JP2006141320A

JP2006141320A - 複数の核酸断片をクローニングする方法

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Publication number: JP2006141320A
Application number: JP2004337985A
Authority: JP
Inventors: Fumio Imamoto; 文男今本; Takeshi Sone; 岳史曽根
Original assignee: Invitrogen Japan KK
Current assignee: Invitrogen Japan KK
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2004-11-22
Publication date: 2006-06-08

Abstract

【課題】複数種の核酸断片を担持するベクターを効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含み２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターと、部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることで、エントリーベクターに含まれる２つの組換え部位に隣接した核酸断片の１つと、ドナーベクターに含まれる２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換し、１つの核酸断片と１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する。モジュラーデスティネーションベクターと２つの組換え部位に隣接した２つの核酸断片エントリーベクターと部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートし、モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットとエントリーベクターに含まれる２つの組換え部位に隣接した２つの核酸断片とを交換し、３つの核酸断片を含むベクターを構築する。
【選択図】図２

Description

本発明は、複数種、特に３種以上の核酸断片を含むベクターを構築する方法に関する。

細胞内の多くのタンパク質は複合体を形成しており、中でも２量体は最も多い。ヒト細胞では、その２／３はヘテロ２量体であり、異なるサブユニット因子の相互作用で形成されている。従って、機能性タンパク質複合体の形成、一時的タンパク質−タンパク質相互作用、及び機能性タンパク質の細胞内所在地決定などに関する研究分野においては、複数遺伝子の同時導入と発現を共役的に行うことが必要とされる。それと共に、過剰発現によるプロテオーム機能の損傷がないように配慮する必要もある。

従来の細胞への遺伝子導入法では、例えば２種類の遺伝子は、それぞれを担持する２種類の組換えプラスミドの共導入によって行なわれていた。この場合には、それぞれの組換えプラスミドの細胞への導入効率は同一でなく、いずれか一種類が優位に導入されることが多く、２種類の組換えプラスミドが共に同数で導入されることはむしろ稀であった。この事情は、３種類遺伝子の同時導入になるともっと深刻であった。

一方、形質転換法には、トランジェント形質転換法とステーブル形質転換法がある。トランジェント形質転換法は比較的容易であり、多量のタンパク質産生の目的には適するが、細胞機能を損なう場合が多かった。一方ステーブル形質転換法ではタンパク質を細胞機能を損なわずに発現させることが可能であると考えられるが、従来のトランスフェクション条件では染色体へ限定数の遺伝子を導入することは容易でなかった。その理由は、不特定多数のｃＤＮＡが染色体の活性や不活性領域にランダムに挿入され、その８５％以上がヘテロクロマチン領域に入って発現しないためであると報告されている。

これを解決するために、複数の遺伝子単位を含み、かつステーブル形質転換可能な発現ベクターを構築することが有用と考えられる。この目的のためには、１個のベクター上に複数種のｃＤＮＡを担持する発現ベクターを迅速かつ簡便に構築することが必要とされる。各ｃＤＮＡの混成発現の制御は、各ｃＤＮＡに適切なプロモーターを連結することによって、所望のレベルで達成することができると考えられる。

目的の核酸断片を含む発現ベクターを構築する手法として、単離された核酸断片の両端に制限酵素が作用する塩基配列を接続し、ベクターにもその部位を作ってから制限酵素とリガーゼを用いて挿入する手法が従来用いられてきた。しかし、このような手法は非常に時間がかかるため、この手法によって複数種の核酸断片を発現ベクターに挿入するのは至難であった。しかし、複数種の核酸断片を含む発現ベクターを構築する手法として、ｉｎｖｉｔｒｏ部位特異的組換え技法であるＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法が報告された。この方法を用い、一定の順番及び配向性で核酸断片群を構築して受容ベクターに連結することにより、複数種の核酸断片を含有する発現ベクターを製造することができる（非特許文献１）。従来のＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法では、２種類のシグナル配列、ａｔｔ１及びａｔｔ２が利用されてきた（非特許文献２）。また近年、３種の核酸断片を同時クローニングにより発現ベクターに導入するためのものとして、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）シグナルであるａｔｔ３及びａｔｔ４が、ＭｕｌｔｉＳｉｔｅＧａｔｅｗａｙ（商標）Ｔｈｒｅｅ−ＦｒａｇｍｅｎｔＶｅｃｔｏｒＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＫｉｔとして入手できるようになった。これらのシステムで使用する標準的デスティネーションベクターは、２個のａｔｔＲシグナルに隣接させたクロラムフェニコール耐性（Ｃｍ^Ｒ）遺伝子及び毒性遺伝子（ｃｃｄＢ）（非特許文献３）のカセットを含有するものである。しかし、このデスティネーションベクターを使用して３種を超える遺伝子を同時クローニングすることについては報告されていない。

Sasaki, Y., Sone, T., Yoshida, S., et al. (2004) J. Biotechnol., 107, 233-243 Hartley, J.L., Temple, G.F. & Brasch, M.A. (2000) Genome Res., 10, 1788-1795 Bernard, P., Kezdy, K.E., Van Melderen, L., et al. (1993) J. Mol. Biol., 234, 534-541

本発明者らは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＤＮＡクローニングシステムにおいて、組換える核酸断片の数を増やして同時クローニングを行うと、組換え効率が著しく低下し、１個の融合構造物中に複数種の核酸断片を担持するベクターを構築するのは、上記システムをもってしても非常に困難であることを見いだした。従って、本発明の課題は、複数種の所望の核酸断片を担持するベクターを効率的に製造する方法を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、少なくとも２つの核酸断片を含む発現ベクターにおいて、特異的組換え部位を用いることにより、少なくとも１つの核酸断片をカセットと交換し、さらに、該カセットを少なくとも２つの所望の核酸断片と組換えることにより、組換え効率を低下させることなく、３つ以上の核酸断片を含むベクターを構築できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換し、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換し、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する工程、
を含む前記方法。

（２）発現ベクター又はエントリーベクターに含まれる核酸断片がｃＤＮＡを含む、（１）記載の方法。
（３）ドナーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、（１）又は（２）記載の方法。

（４）発現ベクター又はエントリーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）組換え部位が、ｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲからなる群より選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）組換えタンパク質がインテグラーゼである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを含む、該キット。

