[go: up one dir, main page]

KR101925768B1 - 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101925768B1
KR101925768B1 KR1020180004442A KR20180004442A KR101925768B1 KR 101925768 B1 KR101925768 B1 KR 101925768B1 KR 1020180004442 A KR1020180004442 A KR 1020180004442A KR 20180004442 A KR20180004442 A KR 20180004442A KR 101925768 B1 KR101925768 B1 KR 101925768B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
primer
probe
reverse primer
forward primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020180004442A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180008836A (ko
Inventor
신명근
원은정
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020180004442A priority Critical patent/KR101925768B1/ko
Publication of KR20180008836A publication Critical patent/KR20180008836A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101925768B1 publication Critical patent/KR101925768B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 위장관 장애를 일으키는 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 기생충 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머와 프로브, 이를 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트는 장내 기생충 검출 시, 우수한 검출 한계, 특이도, 높은 신뢰성을 보이고, 이는 종래의 현미경적 진단법보다 더 민감한 검출이 가능하므로 임상적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법{Kit for detecting intestinal parasites and detection method using the same}
본 발명은 위장관 장애를 일으키는 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 기생충 검출 방법에 관한 것이다.
산업화가 급속하게 이루어지면서 도시생활에 익숙해지고, 문화, 경제 발전으로 전반적인 삶의 질이 향상되어 이제 우리나라 기생충 감염률은 0.04-0.07% 정도로 과거에 비해 크게 감소하였으나, 최근에는 과거에 주목을 받지 못했던 식품매개 기생충, 인수공통 감염 기생충, 기회감염 기생충의 중요성이 대두되고 있다.
이 중 식품매개 기생충 감염의 증가는 주로 생선회, 패류, 갑각류의 생식으로 인한 경우가 많으며, 식생활 습관과 밀접한 관계가 있다. 특히 간흡충, 요코가와흡충, 참굴큰입흡충 등과 같은 흡충이나, 작은와포자충, 람블편모충, 람플편모충, 이질아메바, 블라스토시스티스호미니스, 이핵아메바 등과 같은 원충 등의 기생충 감염에 의한 장관 증상을 나타내는 질환의 꾸준한 유병률을 보이고 있어서 관심의 대상이 되고 있다.
장관 증상을 일으키는 기생충 감염을 진단하기 위한 검사법으로 대변검사, 혈액검사, 객담검사, 셀로판 테이프법, 면역혈청학적 진단법 등 다양한 방법이 있는데, 최근에는 현미경에 의한 육안 검사에 의존하고 있으나, 현미경적 진단법 수행 시, 특수 염색을 해야지만 관찰이 가능하다는 문제점이 있다.
이에, 장관 증상을 유발하는 기생충을 동시에 탐지할 수 있는 새로운 진단 프로토콜의 개발이 시급하다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래 기생충 감염 진단법의 번거로운 문제점을 해결할 수 있는, 장관 증상을 유발하는 기생충을 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 세트, 프로브, 이를 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트 및 장관 증상 유발 기생충 동시 검출 방법을 제공하는데 있다.
1. (1) 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 17의 프로브;
(2) 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트 및 서열번호 18의 프로브; 및
(3) 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 및 서열번호 19의 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상을 포함하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
2. 위 1에 있어서, 상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충(trematode)인 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
3. 위 2에 있어서, 상기 흡충은 참굴큰입흡충(Gymnophalloides seoi), 요코가와흡충(Metagonimus yokogawai) 또는 간흡충(Clonorchis sinensis)인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
4. 위 1에 있어서, 상기 키트는
(4) 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트 및 서열번호 20의 프로브;
(5) 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트 및 서열번호 21의 프로브;
(6) 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트 및 서열번호 22의 프로브;
(7) 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트 및 서열번호 23의 프로브; 및
(8) 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하고, 상기 장관 증상 유발 기생충은 원충을 더 포함하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
5. 위 4에 있어서, 상기 제4 내지 제8 프라이머 세트는 원충(protozoa)으로부터 유래한 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
6. 위 5에 있어서, 상기 원충은 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia), 이핵아메바(Dientamoeba fragilis), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 블라스토시스티스호미니스(Blastocystis hominis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
7. 위 4에 있어서, 상기 원충은 작은와포자충, 람블편모충, 이핵아메바, 이질아메바, 블라스토시스티스호미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
8. 위 1에 있어서, 상기 키트는
