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KR101316820B1 - 콕시듐 원충 증식 동물모델 및 이를 이용한 콕시듐 원충 생산 방법 - Google Patents

콕시듐 원충 증식 동물모델 및 이를 이용한 콕시듐 원충 생산 방법 Download PDF

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KR101316820B1
KR101316820B1 KR1020110055334A KR20110055334A KR101316820B1 KR 101316820 B1 KR101316820 B1 KR 101316820B1 KR 1020110055334 A KR1020110055334 A KR 1020110055334A KR 20110055334 A KR20110055334 A KR 20110055334A KR 101316820 B1 KR101316820 B1 KR 101316820B1
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Abstract

본 발명은 (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 및 (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계를 이용하여 얻어진 콕시듐 원충 증식 동물모델에 관한 것이다.
본 발명은 (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계, (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계 및 (c) 상기 콕시듐 원충이 증식된 동물의 분변에서 콕시듐 오시스트를 획득하는 단계를 포함하는 콕시듐 원충 생산 방법에 관한 것이다.

Description

콕시듐 원충 증식 동물모델 및 이를 이용한 콕시듐 원충 생산 방법{An animal model for proliferating Coccidium protozoa and a method for producing Coccidium protozoa with the animal model}
본 발명은 (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 및 (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계를 이용하여 얻어진 콕시듐 원충 증식 동물모델에 관한 것이다.
본 발명은 (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계, (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계 및 (c) 상기 콕시듐 원충이 증식된 동물의 분변에서 콕시듐 오시스트를 획득하는 단계를 포함하는 콕시듐 원충 생산 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 포자충류(Apicomplexa)에 속하는 아이메리아(Eimeria)속 또는 아이소스포라(Isospora)속 등에 속하는 원충(protozoa)은 좁은 의미로서 콕시듐(coccidium)이라고 불린다.
이들 콕시듐 원충은 닭, 칠면조, 메추리, 꿩 등을 포함한 조류 및 소, 염소, 양, 돼지 등의 가축, 사람 등에 기생하여 병원성을 나타내어 콕시디아증(coccidiosis)을 유발한다.
특히 아이메리아(Eimeria) 원충은 숙주의 세포 내에 기생하는 원충으로서, 숙주의 내장 상피 세포에 영향을 주는데, 생활주기의 무성단계(asexual stage)에서 병원성을 발현하여 콕시디아증을 유발시키는, 매우 중요한 가금류 전염원으로 취급된다.[(비특허문헌 1) Cox, 1998. 참조]
또한 아이메리아(Eimeria) 원충에 의한 콕시디아증은 내장 상피를 파괴하여, 이에 따라 식이효율(feed efficiency) 및 에그 생산(egg production)을 감소시키게 된다.[(비특허문헌 2) Min et al, 2004 ; (비특허문헌 3) Dalloul and Lillehoj, 2005 참조]
콕시디아증은 감염된 동물의 분변 속에 배출된 오시스트(oocyst, 충란)를 섭취함으로써 감염된다.
구체적으로 보면, 콕시듐 원충은 숙주 체내에서 기생하면서 무성생식을 일정 기간 되풀이한 후 자웅의 생식세포를 만들고 배우자 수정 후의 접합자조가 스포로조이트(sporozoit, 종충(種蟲))를 형성하게 되는데, 이 스포로조이트가 다시 무성 및 유성생식을 하여 수천 개의 오시스트(oocyst)를 생산하고 이것이 분변에 배출됨으로써 감염력을 획득하게 된다.
따라서 콕시디아증에 대한 숙주의 질병 감수성(host disease susceptibility)은 콕시듐 원충의 감염 이후에 분변에 배출된 오시스트(oocyst)의 개수 및 체중의 변화를 분석함으로써 평가된다.[(비특허문헌 4) Chapman et al, 2005; (비특허문헌 5) Min et al, 2002 참조]
즉 분변으로 배출되는 오시스트(oocyst) 및 체중의 감소는 콕시디아증의 영향을 측정하기 위하여 사용되는 가장 신뢰할만한 질병 파라미터로 인정되고 있다.[(비특허문헌 4) Chapman et al, 2005; (비특허문헌 7) Lillehoj and Trout, 1996 참조]
한편 콕시디아증은 주로 화학요법제(chemotherapeutic agents)를 이용하여 관리되고 있으나, 현재 가금류 사육 시설에서 약물 내성을 가진 기생충 종자들이 급격히 증가하고 있기 때문에 이에 대한 연구가 시급한 상황이다.[(비특허문헌 8) Allen and Fetterer, 2002; (비특허문헌 9) Williams, 2002 참조]
또한 오시스트(oocyst)를 포함하고 있는 콕시듐 백신은 숙주 내 항체 형성을 통해 면역을 유도하는 역할을 하나, 통상적으로 콕시디아증은 한 종류만 감염되는 것이 아니고 여러 종류의 콕시듐 원충에 감염되므로 다가 항원으로 면역시켜야 되는 실정이다.
