JP2006141202A - 特定塩基配列の検出方法及びプライマーの伸長反応検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 標的となる核酸中に特定の塩基配列が存在するか否かを簡便な方法によって精度良く検出することができる技術を提供する。
【解決手段】 標的となる核酸と、特定の塩基配列を増幅するためのプライマーであって末端にチオール基が付加されているプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する。その後、この試料溶液をＰＣＲ反応させ、反応終了後の試料溶液を用いてインピーダンスの容量成分Ｚ’’を測定する。そして、この容量成分Ｚ’’の測定結果に基づいて、標的となる核酸中に特定の塩基配列が含まれているか(一点鎖線部分参照)、特定の塩基配列が含まれていないか（点線部分参照）を判断する。
【選択図】 図５

Description

本発明は、特定塩基配列の検出方法及びプライマーの伸長反応検出方法に関する。

特定の塩基配列を有する核酸の有無を調べる技術は非常に重要な技術である。例えば、遺伝病の診断、細菌およびウイルス等による食品の汚染検査、細菌およびウイルス等の人体への感染検査などにおいて必須の技術である。

重症複合型免疫不全症、家族性高コレステロール血症等の遺伝病は、特定の遺伝子の欠損が原因で起こることが明らかになっている。このため、上記遺伝病の原因となる特定の塩基配列を有する遺伝子の有無を調べることによって、遺伝病の有無を診断できる。

近年、大腸菌Ｏ１５７等による食品汚染が社会的問題となっている。このような細菌およびウイルス等による食品の汚染検査は、汚染が疑われる細菌あるいはウイルスに特有のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の有無を解析することによって汚染の有無を判断することができる。人体への感染検査に関しても同様である。

このような核酸の塩基配列の検出においては、試料である特定の塩基配列を含む核酸が微量である場合が多いため、検出感度が高いことが求められる。かかる検出感度を高めるために、ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーの伸長反応を繰り返しながら特定の塩基配列を有する核酸を増幅させるＰＣＲ法などが広く利用されている（例えば、特許文献１参照）。

特開平４−３４６８００号公報

しかしながら、増幅された特定の塩基配列を有する核酸を検出する方法には幾つか問題がある。例えば、増幅された特定の塩基配列を有する核酸を検出する最も汎用的な方法の１つとして電気泳動法があるが、この電気泳動法は臭化エチジウムなどの発ガン物質を蛍光インターカレート剤として用いるため、取り扱いに非常に注意を要するといった問題がある。また、この電気泳動法は、検出のために長時間を要するといった問題もある。

本発明は、以上説明した事情を鑑みてなされたものであり、標的となる核酸中に特定の塩基配列が存在するか否かを簡便な方法によって精度良く検出することができる技術を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明に係る塩基配列の検出方法は、標的とする核酸と、特定の塩基配列を増幅するためのプライマーであって末端に電極結合部位を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する調製工程と、前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におくことで、前記核酸中に前記特定の塩基配列が存在する場合に当該プライマーを伸長させる伸長反応工程と、前記伸長反応工程終了後の試料溶液を含む測定溶液中に電極を浸漬させ、電気的測定を行う測定工程と、電気的測定結果に基づいて前記核酸中に前記特定の塩基配列が存在するか否かを検出する検出工程とを具備することを特徴とする。

かかる構成によれば、反応終了後の試料溶液について電気的測定（インピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定など）を行うことで、標的とする核酸中に特定の塩基配列が存在するか否かを精度良く検出することが可能となり、ＳＮＰタイピングに基づいた薬の投与といったテーラーメイド医療等に活用することができる。
ここで、前記プライマーは、前記特定の塩基配列に相補的に結合する相補結合配列によって構成されていることが好ましい。また、前記検出工程では、電気的測定結果に基づいて前記プライマーが伸長したか否かを検出し、この検出結果に基づいて前記特定の塩基配列が存在するか否かを検出する態様が好ましい。

また、前記プライマーは、上流プライマーと下流プライマーの２種類のプライマーからなり、上流プライマー、下流プライマーの少なくともいずれか１種類のプライマーの末端に前記電極結合部位が設けられている態様が好ましい。
さらに、前記電極結合部位は、チオール基、アミノ基、ビオチンのいずれかであることが好ましく、また、前記電気的測定は、前記電極のインピーダンスの測定、電流の測定、電荷量の測定のいずれかであることが好ましい。