(a) 제1 반응용기에 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트, 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트, 서열번호 17의 프로브, 서열번호 21의 프로브 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 제1 조성물;
(b) 제2 반응용기에 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트, 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트, 서열번호 18의 프로브, 서열번호 20의 프로브 및 서열번호 23의 프로브를 포함하는 제2 조성물; 및
(c) 제3 반응용기에 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트, 서열번호 19의 프로브 및 서열번호 22의 프로브를 포함하는 제3 조성물을 포함하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
9. 위 8에 있어서, 상기 제1 조성물은 참굴큰입흡충 검출용이고, 상기 제2 조성물은 요코가와흡충 검출용이며, 상기 제3 조성물은 간흡충 검출용인 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
10. 위 8에 있어서, 상기 제1 조성물은 이핵아메바 또는 블라스토시스티스호미니스, 상기 제2 조성물은 작은와포자충 또는 이질아메바, 상기 제3 조성물은 람블편모충를 추가적으로 검출하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
본 발명에 따른 프라이머와 프로브, 이를 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트는 기생충 검출 시, 우수한 검출 한계, 특이도, 높은 신뢰성을 보이고, 이는 종래의 현미경적 진단법보다 더 민감한 검출이 가능하므로 임상적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 위장관염 환자의 설사변에서 기생충 여부를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시간 PCR법을 통해 확인된 양성 검체의 시퀀싱 결과를 나타내는 도면이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 1) 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트;
(2) 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
(3) 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "검출"은 특정 대상시료 또는 개체 내의 목적균주의 존재, 농도, 조성 또는 활성을 판단하거나 예측하는 것 뿐 아니라, 이러한 분석결과를 통해 질병 또는 질환에 대한 분석대상 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충(trematode)일 수 있고, 바람직하게 상기 흡충은 예를 들어, 참굴큰입흡충(Gymnophalloides seoi), 요코가와흡충(Metagonimus yokogawai) 또느 간흡충(Clonorchis sinensis)일 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 장관 증상 유발 기생충 검출용 프라이머 세트는 (4) 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트;
(5) 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트;
(6) 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트;
(7) 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트; 및
(8) 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 제4 내지 제8 프라이머 세트는 원충(protozoa)으로부터 유래한 것일 수 있고, 상기 원충은 예를 들어, 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia), 이핵아메바(Dientamoeba fragilis), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 블라스토시스티스호미니스(Blastocystis hominis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 17 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프로브를 포함하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 프로브를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명에 있어서, 상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충일 수 있고, 상기 흡충은 예를 들어, 참굴큰입흡충, 요코가와흡충 또는 간흡충일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 장관 증상 유발 기생충 검출용 프로브는 서열번호 20 내지 24로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 20 내지 24의 프로브는 원충으로부터 유래된 것일 수 있으며, 상기 원충은 예를 들어, 작은와포자충, 람블편모충, 이핵아메바, 이질아메바, 블라스토시스티스호미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
한편, 프라이머 또는 프로브 제작 시 참조하여야 하는 본 발명 마커의 뉴클레오타이드 서열은 GenBank에서 확인할 수 있다. 상기 서열을 참조하여 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머 세트와 프로브를 포함하는, 장관 증상 유발 기생충의 실시간 다중 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트를 제공한다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 원하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타깃 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
이렇게 증폭된 반응 결과물을 젤 전기영동으로 확인하는 대신에 실시간 중합효소 연쇄반응 기기에서 증폭 산물의 Ct 값을 측정한다. 이미 알고 있는 농도의 DNA의 증폭 그래프를 통해 상대적 정량까지 가능하다. 본 발명의 마커를 이용한 증폭 반응 결과물의 여부를 Ct 값을 기준으로 정성 분석한다.
본 발명에 있어서, 상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충일 수 있고, 상기 흡충은 예를 들어, 참굴큰입흡충, 요코가와흡충 또는 간흡충일 수 있으며, 추가적으로 원충, 예를 들어, 작은와포자충, 람블편모충, 이핵아메바, 이질아메바 및 블라스토시스티스호미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트는 바람직하게 (a) 제1 반응용기에 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트를 포함하는 제1 조성물;
(b) 제2 반응용기에 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트, 및 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트를 포함하는 제2 조성물; 및
