JP2005520492A - 接合子嚢を生成するための改良方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、接合子嚢を生成するための改良された方法および組成物を提供する。本発明によって生成された接合子嚢は、ワクチンの製造において用途を見出す。好ましい実施形態において、本発明は、アイメリア接合子嚢の生成のための方法および組成物を提供する。本発明によって生成した、アイメリアの接合子嚢、スポロシスト、および／またはスポロゾイトを含有するワクチンは、インオボ（卵内）、または孵化後のいずれかに、コクシジウム症に対して鳥類を免疫するために用いることができる。

Description

［関連出願の情報］
本出願は、２００１年８月３０日提出の米国仮出願第６０／３１６，３１０号（参照することにより本明細書においてその全体を組み込む）の利益を請求する。

［発明の分野］
本発明は、原生動物からの接合子嚢の生成のための方法および組成物を提供する。詳細には、本発明は、アイメリア接合子嚢の生成のための方法および組成物を提供する。

家禽のコクシジウム症は、アイメリア(Ｅｉｍｅｒｉａ）属の寄生原生動物によって生じる疾患である。アイメリア種の接合子嚢は、環境中に偏在し、そして家禽の同腹雛において何ヶ月も存続する。接合子嚢の摂取によって、種特異的な様式で、腸管の種々の領域の感染がもたらされる。この生物は、数日間にわたって腸で増殖し、その結果、糞便中における接合子嚢の次の世代の排出を生じる。複数のサイクルの感染によって、免疫が得られ、そして感染が、ある集団に対して早期に、そしてその集団内で均一の投与量で提示される場合、数回のサイクルの曝露にわたって発達された免疫は、かなり強力であり得る。

対照的に、鳥類が、一様な様式で感染を示さない場合、未感作の鳥類が、突然の大量の感染に供されるという状況が生じ得、これによって飼料転換、および体重増加に関して、能力が劣り、高リスクの二次感染が生じる。現在、家禽産業におけるコクシジウム症の管理のために用いられる最も一般的な方法は、飼料中の抗コクシジウム薬の投与ではなく、ワクチン接種である。ワクチン摂取の率が低いことは、しばしば、飼育施設での飼料もしくは水を介した、または孵化場での噴霧キャビネットワクチン接種による（これらは、投与の伝統的な経路および時点である）、投与用量の均一性の不確実性に起因する。孵化場での投与の間の送達の均一性を改善することはますます注目されている。

近年、インオボ（ｉｎ ｏｖｏ）のワクチン接種技術は、接合子嚢ベースのコクシジウム症生ワクチンの投与に適切であることが見出されている（ＷＯ９６／４０２３４、およびＷＯ９６／４０２３３；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）。投与のインオボ経路によって、各々の胚に対して均一な用量のワクチンを送達する、簡便な方法（そのワクチンは、その卵内でそのまま存在する）が提供される。インオボにおける鳥類のワクチンの送達は、毎年米国で生産される９０億羽のブロイラーの約８５％について現在実施されており、そして毎年米国以外で生産される２１０億羽のブロイラーでも実施されている割合は増加している（例えば、米国特許第４，４５８、６３０号を参照のこと）。従って、インオボ送達のコクシジウム症生ワクチンについての潜在的な市場は、孵化後に送達されるコクシジウム症ワクチンの現在の市場よりもかなり大きい。

コクシジウム症生ワクチンにおける使用のための接合子嚢は、ニワトリの糞便（混入する微生物を最初にかなりの量含んでいる）に由来する。該して、インオボで送達されるワクチンは、本質的に微生物で汚染されていないことが示されるように、監督官庁は要求する。最終製品においては、生体負荷レベルが、完全に最小化されるということを最も完全に保証するため、接合子嚢生成プロセスの各々の段階（収集プロセス、および胞子形成プロセス、ならびに消毒プロセスを含む）で、混入する微生物のレベルを効果的に制御する、組成物および方法論を使用することが有利である。

ワクチン製造のために接合子嚢を生成する現在の方法は、バイオハザードであるか、または設備に対して腐食性である材料を頻繁に利用するという点で、欠点を被るかもしれない。

従って、当分野においては、特にワクチン製造における使用のために、原生動物から接合子嚢を生成する改良方法が必要である。

本発明は、例えば、ワクチンの製造における使用のための、原生動物（例えば、アイメリア）接合子嚢を生成するための改良された方法、および組成物に関する。特に家禽のワクチンに関して、本発明は、孵化後、またはインオボ使用のためのワクチンを生成するために適切である。同様に、このワクチンは、ブロイラー、産卵、畜産家、シチメンチョウ、愛好家、および／または家庭用の鳥類の産業において用いることができる。

従って、第一の態様において、本発明は、過酸化化合物（ｐｅｒｏｘｙｇｅｎ）および有機酸を含む接合子嚢の生成のための組成物であって、酸性のｐＨを有する組成物を提供する。この組成物は、原生動物の接合子嚢の収集、胞子形成、および／または消毒のために用いることができる。

従って、さらなる態様として、本発明は、（ａ）その糞便中に該原生動物由来の接合子嚢を放出している、原生動物に感染した動物を提供するステップと、（ｂ）該感染した動物由来の接合子嚢を含む糞便と、過酸化化合物および有機酸を含む組成物とを接触させるステップとを含む、動物の糞便中における原生動物の接合子嚢を収集する方法を提供する。

前述の詳細な実施形態において、過酸化化合物、または有機酸のいずれかは、詳細には、収集培地として用いられる場合、この組成物から省略される。

なおさらなる態様において、本発明は、（ａ）原生動物の接合子嚢を含む組成物を提供するステップと、（ｂ）胞子形成に適した時間、および条件下で、過酸化化合物および有機酸を含む組成物において接合子嚢に胞子形成させるステップとを含む、原生動物の接合子嚢に胞子形成させる方法を提供する。

なおさらなる態様において、本発明は、（ａ）原生動物の接合子嚢を含む調製物を提供するステップと、（ｂ）該調製物の消毒の所望のレベルを達成するのに十分な時間、および条件下で、過酸化化合物および有機酸を含む組成物においてこの接合子嚢を消毒するステップとを含む、原生動物の接合子嚢を消毒する方法を提供する。

なお別の態様として、本発明は、原生動物の接合子嚢を浄化するための浮遊培地であって、高密度、非イオン性溶液、およびポリカチオンを含む、浮遊培地を提供する。他の実施形態において、本発明は、原生動物の接合子嚢を浄化するための浮遊培地であって、高密度、非イオン性溶液およびオイルを含む浮遊培地を提供する。

本発明はまた、（ａ）上記のような浮遊培地と、原生動物の多数の接合子嚢との間の懸濁物を形成するステップと、（ｂ）この懸濁物を分離させるステップと、（ｃ）この分離した懸濁物から原生動物の接合子嚢を回収するステップとを含む、浮遊によって原生動物の接合子嚢を浄化する方法を提供する。

本発明の前述の態様の特定の実施形態において、原生動物は、アイメリア属の種を含み、動物被験体は鳥類である。

なおさらなる別の態様として、本発明は、（ａ）原生動物から接合子嚢が、感染された鳥類の被験体の糞便中に放出されるのに十分な時間、この原生動物により鳥類被験体を感染させるステップと、（ｂ）この感染した鳥類被験体由来の接合子嚢を含む糞便を収集するステップと、（ｃ）感染した鳥類被験体に対して、この収集ステップの前、および少なくとも一部の間に、少なくとも約１日間、平均粒子サイズの大きい食餌を給餌するステップとを含む、トリの被験体から原生動物の接合子嚢を生成する方法を提供する。特定の実施形態において、この原生動物は、アイメリア属由来の種を含む。

本発明の前述の態様および他の態様は、以下に記載される詳細な説明において、さらに詳細に説明される。

本発明は、本発明の好ましい実施形態に関して、ここで記載される。しかし、本発明は、異なる形態で実現されてもよく、そして本明細書に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が詳細かつ完全となり、当業者に対して本発明の範囲を完全に伝達するように提供されるものである。

他に規定されない限り、本明細書において用いられる、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載するだけの目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。

本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の引用文献は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。

本明細書における本発明の詳細な説明において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的であり、本発明を限定することを意図しない。本発明の詳細な説明および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」とは、文脈が、明白に他を示さない限り、複数形も同様に包含することを意図する。

本発明は、医療的用途および獣医学の用途の両方に適切である。「動物（ａｎｉｍａｌ）」、および「動物被験体（ａｎｉｍａｌ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」という用語は、哺乳動物、およびトリ被験体（好ましくはトリ被験体）を包含するが、それらに限定されない。

適切な哺乳動物被験体としては、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジ、イヌ、マウス、およびウサギ／アナウサギ（ｌａｇａｍｏｒｐｈ）の被験体が挙げられるがこれらに限定されない。

「トリの（ａｖｉａｎ）」、および「トリの被験体（ａｖｉａｎ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」、または「鳥類（ｂｉｒｄ）」、および「鳥類の被験体（ｂｉｒｄ ｓｕｂｊｅｃｔｓ）」という用語は、本明細書において用いる場合、任意のトリまたは鳥類の種の雄および雌を含むことを意図するが、卵、肉のために、またはペットとして市販されている家禽を包含することが主に意図される。従って、「トリの」、および「トリの被験体」、または「鳥類」、および「鳥類の被験体」という用語は、詳細には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、ボタンインコ、オカメインコ、ダチョウ、エミューなどを包含することが意図される。ニワトリおよびシチメンチョウは、好ましいトリまたは鳥類の被験体であり、ニワトリが最も好ましい。

本発明は一般に、原生動物から接合子嚢を生成するための方法および組成物に関する。このような方法および組成物は、例えば、ワクチンを製造する方法において用途を見出す。多くの原生動物が、「接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ）」と命名されるライフステージを形づくる。本発明を実施して、任意の種類の原生動物（アイメリア、クリプトスポリジウム、トキソプラズマ、プラスモディウム、およびイソスポラを含むがこれらに限定されない）から接合子嚢を生成することができる。本発明の実施形態において、本発明を用いて、アイメリアの接合子嚢を生成する。

「原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）」、「接合子嚢（ｏｏｃｙｓｔ）」、「スポロシスト（ｓｐｏｒｏｃｙｓｔ）」、「スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）」、および「メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）」という用語は、当分野において、それの許容される意味を有する。他に示されない限り、これらの用語は、生の（生きた）原生動物、接合子嚢、スポロシスト、スポロゾイト、およびメロゾイトをいうことが意図されるが、このワクチンは、不活化（または弱毒化）された原生動物、接合子嚢、スポロシスト、スポロゾイト、およびメロゾイトを用いて処方されてもよいことを当業者は理解する。

