BRPI0211870B1 - método para esporulação de oocistos viáveis de eimeria - Google Patents

Abstract

"composição para a produção de oocistos, métodos para coletar oocistos de protozoários nas fezes de animais, para esporular e para sanitizar oocistos de protozoários, meio de flotação para purificar oocistos de protozoários métodos para purificar oocistos de protozoários mediante flotação, e para produzir oocistos de protozoários, composição aquosa para reduzir a agregação entre os oocistos de protozoários". a presente invenção fornece métodos melhorados e composições para produzir oocistos. os oocistos produzidos de acordo com a invenção encontram aplicação na fabricação de vacinas. nas modalidades preferidas, a presente invenção fornece métodos e composições para a produção de oocistos de eimeria. as vacinas contendo oocistos, esporocistos e/ou esporozoítos de eimeria produzidos de acordo com a presente invenção podem ser usadas para imunizar pássaros contra a coccidiose, ou in ovo ou após o choco.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA ESPORULAÇÃO DE OOCISTOS VIÁVEIS DE EIMERIA".

INFORMAÇÃO DE PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório dos Estados Unidos n° 60/316.310, depositado em 30 de agosto de 2001, o qual é aqui incorporado como referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece métodos e composições para a produção de oocistos de oriundos de protozoários; em particular, a presente invenção fornece métodos e composições para a produção de oocistos de Eimeria.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A coccidiose de aves domésticas é uma doença causada por parasitas protozoários do gênero Eimeria. Os oocistos da espécie Eimeria são ubíquos no ambiente e persistem por muitos meses no ninho de aves domésticas. A ingestão de oocistos conduz à infecção das várias regiões do trato intestinal de uma maneira específica da espécie. O organismo prolifera nos intestinos durante um período de vários dias, resultando na excreção da geração seguinte de oocistos nas fezes. Os ciclos múltiplos de infecção conduzem à imunidade, e, quando a infecção se apresenta como um floco no início e em uma dosagem uniforme entre o floco, a imunidade desenvolvida através dos vários ciclos de exposição pode ser bastante forte.

Ao contrário, quando os ássaros não se apresentam com a infecção de uma maneira uniforme, situações podem aparecer em que pássaros ingênuos sejam submetidos a infecção maciça súbita, levando a fraco desempenho em termos de transformação em alimentos e ganho de peso, e a um alto risco de infecções secundárias. Presentemente, o método mais comum usado para o controle da coccidiose na indústria de aves domésticas é a não vacinação, mas de preferência a administração de medicamentos anticoccídicos na alimentação. O baixo índice de vacinação é freqüentemente atribuído à incerteza na uniformidade na dosagem através do alimento ou da água na instalação de desenvolvimento ou pela vacinação de gabinete de pulverização na incubadora, as quais são as vias e tempos de administração tradicionais. Existe o interesse crescente em melhorar a uniformidade de liberação durante a administração na incubadora.

Recentemente, as técnicas de vacinação in ovo têm sido julgadas aplicáveis à administração de uma vacina de coccidiose à base de oocistos vivos (WO 96/40234 e WO 96/40233; Pfizer, Inc.). A via de administração in ovo fornece um método conveniente de liberar uma dose uniforme de vacina a cada embrião, enquanto ele ainda está no ovo. A liberação de vacinas aviárias in ovo é correntemente praticada para aproximadamente 85% dos 9 bilhões de frangos produzidos nos Estados Unidos a cada ano, e em um percentual crescente dos 21 bilhões de pássaros produzidos fora dos Estados Unidos a cada ano (ver, por exemplo, a Patente U.S. n° 4.458.630. Portanto, o mercado potencial para uma vacina de coccidiose liberada in ovo, viva, é consideravelmente maior do que o mercado presente para vacinas de coccidiose liberadas após o choco.

Os oocistos para uso em uma vacina da coccidiose viva são liberados das fezes dos frangos, que se acham inicialmente carregadas de microorganismos contaminantes. Tipicamente, as agências reguladoras exigem que as vacinas liberadas in ovo se apresentem essencialmente livres de microorganismos contaminantes. Para mais completamente garantir que os níveis de biocarga sejam completamente minimizados no produto final, é benéfico usar composições e metodologias que efetivamente controlem o nível de microorganismos contaminantes em cada estágio do processo de produção de oocistos, incluindo os processos de coleta e esporulação, assim como o processo de sanitização. Métodos correntes de produzir oocistos para fabricação de vacinas podem sofrer de um inconveniente, em que eles freqüentemente utilizam materiais que são bioperigosos ou corrosivos para com o equipamento.

Conseqüentemente, existe a necessidade na técnica de métodos melhoradas de produzir oocistos de protozoários, especialmente para uso na fabricação de vacinas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a métodos e composições melhoradas para produzir oocistos protozoários (por exemplo, Eimeria), por exemplo para uso na fabricação de vacinas. Com particular respeito às vacinas para aves domésticas, a invenção é adequada para produzir vacinas para uso após o choco ou in ovo. Da mesma forma, a vacina pode ser usada nos frangos, na postura, no animal reprodutor, nos perus, por praticantes de hobby e/ou nas indústrias de pássaros domesticados.

Conseqüentemente, como um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para a produção de oocistos, compreendendo um composto de peroxigênio e um ácido orgânico, referida composição tendo um pH acídico. A composição pode ser usada para a coleta, esporulação e/ou sanitização de oocistos protozoários.

Assim, como um outro aspecto, a presente invenção fornece um método para coletar oocistos protozoários nas fezes dos animais, compreendendo as etapas de: (a) fornecer um animal infectado com um protozoário, em que o animal esteja espalhando oocistos dos protozoários em suas fezes, e (b) colocar em contato as fezes que contenham os oocistos do animal infectado, com a composição contendo um composto de peroxigênio e um ácido orgânico.

Em modalidades particulares do precedente, ou o composto de peroxigênio ou o(s) ácido(s) orgânico(s) é omitido da composição, em particular quando usado como um meio de coleta.

Como ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece um método de oocistos de protozoários esporulantes, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma composição compreendendo oocistos de protozoários, e (b) esporular os oocistos na composição que compreende um composto de peroxigênio e ácido orgânico por um tempo e sob condições adequadas para esporulação.

Como ainda um outro aspecto, a invenção fornece um método para sanitizar oocistos de protozoários, compreendendo (a) fornecer uma preparação compreendendo oocistos de protozoários, e (b) sanitizar os oocistos na composição que compreende um composto de peroxigênio e ácido orgânico por um período e sob condições suficientes para se obter o nível desejado de sanitização da preparação.

Como outro aspecto ainda, a presente invenção fornece um meio de flotação para purificar oocistos de protozoários, compreendendo uma solução não iônica, de alta densidade, e um policátion. Em outras modalidades, a invenção fornece um meio de flotação para purificar oocistos protozoários, compreendendo uma solução não iônica de alta densidade, e óleo. A invenção também fornece métodos de purificar oocistos de protozoários mediante flotação, compreendendo as etapas de: (a) formar uma suspensão entre um meio de flotação como descrito acima e uma pluralidade de oocistos de protozoários, (b) permitir que a suspensão se separe, e (c) recuperar os oocistos de protozoários da suspensão separada.

Nas modalidades particulares dos aspectos precedentes da invenção, o protozoário compreende uma espécie de Eimeria e o animal é um pássaro.

Como outro aspecto ainda, a presente invenção fornece um método para produzir oocistos de protozoários de uma ave, compreendendo as etapas de: (a) infectar um ser avícola com um protozoário por um tempo suficiente para que os oocistos do protozoário sejam espalhados nas fezes da ave infectado, (b) coletar as fezes contendo os oocistos da ave infectado, e (c) alimentar a ave infectada com uma dieta que tenha um grande tamanho médio de partícula por pelo menos cerca de 1 dia antes e durante pelo menos uma parte da referida etapa de coleta. Em modalidades particulares, o protozoário compreende uma espécie do gênero Eimeria.

Os aspectos precedentes e outros da presente invenção são explanados em mais detalhes na descrição apresentada abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será agora descrita com referência às modalidades preferidas da invenção. A invenção pode, entretanto, ser expressa em diferentes formas e não deve ser interpretada como limitada às modalidades aqui apresentadas. De preferência, estas modalidades são fornecidas de modo que esta apresentação seja perfeita e completa, e transmita completamente o escopo da invenção àqueles versados na técnica. A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade normal na técnica a que esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção neste relatório é para os fins de descrever as modalidades particulares apenas e não intenta ser limitativa da invenção.

Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. A terminologia usada na descrição da invenção neste relatório tem por finalidade descrever modalidades particulares apenas e não intenta ser limitativa da invenção. Como usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” intentam incluir as formas plurais também, a menos que o contexto claramente indique de outra forma. A presente invenção é adequada para os usos tanto médicos quanto veterinários. Os termos “animal” e “seres animais” incluem, mas não ficam limitados, seres mamíferos e avícolas, preferivelmente seres avícolas.

Seres mamíferos adequados incluem, sem limitação, seres humanos, símios, porcinos, bovinos, caprinos, eqüinos, felinos, ovinos, murinos e lagomorfos.