(c) 제3 반응용기에 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 및 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트를 포함하는 제3 조성물로 나누어 각각의 프라이머 세트들 간에 간섭이 생기지 않게 하면서, 3 가지 형광이 달린 프로브 세트를 이용하여 각각을 구분할 수 있다.
상기 제1 조성물은 서열번호 17의 프로브, 서열번호 21의 프로브 및 서열번호 24의 프로브를 더 포함할 수 있고, 상기 제2 조성물은 서열번호 18의 프로브, 서열번호 20의 프로브 및 서열번호 23의 프로브를 더 포함할 수 있으며, 상기 제3 조성물은 서열번호 19의 프로브 및 서열번호 22의 프로브를 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 제1 조성물은 상기 제1 조성물은 참굴큰입흡충 검출용이고, 상기 제2 조성물은 요코가와흡충 검출용이며, 상기 제3 조성물은 간흡충 검출용일 수 있고, 추가적으로 상기 제1 조성물은 이핵아메바 또는 블라스토시스티스호미니스, 상기 제2 조성물은 작은와포자충 또는 이질아메바, 상기 제3 조성물은 람블편모충을 검출할 수 있다.
본 발명은 상기 실시간 다중 중합효소 연쇄반응 증폭용 키트를 이용하고, 검체로부터 채취한 시료로부터 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계를 포함하는, 장관 증상 유발 기생충의 동시 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충일 수 있고, 상기 흡충은 예를 들어, 간흡충, 요코가와흡충 또는 참굴큰입흡충일 수 있으며, 추가적으로 원충, 예를 들어, 작은와포자충, 람블편모충, 이핵아메바, 이질아메바 및 블라스토시스티스호미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 상기 실시간 중합효소 연쇄반응은
(i) 제1 반응용기에 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트, 및 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트를 포함하는 제1 조성물과 서열번호 17의 프로브, 서열번호 21의 프로브 및 서열번호 24의 프로브를 혼성화시켜 제1 혼성화 산물을 얻는 단계;
(ii) 제2 반응용기에 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트, 및 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트를 포함하는 제2 조성물과 서열번호 18의 프로브, 서열번호 20의 프로브 및 서열번호 23의 프로브를 혼성화시켜 제2 혼성화 산물을 얻는 단계; 및
(iii) 제3 반응용기에 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 및 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트를 포함하는 제3 조성물과 서열번호 19의 프로브 및 서열번호 22의 프로브를 혼성화시켜 제3 혼성화 산물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.
이렇게 얻어진 혼성화 산물의 존재 유무를 실시간중합효소반응을 통해 확인하여, 각 기생충 감염 여부를 판정할 수 있으며, 특히 상기 제1 혼성화 산물을 이용하여 참굴큰입흡충을 검출할 수 있고, 추가적으로 이핵아메바, 블라스토시스티스호미니스를 검출할 수 있다.
또한, 상기 제2 혼성화 산물을 이용하여 요코가와흡충을 검출할 수 있으며, 추가적으로 작은와포자충 또는 이질아메바를 검출할 수 있다.
나아가, 상기 제3 혼성화 산물을 이용하여 간흡충을 검출할 수 있고, 추가적으로는 람블편모충을 검출할 수 있다.
상기 전기영동으로 증폭산물을 확인하는 절차 없이, 실시간중합효소반응으로 증폭되는 산물의 Ct (threshold cycle)값을 확인함으로써 증폭 여부를 판정할 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브 설계
설사변에서 5가지 원충류(작은와포자충, 람블편모충, 이질아메바, 블라스토시스티스 호미니스, 이핵아메바)와 3가지 흡충류(간흡충, 요코가와흡충, 참굴큰입흡충) 감염을 진단하고자, 프라이머를 Primer 3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 이용하여 고안하였고, 프라이머 시퀀스는 하기 표 1에 정리하였다. 또한 프로브는 프라이머 쌍으로 증폭되는 부위에 상응하도록 Primer 3 소프트웨어(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 이용하여 설계하였고, 상기 프로브 시퀀스는 하기 표 2에 정리하였다.
Target organism Forward primer sequence
(5' → 3')		 Reverse primer sequence
(3' → 5')		 Target Amplicon size (bp)
Cryptosporidium parvum TGTGTTCAATATCTCCCTGCAAA GCATGTCGATTCAATTTGTCA Cowp 1 151
Giardia lamblia GAGGTCAAGAAGTCCGCCG CAAGGGACTTGCGGAAGTTT beta
-giardin		 85
Entamoeba histolytica GCGGACGGCTCATTATAACA TGTCGTGGCATCCTAACTCA 18S rRNA 171
Dientamoeba fragilis TTAGAACCTTAGACAACGGATGTCTTG TGTGCATTCAAAGATCGAACTTATC 18S rRNA 112
Blastocystis hominis GGAGAGGGAGCCTGAGAGAT AACATTGTTCCGCATTGTGA 18S rRNA 113
Clonorchis sinensis GGTGGTTTGAGCTCATCATATGT CGAGTTCCAGCAAGCATATATAATC CO1 138
Metagonimus yokogawai CTATGGCGGTTTAGTGTTGGC ACTGCCGTCTTCAAATCCAG CO1 102
Gymnophalloides seoi AGTGTTGTTTGGGCTCATCA AACCTTAATCGGTGGGAACA CO1 104
* CO1: cytochrome c oxidase subunit 1
Target organism Probe sequence
Cryptosporidium parvum CCTCCTGGATTCAATTTGTCA
Giardia lamblia ACGATCAAGGAGGAGATCGA
Entamoeba histolytica AAATGGCCAATTCATTCAATG
Dientamoeba fragilis TGTGATAAGCGGCTAGAATTGC
Blastocystis hominis ATCCTGACACAGGGAGGTAGTG
Clonorchis sinensis CGGTTACTATGATTATAGGTGTGCC
Metagonimus yokogawai TGGGCGCATCACATGTTTATGGTG
Gymnophalloides seoi TGTTTATGGTTGGTTGATGTTAAGACTTCGGT
실험예
앞서 개발된 실시간 중합연쇄반응 진단법의 수행능에 대해서는 회수율, 검출 한계, 분석특이도 및 진단특이도, 정밀도, 직선성 범위, 54종의 병원체들 간의 교차반응, 임상적 간섭물질들의 간섭효과를 분석하였다.
(1) PCR efficiency test
회수율은 아래와 같은 공식에 따라 계산한 PCR efficiency (%) 로 표시하였다(https://www.lifetechnologies.com/kr/ko/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html).