本発明により、複数種の核酸断片を含むベクターを効率的に構築することができる。

本発明は、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する方法に関する。本発明において、核酸にはＤＮＡ及びＲＮＡが含まれ、核酸断片には、ＤＮＡ断片及びＲＮＡ断片が包含され、好ましくはＤＮＡ断片である。本発明においてベクターに挿入する核酸断片は、ＰＣＲ産物、大きなＤＮＡセグメント、ゲノムクローン又はフラグメント、ｃＤＮＡクローン又はフラグメント、機能性エレメントなど、及び有用な核酸又はタンパク質をコードする遺伝子又は部分的遺伝子を含むが、それらに限定されない。好ましくは、少なくとも１つのｃＤＮＡを含む核酸断片であり、場合により２つ以上ｃＤＮＡを含む核酸断片である。

本発明においてベクターは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、組換えＤＮＡ技術において、外来性核酸を組み込み、宿主細胞中で増えることのできる核酸分子、好ましくはＤＮＡをさす。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。直鎖状のものも環状のものも包含される。また、本発明においては、上記ベクターに所望の核酸断片等を挿入して得られた核酸分子もまた、ベクターに包含される。

本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターを用いる。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片とは、発現ベクターにおいて、核酸断片の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。少なくとも２つの組換え部位の間に存在する核酸断片は、特に制限されず、所望の核酸断片、通常、所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡである。核酸断片がｃＤＮＡを２種以上含んでいてもよく、さらにその他の配列を含んでいてもよい。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むとは、核酸断片とその少なくとも両端に存在する組換え部位とを含む領域が、発現ベクターに２つ以上存在することを意味する。発現ベクターは、さらなる核酸断片及び組換え部位を含んでいてもよい。発現ベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらない。

発現ベクターは、通常、選択マーカーを含む。さらに、好ましくは、核酸断片とその両端の組換え部位を含む各領域の上流にプロモーターをそれぞれ含む。また、発現ベクターは好ましくは、核酸断片同士の間に、転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造、好ましくはｐＡ−Ｐカセットを含む。

最大３つまでの所望の核酸断片を含む発現ベクターは、当技術分野で公知の方法を用いて調製できる。例えば、目的の核酸断片に２つ以上の組換え部位を付加してクローン化し、該クローンを用いてＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング法を実施することにより、１回の組換え反応によって最大３つまでの核酸断片を含む発現ベクターを作製することができる（ＷＯ９９／２１９７７、非特許文献１）。一実施形態として、３つの標的核酸断片（ｃＤＮＡ１及びｃＤＮＡ２及び転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造）を含む発現ベクターの調製方法の概要を図１Ｃに示す。目的の核酸断片に２つ以上の組換え部位を付加する技術としては、例えば、核酸分子の変異誘発（例えば、ランダム又は部位特異的変異誘発）、組換え技術（例えば、アダプターの連結又は核酸分子の組換え部位を含む直鎖分子への連結）、増幅（例えば、組換え部位又はその部分を含むプライマーを使用する）、遺伝子転移（例えば、組換え部位を含むトランスポゾンを使用する）、組換え（例えば、組換え部位を含む１つ以上の相同な配列を使用する）、核酸合成（例えば、組換え部位を含む分子の化学的合成又は種々のポリメラーゼ若しくは逆転写酵素を使用する酵素学的合成）が挙げられる。目的の核酸断片は、任意の供給源から由来する任意の核酸断片であり、非天然の核酸を含む。

本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを用いる。ドナーベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらないものである。カセットは、選択マーカーを少なくとも１つ含む核酸断片を意味し、好ましくは少なくとも２つの別種の選択マーカーを含む。本発明において、カセットは、選択マーカーとして、好ましくは、薬剤耐性遺伝子配列（好ましくは、クロラムフェニコール耐性遺伝子配列）及び毒性遺伝子配列（好ましくは、ｃｃｄＢ）を含む。ドナーベクターは、通常、カセット以外の領域にさらなる選択マーカーを含み、該選択マーカーは、好ましくはカセットに含まれる選択マーカーとは別種のものである。ドナーベクターは、さらに複製起点を含んでいてもよい。

本発明の方法では、少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むエントリーベクターを用いる。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片とは、エントリーベクターにおいて、核酸断片の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。少なくとも２つの組換え部位の間に存在する核酸断片は、特に制限されず、所望の核酸断片、通常、所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡである。核酸断片がｃＤＮＡを２種以上含んでいてもよく、さらにその他の配列を含んでいてもよい。少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含むとは、核酸断片とその少なくとも両端に存在する組換え部位とを含む領域が、エントリーベクターに２つ以上存在することを意味する。エントリーベクターは、さらなる核酸断片及び組換え部位を含んでいてもよい。エントリーベクターに含まれる組換え部位は、通常、実質的に互いに組換わらない。

エントリーベクターは、通常、選択マーカーを含む。さらに、好ましくは、核酸断片とその両端の組換え部位を含む各領域の上流にプロモーターをそれぞれ含む。また、エントリーベクターは好ましくは、核酸断片同士の間に、転写終結シグナルとして働くポリアデニン付加配列と転写開始シグナルとして働くプロモーター配列を一続きの核酸断片として連結したカセット構造、好ましくはｐＡ−Ｐカセットを含む。

図１Ｃの後半部分に、少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含む発現ベクターと少なくとも２つの組換え部位をもつドナーベクターの組換え反応を行うことにより、発現ベクターの骨格をドナーベクターと交換し、少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターを作製する行程を示す。

発現ベクター、エントリーベクター及びドナーベクターを構築するために使用しうるベクターは、特に限定されず、原核生物ベクター又は真核生物ベクターのいずれも使用できる。また、発現ベクター、融合ベクター、ツーハイブリッド又は逆ツーハイブリッドベクター、シャトルベクターなども使用でき、当業者であれば目的に応じて適宜選択できる。

真核生物ベクターには、酵母細胞、植物細胞、魚細胞、真核生物細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞中で増殖又は複製するベクターが含まれ、原核生物ベクターには、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属又はＰｓｅｕｄｅｍｏｎａｓ属等の細菌中で増殖又は複製するベクターが含まれる。

真核生物ベクターの具体例としては、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ＹＡＣｎｅｏ、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣ１ｎｅｏ、及びｐＯＧ４４、ｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、並びにｐＥＢＶＨｉｓ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。

原核生物ベクターの具体例としては、ｐｃＤＮＡＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＲＳＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＧＥＭＥＸ−２、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ３８８−１、並びにｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。