따라서 콕시듐 원충의 시험관 내(in vitro) 연구나 생체 내(in vivo) 연구가 모두 시급한 상황이다.
그러나 현재까지 콕시듐 원충의 세포 배양법이 개발되어 있지 않아, 6개월에 한 번씩 실험동물에 콕시듐 원충을 접종하고 분변으로 배출되는 콕시듐 오시스트(oocyst)를 모아서, 냉장 보관하여 실험을 수행하고 있는 실정이다.[(비특허문헌 10) Shirley, 1995 참조]
즉 6개월 냉장 보관 기간이 지나면 오시스트가 죽기 때문에, 다음 실험을 위해서는 다시 반복하여 실험동물에 콕시듐 원충을 생체 접종하여야만 되는 것이다.
따라서 6개월에 한 번씩 생체 접종을 통해 콕시듐 원충을 얻는 것이 아니라, 필요할 때 바로 콕시듐 원충을 얻어서 시험관 내 연구 및 생체 내 연구를 수행할 수 있는 콕시듐 원충 증식 동물모델이나 이를 이용한 콕시듐 원충 생산 방법이 매우 절실하다 하겠다.
한편 본 연구자들은 콕시디아증의 면역을 위한 생균 백신(live vaccine)에는 콕시듐 오시스트가 포함되어 있는바 이를 이용하면 필요할 때 바로 콕시듐 원충을 확보하여 실험을 할 수 있으리라 착안하였다.
그러나 생균 백신에 들어있는 원충은 약독화(attenuation) 되어 있어 건강한 동물에서는 증식이 이루어지지 않고 병원성이 발현되지 않으므로 생균 백신을 곧바로 이용하기는 어렵다.
따라서 면역을 억제하는 모델을 만들고, 여기에 생균 백신을 투여하면 콕시듐 원충 증식 동물모델을 구축할 수 있고 이를 이용하여 콕시듐 원충을 생산할 수 있다는 점에 최종 착안하였다.
한편 콕시듐 원충과 관련되어 공개된 특허문헌을 간략하게 살펴보면, 먼저 대한민국 공개특허공보 특1999-0022045호에는 기생 원생동물에 대해 사용하는 약재로서 폴리에테르 항생제 또는 합성 제조된 항콕시듐제와 치환된 벤즈이미다졸의 혼합물에 대하여 기재되어 있다.
또한 대한민국 공개특허공보 10-2005-0117770호에는 콕시듐 원충의 포자소체의 재조합 표면항원 단백질 및 이를 포함하는 콕시듐병 백신으로서, 아이메리아 종의 포자소체 표면항원 단백질을 식물 세포에서 발현시키는 것이 기재되어 있다.
또한 대한민국 공개특허공보 10-2009-0047520호에는 콕시디아 감염을 구제하기 위한 톨트라주릴 또는 포나주릴과 같은 트리아진의 경피 적용에 대하여 기재되어 있다.
또한 대한민국 공개특허공보 10-2011-0036238호에는 폴리우루시올을 포함하는 가축용 사료 첨가제 및 그의 제조방법으로서, 생옻에서 추출한 우루시올을 부형제에 혼합하고 부형제와 혼합된 우루시올의 중합반응을 유도하여 제조하는 것이 기재되어 있다.
정리하여 보면, 종래의 선행 특허기술은 콕시듐병을 예방하거나 치료하기 위한 약물에 초점을 두어 연구가 진행되었고, 콕시듐 원충의 증식 동물모델이나 콕시듐 원충의 생산 방법에 대한 연구 시도는 없었던 바, 이에 대한 연구가 시급하다 하겠다.