Os termos “avícola” e “seres avícolas” ou “pássaro” e “seres pássaros” como aqui usado, intentam incluir machos e fêmeas de qualquer espécie aviária ou de pássaro, mas são principalmente destinados a abranger aves domésticas que sejam comercialmente criadas para ovos, carne ou como animais de estimação. Conseqüentemente, os termos “avícola” e “ser avícola” ou “pássaro” ou “ser pássaro” são particularmente destinados a abranger frangos, perus, patos, gansos, codomas, faisão, periquitos, papagaios, cacatuas, periquito australiano (cockatiel), avestruz, ema e outros. Os frangos e os perus são os seres avícolas ou pássaros preferidos, com os frangos sendo os mais preferidos. A presente invenção diz respeito, de uma maneira geral, a métodos e composições para a produção de oocistos de protozoários. Tais métodos e composições encontram uso, por exemplo, nos métodos de fabricação de vacinas. Muitos protozoários formam um estágio vital designado como um “oocisto”. A invenção pode ser praticada para produzir oocistos de qualquer espécie de protozoários, incluindo, sem limitar, Eimeria, Cryptosporidium, Toxoplasma, Pasmodia e Isospora. Nas modalidades da invenção, a invenção é usada para produzir oocistos de Eimeria.

Os termos “protozoário”, “oocisto”, “esporocisto”, “esporozoíto” e “merozoíto” têm seus significados aceitos na técnica. A menos que de outro modo indicado, estes termos se referem a protozoários, oocistos, esporocistos, esporozoíto e merozoíto vivos, embora aqueles versados na técnica observarão que as vacinas podem ser formuladas usando- se protozoários, oocistos, esporocistos, esporozoíto e merozoíto mortos (ou atenuados). O termo “Eimeria” significa uma ou mais espécies do gênero Eimeria. Tais espécies Eimeria incluem aquelas que são encontradas em frangos, incluindo E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. mivati e E. brunetti, e também aquelas que são encontradas em perus, incluindo E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua e E. subrotunda. O termo “Eimeria” também inclui cepas ou espécies de Eimeria que infectam outras espécies de pássaros ou de mamíferos. Além disso, o termo “Eimeria” inclui todas as cepas das espécies acima de Eimeria, incluindo, mas não limitando, as cepas do tipo selvagem, cepas precoces ou de outra forma selecionadas, cepas atenuadas, e oocistos que tenham sido atenuados, por exemplo por irradiação, tratamento químico, e outros. Além disso, o termo “Eimeria” também inclui quaisquer cepas ou espécies recém-verificadas de Eimeria. Finalmente, o termo “Eimeria” abrange Eimeria viva ou morta, embora a Eimeria viva seja a pretendida, a menos que de outra forma indicado.

As composições que compreendem oocistos de Eimeria encontram uso nos métodos de imunizar pássaros contra a coccidiose. Os métodos de vacinar pássaros contra a coccidiose são conhecidos na técnica, e incluem os métodos de vacinação in ovo (por exemplo as publicações de patentes internacionais WO 96/40234 e WO 96/40233; Pfizer Inc.) e pós- choco (por exemplo a Patente U.S. 3.147.186 para Edgar, a Patente U.S. 5.055.292 para McDonald et ai; e a Patente U.S. 4.438.097 para Shirley et al.).

Aqueles versados na técnica observarão que os oocistos podem ser ainda processados para liberar outros estágios vitais (por exemplo, esporozoítos ou esporocistos) para uso na composição final da vacina, ou para produzir proteínas protozoárias para fins de vacinação.

Da mesma forma, o termo “protozoários” inclui cepas do tipo selvagem, cepas precoces ou de outra forma selecionadas, cepas atenuadas, e oocistos que tenham sido atenuados, por exemplo por irradiação, tratamento químico e outros. Além disso, o termo “protozoários” também inclui quaisquer cepas ou espécies recém-verificadas de protozoários. Finalmente, o termo “protozoários” cobre protozoários vivos e mortos, embora os protozoários vivos sejam pretendidos, a menos que de outra forma indicado.

Os termos “produzir”, “produzindo” ou “produção” de oocistos, etc., encerra as etapas de infectar um animal (por exemplo, um pássaro) e daí coletar fezes contendo oocistos, esporular, purificar e/ou sanitizar os oocistos, etc. Assim, os termos “produzir”, “produzindo” ou “produção” se referem ao processo inteiro de colher oocistos de um animal e purificar os oocistos do material fecal, ou às etapas individuais (ou um subconjunto de etapas) no processo. A menos que de outra forma indicado, os termos “purifica(m)”, “purificação”, “purificando” e “purificado” como aqui usados com respeito às preparações de oocistos, se referem à separação ou remoção dos detritos e outro material indesejável, das preparações que contêm os oocistos. Estes termos intentam indicar que o grau de isolamento ou separação dos oocistos de outro material presente nas fezes são intensificados, não que absolutamente todos os materiais estranhos sejam removidos das preparações de oocistos. Da mesma forma, a preparação de oocistos pode conter algum grau de contaminação microbiana, contanto que a preparação final seja adequada para seu uso pretendido (por exemplo, como uma vacina). No caso de vacinas destinadas à administração in ovo a pássaros, nas modalidades particulares, a preparação será essencialmente livre de contaminação detectável por microorganismos, em particular microorganismos que sejam patogênicos (isto é, causem doença significativa ou mortalidade) ao embrião.

Dependendo do contexto, um processo de “purificação” pode referir-se ao processo inteiro de purificar oocistos das fezes para produzir uma preparação adequada para fins de vacinação. Altemativamente, um processo de “purificação” pode referir-se a qualquer subconjunto de etapas, ou mesmo uma etapa única, dentro do esquema inteiro de purificação. A presente invenção fornece métodos e composições para produzir oocistos (por exemplo, oocistos de Eimeria). Os oocistos que são produzidos são geralmente de infecciosidade, viabilidade e pureza suficientes para a fabricação de uma composição imunogênica para uso em vacinação. Os métodos e composições da invenção podem ser usados em combinação com outros métodos conhecidos na técnica. Da mesma forma, os vários métodos e composições da invenção podem ser usados isoladamente ou em combinação uns com os outros. Métodos de produzir oocistos, tais como os oocistos de Eimeria, são conhecidos na técnica [ver, por exemplo, a Patente U.S. 3.147.186 para Edgard; as Patentes U.S. 4.544.548 e 4.863.731 para Davis et al., a publicação de patente internacional WO 00/50072 (Pfizer, Inc.), e a publicação de patente internacional WO 02/37961 (Novus International, Inc.);

Hammond et al., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5: 70; Hill et al., (1961) J. Parasit. 47: 357; Jackson, (1964) Parasitology 54: 87; Lotze et al., (1961) J. Parasit. 47: 588; Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31: 181; Whitlock, (1959) Aust.

Vet. J. 35: 310. Em geral, estes métodos envolvem infectar um animal com o protozoário de interesse, coletar as fezes que contêm os oocistos do animal infectado, purificar os oocistos do material fecal através de uma série de procedimentos de separação tais como peneiração, centrifugação, filtração e/ou flotação da densidade, esporular os oocistos, etapas adicionais opcionais de separação e, opcionalmente, sanitizar os oocistos esporulados para inativar os microorganismos contaminantes (incluindo bactérias, mofo, fungos, leveduras e vírus). Preparações diferentes de oocistos (por exemplo, de espécies ou cepas diferentes) podem ser combinadas para formar um produto final, por exemplo uma vacina contra espécies múltiplas de protozoários (por exemplo, Eimerid).

As expressões “contaminação microbiana” ou “contaminação por microorganismos” intentam indicar a presença de microorganismos viáveis detectáveis e indesejáveis, incluindo, sem limitar, bactérias, mofo, fungos, leveduras e vírus. Em modalidades particulares, a preparação dos oocistos é essencialmente livre de contaminação microbiana detectável, significando que nenhum nível significativo de contaminação microbiana é detectado na preparação. A abreviatura “v/v” se refere a “volume/volume”. Da mesma forma, a abreviação “w/v” se refere a “peso/volume”.

Os aspectos individuais da presente invenção são descritos em mais detalhes abaixo.

COMPOSIÇÕES IMUNOGÊNICAS

As composições imunogênicas produzidas com o uso dos métodos da presente invenção podem ser administradas a um ser animal para vacinar contra a doença de protozoários. Uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) que contenha oocistos produzidos com o uso dos métodos da presente invenção pode ser administrada para eliciar uma resposta imunogênica. Tipicamente, a composição imunogênica compreende uma quantidade imunogênica de oocistos como aqui apresentado em combinação com um portador farmaceuticamente aceitável. Uma “quantidade imunogênica” é uma quantidade dos oocistos que seja suficiente para iniciar ou evocar uma resposta imune no ser ao qual a composição imunogênica seja administrada. Como entendido por aqueles habilitados na técnica, a composição imunogênica pode ser formulada com organismos vivos, atenuados e/ou mortos. No caso de uma vacina da coccidiose viva liberada in ovo, a quantidade de oocistos é geralmente suficiente para produzir uma infecção inicial de nível relativamente baixo, a qual é então seguida por séries múltiplas de reinfecção, através de reciclagem, finalmente conduzindo à imunidade. O exame acima é dirigido a oocistos, mas também é aplicável a outras formas de vida, tais como os esporozoítos ou os esporocistos.

Por “farmaceuticamente aceitável” denota-se um material que não é biologicamente ou de outra forma indesejável, isto é, o material pode ser administrado a um ser sem causar quaisquer efeitos biológicos indesejáveis. Assim, uma tal composição farmacêutica pode ser usada, por exemplo para preparar composições para imunização. Portadores fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis podem conter outros compostos que incluam, mas não limitem, estabilizadores, sais, tampões, adjuvantes e/ou preservativos (por exemplo agentes antibacterianos, antifungicos e antivirais), como é sabido na técnica. O portador farmaceuticamente aceitável não necessita ser estéril, embora ele geralmente seja para administração in ovo a embriões avícolas.

Qualquer via de administração da composição imunogênica conhecida na técnica pode ser empregada, contanto que uma resposta imune ativa (preferivelmente uma resposta imune protetora) contra os protozoários seja eliciada. Quando o ser seja um pássaro, a composição imunogênica pode ser administrada in ovo ou após choco. Vias de administração exemplares são a administração oral de após choco ou a injeção in ovo no âmnio. Nas modalidades particulares da invenção, a administração in ovo usando equipamento automático de injeção é empregada.

