JP2006141320A - Method for cloning plural nucleic acid fragments - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、複数種、特に３種以上の核酸断片を含むベクターを構築する方法に関する。 The present invention relates to a method for constructing a vector containing a plurality of nucleic acid fragments, particularly three or more nucleic acid fragments.
細胞内の多くのタンパク質は複合体を形成しており、中でも２量体は最も多い。ヒト細胞では、その２／３はヘテロ２量体であり、異なるサブユニット因子の相互作用で形成されている。従って、機能性タンパク質複合体の形成、一時的タンパク質−タンパク質相互作用、及び機能性タンパク質の細胞内所在地決定などに関する研究分野においては、複数遺伝子の同時導入と発現を共役的に行うことが必要とされる。それと共に、過剰発現によるプロテオーム機能の損傷がないように配慮する必要もある。 Many proteins in the cell form a complex, with dimers being the most abundant. In human cells, 2/3 is a heterodimer, formed by the interaction of different subunit factors. Therefore, in the field of research related to the formation of functional protein complexes, transient protein-protein interactions, and determination of the intracellular location of functional proteins, it is necessary to perform simultaneous introduction and expression of multiple genes in a coupled manner. Is done. At the same time, it is necessary to take care not to damage the proteome function due to overexpression.
従来の細胞への遺伝子導入法では、例えば２種類の遺伝子は、それぞれを担持する２種類の組換えプラスミドの共導入によって行なわれていた。この場合には、それぞれの組換えプラスミドの細胞への導入効率は同一でなく、いずれか一種類が優位に導入されることが多く、２種類の組換えプラスミドが共に同数で導入されることはむしろ稀であった。この事情は、３種類遺伝子の同時導入になるともっと深刻であった。 In the conventional method of gene introduction into cells, for example, two types of genes have been carried out by co-introduction of two types of recombinant plasmids carrying the respective genes. In this case, the efficiency of introduction of the respective recombinant plasmids into the cells is not the same, and one of the two types of recombinant plasmids is often introduced in an advantageous manner. Rather it was rare. This situation was more serious when three types of genes were introduced simultaneously.
一方、形質転換法には、トランジェント形質転換法とステーブル形質転換法がある。トランジェント形質転換法は比較的容易であり、多量のタンパク質産生の目的には適するが、細胞機能を損なう場合が多かった。一方ステーブル形質転換法ではタンパク質を細胞機能を損なわずに発現させることが可能であると考えられるが、従来のトランスフェクション条件では染色体へ限定数の遺伝子を導入することは容易でなかった。その理由は、不特定多数のｃＤＮＡが染色体の活性や不活性領域にランダムに挿入され、その８５％以上がヘテロクロマチン領域に入って発現しないためであると報告されている。 On the other hand, the transformation method includes a transient transformation method and a stable transformation method. Transient transformation methods are relatively easy and suitable for the purpose of producing large amounts of protein, but often impair cell function. On the other hand, it is considered that stable transformation can express a protein without impairing cell function, but it was not easy to introduce a limited number of genes into chromosomes under conventional transfection conditions. The reason is reported that an unspecified number of cDNAs are randomly inserted into the chromosomal activity or inactive region, and 85% or more of them enter the heterochromatin region and are not expressed.
これを解決するために、複数の遺伝子単位を含み、かつステーブル形質転換可能な発現ベクターを構築することが有用と考えられる。この目的のためには、１個のベクター上に複数種のｃＤＮＡを担持する発現ベクターを迅速かつ簡便に構築することが必要とされる。各ｃＤＮＡの混成発現の制御は、各ｃＤＮＡに適切なプロモーターを連結することによって、所望のレベルで達成することができると考えられる。 In order to solve this, it is considered useful to construct an expression vector containing a plurality of gene units and capable of stable transformation. For this purpose, it is necessary to quickly and easily construct an expression vector carrying multiple types of cDNA on one vector. Control of hybrid expression of each cDNA can be achieved at a desired level by linking an appropriate promoter to each cDNA.
目的の核酸断片を含む発現ベクターを構築する手法として、単離された核酸断片の両端に制限酵素が作用する塩基配列を接続し、ベクターにもその部位を作ってから制限酵素とリガーゼを用いて挿入する手法が従来用いられてきた。しかし、このような手法は非常に時間がかかるため、この手法によって複数種の核酸断片を発現ベクターに挿入するのは至難であった。しかし、複数種の核酸断片を含む発現ベクターを構築する手法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的組換え技法であるＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法が報告された。この方法を用い、一定の順番及び配向性で核酸断片群を構築して受容ベクターに連結することにより、複数種の核酸断片を含有する発現ベクターを製造することができる（非特許文献１）。従来のＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法では、２種類のシグナル配列、ａｔｔ１及びａｔｔ２が利用されてきた（非特許文献２）。また近年、３種の核酸断片を同時クローニングにより発現ベクターに導入するためのものとして、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）シグナルであるａｔｔ３及びａｔｔ４が、ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｈｒｅｅ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔとして入手できるようになった。これらのシステムで使用する標準的デスティネーションベクターは、２個のａｔｔＲシグナルに隣接させたクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）遺伝子及び毒性遺伝子（ｃｃｄＢ）（非特許文献３）のカセットを含有するものである。しかし、このデスティネーションベクターを使用して３種を超える遺伝子を同時クローニングすることについては報告されていない。 As a method of constructing an expression vector containing the target nucleic acid fragment, connect the base sequence that acts on the restriction enzyme to both ends of the isolated nucleic acid fragment, create the site in the vector, and then use the restriction enzyme and ligase. Insertion techniques have been used in the past. However, since such a technique is very time consuming, it has been difficult to insert a plurality of types of nucleic acid fragments into an expression vector by this technique. However, Gateway (trademark) cloning method, which is an in vitro site-specific recombination technique, has been reported as a technique for constructing an expression vector containing a plurality of types of nucleic acid fragments. Using this method, an expression vector containing a plurality of types of nucleic acid fragments can be produced by constructing nucleic acid fragment groups in a certain order and orientation and linking them to a receptor vector (Non-patent Document 1). In the conventional Gateway (trademark) cloning method, two types of signal sequences, att1 and att2, have been used (Non-patent Document 2). In recent years, Gateway (TM) signals att3 and att4 have been available as MultiSite Gateway (TM) Three-Fragment Vector Construction Kit for introducing three types of nucleic acid fragments into an expression vector by simultaneous cloning. became. The standard destination vector used in these systems contains a chloramphenicol resistance (Cm R ) gene and a virulence gene (ccdB) cassette (Non-Patent Document 3) flanked by two attR signals It is. However, there has been no report on the simultaneous cloning of more than 3 genes using this destination vector.
本発明者らは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＤＮＡクローニングシステムにおいて、組換える核酸断片の数を増やして同時クローニングを行うと、組換え効率が著しく低下し、１個の融合構造物中に複数種の核酸断片を担持するベクターを構築するのは、上記システムをもってしても非常に困難であることを見いだした。従って、本発明の課題は、複数種の所望の核酸断片を担持するベクターを効率的に製造する方法を提供することである。 In the Gateway (trademark) DNA cloning system, when the number of nucleic acid fragments to be recombined is increased and co-cloning is performed, the recombination efficiency is significantly reduced, and a plurality of kinds of nucleic acids are contained in one fusion structure. It was found that it was very difficult to construct a vector carrying a fragment even with the above system. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for efficiently producing a vector carrying a plurality of kinds of desired nucleic acid fragments.
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、少なくとも２つの核酸断片を含む発現ベクターにおいて、特異的組換え部位を用いることにより、少なくとも１つの核酸断片をカセットと交換し、さらに、該カセットを少なくとも２つの所望の核酸断片と組換えることにより、組換え効率を低下させることなく、３つ以上の核酸断片を含むベクターを構築できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have exchanged at least one nucleic acid fragment with a cassette by using a specific recombination site in an expression vector containing at least two nucleic acid fragments, Furthermore, it has been found that by recombining the cassette with at least two desired nucleic acid fragments, a vector containing three or more nucleic acid fragments can be constructed without reducing the recombination efficiency, and the present invention has been completed. .
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換し、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換し、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する工程、
を含む前記方法。
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) A method for constructing a vector comprising at least three desired nucleic acid fragments, comprising the following steps (a) and (b):
(A) an expression vector comprising two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites;
A donor vector comprising a cassette flanked by at least two recombination sites;
By incubating with the site-specific recombinant protein,
Exchanging at least one nucleic acid fragment adjacent to at least two recombination sites contained in the expression vector with a cassette adjacent to at least two recombination sites contained in the donor vector, wherein at least one nucleic acid fragment and at least one nucleic acid fragment are exchanged; Constructing a modular destination vector comprising a cassette,
(B) the modular destination vector obtained in (a);
An entry vector comprising at least two nucleic acid fragments flanked by at least two recombination sites;
By incubating with the site-specific recombinant protein,
Exchanging the cassette contained in the modular destination vector with at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites contained in the entry vector to construct a vector comprising at least three desired nucleic acid fragments;
Including said method.
（２）発現ベクター又はエントリーベクターに含まれる核酸断片がｃＤＮＡを含む、（１）記載の方法。
（３）ドナーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、（１）又は（２）記載の方法。
(2) The method according to (1), wherein the nucleic acid fragment contained in the expression vector or entry vector comprises cDNA.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the donor vector comprises at least one selectable marker.
（４）発現ベクター又はエントリーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）組換え部位が、ｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲからなる群より選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）組換えタンパク質がインテグラーゼである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを含む、該キット。
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the expression vector or entry vector comprises at least one selectable marker.
(5) The method according to any one of (1) to (4), wherein the recombination site is selected from the group consisting of loxP, attB, attP, attL and attR.
(6) The method according to any one of (1) to (5), wherein the recombinant protein is an integrase.
(7) A kit for carrying out the method according to any one of (1) to (6), comprising a donor vector comprising a cassette adjacent to at least two recombination sites.
本発明により、複数種の核酸断片を含むベクターを効率的に構築することができる。 According to the present invention, a vector containing a plurality of types of nucleic acid fragments can be efficiently constructed.
本発明は、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する方法に関する。本発明において、核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、核酸断片には、ＤＮＡ断片及びＲＮＡ断片が包含され、好ましくはＤＮＡ断片である。本発明においてベクターに挿入する核酸断片は、ＰＣＲ産物、大きなＤＮＡセグメント、ゲノムクローン又はフラグメント、ｃＤＮＡクローン又はフラグメント、機能性エレメントなど、及び有用な核酸又はタンパク質をコードする遺伝子又は部分的遺伝子を含むが、それらに限定されない。好ましくは、少なくとも１つのｃＤＮＡを含む核酸断片であり、場合により２つ以上ｃＤＮＡを含む核酸断片である。 The present invention relates to a method for constructing a vector comprising at least three desired nucleic acid fragments. In the present invention, the nucleic acid includes DNA and RNA, and the nucleic acid fragment includes a DNA fragment and an RNA fragment, preferably a DNA fragment. The nucleic acid fragment inserted into the vector in the present invention includes a PCR product, a large DNA segment, a genomic clone or fragment, a cDNA clone or fragment, a functional element, etc., and a gene or partial gene encoding a useful nucleic acid or protein. , But not limited to them. Preferably, it is a nucleic acid fragment containing at least one cDNA, and optionally a nucleic acid fragment containing two or more cDNAs.
