１］
（粒径約１００μｍ、細孔半径約８０ｎｍの球状粒子の一般的調製方法）
加熱可能な反応槽内において、加水分解度８８％のポリビニルアルコール（保護コロイド１）０．５ｇと加水分解度９８％のポリビニルアルコール（保護コロイド２）０．１ｇを水４００ｍｌに溶解させた溶液を調製した。この溶液に、メタクリル酸メチル１０ｇと、エチレングリコールジメタクリレート１０ｇと、ＡＩＢＮ０．５ｇと、シクロヘキサノール１０ｍｌと、オクタノール２０ｍｌの混合物を攪拌しながら添加した。前記クロヘキサノールとオクタノールとは、共に細孔形成成分（porogenic component）として作用する。次に、このようにして得た混合物を、７０℃の温度下において、反応終了まで攪拌して重合させた。得られた粒子を水とメタノールで数回洗浄し、ソックスレー抽出器内でメタノールとアセトンで処理した後、恒量となるまで真空中にて１００℃で乾燥させた。

［調製例２］
（粒径約１００μｍ、細孔半径約４５０ｎｍの球状粒子の一般的調製方法）
加熱可能な反応槽内において、加水分解度８８％のポリビニルアルコール（保護コロイド）０．７５ｇと硫酸ナトリウム（追加の安定剤）１０ｇを水８００ｍｌに溶解させた溶液を調製した。この溶液に、メタクリル酸メチル１０ｇと、エチレングリコールジメタクリレート１０ｇと、ＡＩＢＮ０．５ｇと、酢酸ブチル１８．３ｍｌと、オクタノール３６．６ｍｌの混合物を攪拌しながら添加した。前記酢酸ブチルとオクタノールとは、共に細孔形成成分として作用する。次に、リン酸カルシウム１０ｇをさらに添加し、得られた混合物を、７０℃の温度下において、反応終了まで攪拌して重合させた。得られた粒子を水と塩酸で洗浄し、さらに水とメタノールで数回洗浄し、ソックスレー抽出器内でメタノールとアセトンで処理した後、恒量となるまで真空中にて１００℃で乾燥させた。

［調製例３］
（粒径約１００μｍ、細孔半径約１３０ｎｍの球状粒子の一般的調製方法）
加熱可能な反応槽内において、加水分解度８８％のポリビニルアルコール（保護コロイド）１ｇを水８００ｍｌに溶解させた溶液を調製した。この溶液に、メタクリル酸メチル１０ｇと、エチレングリコールジメタクリレート１０ｇと、ＡＩＢＮ０．５ｇと、トルエン１８．３ｍｌと、オクタノール３６．６ｍｌの混合物を攪拌しながら添加した。前記トルエンとオクタノールとは、共に細孔形成成分として作用する。次に、このようにして得た混合物を、７０℃の温度下において、反応終了まで攪拌して重合させる。得られた粒子を水とメタノールで数回洗浄し、ソックスレー抽出器内でメタノールとアセトンで処理した後、恒量となるまで真空中にて１００℃で乾燥させた。

［調製例４］
粒子サイズを変更するため、前記水相内において、モル質量が３０,０００〜２００,０００、加水分解度が７０％〜９８％のポリビニルアルコールと共に、モル質量が１０,０００〜１００,０００のポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチルセルロース、およびポリアクリル酸ナトリウム（polyacrylic acid sodium）を保護コロイドとして用いて調製例１〜３を繰り返した。

［調製例５］
粒子サイズを変更するため、前記水相の量を２００〜８００ｍｌの範囲内で変更し、有機相に対する水相の比率を２０：１〜５：１の範囲で変更して調製例１〜３を繰り返した。

［調製例６］
粒子サイズを調整するため、細孔形成剤（porogenic agent）に対するモノマーの比率を２：１から１：５の範囲で変更して調製例１〜３を繰り返した。

［調製例７］
粒子サイズを変更し、細孔の形態を制御するため、シクロヘキサノールと酢酸ブチルとは別に、さらにトルエン、シクロヘキサノン、ブタノン、キシレン、トリクロロメタン、酢酸エチル、線状ポリメタクリル酸メチル、またはこれらの成分のいくつかを組み合わせた混合物を前記有機相におけるポロゲン成分（porogen component）として使用して調製例１〜６を繰り返した。