Os termos “vacinação” ou “imunização” são bem entendidos na técnica. Por exemplo, os termos vacinação ou imunização podem ser entendidos como sendo um processo que aumenta uma reação imune do ser ao antígeno e, portanto, sua capacidade para resistir ou superar a infecção. Métodos in ovo de vacinação de pássaros contra Eimeria são conhecidos na técnica (por exemplo, as publicações de patentes internacionais WO 96/40234 e WO 96/40233; Pfizer, Inc.).

As expressões “imunidade protetora” ou “resposta imune protetora”, como aqui usadas, intentam significar que o animal hospedeiro atinge uma resposta imune ativa à vacina, de tal forma que, após a exposição subseqüente a uma prova, o animal é capaz de combater a infecção. Assim sendo, uma resposta imune protetora reduzirá a incidência da morbidez e da mortalidade de exposição subseqüente ao patógeno entre os animais tratados.

Aqueles versados na técnica entenderão que, em um ambiente de criação comercial de animais, a produção de uma resposta imune protetora pode ser avaliada pela avaliação dos efeitos da vacinação sobre o rebanho ou manada como um todo, por exemplo, pode ainda haver sinais da doença ou da morbidez e mortalidade em uma minoria dos animais vacinados.

Por “resposta imune ativa”, denota-se qualquer nível de proteção proveniente da exposição subseqüente aos protozoários ou antígenos de protozoários que seja de algum benefício em uma população de seres, quer na forma de mortalidade reduzida, lesões reduzidas, relações de conversão alimentar melhoradas, ou a redução de qualquer outro efeito prejudicial da doença, etc., não obstante seja a proteção parcial ou completa. Uma “resposta imune ativa” ou “imunidade ativa” é caracterizada pela “participação dos tecidos e células do hospedeiro após um encontro com o imunógeno. Ela envolve a diferenciação e proliferação das células imunocompetentes nos tecidos linforreticulares, que conduzem à síntese do anticorpo ou ao desenvolvimento da reatividade mediada pelas células, ou a ambos. Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Funcíion and Cellular Interacíions in Antibody Formation, em IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed.5 1985). Altemativamente estabelecida, uma resposta imune ativa é montada pelo hospedeiro após a exposição aos imunógenos mediante infecção, ou, como no presente caso, por vacinação. A imunidade ativa pode ser contrastada com a imunidade passiva, que é adquirida através da “transferência de substâncias preformadas (anticorpo, fator de transferência, enxerto tímico, interleucina-2) de um hospedeiro ativamente imunizado para um hospedeiro não imune”. Id.

COLETA E ESPORULACÂO DE OOCISTOS

Os oocistos são tipicamente coletados nas fezes de animais infectados e, depois, esporulados na presença de oxigênio antes de atingir a infecciosidade. Em conformidade com muitos métodos convencionais, os oocistos são coletados e esporulados em uma solução contendo bicromato de potássio a 2,5%. O bicromato de potássio atua como uma solução antimicrobiana e como uma fonte de oxigênio para a esporulação dos oocistos. No entanto, o bicromato de potássio é um material perigoso e requer descarte especial como resíduo perigoso. De acordo com métodos convencionais, o bicromato de potássio é removido da preparação de oocistos para produzir um produto final que seja essencialmente isento deste composto perigoso.

De acordo com os métodos da técnica anterior, as fazes contendo oocistos podem ser coletadas secas ou em um meio fluido contendo bicromato de potássio durante o período de débito máximo para cada espécie (por exemplo, de cerca de três, quatro ou cinco dias a cerca de seis a nove dias após a inoculação para as espécies Eimeria). Após o período de coleta, os oocistos são então submetidos à separação inicial dos detritos fecais com o uso de técnicas tais como peneiramento ou flotação da densidade, e depois colocados em meio de bicromato de potássio fresco, agitados e aerados por 48 a 72 horas, para intensificar o processo de esporulação.

Na Patente U.S. 3.147.186 para Edgar, é descrita a esporulação dos oocistos de Eimeria usando-se bicromato de potássio 1% a 4% como o meio de esporulação. Esta patente estabelece que “Este(Seu) composto atende às várias finalidades de atuar como um agente antibacteriano, antifungico e antiviral, e de também fornecer oxigênio aos oocistos durante e após a esporulação, de modo a ajudar a preservar sua viabilidade”. (Coluna 11, linhas 47 a 50).

Ryley et al. [(1976) Parasitology 73(3): 311-326] descrevem o uso de soluções de bicromato de potássio a 2,5% como um meio de coleta, espomlação e armazenagem a longo prazo.

Cost 89/820, Biotechnology, Guidelines on techniques in coccidiosis research. Eckert, J., R. Braun, M. W. Shirley e P. Coudert, editores. 1995. A European Commission, directorate-General XII, Science, Research and Development, Agriculture Biotechnology, Luxemburgo, p. 8, também descreve o uso de bicromato de potássio a 2,5% na produção de oocistos. A presente invenção fornece um meio para coletar oocistos, o meio de coleta compreendendo um composto de peroxigênio e um ácido orgânico. O meio de coleta terá de preferência um pH acídico (por exemplo, pH de menos do que cerca de 7, 6, 5, 4 ou 3) para controlar o crescimento de microorganismos indesejáveis, e pode conter outros compostos antimicrobianos também. Em modalidades particulares, o pH do meio de coleta situa-se na faixa de cerca de 1 a cerca de 3.

Os oocistos podem ser coletados das fezes, dos núcleos cecais, dos revestimentos intestinais, etc., de animais infectados. Para fins comerciais, entretanto, os oocistos serão tipicamente coletados nas fezes. As fezes são colocadas em contato com o meio de coleta, que pode atender a uma ou mais finalidades, por exemplo pode ter propriedades antimicrobianas (por exemplo, antibacterianas, antifungicas, antivirais, e outras) e/ou podem fornecer oxigênio para manter a viabilidade dos oocistos. O oxigênio no meio de coleta pode também induzir a esporulação durante o período de coleta e pode encurtar ou até eliminar uma etapa separada de esporulação.

Por “coletar” ou “coleta de” fezes ou oocistos no meio de coleta da invenção, não é necessário que as fazes/oocistos sejam coletados diretamente no meio de coleta. As fezes/oocistos podem ser coletados “secos” e, depois, transferidos para o meio de coleta da invenção. Nas modalidades da invenção, as fezes/oocistos são transferidos para o meio de coleta inventivo dentro de cerca de 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 12, 24, 36 ou 48 horas após a produção fecal. Nas modalidades ilustrativas, as fezes contendo os oocistos são apanhadas em uma correia móvel ou em uma superfície inclinada e, depois, transferidas para um vaso de coleta contendo um meio de coleta da invenção.

As fezes podem ser pulverizadas com o meio de coleta durante a transferência (isto é, na correia transportadora ou superfície inclinada) para o vaso de coleta. A relação de fezes para o meio de coleta não é crítica, contanto que seja suficiente para controlar o desenvolvimento microbiano e, se desejável, iniciar o processo de esporulação. Relações exemplares de fezes para o meio de coleta são de cerca de 1:0,25, de cerca de 1:0,5, de cerca de 1:1, de cerca de 1:2, de cerca de 1:3, de cerca de 1:4, de cerca de 1:5 ou de cerca de 1:10 (v/v).

Qualquer composto de peroxigênio conhecido na técnica pode ser usado no meio de coleta. Compostos exemplares incluem peróxido de hidrogênio, perborato de sódio (por exemplo a forma monoidrato ou tetraidrato), percarbonato de sódio, peróxido de magnésio, peróxido de cálcio, peróxido de zinco, peróxido de uréia, e uma combinação destes. Os compostos de peróxido podem ser usados com ou sem um ativador, tal como o tetraacetiletilenodiamina (TAED). O TAED é tipicamente usado em uma concentração de cerca de 1 a 3%. O composto de peroxigênio é incluído no meio de coleta em uma concentração suficiente para se obter o efeito pretendido (por exemplo, a ação antimicrobiana e/ou a esporulação), mas insuficiente para ocasionar dano indevido aos oocistos. A concentração do composto de peroxigênio pode ser tão baixa quanto cerca de 0,05, 0,1, 0,25, 0,5 ou 1% (v/v) ou (w/v), e tão elevada quanto cerca de 0,5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 15% (v/v) ou (p/v) ou mais.

Quando o composto de peroxigênio é peróxido de hidrogênio, a concentração no meio é tipicamente de cerca de 0,1%, 0,25% ou 0,5% (v/v) a cerca de 1%, 3% ou 5% (v/v). O ácido orgânico pode ser qualquer ácido orgânico conhecido na técnica, incluindo o ácido cítrico, o ácido acético, o ácido propiônico, ou quaisquer outros ácidos mono- ou poli-acéticos, ou uma combinação destes. A concentração do ácido orgânico no meio pode ser de cerca de 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 8% ou 10% (v/v) ou (p/v), ou maior. A concentração do ácido orgânico pode ainda ser menor do que cerca de 25%, 20%, 15%, 12%, 10% (v/v) ou (p/v), ou menor. Em modalidades particulares, o ácido orgânico é incluído em uma concentração de cerca de 1 a 15% ou de cerca de 3 a 10% (v/v) ou (p/v).

Em outras modalidades particulares, além do composto de peroxigênio, a composição contém de cerca de 1% a cerca de 20% ou de cerca de 2,5% a cerca de 10%, ou 15%, de ácido cítrico, e de cerca de 0,05% a cerca de 1% ou de cerca de 0,1% a cerca de 0,5% de ácido propiônico. O meio de coleta pode adicionalmente conter outros componentes, incluindo tampões, sais, agentes antimicrobianos e outros. Em modalidades particulares da invenção, um agente anti-espumante é incluído.

