JP2005517012A

JP2005517012A - 持続放出のためのポリマーベース組成物

Info

Publication number: JP2005517012A
Application number: JP2003565960A
Authority: JP
Inventors: トレーシー，マーク，エイ．; コンスタンティーノ，ヘンリー，アール．; フィゲイレド，マリア; ウォード，ケビン，エル．; シャー，デービッド，エス．
Original assignee: アルカーメスコントロールドセラピューティクス，インコーポレイテッド; セロノインターナショナルエス．エイ．
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2005-06-09
Also published as: EP1471891A4; CA2474698C; US20040028733A1; WO2003066585A3; NZ535008A; IL163218A; AU2003217367A1; WO2003066585A2; CA2474698A1; AU2003217367B2; ZA200405852B; EP1471891A2

Abstract

本発明は、持続放出組成物、ならびに特に卵胞刺激ホルモン（FSH）の持続放出のために、該組成物を形成する方法および使用する方法に関する。持続放出組成物は、生分解性生物適合性ポリマーおよび安定化FSHのポリマーマトリックスを含有する。持続放出組成物を製造するための本発明の方法は、生分解性ポリマーをポリマー溶媒に溶解させ、ポリマー溶液を形成させる工程；生物学的に活性な安定化FSHを添加する工程；溶媒を除去する工程；および該ポリマーを凝固させて、そこに分散した安定化FSHを含有するポリマーマトリックスを形成する工程を含む。また、本発明の持続放出組成物の用量を患者に投与することを含む、持続した期間を必要とする患者に治療有効量の安定化FSHを提供する方法が開示される。FSHの持続放出組成物は、卵胞の成熟および精子形成を促進するため、および繁殖能力障害を処置するために使用されうる。

Description

発明の詳細な説明

発明の背景
卵胞刺激ホルモン（FSH）は、非共有結合したαおよびβサブユニットからなるヘテロダイマー糖タンパク質ホルモンである。αサブユニット、５つのジスルフィド結合を有する92アミノ酸ポリペプチドは、糖タンパク質ホルモンファミリーに共通であり、これは、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンをさらに含む。βサブユニット、６つのジスルフィド結合を有する111アミノ酸ポリペプチドは、FSHに独特である。各サブユニットは、２アスパラギン結合グリコシル化部位を有する。

ヒトFSHは、脳下垂体および閉経後の尿から単離され（EP 322,438）、近年、哺乳動物細胞において組換え産生されている（US 5,639,640、US 5,556,957、US4,923,805、US 4,840,896、US 5,767,251、EP 212,894およびEP 521,586、Howles, C.M., Human Reproduction Update 2(2): 172-191 (1996)も参照）。

ヒトを含む、雌および雄の哺乳動物における生殖機能は、FSHにより調節される。雌では、FSHは、卵胞の発達を促進し、その結果、排卵を促進する。雄では、FSHは、精子形成において役割を果たす。性腺刺激ホルモン分泌細胞によるFSHの合成は、全身循環への分泌前に、脳下垂体前葉内で起こる。FSHの合成および分泌は、ゴナドトロピン放出ホルモンにより調節され、視床下部内の分化したニューロンにより分泌され、性腺からステロイドおよび非ステロイド産物が分泌される。その膜レセプターへの高親和性結合により、FSHは、卵胞および精巣内の特異的標的細胞の機能に影響し、ステロイド産生、細胞複製、ならびに特異的タンパク質の発現および配偶子形成を制御する成長因子を調節する細胞内機構を引き起こす。

FSHの外来投与に関連する困難さとしては、所望の治療結果を達成するために頻繁な、典型的には日周の注射を必要とする短いインビボ半減期が挙げられる。一般的に、かかる投薬療法は、乏しい患者コンプライアンスおよび結果的に処置の失敗を生じうる。さらに、血流におけるFSHレベルの有意なゆらぎは、卵胞の不適切な成熟を引き起こし得、また処置の失敗を生じうる。

従って、FSHの投与に関しうる困難さを解消しながら、より高い患者コンプライアンスを導きうるFSH持続放出製剤が必要とされている。

発明の要旨
本発明は、FSHの持続放出のための、組成物、および該組成物を形成および使用する方法に関する。持続放出組成物は、約５kD〜約40kD、好ましくは約10kD〜約20kD等の約７kD〜約20kDの分子量を有し、かつそこに安定化FSH製剤が分散しているポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーの生物適合性ポリマーマトリックスを含有する。安定化FSH製剤は、FSH、少なくとも１つの糖および任意に少なくとも１つのバッファー塩を含有する。持続放出組成物におけるFSHの濃度は、組成物の総重量の約0.05％（w/w）〜約15％（w/w）である。特定の態様では、FSHの濃度は約0.1％(w/w)〜約１％(w/w)である。このように、持続放出組成物中でFSHのこの濃度を達成するために必要とされる安定化FSH製剤の量は、安定化製剤中のFSHの量に基づいて決定されうる。糖は、二糖、例えば、スクロース、ラクトースまたはトレハロースでありうる。ポリマーマトリックス内に取り込まれる安定化FSH製剤は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約50％(w/w)〜約99％(w/w)の糖等の安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約30％(w/w)〜約99％(w/w)の糖、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約１％(w/w)〜約70％(w/w)のFSH、例えば、約１％〜約30％（w/w）のFSH等の約１％(w/w)〜約50％(w/w)のFSH、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約０％〜約25％(w/w)バッファー塩を含有する。