本発明においてベクターは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、組換えＤＮＡ技術において、外来性核酸を組み込み、宿主細胞中で増えることのできる核酸分子、好ましくはＤＮＡをさす。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。直鎖状のものも環状のものも包含される。また、本発明においては、上記ベクターに所望の核酸断片等を挿入して得られた核酸分子もまた、ベクターに包含される。 In the present invention, a vector has the meaning normally used in the art, and refers to a nucleic acid molecule, preferably DNA, that can incorporate foreign nucleic acid and increase in a host cell in recombinant DNA technology. Examples of the vector include a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector. Both linear and cyclic are included. In the present invention, a nucleic acid molecule obtained by inserting a desired nucleic acid fragment or the like into the vector is also included in the vector.
本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターを用いる。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片とは、発現ベクターにおいて、核酸断片の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。少なくとも２つの組換え部位の間に存在する核酸断片は、特に制限されず、所望の核酸断片、通常、所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡである。核酸断片がｃＤＮＡを２種以上含んでいてもよく、さらにその他の配列を含んでいてもよい。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むとは、核酸断片とその少なくとも両端に存在する組換え部位とを含む領域が、発現ベクターに２つ以上存在することを意味する。発現ベクターは、さらなる核酸断片及び組換え部位を含んでいてもよい。発現ベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらない。 In the method of the present invention, an expression vector containing two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites is used. A nucleic acid fragment adjacent to at least two recombination sites means that there are recombination sites at least at both ends of the nucleic acid fragment in the expression vector. The nucleic acid fragment present between at least two recombination sites is not particularly limited, and is a desired nucleic acid fragment, usually cDNA encoding a desired gene. The nucleic acid fragment may contain two or more kinds of cDNA, and may further contain other sequences. The phrase “containing two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites” means that there are two or more regions in the expression vector containing the nucleic acid fragments and recombination sites at least at both ends thereof. The expression vector may contain additional nucleic acid fragments and recombination sites. Recombination sites contained in expression vectors usually do not substantially recombine with each other.
発現ベクターは、通常、選択マーカーを含む。さらに、好ましくは、核酸断片とその両端の組換え部位を含む各領域の上流にプロモーターをそれぞれ含む。また、発現ベクターは好ましくは、核酸断片同士の間に、転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造、好ましくはｐＡ−Ｐカセットを含む。 Expression vectors usually include a selectable marker. Furthermore, preferably, a promoter is included upstream of each region including the nucleic acid fragment and the recombination sites at both ends thereof. The expression vector preferably has a cassette structure, preferably a pA-P cassette, in which a polyadenine addition sequence serving as a transcription termination signal and a promoter sequence serving as a transcription initiation signal are linked as a continuous nucleic acid fragment between nucleic acid fragments. Including.
最大３つまでの所望の核酸断片を含む発現ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて調製できる。例えば、目的の核酸断片に２つ以上の組換え部位を付加してクローン化し、該クローンを用いてＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法を実施することにより、１回の組換え反応によって最大３つまでの核酸断片を含む発現ベクターを作製することができる（ＷＯ９９／２１９７７、非特許文献１）。一実施形態として、３つの標的核酸断片（ｃＤＮＡ１及びｃＤＮＡ２及び転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造）を含む発現ベクターの調製方法の概要を図１Ｃに示す。 目的の核酸断片に２つ以上の組換え部位を付加する技術としては、例えば、核酸分子の変異誘発（例えば、ランダム又は部位特異的変異誘発）、組換え技術（例えば、アダプターの連結又は核酸分子の組換え部位を含む直鎖分子への連結）、増幅（例えば、組換え部位又はその部分を含むプライマーを使用する）、遺伝子転移（例えば、組換え部位を含むトランスポゾンを使用する）、組換え（例えば、組換え部位を含む１つ以上の相同な配列を使用する）、核酸合成（例えば、組換え部位を含む分子の化学的合成又は種々のポリメラーゼ若しくは逆転写酵素を使用する酵素学的合成）が挙げられる。目的の核酸断片は、任意の供給源から由来する任意の核酸断片であり、非天然の核酸を含む。 Expression vectors containing up to three desired nucleic acid fragments can be prepared using methods known in the art. For example, by adding two or more recombination sites to a nucleic acid fragment of interest and cloning, and performing the Gateway ™ cloning method using the clone, a maximum of three recombination reactions can be performed in one recombination reaction. An expression vector containing a nucleic acid fragment can be prepared (WO99 / 21977, Non-Patent Document 1). As one embodiment, a method for preparing an expression vector comprising three target nucleic acid fragments (cDNA1 and cDNA2 and a cassette structure in which a polyadenine addition sequence serving as a transcription termination signal and a promoter sequence serving as a transcription initiation signal are linked as a continuous nucleic acid fragment) Is shown in FIG. 1C. Examples of techniques for adding two or more recombination sites to a target nucleic acid fragment include, for example, mutagenesis of nucleic acid molecules (for example, random or site-directed mutagenesis), recombination techniques (for example, ligation of adapters or nucleic acid molecules). To a linear molecule containing a recombination site), amplification (eg, using a primer containing the recombination site or portion thereof), gene transfer (eg, using a transposon containing the recombination site), recombination (Eg, using one or more homologous sequences containing recombination sites), nucleic acid synthesis (eg, chemical synthesis of molecules containing recombination sites or enzymatic synthesis using various polymerases or reverse transcriptases) ). A nucleic acid fragment of interest is any nucleic acid fragment derived from any source, including non-natural nucleic acids.
本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを用いる。ドナーベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらないものである。カセットは、選択マーカーを少なくとも１つ含む核酸断片を意味し、好ましくは少なくとも２つの別種の選択マーカーを含む。本発明において、カセットは、選択マーカーとして、好ましくは、薬剤耐性遺伝子配列（好ましくは、クロラムフェニコール耐性遺伝子配列）及び毒性遺伝子配列（好ましくは、ｃｃｄＢ）を含む。ドナーベクターは、通常、カセット以外の領域にさらなる選択マーカーを含み、該選択マーカーは、好ましくはカセットに含まれる選択マーカーとは別種のものである。ドナーベクターは、さらに複製起点を含んでいてもよい。 In the method of the present invention, a donor vector comprising a cassette flanked by at least two recombination sites is used. The recombination sites contained in the donor vector are usually those that do not substantially recombine with each other. The cassette means a nucleic acid fragment containing at least one selection marker, and preferably contains at least two other types of selection markers. In the present invention, the cassette preferably contains a drug resistance gene sequence (preferably a chloramphenicol resistance gene sequence) and a toxic gene sequence (preferably ccdB) as selectable markers. The donor vector usually contains an additional selectable marker in a region other than the cassette, which is preferably different from the selectable marker contained in the cassette. The donor vector may further contain an origin of replication.
本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むエントリーベクターを用いる。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片とは、エントリーベクターにおいて、核酸断片の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。少なくとも２つの組換え部位の間に存在する核酸断片は、特に制限されず、所望の核酸断片、通常、所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡである。核酸断片がｃＤＮＡを２種以上含んでいてもよく、さらにその他の配列を含んでいてもよい。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むとは、核酸断片とその少なくとも両端に存在する組換え部位とを含む領域が、エントリーベクターに２つ以上存在することを意味する。エントリーベクターは、さらなる核酸断片及び組換え部位を含んでいてもよい。エントリーベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらない。 In the method of the present invention, an entry vector containing two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites is used. A nucleic acid fragment adjacent to at least two recombination sites means that in an entry vector, there are recombination sites at least at both ends of the nucleic acid fragment. The nucleic acid fragment present between at least two recombination sites is not particularly limited, and is a desired nucleic acid fragment, usually cDNA encoding a desired gene. The nucleic acid fragment may contain two or more kinds of cDNA, and may further contain other sequences. The phrase “containing two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites” means that there are two or more regions in the entry vector including the nucleic acid fragments and the recombination sites present at least at both ends thereof. The entry vector may contain additional nucleic acid fragments and recombination sites. Recombination sites contained in entry vectors usually do not substantially recombine with each other.
エントリーベクターは、通常、選択マーカーを含む。さらに、好ましくは、核酸断片とその両端の組換え部位を含む各領域の上流にプロモーターをそれぞれ含む。また、エントリーベクターは好ましくは、核酸断片同士の間に、転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造、好ましくはｐＡ−Ｐカセットを含む。 Entry vectors usually contain a selection marker. Furthermore, preferably, a promoter is included upstream of each region including the nucleic acid fragment and the recombination sites at both ends thereof. The entry vector preferably has a cassette structure, preferably a pA-P cassette, in which a polyadenine addition sequence serving as a transcription termination signal and a promoter sequence serving as a transcription initiation signal are linked as a continuous nucleic acid fragment between nucleic acid fragments. Including.
図１Ｃの後半部分に、少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含む発現ベクターと少なくとも２つの組換え部位をもつドナーベクターの組換え反応を行うことにより、発現ベクターの骨格をドナーベクターと交換し、少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターを作製する行程を示す。 In the latter half of FIG. 1C, the recombination reaction of an expression vector containing at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites and a donor vector having at least two recombination sites is carried out so that the expression vector backbone is The process of creating an entry vector that is exchanged for a donor vector and that contains at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites is shown.
発現ベクター、エントリーベクター及びドナーベクターを構築するために使用しうるベクターは、特に限定されず、原核生物ベクター又は真核生物ベクターのいずれも使用できる。また、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッド又は逆ツーハイブリッドベクター、シャトルベクターなども使用でき、当業者であれば目的に応じて適宜選択できる。 The vectors that can be used to construct the expression vector, entry vector, and donor vector are not particularly limited, and any of prokaryotic or eukaryotic vectors can be used. Moreover, an expression vector, a fusion vector, a two-hybrid or reverse two-hybrid vector, a shuttle vector, etc. can also be used, and those skilled in the art can select suitably according to the objective.
真核生物ベクターには、酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核生物細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞中で増殖又は複製するベクターが含まれ、原核生物ベクターには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属又はＰｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ属等の細菌中で増殖又は複製するベクターが含まれる。 Eukaryotic vectors include vectors that grow or replicate in yeast cells, plant cells, fish cells, eukaryotic cells, mammalian cells or insect cells, and prokaryotic vectors include Escherichia, Salmonella, Vectors that grow or replicate in bacteria such as Bacillus, Streptomyces or Pseudomonas are included.