２−ハイブリッド及び逆２−ハイブリッドベクターの具体例としては、ｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ及びにｐＹＥＳＴｒｐ又はその誘導体若しくは改変体が挙げられる。

本発明においては、工程（ａ）において、上記発現ベクターと、ドナーベクターと、部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換する。この交換反応により、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する。さらに工程（ｂ）において、（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、エントリーベクターと、部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換する。この交換反応により、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する。

ここで、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とは、少なくとも２つの所望の核酸断片が存在する領域の少なくとも両端に組換え部位が存在することを意味する。そしてこの両端の組換え部位で組換えが起こることにより、２つの所望の核酸断片を含む領域がデスティネーションベクターに挿入される。本発明において、モジュラーデスティネーションベクターは、ドナーベクターに含まれるカセット及び最初の発現ベクターに含まれた核酸断片の少なくとも１つを含むベクターを指す。

本発明において、核酸断片とカセット、及びカセットと核酸断片の間の交換は、部位特異的組換えタンパク質（リコンビナーゼ並びに会合するコファクター及びタンパク質を含む）の使用によって達成される。種々の組換えタンパク質が当該分野において記載されている。このようなリコンビナーゼの例として、Ｃｒｅ及びインテグラーゼが挙げられる。本発明においては、インテグラーゼを用いるのが好ましい。

Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１由来のタンパク質（Abremski及びHoess、J.Biol.Chem.259(3):1509-1514(1984)）であり、ｌｏｘＰ（交叉の遺伝子座）部位と呼ばれる３４ｂｐＤＮＡ配列間の交換を触媒する（Hoessら、Nucl.Acids Res.14(5):2287(1986）)。Ｃｒｅは市販されている（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログＮｏ．６９２４７−１）。Ｃｒｅによって媒介される組換えは、可逆的である。Ｃｒｅは、当該分野において周知のように、補因子としてマグネシウム又はスペルミジンのいずれかを含む単純な緩衝液中で働く。交換される核酸は、直鎖状又は超らせん状のいずれでもよい。多くの変異体ｌｏｘＰ部位が記載されている（Hoessら、前掲）。これらの１つｌｏｘＰ５１１は、別のｌｏｘＰ５１１部位と組換えるが、ｌｏｘＰ部位とは組換えない。

インテグラーゼは、λゲノムのＥ．ｃｏｌｉ染色体への組込みを媒介する、バクテリオファージλ由来のタンパク質である。バクテリオファージλＩｎｔ組換えタンパク質は、ａｔｔ部位間の組換えを促進する。組換え反応は、組込み組換え及び切り出し組換えのための２つの独立した経路から生じる。４つのタンパク質（Ｉｎｔ、Ｘｉｓ、ＩＨＦ及びＦＩＳ）が関与する協同的及び競合的相互作用が組換えの方向を決定する。

組込み組換えには、Ｉｎｔ及びＩＨＦタンパク質、並びに部位ａｔｔＰ（２４０ｂｐ）及びａｔｔＢ（２５ｂｐ）が関与する。組換えは、２つの新たな部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲの形成を生じる。切り出し組換えは、ａｔｔＰ及びａｔｔＢを生成するために、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、及びＸｉｓ、並びに部位ａｔｔＬ及びａｔｔＲを必要とする。特定の条件下で、ＦＩＳは、切り出し組換えを刺激する。これらの正常な反応に加えて、ａｔｔＰ及びａｔｔＢは、同一分子上に配置される場合、切り出し組換えを促進して２つの切り出し産物（ａｔｔＬを有するものと、ａｔｔＲを有するもの）を生成する。同様に、ａｔｔＬを含む分子とａｔｔＲを含む分子との間での分子間組換えは、Ｉｎｔ、ＩＨＦ及びＸｉｓの存在下で、組込み組換え並びにａｔｔＰ及びａｔｔＢの生成を生じ得る。従って、核酸断片を、操作したａｔｔ部位の適切な組合せと隣接させることによって、適切な組換えタンパク質の存在下で、切り出し組換え又は組込み組換えを互いの逆反応として導き得る。

ａｔｔ部位のそれぞれは、１５ｂｐのコア配列を含む。機能的に重要な個々の配列エレメントは、この共通コアの境界の範囲内に、外側に、及びその境界を横切って存在する（Landy,A.,Ann.Rev.Biochem.58:913(1989)）。

また、インテグラーゼはバクテリオファージλ上のａｔｔＰ部位（約２４０ｂｐ）をＥ．ｃｏｌｉゲノム上のａｔｔＢ部位（約２５ｂｐ）と組換えて（Weisberg,R.A.及びLandy,A.Lambda II、p.211(1983)、Cold Spring Harbor Laboratory）、ａｔｔＬ（約１００ｂｐ）及びａｔｔＲ（約１６０ｂｐ）部位によって隣接された、組み込まれたλゲノムを生成するように作用する。Ｘｉｓの非存在下では、この反応は本質的に不可逆的である。インテグラーゼ及びＩＨＦによって媒介される組込み反応は、インビトロで、スペルミジンを含む単純な緩衝液を用いて実施できる。

本発明において組換え部位は、部位特異的組換えタンパク質が認識して結合する部位を意味する。従って、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための組換え部位であるｌｏｘＰ（Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)の図１）、λインテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列（Landy,Current Opinion in Biotechnology 3:699-707(1993)）が挙げられる。

操作された組換え部位としては以下のものが挙げられる。例えば、ａｔｔ部位は、組換え反応の特異性又は効率及び産物ＤＮＡの性質を増強するために（例えば、ａｔｔ１、ａｔｔ２、及びａｔｔ３部位）、逆反応を減少させるために（例えば、ａｔｔＲからのＰ１及びＨ１の除去）、１又は複数の変異を有するように操作され得る。従って、変異は、部位特異的組換えを増強するために組換え部位に導入され得る。このような変異には、翻訳終止コドンを有しない組換え部位（これは、融合タンパク質がコードされることを可能にする）；同一のタンパク質によって認識されるが塩基配列が異なる組換え部位及び組換え部位のヘアピン形成を防ぐ変異体が含まれるが、これらに限定されない。どの特定の反応が起こるかは、どの特定のパートナーが反応混合物中に存在するかによって特定される。例えば、三部分タンパク質融合体は、組換え部位ａｔｔＲ１及びａｔｔＬ１；並びにａｔｔＢ３；ａｔｔＲ１；ａｔｔＰ３及び１０ｘＰ；並びに／又はａｔｔＲ３及び１０ｘＰ；並びに／又はａｔｔＲ３及びａｔｔＬ２を含む親プラスミドを用いて達成され得る。本発明において組換え部位は、好ましくは、ａｔｔ１、ａｔｔ２、ａｔｔ３、ａｔｔ４、ａｔｔ５及びａｔｔ６から選択される。上記組換え部位については、例えば、ＷＯ９６／４０７２４、ＷＯ９９−２１９７７及び新遺伝子工学ハンドブック（改訂第４版）羊土社に記載されている。

