JP2006008718A - シクロオキシゲナーゼ活性阻害剤 - Google Patents

Abstract

【課題】副作用が少なく安全性の高い、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）活性を選択的に阻害するＣＯＸ−２活性阻害剤を提供すること。
【解決手段】本発明のＣＯＸ−２活性阻害剤は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する。本発明のＣＯＸ−２活性阻害剤はまた、ＣＯＸ−２が関与する種々の疾患の治療に有用である。本発明のＣＯＸ−２活性阻害剤は、ＣＯＸ−１活性を実質的に阻害しないので、ＣＯＸ−１活性の阻害による副作用が生じる可能性が低く、炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、心血管病などの種々の疾患の治療に非常に有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、シクロオキシゲナーゼ活性阻害剤に関する。より詳細には、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤、およびシクロオキシゲナーゼ−２が関与する疾患の治療剤に関する。

シクロオキシゲナーゼ（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ）は、プロスタグランジンＨ_２を産生するヘム酵素である。このプロスタグランジンＨ_２から、さらにプロスタグランジンＤ_２、Ｅ_２、Ｆ_２、トロンボキサンＡ_２、Ｂ_２などの強い生理活性を有する代謝物が生成する。

シクロオキシゲナーゼには、１型および２型の２種類のアイソザイムがあることが知られている。１型のシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ−１）は、ほとんどの組織や細胞で構成的に発現しており、プロスタグランジン類の内因性基礎放出に関与し、消化管の完全性維持および腎臓血流などの生理機能において重要である。一方、２型であるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）は、通常発現せず、分裂促進物質、エンドトキシン、ホルモン、サイトカイン、成長因子などの多くの物質によって発現誘導され、プロスタグランジン類を急速に合成し放出する。例えば、炎症時におけるプロスタグランジンの産生には、主としてＣＯＸ−２が関与することが明らかとなっている。

非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であるアスピリン、インドメタシンなどに代表される多くのシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２の両酵素を非特異的に阻害し、プロスタグランジン類の生合成を抑制する作用を有するため、プロスタグランジン類が関与する疾病に有効である。しかし、現在使用されているシクロオキシゲナーゼ阻害剤の多くは、消化性潰瘍、めまいなどのＣＯＸ−１の阻害に関連する副作用があり、治療に必要とする使用量と副作用が発現する使用量との間に大きな差がない。したがって、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、通常のＮＳＡＩＤに類似の抗炎症、下熱、および鎮痛特性を有し、ホルモン誘発性の子宮収縮を抑制し、かつ潜在的抗癌作用を有するが、上記のような副作用を起こす恐れは少ないと考えられる。ＣＯＸ−１を阻害せず、ＣＯＸ−２のみを選択的に阻害する化合物が、メロキシカムをはじめとして種々実用化されており、現在もさらに新たな化合物が開発されている（例えば、特許文献１〜４参照）。これらはいずれも化学合成物質であり、より安価かつ安全性の高い天然物由来のＣＯＸ−２選択的阻害剤は、未だ知られていない。

植物由来のシクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、マンゴスチン果皮抽出物中のα−マンゴスチンおよびγ−マンゴスチンが知られている（特許文献５）。カロテノイド（カロチノイド）の一種であるアスタキサンチンが、シクロオキシゲナーゼの発現を阻害すること、およびマクロファージ刺激下でのプロスタグランジンＥ２の濃度を低下させることも報告されている（特許文献６）。しかし、これらは、従来のＮＳＡＩＤと同様に副作用を発現する可能性も懸念される。マメ科ハナモツヤクノキの抽出物がＣＯＸ−２阻害作用を有すると報告されている（特許文献７）。しかし、これらはいずれも、ＣＯＸ−２を選択的に阻害するか否か、あるいはＣＯＸ−１阻害作用があるか否かは不明である。
特開平１０−７７２６６号公報 特開２０００−１３６１８２号公報 特開２００３−１６０５５４号公報 特開２００３−４０８５２号公報 特開２００２−４７１８０号公報 特開２００４−２１０７２５号公報 特開２００５−３５９８１号公報

本発明は、副作用が少なく安全性の高い、ＣＯＸ−２活性を選択的に阻害するＣＯＸ−２活性阻害剤を提供することを目的とする。

本発明は、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤を提供する。

１つの実施態様では、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、シクロオキシゲナーゼ−１活性を実質的に阻害しない。

本発明はまた、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、シクロオキシゲナーゼ−２が関与する疾患の治療剤を提供する。１つの実施態様では、この疾患は、炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、または心血管病である。

本発明によれば、新たなシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤が提供される。このシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、実質的にＣＯＸ−１活性を阻害せずに、ＣＯＸ−２活性のみを阻害する。そのため、ＣＯＸ−２が関与すると考えられる種々の疾患、特に炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、心血管病などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、非常に毒性が低いため、安全性が高く、しかも、ＣＯＸ−１活性阻害による副作用が生じる可能性も低い。