真核生物ベクターの具体例としては、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ＹＡＣｎｅｏ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、及びｐＯＧ４４、ｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、並びにｐＥＢＶＨｉｓ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。 Specific examples of eukaryotic vectors include pFastBac, pFastBac HT, pFastBac DUAL, pSFV, pTet-Splice, pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEpp, pCMVpp pCH110, pKK232-8, p3′SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, and pOG44, pYES2, pAC360, pBlueBacHis, pVL1392, pBlueBacIII, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pZeoSV, pZeoSV Or a modification is mentioned.
原核生物ベクターの具体例としては、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＲＳＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ３８８−１、並びにｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。 Specific examples of prokaryotic vectors include pcDNAII, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHis, pRSET, pGEMEX-1, pGEMEX-2, pET, pTrc99A, pKK223-3, pGEX, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, KK2331 , PKK388-1, and pProEx-HT or derivatives or variants thereof.
２−ハイブリッド及び逆２−ハイブリッドベクターの具体例としては、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ及びにｐＹＥＳＴｒｐ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。 Specific examples of the 2-hybrid and reverse 2-hybrid vectors include pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACT, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9. PGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, and pYESTrp or a derivative or modification thereof.
本発明においては、工程（ａ）において、上記発現ベクターと、ドナーベクターと、部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換する。この交換反応により、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する。さらに工程（ｂ）において、（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、エントリーベクターと、部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換する。この交換反応により、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する。 In the present invention, in the step (a), nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites contained in the expression vector are obtained by incubating the expression vector, donor vector, and site-specific recombination protein. Exchange at least one and cassette adjacent to at least two recombination sites contained in the donor vector. By this exchange reaction, a modular destination vector including at least one nucleic acid fragment and at least one cassette is constructed. Furthermore, in the step (b), the modular destination vector obtained in (a), the entry vector, and the site-specific recombinant protein are incubated, whereby the cassette contained in the modular destination vector, Exchange at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two contained recombination sites. By this exchange reaction, a vector containing at least three desired nucleic acid fragments is constructed.
ここで、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とは、少なくとも２つの所望の核酸断片が存在する領域の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。そしてこの両端の組換え部位で組換えが起こることにより、２つの所望の核酸断片を含む領域がデスティネーションベクターに挿入される。本発明において、モジュラーデスティネーションベクターは、ドナーベクターに含まれるカセット及び最初の発現ベクターに含まれた核酸断片の少なくとも１つを含むベクターを指す。 Here, the at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites contained in the entry vector means that there are recombination sites at least at both ends of a region where at least two desired nucleic acid fragments are present. . Then, when recombination occurs at the recombination sites at both ends, a region containing two desired nucleic acid fragments is inserted into the destination vector. In the present invention, a modular destination vector refers to a vector comprising at least one of a cassette contained in a donor vector and a nucleic acid fragment contained in the first expression vector.
本発明において、核酸断片とカセット、及びカセットと核酸断片の間の交換は、部位特異的組換えタンパク質（リコンビナーゼ並びに会合するコファクター及びタンパク質を含む）の使用によって達成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコンビナーゼの例として、Ｃｒｅ及びインテグラーゼが挙げられる。本発明においては、インテグラーゼを用いるのが好ましい。 In the present invention, exchange between a nucleic acid fragment and a cassette and between a cassette and a nucleic acid fragment is accomplished by the use of site-specific recombinant proteins, including recombinases and associated cofactors and proteins. Various recombinant proteins have been described in the art. Examples of such recombinases include Cre and integrase. In the present invention, integrase is preferably used.
Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（Abremski及びHoess、J.Biol.Chem.259(3):1509-1514(1984)）であり、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐＤＮＡ配列間の交換を触媒する（Hoessら、Nucl.Acids Res.14(5):2287(1986）)。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．６９２４７−１）。Ｃｒｅによって媒介される組換えは、可逆的である。Ｃｒｅは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウム又はスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。交換される核酸は、直鎖状又は超らせん状のいずれでもよい。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Hoessら、前掲）。これらの１つｌｏｘＰ５１１は、別のｌｏｘＰ５１１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組換えない。 Cre is a protein derived from bacteriophage P1 (Abremski and Hoess, J. Biol. Chem. 259 (3): 1509-1514 (1984)), and exchange between 34 bp DNA sequences called loxP (crossover locus) sites (Hoess et al., Nucl. Acids Res. 14 (5): 2287 (1986)). Cre is commercially available (Novagen, catalog No. 69247-1). Recombination mediated by Cre is reversible. Cre works in a simple buffer containing either magnesium or spermidine as a cofactor, as is well known in the art. The exchanged nucleic acid may be either linear or superhelical. A number of mutant loxP sites have been described (Hoess et al., Supra). One of these loxP511 recombines with another loxP511 site, but not with the loxP site.
インテグラーゼは、λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込みを媒介する、バクテリオファージλ由来のタンパク質である。バクテリオファージλＩｎｔ組換えタンパク質は、ａｔｔ部位間の組換えを促進する。組換え反応は、組込み組換え及び切り出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。４つのタンパク質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦ及びＦＩＳ）が関与する協同的及び競合的相互作用が組換えの方向を決定する。 Integrase is an E. coli lambda genome. It is a protein derived from bacteriophage λ that mediates integration into the E. coli chromosome. The bacteriophage λInt recombinant protein promotes recombination between att sites. The recombination reaction results from two independent pathways for integration recombination and excision recombination. Cooperative and competitive interactions involving four proteins (Int, Xis, IHF and FIS) determine the direction of recombination.
組込み組換えには、Ｉｎｔ及びＩＨＦタンパク質、並びに部位ａｔｔＰ（２４０ｂｐ）及びａｔｔＢ（２５ｂｐ）が関与する。組換えは、２つの新たな部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲの形成を生じる。切り出し組換えは、ａｔｔＰ及びａｔｔＢを生成するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓ、並びに部位ａｔｔＬ及びａｔｔＲを必要とする。特定の条件下で、ＦＩＳは、切り出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、ａｔｔＰ及びａｔｔＢは、同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物（ａｔｔＬを有するものと、ａｔｔＲを有するもの）を生成する。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子との間での分子間組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦ及びＸｉｓの存在下で、組込み組換え並びにａｔｔＰ及びａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、核酸断片を、操作したａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り出し組換え又は組込み組換えを互いの逆反応として導き得る。 Integration recombination involves the Int and IHF proteins and the sites attP (240 bp) and attB (25 bp). Recombination results in the formation of two new sites, attL and attR. Excision recombination requires Int, IHF, and Xis and sites attL and attR to generate attP and attB. Under certain conditions, FIS stimulates excision recombination. In addition to these normal reactions, attP and attB, when placed on the same molecule, promote excision recombination to produce two excision products (one with attL and one with attR). Similarly, intermolecular recombination between molecules containing attL and molecules containing attR can result in integrative recombination and production of attP and attB in the presence of Int, IHF and Xis. Thus, excision recombination or integrative recombination can be induced as an inverse reaction to each other in the presence of the appropriate recombinant protein by flanking the nucleic acid fragments with the appropriate combination of engineered att sites.
ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア配列を含む。機能的に重要な個々の配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、及びその境界を横切って存在する（Landy,A.,Ann.Rev.Biochem.58:913(1989)）。 Each of the att sites contains a 15 bp core sequence. Functionally important individual sequence elements are present within, outside and across this common core boundary (Landy, A., Ann. Rev. Biochem. 58: 913 (1989) ).
また、インテグラーゼはバクテリオファージλ上のａｔｔＰ部位（約２４０ｂｐ）をＥ．ｃｏｌｉゲノム上のａｔｔＢ部位（約２５ｂｐ）と組換えて（Weisberg,R.A.及びLandy,A.Lambda II、p.211(1983)、Cold Spring Harbor Laboratory）、ａｔｔＬ（約１００ｂｐ）及びａｔｔＲ（約１６０ｂｐ）部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非存在下では、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼ及びＩＨＦによって媒介される組込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて実施できる。 In addition, integrase introduces an attP site (about 240 bp) on bacteriophage λ into E. coli. recombined with the attB site (about 25 bp) on the E. coli genome (Weisberg, RA and Landy, A. Lambda II, p. 211 (1983), Cold Spring Harbor Laboratory), attL (about 100 bp) and attR (about 160 bp) It acts to generate an integrated lambda genome flanked by sites. In the absence of Xis, this reaction is essentially irreversible. The integration reaction mediated by integrase and IHF can be performed in vitro using a simple buffer containing spermidine.
本発明において組換え部位は、部位特異的組換えタンパク質が認識して結合する部位を意味する。従って、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための組換え部位であるｌｏｘＰ（Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)の図１）、λインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列（Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)）が挙げられる。 In the present invention, the recombination site means a site where a site-specific recombination protein recognizes and binds. Thus, for example, loxP, the recombination site for Cre recombinase (Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5: 521-527 (1994), FIG. 1), attB, attP, attL recognized by λ integrase. And attR sequences (Landy, Current Opinion in Biotechnology 3: 699-707 (1993)).
操作された組換え部位としては以下のものが挙げられる。例えば、ａｔｔ部位は、組換え反応の特異性又は効率及び産物ＤＮＡの性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔｔ２、及びａｔｔ３部位）、逆反応を減少させるために（例えば、ａｔｔＲからのＰ１及びＨ１の除去）、１又は複数の変異を有するように操作され得る。従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得る。このような変異には、翻訳終止コドンを有しない組換え部位（これは、融合タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位及び組換え部位のヘアピン形成を防ぐ変異体が含まれるが、これらに限定されない。どの特定の反応が起こるかは、どの特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定される。例えば、三部分タンパク質融合体は、組換え部位ａｔｔＲ１及びａｔｔＬ１；並びにａｔｔＢ３；ａｔｔＲ１；ａｔｔＰ３及び１０ｘＰ；並びに／又はａｔｔＲ３及び１０ｘＰ；並びに／又はａｔｔＲ３及びａｔｔＬ２を含む親プラスミドを用いて達成され得る。本発明において組換え部位は、好ましくは、ａｔｔ１、ａｔｔ２、ａｔｔ３、ａｔｔ４、ａｔｔ５及びａｔｔ６から選択される。上記組換え部位については、例えば、ＷＯ９６／４０７２４、ＷＯ９９−２１９７７及び新遺伝子工学ハンドブック（改訂第４版）羊土社に記載されている。 The engineered recombination sites include the following: For example, the att site may be used to enhance the specificity or efficiency of the recombination reaction and the nature of the product DNA (eg, att1, att2, and att3 sites) or to reduce the reverse reaction (eg, P1 from attR). And removal of H1) can be engineered to have one or more mutations. Thus, mutations can be introduced at the recombination site to enhance site-specific recombination. Such mutations include recombination sites that do not have a translation stop codon (which allows the fusion protein to be encoded); recombination sites and sets that are recognized by the same protein but differ in nucleotide sequence. Mutants that prevent hairpin formation at the replacement site are included, but are not limited to these. Which particular reaction occurs is determined by which particular partner is present in the reaction mixture. For example, a three-part protein fusion can be achieved using parental plasmids comprising recombination sites attR1 and attL1; and attB3; attR1; attP3 and 10xP; and / or attR3 and 10xP; and / or attR3 and attL2. In the present invention, the recombination site is preferably selected from att1, att2, att3, att4, att5 and att6. The recombination sites are described in, for example, WO96 / 40724, WO99-21977, and New Genetic Engineering Handbook (4th revised edition) Yodosha.