PCR efficiency (E) = 10 - 1 / slope
PCR efficiency (%) = (E - 1) X 100%
　Average Ct values according to DNA concentrations R2 slope Efficiency (%)
Target organism 100 fg 10 fg 1 fg 100 ag 10 ag
C. parvum 26.04 29.47 33.08 37.25 41.14 0.999 -3.80 83.3
G. lamblia 27.38 30.83 34.43 37.25 41.14 0.998 -3.39 97.1
E. histolytica 26.54 30 33.44 36.67 39.92 1.000 -3.34 99.1
D. fragilis 27.88 31.53 35.24 38.17 41.72 0.999 -3.43 95.6
B. hominis 30.3 33.72 37.17 40.91 42.95 0.992 -3.25 103.2
C. sinensis 25.72 29.3 32.75 36.13 39.47 1.000 -3.43 95.6
M. yokogawai 25.82 29.43 32.66 36.44 39.64 0.999 -3.47 94.3
G. seoi 30.92 34.13 37.57 40.8 43.16 0.996 -3.12 109.5
Abbreviations: C. parvum , Cryptosporidium parvum ; G. lamblia , Giardia lamblia ; E. histolytica, Entamoeba histolytica ; D. fragilis , Dientamoeba fragilis ; B. hominis , Blastocystis hominis ; C. sinensis , Clonorchis sinensis ;M . yokogawai , Metagonimus yokogawai; G. seoi , Gymnophalloides seoi .
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 8가지 기생충의 DNA농도와 Ct 값 간에는 0.9924 에서 0.9998의 R2값과 함께 우수한 상관성을 보였다. 개발한 실시간 중합연쇄반응법의 중합연쇄반응효율은 83.33%-109.45%로 높은 회수율을 보였다.
(2) Analytical sensitivity and precision test
각 기생충 DNA (3 ⅹ 108 clones/mL)를 100 pg에서 10 ag까지 10배씩 희석하여 제조한 농도 물질을 24번씩 반복 측정하였으며, 농도별로 검출되는 Ct 값을 기준으로 검출 한계를 조사하였다. 검출한계는 CLSI 기준 EP17-A에 따라 95%이상 양성을 보이는 Ct 값으로 결정하였다.
Target organism Average Ct values according to different copy number of target DNA
Template (27,500-30,000 copies) ×10-1 ×10-2 ×10-3 ×3-1
×10-3 		×6-1
×10-3 		×10-4 N.C.
C. parvum Average Ct value 26.05 29.2 32.9 36.26 39.31 39.41 39.96 -
CV 0.41% 0.74% 1.37% 1.17% 5.65% 4.00% 1.31% -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 67% 38% 54% -
G. lamblia Average Ct value 27.46 30.77 34.15 37.24 40.98 39.26 40.11 -
CV 0.83% 0.86% 1.34% 2.01% 5.45% 2.47% 4.66% -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 100% 33% 58% 0%
E. histolytica Average Ct value 26.52 30.02 33.36 36.94 39.28 39.01 40.6 -
CV 0.64% 0.74% 1.16% 4.58% 4.37% 4.55% 4.81% -
Detection Rate 100% 100% 100% 96% 54% 25% 29% 0%
D. fragilis Average Ct value 27.73 31.15 34.7 37.53 40.72 41.44 41.61 -
CV 1.40% 1.04% 1.86% 1.96% 5.19% 4.71% 3.99% -
Detection Rate 100% 100% 100% 96% 63% 71% 50% 0%
B. hominis Average Ct value 30.47 34.08 37.29 40.63 42.25 40.77 42.65 -
CV 1.35% 1.51% 1.58% 2.01% 3.68% 3.43% 3.48% -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 46% 17% 21% 0%
C. sinensis Average Ct value 25.73 29.28 32.23 36.23 39.47 39.2 39.39 -
CV 0.48% 0.97% 1.09% 2.96% 6.78% 4.70% 5.14% -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 79% 50% 75% 0%
M. yokogawai Average Ct value 25.88 29.39 32.24 35.65 38.38 39.51 38.98 -
CV 0.35% 0.57% 2.02% 4.96% 3.42% 5.34% 4.15% -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 100% 58% 50% 0%
G. seoi 　 Average Ct value 30.15 33.94 37.2 40.14 41.64 40.21 40.08 -
CV 1.51% 0.97% 1.12% 1.89% 3.74% 4.12% - -
Detection Rate 100% 100% 100% 100% 54.17% 12.50% 4.17% 0%
본 진단법은 람블편모충과 요코가와흡충의 경우 30ag 농도(10 copies)까지, 나머지 6가지 기생충은 100ag 농도 (30 copies)까지 검출할 수 있었다.
반복 측정 하였을 때 0%에서 7%까지 모두 10% 미만의 CV값을 보여 재현성이 우수함을 알 수 있었다.
(3) Cross-reactivity test
진단 특이도를 확인하기 위해 54가지 주요 병원체 (27종 박테리아 및 진균, 11종 기생충, 16종 바이러스) 의 DNA와의 교차반응 여부를 검사하였다. 적혈구, 백혈구, 빌리루빈, 담즙산, 헤파린, 아세트아미노펜, 이부프로펜과 같은 다양한 임상적 간섭물질들과의 간섭효과를 분석하기 위해, 임의로 200 mg 음성 대변 검체에 10 fg의 양성대조물질과 간섭물질을 섞어 검사하였다.
No. Organisms Name Results
1 Bacteria Clostridium difficile U.D.
2 Yersinia enterocolitica U.D.
3 Salmonella typhimurium U.D.
4 Proteus mirabilis U.D.
5 Pseudomonas aeruginosa U.D.
6 Escherichia coli U.D.
7 Lactobacillus acidophilus U.D.
8 Bifidobacterium bifidum U.D.
9 Enterobacter aerogenes U.D.
10 Clostridium perfringens U.D.
11 Enterococcus faecalis U.D.
12 Shigella flexneri U.D.
13 Klebsiella pneumoniae U.D.
14 Campylobacter jejuni U.D.
15 Candida albicans U.D.
16 Filobasidiella neoformans U.D.
17 Staphylococcus epidermidis U.D.
18 Aspergillus fumigatus U.D.