本発明のシクロオキシゲナーゼ活性阻害剤に含まれる、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、以下の式：

（ここで、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、水素原子または脂肪酸残基である）で示されるカロテノイドの一種である。アスタキサンチンのエステルとしては、特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸などの飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ビスホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸のモノエステルまたはジエステルが挙げられる。これらは単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。アスタキサンチンは、β−カロチンの骨格の両端にオキソ基とヒドロキシ基とを余分に有する構造であるため、β−カロチンとは異なり、分子の安定性が低い。これに対し、両端のヒドロキシ基が不飽和脂肪酸などでエステル化されたエステル体（例えば、オキアミ抽出物）はより安定である。

本発明に用いられるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは、化学的に合成されたものであっても、あるいは天然物由来のもののいずれであってもよい。後者の天然物としては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する赤色酵母；ティグリオパス（赤ミジンコ）、オキアミなどの甲殻類の殻；緑藻類などの微細藻類などが挙げられる。本発明においては、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルの特性を利用できるものであれば、どのような方法で生産されたアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する抽出物をも使用することができる。一般的には、これらの天然物からの抽出物が用いられ、抽出エキスの状態であっても、また必要により適宜精製したものであってもよい。本発明においては、このようなアスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する粗抽出物や破砕粉体物、あるいは必要により適宜精製されたもの、化学合成されたものを、単独でまたは適宜組み合わせて用いることができる。体内での安定性を考慮すると、好ましくはエステル体が用いられる。

本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、ＣＯＸ−２が関与する疾患または症状を治療するのに有用であり得る。このような疾患または症状としては、炎症（例えば、アレルギー性結膜炎、虹彩炎、毛様体炎、強膜炎などの炎症性眼疾患；糸球体腎炎、腎孟腎炎、前立腺炎；気管支炎、肺炎；胃腸炎など）、慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、大腸癌などの癌、自己免疫疾患（例えば、ベーチェット病、膠原病など）、生殖系障害（例えば、流産、生理痛など）、アルツハイマー病、虚血性脳障害やインフルエンザ脳症などの脳障害、癌、生活習慣病、動脈硬化などの心血管病などが挙げられる。

本発明のＣＯＸ−２が関与する疾患の治療剤は、上記の本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤と同様に、アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する。特に、炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、または心血管病の治療に有用である。

本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤またはシクロオキシゲナーゼ−２が関与する疾患の治療剤の投与経路は、経口投与または非経口投与のいずれであってもよい。その剤形は、投与経路に応じて適宜選択される。例えば、注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤、経腸栄養剤などが挙げられる。これは、症状に応じてそれぞれ単独でまたは組み合わせて使用することができる。これらの製剤には、必要に応じて、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。

本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤またはシクロオキシゲナーゼ−２が関与する疾患の治療剤の投与量は、投与の目的や投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）に応じて異なる。通常、成人に対して、アスタキサンチンフリー体換算で、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜２ｇ、好ましくは４ｍｇ〜５００ｍｇ、一方、非経口投与の場合、１日あたり０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜５００ｍｇで投与され得る。

本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、上記のような医薬品としてだけでなく、医薬部外品、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物などとして使用することができる。医薬部外品または化粧品として使用する場合、必要に応じて、医薬部外品または化粧品などの技術分野で通常用いられている種々の補助剤とともに使用され得る。あるいは、機能性食品、栄養補助剤、または飲食物として使用する場合、必要に応じて、例えば、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの食品に通常用いられる添加剤とともに使用してもよい。また、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状などの所望の形状で、あるいは必要に応じて成形して使用してもよい。これらに含まれる割合は、特に限定されず、使用目的、使用形態、および使用量に応じて適宜選択することができる。

（調製例１：アスタキサンチンモノエステルの調製）
アスタキサンチンモノエステルを、次のように調製した。ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pulvialis）K0084株を、２５℃にて光照射条件下３％ＣＯ_２を含むガスを通気しながら栄養ストレス（窒素源欠乏）をかけて培養し、シスト化した。シスト化した細胞を、当業者が通常用いる手段によって破砕し、エタノールで油性画分を抽出した。抽出物は、アスタキサンチン類の他に、トリグリセリドなどの脂質を含んでいた。抽出物を、合成樹脂吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィーにかけて、アスタキサンチンのモノエステルを含む精製物を得た。この精製物をＨＰＬＣによって分析し、このアスタキサンチンモノエステル精製物が、分子量８５８のモノエステルを主成分として含み、アスタキサンチンの遊離体およびジエステル体を含まず、わずかにジグリセリドを含んでいることを確認した。