本発明において、選択マーカーは、特定の条件下で、それを含有する分子又は細胞を選択する、あるいはそれを含有しない分子又は細胞を選択することを可能にする、核酸配列である。選択マーカーの例としては以下が挙げられるがそれらに限定されない。（１）毒性ある薬剤（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質）に対する耐性を提供する産物をコードする配列（薬剤耐性遺伝子配列）、（２）レシピエント細胞において別に欠如している産物をコードする配列（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求マーカー）、（３）遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードする配列、（４）容易に同定され得る産物をコードする配列（例えば、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及び細胞表面タンパク質のような表現型マーカー）、（５）レピシエント細胞において毒性である産物をコードする配列（毒性遺伝子配列）などである。

毒性遺伝子の例は当該分野において周知であり、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（例えば、ＤｐｎＩ）、アポトーシス関連遺伝子（例えば、ＡＳＫ１又はｂｃｌ−２／ｃｅｄ−９ファミリーのメンバー）、レトロウイルス遺伝子（ヒト免疫不全ウイルスの毒性遺伝子産物を含む）、抗生物質感受性遺伝子（例えば、ｒｐｓＬ）、抗菌剤感受性遺伝子（例えば、ｐｈｅＳ）、プラスミド殺傷遺伝子、及び抑制機能の非存在下で宿主を傷害する遺伝子（例えば、ｋｉｃＢ又はｃｃｄＢ）を含むがそれらに限定されない。本発明の組換え反応においては、通常、上記のような選択マーカーを利用して、所望の組換え産物の選択、富化又は同定を行う。

本発明の一実施形態を図２を参照することにより以下に説明する。まず、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＢ３及びａｔｔＢ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ２を含むエントリーベクター１（２種ｃＤＮＡタンデムｐＥＸＰＲ）を調製する（図２Ａ及びＢ）。続いて、部位特異的組換えタンパク質の存在下、選択マーカーであるｃｃｄＢとクロラムフェニコール耐性遺伝子配列（Ｃｍ^Ｒ）を含むカセットであって、ａｔｔＰ３とａｔｔＰ２に隣接したカセットを含むドナーベクター（ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２）と、エントリーベクター１とをインキュベートする（図２Ｂ）。これにより、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＲ３とａｔｔＲ２に隣接したカセットを含むモジュラーデスティネーションベクター（モジュラーｐＤＥＳＴ）が得られる（図２Ｃ）。続いて、部位特異的組換えタンパク質の存在下、このモジュラーデスティネーションベクターと、ａｔｔＬ３とａｔｔＢ６に隣室した核酸断片ｃＤＮＡ２及びａｔｔＢ５とａｔｔＬ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ３を含むエントリーベクター２とをインキュベートする（図２Ｃ）。これにより、ａｔｔＢ１及びａｔｔＢ４に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ１と、ａｔｔＢ３とａｔｔＢ６に隣室した核酸断片ｃＤＮＡ２と、ａｔｔＢ５とａｔｔＢ２に隣接した核酸断片ｃＤＮＡ３を含むベクターが得られる（図２Ｄ）。

本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットに関する。該キットは、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを含む。該キットはさらに、組換えタンパク質又はリコンビナーゼ、宿主細胞（例えば、コンピテントセル）を含み得る。

蛍光タンパク質のクローン
標的ｃＤＮＡ産物を標識するか、又は単に発現させるために、別種の励起及び放出波長を持つ、５タイプの蛍光タンパク質を使用した。これらは以下のものである：ＥＧＦＰ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ．；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ５５７６３）（Cormack, B.P., Valdivia, R.H. & Falkow, S. (1996) Gene, 173, 33-38；Zhang, G., Gurtu, V. & Kain, S.R. (1996) 227, 707-711）、Ｖｅｎｕｓ（ＥＹＦＰ−Ｆ４６Ｌ／Ｆ６４Ｌ／Ｍ１５３Ｔ／Ｖ１６３Ａ／Ｓ１７５Ｇ）（Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K. & Miyawaki, A. (2002) Nat Biotechnol, 20, 87-90）、ＳＥＣＦＰ（ＥＣＦＰ−Ｋ２７Ｒ／Ｎ１６５Ｈ）（Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S.S. & Tsien, R.Y. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 98, 14997-15002）、ＤｓＲｅｄ２（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ．）（Matz, M.V., Fradkov, A.F., Labas, Y.A., et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17, 969-973；Terskikh, A.V., Fradkov, A.F., Zaraisky, A.G., Kajava, A.V. & Angres, B. (2002) J. Biol. Chem., 277, 7633-7636）及びｍＲＦＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＡＦ５０６０２７、Campbell, R.E., Tour, O., Palmer, A.E., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 99, 7877-7882）。対応する蛍光タンパク質ＯＲＦを含有する組換えプラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ）、ｐＣＳ２−Ｖｅｎｕｓ、ｐＲＳＥＴＢ−ＳＥＣＦＰ、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ）及びｐＲＳＥＴＢ−ｍＲＦＰ１を、ＰＣＲのための鋳型として使用した。ＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１を含有する哺乳動物発現ベクター（ｐＣＸＮ−ＥＧＦＰ及びｐＣＸＮ−ｍＲＦＰ１）も、トランスフェクションアッセイの対照ベクターとして使用した。

ドナーベクター
ドナーベクターを使用して、その一対のａｔｔＰシグナルに隣接したｃｃｄＢ−Ｃｍ^Ｒカセットと一対のａｔｔＢシグナルに隣接したＤＮＡ断片とをＢＰ反応で交換することによって、ＤＮＡ断片をクローン化した。この実験で使用したドナーベクター（ｐＤＯＮＲ）はｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）から構築した。これはａｔｔＰ１及びａｔｔＰ２を持つが、既報（Sasaki, Y., Sone, T., Yoshida, S., et al. (2004a) J. Biotechnol., 107, 233-243）に記載されているように、変異型ａｔｔＰシグナルを生成するように、ａｔｔＰシグナルを改変している（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、並びにその逆方向相当物、Ｐ３ｒ、Ｐ４ｒ、Ｐ５ｒ、及びＰ６ｒ）。これらは以下のものである：ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ４、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ６、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ３ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ５ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ２、ｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ３ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ５ｒ、ｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ６、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ４、及びｐＤＯＮＲ−Ｐ２ｒＰ４。