Os agentes anti-espumantes podem vantajosamente ser usados para reduzir a formação de espuma e a aglomeração dos oocistos.

Como será observado na técnica, os ácidos orgânicos podem ser relativamente dispendiosos. Assim, em certas modalidades, o(s) ácido(s) orgânico(s) pode(m) ser omitidos do meio de coleta.

Da mesma forma, existem certas circunstâncias em que pode ser desejável evitar o uso do composto de peroxigênio no estágio de coleta.

Assim, em modalidades particulares da invenção, o composto de peroxigênio é omitido do meio de coleta.

Em modalidades particulares, um composto de peroxigênio e/ou ácido(s) orgânico(s) pode(m) ser usado(s) com relação a uma coleta mais tradicional ou meio de esporulação contendo bicromato de potássio. Em outras modalidades particulares, os meios de coleta e de esporulação da invenção não contêm bicromato de potássio, e podem ser mais seguros de se usar e mais fáceis de dispor do que os meios que contenham bicromato de potássio. O meio de peroxigênio da invenção compreendendo um composto de peroxigênio e um ácido orgânico (cada um conforme descrito acima) pode altemativamente, ou adicionalmente, ser usado como um meio de esporulação. Observou-se que, quando o meio de peroxigênio é usado como um meio de coleta, um percentual significativo de oocistos de Eimeria é esporulado durante o período de coleta. Em modalidades particulares, pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais dos oocistos são esporulados durante o período de coleta (isto é, antes de qualquer etapa de purificação).

Em algumas modalidades, o meio de peroxigênio é usado como um meio de esporulação em uma etapa separada de esporulação para completar o processo de esporulação. Além disso, se o meio de coleta inventivo não for empregado (por exemplo, se um meio de coleta de bicromato de potássio for usado), é provável que uma etapa de esporulação designada seja realizada para se obter suficiente esporulação da preparação de oocistos.

Conseqüentemente, nas modalidades particulares, a presente invenção provê um método para esporular oocistos (por exemplo os oocistos de Eimeria), compreendendo as etapas de prover uma composição contendo oocistos, e esporulando-se os oocistos em um meio de esporulação da invenção por um tempo e sob condições adequadas para a esporulação.

Em se realizar a esporulação após o período de coleta, as fezes são tipicamente coletadas do animal, e depois opcionalmente submetidas a etapas de purificação, tais como peneiramento, filtração e outras. Os oocistos são então transferidos para o meio de esporulação, e a esporulação é geralmente deixada prosseguir por cerca de 24 a 96 horas, por exemplo por cerca de 48 a 72 horas sob condições apropriadas. Por exemplo, a solução pode ser misturada ou agitada e aerada durante o processo de esporulação.

Embora o meio de peroxigênio não precisa ser alterado entre os processos de coleta e de esporulação, para fins de fabricação comercial, haverá em geral uma ou mais etapas de purificação intervenientes e meio de esporulação frasco será adicionado antes da etapa de esporulação.

Em outras modalidades, o processo de esporulação é realizado simultaneamente com a coleta e/ou processo de sanitização (descrito abaixo). A relação de sólidos para o meio de coleta não é crítica, contanto que ela seja suficiente para se obter o nível desejado de esporulação e para controlar o desenvolvimento microbiano.

Exemplos de relações de fezes para o meio de coleta são de cerca de 1:0,25, de cerca de 1:0,5, de cerca de 1:1, de cerca de 1:2, de cerca de 1:3, de cerca de 1:4, de cerca de 1:5, ou de cerca de 1:10 (v/v).

Por exemplo, em uma modalidade ilustrativa, as fezes contendo os oocistos são coletadas no meio de coleta/esporulação da invenção. Os oocistos são purificados da matéria fecal usando-se as técnicas de peneiramento, flotação da densidade e/ou filtração. Os oocistos são então pelotizados por centrifugação e recolocados em suspensão em meio fresco de coleta/esporulação, e a esporulação é deixada prosseguir sob condições apropriadas (por exemplo, agitação e/ou aeração) por cerca de 48 a 72 horas.

Os protozoários esporulados podem então, opcionalmente, ser submetidos a procedimentos de purificação adicionais e/ou a sanitização (descritos abaixo). O uso do meio inventivo como um meio de coleta e/ou de esporulação, pode ser vantajoso no fato de que ele pode proteger os oocistos contra a secagem, reduzir a biocarga do início do período de coleta, prover altos índices de esporulação, e pode ser mais facilmente descartado do que os meios que contenham bicromato de potássio.

Em seguida à esporulação, podem ser adotadas etapas para remover o composto de peroxigênio, por exemplo com o uso de um processo enzimático, diálise e/ou filtração. Por exemplo, o composto de peroxigênio pode ser removido usando-se a decomposição catalítica (por exemplo um processo enzimático ou tratamento químico tal como com o dióxido de manganês), diálise e/ou filtração. No caso do peróxido de hidrogênio, a catalase pode ser usada para reduzir ou remover o peróxido de hidrogênio residual.

SANITIZAÇÃO DOS OOCISTOS

Uma etapa de sanitização é uma etapa opcional que será tipicamente empregada nos métodos de produzir oocistos para vacinas in ovo e é, algumas vezes, usada para vacinas de pós-choco também. Como é conhecido na técnica, os oocistos para uso nas preparações de vacinas são convencionalmente sanitizados usando-se soluções de hipoclorito de sódio, as quais podem causar dano às paredes do oocisto, enfraquecer a estrutura do oocisto e, potencialmente, reduzir a viabilidade de longo prazo dos oocistos sanitizados durante a armazenagem.

Vetterling, J. M. [(1969) J. Parasitology 55(2): 412-417] descreve a produção de oocistos estéreis com o uso de meio de hipoclorito.

Jackson, A. R. B [(1964) Parasitology 54: 87-93] também descreve o isolamento de esporozoítos coccidiais viáveis usando hipoclorito como um meio de sanitização.

Nyberg e Knapp [(1970) Proceeding of the Helminthological Society of Washington 37: 32-36] descreve o efeito do hipoclorito de sódio sobre a parede dos oocistos de Eimeria tenella, conforme foi mostrado por microscopia eletrônica.

Observou-se que o meio de coleta/esporulação descrito acima, contendo um composto de peroxigênio e ácido orgânico, também pode ser empregado como um meio de sanitização (estéril). Em modalidades particulares, o meio de sanitização ainda compreenderá hipoclorito (isto é, branqueador) ou outros agentes de sanitização conhecidos na técnica.

Em seguida à esporulação (descrita acima), a preparação dos oocistos pode ser submetida a procedimentos de purificação adicional (por exemplo, filtração de densidade, flotação e outros) seguidos por sanitização.

Altemativamente, uma etapa de sanitização pode ser usada antes ou simultaneamente com a etapa de esporulação. Geralmente, entretanto, é vantajoso sanitizar os oocistos perto do final do processo de purificação, já que as etapas após a sanitização serão realizadas usando-se procedimentos e reagentes estéreis.

Por “sanitizar” ou “sanitização” ou “sanitizado”, intenta-se que exista uma redução na carga microbiana contaminante (isto é, microorganismos viáveis de contaminação, como definido acima) na preparação dos oocistos. Não é necessário que a preparação dos oocistos contenha absolutamente qualquer contaminação microbiana, contanto que a preparação final seja adequada para seu uso pretendido (por exemplo como uma vacina). No caso de vacinas destinadas a administração in ovo a pássaros, a preparação será em geral essencialmente livre de contaminação microbiana detectável (isto é, nenhum nível significativo de microorganismos contaminantes seja detectado). Em outras modalidades, existe uma redução de pelo menos cerca de 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais nos microorganismos contaminantes detectáveis, em comparação com o nível na ausência de sanitização. Métodos de detectar microorganismos são conhecidos na técnica e dependem da classe de microorganismo que esteja sendo detectado.

Conseqüentemente, a presente invenção provê um método para sanitizar oocistos, compreendendo a etapa de fornecer uma composição t contendo oocistos, e sanitizar os oocistos em um meio de sanitização da invenção (conforme descrito acima) por um período e sob condições suficientes para se obter o nível desejado de sanitização da composição. Nas modalidades da invenção, o processo de sanitização resulta em uma preparação com um nível de contaminação microbiana que seja adequado para administração a um ser animal (por exemplo, nos métodos de vacinação in ovo). O procedimento de sanitização pode ser realizado por qualquer extensão de tempo adequada, tipicamente por cerca de uma hora a cerca de 12, 24 ou 48 horas.

Em outras modalidades particulares, os processos de esporulação e de sanitização são realizados simultaneamente. A temperatura do processo de sanitização não é crítica e pode, em geral, ser realizado em uma temperatura de cerca de 4°C a cerca de 40°C.

Preferivelmente, os oocistos não são submetidos a congelamento ou a exposição prolongada a altas temperaturas (por exemplo, a exposição a 40°C deve tipicamente ser por menos do que umas poucas horas ou mesmo por menos do que 1 hora). Em uma modalidade exemplar, a sanitização é realizada por cerca de 24 a 72 horas em cerca de 30°C. A relação da preparação de oocistos para o meio de sanitização não é crítica contanto que ela seja suficiente para reduzir o desenvolvimento microbiano ao nível desejado. Relações exemplares de fezes para o meio de coleta são de cerca de 1:0,25, de cerca de 1:0,5, de cerca de 1:1, de cerca de 1:2, de cerca de 1:3, de cerca de 1:4, de cerca de 1:5 ou de cerca de 1:10 (v/v).