「アイメリア」という用語は、アイメリア属の１つ以上の種を意味する。このようなアイメリア種としては、ニワトリにおいて見出されているもの（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉを含む）、ならびにシチメンチョウにおいて見出されているもの（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ、およびＥ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａを含む）が挙げられる。「アイメリア」という用語は、他の鳥類、または哺乳動物の種に感染する、アイメリアの株、または種を含む。さらに、「アイメリア」という用語は、アイメリアの前述の種の全ての株（野生型株、早熟性株、またはその他の選択された株、弱毒化株が挙げられるがこれらに限定されない）、ならびに接合子嚢（例えば、放射線、化学処理などによって弱毒化された）を含む。さらに、「アイメリア」という用語はまた、アイメリアの任意の新しく開発された株または種を包含する。最終的に、「アイメリア」という用語は、生の（生きた）アイメリア、および不活化（殺傷）されたアイメリアを包含するが、他に示されない限り、生の（生きた）アイメリアが意図される。

アイメリア接合子嚢を含む組成物は、コクシジウム症に対して鳥類を免疫する方法において用途を見出す。コクシジウム症に対する鳥類の免疫の方法は、当分野で公知であり、これには、インオボのワクチン接種方法（例えば、国際特許公報ＷＯ９６／４０２３４、およびＷＯ９６／４０２３３；Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）、および孵化後のワクチン接種方法（例えば、Ｅｄｇａｒに付与された米国特許第３，１４７、１８６号；ＭｃＤｏｎａｌｄらに付与された米国特許第５，０５５、２９２号、およびＳｈｉｒｌｅｙらに付与された米国特許第４，４３８，０９７号）が挙げられる。

最終ワクチン組成物における使用のための他のライフステージ（例えば、スポロゾイト、またはスポロシスト）を放出するために、またはワクチン接種目的のためにプロトゾアのタンパク質を生成するために、接合子嚢がさらに処理されてもよいということが、当業者に理解される。

同様に、「プロトゾア」という用語は、野生型株、早熟株、またはその他の選択された株、弱毒化株、および例えば、放射線、化学的処理などによって弱毒化された接合子嚢を包含する。さらに、「プロトゾア」という用語はまた、プロトゾアの任意の新しく発見された株、または種を含む。最終的に、「プロトゾア」という用語は、生の（生きた）プロトゾア、および不活化（殺傷）されたプロトゾアの両方を包含するが、他に示されない限り、生の（生きた）プロトゾアが意図される。

接合子嚢の「生成する（ｐｒｏｄｕｃｅ）」、「生成する（ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、または「生成（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」などという用語は、動物（例えば、鳥類）を感染させるステップ、およびそれから接合子嚢を含む糞便を収集するステップ、接合子嚢を胞子形成するステップ、浄化するステップ、および／または消毒するステップなどを包含する。従って、「生成する」、「生成する」、または「生成」という用語は、動物から接合子嚢を回収して糞便材料から接合子嚢を浄化するプロセスの全体、またはこのプロセスにおける個々のステップ（またはステップのサブセット）をいう。

他に示さない限り、「浄化する（ｐｕｒｉｆｙ（ｉｅｓ））」、「浄化（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「浄化ステップ（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」、および「浄化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」という用語は、接合子嚢の調製に関して、本明細書において用いる場合、接合子嚢を含有する調製物からの砕片、および他の望ましくない物質からの分離、またはその物質の除去をいう。これらの用語は、糞便中に存在する他の物質からの接合子嚢の浄化または分離の程度が、強化されることを意図するのであって、無関係の物質の絶対的に全部が、接合子嚢調製物から除去されることを意図するのではない。同様に、接合子嚢調製物は、最終調製物が、意図される用途（例えば、ワクチンとして）に適切である限り、ある程度の微生物汚染を含んでもよい。鳥類に対するインオボ投与について意図されるワクチンの場合、特定の実施形態では、この調製物は、微生物による検出可能な汚染、詳細には、胚に対して病原性である（すなわち、重大な病気または死亡を生じる）微生物を実質的に含まない。

文脈によっては、「浄化（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」プロセスとは、ワクチン接種プロセスに適切な調製物を生成するために、糞便から接合子嚢を浄化する全体的プロセスをいうかもしれない。あるいは、「浄化」プロセスとは、浄化スキーム全体の中の、ステップの任意のサブセット、または単一のステップをさえいう可能性がある。

本発明は、接合子嚢（例えば、アイメリア接合子嚢）を生成するための方法および組成物を提供する。生成される接合子嚢は、概して、ワクチン接種における使用のための免疫原性組成物の製造のために十分な感染力、生存度、および純度の接合子嚢である。本発明の方法および組成物は、当分野で公知の他の方法と一致して用いられてもよい。同様に、本発明の種々の方法および組成物は、単一で、またはお互いに組み合わせて用いられてもよい。

接合子嚢（例えば、アイメリア接合子嚢）を生成する方法は、当分野で公知である（例えば、Ｅｄｇａｒに付与された米国特許第３，１４７、１８６号；Ｄａｖｉｓらに付与された米国特許第４，５４４、５４８号、および同第４，８６３、７３１号、国際特許公報ＷＯ００／５００７２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、および国際特許公報ＷＯ０２／３７９６１（Ｎｏｖｕｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｍｍｏｎｄら（１９４４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５：７０；Ｈｉｌｌら、（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：３５７；Ｊａｃｋｓｏｎ、（１９６４）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５４：８７；Ｌｏｔｚｅら、（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：５８８；Ｓｃｈｍａｔｚら、（１９８４）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３１：１８１；Ｗｈｉｔｌｏｃｋ、（１９５９）Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．３５：３１０を参照のこと）。概して、これらの方法は、目的の原生動物を用いて動物を感染させるステップ、この感染した動物から接合子嚢を含む糞便を収集するステップ、ふるい分け、遠心分離、濾過、および／または密度浮遊のような一連の分離手順によって糞便材料から接合子嚢を浄化するステップ、接合子嚢を胞子形成するステップ、任意のさらなる分離ステップ、および、必要に応じて、胞子形成した接合子嚢を消毒して、混入している微生物（細菌、粘菌、真菌、酵母、およびウイルスを含む）を不活性化するステップを包含する。異なる接合子嚢調製物（例えば、異なる種または株由来）を組み合わせて、最終産物、例えば、複数の原生動物（例えば、アイメリア）種に対するワクチンを形成してもよい。

「微生物汚染（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）」、または「微生物による汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、検出可能であり、かつ望ましくない視認できる微生物（細菌、粘菌、真菌、酵母、およびウイルスが挙げられるがそれらに限定されない）の存在を示すことが意図される。詳細な実施形態では、接合子嚢調製物は、本質的に検出可能な微生物汚染を含まず、このことは、この調製物中で、有意なレベルの微生物汚染が検出されないことを意味する。

「ｖ／ｖ」という略号は、「容積／容積（ｖｏｌｕｍｅ／ｖｏｌｕｍｅ）」をいう。同様に、「ｗ／ｖ」という略号は、「重量／容積（ｗｅｉｇｈｔ／ｖｏｌｕｍｅ）」をいう。

本発明の個々の態様は、以下により詳細に記載される。

［免疫原性組成物］
本発明の方法を用いて生成された免疫原性組成物は、原虫感染症（原生動物による疾患）に対してワクチン接種するために動物被験体に対して投与されてもよい。本発明の方法を用いて生成された接合子嚢を含む、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）は、免疫原性応答を誘発するために投与されてもよい。代表的には、免疫原性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、本明細書において開示されるような免疫原性の量の接合子嚢を含む。「免疫原性の量（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｏｕｎｔ）」とは、この免疫原性組成物が投与される被験体において、免疫応答を開始または惹起するのに十分な接合子嚢の量である。当業者によって理解されるとおり、免疫原性組成物は、生の（生きた）、弱毒化された、および／または不活化（殺傷）された生物体を用いて処方され得る。インオボで送達されたコクシジウム症生ワクチンの場合、接合子嚢の量は、一般に、比較的低レベルの最初の感染を生じるのに十分であり、この後に、再循環による、複数回の再感染が続き、最終的に免疫が得られる。前述の考察は、接合子嚢に関するものであるが、スポロゾイトまたはスポロシストのような他の生物形態にもあてはまる。

「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」とは、生物学的にもその他でも望ましくないことがない材料を意味する。すなわち、この材料は、なんら所望されない生物学的効果を有さずに被験体に投与され得る。従って、このような薬学的組成物は、例えば、免疫用の組成物を調製するために、投与されてもよい。生理学的に、かつ薬学的に受容可能なキャリアとしては、当分野で公知のとおり、安定化剤、塩、緩衝液、アジュバント、および／または防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤、および／または抗ウイルス剤）を含むがこれに限定されない、他の化合物を挙げることができる。薬学的に受容可能なキャリアは、滅菌される必要はないが、これは、一般に、トリの胚に対するインオボ投与についてである。

原生動物に対する能動免疫応答（好ましくは、防御的な免疫応答）が惹起される限り、当分野で公知の免疫原性組成物の投与の任意の経路が、使用されてもよい。被験体が鳥類である場合、この免疫原性組成物は、インオボで、または孵化後に投与されてもよい。投与の例示的な経路は、孵化後経口投与であるか、または羊膜へのインオボ注射である。本発明の特定の実施形態において、自動化された注射装置を用いるインオボ投与が使用される。

「ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」、または「免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」という用語は、当分野で十分理解される。例えば、ワクチン接種または免疫という用語は、抗原に対する被験体の免疫反応、従って、感染に抵抗するか感染を克服する能力を増大するプロセスであることが理解できる。アイメリアに対する鳥類のワクチン接種のインオボ方法は、当分野で公知である（例えば、国際特許公報ＷＯ９６／４０２３４、およびＷＯ９６ ４０２３３；Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）。

「防御的免疫（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、または「防御的免疫応答（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、宿主動物が、引き続く曝露またはチャレンジの際に、その感染と戦うことができるように、その動物が、ワクチンに対する能動免疫応答を惹起する手段であることが意図される。従って、防御的な免疫応答は、処置された動物の間で、病原体に対して、その後の曝露による罹患率および死亡率の頻度を低下させる。商業的な畜産業の状況において、防御的免疫応答の生成は、全体としての集団または群れに対するワクチン接種の効果を増強することによって評価され得るということを、当業者は理解する（例えば、ワクチン接種された少数の動物において、病気の兆候、または罹患率および死亡率が依然として存在し得る）。