デスティネーションベクター
ＥＦ１−αプロモーター１個を持つ通常の発現ベクターの構築のため、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を使用した。このデスティネーションベクター（ｐＤＥＳＴ）は、ａｔｔＲ１−ｃｃｄＢ−Ｃｍ^Ｒ−ａｔｔＲ２カセットを持ち、５’及び３’末端にそれぞれヒトＥＦ−１ａプロモーター及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ヒトＥＦ−１ａプロモーターの１．３ｋｂ断片の切除によって、プロモーターを含まないデスティネーションベクターを構築した。ｐＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴと命名したこのデスティネーションベクターは、第１プロモーターシグナルをｐＥＮＴＲ中にクローン化した断片として添加する場合に使用した。

複数遺伝子発現ベクター（ｐＥＸＰＲ）を構築するために、ｃｃｄＢ−Ｃｍ^Ｒカセットのそれぞれの末端のａｔｔＲ１及びａｔｔＲ２に代えて、任意のａｔｔＲ又はａｔｔＬシグナルの組み合わせを所有するデスティネーションベクターを設計した。この一時的デスティネーションベクターの使用例を図１Ｃに示す。これらのベクターは、両端でａｔｔＢシグナルに隣接しているＥＧＦＰ遺伝子を含有するＰＣＲ産物を、ライゲーションによってｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ部位に挿入した後、ＢＰ反応によって、ＥＧＦＰ遺伝子を対応するａｔｔＰシグナルを持つドナーベクターのｃｃｄＢ−Ｃｍ^Ｒカセットと交換する（Sasakiら、2004a前掲）ことによって、構築した。この実験で使用した一時的デスティネーションベクターは以下のものである：ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ４、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６、ｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ６、及びｐＵＣ−ＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４。

エントリーベクター
蛍光タンパク質−ＯＲＦを含有するエントリーベクター（ｐＥＮＴＲ）を以下のようにして構築した。例えばａｔｔＢｘ−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）−ａｔｔＢｙ（ａｔｔＢｘ又はａｔｔＢｙ：任意のａｔｔＢ配列、ＳＤＫ：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列及びＫｏｚａｋ配列を持つＤＮＡ断片の調製については、ＰＣＲによるＯＲＦ断片の増幅のための鋳型として、そのｃＤＮＡを保有するプラスミドベクターを使用した。フォワードプライマー（Ｆｗ）混合物（ａｔｔＢｘ−ＳＤＫ及びＳＤＫ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）、相対量１０／１００）並びにａｔｔＢｙ（^＊）−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）のリバースプライマー（Ｒｖ）を使用して、増幅反応を組み立てた。ａｔｔＢに隣接したＯＲＦ断片で構成されるＮ−末端融合物（ＳＤＫ配列を含まない）の調製では、ａｔｔＢｘ−ＥＧＦＰ−Ｆｗプライマー及びａｔｔＢｙ−ＥＧＦＰ−Ｒｖプライマーのみを使用して、ａｔｔＢｘ−ＥＧＦＰ（ＯＲＦ）−ａｔｔＢｙを増幅させた。使用したａｔｔＢに隣接したＰＣＲプライマーを表１に掲載する。

この場合、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びＶｅｎｕｓのＯＲＦはその名称中に「ＥＧＦＰ」を含む同一のプライマーセットで増幅した。なぜならば、これらのＯＲＦのＮ−及びＣ−末端配列は同一だからである。ＤｓＲｅｄ２又はｍＲＦＰ１のＯＲＦはそれぞれその名称中に「ＤｓＲ２」又は「ｍＲＦＰ１」を含む別種のプライマーセットで増幅した。ＢＰ反応で、ａｔｔＢに隣接するＰＣＲ産物を、対応するａｔｔＰシグナルを含むドナーベクターと組換えて、蛍光タンパク質を含むエントリーベクターを作製した。ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）３１００ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）で配列解析することによって、エントリーベクターを確認した。

この実験で使用した蛍光タンパク質をコードするＯＲＦを含むエントリーベクターは以下のものである：ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＥＧＦＰ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−Ｖｅｎｕｓ−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＳＤＫ−ＳＥＣＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＤｓＲｅｄ２−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＥＧＦＰ−Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ６、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ＥＧＦＰ−Ｌ４、ｐＥＮＴＲ−Ｌ５−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−^＊Ｌ２、ｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ＥＧＦＰ−^＊Ｌ２及びｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｍＲＦＰ１−Ｌ４。

ヒトアクチンキャップタンパク質のサブユニット、ＣＰα１（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ５６６３７）（Hart, M.C., Korshunova, Y.O. & Cooper, J.A. (1997) Cell Motil Cytoskeleton, 38, 120-132）及びＣＰβ２（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｕ０３２７１）（Barron-Casella, E.A., Torres, M.A., Scherer, S.W., Heng, H.H., Tsui, L.C. & Casella, J.F. (1995) J Biol Chem, 270, 21472-21479；Hart, M.C. & Cooper, J.A. (1999) J Cell Biol, 147, 1287-1298）、並びにβ−アクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：ＮＭ＿００１１０１）（Gunning, P., Ponte, P., Okayama, H., Engel, J., Blau, H. & Kedes, L. (1983) Mol Cell Biol, 3, 787-795）をコードするＯＲＦを含有するｐＥＮＴＲベクターを、これらの遺伝子について特異的な、ａｔｔＢに接続したプライマー（表１）を使用する同様の操作法によって構築した。ＣＰβ２をコードするＯＲＦをプラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｃｐβ２）から増幅させた。ＣＰα１及びβ−アクチンをコードするＯＲＦを、鋳型としてヒトｃＤＮＡを使用することによって増幅させた。ＣＰβ２、ＣＰα１又はβ−アクチンのＯＲＦはそれぞれ「ＣＰｂ２」、「ＣＰａ１」又は「ＡＣＴ」を含むプライマーセットで増幅した。この実験で使用したすべてのアクチン関連タンパク質をコードするＯＲＦを含有するエントリーベクターは、以下のものである：ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ＳＤＫ−ｃｐβ２−Ｒ３、ｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ＳＤＫ−ｃｐβ２−Ｒ５、ｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｃｐα１−^＊Ｌ２、及びｐＥＮＴＲ−Ｒ２−ｃｐα１−^＊Ｌ４。