Em seguida à sanitização, as etapas podem ser conduzidas para remover o composto de peroxigênio, por exemplo usando a decomposição catalítica (por exemplo, um processo enzimático ou tratamento químico tal com dióxido de manganês), diluição, diálise e/ou filtração. Por exemplo, no caso do peróxido de hidrogênio, a catalase pode ser usada para reduzir ou remover o peróxido de hidrogênio residual.

Como outra etapa opcional, a preparação de oocistos pode ser colocada em contato com (por exemplo, pulverizada, lavada ou misturada com) uma composição que reduza a agregação entre os oocistos, tal como uma solução (por exemplo, uma solução aquosa) contendo proteína, peptídeos, hidrolisado protéico e/ou aminoácidos. Os compostos ilustrativos incluem, sem limitar, a proteína de soja, o hidrolisado de soja, a caseína, o hidrolisado de caseína, a lisozima, o albúmen, albúmen de soro bovino, proteínas do leite, aminoácidos (por exemplo arginina, fenilalanina e/ou ácido aspártico), soro fetal de bezerro, soro de frango, leite integral, e outros. Em uma modalidade particular, a solução anti-agregação compreende um aminoácido positivamente carregado, um aminoácido negativamente carregado e um aminoácido neutro.

Tipicamente, a concentração de cada componente na solução será de 0,01M a 10M, de cerca de 0,05M a 5M, ou de cerca de 0,05M a cerca de 2M. O pH da solução pode ser escolhido de acordo com os componentes específicos usados no meio, e pode situar-se na faixa acídica, neutra ou alcalina. Nas modalidades particulares, o pH da solução anti- agregação situa-se na faixa neutra. Por exemplo, a solução pode ser tamponada com solução salina de tampão de fosfato (pH 7) ou Solução Salina Balanceada de Hanks (pH 7).

Outros compostos podem ser usados também para reduzir a agregação, tal como um agente anti-formação de espuma (por exemplo, o anti-espuma A).

Os oocistos podem ser colocados em contato com o meio anti- agregação em qualquer ponto no processo de purificação em que seja desejável reduzir a agregação entre os oocistos. Podem ser vantajosamente usados após o processo de sanitização. Nas modalidades específicas, na ausência de uma etapa de sanitização (por exemplo, em alguns produtos de vacina de após o choco), este processo pode ser usado para reduzir a agregação no produto final. Altemativamente, ou adicionalmente, a solução anti-agregação pode ser adicionada à formulação final para reduzir nela a agregação de oocistos.

MEIO DE FLOTAÇÂO PARA SEPARAÇÃO DE OOCISTOS

Uma técnica convencional usada para purificar os oocistos do material fecal e de outros detritos indesejáveis confia na flotação da densidade dos oocistos através de um meio de alta densidade, tal como uma solução saturada de cloreto de sódio ou de sacarose, e recuperação da fração que contém os oocistos. Os métodos de flotação podem ser usados antes e/ou após a esporulação. As soluções iônicas, tais como o cloreto de sódio, podem danificar os oocistos após exposição prolongada (Ryley e Ryley, (1978) Parasitology 77: 33-39). Soluções não iônicas, tais como uma solução concentrada de sacarose, também têm sido usadas nos procedimentos de flotação. Um inconveniente de qualquer reagente sólido, tal como o cloreto de sódio ou a sacarose, é que ele deve ser dissolvido em uma solução aquosa antes do uso.

Nas Patentes U.S. n— 4.544.548 e 4.863.731 para Davis et al., um método para controle da coccidiose em aves domésticas é demonstrado.

Estas patentes descrevem o uso de um processo salino de flotação, isto é, flotação em uma solução densa de sal usando-se a centrifugação, e seguida por diluição e recuperação dos oocistos em uma segunda etapa de centrifugação.

Ryley et al. [(1976) Parasitology 73(3): 311-326] descreve um método para separar oocistos das fezes com o uso de flotação de sacarose, cloreto de sódio e sulfato de zinco.

Vetterling, J. M. [(1969) J. Parasitology 55(2): 412-417] descreve técnicas de centrifugação de fluxo contínuo: flotação em solução de sacarose em alta densidade, diluição com água, e recuperação dos oocistos por centrifugação adicional.

Marquardt, W. C. [(1961) J. Parasitology 47: 248-250] descreve a separação de ovos de nematódeos dos detritos fecais mediante centrifugação de gradiente. Patnaik, B. [(1966) Indian Vet. J. 43: 414-422] apresenta uma técnica de obter oocistos de coccídios no estado puro, das fezes de frango mediante uma modificação do método de Marquardt.

Sharma e Reid [(1963) J. Parasitology 49: 159-160] apresenta um método de limpeza para oocistos coccidiais usando sedimentação de gradiente de densidade. A publicação da patente internacional WO 00/50072 (Pfizer, Inc.) descreve o uso de um processo de flotação de sulfato de sódio.

Dulski et al., (1988) Avian Diseases 32: 235, descrevem o uso de suspensões de sílica coloidal (Percoll®) para flotação de densidade de oocistos. A presente invenção provê um meio de flotação para purificar oocistos de matéria indesejável, compreendendo um líquido não iônico de alta densidade e uma molécula ou partícula de policátion. O líquido não iônico de alta densidade pode ser qualquer líquido aquoso que tenha uma densidade de cerca de 1,08, 1,1, 1,12, 1,14, 1,16, 1,18 ou 1,2 g/ml. Tipicamente, a densidade não será mais elevada, já que a maior parte do equipamento de centrifugação comercial não se destina ao uso com soluções de densidade superior. Nas modalidades da invenção, a solução não iônica de alta densidade é glicerol, sorbitol, sacarose, xarope de milho de alto teor de ffutose, hidroximetilcelulose, ou uma combinação destes.

Verificou-se que as moléculas ou partículas policatiônicas podem ser usadas para melhorar a remoção de detritos característicos de meios de flotação não iônicos. Qualquer policátion adequado conhecido na técnica pode ser incluído no meio de flotação. Policátions ilustrativos incluem arginina, histidina, lisina, dietilaminoetil-celulose (DEAE-celulose), e íons de metais polivalentes (por exemplo os sais de ferro ou de alumínio, tais como o sulfato de alumínio e o cloreto férrico). A concentração do policátion não é crítica, mas é de preferência suficientemente elevada para promover a floculação de detritos, mas insuficiente para danificar indevidamente os oocistos. Concentrações exemplares do policátion no meio são de cerca de 0,01M, 0,05M ou 0,1M a cerca de 0,5M, 1M, 3M ou superiores. O meio de flotação pode conter outros ingredientes tais como tampões ou agentes antimicrobianos. Em modalidades particulares, o meio de flotação inclui um detergente não iônico (por exemplo, Tween-20) e/ou um agente anti-espumante (anti-espuma A) para reduzir a probabilidade dos oocistos formarem agregados. A presente invenção também abrange métodos de purificar oocistos usando um procedimento de flotação da densidade. Em modalidades particulares, o método compreende: colocar em suspensão uma preparação que contenha os oocistos em uma composição compreendendo líquido não iônico de alta densidade e um policátion para formar uma suspensão sob condições suficientes para resultar em flotação dos oocistos, e recuperar os oocistos da suspensão. Em geral, o material que contenha os oocistos é misturado com a solução de flotação, e a solução é deixada separar-se, com os oocistos permanecendo na fração sobrenadante e os detritos fecais formando uma pelota. A centrifugação pode ser usada para facilitar ou melhorar a separação.

Observou-se ainda que o procedimento de flotação pode ser intensificado pela adição de óleo a um meio de flotação que compreenda um meio de flotação não iônico de alta densidade (com ou sem um policátion). O óleo pode ser qualquer óleo adequado conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, óleo de milho, óleo de açafroa, óleo de amendoim, óleo de canola, óleo de soja, e outros. A adição de óleo pode melhorar a remoção de detritos e pode alcançar níveis melhorados de separação na ausência de centrifugação de alta velocidade e pode ainda eliminar a necessidade absoluta de centrifugação. Não existem limites específicos para a concentração de óleo no processo de flotação. O óleo é geralmente usado no meio de flotação em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 10% ou de cerca de 3% a cerca de 7% do volume total da solução de flotação.

Altemativamente, uma etapa de flotação de óleo pode ser realizada antes ou após a flotação na solução não iônica de alta densidade contendo policátion, descrita acima.

Em seguida à(s) etapa(s) de flotação, a fração recuperada contendo os oocistos pode ser processada por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a fração pode ser submetida a procedimentos adicionais de purificação, e/ou esporulação e/ou sanitização, como conhecido na técnica ou como aqui apresentado. O meio de flotação pode ser removido dos oocistos por qualquer método conhecido na técnica, incluindo as etapas de centrifugação/lavagem, diálise e filtração (por exemplo, filtração de fluxo tangencial).

DIETA DE PRODUÇÃO

Com particular respeito à produção de oocistos nos pássaros, observou-se que a dieta em que os pássaros são alimentados no, ou ao redor do, momento em que os oocistos são espalhados dentro das fezes, pode ter impacto no processo de separar os oocistos da matéria fecal. De acordo com métodos tradicionais, as aves domésticas são geralmente alimentadas com uma dieta completa triturada ou esfarelada durante todo o período em que os oocistos (por exemplo oocistos de Eimeria) são espalhados nas fezes. Depois que a matéria fecal contendo os oocistos tenha sido coletada, as etapas iniciais de purificação confiam nas técnicas de volume, tais como peneiramento e/ou filtração. A dieta normal de aves domésticas contém partículas muito finas, as quais podem ser difíceis de separar dos oocistos. Observou-se o efeito da dieta sobre o processo de purificar oocistos das fezes dos animais.