「能動免疫応答（ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、この防御が、部分的であるか完全であるかにかかわらず、原生動物または原生動物抗原に対する引き続く曝露からの任意のレベルの防御であって、被験体のある集団において、死亡率の低下、病変の減少、食餌転換率の改善、または疾患の任意の他の有害な影響の減少などのいずれの形態であっても、ある程度の利益である、防御を意味する。「能動免疫応答」、または「能動免疫（ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」とは、免疫源と遭遇した後の宿主の組織および細胞の関与によって特徴付けられる。これは、抗体の合成、もしくは細胞媒介性反応の発達、またはその両方をもたらす、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖に関与する（Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ編、１９８５））。言い換えると、能動免疫応答は、感染によって免疫源に曝された後に、またはこの場合のようにワクチン接種によって、宿主により惹起される。能動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への予め成形された物質（抗体、伝達因子、胸腺移植、インターロイキン２）の移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆａｃｔｏｒ、ｔｈｙｍｉｃ ｇｒａｆｔ、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）ｆｒｏｍ ａｎ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｈｏｓｔ ｔｏ ａ ｎｏｎ−ｉｍｍｕｎｅ ｈｏｓｔ）」（同書）を通じて獲得される、受動免疫と対比することができる。

［接合子嚢の収集および胞子形成］
接合子嚢は、代表的には、感染した動物由来の糞便において収集され、次いで感染性を得る前に酸素の存在下で胞子形成される。多くの従来の方法によれば、接合子嚢は、２．５％の重クロム酸カリウムを含有する溶液中で収集されて、胞子形成される。重クロム酸カリウムは、抗菌溶液として、および接合子嚢の胞子形成のための酸素供給源として作用する。しかし、重クロム酸カリウムは、有害な物質であって、有害な廃棄物として特別な廃棄方法を必要とする。従来の方法によれば、重クロム酸カリウムは、この有害な化合物を本質的に含まない最終製品を生成するために、接合子嚢の調製物から取り出される。

先行技術の方法によれば、接合子嚢を含有する糞便は、各々の種についてのピークアウト期間（例えば、アイメリア種については、接種後、約３、４、または５日〜約６〜９日）の間に、乾燥して収集されてもよいし、または重クロム酸カリウムを含む液体培地中で収集されてもよい。次いで、収集期間の後に、ふるい分け、または密度浮遊のような技術を用いて、この接合子嚢を、糞便破片からの最初の分離に供して、次いで新鮮な重クロム酸カリウム培地に入れ、撹拌して、４８〜７２時間通気して、胞子形成プロセスを強化する。

Ｅｄｇａｒに付与された米国特許第３，１４７，１８６号において、胞子形成培地として、１％〜４％の重クロム酸カリウムを用いるアイメリア接合子嚢の胞子形成が記載されている。この特許は、「この化合物は、抗菌剤、抗真菌剤、および抗ウイルス剤として働くという、そしてまた胞子形成の間および後に接合子嚢に酸素を供給してその生存度を保持するという、いくつかの目的を果たす（ｔｈｉｓ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｓｅｒｖｅｓ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｕｒｐｏｓｅｓ ｏｆ ａｃｔｉｎｇ ａｓ ａｎ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ、ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ、ａｎｄ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｏｆ ａｌｓｏ ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ ｏｘｙｇｅｎ ｔｏ ｔｈｅ ｏｏｃｙｓｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｓｏ ａｓ ｔｏ ｈｅｌｐ ｐｒｅｓｅｒｖｅ ｔｈｅｉｒ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）」（第１１列、４７〜５０行）と述べている。

Ｒｙｌｅｙら（（１９７６）Ｐａｒｉｓｉｔｏｌｏｇｙ ７３（３）：３１１−３２６）は、収集、胞子形成、および長期保管培地としての２．５％重クロム酸カリウム溶液の使用を開示している。

Ｃｏｓｔ ８９／８２０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｃｋｅｒｔ、Ｊ．，Ｒ．Ｂｒａｕｎ，Ｍ．Ｗ．Ｓｈｉｒｌｅｙ、ａｎｄ Ｐ．Ｃｏｕｄｅｒｔ、ｅｄｉｔｏｒｓ．１９９５．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ−Ｇｅｎｅｒａｌ ＸＩＩ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ．ｐ．８．もまた、接合子嚢生成における２．５％重クロム酸カリウムの使用を記載している。

本発明は、接合子嚢を収集するための培地を提供する。この収集培地は、過酸化化合物、および有機酸を含む。この収集培地は、好ましくは、望ましくない微生物の増殖を制御するために、酸性ｐＨ（例えば、約ｐＨ７、６、５、４、または３未満）を含んでもよく、そして他の抗菌化合物も同様に含んでもよい。特定の実施形態においては、この収集培地のｐＨは、約ｐＨ１〜約ｐＨ３の範囲である。

接合子嚢は、感染した動物由来の糞便、盲腸の中心、小腸の裏打ちなどから収集され得る。しかし、市販の目的のためには、接合子嚢は、代表的には糞便中で収集される。糞便は、この収集培地と接触され、この培地は、１つ以上の目的で働くことができる。例えば、この培地は、抗菌特性（例えば、抗細菌、抗真菌、抗ウイルスなど）を有してもよく、そして／または酸素を提供して、接合子嚢の生存度を維持してもよい。収集培地における酸素はまた、収集期間の間に胞子形成を誘導することができ、そして別々の胞子形成段階を短縮するか排除することさえできる。

本発明の収集培地における糞便または接合子嚢の「収集（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ、またはｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ）」とは、この糞便／接合子嚢が、この収集培地中に直接、収集されることは必要としない。この糞便／接合子嚢は、「乾燥して」収集されて、次いで本発明の収集培地に移されてもよい。本発明の実施形態において、糞便／接合子嚢は、糞便生成後、約０．２５時間内、０．５時間内、１時間内、２時間内、４時間内、１２時間内、２４時間内、３６時間内または４８時間内に本発明の収集培地に移される。例示的実施形態において、接合子嚢を含有する糞便は、移動ベルト、または傾斜表面に捕捉されて、次いで本発明の収集培地を含有する収集容器に移される。糞便は、この収集容器への移入の間に（すなわち、コンベヤーベルト、または傾斜した表面上で）収集培地を噴霧されてもよい。

収集培地に対する糞便の比は、微生物の増殖を制御するのに、そして（所望の場合）胞子形成プロセスを開始するのに十分でさえあれば、重要ではない。収集培地に対する糞便の例示的な比は、約１：０．２５、約１：０．５、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、または約１：１０（ｖ／ｖ）である。

当分野で公知の任意の過酸化化合物は、この収集培地中で用いられてもよい。例示的な化合物としては、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム（例えば、一水和物型、または四水和物型）、過炭酸ナトリウム、過酸化マグネシウム、過酸化カルシウム、過酸化亜鉛、過酸化尿素、およびそれらの組み合わせが挙げられる。過酸化化合物は、四アセチレンジアミン（ＴＡＥＤ）のような活性化因子の有無において用いることができる。ＴＡＥＤは代表的に、約１〜３％の濃度で用いられる。

過酸化化合物は、意図される効果（例えば、抗菌作用、および／または胞子形成）を達成するのに十分であるが、接合子嚢に対して過度の障害を生じるには不十分な濃度で、収集培地に含まれる。過酸化化合物の濃度は、約０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％または１％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）程度低くても、そして約０．５％，１％、３％、５％、１０％、１５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）程度高くても、それ以上でもよい。過酸化化合物が、過酸化水素である場合、この培地中の濃度は、代表的には、約０．１％、０．２５％、または０．５％（ｖ／ｖ）〜約１％、３％、または０．５％（ｖ／ｖ）である。

有機酸は、当分野で公知の任意の有機酸であってもよい。これには、クエン酸、酢酸、プロピオン酸、または任意の他の一酢酸、もしくは多価酢酸、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。この培地中の有機酸の濃度は、約０．１％、０．５％，１％、２％、３％、５％、８％、もしくは１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、またはそれ以上であってもよい。この有機酸の濃度はさらに、約２５％、２０％、１５％、１２％、１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、またはそれ以下であってもよい。特定の実施形態において、この有機酸は、約１〜１５％、または約３〜１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）の濃度で含まれる。

他の特定の実施形態において、過酸化化合物に加えて、この組成物は、約１％〜約２０％、または約２．５％〜約１０％、または１５％のクエン酸、および約０．０５％〜約１％、または約０．１％〜約０．５％のプロピオン酸を含む。

この収集培地はさらに、他の成分を含んでもよく、この成分としては、緩衝液、塩、抗菌剤などが挙げられる。本発明の特定の実施形態において、消泡剤が含まれる。消泡剤は、接合子嚢の発泡および凝集を軽減するために有利に用いることができる。

当分野で理解されるとおり、有機酸は、比較的高価であるかもしれない。従って、特定の実施形態においては、有機酸は収集培地から省略されるかもしれない。

同様に、収集段階で過酸化化合物の使用を回避することが所望され得る特定の状況がある。従って、本発明の特定の実施形態においては、過酸化化合物が、収集培地から省略される。

特定の実施形態において、過酸化化合物、および／または有機酸は、重クロム酸カリウムを含有する、より古典的な収集培地、または胞子形成培地と組み合わせて、用いられてもよい。他の特定の実施形態において、本発明の収集培地および胞子形成培地は、重クロム酸カリウムを含まず、そして重クロム酸カリウムを含有する培地よりも、使用が安全であって、廃棄も簡単であるかもしれない。

過酸化化合物、および有機酸（各々が、上記のような）を含む本発明の過酸化培地は、あるいは、またはさらに、胞子形成培地として用いられてもよい。本発明者らは、過酸化培地が、収集培地として用いられる場合、大きな割合のアイメリア接合子嚢が、この収集期間の間に胞子形成されることを見出した。特定の実施形態において、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５、９８％、またはそれ以上の接合子嚢が、収集期間の間に（すなわち、任意の浄化ステップの前に）胞子形成される。

いくつかの実施形態において、この過酸化培地は、胞子形成プロセスを完了するために、別々の胞子形成ステップにおいて、胞子形成培地として用いられる。さらに、本発明の収集培地が、使用されない場合（例えば、重クロム酸カリウム収集培地が用いられる場合）、接合子嚢の調製物の十分な胞子形成を達成するために、指定された胞子形成ステップが実施される可能性が高い。

従って、特定の実施形態において、本発明は、接合子嚢を含む組成物を提供するステップ、および胞子形成に適切な時間および条件下で、本発明の胞子形成培地において接合子嚢を胞子形成するステップを包含する、接合子嚢（例えば、アイメリア接合子嚢）を胞子形成する方法を提供する。