（実施例１：ＣＯＸ−２の活性に及ぼす効果）
上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルについて、ＣＯＸ−２の活性に及ぼす効果を検討した。ＣＯＸ−２として、ヒト組換え昆虫Ｓｆ２１細胞由来のＣＯＸ−２を用いた。アスタキサンチンモノエステルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、以下の表１に示すアッセイ系に２５０、２５、２、および０．２μＭとなるように添加してインキュベートして、阻害率を測定した。

アスタキサンチンモノエステルによる５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）は、１１．４μＭであった。２５０μＭにおける酵素活性の阻害率は９３％であり、そして２５μＭにおける阻害率は６７％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、ＣＯＸ−２活性に対して比較的低い阻害濃度かつ高い阻害率を示した。

（実施例２：ＣＯＸ−１の活性に及ぼす効果）
上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルについて、ＣＯＸ−１の活性に及ぼす効果を検討した。ＣＯＸ−１として、ヒト血小板由来のＣＯＸ−１を用いた。アスタキサンチンモノエステルを、ＤＭＳＯに溶解し、以下の表２に示すアッセイ系に２５０μＭとなるように添加してインキュベートして、阻害率を測定した。

２５０μＭのアスタキサンチンモノエステルによる酵素活性の阻害率は１３％であった。このように、アスタキサンチンモノエステルは、ＣＯＸ−１活性をほぼ阻害しないことがわかった。

（参考例１：ＨＵＶＥＣに対する５０％致死濃度の測定）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７３０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手し、１％Antibiotic-Antimycotic（GIBCO BRL, USA）を添加した１０％ウシ胎児血清含有Endothelial Cell Growth Medium（CELL APPLICATIONS, USA））中、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃にて予備培養した。

Matrigelマトリックス（BD Biosciences, USA）を融解して氷上で４℃にて保持し、そして５０μＬのマトリックスを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに移した。プレートを３７℃にて少なくとも１時間インキュベートして、マトリックス溶液を固化させた。

一方、上記調製例１で得たアスタキサンチンモノエステルを、ＤＭＳＯに溶解し、次いで蒸留水で希釈して、４０(v/v)％ＤＭＳＯ中に25000、2500、250、25、および2.5μＭのアスタキサンチンモノエステルを含むストック試験溶液を調製した。

100μＬのＨＵＶＥＣ懸濁液（約２．５×１０^３細胞／ウェル）を、５％ＣＯ_２雰囲気下３７℃にて９６ウェルのMatrigelプレートに入れた。２４時間後、100μＬの増殖培地および上記の各ストック試験溶液またはベヒクル（４０(v/v)％ＤＭＳＯ）２μＬずつを、各２つのウェルに添加し、さらに７２時間インキュベートした。ＤＭＳＯおよびアスタキサンチンモノエステルの最終濃度は、250、25、2.5、0.25、および0.025μＭであった。

インキュベーション終了後、20μＬの90％alamarBlue試薬を個々のウェルに添加し、さらに６時間インキュベートした。次いで、各ウェルの蛍光強度を、Spectrafluor Plusプレートリーダーを用いて、励起波長530nmおよび発光波長590nmにて測定し、生存細胞数を計数した。これは、生存細胞が、alamarBlueを非蛍光性の酸化型（青）から蛍光性の還元型（赤）に変化させる能力に基づく。なお、５０％致死濃度は、実験開始時の細胞数の５０％になる濃度を算出した。

この結果、ＨＵＶＥＣに対するアスタキサンチンモノエステルの５０％致死濃度（ＬＣ_５０）は２５０μＭ（ＤＭＳＯへの最大溶解濃度）以上であり、毒性が低いことがわかった。

本発明によれば、新たなシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤が提供される。これは、実質的にＣＯＸ−１活性を阻害せずに、ＣＯＸ−２活性のみを阻害する。そのため、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、ＣＯＸ−１活性阻害による副作用が生じる可能性が低い。したがって、このシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤は、シクロオキシゲナーゼ−２が関与すると考えられる炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、心血管病などの種々の疾患の治療剤として用いられ得る。本発明のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤に含まれるアスタキサンチンおよび／またはそのエステルは食経験が長く、非常に毒性が低いため、安全性が極めて高い。したがって、医薬品として使用されるだけでなく、健康食品などとして日常的に用いられ得る。

Claims (4)

1. アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、シクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤。
2. シクロオキシゲナーゼ−１活性を実質的に阻害しない、請求項１に記載のシクロオキシゲナーゼ−２活性阻害剤。
3. アスタキサンチンおよび／またはそのエステルを含有する、シクロオキシゲナーゼ−２が関与する疾患の治療剤。
4. 前記疾患が、炎症性疾患、アレルギー性疾患、血栓症、脳障害、癌、生活習慣病、または心血管病である、請求項３に記載の治療剤。