19 Staphylococcus aureus U.D.
20 Myocobacterium tubercμLosis U.D.
21 M. intracellμLare U.D.
22 M. abscessus U.D.
23 M. hominis U.D.
24 Chlamydia trichomatis U.D.
25 Nisseria gornorae U.D.
26 Ureaplasma parvum U.D.
27 U. urealyticum U.D.
No. Organisms Name Results
28 Parasites Ascaris lumbricoides U.D.
29 Enterobius vermicμLaris U.D.
30 Taenia asiatica U.D.
31 Taenia solium U.D.
32 Taenia saginata U.D.
33 Diphyllobothrium nihonkaiense U.D.
34 Plasmodium falciparum U.D.
35 P. vivax U.D.
36 P. ovale U.D.
37 P. malariae U.D.
38 T. vaginalis U.D.
39 Virus
　		 Noro virus U.D.
40 Rota virus U.D.
41 HSV1 U.D.
42 HSV -2 U.D.
43 HAV U.D.
44 HBV U.D.
45 HCV U.D.
46 EBV U.D.
47 JEV U.D.
48 Enterovirus 70 U.D.
49 Enterovirus 71 U.D.
50 BKV U.D.
51 Dengue virus 2 U.D.
52 Dengue virus 3 U.D.
53 Dengue virus 4 U.D.
54 Human adenovirus U.D.
Interferents Ct values of parasite PCR adding different concentration of interferents
C. parvum G. lamblia E. histolytica D. fragilis B. hominis M. yokogawai C. sinensis G. seoi
Erythrocyte 20% U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D.
4% 34.06 36.92 36.55 34.65 36.44 35.15 32.27 37.45
1% 34.18 36.21 36.57 35.32 36.76 35.43 32.32 37.31
Negative 33.87 36.01 36.11 35.15 36.51 35.76 32.20 37.04
Leucocyte 20% U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D. U.D.
4% 33.30 34.21 33.32 34.90 37.58 32.04 31.76 37.31
1% 32.63 33.84 33.10 34.93 37.69 32.12 31.80 37.47
Negative 33.09 34.06 33.24 34.70 37.65 32.05 31.96 37.26
Bilirubin 2ug/ml 32.94 34.56 36.60 34.84 37.23 33.82 36.49 37.48
1ug/ml 32.72 37.45 36.44 34.06 37.22 34.06 36.44 36.64
0.5ug/ml 32.75 37.31 36.76 34.18 37.09 34.18 36.76 37.46
Negative 32.91 37.04 36.51 34.12 37.18 33.87 36.51 37.19
Bile salts 1mg/ml 32.51 34.76 33.28 34.89 37.31 33.00 37.48 37.49
0.5mg/ml 32.81 34.44 32.78 34.96 37.45 32.49 36.64 37.28
0.1mg/ml 33.03 34.19 33.37 34.81 37.38 32.37 37.46 37.54
Negative 32.49 34.27 32.66 35.13 37.61 32.71 37.19 37.37
Heparin 0.2 IU 38.05 U.D. U.D. U.D. U.D. 37.51 U.D. 39.86
0.1 IU 32.73 33.47 33.35 33.30 37.13 32.20 32.56 36.75
0.05 IU 32.80 33.43 33.32 33.16 36.51 31.71 32.34 37.33
Negative 32.62 33.35 32.62 33.04 36.49 31.31 32.11 37.31
Acetaminophen 200ug/ml 34.12 34.27 32.98 34.75 33.71 32.73 32.62 33.66
100ug/ml 32.64 33.53 33.14 34.79 32.84 31.99 32.47 33.74
50ug/ml 32.42 32.88 33.20 33.37 32.46 31.29 30.02 33.37
Negative 32.71 32.52 33.73 32.95 32.38 32.85 32.81 32.98
Ibuprofen　 200ug/ml 34.12 34.27 32.98 34.75 33.71 32.73 32.62 33.66
100ug/ml 32.64 33.53 33.14 34.79 32.84 31.99 32.47 33.74
50ug/ml 32.42 32.88 33.20 33.37 32.46 31.29 30.02 33.37
Negative 32.71 32.52 33.73 32.95 32.38 32.85 32.81 32.98
상기 표 5 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 54종의 주요 병원체들과의 교차반응은 보이지 않았다. 상기 표 7에 나타낸 바와 같이 다양한 임상적 간섭물질들과의 간섭효과는 저농도인 경우에는 보이지 않았지만, 20%이상 고농도의 적혈구와 백혈구 또는 0.2 IU의 헤파린이 섞인 경우 중합연쇄반응이 억제됨을 알 수 있었다.
(4) Validation of the multiplex qPCR assay using stool samples obtained from gastroenteritis patients
개발한 실시간 중합연쇄반응 진단키트의 검증을 위해 실험실적으로 배양한 이질아메바, 람블편모충, 참굴큰입흡충을 대변과 섞어 만든 양성 대조 검체 6개를 포함하여 총 126개의 설사변을 대상으로 현미경적 진단법과 실시간 중합연쇄반응 진단법을 비교하였다.
Final identification No. of specimens Microscopy multiplex real-time PCR
Correct ID Incorrect ID Correct ID Incorrect ID
Blastocystis hominis 8 0 8 8 0
Cryptosporidium parvum 3 1 2 3 0
Clonorchis sinensis 3 2 1 3 0
Entamoeba histolytica 2 2 0 2 0
Giardia lamblia 2 2 0 2 0
Gymnophalloides seoi 2 0 2 2 0
Negative for parasites 106 106 0 106 0
Total No.(%) 126 113(89.7) 13(10.3) 126(100.0) 0(0.0)
Methods Results No. of specimens with
Positive for the parasites Negative for the parasites Subtotal
Microscopic examination Positive 7 0 7
Negative 13 106 119
Subtotal 20 106 -
Multiplex
real-time PCR		 Positive 20 0 20
Negative 0 106 106
Subtotal 20 106 -
Methods Diagnostic performance
[95% confidence interval]
Sensitivity Specificity Positive predictive value Negative predictive value
Microscopic examination