収集期間の後に胞子形成を実行するのにおいて、糞便は代表的に、動物から収集され、次いで、必要に応じて、ふるい分け、濾過、などの浄化ステップに供される。次いで、接合子嚢は、胞子形成培地に移されて、胞子形成は、一般に、適切な条件下で、約２４〜９６時間（例えば、４８〜７２時間）進行させられる。例えば、溶液は、胞子形成プロセスの間、撹拌されても、かき混ぜられてもよく、そして通気されてもよい。

過酸化培地は、収集プロセスと胞子形成プロセスとの間で変化される必要は無いが、市販の製造プロセスについては、通常、１つ以上の介在する浄化ステップがあり、そして新鮮な胞子形成培地が、胞子形成ステップの前に添加される。

他の実施形態において、この胞子形成プロセスは、収集プロセス、および／または消毒プロセス（下記）と同時に実行される。

収集培地に対する固体の比は、所望のレベルの胞子形成を達成するのに、そして微生物の増殖を制御するのに、十分でさえあれば、重要ではない。収集培地に対する糞便の例示的な比は、約１：０．２５、約１：０．５、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、または約１：１０（ｖ／ｖ）である。

例えば、１つの例示的実施形態において、接合子嚢を含有する糞便は、本発明の収集培地／胞子形成培地において収集される。接合子嚢は、ふるい分け、密度浮遊、および／または濾過技術を用いて、糞便材料から浄化される。次いで、この接合子嚢は、遠心分離によってペレットにされて、新鮮な収集培地／胞子形成培地中に再懸濁され、そして適切な条件（例えば、撹拌、および／または通気）下で、胞子形成が、約４８〜７２時間進行される。

次いで、胞子形成された原生動物は、必要に応じて、さらなる浄化手順、および／または消毒（以下に記載）に供されてもよい。

本発明の培地の、収集培地、および／または胞子形成培地としての使用は、接合子嚢を乾燥から防ぎ、収集期間の開始からの汚染微生物数を減じ、高い胞子形成率を得ることができ、そして重クロム酸カリウムを含有する従来の培地よりも容易に廃棄できるという点で有利であり得る。

胞子形成後、例えば、酵素処理、透析、および／または濾過を用いて、過酸化化合物を除去するためのステップをとってもよい。例えば、過酸化化合物は、触媒性分解（例えば、酵素処理、または二酸化マンガンを用いるような化学的処理）、透析、および／または濾過を用いて除去されてもよい。過酸化水素の場合、残留する過酸化水素を減少させるか、または除去するためにはカタラーゼが用いられ得る。

［接合子嚢の消毒］
消毒ステップは、インオボワクチンのための接合子嚢を生成する方法において代表的に使用される、選択的ステップであり、時には、孵化後ワクチンのためにも同様に使用される。当分野で公知のように、ワクチン調製における使用のための接合子嚢は、次亜塩素酸ナトリウム溶液を用いて従来消毒されているが、これは接合子嚢壁に障害を与え、接合子嚢の構造を弱めて、この消毒された接合子嚢の長期生存度を貯蔵の間に低下させる可能性がある。

Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ、Ｊ．Ｍ．（（１９６９）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５５（２）：４１２〜４１７）は、次亜塩素酸培地を用いる滅菌接合子嚢の生成を記載している。

Ｊａｃｋｓｏｎ、Ａ．Ｒ．Ｂ．（（１９６４）Ｐａｒｉｓｉｔｏｌｏｇｙ ５４：８７−９３）はまた、消毒培地として次亜塩素酸を用いる、生存可能なコクシジウム症スポロゾイトの浄化を記載している。

Ｎｙｂｅｒｇ、およびＫｎａｐｐ（（１９７０）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ３７：３２〜３６）は、電子顕微鏡によって示されるようなＥｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａの接合子嚢の壁に対する次亜塩素酸ナトリウムの影響を記載している。

本発明者らは、上記の収集／胞子形成培地であって、過酸化化合物および有機酸を含有する培地がまた、（滅菌）消毒培地として使用されてもよいことを見出した。特定の実施形態において、この消毒培地はさらに、当分野で公知の次亜塩素酸（すなわち、漂白剤）、または他の消毒剤を含む。

胞子形成（上記）後、接合子嚢調製物を、さらなる浄化手順（例えば、密度濾過、浮遊、など）、その後に消毒に供してもよい。あるいは、消毒ステップは、胞子形成ステップの前か、または胞子形成ステップと同時に用いられてもよい。しかし、概して、浄化プロセスの終わり近くに接合子嚢を消毒することが有利である。なぜなら、消毒後のステップは、滅菌手順および滅菌試薬を用いて実行されるからである。

「消毒（ｓａｎｉｔｉｚｉｎｇ、またはｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ）」、または「消毒した（ｓａｎｉｔｉｚｅｄ）」とは、接合子嚢の調製において、混入している微生物負荷（すなわち、上記のような、生存している、汚染している微生物）の減少があることを意図する。最終調整物が、その意図される用途に（例えば、ワクチンとして）適切でさえあれば、接合子嚢調製物が、微生物汚染を絶対的に含まないということは必要ではない。鳥類に対するインオボ投与のために意図されるワクチンの場合、この調製物は一般に、検出可能な微生物汚染を本質的に含まない（すなわち、有意なレベルの混入する微生物が検出されない）。他の実施形態において、消毒なしのレベルと比べた場合、混入する微生物の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上の低下がある。

微生物を検出する方法は、当分野で公知であり、そして検出される微生物のクラスに依存する。

従って、本発明は、接合子嚢を含む組成物を提供するステップ、およびこの組成物の所望のレベルの消毒を達成するのに十分な時間および条件下で、（上記のように）本発明の培地を消毒するのにおいて接合子嚢を消毒するステップを包含する、接合子嚢を消毒する方法を提供する。本発明の実施形態において、消毒プロセスによって、微生物汚染のレベルが、動物被験体に対する投与（例えば、インオボのワクチン接種方法）に適切である調製物が得られる。消毒手順は、任意の適切な時間、代表的には、約１時間〜約１２、２４、または４８時間実行され得る。

他の特定の実施形態において、胞子形成プロセス、および消毒プロセスを同時に実行する。

この消毒プロセスの温度は、重要ではなく、そして通常は、約４℃〜４０℃の温度で実行され得る。好ましくは、接合子嚢は、凍結にも高温への長時間の曝露にもさらされない（例えば、４０℃への曝露は代表的には、２〜３時間未満、または１時間未満でさえある）。１つの例示的な実施形態においては、滅菌は、約３０℃で約２４時間〜７２時間実行される。

滅菌培地に対する接合子嚢調製物の比は、微生物の増殖を所望のレベルに低下させるのに十分でさえあれば、重要ではない。収集培地に対する糞便の例示的な比は、約１：０．２５、約１：０．５、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、または約１：１０（ｖ／ｖ）である。

消毒後、例えば、触媒性分解（例えば、酵素処理、または二酸化マンガンを用いるような化学的処理）、希釈、透析、および／または濾過を用いて、過酸化化合物を除去するためのステップをとってもよい。例えば、過酸化水素の場合、残留する過酸化水素を減少させるか、または除去するためにはカタラーゼが用いられ得る。

別の任意のステップとして、接合子嚢調製物は、接合子嚢の間の凝集を低下させる、タンパク質、ペプチド、タンパク質加水分解産物、および／またはアミノ酸を含有する溶液（例えば、水溶液）のような組成物と、接触（例えば、噴霧、リンス、または混合）させてもよい。例示的な組成物としては、ダイズタンパク質、ダイズ加水分解産物、カゼイン、カゼイン加水分解産物、リゾチーム、アルブミン、ウシ血清アルブミン、乳タンパク質、アミノ酸（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、および／またはアスパラギン酸）、ウシ胎仔血清、ニワトリ血清、全乳、などが挙げられるがこれらに限定されない。１つの特定の実施形態において、抗凝集溶液は、正に荷電したアミノ酸、負に荷電したアミノ酸、および中性のアミノ酸を含む。

代表的には、この溶液中の各々の成分の濃度は、約０．０１Ｍ〜１０Ｍ、約０．０５Ｍ〜５Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約２Ｍである。

この溶液のｐＨは、培地中で用いられる特定の成分によって選択されてもよいし、酸性、中性、またはアルカリ性の範囲であってもよい。特定の実施形態において、抗凝集溶液のｐＨは、中性の範囲である。例えば、この溶液は、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７）を用いて緩衝されても、ハンクス平衡化塩溶液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｐＨ７）を用いて緩衝されてもよい。

消泡剤（例えば、アンチフォーム（ａｎｔｉｆｏｒｍ）Ａ）のような他の化合物を同様に用いて、凝集を低下させることもできる。

接合子嚢は、浄化プロセスにおける任意の時点（接合子嚢の間の凝集を低下させることが所望される）で、抗凝集培地と接触されてもよい。消毒プロセスの後に用いることが有利であるかもしれない。特定の実施形態においては、消毒ステップのない場合（例えば、いくつかの孵化後用のワクチン製品において）、このプロセスを、最終製品における凝集を低下させるために用いることができる。あるいは、またはさらに、この抗凝集溶液を、最終処方物に添加して、その処方物中での接合子嚢凝集を低下することができる。

［接合子嚢分離のための浮遊培地］
糞便材料および他の所望されない砕片から接合子嚢を浄化するために用いられる１つの従来の技術は、飽和した塩化ナトリウムまたはスクロース溶液のような高密度培地を通じた接合子嚢の密度浮遊、および接合子嚢を含有する画分の回収に依存する。浮遊方法は、胞子形成の前であっても、そして／または後であってもよい。塩化ナトリウムのようなイオン性溶液は、長期曝露の際に接合子嚢を損傷する可能性がある（Ｒｙｌｅｙ、およびＲｙｌｅｙ、（１９７８）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ７７：３３〜３９）。非イオン性溶液（例えば、濃スクロース溶液）がまた、浮遊手順において用いられている。任意の固体試薬（例えば、塩化ナトリウム、またはスクロース）の１つの障害は、それを使用前に水溶液に溶解しなければならないということである。

Ｄａｖｌｓら付与された米国特許第４，５４４，５４８号、および同第４，８６３，７３１号において、家禽におけるコクシジウム症の管理方法が実証される。これらの特許は、塩浮遊プロセスの使用、すなわち、遠心分離を用いる濃塩溶液における浮遊、その後の第二の遠心分離ステップにおける接合子嚢の希釈および回収を記載している。