好ましい態様では、取り込まれる安定化FSH製剤は、70〜97％(w/w)の糖、３％〜30％(w/w)のFSHおよび０％〜10％(w/w)バッファーを含有する。ポリマーは、末端メチルエステル、末端酸基またはコポリマーのブレンドを有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーでありうる。ブレンドは、例えば、１酸末端対３エステル末端の１：３酸末端：エステル末端の比でありうる。詳細な態様では、持続放出組成物は、少なくとも５日間にわたりヒトにおいてFSHを放出し、好ましくは、FSHは、約５日〜約30日間の期間放出される。好ましい態様では、FSHは、約５〜14日間放出される。他の態様では、持続放出組成物は、少なくとも30日間ヒトにおいてFSHを放出する。好ましい態様では、組成物は、微粒子の形態である。

FSHの持続放出用組成物の形成のための本発明の方法は、約７kD〜約20kD、例えば、約10kD〜約20kD等の約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ(ラクチド-コ-グリコリド)コポリマーをポリマー溶媒に溶解させてポリマー溶液を形成する工程、FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤をポリマー溶液に添加して、組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)のFSH最終濃度を有するポリマー／安定化FSH製剤混合物を達成する工程、ポリマー溶媒を除去し、それによりそこに分散したFSHを含有する固体ポリマーマトリックスを形成する工程を含む。

典型的には、安定化FSH製剤は固体形態でポリマー溶液中に添加される。しかし、FSHは、ポリマー溶液に可溶性でありうる。すなわち、安定化FSH製剤は、ポリマー溶媒に可溶であるか、またはポリマー溶液に添加する前にFSH溶媒に予め溶解されうる。FSH溶媒が使用され、ポリマー溶媒とは異なる場合、全ての溶媒（FSHおよびポリマー）は、そこに分散した安定化FSHを含有する固体ポリマーマトリックスを形成するために除去されうる。除去される溶媒が安定化FSH製剤溶媒およびポリマー溶媒の組み合わせである場合、全体の溶媒は溶媒相と呼ばれる。安定化FSH製剤がポリマー溶媒への添加前に安定化FSH製剤溶媒に溶解される場合、安定化FSH製剤溶媒は、ポリマーの実質的な沈殿を起こさず、FSHに有害でないポリマー溶媒と混和されなければならない。

適切な安定化FSH製剤溶媒としては、例えば：エタノール、メタノール、水、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）の適切な溶媒としては：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、メチルアセトン、塩化メチレン、クロロホルム、ヘキサフルオロイソプロパノール、アセトン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

本方法は、溶媒または溶媒相の除去の前にポリマー／安定化FSH製剤混合物の液滴を形成する工程をさらに含みうる。さらに、本方法は、溶媒相の溶媒の除去の前に液滴を凍結させる工程を含みうる。本発明の方法によれば、液滴は、微小液滴でありうる。液滴が形成され、次いで凍結される特定の態様では、ポリマー溶媒または溶媒相は、抽出プロセスにより除去されうる。あるいは、ポリマー溶媒または溶媒相は、エバポレーションプロセスまたはエバポレーションおよび抽出プロセスの組み合わせにより除去されうる。

本明細書中で使用される用語「微小液滴」は、約1,000ミクロン以下の寸法を有する任意の形態の液滴をいう。

ある態様では、本明細書中に記載される、FSHの持続放出組成物を使用するための本発明の方法は、約５kD〜約40kD、好ましくは、約10kD〜約20kD等の約７kD〜約20kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーおよびそこに分散された安定化FSH製剤を含有するFSHの持続放出用組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む。安定化FSH製剤は、FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する。安定化FSH製剤は、任意に、バッファー塩等の少なくとも１つの塩を含有しうる。特定の態様では、持続放出組成物中のFSHの濃度は、組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜15％(w/w)である。このように、持続放出組成物中でFSHのこの濃度を達成するために必要とされる安定化FSH製剤の量は、安定化製剤中のFSHの量に基づいて決定されうる。

安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、約１％(w/w)〜約70％(w/w)、例えば、約１％(w/w)〜約30％(w/w)等の約１％〜約50％(w/w)でありうる。特定の態様では、安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約３％(w/w)〜約30％(w/w)でありうる。

安定化製剤中の糖の濃度は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて、約50％(w/w)〜約99％(w/w)等の約30％(w/w)〜約99％(w/w)である。特定の態様では、糖は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約70％(w/w)〜約97％(w/w)である。好ましい態様では、糖は、ラクトース、スクロースおよびトレハロース等の二糖である。