［調製例８］
粒子サイズを変更し、細孔の形態を制御するため、オクタノールとは別に、さらにその他の第一級アルコール、ならびに６個以上の炭素原子を有するアルカンまたはこれらの成分の混合物を前記有機相における細孔形成成分として使用して調製例１〜６を繰り返した。

［調製例９］
粒子の品位を向上させ、かつ粒度分布を制御するため、調製例２（調製例４〜６はこの調製例の変更例である）において使用された前記水相に添加する前記塩の量と種類を変更して調製例４〜６を繰り返す。硫酸ナトリウムとは別に、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化銅、リン酸水素二ナトリウム、および酢酸ナトリウムを使用し、また、リン酸カルシウムとは別に、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および高分散ケイ酸（highly disperse silicic acid）を使用した。これら成分の量は２０ｇまでであった。

［調製例１０］
メタクリル酸メチルとは別に、さらにメタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸シクロヘキシル、メタクリル酸フェニル、スチレン、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸アミド、および２−ビニルピロリドンをモノマーとして使用し、また、エチレングリコールジメタクリレートとは別に、さらにジビニルベンゼン、ブチレングリコールジメタクリレート、およびこれらの成分の混合物を使用して、調製例１〜６を繰り返した。このようにして、表面特性を変更することができる。

異なるウイルス種に対する本発明の吸着ユニットの有効性を、ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）とＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関して立証した。

［実施例１１］
（ウイルス力価の測定）
ウシウイルス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）のウイルス力価を、感染性測定（ウイルス力価測定）のための終点希釈法（end point dilution method）によって測定した。ｌｏｇＣＩＤ₅₀／ｍｌ（ＣＩＤ₅₀：５０％を基準とした培養物感染量（culture infectious dosage on the basis of 50%））で表される力価の算出は、Kaerber（Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 1931: 162, 480）に記載の方法にしたがって行った。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス力価を、ｂ−ＤＮＡプロセス（分岐ＤＮＡプロセス）による信号増幅法を用いた定量的ＨＣＶ検出（単位：ＩＵ／ｍｌ）によって測定した。

［実施例１２］
（ウイルス懸濁液におけるＢＶＤＶの減少）
平均細孔半径８１ｎｍ、気孔率０．４５、比表面積６０８ｍ²／ｇのポリマー粒子（調製例１と同様の方法で調製）３００ｍｇをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に懸濁させた。プラスチック材料（直径１ｃｍ、粒子床高さ２．２ｃｍ、粒子床容積１．７ｍｌ）で構成されたカラムに前記懸濁液を充填した。粒子の漏れを防止するため、前記粒子床の上部と底部をメッシュサイズ４０μｍの濾布で封じた。接続チューブと排出用チューブを含む前記粒子充填カラムのデッドボリュームは２．５ｍｌである。前記粒子をＰＢＳでコンディショニングした。

ウイルス力価（ｌｏｇＣＩＤ₅₀／ｍｌで表される）が５．８であるウイルスのＰＢＳ懸濁液１ｍｌを、シリンジポンプを用い、０．２５ｍｌ／分の一定流量で前記粒子充填カラムに供給した。次に、５ｍｌのＰＢＳを用いて前記カラムの溶出を行った（０．２５ｍｌ／分）。この溶出液（６ｍｌ）を回収した。そして、前記カラムを６ｍｌのＰＢＳで洗浄した（０．２５ｍｌ／分）。この洗浄液も回収した。前記洗浄液および前記溶出液を、−８０℃で凍結させ、ウイルス力価を測定した。また、対照用サンプルとして、ＰＢＳで６倍に希釈したウイルス懸濁液（前記カラムから溶出した後の前記ウイルス懸濁液の希釈率に相当）を使用した。

前記対照用サンプル、前記溶出液、および前記洗浄液のウイルス力価を、実施例１１と同様の方法で測定した。希釈された処理前の懸濁液のウイルス力価（ｌｏｇＣＩＤ₅₀／ｍｌ）は４．４であった。前記溶出液および前記洗浄液においては、感染状態は検出できなかった。