Ｒｙｌｅｙ、ら（（１９７６）Ｐａｒｉｓｉｔｏｌｏｇｙ ７３（３）：３１１〜３２６）は、スクロース、塩化ナトリウム、および硫酸亜鉛浮遊を用いる、糞便からの接合子嚢の分離方法を記載している。

Ｖｅｔｔｅｒｌｉｎｇ、Ｊ．Ｍ．（（１９６９）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ５５（２）：４１２〜４１７）は、以下のような連続フロー式遠心分離技術を記載している。高密度スクロース溶液における浮遊、水での希釈、およびさらなる遠心分離による接合子嚢の回収。

Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、Ｗ．Ｃ．（（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４７：２４８〜２５０）は、勾配遠心分離による糞便砕片からの線虫の卵の分離を記載している。Ｐａｔｎａｉｋ、Ｂ．（（１９６６）Ｉｎｄｉａｎ Ｖｅｆ．Ｊ．４３：４１４〜４２２）は、改変マルクワルト法によるニワトリ糞便から純粋な状態でのコクシジウム症接合子嚢を得る技術を開示している。

Ｓｈａｒｍａ、およびＲｅｉｄ（（１９６３）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ４９：１５９〜１６０）は、密度勾配沈殿を用いるコクシジウム症接合子嚢をクローニングする方法を開示している。

国際特許出願ＷＯ００／５００７２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）は、硫酸ナトリウム浮遊プロセスの使用を開示している。

Ｄｕｌｓｋｉら、（１９８８）Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３２：２３５は、接合子嚢の密度浮遊のためのコロイド性シリカ懸濁液（Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標））の使用を記載している。

本発明は、高密度、非イオン性液体およびポリカチオンの分子または粒子を含む、所望されない物質から、接合子嚢を浄化するための浮遊方法を提供する。この高密度、非イオン性液体は、約１．０８、１．１、１．１２、１．１４、１．１６、１．１８、または１．２ｇ／ｍｌの密度を有する任意の水溶液であってもよい。代表的には、この密度は、より高い密度の溶液を使用することを意図していないほとんどの市販の遠心分離装置ほど高くない。本発明の実施形態においては、高密度、非イオン性溶液は、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トウモロコシ高フルクトースシロップ、ヒドロキシメチルセルロース、またはそれらの組み合わせである。

本発明者らは、ポリカチオン分子または粒子が、非イオン性浮遊培地の砕片除去特性を改善するために用いることができることを発見した。当分野で公知の任意の適切なポリカチオンは、浮遊培地中に含まれ得る。例示的なポリカチオンとしては、アルギニン、ヒスチジン、リジン、ジエチルアミノエチル−セルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）、および多価金属イオン（例えば、鉄、または硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、および塩化第二鉄）が挙げられる。ポリカチオンの濃度は臨界ではないが、好ましくは、砕片の綿状沈殿（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）を促進するには十分高く、接合子嚢を過度に損傷するには不十分である。この培地中のポリカチオンの例示的な濃度は、約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、または０．１Ｍ〜約０．５Ｍ、１Ｍ、３Ｍ、またはそれ以上である。

浮遊培地は、緩衝液または抗菌剤のような他の成分を含んでもよい。特定の実施形態では、浮遊培地は、接合子嚢が凝集塊を形成する可能性を低下させるために、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、および／または消泡剤（アンチフォーム（ａｎｔｉｆｏｒｍ）Ａ）を含む。

本発明はまた、密度浮遊手順を用いて、接合子嚢を浄化する方法を包含する。特定の実施形態において、本発明は、接合子嚢の浮遊を生じるのに十分な条件下で、高密度、非イオン性液体およびポリカチオンを含む組成物中で、接合子嚢を含有する調製物を懸濁して、懸濁物を形成するステップ、ならびにこの懸濁液から接合子嚢を回収するステップを含む。一般に、接合子嚢を含有する材料を、浮遊培地と混合して、その溶液を、上清画分中に残留する接合子嚢、およびペレットを形成する糞便砕片に分離させる。遠心分離を用いて分離を促進または改善することができる。

本発明者らは、浮遊手順が、高密度非イオン性培地（ポリカチオンあり、またはなし）を含む浮遊培地に対してオイルを添加することによって増強され得るということをさらに見出した。このオイルは、当分野で公知の任意の適切なオイルであってもよく、これには、コーンオイル、サフラワーオイル、ピーナツオイル、菜種油、大豆油などが挙げられるがこれらに限定されない。オイルの添加によって、砕片の除去が改善され、そして高速の遠心分離なしで分離のレベルの改善が達成され、そして遠心分離の必要性が全く排除さえされ得る。

浮遊プロセスにおけるオイルの濃度に対して特定の限界はない。オイルは、この浮遊培地において、通常、浮遊溶液の総容積の約１％〜約１０％、または約３％〜約７％の濃度で用いられる。

あるいは、オイル浮遊ステップは、上記の、ポリカチオンを含有する高密度、非イオン性溶液における浮遊の前に実施されても、後に実施されてもよい。

浮遊ステップ後に、接合子嚢を含有する回収された画分は、当分野で公知の任意の適切な方法によって、さらに、処理されてもよい。例えば、この画分は、当分野で公知であるか、または本明細書において開示されるような、さらなる浄化手順、および／または胞子形成、および／または消毒に供されてもよい。

浮遊培地は、当分野で公知の任意の方法によって接合子嚢から除去され得る。この方法としては、遠心分離／洗浄ステップ、透析、および濾過（例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））が挙げられる。

［生成物の食餌］
鳥類における接合子嚢の生成に関して、本発明者らは、接合子嚢が糞便中に放出される時点でまたはそのあたりで給餌される鳥類の食餌が、糞便材料からの接合子嚢の分離のプロセスに影響し得るということを見出した。伝統的な方法によれば、家禽は一般に、接合子嚢（例えば、アイメリアの接合子嚢）が糞便中に放出される期間を通じて、完全にすりつぶすか、または砕いた食餌を給餌される。接合子嚢を含む糞便材料が収集された後、最初の浄化ステップは、ふるい分け、および／または濾過のようなバルク技術に依存する。正常な家禽の食餌は、接合子嚢と分離することを困難にするかもしれない、非常に微細な粒子を含む。本発明者の知る限り、本明細書において記載されたこの検討は、動物の糞便から接合子嚢を浄化するプロセスに対する食餌の影響に、初めて取り組み、かつ評価するものである。

本発明者らは、糞便材料からの接合子嚢の分離が、大型の粒子の食餌（すなわち、大きい平均直径サイズを有する食餌）で、感染した鳥類を飼育することによって、増強（すなわち、改善）され得ることを見出した。この食餌は代表的には、挽かれていない（すなわち全粒）であるか、もしくは部分的に引かれた成分、または押し出されるか、もしくは抽出された成分のかなりの割合を含む。例示的な成分としては、挽き割りトウモロコシ、押し出し大豆、全粒カラスムギ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、穀物をふるい分けて、微粉を除去した。本発明の特定の実施形態において、大粒子の食餌は、約４０％（ｗ／ｗ）未満、約３０％（ｗ／ｗ）未満、約２０％（ｗ／ｗ）未満、約１０％（ｗ／ｗ）未満、約５％（ｗ／ｗ）未満、またはなおそれ未満の挽いた飼料、または食餌（例えば、挽いたトウモロコシ、大豆、魚、または骨粉など）を含む。他の実施形態において、大きい粒子の食餌は、本質的に、挽いた食餌成分を含まない。当業者は、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、および他の微量栄養素が、代表的には、顆粒の予備混合処方物において食餌に添加されることを理解する。

例示的な家禽の食餌は、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上（ｗ／ｗ）の押し出された大豆、挽き割りトウモロコシ、全粒カラスムギ、および／または当分野で公知の他の挽かれていないかもしくは部分的にのみ挽かれた、押し出されるか、もしくは抽出された飼料成分、ならびに鳥類の栄養状態を維持するための任意のビタミン、ミネラル、アミノ酸、および塩を含む。１つの特定の実施形態において、ニワトリは、本質的に４５〜５５％（ｗ／ｗ）の押し出された大豆、３５〜４０％（ｗ／ｗ）の挽き割りトウモロコシ、および５〜１５％（ｗ／ｗ）の全粒カラスムギ、ならびに鳥類の栄養状態を維持するためのビタミン、ミネラル、アミノ酸、および塩からなる、食餌を給餌される。

概して、収集期間の間に大粒子の食餌において飼育される鳥類によって生成された糞便のうち少なくとも約３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％（ｗ／ｗ）またはそれ以上が、０．５ｍｍのスクリーンによって保持される。あるいは、この糞便の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％（ｗ／ｗ）、またはそれ以上が、０．０７５ミリメートルのスクリーンによって保持される。

鳥類は、孵化から大粒子の食餌を給餌されてもよい。あるいは、鳥類は、正常な家禽の食餌で開始されて、次いで収集期間に、またはその前のある時点で（例えば、収集の少なくとも約７日、５日、３日、２日、１日、もしくは１２時間前）、あるいは、収集の開始の時点で、大粒子の食餌に切り換えられる。鳥類は、一般に収集期間を通じて、大粒子の食餌で飼育される。鳥類は、浄化においてなんらかの改善または利点が観察されるのでさえあれば、大粒子の食餌を給餌されるのが、収集期間全体よりも短くてもよい。

放出された接合子嚢を含有する糞便は代表的には、各々の種に依存するその種に関するピークアウト期間（これは、代表的には、感染の３、４、または５日後に開始し、その後約２〜４日間収集が続く）の間、収集される。本発明の実施形態において、収集期間は、感染後約３〜９日、または約４〜８日のある時点で行われる。

本発明の大粒子の生成物の食餌によって、より簡便な砕片の除去、接合子嚢の生成の改善、および／または生成費用の低下を達成することができる。

以下の実施例は、本発明を例示するために記載するものであり、その限定として解釈されるべきではない。

［接合子嚢を生成する食餌］
本実施例は、接合子嚢を生成する食餌であって、大粒子と代表的な食餌性補充物（ビタミン、ミネラル、微量栄養素）との組み合わせからなる食餌を記載する。大粒子成分は、挽き割りトウモロコシ、押し出された大豆、および／または全粒（例えば、カラスムギ）から構成されてもよい。この食餌は、鳥類の適切な栄養を維持し、かつ接合子嚢浄化を容易にしながらも、接合子嚢の放出および生産を改善するように開発された。このレジメンは、収集期間（この時、鳥類は、接合子嚢放出期間のために大粒子の食餌に切り換えられる）の開始の直前まで、正常な家禽の食餌の使用を包含してもよい。この食餌の利点は、ふるい分け、および濾過によって、砕片を除去することが容易であるということである。これによって、接合子嚢の収率が改善されて、生成の費用が減少する。