本発明において、選択マーカーは、特定の条件下で、それを含有する分子又は細胞を選択する、あるいはそれを含有しない分子又は細胞を選択することを可能にする、核酸配列である。選択マーカーの例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない。（１）毒性ある薬剤（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードする配列（薬剤耐性遺伝子配列）、（２）レシピエント細胞において別に欠如している産物をコードする配列（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）、（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする配列、（４）容易に同定され得る産物をコードする配列（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）、（５）レピシエント細胞において毒性である産物をコードする配列（毒性遺伝子配列）などである。 In the present invention, a selectable marker is a nucleic acid sequence that makes it possible to select molecules or cells containing it, or molecules or cells that do not contain it, under specific conditions. Examples of selectable markers include, but are not limited to: (1) a sequence (drug resistance gene sequence) that encodes a product that provides resistance to a toxic drug (eg, antibiotics such as chloramphenicol, ampicillin, kanamycin), (2) otherwise absent in the recipient cell A sequence encoding a product (eg, tRNA gene, auxotrophic marker), (3) a sequence encoding a product that suppresses the activity of the gene product, (4) a sequence encoding a product that can be easily identified (eg, β Phenotypic markers such as galactosidase, green fluorescent protein (GFP), and cell surface proteins), (5) sequences encoding products that are toxic in recipient cells (toxic gene sequences), and the like.
毒性遺伝子の例は当該分野において周知であり、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（例えば、ＤｐｎＩ）、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１又はｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミリーのメンバー）、レトロウイルス遺伝子（ヒト免疫不全ウイルスの毒性遺伝子産物を含む）、抗生物質感受性遺伝子（例えば、ｒｐｓＬ）、抗菌剤感受性遺伝子（例えば、ｐｈｅＳ）、プラスミド殺傷遺伝子、及び抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢ又はｃｃｄＢ）を含むがそれらに限定されない。本発明の組換え反応においては、通常、上記のような選択マーカーを利用して、所望の組換え産物の選択、富化又は同定を行う。 Examples of virulence genes are well known in the art and include restriction endonuclease genes (eg, DpnI), apoptosis-related genes (eg, members of ASK1 or bcl-2 / ced-9 family), retroviral genes (human immunodeficiency virus) Toxic gene products), antibiotic susceptibility genes (eg rpsL), antibacterial agent susceptibility genes (eg pheS), plasmid killing genes, and genes that damage the host in the absence of suppressor function (eg kicB or including but not limited to ccdB). In the recombination reaction of the present invention, the desired recombination product is usually selected, enriched, or identified using the selection marker as described above.
本発明の一実施形態を図２を参照することにより以下に説明する。まず、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＢ３及びａｔｔＢ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ２を含むエントリーベクター１（２種ｃＤＮＡタンデムｐＥＸＰＲ）を調製する（図２Ａ及びＢ）。続いて、部位特異的組換えタンパク質の存在下、選択マーカーであるｃｃｄＢとクロラムフェニコール耐性遺伝子配列（ＣｍＲ）を含むカセットであって、ａｔｔＰ３とａｔｔＰ２に隣接したカセットを含むドナーベクター（ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２）と、エントリーベクター１とをインキュベートする（図２Ｂ）。これにより、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＲ３とａｔｔＲ２に隣接したカセットを含むモジュラーデスティネーションベクター（モジュラーｐＤＥＳＴ）が得られる（図２Ｃ）。続いて、部位特異的組換えタンパク質の存在下、このモジュラーデスティネーションベクターと、ａｔｔＬ３とａｔｔＢ６に隣室した核酸断片ｃＤＮＡ２及びａｔｔＢ５とａｔｔＬ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ３を含むエントリーベクター２とをインキュベートする（図２Ｃ）。これにより、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＢ３とａｔｔＢ６に隣室した核酸断片ｃＤＮＡ２と、ａｔｔＢ５とａｔｔＢ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ３を含むベクターが得られる（図２Ｄ）。
One embodiment of the present invention is described below with reference to FIG. First, an entry vector 1 (two kinds of cDNA tandem pEXPR) containing a nucleic acid fragment cDNA1 adjacent to attB1 and attB4 and a nucleic acid fragment cDNA2 adjacent to attB3 and attB2 is prepared (FIGS. 2A and B). Subsequently, in the presence of a site-specific recombinant protein, a donor vector (pDONR) comprising a cassette containing a selectable marker ccdB and a chloramphenicol resistance gene sequence (Cm R ) adjacent to attP3 and attP2. -P3P2) and
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。該キットは、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを含む。該キットはさらに、組換えタンパク質又はリコンビナーゼ、宿主細胞（例えば、コンピテントセル）を含み得る。 The invention also relates to a kit for performing the method of the invention. The kit includes a donor vector that includes a cassette flanked by at least two recombination sites. The kit may further comprise a recombinant protein or recombinase, a host cell (eg, a competent cell).
蛍光タンパク質のクローン
標的ｃＤＮＡ産物を標識するか、又は単に発現させるために、別種の励起及び放出波長を持つ、５タイプの蛍光タンパク質を使用した。これらは以下のものである：ＥＧＦＰ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ５５７６３）（Cormack, B.P., Valdivia, R.H. & Falkow, S. (1996) Gene, 173, 33-38；Zhang, G., Gurtu, V. & Kain, S.R. (1996) 227, 707-711）、Ｖｅｎｕｓ（ＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ／Ｆ６４Ｌ／Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ／Ｓ１７５Ｇ）（Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K. & Miyawaki, A. (2002) Nat Biotechnol, 20, 87-90）、ＳＥＣＦＰ（ＥＣＦＰ−Ｋ２７Ｒ／Ｎ１６５Ｈ）（Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S.S. & Tsien, R.Y. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 98, 14997-15002）、ＤｓＲｅｄ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）（Matz, M.V., Fradkov, A.F., Labas, Y.A., et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17, 969-973；Terskikh, A.V., Fradkov, A.F., Zaraisky, A.G., Kajava, A.V. & Angres, B. (2002) J. Biol. Chem., 277, 7633-7636）及びｍＲＦＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＡＦ５０６０２７、Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 99, 7877-7882）。対応する蛍光タンパク質ＯＲＦを含有する組換えプラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ）、ｐＣＳ２−Ｖｅｎｕｓ、ｐＲＳＥＴＢ−ＳＥＣＦＰ、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ）及びｐＲＳＥＴＢ−ｍＲＦＰ１を、ＰＣＲのための鋳型として使用した。ＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１を含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＣＸＮ−ＥＧＦＰ及びｐＣＸＮ−ｍＲＦＰ１）も、トランスフェクションアッセイの対照ベクターとして使用した。
Five types of fluorescent proteins with different excitation and emission wavelengths were used to label or simply express the cloned target cDNA product of the fluorescent protein. These are: EGFP (BD Biosciences Clontech Inc .; GenBank accession number: U55763) (Cormack, BP, Valdivia, RH & Falkow, S. (1996) Gene, 173, 33-38; Zhang, G. , Gurtu, V. & Kain, SR (1996) 227, 707-711), Venus (EYFP-F46L / F64L / M153T / V163A / S175G) (Nagai, T., Ibata, K., Park, ES, Kubota, M., Mikoshiba, K. & Miyawaki, A. (2002) Nat Biotechnol, 20, 87-90), SECFP (ECFP-K27R / N165H) (Zhang, J., Ma, Y., Taylor, SS & Tsien, RY (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 14997-15002), DsRed2 (BD Biosciences Clontech Inc.) (Matz, MV, Fradkov, AF, Labas, YA, et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17, 969-973; Terskikh, AV, Fradkov, AF, Zaraisky, AG, Kajava, AV & Angres, B. (2002) J. Biol. Chem., 277, 7 633-7636) and mRFP1 (GenBank accession number: AF506027, Campbell, RE, Tour, O., Palmer, AE, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882). Recombinant plasmids containing the corresponding fluorescent protein ORF, pEGFP-C1 (BD Biosciences Clontech Inc), pCS2-Venus, pRSETB-SECFP, pDsRed2-N1 (BD Biosciences Clontech Inc) and pRSETB-mRFP1 for PCR Used as. Mammalian expression vectors containing EGFP and mRFP1 (pCXN-EGFP and pCXN-mRFP1) were also used as control vectors in the transfection assay.
ドナーベクター
ドナーベクターを使用して、その一対のａｔｔＰシグナルに隣接したｃｃｄＢ−ＣｍＲカセットと一対のａｔｔＢシグナルに隣接したＤＮＡ断片とをＢＰ反応で交換することによって、ＤＮＡ断片をクローン化した。この実験で使用したドナーベクター（ｐＤＯＮＲ）はｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）から構築した。これはａｔｔＰ１及びａｔｔＰ２を持つが、既報（Sasaki, Y., Sone, T., Yoshida, S., et al. (2004a) J. Biotechnol., 107, 233-243）に記載されているように、変異型ａｔｔＰシグナルを生成するように、ａｔｔＰシグナルを改変している（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、並びにその逆方向相当物、Ｐ３ｒ、Ｐ４ｒ、Ｐ５ｒ、及びＰ６ｒ）。これらは以下のものである：ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ４、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ６、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ３ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ５ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ３ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ５ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ６、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ４、及びｐＤＯＮＲ−Ｐ２ｒＰ４。
Donor vector A DNA fragment was cloned by exchanging the ccdB-Cm R cassette adjacent to the pair of attP signals and the DNA fragment adjacent to the pair of attB signals in a BP reaction using the donor vector. The donor vector (pDONR) used in this experiment was constructed from pDONR201 (Invitrogen). It has attP1 and attP2, but as described in previous reports (Sasaki, Y., Sone, T., Yoshida, S., et al. (2004a) J. Biotechnol., 107, 233-243). The attP signal has been modified to generate a mutated attP signal (P3, P4, P5, P6 and its reverse counterparts, P3r, P4r, P5r, and P6r). These are: pDONR-P1P4, pDONR-P1P6, pDONR-P1P3r, pDONR-P1P5r, pDONR-P3P2, pDONR-P5P2, pDONR-P4rP2, pDONR-P6rP2, pDONR-P4rP3r, PDOr-P6rP3rP P3P6, pDONR-P5P4, and pDONR-P2rP4.