KR 10-1999-0022045 A KR 10-2005-0117770 A KR 10-2009-0047520 A KR 10-2011-0036238 A
Cox FE. Control of coccidiosis: lessons from other sporozoa. Int J Parasitol 1998; 28(1):165~179. Min W, Dalloul RA, Lillehoj HS. Application of biotechnological tools for coccidian vaccine development. J Vet Sci.2004; 5(4): 279~288. Dalloul RA, Lillehoj HS. Recent advances in immunomodulation and vaccination strategies against coccidiosis. Avian Dis 2005; 49(1): 1~8. Chapman HD, Matsler PL, Muthavarapu VK, Chapman ME. Acquisition of immunity to Eimeria maxima in newly hatched chickens given 100 oocysts. Avian Dis 2005; 49(3): 426~429. Min W, Lillehoj HS, Burnside J, Weining KC, Staeheli P, Zhu JJ. Adjuvant effects of IL-1b, IL-2, IL-8, IL-15, IFN-a, IFN-g, TGF-b4 and lymphotactin on DNA vaccination against Eimeria acervulina. Vaccine 2002; 20(1-2): 267~274. Lillehoj HS, Trout JM. Avian gut-associated lymphoid tissues and intestinal immune responses to Eimeria parasites. Clin Microbiol Rev 1996; 9(3): 349~360. Allen PC, Fetterer RH. Recent advances in biology and immunobiology of Eimeria species and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry. Clin Microbiol Rev 2002; 15(1): 58~65. Williams RB. Fifty years of anticoccidial vaccines for poultry (1952~2002). Avian Dis 2002; 46(4): 775~802. Shirley MW. Guidelines on techniques in coccidiosis research. In: Eimeria species and strains of chicken (Eckert J, Braun R, Shirley MW, Coudert P, eds), European Commission, Luxemburg, 1995; pp 1~25.
본 발명의 목적은, 면역을 억제하는 모델을 만들고, 여기에 생균 백신을 투여하여 콕시듐 원충을 증식할 수 있는 콕시듐 원충 증식 동물모델을 제공함에 있다.
본 발명의 목적은, 면역을 억제하는 모델을 만들고, 여기에 생균 백신을 투여하여 콕시듐 원충을 증식할 수 있는 콕시듐 원충 증식 동물모델을 구축함으로써, 콕시듐 원충을 생산할 수 있는 방법을 제공함에 있다.
본 발명은, (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 및 (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계를 이용하여 얻어진 콕시듐 원충 증식 동물모델을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, (a) 면역 억제제를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계, (b) 상기 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계 및 (c) 상기 콕시듐 원충이 증식된 동물의 분변에서 콕시듐 오시스트를 획득하는 단계를 포함하는 콕시듐 원충 생산 방법을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명인 콕시듐 원충 증식 동물모델의 분변에서는 정상대조군(Control)에 비하여 콕시듐 오시스트(oocyst)가 유의미하게 검출되었고, 정상대조군에 비하여 정상적인 발육의 어려움을 겪어서 체중의 변화가 관찰되었는바, 본 발명의 콕시듐 원충 증식 동물모델은 콕시디아증의 중요 질병 파라미터 조건을 모두 만족하는 현저한 효과를 나타내고 있다.
본 발명인 콕시듐 원충 증식 동물모델은 생체 내(in vivo) 콕시듐 원충 및 콕시디아증(coccidiosis)의 연구를 위해서 이용될 수 있는 현저한 효과가 있다.
본 발명인 콕시듐 원충 생산 방법은, 콕시듐 원충이 필요할 때 즉각적으로 생산할 수 있으므로, 콕시듐 원충의 시험관 내(in vitro) 연구를 위해서 이용될 수 있는 현저한 효과가 있다.
도 1은 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 생균 백신(live vaccine)을 투여하는 것을 나타내는 도면이다.
도 2는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 콕시듐 원충을 획득하는 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 획득된 콕시듐 원충을 현미경 관찰한 도면이다.
도 4는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 체중 변화를 나타내는 도면이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1. 콕시듐 원충 증식 동물모델의 구축
(a) 면역 억제제(immunosuppresive drug)를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 및 (b) 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충을 증식시키는 단계를 이용하여 콕시듐 원충 증식 동물모델을 구축하였다.
여기에서, 면역 억제제는 특이적 또는 비특이적 면역 억제제가 선택될 수 있으며, 특이적 면역 억제제는 생균 백신에 포함된 콕시듐 원충에 특이적으로 반응하는 면역 억제제가 이용될 수 있다.