(Subtotal)		 35.0%
[15.39-59.22]		 100.0%
[96.58-100.0]		 100.0%
[59.04-100.0]		 89.1%
[82.04-94.05]
Multiplex
real-time PCR
(Subtotal)		 100.0%
[83.16-100.0]		 100.0%
[96.58-100.0]		 100.0%
[83.16-100.0]		 100.0%
[96.58-100.0]
상기 표 8 내지 10에 나타낸 바와 같이, 126개 임상 검체를 대상으로 비교하였을 때, 본 연구에서 개발한 실시간 중합연쇄반응법으로는 20건의 양성 검체를 진단한 반면, 현미경 진단법으로는 7건의 양성 검체만을 진단할 수 있었다.
실시간 중합연쇄반응법으로는 6개의 양성대조검체 외에도 8건의 블라스토시스티스 호미니스, 3건의 작은와포자충, 3건의 간흡충 양성검체를 진단할 수 있었다.
위양성 여부를 알아보기 위해 실시간 중합연쇄반응법에서만 양성으로 나온 14건은 모두 시퀀싱을 시행하였으며, 모두 양성임을 확인하였다.
실시간 중합연쇄반응 진단법(100%)은 현미경 진단법(89.7%)에 비해 보다 정확히 동정하는 비율이 높았다. 전체적으로 실시간 중합연쇄반응 진단법(100%)은 현미경 진단법(35%)에 비해 높은 민감도를 나타내었고, 상기 두 방법 모두 100%의 특이도를 보이는 것으로 확인되었다.
<110> Chonnam National University <120> Kit for detecting intestinal parasites and detection method using the same <130> 18P01028 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gymnophalloides seoi Forward primer sequence <400> 1 agtgttgttt gggctcatca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gymnophalloides seoi Reverse primer sequence <400> 2 aaccttaatc ggtgggaaca 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Metagonimus yokogawai Forward primer sequence <400> 3 ctatggcggt ttagtgttgg c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Metagonimus yokogawai Reverse primer sequence <400> 4 actgccgtct tcaaatccag 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clonorchis sinensis Forward primer sequence <400> 5 ggtggtttga gctcatcata tgt 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clonorchis sinensis Reverse primer sequence <400> 6 cgagttccag caagcatata taatc 25 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cryptosporidium parvum Forward primer sequence <400> 7 tgtgttcaat atctccctgc aaa 23 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cryptosporidium parvum Reverse primer sequence <400> 8 gcatgtcgat tcaatttgtc a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blastocystis hominis Forward primer sequence <400> 9 ggagagggag cctgagagat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blastocystis hominis Reverse primer sequence <400> 10 aacattgttc cgcattgtga 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Giardia lamblia Forward primer sequence <400> 11 gaggtcaaga agtccgccg 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Giardia lamblia Reverse primer sequence <400> 12 caagggactt gcggaagttt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Entamoeba histolytica Forward primer sequence <400> 13 gcggacggct cattataaca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Entamoeba histolytica Reverse primer sequence <400> 14 tgtcgtggca tcctaactca 20 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dientamoeba fragilis Forward primer sequence <400> 15 ttagaacctt agacaacgga tgtcttg 27 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dientamoeba fragilis Reverse primer sequence <400> 16 tgtgcattca aagatcgaac ttatc 25 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gymnophalloides seoi Probe sequence <400> 17 tgtttatggt tggttgatgt taagacttcg gt 32 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Metagonimus yokogawai Probe sequence <400> 18 tgggcgcatc acatgtttat ggtg 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Clonorchis sinensis Probe sequence <400> 19 cggttactat gattataggt gtgcc 25 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cryptosporidium parvum Probe sequence <400> 20 cctcctggat tcaatttgtc a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Blastocystis hominis Probe sequence <400> 21 atcctgacac agggaggtag tg 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Giardia lamblia Probe sequence <400> 22 acgatcaagg aggagatcga 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Entamoeba histolytica Probe sequence <400> 23 aaatggccaa ttcattcaat g 21 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dientamoeba fragilis Probe sequence <400> 24 tgtgataagc ggctagaatt gc 22