ヒトＥＦ−１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号：Ｊ０４６１７）（Kim, D.W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N. &Sugano, S. (1990) Gene, 91, 217-223；Uetsuki, T., Naito, A., Nagata, S. & Kaziro, Y. (1989) J Biol Chem, 264, 5791-5798）をコードするエントリーベクター（ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−Ｐ_ＥＦ１α−Ｌ６）も構築した。ＥＦ−１αプロモーターの増幅のための鋳型として、デスティネーションベクター、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴを使用した。プライマーセット、Ｂ１−Ｐ_ＥＦ１α−Ｆｗ及びＢ６−Ｐ_ＥＦ１α−Ｒｖを使用して、ＥＦ−１α（Ｐ_ＥＦ１α）のプロモーターシグナルを増幅した。

ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−ＤＥＳＴをＨｉｎｄＩＩＩ又はＸｂａＩで消化し、ヒトＥＦ−１αプロモーター（Ｐ_ＥＦ１α）の１．３ｋｂ断片又はウシ成長ホルモンからのポリアデニル化シグナル（ｐＡ_ＢＧＨ）を含有する０．６ｋｂ断片を、ｐＵＣ１８の対応する制限部位中に順次挿入した。生成したベクターを配列決定し、２つの断片の配向性を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐＡ_ＢＧＨ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ−Ｐ_ＥＦ１α−ＸｂａＩの配向性を持つ構築したプラスミドベクターを鋳型として使用し、プライマーセットとしてＢ４ｒ−ＭＣＳ−Ｆｗ及びＢ３ｒ−ＭＣＳ−Ｒｖ、又はＢ６ｒ−ＭＣＳ−Ｆｗ及びＢ５ｒ−ＭＣＳ−Ｒｖを使用することによって、合計２．０ｋｂの断片を増幅させた。ＢＰ反応で、ａｔｔＢに隣接したＰＣＲ産物をｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ３ｒ又はｐＤＯＮＲ−Ｐ６ｒＰ５ｒと組換えて、エントリーベクター、それぞれｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｐＡ_ＢＧＨ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｒ３又はｐＥＮＴＲ−Ｒ６−ｐＡ_ＢＧＨ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｒ５（表１）を作製した。停止コドンを欠損しているＯＲＦをコードするエントリーベクターの３’末端にｐＡ_ＢＧＨ−Ｐ_ＥＦ１αカセットをＬＲ反応によって接続したとき、生成するタンパク質はそのＣ末端に、１８アミノ酸長を含む（翻訳されたａｔｔＢ４ｒ又はａｔｔＢ６ｒの７ａａを含む）。

表１においては、ａｔｔＢ部位を太字で示し、下線を付けている。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ及びＫｏｚａｋ共通配列（ＳＤＫ）を普通字で示し、下線を付けている。開始コドンＡＴＧ、及び停止コドンＴＡＡ若しくはＴＡＧを枠付きで示す。プライマーの名称は、「接続したシグナル配列（Ｂｘ又はＳＤＫ）−遺伝子特異的配列（ＥＧＦＰ、ＤｓＲ２、ｍＲＦＰ、その他）−配向性、フォワード（Ｆｗ）又はリバース（Ｒｖ）」として示している。停止コドンを含むプライマーにはその名称中に星印（^＊）を付している。

ｉｎｖｉｔｒｏ組換え反応
ＢＰＣｌｏｎａｓｅ（商標）ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＬＲＣｌｏｎａｓｅ（商標）ＥｎｚｙｍｅＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、供給元の指示及び既報（Sasakiら、2004a前掲）にしたがって、ＢＰ及びＬＲ反応を実施した。

１〜５種のエントリーベクター及びデスティネーションベクター１種を使用するＭｕｌｔｉｓｉｔｅＧａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換えの効率を、宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数として測定した。

各反応後のＤＮＡの混合物を使用して、ＤＨ１０Ｂコンピテント細胞（１ｘ１０^９ｃ．ｆ．ｕ．／μｇｐＵＣ１９）を形質転換し、次にアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にこれを塗布した。３７℃で１８時間のインキュベート後、コロニーを計数した。これらのいくつかを培養し、精製したプラスミドを、アガロースゲル電気泳動によって、そのサイズ及び制限パターンについて、これらが真性の目的ベクターであるか偽性陽性ベクターであるかをチェックした。結果を以下の表２に示す。宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数を「コロニー」として表示した列に記載した。

反応に関与する組換え部位の数が増加するにつれて、組換え効率は低下した（Ａ〜Ｅ）。６種の組換えシグナルが関与する５種−ｐＥＮＴＲで陽性ベクターを獲得するのは困難だった。Ｆに、ＭｕｌｔｉｓｉｔｅＧａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換えによる３種−ＤＮＡタンデム発現ベクターの構築の効率を、ＧにこれらのＢＰ組換えによる３種−ＤＮＡタンデムエントリーベクターへの変換の効率を示す。また、これらの模式図を図１に示す。形質転換の条件及び構築物のチェックは、陽性エントリーベクターの取得のためにカナマイシンを含有するＬＢ−アガープレートを使用した以外は、Ａ〜Ｅの場合と同一である。

次に、２種及び４種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図２）、及び２種及び３種融合型ｃＤＮＡ-タンデム発現ベクターの構築を実施した（図３）。

（１）２種及び４種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図２）
（Ａ）ｐＥＮＴＲ−Ｌ１−ｃＤＮＡ１−Ｌ４（ｐＥＮＴＲ−１）、ｐＥＮＴＲ−Ｒ４−ｐＡ−Ｐ−Ｒ３（ｐＥＮＴＲ−２）及びｐＥＮＴＲ−Ｌ３−ｃＤＮＡ２−Ｌ２（ｐＥＮＴＲ−３）と、Ｃｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットの近接部位にプロモーター１個を保有するｐＤＥＳＴ（−Ｒ１Ｒ２）とのＬＲ組換えにより、２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。４対のａｔｔＬ−ａｔｔＲシグナルが相互に特異的に組換えられる。（Ｂ）２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターとｐＤＯＮＲ−Ｐ３Ｐ２とのＢＰ組換えにより、Ｂ３−ｃＤＮＡ２−Ｂ２とＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、ｃＤＮＡ１個、ｐＡ−Ｐカセット１個及びＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２を作製した。（Ｃ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ３Ｒ２から、２種−ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ３Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｄ）３種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターから、ｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ２とのＢＰ組換えにより、Ｂ５−ｃＤＮＡ３−Ｂ２とＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、ｃＤＮＡ２個、ｐＡ−Ｐカセット２個及びＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２を作製した。（Ｅ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２から、２種−ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。組換え反応における各段階の効率を以下の表３に要約する。