Observou-se que a separação dos oocistos da matéria fecal pode ser intensificada (isto é, melhorada) mantendo-se o pássaro infectado em uma dieta de partículas grandes, isto é, uma dieta tendo um grande tamanho de diâmetro médio. A dieta tipicamente conterá uma proporção substancial de ingredientes que não sejam moídos (isto é, o grão completo) ou apenas parcialmente moídos ou que sejam extrusados ou extraídos. Ingredientes exemplares incluem o milho quebrado, feijões de soja extrusados, aveia completa, e combinações destes. Em algumas modalidades, os grãos são peneirados para remover os finos. Em modalidades particulares da invenção, a dieta de partículas grandes contém menos do que cerca de 40% (p/p), menos do que cerca de 30% (p/p), menos do que cerca de 20% (p/p), menos do que cerca de 10% (p/p), menos do que cerca de 5% (p/p), ou ainda menos, de alimento ou farinha moídos (por exemplo, milho moído, soja, farinha de peixe ou de ossos, e outros). Em outras modalidades, a dieta de partículas grandes essencialmente não contém nenhum componente de farinha moída. Aqueles versados na técnica observarão que as vitaminas, minerais, aminoácidos e outros micro-nutrientes tipicamente serão adicionados à farinha em uma formulação granular de pré-mistura.

Dietas ilustrativas para aves domésticas contêm pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais (p/p) de feijões soja extrusados, milho quebrado, aveia completa e/ou outros componentes alimentares não moídos ou apenas parcialmente moídos, extrusados ou extraídos conforme conhecido na técnica, bem como quaisquer vitaminas, minerais, aminoácidos e sais para manter a saúde nutricional do pássaro. Em uma modalidade particular, os frangos são alimentados com uma dieta consistindo essencialmente de 45 a 55% (p/p) de feijões soja extrusados, de 35 a 40% (p/p) de milho quebrado, e de 5 a 15% (p/p) de aveia completa, assim como vitaminas, minerais, aminoácidos e sais, para manter a saúde nutricional do pássaro.

Em geral, pelo menos cerca de 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% (p/p) ou mais das fezes produzidas por um pássaro mantido na dieta de partículas grandes durante o período de coleta, são retidos por uma peneira de 0,5 mm. Altemativamente, pelo menos cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% (p/p) ou mais das fezes ficam retidas por uma peneira de 0,075 milímetros. O pássaro pode ser alimentado com dieta de partículas grandes a partir do choco. Altemativamente o pássaro é iniciado na dieta normal de aves domésticas e, então, é mudado para a dieta de partículas grandes em algum ponto, ou antes, do período de coleta, por exemplo pelo menos cerca de sete dias, cinco dias, três dias, dois dias, um dia, ou doze horas, antes da coleta, ou, altemativamente, no momento em que começa a coleta. Os pássaros são geralmente mantidos na dieta de partículas grandes na totalidade do período de coleta. Os pássaros podem ser alimentados com a dieta de partículas grandes por menos do que o período inteiro da coleta, contando que algum melhoramento ou vantagem na purificação sejam observados.

As fezes contendo os oocistos espalhados são tipicamente coletadas durante o período de débito máximo para cada espécie, tipicamente iniciando três, quatro ou cinco dias após a infecção e continuando a coleta por cerca de dois a quatro dias após, dependendo da espécie. Nas modalidades da invenção, o período de coleta tem lugar em algum tempo após cerca de 3 a 9 ou de cerca de 4 a 8 dias após infecção. A dieta de produção de partículas grandes da invenção pode resultar em remoção mais fácil dos detritos, produções melhoradas dos oocistos, e/ou custos de produção reduzidos.

Os Exemplos que seguem são apresentados para ilustrar a presente invenção, e não devem ser interpretados como limitativos desta. EXEMPLO 1 DIETA DE PRODUÇÃO DE OOCISTOS

Este Exemplo descreve uma dieta de produção de oocistos consistindo de combinações de partículas grandes com suplementos dietéticos típicos (vitaminas, minerais, nutrientes de traço). Os componentes de partículas grandes podem consistir de milho quebrado, feijões de soja extrusados, e/ou grãos completos tais como as aveias. Esta dieta foi desenvolvida para melhorar a produção e o rendimento dos oocistos enquanto mantém a nutrição apropriada do pássaro e facilita o isolamento dos oocistos. O regime pode incluir o uso de uma dieta normal para aves domésticas até logo antes do início do período de coleta, quando os pássaros passam a receber uma dieta de partículas grandes pela duração do período de produção dos oocistos. As vantagens desta dieta são que fica mais fácil remover os detritos mediante peneiramento e filtração, melhora a produção de oocistos, e reduz os custos de produção.

Os processos de peneiramento são rotineiramente usados na purificação dos oocistos. O processo de peneiramento pode ser facilitado pelo desenvolvimento de uma formulação de dieta usando-se um percentual elevado de partículas grandes que ficam retidas nas peneiras. Quatro dietas experimentais foram testadas para a produção de oocistos usando-se a dieta normal de aves domésticas como um controle. Frangos Cobb x Cobb foram usados para a produção de oocistos de E. maxima. Cinco replicados de cada tratamento foram usados. Neste Exemplo, as dietas de partículas grandes foram fornecidas na totalidade da experiência, sem a suplementação com a dieta normal para aves domésticas. As amostras fecais foram coletadas durante o período de débito máximo (dias 5 a 8 após a gavagem) e levadas a um volume padrão, bem misturadas e sub-amostradas quanto à enumeração dos oocistos e determinação dos detritos. Cada amostra foi então processada através de uma peneira de malha 35 (aproximadamente 0,5 mm), levada a um volume padrão, bem misturada e sub-amostrada quanto à enumeração dos oocistos e determinação dos detritos. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Os resultados destas experiências indicam que os níveis de detrito iniciais foram mais elevados usando-se a dieta normal de aves domésticas. As dietas 2 a 5 (dietas de partículas grandes) produziram níveis iniciais de detritos que eram menores do que a dieta normal de aves domésticas, e as quais eram semelhantes para todas as dietas experimentais. A recuperação dos oocistos após a peneira de malha 35 foi superior para as dietas de partículas grandes (91 a 99%) do que para a dieta normal de aves domésticas (85%). Finalmente, até 46% dos detritos foram removidos pela peneira de malha 35, quando as dietas de partículas grandes foram usadas, em comparação com os 5% apenas dos detritos removidos pela peneira de malha 35 quando a dieta normal de aves domésticas foi usada. EXEMPLO 2 USO DA ESCALA PILOTO DA DIETA DE PRODUÇÃO DOS OOCISTOS

Oocistos de E. maxima foram produzidos com o uso de frangos em gaiolas (540 pássaros no total). A alimentação principal foi a Dieta 5 (dieta de partículas grandes) descrita no Exemplo 1; bandejas suplementares de dieta padrão de frangos foram também fornecidas através da D5. O inóculo dos oocistos foi administrado através de gavagem oral ao grupo (10.000 oocistos espomlados por pássaro). As fezes foram coletadas em solução de ácido cítrico a 10%, ácido propiônico a 0,25% (2 litros por mistura) do 5° dia ao 8° dia após a inoculação.

Após a colheita, as seguintes etapas foram realizadas para cada série: • Coletada; medido o volume da amostra coletada; sub- amostrada. • Peneirada através de telas empilhadas de malha 18 (1 mm) e malha 60 (~0,25 mm), com o uso de peneira vibratória. • Peneirada através de uma tela de malha 200 (0,075 mm) usando-se uma peneira vibratória. • Os oocistos foram enumerados usando-se o método de McMasters. • Os níveis de detritos foram determinados mediante centrifugação de uma pequena amostra e medindo-se a relação do volume de sólidos pelotizados para o volume total centrifugado.

Os resultados acham-se resumidos na Tabela 2 abaixo: Os resultados demonstram recuperações de oocistos com média da Dieta 5 determinada em 86 a 88% com CVs <15%. Uma média de 72% dos sólidos de partida foi removida durante a etapa de peneiramento. EXEMPLO 3 USO DO MEIO À BASE DE PEROXIGÊNIO E ÁCIDO ORGÂNICO

PARA COLETA E ESPORULACÂO DE OOCISTOS

Este Exemplo, assim como os dois Exemplos seguintes, descrevem um meio de coleta/esporulação/sanitização que protege os oocistos contra a secagem, reduz a biocarga do início do período de coleta, produz altas taxas de esporulação, é mais fácil de descarte do que o bicromato de potássio, e é um reagente de sanitização mais suave do que o hipoclorito.

Foi desenvolvido um meio consistindo de peróxido de hidrogênio a 0,75%, ácido cítrico a 10%, ácido propiônico a 0,25% e Anti- espuma A a 0,1%, que pode servir como um meio para coleta e esporulação de oocistos. O meio aquoso protege os oocistos contra a secagem, atua como um meio antimicrobiano para matar vírus, e previne o estabelecimento de bactérias ou mofo durante o processo de coleta, e promove a esporulação durante referido processo de coleta. O Anti-espuma A é adicionado para impedir a espumação excessiva da suspensão fecal, e serve para reduzir a agregação dos oocistos. O anti-espuma A, entretanto, é opcional no meio.

Outros compostos de peroxigênio, tais como o perborato de sódio (a forma monoidrato ou tetraidrato) pode ser usada ou no lugar ou em combinação com peróxido de hidrogênio.