［実施例１３］
（ＨＣＶ陽性血漿におけるウイルスの減少）
平均細孔半径４２７ｎｍ、気孔率０．４３、比表面積８８ｍ²／ｇのポリマー粒子（調製例２と同様の方法で調製）３００ｍｇを、実施例１２と同様の方法でカラムに充填した。前記粒子をＰＢＳでコンディショニングした。

ＨＣＶ陽性血漿の血漿製剤５ｍｌを、シリンジポンプを用い、０．２５ｍｌ／分の一定流量で前記粒子充填カラムを通過させた。溶出液（５ｍｌ）を回収し、ウイルス力価が測定されるまで−８０℃で凍結させた。また、対照用サンプルとして、ＰＢＳで２倍に希釈した血漿製剤（前記カラムから溶出した後の前記血漿製剤の希釈率に相当）を、使用した。

前記溶出液および前記対照用サンプルのウイルス力価を、実施例１１と同様の方法で測定した。前記対照用サンプルのウイルス力価は２５，９１０ＩＵ／ｍｌであり、前記溶出液のウイルス力価は定量的検出限界である６１５ＩＵ／ｍｌ未満であった。これは、９７％を超えるウイルス減少に相当する。

［実施例１４］
（血液におけるＢＶＤＶの減少）
平均細孔半径１３１ｎｍ、気孔率０．５１、比表面積１０５ｍ²／ｇのポリマー粒子（調製例３と同様の方法で調製）３００ｍｇを、実施例１２と同様にしてカラムに充填した。実験開始前に、前記粒子をデキストラン４０輸液でコンディショニングした。

ウイルス力価が高いＢＶＤＶ懸濁液を添加したヒトヒルジン血液の血液製剤５ｍｌを、シリンジポンプを用い、０．１ｍｌ／分の一定流量で前記粒子充填カラムを通過させた。血球を分離するため、得られた溶出液（５ｍｌ）を２２００Ｇで１０分間遠心分離し、ウイルス力価が測定されるまで−８０℃で凍結させた。また、対照用サンプルとして、デキストラン４０輸液で２倍に希釈した血液製剤（前記カラムから溶出した後の前記血液製剤の希釈率に相当）を使用した。

前記溶出液および前記対照用サンプルから回収した超過分のウイルス力価を、実施例１１と同様の方法で測定した。ｌｏｇＣＩＤ₅₀／ｍｌで表される前記対照用サンプルのウイルス力価は３．９であり、前記溶出液のウイルス力価は２．４であった。これは９７％のウイルス減少に相当する。

Claims

貫通細孔を備えたポリマーマトリックスを有する平均直径２０〜５００μｍの吸着材粒子を含むことを特徴とする、ウイルスおよびウイルス成分を生理的液体から除去するための吸着系。
前記貫通細孔の細孔半径が、２５〜１，０００ｎｍである請求項１に記載の吸着系。
前記粒子の気孔率が、０．２５〜０．７５である請求項１または２に記載の吸着系。
前記粒子が、メタクリル酸由来の単位をモノマーとして含むポリマーマトリックスを有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の吸着系。
前記ポリマーマトリックスが、メタクリル酸エステルと架橋剤とを含むコポリマーによって形成されている請求項４に記載の吸着系。
前記粒子の表面に血液適合性を向上させる物質が、塗布されている請求項１〜５のいずれか１項に記載の吸着系。
前記粒子が、メタクリル酸由来の単位を含むポリマーマトリックスを有し、前記血液適合性を向上させる物質が、リンカーとしてのポリエチレングリコール鎖を介して前記粒子表面に結合している請求項６に記載の吸着系。
前記血液適合性を向上させる物質が、ポリオルガノシロキサンである請求項６または７に記載の吸着系。
ウイルスまたはウイルス成分を血液または血漿から除去するための請求項１〜８のいずれかに記載の吸着系。
貫通細孔を備えたポリマーマトリックスを有する平均直径２０〜５００μｍの粒子を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の吸着系に使用するための吸着材。
ウイルス性感染症治療のための請求項１〜９のいずれかに記載の吸着系。
前記ウイルス性感染症が、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＡＩＤＳおよびウイルス性出血熱から選択される疾患である請求項１１に記載の吸着系。
ウイルス性感染症治療のための請求項１０に記載の吸着材。
前記ウイルス性感染症が、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、ＡＩＤＳおよびウイルス性出血熱から選択される疾患である請求項１３に記載の吸着材。