デスティネーションベクター
ＥＦ１−αプロモーター１個を持つ通常の発現ベクターの構築のため、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用した。このデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴ）は、ａｔｔＲ１−ｃｃｄＢ−ＣｍＲ−ａｔｔＲ２カセットを持ち、５’及び３’末端にそれぞれヒトＥＦ−１ａプロモーター及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ヒトＥＦ−１ａプロモーターの１．３ｋｂ断片の切除によって、プロモーターを含まないデスティネーションベクターを構築した。ｐＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴと命名したこのデスティネーションベクターは、第１プロモーターシグナルをｐＥＮＴＲ中にクローン化した断片として添加する場合に使用した。
PEF5 / FRT / V5-DEST (Invitrogen) was used for the construction of a normal expression vector with one destination vector EF1-α promoter. The destination vector (pDEST) has the attR1-ccdB-Cm R -attR2 cassette, respectively at the 5 'and 3' ends, including a polyadenylation signal of the human EF-1a promoter and the bovine growth hormone. pEF5 / FRT / V5-DEST was digested with HindIII and a 1.3 kb fragment of the human EF-1a promoter was excised to construct a promoter-free destination vector. This destination vector, named pFRT / V5-DEST, was used when the first promoter signal was added as a fragment cloned into pENTR.
複数遺伝子発現ベクター（ｐＥＸＰＲ）を構築するために、ｃｃｄＢ−ＣｍＲカセットのそれぞれの末端のａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２に代えて、任意のａｔｔＲ又はａｔｔＬシグナルの組み合わせを所有するデスティネーションベクターを設計した。この一時的デスティネーションベクターの使用例を図１Ｃに示す。これらのベクターは、両端でａｔｔＢシグナルに隣接しているＥＧＦＰ遺伝子を含有するＰＣＲ産物を、ライゲーションによってｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、ＢＰ反応によって、ＥＧＦＰ遺伝子を対応するａｔｔＰシグナルを持つドナーベクターのｃｃｄＢ−ＣｍＲカセットと交換する（Sasakiら、2004a前掲）ことによって、構築した。この実験で使用した一時的デスティネーションベクターは以下のものである：ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ４、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ６、及びｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４。 In order to construct a multigene expression vector (pEXPR), a destination vector was designed that possessed any combination of attR or attL signals instead of attR1 and attR2 at each end of the ccdB-Cm R cassette. An example of the use of this temporary destination vector is shown in FIG. 1C. In these vectors, a PCR product containing the EGFP gene adjacent to the attB signal at both ends was inserted into the HincII site of pUC18 by ligation, and then a donor vector having an attP signal corresponding to the EGFP gene by BP reaction. It was constructed by exchanging with a ccdB-Cm R cassette (Sasaki et al., 2004a supra). The temporary destination vectors used in this experiment are: pUC-DEST-R3R2, pUC-DEST-R5R2, pUC-DEST-R1R4, pUC-DEST-R1R6, pUC-DEST-R3R6, and pUC- DEST-R5R4.
エントリーベクター
蛍光タンパク質−ＯＲＦを含有するエントリーベクター（ｐＥＮＴＲ）を以下のようにして構築した。例えばａｔｔＢｘ−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）−ａｔｔＢｙ（ａｔｔＢｘ又はａｔｔＢｙ：任意のａｔｔＢ配列、ＳＤＫ：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及びＫｏｚａｋ配列を持つＤＮＡ断片の調製については、ＰＣＲによるＯＲＦ断片の増幅のための鋳型として、そのｃＤＮＡを保有するプラスミドベクターを使用した。フォワードプライマー（Ｆｗ）混合物（ａｔｔＢｘ−ＳＤＫ及びＳＤＫ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）、相対量１０／１００）並びにａｔｔＢｙ（＊）−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）のリバースプライマー（Ｒｖ）を使用して、増幅反応を組み立てた。ａｔｔＢに隣接したＯＲＦ断片で構成されるＮ−末端融合物（ＳＤＫ配列を含まない）の調製では、ａｔｔＢｘ−ＥＧＦＰ−Ｆｗプライマー及びａｔｔＢｙ−ＥＧＦＰ−Ｒｖプライマーのみを使用して、ａｔｔＢｘ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）−ａｔｔＢｙを増幅させた。使用したａｔｔＢに隣接したＰＣＲプライマーを表１に掲載する。
An entry vector (pENTR) containing the entry vector fluorescent protein-ORF was constructed as follows. For example, for preparation of a DNA fragment having attBx-SDK-EGFP (ORF) -attBy (attBx or attBy: any attB sequence, SDK: Shine-Dalgarno sequence and Kozak sequence, as a template for amplification of the ORF fragment by PCR The plasmid vector carrying the cDNA was used, the forward primer (Fw) mixture (attBx-SDK and SDK-EGFP (ORF), relative amount 10/100) and the reverse primer of attBy ( * )-EGFP (ORF) ( Rv) was used to assemble the amplification reaction, and for the preparation of N-terminal fusions composed of ORF fragments flanked by attB (without the SDK sequence), the attBx-EGFP-Fw primer and attBy-EGFP- Rv Use timer only was amplified attBx-EGFP (ORF) -attBy. PCR primers adjacent to attB used are listed in Table 1.
この場合、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びＶｅｎｕｓのＯＲＦはその名称中に「ＥＧＦＰ」を含む同一のプライマーセットで増幅した。なぜならば、これらのＯＲＦのＮ−及びＣ−末端配列は同一だからである。ＤｓＲｅｄ２又はｍＲＦＰ１のＯＲＦはそれぞれその名称中に「ＤｓＲ２」又は「ｍＲＦＰ１」を含む別種のプライマーセットで増幅した。ＢＰ反応で、ａｔｔＢに隣接するＰＣＲ産物を、対応するａｔｔＰシグナルを含むドナーベクターと組換えて、蛍光タンパク質を含むエントリーベクターを作製した。ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で配列解析することによって、エントリーベクターを確認した。 In this case, EGFP, SECFP and Venus ORFs were amplified with the same primer set containing “EGFP” in the name. This is because the N- and C-terminal sequences of these ORFs are identical. The DsRed2 or mRFP1 ORF was amplified with a different kind of primer set containing “DsR2” or “mRFP1” in its name, respectively. In the BP reaction, the PCR product adjacent to attB was recombined with the donor vector containing the corresponding attP signal to create an entry vector containing the fluorescent protein. The entry vector was confirmed by sequence analysis with ABI PRISM ™ 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc.).
この実験で使用した蛍光タンパク質をコードするＯＲＦを含むエントリーベクターは以下のものである：ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＥＧＦＰ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＥＧＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＥＧＦＰ−＊Ｌ２及びｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４。 The entry vectors containing the ORF encoding the fluorescent protein used in this experiment are as follows: pENTR-L1-SDK-EGFP- * L2, pENTR-L1-SDK-SECFP- * L2, pENTR-L1-SDK- Venus- * L2, pENTR-L1-SDK-DsRed2- * L2, pENTR-L1-SDK-mRFP1- * L2, pENTR-R6-SDK-EGFP-L2, pENTR-R6-SDK-SECFP- * L2, pENTR- R6-SDK-Venus- * L2, pENTR-R6-SDK-mRFP1- * L2, pENTR-L1-SDK-EGFP-L4, pENTR-L3-SDK-DsRed2- * L2, pENTR-L1-SDK-EGFP-L6 , PENTR-L5- DK-mRFP1- * L2, pENTR- L1-SDK-mRFP1- * L6, pENTR-L5-SDK-EGFP- * L2, pENTR-L5-EGFP- * L2, pENTR-R6-SDK-mRFP1-L4, pENTR- L3-SDK-Venus- * L2, pENTR-L3-SDK-SECFP-L6, pENTR-L5-SDK-DsRed2- * L2, pENTR-L3-EGFP-L6, pENTR-L5-SDK-mRFP1-L4, pENTR- L3-mRFP1- * L6, pENTR-L5-SDK-EGFP-L4, pENTR-L5-SDK-mRFP1- * L2, pENTR-L3-EGFP- * L2, and pENTR-L1-SDK-mRFP1-L4.
ヒトアクチンキャップタンパク質のサブユニット、ＣＰα１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ５６６３７）（Hart, M.C., Korshunova, Y.O. & Cooper, J.A. (1997) Cell Motil Cytoskeleton, 38, 120-132）及びＣＰβ２（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ０３２７１）（Barron-Casella, E.A., Torres, M.A., Scherer, S.W., Heng, H.H., Tsui, L.C. & Casella, J.F. (1995) J Biol Chem, 270, 21472-21479；Hart, M.C. & Cooper, J.A. (1999) J Cell Biol, 147, 1287-1298）、並びにβ−アクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＮＭ＿００１１０１）（Gunning, P., Ponte, P., Okayama, H., Engel, J., Blau, H. & Kedes, L. (1983) Mol Cell Biol, 3, 787-795）をコードするＯＲＦを含有するｐＥＮＴＲベクターを、これらの遺伝子について特異的な、ａｔｔＢに接続したプライマー（表１）を使用する同様の操作法によって構築した。ＣＰβ２をコードするＯＲＦをプラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｃｐβ２）から増幅させた。ＣＰα１及びβ−アクチンをコードするＯＲＦを、鋳型としてヒトｃＤＮＡを使用することによって増幅させた。ＣＰβ２、ＣＰα１又はβ−アクチンのＯＲＦはそれぞれ「ＣＰｂ２」、「ＣＰａ１」又は「ＡＣＴ」を含むプライマーセットで増幅した。この実験で使用したすべてのアクチン関連タンパク質をコードするＯＲＦを含有するエントリーベクターは、以下のものである：ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｃｐβ２−Ｒ３、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｃｐβ２−Ｒ５、ｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｃｐα１−＊Ｌ２、及びｐＥＮＴＲ−Ｒ２−ｃｐα１−＊Ｌ４。 Subunits of human actin cap protein, CPα1 (GenBank accession number: U563637) (Hart, MC, Korshunova, YO & Cooper, JA (1997) Cell Motil Cytoskeleton, 38, 120-132) and CPβ2 (GenBank accession number: U03271) (Barron-Casella, EA, Torres, MA, Scherer, SW, Heng, HH, Tsui, LC & Casella, JF (1995) J Biol Chem, 270, 21472-21479; Hart, MC & Cooper, JA (1999) J Cell Biol, 147, 1287-1298), and β-actin (GenBank accession number: NM — 00101) (Gunning, P., Ponte, P., Okayama, H., Engel, J., Blau, H. & Kedes, L (1983) Molten Biol, 3, 787-795) containing a pENTR vector containing an ORF by a similar procedure using primers (Table 1) connected to attB specific for these genes. It was constructed. The ORF encoding CPβ2 was amplified from a plasmid vector (pEGFP-N1-cpβ2). ORFs encoding CPα1 and β-actin were amplified by using human cDNA as a template. The CPβ2, CPα1 or β-actin ORFs were amplified with primer sets containing “CPb2”, “CPa1” or “ACT”, respectively. Entry vectors containing ORFs encoding all actin-related proteins used in this experiment are: pENTR-L1-SDK-cpβ2-R3, pENTR-R6-SDK-cpβ2-R5, pENTR-R4 -Cpα1- * L2, and pENTR-R2-cpα1- * L4.