또한 비특이적 면역 억제제는 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 나이트로젠머스터드(nitrogen mustard) 등의 알킬화제, 6-메르캅토푸린(6-mercaptopurine), 아자싸이오푸린, 시토신아라비노시드(cytosine arabinoside) 등의 대사길항제, 미토마이신 C(mitomycin C), 악티노마이신 D(actinomycin D) 등의 항생물질, 부신피질스테로이드제, 빈알칼로이드제 등에서 선택적으로 이용될 수 있다.
여기에서, 인간을 제외한 정상동물은 닭, 칠면조, 메추리, 꿩 등을 포함한 조류 및 소, 염소, 양, 돼지 등의 가축 중에서 선택될 수 있다.
여기에서, 생균 백신(live vaccine)에 포함된 콕시듐 오시스트(oocyst)는 포자충류(Apicomplexa)에 속하는 아이메리아(Eimeria) 또는 아이소스포라(Isospora)속에 속하는 원충의 오시스트(oocyst)에서 선택될 수 있다.
실시예 2. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델의 구축
(a) 면역 억제제(immunosuppresive drug)를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계 및 (b) 면역 억제된 정상동물에 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충을 증식시키는 단계를 이용하여 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델을 구축하였다.
여기에서, 면역 억제제는 비특이적 면역 억제제로서, 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide)가 이용되었다.
여기에서, 인간을 제외한 정상동물은 닭, 칠면조, 메추리, 꿩 등을 포함한 조류 중에서 선택될 수 있다.
여기에서, 면역 억제제를 투여하는 방법은 복부 지역(abdominal region)에 피하 주입(subcutaneous injection)하는 것을 이용한다.
여기에서, 생균 백신(live vaccine)에 포함된 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 오시스트(oocyst)의 원충은 아이메리아 아서벌리나( Eimeria acervulina ), 아이메리아 미바티( Eimeria mivati ), 아이메리아 맥시마( Eimeria maxima ), 아이메리아 테넬라 ( Eimeria tenella ), 아이메리아 네카트릭스( Eimeria necatrix ), 아이메리아 프래콕스( Eimeria praecox ), 아이메리아 브루넷( Eimeria brunette ), 아이메리아 하가니(Eimeria hagani ) 를 포함한다.
여기에서, 생균 백신을 투여하는 방법은 경구(oral) 투여하는 것을 이용한다.
실시예 3. 콕시듐 원충 증식 동물모델을 이용한 콕시듐 원충의 생산 방법
(a) 면역 억제제(immunosuppresive drug)를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계, (b) 면역 억제된 정상동물에 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충을 증식시키는 단계 및 (c) 콕시듐 원충이 증식된 동물모델의 분변에서 콕시듐 오시스트(oocyst)를 획득하는 단계를 이용하여 콕시듐 원충을 생산하였다.
실시예 4. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델을 이용한 아이메리아( Eimeria ) 콕시듐 원충의 생산 방법
(a) 면역 억제제(immunosuppresive drug)를 인간을 제외한 정상동물에게 투여하는 단계, (b) 면역 억제된 정상동물에 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충을 증식시키는 단계 및 (c) 콕시듐 원충이 증식된 동물모델의 분변에서 콕시듐 오시스트(oocyst)를 획득하는 단계를 이용하여 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충을 생산하였다.
실험예 1. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서의 콕시듐 원 충 획득 효과
1-1. 실험동물
먼저, 이 실험은 원광대학교 동물 자원 개발 센터의 동물 사육 시설에서 진행되었음을 밝힌다.
또한 이 실험은 원광대학교 동물 실험 가이드(Guide for Animal Experimentation)를 준수하여 시행되었으며, 원광대학교 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었음을 밝힌다.(Approval No. WKU11-007)
또한 실험 동물의 고통 및 불안함을 최소화하기 위해 최선의 노력을 경주하였음을 밝힌다.
출생 후 3일 된 닭(n=20)을 항온(28±2℃) 및 항습(50±5%) 하에서 12시간 싸이클(09:00~21:00)로 명암이 자동 조절되는 동물 사육실의 케이지(cage)에서 적응시켰다.