ふるい分けプロセスは、接合子嚢浄化において慣用的に用いられる。このふるい分けプロセスは、ふるい上に保持される高い割合の大粒子を用いる食餌処方物の開発によって促進することができる。コントロールとして正常な家禽の食餌を用いて、接合子嚢放出のために、４つの実験的な食餌を試験した。Ｃｏｂｂ×ＣｏｂｂブロイラーをＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢の生成のために用いた。各々の処理について５つの複製を用いた。この実施例においては、この実験を通じて、正常な家禽の食餌を用いて補充することなしに、大粒子の食餌を給餌した。糞便のサンプルを、ピークアウト期間（胃管栄養法の後、５〜８日）の間に収集して、標準的な容積にして、十分混合し、接合子嚢の数え上げ、および砕片の決定のために副標本とした。次いで、各々のサンプルを３５メッシュ（約０．５ｍｍ）のふるいを通して処理し、標準的な容積にして、十分混合し、接合子嚢数え上げ、および砕片の決定のために副標本とした。結果を表１に示す。

これらの実験に結果によって、最初の砕片のレベルが、正常な家禽の食餌を用いた場合に最高であったことが示される。食餌２〜５（大粒子の食餌）によって、正常な家禽の食餌よりも低く、全ての実験的食餌と同様である開始砕片レベルが得られた。３５メッシュのふるい後の接合子嚢の回収は、正常な家禽の食餌（８５％）よりも大きい粒子の食餌について高かった（９１〜９９％）。最終的に、正常な家禽の食餌を用いた場合、３５メッシュのふるいによって除去される砕片のわずか５％に比べて、大粒子の食餌を用いた場合、砕片のうち４６％までが、３５メッシュふるいによって除去された。

［接合子嚢を生成する食餌の予備的な規模の使用］
Ｅ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を、ケージ中でブロイラー（全部で５４０羽）を用いて生成した。初めの飼料は、実施例１に記載された食餌５（大粒子の食餌）であった。・標準的なブロイラーの食餌の補充用のトレイがまた、Ｄ５を通じて提供された。一団に対して経口胃管を介して、接合子嚢接種物を投与した（１羽あたり、胞子形成された接合子嚢２０，０００）。接種後、５〜８日、１０％クエン酸、０．２５％プロピオン酸溶液（１つの皿（ｐａｎ）あたり２リットル）中に糞便を収集した。

回収の際、各々の試行について以下のステップを実施した。
・プールした；このプールしたサンプルの容積を測定し、副サンプルとした。
・振動ふるい（ｖｉｂｒａｔｏｒｙ ｓｉｅｖｅ）を用いて、重ねた１８メッシュ（１ｍｍ）、および６０メッシュ（約０．２５ｍｍ）のスクリーンを通してふるい分けた。
・振動ふるいを用いて、２００メッシュ（０．０７５ｍｍ）のスクリーンを通してふるい分けた。
・マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）法を用いて、接合子嚢を数え上げた。
・小さいサンプルを遠心分離すること、および遠心分離した総容積に対するペレット化した固体の容積の比を測定することによって、砕片のレベルを決定した。
結果を、下の表２にまとめる。

この結果によって、接合子嚢の回収は、食餌５を用いて平均８６〜８８％であり、ＣＶ＜１５％であることが実証される。出発固体の平均７２％を、ふるい分けステップの間に除去した。

［接合子嚢の収集および胞子形成のための過酸化物および有機酸に基づく培地の使用］
本実施例、および以下の２つの実施例は、接合子嚢を乾燥から保護し、収集期間の開始から汚染微生物数を低下し、高い胞子形成率を生じる、収集／胞子形成／消毒培地が、重クロム酸カリウムよりも廃棄が容易であり、そして次亜塩素酸塩よりも温和な消毒試薬であるということを記載する。

０．７５％の過酸化水素、１０％クエン酸、０．２５％プロピオン酸、および０．１％アンチフオーム（Ａｎｔｉｆｏｒｍ）Ａから構成される培地を開発した。この培地は、接合子嚢の収集および胞子形成のための培地として役立つことが可能である。この水性培地は、接合子嚢を乾燥から保護し、抗菌培地として働いて、ウイルスを殺傷し、収集プロセスの間の細菌またはカビの構築を防ぎ、そして収集プロセスの間の胞子形成を促進する。Ａｎｔｉｆｏｒｍ Ａを添加すれば、糞便懸濁物の過剰な発泡を防止し、接合子嚢の凝集を軽減するように作用する。しかし、Ａｎｔｉｆｏｒｍ Ａは、培地中では任意である。過ホウ酸ナトリウム（一水和物、または四水和物型）のような他の過酸化化合物は、過酸化水素の代わりに、または過酸化水素と組み合わせてのいずれかで用いることができる。

種々のアイメリア種の接合子嚢を、ニワトリにおいて生成して、各々の種に関するピークアウト期間の間に培地中に収集した。約２〜３リットルの収集培地を用いて、８〜１０羽から糞便を収集した。収集期間の終わりの時点で、ふるい分けおよび密度浮遊技術を用いて、接合子嚢を浄化した。次いで、接合子嚢を新鮮な胞子形成培地に入れて、７２時間撹拌して、通気した。収集の直後に、そしてふるい分け、浮遊、および３日の胞子形成処理による処理の後に再度、標準的な顕微鏡技術を用いて、胞子形成率を決定した。結果を表３に示す。

接合子嚢を新しい培地中に収集した場合、胞子形成プロセスのほとんどが、処理の前に生じたことが観察され、そして試験した全てのアイメリア株について高い最終胞子形成率が観察された。これらの結果によって、提案された収集および胞子形成の培地によって、標準的な４８〜７２時間の胞子形成プロセスを実施する前でさえ、接合子嚢収集期間の間に高レベルの胞子形成を達成するための有効な方法が提供されることが示唆される。

［過酸化物、および有機酸に基づく消毒培地の静真菌性および殺真菌性の特性の実証］
実験を行って、実施例３に記載の収集および胞子形成培地において用いた試薬の静真菌性特性および殺真菌性特性を評価した。トリプチカーゼソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）（ＴＳＢ）を用いて、最初の無菌性試験を実施した。Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ ｂｒｕｍｐｔｉｉストック培養物由来の真菌のかきとったものを、２５ｍＬのＰＢＳに懸濁すること、および粗いＳｗｉｎｎｅｙフィルター（約１００：ｍ）を通してこの材料を濾過することによって、真菌のストックを生成した。この真菌ストックの２００：Ｌを、処理（Ｔｒｔ）２〜１１のために３つのＴＳＢフラスコに接種した。

処理によって、実施例３に記載の収集／胞子形成／消毒培地の種々の成分を、単独か、または組み合わせて、評価した。プロピオン酸に加えて、プロピオン酸ナトリウムも試験した。処理は、室温で２８日間評価し；次いで、インキュベーションの２８日目に、全ての処理について各々の複製のフラスコの１ｍＬを、クロラムフェニコール（５０ｇ／ｍＬ）、およびペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）を有する麦芽エキス寒天（ＭＥＡ）プレート上にプレートして、室温で１４日間インキュベートした。ＴＳＢフラスコ（−）の２８日間インキュベーションにおいて増殖が観察されず、そしてこのフラスコ中の培地が、ＭＥＡプレート（＋）に移されたとき、増殖が観察される場合に、この試薬は、静真菌性であるとみなされた。ＴＳＢフラスコ（−）においても、ＭＥＡプレート（−）に移された際も、増殖が観察されない場合に、この試薬は、殺真菌性であるとみなされた。結果を表４に示す。

予想どおり、培地コントロールは、この実験において真菌増殖について陰性のままであり、そして真菌コントロールは、陽性であった。フラスコおよびプレート試験の両方において、プロピオン酸ナトリウム（０．２５％、または０．５０％）は、真菌の増殖を阻害しない。培地中のプロピオン酸処理（０．２５％）（処理４）は、静真菌性であった；それは、フラスコ中の真菌増殖を阻害したが、ＭＥＡプレート上の増殖は阻害しなかった。他の全ての処理（コントロールを除く）は、明白に殺真菌性であって、このフラスコ中に真菌の増殖は観察されず、プレート上でも増殖は観察されなかった。これらの結果によって、提案された処方物において用いた試薬の強力な静真菌性特性および殺真菌性特性が示される（処理９）。

［接合子嚢の生成における過酸化物および有機酸に基づく消毒培地の使用］
実験を行って、消毒試薬としての実施例３に記載の胞子形成培地の有用性を検討した。Ｅ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を、ブロイラー中で生成して、密度浮遊技術を用いて浄化した。１０％クエン酸、０．２５％プロピオン酸、０．７５％過酸化水素、および１ｍＬ／Ｌ Ａｎｔｉｆｏｒｍ Ａを用いて７２時間、接合子嚢を胞子形成させた。胞子形成後、接合子嚢を遠心分離して、無菌濾過した胞子形成培地（１０％クエン酸、０．２５％プロピオン酸、０．７５％過酸化水素、１ｍＬ／Ｌ Ａｎｔｉｆｏｒｍ Ａ）中に再懸濁して、撹拌しながら室温で一晩インキュベートした。消毒後、２００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７）、続いて、防腐剤なしのＰＢＳを用いるダイアフィルトレーションによって緩衝液交換を行った。バルクサンプルを、４℃でガラスボトルに約１／３貯蔵した。米国農務省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ））のガイドラインに従って、純度検定のために、最終製品の副サンプルを、商業的な検査室に送付した。過酸化物に基づく培地を用いる消毒後の９ＣＦＲ滅菌試験の結果を表５に示す。

全ての試験結果によって、無菌濾過した胞子形成培地は、接合子嚢の消毒のために、次亜塩素酸ナトリウムに対する有効な代用物として使用することができることが示される。

［過酸化物および有機酸に基づく培地を用いる接合子嚢の消毒］
Ｅ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢の２つの実験的バッチを調製した（Ｒｕｎ Ａ（試行Ａ）、およびＲｕｎ Ｂ（試行Ｂ））。ふるい分けおよび浮遊手順を用いて、各々のバッチを浄化した。次いで、各々のバッチを分けて、２つの方法の消毒を試験した（次亜塩素酸ナトリウム、および過酸化水素と、クエン酸およびプロピオン酸）。各々の試験からのサンプルをいくつかの純度検定に供した。この検定には、ウイルス検出のための、９ＣＦＲ検定および２つのＰＣＲ方法を含んだ。結果を表６に示す。