ヒトＥＦ−１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｊ０４６１７）（Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N. &Sugano, S. (1990) Gene, 91, 217-223；Uetsuki, T., Naito, A., Nagata, S. & Kaziro, Y. (1989) J Biol Chem, 264, 5791-5798）をコードするエントリーベクター（ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＰＥＦ１α−Ｌ６）も構築した。ＥＦ−１αプロモーターの増幅のための鋳型として、デスティネーションベクター、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴを使用した。プライマーセット、Ｂ１−ＰＥＦ１α−Ｆｗ及びＢ６−ＰＥＦ１α−Ｒｖを使用して、ＥＦ−１α（ＰＥＦ１α）のプロモーターシグナルを増幅した。 Human EF-1α promoter (GenBank accession number: J04617) (Kim, DW, Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N. & Sugano, S. (1990) Gene, 91, 217-223; Uetsuki, T. , Naito, A., Nagata, S. & Kaziro, Y. (1989) J Biol Chem, 264, entry vector encoding 5791-5798) (pENTR-L1-P EF1α -L6) was also constructed. The destination vector, pEF5 / FRT / V5-DEST, was used as a template for amplification of the EF-1α promoter. The promoter signal of EF-1α (P EF1α ) was amplified using the primer set, B1-P EF1α- Fw and B6-P EF1α- Rv.
ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴをＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩで消化し、ヒトＥＦ−１αプロモーター（ＰＥＦ１α）の１．３ｋｂ断片又はウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル（ｐＡＢＧＨ）を含有する０．６ｋｂ断片を、ｐＵＣ１８の対応する制限部位中に順次挿入した。生成したベクターを配列決定し、２つの断片の配向性を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐＡＢＧＨ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−ＰＥＦ１α−ＸｂａＩの配向性を持つ構築したプラスミドベクターを鋳型として使用し、プライマーセットとしてＢ４ｒ−ＭＣＳ−Ｆｗ及びＢ３ｒ−ＭＣＳ−Ｒｖ、又はＢ６ｒ−ＭＣＳ−Ｆｗ及びＢ５ｒ−ＭＣＳ−Ｒｖを使用することによって、合計２．０ｋｂの断片を増幅させた。ＢＰ反応で、ａｔｔＢに隣接したＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ３ｒ又はｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ５ｒと組換えて、エントリーベクター、それぞれｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｐＡＢＧＨ−ＰＥＦ１α−Ｒ３又はｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ｐＡＢＧＨ−ＰＥＦ１α−Ｒ５（表１）を作製した。停止コドンを欠損しているＯＲＦをコードするエントリーベクターの３’末端にｐＡＢＧＨ−ＰＥＦ１αカセットをＬＲ反応によって接続したとき、生成するタンパク質はそのＣ末端に、１８アミノ酸長を含む（翻訳されたａｔｔＢ４ｒ又はａｔｔＢ６ｒの７ａａを含む）。 pEF5 / FRT / V5-DEST was digested with HindIII or XbaI and a 0.6 kb fragment containing a 1.3 kb fragment of the human EF-1α promoter (P EF1α ) or a polyadenylation signal (pA BGH ) from bovine growth hormone. , Inserted sequentially into the corresponding restriction sites of pUC18. The resulting vector was sequenced to confirm the orientation of the two fragments. The constructed plasmid vector having the orientation of HindIII-pA BGH -HindIII-XbaI-P EF1α -XbaI was used as a template, and B4r-MCS-Fw and B3r-MCS-Rv, or B6r-MCS-Fw and primer set were used. A total of 2.0 kb fragments were amplified by using B5r-MCS-Rv. In BP reaction, the PCR products adjacent the attB instead pDONR-P4rP3r or pDONR-P6rP5r paired, entry vector each pENTR-R4-pA BGH -P EF1α -R3 or pENTR-R6-pA BGH -P EF1α -R5 (Table 1) was produced. When the pA BGH- P EF1α cassette is connected to the 3 ′ end of an entry vector encoding an ORF lacking a stop codon by LR reaction, the resulting protein contains 18 amino acids in length at the C terminus (translated) including 7 ata of attB4r or attB6r).
表１においては、ａｔｔＢ部位を太字で示し、下線を付けている。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ及びＫｏｚａｋ共通配列（ＳＤＫ）を普通字で示し、下線を付けている。開始コドンＡＴＧ、及び停止コドンＴＡＡ若しくはＴＡＧを枠付きで示す。プライマーの名称は、「接続したシグナル配列（Ｂｘ又はＳＤＫ）−遺伝子特異的配列（ＥＧＦＰ、ＤｓＲ２、ｍＲＦＰ、その他）−配向性、フォワード（Ｆｗ）又はリバース（Ｒｖ）」として示している。停止コドンを含むプライマーにはその名称中に星印（＊）を付している。 In Table 1, the attB site is shown in bold and underlined. Shine-Dalgarno and Kozak consensus sequences (SDKs) are shown in normal letters and underlined. The start codon ATG and the stop codon TAA or TAG are indicated with a frame. The name of the primer is shown as “connected signal sequence (Bx or SDK) —gene specific sequence (EGFP, DsR2, mRFP, etc.) — Orientation, forward (Fw) or reverse (Rv)”. A primer containing a stop codon is marked with an asterisk ( * ) in its name.
ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え反応
ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、供給元の指示及び既報（Sasakiら、2004a前掲）にしたがって、ＢＰ及びＬＲ反応を実施した。
In vitro recombination reactions BP Clonase ™ Enzyme Mix (Invitrogen) and LR Clonase ™ Enzyme Mix (Invitrogen) were used and BP and LR reactions according to supplier's instructions and previous reports (Sasaki et al., 2004a supra). Carried out.
１〜５種のエントリーベクター及びデスティネーションベクター１種を使用するＭｕｌｔｉｓｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換えの効率を、宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数として測定した。 The efficiency of Multisite Gateway ™ LR recombination using 1-5 entry vectors and one destination vector was measured as the number of colonies formed after transformation into host bacteria.
各反応後のＤＮＡの混合物を使用して、ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（１ｘ１０９ｃ．ｆ．ｕ．／μｇ ｐＵＣ１９）を形質転換し、次にアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にこれを塗布した。３７℃で１８時間のインキュベート後、コロニーを計数した。これらのいくつかを培養し、精製したプラスミドを、アガロースゲル電気泳動によって、そのサイズ及び制限パターンについて、これらが真性の目的ベクターであるか偽性陽性ベクターであるかをチェックした。結果を以下の表２に示す。宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数を「コロニー」として表示した列に記載した。 The mixture of DNA after each reaction was used to transform DH10B competent cells (1 × 10 9 cfu / μg pUC19), which were then spread on LB agar plates containing ampicillin. Colonies were counted after 18 hours of incubation at 37 ° C. Some of these were cultured and purified plasmids were checked by agarose gel electrophoresis for their size and restriction pattern whether they were genuine target vectors or false positive vectors. The results are shown in Table 2 below. The number of colonies formed after transformation into host bacteria is listed in the column labeled “Colony”.
反応に関与する組換え部位の数が増加するにつれて、組換え効率は低下した（Ａ〜Ｅ）。６種の組換えシグナルが関与する５種−ｐＥＮＴＲで陽性ベクターを獲得するのは困難だった。Ｆに、Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換えによる３種−ＤＮＡタンデム発現ベクターの構築の効率を、ＧにこれらのＢＰ組換えによる３種−ＤＮＡタンデムエントリーベクターへの変換の効率を示す。また、これらの模式図を図１に示す。形質転換の条件及び構築物のチェックは、陽性エントリーベクターの取得のためにカナマイシンを含有するＬＢ−アガープレートを使用した以外は、Ａ〜Ｅの場合と同一である。 As the number of recombination sites involved in the reaction increased, the recombination efficiency decreased (AE). It was difficult to obtain a positive vector with 5-pENTR involving 6 recombination signals. F shows the efficiency of construction of a 3-type DNA tandem expression vector by Multisite Gateway ™ LR recombination, and G shows the efficiency of conversion to a 3-type tandem entry vector by these BP recombination. Moreover, these schematic diagrams are shown in FIG. Transformation conditions and construct checks are the same as in A to E except that LB-Agar plates containing kanamycin were used to obtain positive entry vectors.
次に、２種及び４種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図２）、及び２種及び３種融合型ｃＤＮＡ-タンデム発現ベクターの構築を実施した（図３）。 Next, construction of 2 and 4 cDNA-tandem expression vectors (FIG. 2) and construction of 2 and 3 fusion cDNA-tandem expression vectors were carried out (FIG. 3).
（１）２種及び４種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図２）
（Ａ）ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ｃＤＮＡ１−Ｌ４（ｐＥＮＴＲ−１）、ｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｐＡ−Ｐ−Ｒ３（ｐＥＮＴＲ−２）及びｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ｃＤＮＡ２−Ｌ２（ｐＥＮＴＲ−３）と、ＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットの近接部位にプロモーター１個を保有するｐＤＥＳＴ（−Ｒ１Ｒ２）とのＬＲ組換えにより、２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。４対のａｔｔＬ−ａｔｔＲシグナルが相互に特異的に組換えられる。（Ｂ）２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターとｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２とのＢＰ組換えにより、Ｂ３−ｃＤＮＡ２−Ｂ２とＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、ｃＤＮＡ１個、ｐＡ−Ｐカセット１個及びＣｍＲ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２を作製した。（Ｃ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２から、２種−ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ３Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｄ）３種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターから、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ２とのＢＰ組換えにより、Ｂ５−ｃＤＮＡ３−Ｂ２とＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、ｃＤＮＡ２個、ｐＡ−Ｐカセット２個及びＣｍＲ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２を作製した。（Ｅ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２から、２種−ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。組換え反応における各段階の効率を以下の表３に要約する。
(1) Construction of 2 and 4 cDNA-tandem expression vectors (FIG. 2)
(A) pENTR-L1-cDNA1-L4 (pENTR-1), pENTR-R4-pA-P-R3 (pENTR-2) and pENTR-L3-cDNA2-L2 (pENTR-3) and a Cm R -ccdB cassette A two-cDNA tandem expression vector was prepared by LR recombination with pDEST (-R1R2) having one promoter in the adjacent region. Four pairs of attL-attR signals are specifically recombined with each other. (B) The B3-cDNA2-B2 and the Cm R -ccdB cassette were exchanged by BP recombination between the two species-cDNA tandem expression vector and pDONR-P3P2, and one cDNA, one pA-P cassette and Cm R − Modular pDEST-R3R2 carrying one ccdB cassette in tandem configuration was made. (C) A three-cDNA tandem expression vector was prepared from the modular pDEST-R3R2 by LR recombination with a two-cDNA tandem pENTR (-L3L2). (D) B5-cDNA3-B2 and Cm R -ccdB cassette were exchanged from 3 kinds of cDNA-tandem expression vectors by BP recombination with pDONR-P5P2, and 2 cDNAs, 2 pA-P cassettes and Cm R A modular pDEST-R5R2 carrying one ccdB cassette in tandem configuration was made. (E) A four-cDNA tandem expression vector was prepared from the modular pDEST-R5R2 by LR recombination with a two-cDNA tandem pENTR (-L5L2). The efficiency of each step in the recombination reaction is summarized in Table 3 below.