이 동물들은 적응기간 동안 일반증상의 이상이 관찰되지 않았다
적응기간 동안, 사료는 항생제 및 항콕시듐제가 없는 상업용 닭 전용사료(한일 사료 주식회사, 대한민국 용인)를 자유 급이 하였으며, 음수는 상수돗물을 자유 급식하였다.
1-2. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델
(a) 면역 억제제 투여 처리
적응기가 끝난 실험동물 모두에게 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide) (Sigma Chemical, St Louis, USA)를 투여 처리하였다.
구체적으로 보면, 4일 동안 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide, 2H-1.3, 2-oxazaphosphorin-2-amine) 용액(3mg/ml)을 복부 지역(abdominal region)에 피하 주입(subcutaneous injection) 하였다.
(b) 시험군 구성 및 생균 백신 투여 처리
4일 동안 면역 억제제를 투여한 실험동물(n=20)을 한 군당 10마리로 구성하되, 정상대조군(Control, n=10) 및 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군(n=10) 등 2 개 군으로 구성하였고, 10일간 관찰하였다.
아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군에는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 오시스트(oocyst)가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 경구(oral) 투여하였다.
여기에서, 생균 백신(live vaccine)은 Coccivac™-D(Intervet/Schering-Plough Animal Health, USA)를 이용하였으며, 이 백신에는 아이메리아 아서벌리나( Eimeria acervulina ), 아이메리아 미바티( Eimeria mivati ), 아이메리아 맥시마( Eimeria maxima ), 아이메리아 테넬라 ( Eimeria tenella ), 아이메리아 네카트릭스( Eimeria necatrix ), 아이메리아 프래콕스( Eimeria praecox ), 아이메리아 브루넷( Eimeria brunette ), 아이메리아 하가니(Eimeria hagani ) 를 포함한다.
여기에서, 경구(oral) 투여는 3 ml 주사기에 부착된 24 게이지, 마우스용 스테인레스 스틸 식이 튜브(Popper & Sons, Inc., New York, USA)를 이용하여 수행하였다.
도 1은 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 생균 백신(live vaccine)을 투여하는 것을 나타내는 도면이다.
여기에서, 경구 투여되는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 오시스트(oocyst)는 식염수 1 ml 당 약 10⁴개 정도이다.
정상대조군(Control)에는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군에 생균 백신(live vaccine)을 경구(oral) 투여하는 방식과 동일하게 식염수를 투여하였다.
1-3. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서의 콕시듐 원충 획득 효과
(a) 콕시듐 오시스트(oocyst)의 개수 분석
하루에 두 번 콕시듐 병의 발병 및 사망 상태를 관찰하면서, 정상대조군(Control, n=10) 및 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군(n=10)에서의 분변에서 배출되는 오시스트(oocyst)의 개수를 분석하였다.
생균 백신(live vaccine)을 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군에 경구(oral) 투여한 후 6일에서 10일까지, 분변 물질을 모아서 오시스트(oocyst)의 개수를 분석하였다.
콕시듐 오시스트(oocyst)의 개수 분석은 맥마스터 카운트 챔버(McMaster counting chamber)를 이용하였다.
전체 오시스트 개수를 계산하기 위하여, 전체 오시스트 개수(total number oocysts) = 오시스트 개수(oocyst count) x 희석계수(dilution factor) x (분변 샘플의 부피(fecal sample volume)/카운트 챔버의 부피(counting chamber volume)) / 케이지 당 닭의 개수(number of birds per cage) 이라는 수식을 이용하였다.
(b) 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서의 콕시듐 원충 획득 효과
도 2는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 콕시듐 원충을 획득하는 효과를 나타내는 도면이고, 도 3은 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 획득된 콕시듐 원충을 현미경 관찰한 도면이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 정상대조군(Control)의 분변에서는 전혀 콕시듐 오시스트(oocyst)가 검출되지 않았음을 알 수 있다.
반면에, 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군의 분변에서는 정상대조군(Control)에 비하여 콕시듐 오시스트(oocyst)가 유의미하게 검출되었다.(P<0.05)
또한 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군의 분변에서 배출된 오시스트(oocyst)의 개수는 생균 백신(live vaccine)을 투여한 후 7일째 되는 날에서 제일 많았으며 이후에 감소하는 경향을 보였음을 알 수 있는데, 이는 면역 억제제의 약효가 시간에 따라 감소되는 것 또는 면역 억제제의 작용에 영향받지 않은 다른 면역 작용이 수행되는 것과 관련되는 결과로 추정된다.