Claims (10)

  1. (1) 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 17의 프로브;
    (2) 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트 및 서열번호 18의 프로브; 및
    (3) 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 및 서열번호 19의 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상을 포함하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 장관 증상 유발 기생충은 흡충(trematode)인 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 흡충은 참굴큰입흡충(Gymnophalloides seoi), 요코가와흡충(Metagonimus yokogawai) 또는 간흡충(Clonorchis sinensis)인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 키트는
    (4) 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트 및 서열번호 20의 프로브;
    (5) 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트 및 서열번호 21의 프로브;
    (6) 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트 및 서열번호 22의 프로브;
    (7) 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트 및 서열번호 23의 프로브; 및
    (8) 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트 및 서열번호 24의 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하고, 상기 장관 증상 유발 기생충은 원충을 더 포함하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제4 내지 제8 프라이머 세트는 원충(protozoa)으로부터 유래한 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 원충은 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia), 이핵아메바(Dientamoeba fragilis), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 블라스토시스티스호미니스(Blastocystis hominis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  7. 청구항 4에 있어서,
    상기 원충은 작은와포자충, 람블편모충, 이핵아메바, 이질아메바, 블라스토시스티스호미니스로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 키트는
    (a) 제1 반응용기에 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머를 포함하는 제5 프라이머 세트, 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머를 포함하는 제8 프라이머 세트, 서열번호 17의 프로브, 서열번호 21의 프로브 및 서열번호 24의 프로브를 포함하는 제1 조성물;
    (b) 제2 반응용기에 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머를 포함하는 제4 프라이머 세트, 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머를 포함하는 제7 프라이머 세트, 서열번호 18의 프로브, 서열번호 20의 프로브 및 서열번호 23의 프로브를 포함하는 제2 조성물; 및
    (c) 제3 반응용기에 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머를 포함하는 제6 프라이머 세트, 서열번호 19의 프로브 및 서열번호 22의 프로브를 포함하는 제3 조성물을 포함하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 제1 조성물은 참굴큰입흡충 검출용이고,
    상기 제2 조성물은 요코가와흡충 검출용이며,
    상기 제3 조성물은 간흡충 검출용인 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 제1 조성물은 이핵아메바 또는 블라스토시스티스호미니스, 상기 제2 조성물은 작은와포자충 또는 이질아메바, 상기 제3 조성물은 람블편모충을 추가적으로 검출하는 것인 장관 증상 유발 기생충 검출용 다중 중합효소 연쇄반응 증폭 키트.
KR1020180004442A 2018-01-12 2018-01-12 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법 Active KR101925768B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180004442A KR101925768B1 (ko) 2018-01-12 2018-01-12 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180004442A KR101925768B1 (ko) 2018-01-12 2018-01-12 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160017693A Division KR20170096379A (ko) 2016-02-16 2016-02-16 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180008836A KR20180008836A (ko) 2018-01-24
KR101925768B1 true KR101925768B1 (ko) 2018-12-06