モジュラーデスティネーションベクターを使用する、３種及び４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築効率を、宿主細菌への形質転換後に形成されたコロニーの数として記載した（「コロニー」として表示した列）。Ａ〜Ｄのアルファベットは、図２に示した組換えの各段階を表す。形質転換の条件及び構築物のチェックは、モジュラーデスティネーションベクターを含有する陽性エントリーベクターの取得のためにＤＢ３．１コンピテント細胞（１ｘ１０^８ｃ．ｆ．ｕ．／μｇｐＵＣ１９）を使用した以外は、ほぼ表１の場合と同一である。（Ａ）２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築のための、表１Ｃ、Ｆと同様の３種断片の組換え。（Ｂ）ＢＰ組換えによる、２種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターのモジュラーデスティネーションベクターへの変換。（Ｃ）モジュラーデスティネーションベクター及び２種−ｃＤＮＡタンデムエントリーベクターを使用する、ＬＲ組換えによる３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築。（Ｄ）ＢＰ組換えによる３種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターのモジュラーデスティネーションベクターへの変換。（Ｅ）モジュラーデスティネーションベクター及び２種−ｃＤＮＡタンデムエントリーベクターを使用する、ＬＲ組換えによる４種−ｃＤＮＡタンデム発現ベクターの構築。

（Ｂ，Ｄ）偽性陽性ベクターを減少させるため、アンピシリン及びクロラムフェニコールを含有するＬＢ−アガープレート上での第１スクリーニングの後、取得したコロニーを２種類のＬＢ−アガープレート（第１はアンピシリン及びクロラムフェニコールを含み、第２はカナマイシンを含む）に接種することによる、第２スクリーニングを実施した。両プレートでコロニーを形成したベクターは偽性陽性ベクターであるので、これらを除外した。第１スクリーニングで形成したコロニーの数を「コロニー（１ｓｔ）」と表示した列に示す。第２スクリーニング後のコロニーの数を「コロニー（２ｎｄ）」と表示した列に示す。

（２）２種及び３種融合型ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築（図３）
（Ａ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ２（図２Ｂ中と同様のもの）から、タンデム配置で融合したｃＤＮＡｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、単一ｃＤＮＡ、１種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｂ）前記１種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ１−ｃＤＮＡ１−Ｂ６とｐＤＯＮＲ−Ｐ１Ｐ６のＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、Ｃｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセット１個、ｐＡ−Ｐカセット１個、及び融合型ｃＤＮＡ１個を別のｃＤＮＡとタンデム配置して保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６を作製した。（Ｃ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ１Ｒ６から、ｐＥＮＴＲ（−Ｌ１Ｌ６）の１種融合型ｃＤＮＡカセットとのＬＲ組換えにより、融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクター（タンデム配置の２個の融合型ｃＤＮＡカセットを含む）を作製した。（Ｄ）前記融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ４ｒ−ｃＤＮＡ３−Ｂ２とｐＤＯＮＲ−Ｐ４ｒＰ２のＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、融合型ｃＤＮＡ１セット、単一のｃＤＮＡ１個及びＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセット１個をタンデム配置で保有する、モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｌ４Ｒ２を作製した。（Ｅ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｌ４Ｒ２から、融合型ｃＤＮＡタンデムｐＥＮＴＲ（−Ｒ４Ｌ２）とのＬＲ組換えにより、融合型ｃＤＮＡ及び単一ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。（Ｆ）前記融合型ｃＤＮＡ及び単一ｃＤＮＡタンデム発現ベクターから、ＢＰ組換えにより、Ｂ５−ｃＤＮＡ２−Ｂ４とｐＤＯＮＲ−Ｐ５Ｐ４のＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットとを交換し、融合型ｃＤＮＡｓ及びＣｍ^Ｒ−ｃｃｄＢカセットをタンデム配置で保有するモジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４を作製した。（Ｇ）モジュラーｐＤＥＳＴ−Ｒ５Ｒ４から、２種融合型ｃＤＮＡ−タンデムｐＥＮＴＲ（−Ｌ５Ｌ４）とのＬＲ組換えにより、３種融合型ｃＤＮＡタンデム発現ベクターを作製した。

細菌宿主及び形質転換
ｃｃｄＢ遺伝子（Bernard, P., Kezdy, K.E., Van Melderen, L., et al. (1993) J Mol Biol, 234, 534-541）を含有するドナーベクター及びデスティネーションベクターの構築のため、ＬｉｂｒａｒｙＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＢ３．１（商標）ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ｃｃｄＢ遺伝子を含まないその他のベクターの構築のためには、ＭａｘＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＨ１０Ｂ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。二重形質転換されたコロニー（エントリー及び発現ベクターの両方、又はドナー及びデスティネーションベクターの両方を含むもの）、あるいは複成分中間体産物（２対のａｔｔ部位のうち１方だけでの組換えの結果である、エントリーベクターとデスティネーションベクター、又は発現ベクターとドナーベクターの融合構築物）を減少させるため、取得したコロニーを以下の２種類のＬＢアガープレートに接種することによる二次スクリーニングを実施した：第１は形成させたものと同一の抗生物質（アンピシリン又はカナマイシン）を含むもの；第２は第１のものとは別の抗生物質を含むものである。両プレートでコロニーを形成したベクターは二重形質転換物又は中間体産物を含む偽性ベクターであり、したがってこれを除外した。５コロニー以上を集めて、適切な抗生物質を含むＬＢ培地２ｍｌ中で培養した。ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐＭｉｎｉＫｉｔ（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、各ベクターのプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素消化とその後のアガロースゲル電気泳動によって、サイズ及び消化パターンを確認した。適正なサイズ及びパターンを持つベクターを真性陽性ベクターとして保存し、その後の実験で使用した。