モジュラーデスティネーションベクターを使用する、３種及び４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築効率を、宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数として記載した（「コロニー」として表示した列）。Ａ〜Ｄのアルファベットは、図２に示した組換えの各段階を表す。形質転換の条件及び構築物のチェックは、モジュラーデスティネーションベクターを含有する陽性エントリーベクターの取得のためにＤＢ３．１コンピテント細胞（１ｘ１０８ｃ．ｆ．ｕ．／μｇ ｐＵＣ１９）を使用した以外は、ほぼ表１の場合と同一である。（Ａ）２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築のための、表１Ｃ、Ｆと同様の３種断片の組換え。（Ｂ）ＢＰ組換えによる、２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターのモジュラーデスティネーションベクターへの変換。（Ｃ）モジュラーデスティネーションベクター及び２種−ｃＤＮＡタンデムエントリーベクターを使用する、ＬＲ組換えによる３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築。（Ｄ）ＢＰ組換えによる３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターのモジュラーデスティネーションベクターへの変換。（Ｅ）モジュラーデスティネーションベクター及び２種−ｃＤＮＡタンデムエントリーベクターを使用する、ＬＲ組換えによる４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築。 The construction efficiency of 3 and 4 cDNA tandem expression vectors using a modular destination vector was described as the number of colonies formed after transformation into host bacteria (columns labeled as “colony”). The alphabets A to D represent the respective steps of recombination shown in FIG. Transformation conditions and construction checks were performed except that DB3.1 competent cells (1 × 10 8 cfu / μg pUC19) were used to obtain positive entry vectors containing modular destination vectors. This is almost the same as in Table 1. (A) Recombination of 3 types of fragments similar to Tables 1C and F for construction of 2 types-cDNA tandem expression vectors. (B) Conversion of a two-cDNA tandem expression vector into a modular destination vector by BP recombination. (C) Construction of a three-cDNA tandem expression vector by LR recombination using a modular destination vector and a two-cDNA tandem entry vector. (D) Conversion of the three-cDNA tandem expression vector into a modular destination vector by BP recombination. (E) Construction of a four-cDNA tandem expression vector by LR recombination using a modular destination vector and a two-cDNA tandem entry vector.
（Ｂ，Ｄ）偽性陽性ベクターを減少させるため、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＬＢ−アガープレート上での第１スクリーニングの後、取得したコロニーを２種類のＬＢ−アガープレート（第１はアンピシリン及びクロラムフェニコールを含み、第２はカナマイシンを含む）に接種することによる、第２スクリーニングを実施した。両プレートでコロニーを形成したベクターは偽性陽性ベクターであるので、これらを除外した。第１スクリーニングで形成したコロニーの数を「コロニー（１ｓｔ）」と表示した列に示す。第２スクリーニング後のコロニーの数を「コロニー（２ｎｄ）」と表示した列に示す。 (B, D) In order to reduce false positive vectors, after the first screening on LB-Agar plates containing ampicillin and chloramphenicol, the obtained colonies were separated into two LB-Agar plates (first A second screen was performed by inoculating ampicillin and chloramphenicol, the second containing kanamycin. The vectors that formed colonies on both plates were false positive vectors and were excluded. The number of colonies formed in the first screening is shown in the column labeled “Colony (1st)”. The number of colonies after the second screening is shown in the column labeled “Colony (2nd)”.
（２）２種及び３種融合型ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図３）
（Ａ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２（図２Ｂ中と同様のもの）から、タンデム配置で融合したｃＤＮＡｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、単一ｃＤＮＡ、１種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｂ）前記１種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ１−ｃＤＮＡ１−Ｂ６とｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ６のＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、ＣｍＲ−ｃｃｄＢカセット１個、ｐＡ−Ｐカセット１個、及び融合型ｃＤＮＡ１個を別のｃＤＮＡとタンデム配置して保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６を作製した。（Ｃ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６から、ｐＥＮＴＲ（−Ｌ１Ｌ６）の１種融合型ｃＤＮＡカセットとのＬＲ組換えにより、融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクター（タンデム配置の２個の融合型ｃＤＮＡカセットを含む）を作製した。（Ｄ）前記融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ４ｒ−ｃＤＮＡ３−Ｂ２とｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ２のＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、融合型ｃＤＮＡ１セット、単一のｃＤＮＡ１個及びＣｍＲ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有する、モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｌ４Ｒ２を作製した。（Ｅ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｌ４Ｒ２から、融合型ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｒ４Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、融合型ｃＤＮＡ及び単一ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｆ）前記融合型ｃＤＮＡ及び単一ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ５−ｃＤＮＡ２−Ｂ４とｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ４のＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、融合型ｃＤＮＡｓ及びＣｍＲ−ｃｃｄＢカセットをタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４を作製した。（Ｇ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４から、２種融合型ｃＤＮＡ−タンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ４）とのＬＲ組換えにより、３種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。
(2) Construction of two- and three-fusion cDNA-tandem expression vectors (FIG. 3)
(A) A single cDNA, single fusion cDNA tandem expression vector was prepared from the modular pDEST-R5R2 (same as in FIG. 2B) by LR recombination with cDNA pENTR (-L5L2) fused in tandem configuration. . (B) By exchanging B1-cDNA1-B6 with the Cm R -ccdB cassette of pDONR-P1P6 from the single fusion cDNA tandem expression vector by BP recombination, one Cm R -ccdB cassette, pA-P A modular pDEST-R1R6 carrying one cassette and one fusion cDNA in tandem with another cDNA was prepared. (C) From the modular pDEST-R1R6, a fusion cDNA tandem expression vector (including two fusion cDNA cassettes in tandem arrangement) is prepared by LR recombination with a single fusion cDNA cassette of pENTR (-L1L6) did. (D) From the fused cDNA tandem expression vector, B4r-cDNA3-B2 and pDONR-P4rP2 Cm R -ccdB cassette are exchanged by BP recombination, and one set of fused cDNA, one single cDNA and Cm R -Modular pDEST-L4R2 was made, holding one ccdB cassette in tandem configuration. (E) A fused cDNA and a single cDNA tandem expression vector were prepared from the modular pDEST-L4R2 by LR recombination with the fused cDNA tandem pENTR (-R4L2). (F) B5-cDNA2-B4 and the Cm R -ccdB cassette of pDONR-P5P4 are exchanged from the fused cDNA and the single cDNA tandem expression vector by BP recombination, and fused cDNAs and Cm R -ccdB cassette A modular pDEST-R5R4 was prepared in a tandem configuration. (G) From the modular pDEST-R5R4, a triple fusion cDNA tandem expression vector was prepared by LR recombination with a two fusion cDNA-tandem pENTR (-L5L4).
細菌宿主及び形質転換
ｃｃｄＢ遺伝子（Bernard, P., Kezdy, K.E., Van Melderen, L., et al. (1993) J Mol Biol, 234, 534-541）を含有するドナーベクター及びデスティネーションベクターの構築のため、Ｌｉｂｒａｒｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＢ３．１（商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ｃｃｄＢ遺伝子を含まないその他のベクターの構築のためには、Ｍａｘ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０Ｂ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。二重形質転換されたコロニー（エントリー及び発現ベクターの両方、又はドナー及びデスティネーションベクターの両方を含むもの）、あるいは複成分中間体産物（２対のａｔｔ部位のうち１方だけでの組換えの結果である、エントリーベクターとデスティネーションベクター、又は発現ベクターとドナーベクターの融合構築物）を減少させるため、取得したコロニーを以下の２種類のＬＢアガープレートに接種することによる二次スクリーニングを実施した：第１は形成させたものと同一の抗生物質（アンピシリン又はカナマイシン）を含むもの；第２は第１のものとは別の抗生物質を含むものである。両プレートでコロニーを形成したベクターは二重形質転換物又は中間体産物を含む偽性ベクターであり、したがってこれを除外した。５コロニー以上を集めて、適切な抗生物質を含むＬＢ培地２ｍｌ中で培養した。Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、各ベクターのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化とその後のアガロースゲル電気泳動によって、サイズ及び消化パターンを確認した。適正なサイズ及びパターンを持つベクターを真性陽性ベクターとして保存し、その後の実験で使用した。
Construction of donor and destination vectors containing bacterial host and transformed ccdB gene (Bernard, P., Kezdy, KE, Van Melderen, L., et al. (1993) J Mol Biol, 234, 534-541) For this purpose, Library Efficiency DB3.1 ™ Competent Cells (Invitrogen) was used. Max Efficiency DH10B ™ (Invitrogen) was used for the construction of other vectors not containing the ccdB gene. Double transformed colonies (including both entry and expression vectors, or both donor and destination vectors) or multi-component intermediate products (recombination in only one of the two pairs of att sites) In order to reduce the resulting entry vector and destination vector or expression vector and donor vector fusion construct), a secondary screening was performed by inoculating the obtained colonies on the following two types of LB agar plates: The first contains the same antibiotic (ampicillin or kanamycin) as formed; the second contains another antibiotic different from the first. Vectors that formed colonies on both plates were pseudo-vectors containing double transformants or intermediate products and were therefore excluded. Five or more colonies were collected and cultured in 2 ml of LB medium containing appropriate antibiotics. Quantum Prep Mini Kit (Bio-Rad Laboratories) was used to isolate the plasmid DNA of each vector, and the size and digestion pattern were confirmed by restriction enzyme digestion followed by agarose gel electrophoresis. Vectors with the correct size and pattern were stored as true positive vectors and used in subsequent experiments.