1-4. 통계처리
실험 결과는 원웨이 아노바 테스트(one-way ANOVA-test, GraphPad InStat, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 p-value를 구하였으며, p < 0.05인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.
실험예 2. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서의 체중 변화
2-1. 실험준비
실험예 1과 동일하게, 시험군을 구성하고 생균 백신을 투여 처리한 후에, 10일간 관찰하였다.
하루에 두 번 콕시듐 병의 발병 및 사망 상태를 관찰하면서, 정상대조군(Control, n=10) 및 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군(n=10)에서의 체중을 측정하되, 개개의 닭의 체중을 측정하였다.
2-2. 아이메리아 ( Eimeria ) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서의 체중 변화
도 4는 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델에서 체중 변화를 나타내는 도면이다.
도 2에 도시된 바와 같이, 정상대조군(Control)의 체중은 지속적으로 증가되는 경향을 보이고 있으며 정상적인 발육을 하고 있음을 알 수 있다.
반면에, 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군의 체중은 생균 백신 투여 후 3일까지 급속히 체중이 감소하였으며 이후에 지속적으로 체중이 증가됨을 알 수 있다.
이는 콕시듐 병의 증상이 설사와, 장염 및 혈변을 특징으로 하고 있으며 정상적인 발육을 저해한다는 점과 관련됨을 알 수 있다.
또한 5일 이후로 체중이 증가되는 경향은 면역 억제제의 약효가 시간에 따라 감소되는 것 또는 면역 억제제의 작용에 영향받지 않은 다른 면역 작용이 수행되는 것과 관련되는 결과로 추정된다.
2-3. 통계처리
실험 결과는 원웨이 아노바 테스트(one-way ANOVA-test, GraphPad InStat, GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 p-value를 구하였으며, p < 0.05인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.
실험예 1 내지 실험예 2를 총괄하여 정리하여 보면, 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군의 분변에서는 정상대조군(Control)에 비하여 콕시듐 오시스트(oocyst)가 유의미하게 검출되었다.
또한 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식군의 체중은 생균 백신 투여의 영향으로 정상대조군(Control)에 비하여 정상적인 발육의 어려움을 겪어서 체중의 변화가 있었음을 알 수 있다.
단, 면역 억제제의 약효 감소 또는 또는 면역 억제제의 작용에 영향받지 않은 다른 면역 작용과 관련하여, 지속적으로 오시스트(oocyst)량이 증가하거나 지속적으로 체중이 감소하지는 않았다고 추정될 수 있다.
따라서 면역 억제제 및 생균 백신의 투여를 통해 구축된 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델은 생체 내(in vivo) 콕시듐 원충 및 콕시디아증(coccidiosis)의 연구를 위해서 이용될 수 있음을 알 수 있다.
또한 면역 억제제 및 생균 백신의 투여를 통해 구축된 아이메리아(Eimeria) 콕시듐 원충 증식 동물모델은 즉각적으로 콕시듐 원충을 생산할 수 있으므로 콕시듐 원충의 시험관 내(in vitro) 연구를 위해서도 유용함을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. (a) 면역 억제제를 조류에게 투여하는 단계;
    (b) 상기 면역 억제된 조류에 아이메리아(Eimeria) 원충의 오시스트가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계;를 이용하여 얻어진 콕시듐 원충 증식 동물모델.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제의 투여는 복부 지역(abdominal region)에 피하 주입(subcutaneous injection)하는 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 콕시듐 원충 증식 동물모델.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide)인 것을 특징으로 하는 콕시듐 원충 증식 동물모델.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. (a) 면역 억제제를 조류에게 투여하는 단계;
    (b) 상기 면역 억제된 조류에 아이메리아(Eimeria) 원충의 오시스트가 포함된 생균 백신(live vaccine)을 투여하여 콕시듐 원충(Coccidium protozoa)을 증식시키는 단계;
    (c) 상기 콕시듐 원충이 증식된 조류의 분변에서 콕시듐 오시스트를 획득하는 단계;를 포함하는 콕시듐 원충 생산 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제의 투여는 복부 지역(abdominal region)에 피하 주입(subcutaneous injection)하는 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 콕시듐 원충 생산 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역 억제제는 싸이클로포스파마이드(cyclophosphamide)인 것을 특징으로 하는 콕시듐 원충 생산 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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