本実施形態では、試料中の標的となるＤＮＡのＳＮＰ（single nucleotide polymorphism）部位に特定の塩基配列が存在するか否かをプライマーの伸長反応を利用して検出（すなわちＳＮＰタイピング）する場合について説明する。なお、ＳＮＰ部位とは、ＤＮＡ配列約1000個程度に１つの割合で存在する塩基配列の異なる部位であって、個々人の病気のなり易さ、薬物に対する応答性など、個人間の遺伝的な差異そのものをあらわす部位をいう。

このようなＳＮＰタイピングを行う際、まず、ＳＮＰ部位を有する標的となるゲノムＤＮＡと、上流プライマー及び下流プライマーからなる一対のプライマーと、Ｔａｑポリメラーゼと、バッファーと、ｄＮＴＰｓを含む試料溶液を調製する（詳細は下記参照）。この試料溶液に含まれる上流プライマー及び下流プライマーのいずれか1種類のプライマーの末端にはチオール基（電極結合部位）が付加されている。なお、以下の説明では下流プライマーの末端にチオール基が付加されている場合を想定する。
＜試料溶液の組成＞
ｄＮＴＰｓ （終濃度０．２ｍＭ）
上流プライマー （終濃度１．０μＭ）
下流プライマー（２０塩基） （終濃度１．０μＭ）
１０×バッファー （終濃度１×バッファー）
Ｔａｑポリメラーゼ （終濃度２ｕｎｉｔ）
ゲノムＤＮＡ （終濃度０．１〜０．２μｇ）

試料溶液を調製すると、当該試料溶液をＰＣＲ反応（各プライマーの伸長反応）が生じる条件下におく。図１は、ゲノムＤＮＡと各プライマーが相補的な場合（野生型ゲノムＤＮＡを用いた場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。ＰＣＲ反応を生じさせるためには、以下に示す３段階の温度変化をｎ（例えば３０〜３５）サイクル繰り返し実行する必要がある。具体的には、まず、第1段階（熱変性）の温度変化（例えば９４〜９６℃）によって標的となるＳＮＰ部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０を得る（図１に示すＡ、Ｂ参照）。ここで、一本鎖ＤＮＡ１１０、１２０のうち、遺伝子情報を有するものをターゲットＤＮＡ１１０と呼び、遺伝子情報を有しないものを相補鎖ＤＮＡ１２０と呼ぶ。

次に、第2段階（アニーリング）の温度変化（例えば５５〜６０℃）によって上流プライマー１３０はターゲットＤＮＡ１１０にアニーリングし、末端にチオール基１５０が付加された下流プライマー１４０は相補鎖ＤＮＡ１２０にアニーリングする（図１に示すＣ参照）。そして、第3段階（伸長反応）の温度変化（例えば７２〜７４℃）によって上流プライマー１３０、下流プライマー１４０は共に伸長される（図１に示すＤ参照）。このようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０、相補鎖ＤＮＡ１２０は共に２ｎ倍に増幅される。

一方、図２は、ゲノムＤＮＡと両プライマーの少なくともいずれか一方が非相補的な場合（突然変異型ゲノムＤＮＡを用いた場合）のＰＣＲ反応を説明するための図である。なお、本実施形態では、ゲノムＤＮＡと下流プライマーが非相補的な場合を説明するが、ゲノムＤＮＡと上流プライマーが非相補的な場合も同様である。

まず、上記と同様、第１段階の温度変化によって標的となるＳＮＰ部位１０を有するゲノムＤＮＡ１００を熱変性し、ターゲットＤＮＡ１１０、相補鎖ＤＮＡ１２０を得る（図２に示すＡ、Ｂ参照）。次に、第２段階の温度変化によって上流プライマー１２０はターゲットＤＮＡ１１０にアニーリングするが、下流プライマー１４０は端部においてミスマッチ（具体的には、図２のＣに示す下流プライマー１４０の塩基「G」と相補鎖ＤＮＡ１２０の塩基「T」）が生じているため、相補鎖ＤＮＡ１２０に完全な形でアニーリングすることはない。

このような形でアニーリングが行われる結果、第3段階の温度変化によって上流プライマー１３０は伸長されるものの、下流プライマー１４０は伸長されない（図２に示すＤ参照）。このようなサイクルがｎサイクル繰り返されることにより、ターゲットＤＮＡ１１０が２ｎ倍に増幅される一方、相補鎖ＤＮＡ１２０は増幅されない。

以上の説明から明らかなように、プライマーが特定の塩基配列と相補的に結合する相補結合配列によって構成されている場合には、伸長反応が起きる一方、プライマーが上記相補結合配列によって構成されていない場合（言い換えれば、特定の塩基配列と相補的に結合しない非相補結合配列によって構成されている場合）には、伸長反応が起こらず、鎖長は伸びない。