Os oocistos de várias espécies de Eimeria foram produzidos em frangos e coletados no meio durante o período de débito máximo para cada espécie. Aproximadamente 2 a 3 litros de meio de coleta foram usados para coletar as fezes de 8 a 10 pássaros. No final do período de coleta, os oocistos foram purificados usando-se técnicas de peneiramento e flotação da densidade. Os oocistos foram então colocados em meio fresco de esporulação, agitados e aerados por 72 horas. As taxas de esporulação foram determinadas com o uso de técnicas microscópicas padrão imediatamente após a coleta e novamente após o processamento através de peneiramento, flotação e tratamento de esporulação de 3 dias. Os resultados são apresentados na Tabela 3: Quando os oocistos foram coletados no novo meio, observou- se que a maior parte do processo de esporulação havia ocorrido antes do processamento, e altas taxas finais de esporulação foram observadas quanto a todas as cepas de Eimeria testadas. Estes resultados sugerem que a coleta e o meio de esporulação propostos provêm um método eficaz para se obter altos níveis de esporulação durante o período de coleta dos oocistos, mesmo antes de realizar o processo padrão de esporulação de 48 a 72 horas. EXEMPLO 4 DEMONSTRAÇÃO DAS PROPRIEDADES FUNGISTÁTICAS E

FUNGICIDAS DO PEROXIGÊNIO E MEIO DE SANITIZACÃO À BASE

DE ÁCIDO ORGÂNICO

Uma experiência foi conduzida para avaliar as propriedades fungistáticas e fungicidas dos reagentes usados no meio de coleta e esporulação descrito no Exemplo 3. Testes iniciais de esterilidade foram realizados usando-se caldo de soja tripticase (TSB). Uma população fungica foi criada pela suspensão de restos fungicos de uma cultura de população de Scopulariopsis brumptii em 25 ml de PBS, e filtração deste material através de um filtro bruto Swinney (~100:m). Duzentos:L desta população fungica foram inoculados em três frascos de TSB para os tratamentos (Trt) 2-11.

Os tratamentos avaliaram vários dos componentes do meio de coleta/esporulação/sanitização descrito no Exemplo 3, ou sozinho ou em combinação. Propionato de sódio foi também testado além do ácido propiônico. Os tratamentos foram avaliados em temperatura ambiente por 28 dias; depois, no 28- dia da inoculação, um ml de cada frasco de replicado para todos os tratamentos foi plaqueado em uma placa de ágar de extrato de malte (MEA) com cloranfenicol (50:g/ml) e penicilina-G (100 U/ml) e incubado em temperatura ambiente por 14 dias. O reagente era considerado fungistático se nenhum crescimento fosse observado no 28fi dia de incubação dos frascos de TSB (-) e o desenvolvimento foi observado quando o meio no frasco foi transferido para as placas(+) de MEA. O reagente era considerado fungicida se nenhum desenvolvimento fosse observado nos ffascos(-) de TSB ou após a transferência para placas(-) de MEA. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Os controles dos meios permaneceram negativos quanto ao crescimento fungico nesta experiência, e os controles fungicos foram positivos, como esperado. Tanto nos testes dos frascos quanto das placas, o propionato de sódio (0,25% ou 0,50%) não inibiu o crescimento fungico. O tratamento de ácido propiônico (0,25%) nos meios (Tratamento 4) foi fimgistático; ele inibiu o crescimento fungico no frasco, mas não nas placas de MEA. Todos os outros tratamentos (excluindo os controles) foram aparentemente fungicidas, sem qualquer crescimento fungico observado nos frascos e nenhum crescimento nas placas. Estes resultados indicam as propriedades fungistáticas e fungicidas potentes dos reagentes usados na formulação proposta (Tratamento 9). EXEMPLO 5 USO DO MEIO DE SANITIZACÂO À BASE DE PEROXIGÊNIO E

ÁCIDO ORGÂNICO NA PRODUÇÃO DOS OOCISTOS

Uma experiência foi realizada para pesquisar a utilidade do meio de espomlação descrito no Exemplo 3, como um reagente de sanitização. Os oocistos de E. maxima foram produzidos em frangos e purificados usando-se uma técnica de flotação da densidade. Os oocistos foram esporulados por 72 horas usando-se ácido cítrico 10%, ácido propiônico 0,25%, peróxido de hidrogênio 0,75%, e 1 ml/litro de Anti-espuma A. Após a esporulação, os oocistos foram centrifugados e recolocados em suspensão em meio de esporulação estéril-filtrado (ácido cítrico 10%, ácido propiônico 0,25%, peróxido de hidrogênio 0,75%, 1 ml/litro de Anti-espuma A) e incubados durante a noite em temperatura ambiente com agitação. Após a sanitização, a troca de tampão foi realizada através da diafiltração com o uso de fosfato de potássio 200 mM, pH 7, seguido por PBS sem preservativos. A amostra de massa foi armazenada em garrafas de vidro com aproximadamente um terço cheia em 4°C. Sub-amostras do produto final foram enviadas a um laboratório comercial de testes para os testes de pureza de acordo com as diretrizes do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA). Os resultados dos testes de esterilidade 9CFR após a sanitização usando meio à base de peróxido apresentam-se na Tabela 5.

Todos os resultados do teste indicam que o meio de esporulação estéril-filtrado pode ser usado como uma alternativa eficaz para o hipoclorito de sódio para sanitização dos oocistos. EXEMPLO 6 SANITIZAÇÃO DE OOCISTOS COM O USO DE UM MEIO À BASE

DE PEROXIGÊNIO E ÁCIDO ORGÂNICO

Duas bateladas experimentais de oocistos de E. maxima foram preparadas (Desenvolvimento A e Desenvolvimento B). Cada batelada foi purificada usando-se procedimentos de peneiramento e de flotação. Cada batelada foi então dividida e dois métodos de sanitização foram testados (hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio com ácido cítrico e ácido propiônico).

As amostras de cada teste foram submetidas a vários testes de pureza, incluindo os testes 9CFR e dois métodos de PCR quanto à detecção de vírus. Os resultados são apresentados na Tabela 6: Os resultados dos testes de pureza indicam que todos os materiais sanitizados estavam livres de microorganismos contaminantes, e que a solução de sanitização de peróxido de hidrogênio era eficaz como hipoclorito. EXEMPLO 7 FLOTACÂO DE OOCISTOS DE E. ΜΑΧΙΜΑ EM SOLUÇÕES À BASE DE GLICEROL

Os seguintes dois exemplos descrevem os meios de flotação para a separação dos oocistos, usando moléculas ou partículas com cargas positivas múltiplas (por exemplo, arginina 0,1 M). Estas moléculas podem ser usadas para melhorar as características de remoção de detritos de meios de flotação não iônicos (por exemplo, sacarose, glicerol, xarope de milho de alto teor de frutose), e aditivos tais como os detergentes não iônicos (por exemplo, Tween-20) ou agentes anti-espumantes (por exemplo, Anti-espuma A) podem ser usados para reduzir a agregação de oocistos e, dessa forma, otimizar o processo de flotação. As vantagens destes meios de flotação incluem a remoção melhorada dos detritos, a solução não iônica pode ser menos prejudicial aos oocistos do que as soluções salinas, e as espécies positivamente carregadas atuam como um auxiliar de floculação para ligar as pequenas partículas de detritos entre si e proporcionar pelotização mais eficiente das partículas de detritos durante a centrifugação.

As fezes de frangos contendo os oocistos de E. maxima foram processadas usando-se cinco diferentes meios de flotação. O material de partida foi composto de materiais reunidos de aproximadamente 150 pássaros. A amostra reunida foi peneirada usando-se um dispositivo de peneira mecânica seguido por uma peneira de malha fina. A amostra peneirada foi centrifugada em alíquotas de 750 ml para pelotizar os oocistos. Os sobrenadantes foram decantados e as pelotas foram recolocadas em suspensão usando-se: 1) sulfato de sódio 20%, 2) glicerol 60%, 3) glicerol 60% + arginina 0,1 Μ, 4) glicerol 60% + 10 g/litro de DEAE-celulose, ou 5) glicerol 60% + arginina 0,1M + 10 g/litro de DEAE-celulose. Cada meio foi usado em 5X o volume de pelotas para recolocar em suspensão três pelotas representando aproximadamente 2250 ml de amostra peneirada. O meio de sulfato de sódio 20% foi centrifugado em 1000 rpm por 10 minutos a 10°C; todos os outros tratamentos foram centrifugados em 3000 rpm por 10 minutos a 10°C. Os resultados quanto aos tratamentos de flotação acham-se resumidos na Tabela 7.

Nesta experiência, todos os meios de flotação produziram recuperação razoavelmente boa de oocistos, variando de 78,4% a 103,6%.

Todos os meios à base de glicerol foram mais eficientes para a remoção dos detritos do que o meio de sulfato de sódio. A redução percentual de sólidos para o meio de sulfato de sódio foi de 63,8%, enquanto os meios à base de glicerol variaram de 79,6% a 96,7%. A adição de uma molécula (arginina) ou partícula (DEAE-celulose) positivamente carregadas melhorou a remoção dos detritos em comparação com o glicerol sozinho. O método padrão de flotação de sulfato de sódio produziu um aumento de 2,7 vezes nos oocistos por mililitro de sólidos, enquanto um método usando a floração em glicerol a 60% + arginina 0,1 M produziu um aumento de 28,8 vezes nos oocistos por mililitro de sólidos. EXEMPLO 8 FLOTAÇÃO DE OOCISTOS DE E. MÁXIMA EM MEIOS À BASE DE

GLICEROL E DE SACAROSE

Meios de floração alternativos foram testados usando-se fezes de frangos contendo oocistos de E. maxima produzidos nos frangos. Um período de abstenção de alimentação de 36 horas foi usado antes da coleta fecal. Embora os meios de glicerol-arginina sejam altamente eficazes em termos de recuperação de oocistos e remoção de detritos, a despesa com o glicerol em uma escala mais elevada pode ser proibitiva. Para utilizar as interações de carga entre a arginina e os detritos fecais, os efeitos de um intensificador de densidade não iônica foram pesquisados. Nesta experiência, várias formulações com base ou no glicerol ou na sacarose como compostos não iônicos foram comparadas.