哺乳動物細胞へのトランスフェクション及び発現アッセイ
構築後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＰＬＵＳＲｅａｇｅｎｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって、複数ｃＤＮＡのタンデム発現ベクターをＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションは供給元の指示にしたがって実施した。ＨｅＬａ細胞を３５ｍｍガラスボトム培養皿（ＡｓａｈｉＴｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ）で培養した。継代１日後、培地を「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩＲｅｄｕｃｅｄ−ＳｅｒｕｍＭｅｄｉｕｍｗｉｔｈｏｕｔＰｈｅｎｏｌＲｅｄ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。これは血清を含まないものである。次に、精製発現ベクター５００ｎｇ及びＰＬＵＳＲｅｇｅｎｔ６μｌを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌに溶解し、室温で１５分インキュベートした。次に、これらを、あらかじめＯｐｔｉ−ＭＥＭ１００μｌに溶解したＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ４μｌと混合し、さらに１５分インキュベートした。混合物を、低血清培地中のＨｅＬａ細胞を含む３５ｍｍ培養皿に添加した。次に細胞を５％ＣＯ_２中、３７℃で培養し、その後培地を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に変更した。一晩培養後、培地を再び血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭに変更し、ＣＦＰ／ＹＦＰ／Ｃｙ５（８６００８ｖ１；ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＢＦＰ／ＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ（８６００９；ＣｈｒｏｍａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）用のフィルターセットと冷却ＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−ＥＲ；ＨａｍａｍａｔｓｕＰｈｏｔｏｎｉｃｓ）を装備した、フィルターホイール制御システム（ＭＡＣ５０００；ＬｕｄｌＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）付きの蛍光顕微鏡（ＤＩＡＰＨＯＴＯ３００；Ｎｉｃｏｎ）で、細胞を観察した。結果を図４に示す。

図４Ａは、ｐＣＸＮ−ＥＧＦＰ及びｐＣＸＮ−ｍＲＦＰ１の同時トランスフェクションによる、ＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。２種の蛍光タンパク質の発現プロフィールは細胞間で異なっている。下部の白線は１００μｍを示す。図４Ｂは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ３−ＥＧＦＰ−^＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。２種の蛍光タンパク質の発現プロフィールは、図４Ａに示した同時トランスフェクションに比較して、かなり均一である。下部の白線は１００μｍを示す。図４Ｃは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ４−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−^＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びｍＲＦＰ１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｄは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ４−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ３−Ｖｅｎｕｓ−^＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＶｅｎｕｓの混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１、Ｖｅｎｕｓの画像、並びにＥＧＦＰ、ＳＥＣＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＶｅｎｕｓの合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｅは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ３−ｃｐβ２−Ｂ６−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ４−ｃｐα１−^＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中での２種の融合タンパク質、ＣＰβ２−ＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１−ＣＰα１の混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１の画像並びにＥＧＦＰ及びｍＲＦＰ１の合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。図４Ｅは、ｐＥＦ５／ＦＲＴ／Ｖ５−Ｂ１−ＥＧＦＰ−Ｂ３−ｃｐβ２−Ｂ６−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ５−ｍＲＦＰ１−Ｂ２−ｃｐα１−^＊Ｂ４−ｐＡ−Ｐ_ＥＦ１α−Ｂ３−ＳＥＣＦＰ−Ｂ６−ｂＡｃｔ−^＊Ｂ２でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中での３種の融合タンパク質、ＣＰβ２−ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１−ＣＰα１及びＳＥＣＦＰ−β−アクチンの混成発現を示す。パネルは、左から、ＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１、ＳＥＣＦＰの画像並びにＥＧＦＰ、ｍＲＦＰ１及びＳＥＣＦＰの合併画像を示す。下部の白線は２５μｍを示す。

１個の生細胞中での複数の異種ｃＤＮＡの発現と、生理学的タンパク質レベルを獲得するためのその発現の最適化の必要性は、プロテオミクス研究において重要性が増して来ている。蛍光タグを持つ融合タンパク質の発現は、機能性ゲノミクスにとって重要性が高まった研究手段となっている。本明細書に記載する方法を使用して、所望のどんなプロモーターの制御下でも、細胞中で複数の遺伝子又は遺伝子融合物の発現を導くように、モジュール方式で、遺伝子エレメントを組み立てることができる。これによって、ウイルス、組織特異的又は調節性プロモーターを介した制御可能な細胞遺伝子発現が可能になり、また細胞内所在地の決定、タンパク質複合体の形成の判定、またさらには単一分子の可視化のための蛍光タグの使用が促進される。

なお、本発明は、経済産業省・ＮＥＤＯプロジェクトの（平成１４〜１８年度）に参画して行われた。

各種ベクターの構造（Ａ及びＢ）、及び２つの標的核酸断片（ｃＤＮＡ１及びｃＤＮＡ２）を含むエントリーベクターの調製方法（Ｃ）を示す。２種及び４種ｃＤＮＡ−タンデム発現ベクターの構築方法の概要を示す。２種及び３種融合型ｃＤＮＡ-タンデム発現ベクターの構築方法の概要を示す。ＭｕｌｔｉｓｉｔｅＧａｔｅｗａｙ（商標）複数遺伝子発現ベクターを使用する、単一細胞中での複数ｃＤＮＡの同時導入及び発現を示す。

配列番号１〜３２：合成オリゴヌクレオチド

Claims

少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する方法であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の工程：
（ａ）少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片を２つ以上含む発現ベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
発現ベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した核酸断片の少なくとも１つと、ドナーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットとを交換し、少なくとも１つの核酸断片と少なくとも１つのカセットとを含むモジュラーデスティネーションベクターを構築する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたモジュラーデスティネーションベクターと、
少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片を含むエントリーベクターと、
部位特異的組換えタンパク質とをインキュベートすることにより、
モジュラーデスティネーションベクターに含まれるカセットと、エントリーベクターに含まれる少なくとも２つの組換え部位に隣接した少なくとも２つの核酸断片とを交換し、少なくとも３つの所望の核酸断片を含むベクターを構築する工程、
を含む前記方法。
発現ベクター又はエントリーベクターに含まれる核酸断片がｃＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
ドナーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項１又は２記載の方法。
発現ベクター又はエントリーベクターが少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
組換え部位が、ｌｏｘＰ、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ及びａｔｔＲからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
組換えタンパク質がインテグラーゼである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも２つの組換え部位に隣接したカセットを含むドナーベクターを含む、該キット。