上記サイクルを繰り返すことによってＰＣＲ反応を終了すると、下記組成の測定溶液にＰＣＲ反応終了後の試料溶液を投入し、インピーダンス測定を開始する。
＜測定溶液の組成＞
ＰＢＳ（ｐＨ７．０） （５０ｍＭ）
ＮａＣｌ （１Ｍ）
ＭｇＣｌ₂ （１０ｍＭ）

図３は、伸長反応が起きた試料溶液（以下、既反応試料溶液）を用いてインピーダンス測定を行う場合の説明図、図４は、伸長反応が起こらなかった試料溶液（以下、未反応試料溶液）を用いてインピーダンス測定を行う場合の説明図である。

まず、上記測定溶液１０ｍｌを調製した後、測定溶液に電極基板（本実施形態では電極面積３ｍｍ程度の金電極基板）を５分程度浸漬させる。そして、図３（ａ）、図４（ａ）に示すように電極基板Ａに接続されたインピーダンス測定装置５０を利用してインピーダンスの容量成分Ｚ’’（イマージナリーパート）の測定を開始する。測定開始から５００秒経過後、測定溶液中に各試料溶液（１μＭ、１００μｌ）を投入し（図３（ｂ）、図４（ｂ）参照）、３０００秒経過するまでの間、１００Ｈｚで１０秒に１回の割合でインピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定を行う。

前述したように、各試料溶液には末端にチオール基１５０が結合された下流プライマー１４０が多数含まれている。このチオール基１５０の機能により、下流プライマー１４０は電極基板Ａの表面に固定化される。具体的には、既反応試料溶液については鎖長が伸びた下流プライマー１４０が電極基板Ａの表面に固定化される一方（図３（ｃ）参照）、未反応試料溶液については鎖長が伸びていない下流プライマー１４０が電極基板Ａの表面に固定化される（図４(ｃ)参照）。

図５は、インピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定結果を示す図である。なお、図５では伸長反応が起こった場合の測定結果を一点鎖線で示し、伸長反応が起こらなかった場合の測定結果を点線で示している。また、比較のため、オリゴＤＮＡの鎖長が２０塩基のプローブを電極基板に固定化し、上記と同じ条件でインピーダンスの容量成分Ｚ’’の測定（比較実験）を行ったときの測定結果を太実線で示している。

図５に示すように、伸長反応が起こらなかった場合のインピーダンスの容量成分Ｚ’’と伸長反応が起こった場合のインピーダンスの容量成分Ｚ’’は大きく異なっている。具体的には、伸長反応が起こらなかった場合は比較実験とほぼ同様な結果が得られるのに対し（図５に示す点線、太実線参照）、伸長反応が起こった場合は比較実験と大きく異なる結果が得られる(図５に示す一点鎖線、太実線参照)。このように、得られるインピーダンスの容量成分Ｚ’’の大きさを適宜比較することで、伸長反応が起こったか否か（ここでは特定の塩基配列が存在するか否か）を精度良く検出することができる。なお、比較実験においては、構成が異なる２０塩基のプローブを複数種類用意し（詳細は下記参照）、これら各プローブについて上記と同じ条件でインピーダンスの容量成分Ｚ’’を測定したが、その測定結果に大きな差異はみとめられなかった。従って、塩基数が同じプローブについて比較するのであれば、プローブの構成（塩基配列）が異なっても同様の結果（同程度のインピーダンスの容量成分Ｚ’’）が得られる。また、２０塩基のプローブに限らず、５塩基のプローブ、４９塩基のプローブなど様々な数の塩基によって構成されたプローブにも適用可能である。
＜プローブの構成（２０塩基）＞
5'HS-C₆H₁₂-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 3'
5'HS-C₆H₁₂-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3'
5'HS-C₆H₁₂-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG 3'
5'HS-C₆H₁₂-CCACACTCACAGTTTTCACT 3'
5'HS-C₆H₁₂-TTTTCACTTCAGTGTATGCG 3'

以上説明したように、上記方法によれば、インピーダンスの容量成分Ｚ’’を測定するといった簡便な方法によって伸長反応が生じたか否か（本実施形態ではＳＮＰ部位に特定の塩基配列が存在するか否か）を精度良く検出することができるため、ＳＮＰタイピングに基づいた薬の投与といったテーラーメイド医療に活用することができる。
また、本実施形態では、標的となるＤＮＡとしてＳＮＰ部位を有するＤＮＡを例示したが、抽出動物組織、菌体、培養細胞などから抽出したＳＮＰ部位を有していないＤＮＡを標的としても良い。これらの検体に適用することで、遺伝病の診断、細菌及びウイルスなどによる食品の汚染検査、細菌及びウイルスなどの人体への感染検査に活用することができる。