Antes da flotação, as fezes foram processadas através de peneiras de malhas brutas e finas para remover grandes partículas de detritos. Os sobrenadantes foram decantados e as pelotas foram recolocadas em suspensão usando-se as formulações de teste indicadas abaixo. Porções aproximadamente equivalentes foram usadas para cada meio de teste. Cada meio foi usado em 5X o volume da pelota para recolocar em suspensão três pelotas representando aproximadamente 2100 ml de amostra peneirada. As pelotas recolocadas em suspensão reunidas foram passadas através de uma tela bruta para garantir a re- suspensão dos aglomerados. Os aglomerados foram lavados através da peneira com uma pequena quantidade do meio de flotação apropriado. MEIOS DE FLOTACÂO: A. glicerol 60%, arginina 0,1 M

B. glicerol 60%, arginina 0,1 M, Tween-20 0,2%, 1 ml/1 de Anti-espuma A

C. Sacarose 1,5 M, arginina 0,1 M

D. Sacarose 1,5 M, arginina 0,1 M, Tween-20 0,2%, 1 ml/1 Anti-espuma A E. Sacarose 1,5 M, arginina 0,1 M, Tween-20 0,2%, 1 ml/1 Anti-espuma A, goma xantano a 0,1%.

Os resultados dos tratamentos de flotação acham-se resumidos na Tabela 8.

Glicerol-arginina, ou com ou sem aditivos, produziu boa recuperação de oocistos e melhoramento na purificação dos oocistos (melhoramento de aproximadamente 19 vezes nos oocistos por mililitro de sólidos sobre a etapa anterior). Embora o meio de sacarose-arginina sozinho tenha produzido boa recuperação de oocistos (90%) e boa remoção de detritos (melhoramento de 18 vezes sobre a etapa anterior), a adição de Tween-20 a 0,2% e 1 ml/litro de Anti-espuma produziu uma leve queda em ambas as medidas do desempenho. A intensificação da viscosidade do meio de sacarose-arginina-Tween 20-Anti-espuma A com goma xantano não teve essencialmente nenhum efeito sobre a recuperação dos oocistos, mas afetou adversamente a remoção dos detritos.

Portanto, moléculas positivamente carregadas (tais como a arginina) ou positivamente carregadas (tais como a DEAE-celulose) podem intensificar a remoção de detritos quando usadas com meios de flotação não iônicos. Os meios de flotação não iônicos incluem formulações tais como a solução aquosa de glicerol, a solução aquosa de sacarose, a solução aquosa de xarope de milho de alto teor de frutose, ou outras soluções semelhantes. É possível que as porções positivamente carregadas atuem como auxiliares de floculação, ligando entre si as partículas de detritos negativamente carregadas, e assim proporcionando pelotização mais eficiente dos detritos durante a centrifugação. A recuperação dos oocistos e os efeitos da remoção intensificada dos detritos podem ser otimizados usando-se outros aditivos tais como o Tween-20 ou o Anti-espuma A. EXEMPLO 9 TÉCNICA DE FLOTAÇÃO DE OOCISTOS INTENSIFICADA POR

ÓLEO

Este exemplo descreve experiências programadas para pesquisar os efeitos do óleo no processo de flotação dos oocistos. O processo auxiliado pelo óleo pode melhorar a separação dos oocistos dos sólidos e permitir que o processo seja realizado em 1 x g, dessa forma evitando o uso de equipamento de centrifugação dispendioso em forças de g mais elevadas. A experimentação foi conduzida para determinar se um método de flotação suave contínuo podería ser usado para separação de oocistos dos detritos fecais. A separação pode ser realizada tirando-se proveito das diferenças na densidade, usando-se um processo de agitação contínua em que os oocistos lentamente aumentem até o topo do meio, onde eles possam ser removidos e recuperados dos detritos fecais.

Nas provas iniciais, uma batelada de oocistos de E. maxima parcialmente purificada (peneirada e esporulada) foi usada. Xarope de Milho de alto teor de frutose (HFCS), CornSweet 55 (ADM, Illinois) e sal de cloreto de sódio foram usados como agentes de aumento da densidade em várias combinações. O material foi colocado em um béquer de polipropileno de 1 litro e lentamente misturado com HFCS e NaCl com o uso de um misturador de bateladas do IKA Labortechnik. As amostras foram retiradas do topo da suspensão, e depois de perto do fundo do recipiente. HFCS adicional foi adicionado após a amostragem, o material foi lentamente misturado ainda, depois um segundo conjunto de amostras foi retirado. As amostras da camada do topo (F-l, F-2) foram coletadas com a utilização de uma pipeta ou colher de plástico de 25 ml em um tubo de polipropileno de 50 ml (25 ml por amostra). As amostras do fundo (S-l, S-2) foram retiradas com pipeta de 25 ml em um tubo de polipropileno de 50 ml (25 ml por amostra). Todas as amostras foram diluídas por 10 vezes com água destilada e transferidas para garrafas de 250 ml. De cada garrafa, duas sub-amostras foram retiradas e diluídas por 10 vezes com tampão de IX PBS. Os oocistos foram contados nestas sub-amostras diluídas usando-se o método de McMaster. Os resultados desta experiências são apresentados na Tabela 9.

Os dados indicam que, não obstante existisse claramente o enriquecimento de oocistos nas camadas superiores da suspensão, os oocistos não flutuavam eficientemente e formavam uma camada de topo distinta em qualquer das condições testadas (isto é, na ausência de centrifugação). A relação de HFCS para NaCl ou outra diluição da suspensão fecal, não influenciaram a flotação neste estudo. Foi observado ser difícil amostrar a camada de topo das suspensões testadas.

Depois destas experiências, pareceu que, ou uma diluição significativa do material, ou uma introdução de um agente intensificador da flotação, pudessem ser úteis para facilitar o movimento dos oocistos através do material fecal. Uma experiência foi realizada para determinar a utilidade do óleo vegetal como um agente de intensificação da flotação.

Em um béquer de polipropileno de 1 litro, 500 ml da suspensão original de oocistos e 500 ml de água contendo 160 g de Xarope de Milho de alto teor de frutose + 40 g de NaCl + 50 ml de óleo de açafroa, foram misturados usando-se um misturador de bateladas da IKA. O misturador foi operado na seguinte seqüência: rápido-lento-parar-lento-parar. A camada de topo (50 ml) foi colhida com uma colher na garrafa de 250 ml contendo 200 ml de água. Os conteúdos da garrafa foram misturados completamente. Três camadas distintas se formaram dentro de minutos. Duas sub-amostras de cada camada foram retiradas e os oocistos foram contados usando-se uma câmara da McMaster. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Estes resultados indicam que o óleo facilitou o processo de flotação dos oocistos. Uma vantagem deste processo de flotação auxiliado pelo óleo é que a camada de oocistos formou-se rapidamente sem necessitar centrifugação, isto é, em 1 x g. Tipicamente, os processos de flotação de oocistos usam a centrifugação em forças de 2000 x g ou ainda mais elevadas para se obter a separação da camada de oocistos dos detritos.

Os exemplos dados mais acima são ilustrativos da presente invenção, e não devem ser interpretados como limitativos desta. A invenção é descrita pelas seguintes reivindicações, com equivalentes das reivindicações a serem nela incluídas.

Claims (14)

1. Método para esporular oocistos viáveis de Eimeria, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer oocistos viáveis de Eimeria não esporulados; e b) contatar os oocistos viáveis de Eimeria não esporulados com uma composição compreendendo um composto de peroxigênio e uma combinação de ácidos cítrico e propiônico para efetuar a esporulação, a referida composição possuindo um pH ácido abaixo de pH 4, em que o referido método não inclui o uso de dicromato de postássio.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Eimeria é selecionada a partir do grupo consistindo em E. máxima, E. mitis, E. tenella, E. acervuline, E. brunetti, E. necatrix, E. praecox, E. mivati e uma combinação dos mesmos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH da composição é a partir de cerca de pH 1,0 até cerca de pH 3,0.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto de peroxigênio na composição é de cerca de 0,1% a cerca de 10% (v/v) ou (m/m).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto de peroxigênio é selecionado a partir do grupo consistindo em peróxido de hidrogênio, perborato de sódio, percarbonato de sódio, peróxido de magnésio, peróxido de cálcio, peróxido de zinco, peróxido de ureia, e uma combinação dos mesmos.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o composto de peroxigênio é peróxido de hidrogênio.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a concentração de peróxido de hidrogênio na composição é de cerca de 0,1% (v/v) a cerca de 3% (v/v).

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração de peróxido de hidrogênio na composição é de 0,25% (v/v) a cerca de 1% (v/v).

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de ácidos orgânicos na composição é de cerca de 1,0% a cerca de 15% (v/v) ou (m/v).

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Eimeria compreende uma espécie de Eimeria que infecta aves.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a Eimeria compreende uma espécie de Eimeria que infecta perus.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Eimeria compreende uma espécie de Eimeria que infecta galinhas.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Eimeria compreende uma espécie de Eimeria que infecta mamíferos.

14. Método para esporular oocistos viáveis de Eimeria, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer oocistos viáveis de Eimeria não esporulados; e b) contatar os oocistos viáveis de Eimeria não esporulados com uma composição compreendendo um composto de peroxigênio e uma combinação de ácidos orgânicos para efetuar a esporulação, a referida composição possuindo um pH ácido abaixo de pH 4 em que a concentração do composto de peroxigênio na composição é de cerca de 0,1% a cerca de 10% (v/v) e a concentração de ácidos cítrico e propiônico na composição é de cerca de 0,1% a cerca de 5%, e; em que o referido método não inclui o uso de dicromato de postássio.