哺乳動物細胞へのトランスフェクション及び発現アッセイ
構築後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、複数ｃＤＮＡのタンデム発現ベクターをＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションは供給元の指示にしたがって実施した。ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍガラスボトム培養皿（Ａｓａｈｉ Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ）で培養した。継代１日後、培地を「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｌ Ｒｅｄ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。これは血清を含まないものである。次に、精製発現ベクター５００ｎｇ及びＰＬＵＳ Ｒｅｇｅｎｔ６μｌを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌに溶解し、室温で１５分インキュベートした。次に、これらを、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＥＭ １００μｌに溶解したＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ４μｌと混合し、さらに１５分インキュベートした。混合物を、低血清培地中のＨｅＬａ細胞を含む３５ｍｍ培養皿に添加した。次に細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で培養し、その後培地を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。一晩培養後、培地を再び血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭに変更し、ＣＦＰ／ＹＦＰ／Ｃｙ５（８６００８ｖ１；Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＢＦＰ／ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ（８６００９；Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）用のフィルターセットと冷却ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ；Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を装備した、フィルターホイール制御システム（ＭＡＣ５０００；Ｌｕｄｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）付きの蛍光顕微鏡（ＤＩＡＰＨＯＴＯ３００；Ｎｉｃｏｎ）で、細胞を観察した。結果を図４に示す。
After transfection into mammalian cells and expression assay construction, multiple cDNA tandem expression vectors were transfected into HeLa cells by using LipofectAMINE (Invitrogen) and PLUS Reagents (Invitrogen). Transfection was performed according to the supplier's instructions. HeLa cells were cultured in a 35 mm glass bottom culture dish (Asahi Technology). One day after the passage, the medium was changed to “Opti-MEM I Reduced-Serum Medium without Phenol Red” (Invitrogen). This is serum free. Next, 500 ng of purified expression vector and 6 μl of PLUS Reagent were dissolved in 100 μl of Opti-MEM and incubated at room temperature for 15 minutes. Next, these were mixed with 4 μl of LipofectAMINE previously dissolved in 100 μl of Opti-MEM and further incubated for 15 minutes. The mixture was added to a 35 mm culture dish containing HeLa cells in low serum medium. The cells were then cultured in 5% CO 2 at 37 ° C., after which the medium was changed to D-MEM (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (Invitrogen). After overnight culture, the medium was changed again to serum-free Opti-MEM, a filter set for CFP / YFP / Cy5 (86008v1; Chroma Technology) and BFP / GFP / DsRed (86009; Chroma Technology) and a cooled CCD camera The cells were observed with a fluorescence microscope (DIAPHOTO300; Nicon) equipped with a filter wheel control system (MAC5000; Ludl Electronic Products) equipped with (ORCA-ER; Hamamatsu Photonics). The results are shown in FIG.
図４Ａは、ｐＣＸＮ−ＥＧＦＰ及びｐＣＸＮ−ｍＲＦＰ１の同時トランスフェクションによる、ＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。２種の蛍光タンパク質の発現プロフィールは細胞間で異なっている。下部の白線は１００μｍを示す。図４Ｂは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ３−ＥＧＦＰ−＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。２種の蛍光タンパク質の発現プロフィールは、図４Ａに示した同時トランスフェクションに比較して、かなり均一である。下部の白線は１００μｍを示す。図４Ｃは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ４−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｄは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ４−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ３−Ｖｅｎｕｓ−＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＶｅｎｕｓの混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１、Ｖｅｎｕｓの画像、並びにＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＶｅｎｕｓの合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｅは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ３−ｃｐβ２−Ｂ６−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｃｐα１−＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中での２種の融合タンパク質、ＣＰβ２−ＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１−ＣＰα１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｅは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ３−ｃｐβ２−Ｂ６−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ２−ｃｐα１−＊Ｂ４−ｐＡ−ＰＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｂＡｃｔ−＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中での３種の融合タンパク質、ＣＰβ２−ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１−ＣＰα１及びＳＥＣＦＰ−β−アクチンの混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１、ＳＥＣＦＰの画像並びにＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＳＥＣＦＰの合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。 FIG. 4A shows mixed expression of EGFP and mRFP1 in HeLa cells by co-transfection of pCXN-EGFP and pCXN-mRFP1. The panel shows, from the left, an image of EGFP and mRFP1 and a combined image of EGFP and mRFP1. The expression profiles of the two fluorescent proteins differ between cells. The white line at the bottom indicates 100 μm. FIG. 4B shows mixed expression of EGFP and mRFP1 in HeLa cells transfected with pEF5 / FRT / V5-B1-mRFP1-B4-pA-P EF1α- B3-EGFP- * B2. The panel shows, from the left, an image of EGFP and mRFP1 and a combined image of EGFP and mRFP1. The expression profiles of the two fluorescent proteins are fairly uniform compared to the cotransfection shown in FIG. 4A. The white line at the bottom indicates 100 μm. FIG. 4C shows EGFP, SECFP in HeLa cells transfected with pEF5 / FRT / V5-B1-EGFP-B4-pA-P EF1α- B3-SECFP-B6-pA-P EF1α -B5-mRFFP1- * B2. And hybrid expression of mRFP1. The panel shows, from the left, images of EGFP, SECFP, and mRFP1, and a combined image of EGFP, SECFP, and mRFP1. The white line at the bottom indicates 25 μm. FIG. 4D shows pEF5 / FRT / V5-B1-EGFP-B4-pA-P EF1α- B3-SECFP-B6-pA-P EF1α -B5-mRFP1-B4-pA-P EF1α -B3-Venus- * B2 Shown is the hybrid expression of EGFP, SECFP, mRFP1 and Venus in transfected HeLa cells. From the left, the panel shows images of EGFP, SECFP, mRFP1, and Venus, and merged images of EGFP, SECFP, mRFP1, and Venus. The white line at the bottom indicates 25 μm. Figure 4E, pEF5 / FRT / V5-B1 -EGFP-B3-cpβ2-B6-pA-P EF1α -B5-mRFP1-B4-cpα1- * B2 in two fusion proteins in HeLa cells transfected with, 2 shows hybrid expression of CPβ2-EGFP and mRFP1-CPα1. The panel shows, from the left, an image of EGFP and mRFP1 and a combined image of EGFP and mRFP1. The white line at the bottom indicates 25 μm. FIG. 4E shows pEF5 / FRT / V5-B1-EGFP-B3-cpβ2-B6-pA-P EF1α -B5-mRFP1-B2-cpα1- * B4-pA-P EF1α- B3-SECFP-B6-bAct- * Shown is the hybrid expression of three fusion proteins, CPβ2-EGFP, mRFP1-CPα1 and SECFP-β-actin in HeLa cells transfected with B2. The panel shows, from the left, images of EGFP, mRFP1, and SECFP and a combined image of EGFP, mRFP1, and SECFP. The white line at the bottom indicates 25 μm.
１個の生細胞中での複数の異種ｃＤＮＡの発現と、生理学的タンパク質レベルを獲得するためのその発現の最適化の必要性は、プロテオミクス研究において重要性が増して来ている。蛍光タグを持つ融合タンパク質の発現は、機能性ゲノミクスにとって重要性が高まった研究手段となっている。本明細書に記載する方法を使用して、所望のどんなプロモーターの制御下でも、細胞中で複数の遺伝子又は遺伝子融合物の発現を導くように、モジュール方式で、遺伝子エレメントを組み立てることができる。これによって、ウイルス、組織特異的又は調節性プロモーターを介した制御可能な細胞遺伝子発現が可能になり、また細胞内所在地の決定、タンパク質複合体の形成の判定、またさらには単一分子の可視化のための蛍光タグの使用が促進される。 The need for the expression of multiple heterologous cDNAs in a single living cell and the optimization of that expression to obtain physiological protein levels has become increasingly important in proteomics studies. The expression of fusion proteins with fluorescent tags has become a research tool of increasing importance for functional genomics. Using the methods described herein, genetic elements can be assembled in a modular fashion to direct the expression of multiple genes or gene fusions in a cell under the control of any desired promoter. This allows for controllable cellular gene expression via viral, tissue-specific or regulatable promoters, and determination of subcellular location, determination of protein complex formation, or even single molecule visualization. The use of fluorescent tags for this purpose.
なお、本発明は、経済産業省・ＮＥＤＯプロジェクトの（平成１４〜１８年度）に参画して行われた。 The present invention was carried out by participating in the Ministry of Economy, Trade and Industry / NEDO Project (2002-2006).
配列番号１〜３２：合成オリゴヌクレオチド Sequence number 1-32: Synthetic oligonucleotide
Claims (7)
（ａ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換し、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換し、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する工程、
を含む前記方法。 A method for constructing a vector comprising at least three desired nucleic acid fragments, comprising the following steps (a) and (b):
(A) an expression vector comprising two or more nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites;
A donor vector comprising a cassette flanked by at least two recombination sites;
By incubating with the site-specific recombinant protein,
Exchanging at least one nucleic acid fragment adjacent to at least two recombination sites contained in the expression vector with a cassette adjacent to at least two recombination sites contained in the donor vector, wherein at least one nucleic acid fragment and at least one nucleic acid fragment are exchanged; Constructing a modular destination vector comprising a cassette;
(B) the modular destination vector obtained in (a);
An entry vector comprising at least two nucleic acid fragments flanked by at least two recombination sites;
By incubating with the site-specific recombinant protein,
Exchanging the cassette contained in the modular destination vector with at least two nucleic acid fragments adjacent to at least two recombination sites contained in the entry vector to construct a vector comprising at least three desired nucleic acid fragments;
Including said method.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115433736A (en) * | 2021-04-29 | 2022-12-06 | 谢文军 | Gateway prokaryotic vector system for high-efficiency expression and purification of small tag active fusion proteins |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002500861A (en) * | 1997-10-24 | 2002-01-15 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | Recombination cloning using nucleic acids with recombination sites |
| JP2003510019A (en) * | 1999-07-14 | 2003-03-18 | クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | Method for producing expression vector using recombinase, and composition used for carrying out this method |
| JP2003512075A (en) * | 1999-10-25 | 2003-04-02 | インビトロジェン コーポレイション | Methods of manipulating and sequencing nucleic acid molecules using transposition and recombination |
| JP2004121248A (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-22 | South China Agricultural Univ | Method for preparation and application of multi-gene recombinant vector construct |
| JP2004531259A (en) * | 2001-04-19 | 2004-10-14 | インヴィトロジェン コーポレーション | Compositions and methods for recombinant cloning of nucleic acid molecules |
-
2004
- 2004-11-22 JP JP2004337985A patent/JP2006141320A/en active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002500861A (en) * | 1997-10-24 | 2002-01-15 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | Recombination cloning using nucleic acids with recombination sites |
| JP2003510019A (en) * | 1999-07-14 | 2003-03-18 | クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | Method for producing expression vector using recombinase, and composition used for carrying out this method |
| JP2003512075A (en) * | 1999-10-25 | 2003-04-02 | インビトロジェン コーポレイション | Methods of manipulating and sequencing nucleic acid molecules using transposition and recombination |
| JP2004531259A (en) * | 2001-04-19 | 2004-10-14 | インヴィトロジェン コーポレーション | Compositions and methods for recombinant cloning of nucleic acid molecules |
| JP2004121248A (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-22 | South China Agricultural Univ | Method for preparation and application of multi-gene recombinant vector construct |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JPN6010035437, Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， Ｆｅｂ．２００４， Ｖｏｌ．１０７， ｐ．２３３−２４３ * |
| JPN6010035440, Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ２０００， Ｖｏｌ．１０， ｐ．１７８８−１７９５ * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115433736A (en) * | 2021-04-29 | 2022-12-06 | 谢文军 | Gateway prokaryotic vector system for high-efficiency expression and purification of small tag active fusion proteins |
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