純度検定からの結果によって、全ての消毒された材料が微生物汚染を含まないこと、および過酸化水素消毒溶液が、次亜塩素酸と同様に有効であることが示される。

［グリセロールに基づく溶液中のＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢の浮遊］
次の２つの実施例は、多価の陽性荷電を有する分子または粒子（例えば、０．１Ｍアルギニン）を用いる、接合子嚢分離のための浮遊培地を記載する。これらの分子を用いて、非イオン性浮遊培地（例えば、スクロース、グリセロール、トウモロコシ高フルクトースシロップ）の砕片除去特性を改善することができる。そして非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０）、または消泡剤（例えば、アンチフォームＡ）のような添加物を用いて、接合子嚢の凝集を低下させて、これによって浮遊プロセスを最適化することができる。これらの浮遊培地の利点としては、改善された砕片除去が挙げられる。非イオン性溶液は、塩溶液よりも接合子嚢を傷害する可能性が低く、そして正に荷電した種は、凝結補助として作用して小さい砕片粒子を一緒に結合し、遠心分離の間に、砕片粒子のより効率的なペレット形成をもたらす。

Ｅ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を含有するニワトリ糞便を、５つの異なる浮遊培地を用いて処理した。出発材料は、およそ１５０羽由来のプールした材料からなる。機械的なふるい分けデバイスを用い、その後に微細なメッシュのスクリーンを用いて、プールしたサンプルをふるい分けした。このふるい分けしたサンプルを７５０ｍＬのアリコート中で遠心分離して、接合子嚢にペレット化した。上清をデカントして、以下を用いて、ペレットを再懸濁した。１）２０％硫酸ナトリウム、２）６０％グリセロール、３）６０％グリセロール＋０．１Ｍアルギニン、４）６０％グリセロール＋１０ｇ／Ｌ ＤＥＡＥ−セルロース、または５）６０％グリセロール＋０．１Ｍアルギニン＋１０ｇ／Ｌ ＤＥＡＥ−セルロース。各々の培地は、再懸濁した３つのペレットに対して、ペレット容積の５倍が用いられ、これは、約２２５０ｍＬのふるい分けしたサンプルに相当する。２０％の硫酸ナトリウムを１０℃において、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した；全ての他の処理は、１０℃において、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。浮遊処理の結果を表７にまとめる。

この実施形態において、浮遊培地の全てで、７８．４％〜１０３．６％に及ぶ、かなり良好な接合子嚢回収が得られた。グリセロールに基づく培地の全てが、硫酸ナトリウム培地よりも砕片除去に有効であった。硫酸ナトリウム培地に関する固体減少パーセントは６３．８％であったが、グリセロールに基づく培地では、７９．６％〜９６．７％に及んだ。正に荷電された分子（アルギニン）、または粒子（ＤＥＡＥ−セルロース）の添加によって、グリセロール単独と比較して、砕片の除去が改善された。標準的な硫酸ナトリウム浮遊方法によって、固体１ｍＬあたりの接合子嚢の２．７倍の増大が得られたが、６０％グリセロール＋０．１Ｍアルギニンにおける浮遊を用いる方法では、固体１ｍＬあたり接合子嚢の２８．８倍の増大が得られた。

［グリセロールに基づく培地、およびスクロースに基づく培地におけるＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢の浮遊］
ブロイラー中で生成したＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を含有するニワトリ糞便を用いて、別々の浮遊培地を試験した。糞便収集の前に、３６時間の給餌中止期間を用いた。グリセロールアルギニン培地は、接合子嚢回収および砕片除去に関して非常に有効であるが、より大規模のグリセロールの費用は高額すぎるかもしれない。アルギニンと糞便砕片との間の荷電相互作用を利用するために、非イオン性密度エンハンサーの効果を検討した。この実験では、非イオン性化合物としてグリセロールまたはスクロースのいずれかに基づく種々の処方物が比較された。

浮遊の前に、粗いメッシュ、および微細なメッシュのふるいを通して糞便を処理して、大きい砕片粒子を除去した。ふるい分けしたサンプルを７００ｍＬのアリコート中で遠心分離して、接合子嚢をペレット化した。この上清をデカントして、そのペレットを、以下に示す試験処方物を用いて再懸濁した。各々の試験培地について、ほぼ等価の部分を用いた。各々の培地は、再懸濁した３つのペレットに対して、ペレット容積の５倍が用いられ、これは、約２１００ｍＬのふるい分けしたサンプルに相当する。プールした再懸濁したペレットを、粗いスクリーンを通過させて、凝集物の再懸濁を確実にした。少量の適切な浮遊培地を用いて、このスクリーンを通して凝集物をリンスした。

［浮遊培地］
Ａ．６０％グリセロール、０．１Ｍアルギニン
Ｂ．６０％グリセロール、０．１Ｍアルギニン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＬ／Ｌ Ａｎｔｉｆｏａｍ（アンチフォーム）Ａ
Ｃ．１．５Ｍ スクロース、０．１Ｍ アルギニン
Ｄ．１．５Ｍ スクロース、０．１Ｍ アルギニン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＬ／Ｌ Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ
Ｅ．１．５Ｍ スクロース、０．１Ｍ アルギニン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍＬ／Ｌ Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ、０．１％ キサンタンガム。

浮遊処理に関する結果を表８にまとめる。

グリセロール−アルギニンでは、添加物あり、または添加物なしのいずれでも、良好な接合子嚢回収、および接合子嚢浄化の改善（前のステップを上回る固体１ｍｌあたりの接合子嚢における約１９倍の改善）が得られた。スクロースアルギニン培地単独では、良好な接合子嚢回収（９０％）、および良好な砕片除去（前のステップを上回る１８倍の改善）が得られたが、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０、および１ｍＬ／ＬのＡｎｔｉｆｏｒｍの添加によって、能力の両方の測定においてわずかな低下が生じた。スクロース−アルギニン−Ｔｗｅｅｎ−２０−Ａｎｔｉｆｏａｍ Ａ培地のキサンタンガムによる粘性の増強は本質的に、接合子嚢回収に影響を有さないが、砕片除去には有害に影響した。

従って、正に荷電した分子（例えば、アルギニン）、または正に荷電した粒子（例えば、ＤＥＡＥセルロース）は、非イオン性浮遊培地を用いた場合、砕片除去を強化し得る。非イオン性培地としては、グリセロール水溶液、スクロース水溶液、トウモロコシ高フルクトースシロップ水溶液、または他の類似の溶液のような処方物が挙げられる。正に荷電した部分は、綿状沈殿補助物（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ａｉｄ）として作用し、陰性に荷電した砕片粒子と一緒に結合し、これによって、遠心分離の間に、この砕片のより効率的なペレット化をもたらすことが可能である。接合子嚢の回収、および砕片除去効果の増強は、Ｔｗｅｅｎ−２０、またはＡｎｔｉｆｏａｍ Ａのような他の添加物を用いて最適化され得る。

［オイルで増強した接合子嚢浮遊技術］
本実施例は、接合子嚢浮遊プロセスにおけるオイルの効果を検討するために設計された実験を記載する。このオイル補助プロセスは、固体からの接合子嚢の分離を改善して、このプロセスが１×ｇで実施されることを可能にし、これによって、より高いｇの力での、高価な遠心分離装置の使用を回避する。

実験を実施して、穏やかな連続的浮遊方法を、糞便砕片からの接合子嚢の分離のために用いることができるか否かを決定した。連続的撹拌プロセス（接合子嚢が培地の頂部にゆっくりと上昇し、ここで掬い取られて、糞便砕片から回収される）を用いて、密度の差を利用することによって、分離を達成することができる。

最初のトライアルでは、部分的に浄化した（ふるい分けた、および胞子形成した）バッチのＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を用いた。トウモロコシ高フルクトースシロップ（Ｈｉｇｈ−Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−Ｃｏｒｎ−Ｓｙｒｕｐ）（ＨＦＣＳ）、ＣｏｒｎＳｗｅｅｔ ５５（ＡＤＭ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、および塩化ナトリウム塩を、いくつかの組み合わせにおいて、密度増大因子として用いた。この材料を１Ｌのポリプロピレンビーカーに入れて、ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋバッチミキサー（ｂａｔｃｈ ｍｉｘｅｒ）を用いてＨＦＣＳ、およびＮａＣｌとゆっくり混合させた。サンプルを懸濁物の頂部から採取し、次いで容器の底部付近から採取した。サンプリング後にさらなるＨＦＣＳを添加して、この材料をゆっくりとさらに混合し、次いでサンプルの第二のセットを採取した。

２５ｍＬのピペットまたはプラスチックスプーンを用いて、頂部層のサンプル（Ｆ−１、Ｆ−２）を、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに収集した（１サンプルあたり２５ｍｌ）。底部サンプル（Ｓ−１、Ｓ−２）を２５ｍＬのピペットを用いて、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに採取した（１サンプルあたり２５ｍｌ）。蒸留水を用いて、全てのサンプルを１０倍に希釈して、２５０ｍＬのボトル中に移した。あらゆるボトルから、２つの副サンプルを採取して、１×ＰＢＳ緩衝液を用いて１０倍に希釈した。マクマスターの方法を用いて、接合子嚢をこれらの希釈した副サンプル中でカウントした。この実験の結果を表９に示す。

このデータによって、この懸濁物の頂層中に接合子嚢の明白な濃縮が存在するが、この接合子嚢は、効率的に浮遊することなく、そして試験されたいずれの条件（すなわち、遠心分離なし）でも明瞭な頂部層を形成するということが示される。ＮａＣｌに対するＨＦＣＳの比、または糞便懸濁物のさらなる希釈は、本研究における浮遊（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）に影響しなかった。試験した懸濁物の頂部層をサンプリングすることは困難であることが見出された。

これらの実験の後、この材料の有意な希釈、または浮遊増強因子（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ−ａｇｅｎｔ）による誘導のいずれかが、糞便材料を通じた接合子嚢の移動を促進するために有用であると考えられた。実験を実施して、浮遊増強因子としての植物油の有用性を確認した。

１Ｌのポリプロピレンビーカーにおいて、ＩＫＡバッチミキサーを用いて、５００ｍＬのもとの接合子嚢懸濁液、および５００ｍＬの水（１６０ｇのトウモロコシ高フルクトースシロップ＋４０ｇのＮａＣｌ＋５０ｍＬのサフラワーオイルを含有する）を混合した。このミキサーを以下の順序で操作した。高速−低速−停止−低速−停止（ｆａｓｔ−ｓｌｏｗ−ｓｔｏｐ−ｓｌｏｗ−ｓｔｏｐ）。頂部層（５０ｍＬ）を、２００ｍＬの水を含む２５０ｍＬのボトルにすくい入れた。このボトルの内容物を徹底的に混合した。数分間で、３つの異なる層が形成された。各々の層からの２つの副サンプルを採取して、マクマスター（ＭｃＭａｓｔｅｒ）チャンバーを用いて、接合子嚢をカウントした。結果を表１０に示す。