また、本実施形態では、電極基板として金電極基板を使用したが、他の金属によって形成された電極を用いても良い。かかる場合には、例えばアミノ基やビオチンなど、電極基板の種類等に応じて固定化に必要な官能基（電極結合部位）をプライマーの末端に付加すれば良い。

また、本実施形態では、インピーダンスの容量成分Ｚ’’を測定（電気的測定）することで伸長反応が生じたか否か（ＳＮＰ部位に特定の塩基配列が存在するか否か）を検出したが、インピーダンスに限らず、電流測定（電気的測定）によって得られる電流値や電荷量測定（電気的測定）によって得られる電荷量を比較することによって伸長反応が生じたか否か等を検出するようにしても良い。なお、ＰＣＲ反応時に蛍光分子を取り込ませれば蛍光観察によって伸長反応が生じたか否か等を検出することも可能である。

また、本実施形態では、特定の塩基配列と相補的に結合する相補結合配列によって構成されているプライマーを例示したが、例えば東洋紡績（株）によって開発されたＡＳＰ(Allele Specific Primer)のように、一部に非相補的配列を含むプライマーについても適用可能である。このＡＳＰは、プライマーの３'末端から２番目の塩基がＳＮＰ部位に対応しており、さらに３'末端から３番目の塩基が標的となる塩基に対して必ず非相補的になるように設計されたプライマーである。かかるＡＳＰの末端に電極結合部位を付加しておくことで、煩雑な処理作業等を行うことなく、伸長反応が生じたか等を検出することができる。

本実施形態に係るゲノムＤＮＡと各プライマーが相補的な場合のＰＣＲ反応を説明するための図である。 同実施形態に係るゲノムＤＮＡと両プライマーのいずれか一方が非相補的な場合のＰＣＲ反応を説明するための図である。 同実施形態に係るインピーダンス測定を行う場合の説明図である。 同実施形態に係るインピーダンス測定を行う場合の説明図である。 同実施形態に係るインピーダンスの容量成分Ｚ''の測定結果を示す図である。

符号の説明

１０・・・ＳＮＰ部位、１００・・・ゲノムＤＮＡ、１１０・・・ターゲットＤＮＡ、１２０・・・相補鎖ＤＮＡ、１３０・・・上流プライマー、１４０・・・下流プライマー、１５０・・・チオール基、５０・・・インピーダンス測定装置、Ａ・・・電極基板。

Claims (7)

1. 標的とする核酸と、特定の塩基配列を増幅するためのプライマーであって末端に電極結合部位を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する調製工程と、
   前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におくことで、前記核酸中に前記特定の塩基配列が存在する場合に当該プライマーを伸長させる伸長反応工程と、
   前記伸長反応工程終了後の試料溶液を含む測定溶液中に電極を浸漬させ、電気的測定を行う測定工程と、
   電気的測定結果に基づいて前記核酸中に前記特定の塩基配列が存在するか否かを検出する検出工程と
   を具備することを特徴とする特定塩基配列の検出方法。
2. 前記プライマーは、前記特定の塩基配列に相補的に結合する相補結合配列によって構成されていることを特徴とする請求項１に記載の特定塩基配列の検出方法。
3. 前記検出工程では、電気的測定結果に基づいて前記プライマーが伸長したか否かを検出し、この検出結果に基づいて前記特定の塩基配列が存在するか否かを検出することを特徴とする請求項１または２に記載の特定塩基配列の検出方法。
4. 前記プライマーは、上流プライマーと下流プライマーの２種類のプライマーからなり、上流プライマー、下流プライマーの少なくともいずれか１種類のプライマーの末端に前記電極結合部位が設けられていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１の請求項に記載の特定塩基配列の検出方法。
5. 前記電極結合部位は、チオール基、アミノ基、ビオチンのいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１の請求項に記載の特定塩基配列の検出方法。
6. 前記電気的測定は、前記電極のインピーダンスの測定、電流の測定、電荷量の測定のいずれかであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１の請求項に記載の特定塩基配列の検出方法。
7. 標的とする核酸と、特定の塩基配列を増幅するためのプライマーであって末端に電極結合部位を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する調製工程と、
   前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におくことで、前記核酸中に前記特定の塩基配列が存在する場合に当該プライマーを伸長させる伸長反応工程と、
   前記伸長反応工程終了後の試料溶液を含む測定溶液中に電極を浸漬させ、電気的測定を行う測定工程と、
   電気的測定結果に基づいて前記プライマーが伸長したか否かを検出する検出工程と
   を具備することを特徴とするプライマーの伸長反応検出方法。
   
   

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