Family

ID=61029287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180004442A Active KR101925768B1 (ko) 2018-01-12 2018-01-12 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101925768B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230005450A (ko) 2021-07-01 2023-01-10 대한민국(질병관리청장) 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117568494B (zh) * 2024-01-17 2024-03-29 黑龙江八一农垦大学 一种淡水鱼中人兽共患吸虫囊蚴多重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101247999B1 (ko) * 2012-10-05 2013-03-27 대한민국 흡충의 피낭유충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법
WO2014071946A1 (en) * 2012-11-07 2014-05-15 Statens Serum Institut Diagnostic pcr primers enabling exhaustive detection of non-human eukaryotic ssu rdna in human clinical samples

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101247999B1 (ko) * 2012-10-05 2013-03-27 대한민국 흡충의 피낭유충 감염을 진단하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법
WO2014071946A1 (en) * 2012-11-07 2014-05-15 Statens Serum Institut Diagnostic pcr primers enabling exhaustive detection of non-human eukaryotic ssu rdna in human clinical samples

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Guy et al. Applied And Environmental Microbiology(2003), Vol.69, No.9, p.5178-5185.
Guy et al. Journal of Clinical Microbiology(2004), Vol.42, No.7, p.3317-3320
Lee et al. Korean Journal of Parasitology (2007), Vol.45, No.3, p.181-189

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230005450A (ko) 2021-07-01 2023-01-10 대한민국(질병관리청장) 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트
KR102578751B1 (ko) 2021-07-01 2023-09-14 대한민국(질병관리청장) 이질아메바와 동형아메바 감별용 프라이머 세트

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180008836A (ko) 2018-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2020449B1 (en) Method for detection and multiple, simultaneous quantification of pathogens by means of real-time polymerase chain reaction
AU659657B2 (en) Mycobacterium primers and probes
JP2009505651A (ja) 微生物および抗生物質耐性マーカーの検出の方法およびそのための核酸オリゴヌクレオチド
JP5851395B2 (ja) 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌の検出方法
EP2078756A1 (en) Detection of bacterium by utilizing dnaj gene and use thereof
CA2972475C (en) Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
EP3802873B1 (en) Method for detecting a single nucleotide polymorphism (snp) using lamp and blocking primers
KR101925768B1 (ko) 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법
KR20170096379A (ko) 장내 기생충 검출용 키트 및 이를 이용한 검출 방법
JP7605829B2 (ja) クレブシエラ属細菌の検出のためのプライマーセット及びプローブ
WO2009087685A2 (en) Method for detection of hepatitis nucleic acid and uses thereof
JP2019062815A (ja) 虫由来ｄｎａの断片を増幅するためのプライマーセット、及び、それを用いた虫種の同定方法
WO2013064834A1 (en) Dengue assay
KR20030077790A (ko) 병원성 미생물의 유전자 증폭용 프라이머, 이를 이용한병원성 미생물의 검출방법, 및 검출키트
Lübeck et al. PCR technology and applications to zoonotic food-borne bacterial pathogens
KR20190134202A (ko) 패혈증-유발 그람 음성균 검출용 mlpa 프로브 및 그 용도
EP1802771B1 (en) Detection, identification and differentiation of serratia species using the spacer region
JP6996075B2 (ja) 食中毒原因菌の迅速検出方法
EP4332220A1 (en) Method for amplifying target gene having specific gc content
KR101336948B1 (ko) 쉬겔라 소네이 검출방법
JP6728657B2 (ja) 核酸増幅法
WO2005081776A2 (en) Materials and methods for the detection of sars
KR20120135992A (ko) 장출혈성 대장균 ｏ157:ｈ7 검출방법
KR101336947B1 (ko) 쉬겔라 플렉스네리 검출방법
JP2007075017A (ja) Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉの検出法

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
PA0107 Divisional application

Comment text: Divisional Application of Patent

Patent event date: 20180112

Patent event code: PA01071R01D

Filing date: 20160216

Application number text: 1020160017693

PA0201 Request for examination
PG1501 Laying open of application
E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20180130

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20180829

PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20181130

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20181130

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20211027

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220921

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20241223

Start annual number: 7

End annual number: 7