これらの結果によって、オイルが、接合子嚢浮遊プロセスを促進したことが示される。このオイル補助による浮遊プロセスの利点の１つは、接合子嚢層が、遠心分離を必要とすることなく、すなわち１×ｇで、迅速に形成されるということである。代表的には、砕片からの接合子嚢層の分離を達成するために、接合子嚢浮遊プロセスは、２０００×ｇ、またはさらに高い力での遠心分離を用いる。

前述の実施例は、本発明の例示であって、その限定と解釈されるべきではない。本発明は、添付の特許請求の範囲によって、そこに包含されるべき請求項の等価物とともに記載される。

Claims (69)

1. 過酸化化合物、および有機酸を含み、酸性のｐＨを有する、接合子嚢の生成のための組成物。
2. 前記組成物のｐＨが、約ｐＨ１〜約ｐＨ３である、請求項１の組成物。
3. 前記過酸化化合物の濃度が、約０．１％〜約１０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）である、請求項１の組成物。
4. 前記過酸化化合物が、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、過酸化マグネシウム、過酸化カルシウム、過酸化亜鉛、過酸化尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１の組成物。
5. 前記過酸化化合物が、過酸化水素である、請求項４の組成物。
6. 前記組成物中の過酸化水素の濃度が、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約３％（ｖ／ｖ）である、請求項５の組成物。
7. 前記組成物中の過酸化水素の濃度が、約０．２５％（ｖ／ｖ）〜約１％（ｖ／ｖ）である、請求項６の組成物。
8. 消泡剤をさらに含有する、請求項１の組成物。
9. 前記組成物中の有機酸の濃度が、約１％〜約１５％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）である、請求項１の組成物。
10. 前記有機酸が、少なくともクエン酸を含む、請求項１の組成物。
11. 前記有機酸が、少なくともプロピオン酸を含む、請求項１の組成物。
12. 前記有機酸が、クエン酸およびプロピオン酸を含む、請求項１の組成物。
13. 前記組成物が、無菌である、請求項１の組成物。
14. 原生動物の接合子嚢をさらに含む、請求項１の組成物。
15. 動物の糞便中における原生動物の接合子嚢を収集する方法であって、
    （ａ）原生動物に感染し、該原生動物由来の接合子嚢をその糞便中に放出している動物を提供するステップと、
    （ｂ）感染した動物由来の接合子嚢を含む糞便と、請求項１の組成物とを接触させるステップと
    を含む方法。
16. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項１５の方法。
17. 前記アイメリア種がＥ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１６の方法。
18. 前記動物が、鳥類である、請求項１５の方法。
19. 前記鳥類が、シチメンチョウである、請求項１８の方法。
20. 前記鳥類が、ニワトリである、請求項１８の方法。
21. 接合子嚢の生成のための組成物であって、過酸化化合物を含み、該組成物は、酸性ｐＨを有する、組成物。
22. 前記過酸化化合物が、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、過酸化マグネシウム、過酸化カルシウム、過酸化亜鉛、過酸化尿素、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２１の組成物。
23. 動物の糞便中における原生動物の接合子嚢を収集する方法であって、
    （ａ）原生動物由来の接合子嚢をその糞便中に放出している、該原生動物に感染した動物を提供するステップと、
    （ｂ）該感染した動物由来の接合子嚢を含む糞便と、請求項２１の組成物とを接触させるステップと
    を含む、方法。
24. 接合子嚢の生成のための組成物であって、有機酸を含み、酸性ｐＨを有する組成物。
25. 前記有機酸が、クエン酸、プロピオン酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される有機酸を含む、請求項２４の組成物。
26. 動物の糞便中における原生動物の接合子嚢を収集する方法であって、
    （ａ）原生動物由来の接合子嚢をその糞便中に放出している、該原生動物に感染した動物を提供するステップと、
    （ｂ）該感染した動物由来の接合子嚢を含む糞便と、請求項２４の組成物とを接触させるステップと
    を含む、方法。
27. 原生動物の接合子嚢に胞子形成させる方法であって、
    （ａ）原生動物の接合子嚢を含む組成物を提供するステップと、
    （ｂ）胞子形成に適した時間、および条件下で、請求項１の組成物において該接合子嚢に胞子形成させるステップと、
    を包含する、方法。
28. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項２７の方法。
29. 前記アイメリア種がＥ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２８の方法。
30. 原生動物の接合子嚢を含む前記組成物が、該原生動物に感染した動物から収集した糞便を含む、請求項２７の方法。
31. 原生動物の接合子嚢を消毒する方法であって、
    （ａ）原生動物の接合子嚢を含む調製物を提供するステップと、
    （ｂ）該調製物の消毒の所望のレベルを達成するのに十分な時間、および条件下で、請求項１の組成物において接合子嚢を消毒するステップと
    を含む、方法。
32. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項３１の方法。
33. 前記アイメリア種がＥ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３２の方法。
34. 前記消毒ステップ後に、前記調製物が検出可能な微生物汚染を本質的に含まない、請求項３１の方法。
35. 前記消毒ステップが、約１２時間〜約４８時間実行される、請求項３１の方法。
36. 原生動物の接合子嚢を浄化するための浮遊培地であって、高密度、非イオン性溶液、およびポリカチオンを含む、浮遊培地。
37. 前記高密度、非イオン性溶液が、グリセロール、ソルビトール、スクロース、トウモロコシ高フルクトースシロップ、ヒドロキシメチルセルロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６の浮遊培地。
38. 前記ポリカチオンが、アルギニン、ヒスチジン、リジン、ジエチルアミノエチル−セルロース、多価金属イオン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６の浮遊培地。
39. 前記ポリカチオンが、アルギニンを含む、請求項３８の浮遊培地。
40. 前記浮遊培地中のポリカチオンの濃度が、約０．０５Ｍ〜約１Ｍである、請求項３６の浮遊培地。
41. 前記浮遊培地中が、さらに非イオン性界面活性剤を含む、請求項３６の浮遊培地。
42. 前記浮遊培地中が、さらに消泡剤を含む、請求項３６の浮遊培地。
43. 前記浮遊培地が、さらにオイルを含む、請求項３６の浮遊培地。
44. 原生動物の接合子嚢を浄化するための浮遊培地であって、高密度、非イオン性溶液およびオイルを含む、浮遊培地。
45. 浮遊によって原生動物の接合子嚢を浄化する方法であって、
    （ａ）請求項３６の浮遊培地と、原生動物の複数の接合子嚢との間の懸濁物を形成するステップと、
    （ｂ）該懸濁物を分離させるステップと、
    （ｃ）該分離した懸濁物から原生動物の接合子嚢を収集するステップと
    を含む、方法。
46. 前記懸濁物形成ステップが、浮遊培地と原生動物の複数の接合子嚢とを混合するステップを含み、前記懸濁物を分離させるステップが、遠心分離を包含する、請求項４５の方法。
47. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項４５の方法。
48. 前記アイメリア種が、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４７の方法。
49. 浮遊によって原生動物の接合子嚢を浄化する方法であって、
    （ａ）請求項４４の浮遊培地と、原生動物の複数の接合子嚢との間の懸濁物を形成するステップと、
    （ｂ）該懸濁物を分離させるステップと、
    （ｃ）該分離した懸濁物から原生動物の接合子嚢を収集するステップと
    を含む、方法。
50. 前記懸濁物形成ステップが浮遊培地と多数の原生動物の接合子嚢とを混合するステップを含み、前記懸濁物を分離させる前記ステップが遠心分離を包含する、請求項４９の方法。
51. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項４９の方法。
52. 前記アイメリア種が、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５１の方法。
53. 鳥類の被験体から原生動物の接合子嚢を生成する方法であって、
    （ａ）該原生動物由来の接合子嚢が、感染された鳥類の被験体の糞便中に放出されるのに十分な時間、該原生動物により該鳥類被験体を感染させるステップと、
    （ｂ）該感染した鳥類被験体由来の該接合子嚢を含む該糞便を収集するステップと、
    （ｃ）該感染した鳥類被験体に対して、該収集ステップの前、および収集ステップの間に少なくとも約１日間、平均粒子サイズの大きい食餌を給餌するステップと、
    を包含する、方法。
54. 前記食餌の少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）が、挽いていない穀物、部分的に挽いた穀物、押し出した穀物、抽出した穀物、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を含む、請求項５３の方法。
55. 前記食餌の少なくとも約８０％（ｗ／ｗ）が、挽いていない穀物、部分的に挽いた穀物、押し出した穀物、抽出した穀物、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される成分を含む、請求項５３の方法。
56. 前記収集した糞便の少なくとも約３５％（ｗ／ｗ）が、０．５ミリメートルのふるい上に残る、請求項５３の方法。
57. 前記糞便の少なくとも約６０％が、０．０７５ミリメートルのふるい上に残る、請求項５３の方法。
58. 前記平均粒子サイズの大きい食餌が、約２０％（ｗ／ｗ）未満の挽いた粉を含む、請求項５３の方法。
59. 前記原生動物が、アイメリア属由来の種を含む、請求項５３の方法。
60. 前記アイメリア種が、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５９の方法。
61. 前記鳥類被験体が、シチメンチョウである、請求項５３の方法。
62. 前記鳥類被験体が、ニワトリである、請求項５３の方法。
63. 原生動物の接合子嚢の間の凝集を低下させるための水性組成物であって、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、タンパク質加水分解産物、消泡剤、および前述の任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、水性組成物。
64. 前記組成物が、カゼイン加水分解産物、またはダイズタンパク質加水分解産物を含む、請求項６３の組成物。
65. 前記組成物が、アルギニン、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸を含む、請求項６３の組成物。
66. 原生動物の複数の接合子嚢をさらに含む、請求項６３の組成物。
67. 原生動物の接合子嚢を生成する方法であって、原生動物の接合子嚢の調製物と、該接合子嚢の間の凝集を低下させる水性組成物とを接触させるステップを含む、方法。
68. 前記組成物が、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、タンパク質加水分解産物、消泡剤、および前述の任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む、請求項６７の方法。
69. 前記接触ステップを、前記消毒ステップの後に行なう、請求項６７の方法。