バッファー塩は、製剤の総乾燥重量の約０％(w/w)〜約25％(w/w)で安定化製剤中に存在する。特定の態様では、バッファー塩は、安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約10％で存在する。

別の態様では、本発明は、約５kD〜約40kD、好ましくは、約10kD〜約20kD等の約７kD〜約20kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーおよびそこに分散した安定化FSH製剤を含有する持続放出組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む、患者の卵巣内の卵胞の成熟化を促進または刺激する方法である。安定化FSH製剤は、FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する。安定化FSH製剤は、任意に、バッファー塩等の少なくとも１つの塩を含有しうる。特定の態様では、持続放出組成物中のFSHの濃度は、組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜15％(w/w)である。このように、持続放出組成物中でFSHのこの濃度を達成するために必要とされる安定化FSH製剤の量は、安定化製剤中のFSHの量に基づいて決定されうる。

安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、約１％(w/w)〜約70％(w/w)、例えば、約１％〜約30％(w/w)等の約１％〜約50％(w/w)でありうる。特定の態様では、安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約３％(w/w)〜約30％(w/w)でありうる。

バッファー塩は、製剤の総乾燥重量の約０％(w/w)〜約25％(w/w)で安定化製剤中に存在する。特定の態様では、バッファー塩は、安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約10％である。

さらに別の態様では、本発明は、約５kD〜約40kD、好ましくは約10kD〜約20kD等の約７kD〜約20kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーおよびそこに分散した安定化FSH製剤を含有する持続放出組成物の治療有効量を処置を必要とする患者に投与することを含む、患者の精巣において精子形成を促進する方法である。安定化FSH製剤は、FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する。安定化FSH製剤は、任意に、バッファー塩等の少なくとも１つの塩を含有しうる。特定の態様では、持続放出組成物中のFSHの濃度は、組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜15％(w/w)である。このように、持続放出組成物中でFSHのこの濃度を達成するために必要とされる安定化FSH製剤の量は、安定化製剤中のFSHの量に基づいて決定されうる。

安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、約１%(w/w)〜約70％(w/w)、例えば、約１％〜約30％(w/w)等の約１％〜約50％(w/w)でありうる。特定の態様では、安定化FSH製剤中に存在するFSHの量は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約３％(w/w)〜約30％(w/w)でありうる。

安定化製剤中の糖の濃度は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて、約50％(w/w)〜約99％(w/w)等の約30％(w/w)〜約99％(w/w)である。特定の態様では、糖は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する。好ましい態様では、糖は、ラクトース、スクロースおよびトレハロースなどの二糖である。

別の態様では、本発明は、繁殖能力障害の処置方法に関する。本方法は、約５kD〜約40kD、好ましくは、約10kD〜約20kD等の約７kD〜約20kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーおよびそこに分散した安定化FSH製剤を含有する持続放出組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む。安定化FSH製剤は、FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する。安定化FSH製剤は、任意に、バッファー塩等の少なくとも１つの塩を含みうる。特定の態様では、持続放出組成物中のFSHの濃度は、組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜15％(w/w)である。このように、持続放出組成物中でFSHのこの濃度を達成するために必要とされる安定化FSH製剤の量は安定化製剤中のFSHの量に基づいて決定されうる。

安定化製剤中の糖の濃度は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて、約50％(w/w)〜約99％(w/w)等の約30％(w/w)〜約99％(w/w)である。特定の態様では、糖は、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する。特定の態様では、糖は、ラクトース、スクロースおよびトレハロース等の二糖である。

本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、付随する図面に説明されるように、発明の好ましい態様の以下のより詳細な記載から明らかである。

発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明は以下のとおりである。
本発明は、約５ｋＤ〜約４０ｋＤ、好ましくは約７ｋＤ〜約２０ｋＤ（例えば、約１０ｋＤ〜約２０ｋＤ）の分子量を有し、かつその中に安定化ＦＳＨ製剤が分散されたポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーを含有する組成物が持続形式でＦＳＨを送達するのに使用され得るという予期しない発見に基づいている。一般に、ＦＳＨの持続的な放出は、少なくとも５日間生じることが望ましい。

本発明の持続放出組成物は、約５ｋＤ〜約４０ｋＤ、好ましくは約７ｋＤ〜約２０ｋＤ（例えば、約１０ｋＤ〜約２０ｋＤ）の分子量を有し、その中に安定化ＦＳＨ製剤が分散されたポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーの生物学的適合性ポリマーマトリックスを含有する。安定化ＦＳＨ製剤は、ＦＳＨおよび少なくとも一つの糖を含有する。糖は、二糖であり得る。ＦＳＨ製剤は、任意に、少なくとも一つのバッファー塩を含みうる。持続放出組成物中のＦＳＨの濃度は、持続放出組成物の総乾燥重量の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）である。このように、持続放出組成物中においてＦＳＨのこの濃度を達成するのに必要な安定化ＦＳＨ製剤の量は、前記安定化製剤中のＦＳＨの量に基づいて決定することができる。

典型的には、ＦＳＨは、前記安定化製剤中において、約１％（ｗ／ｗ）〜約７０％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％〜約５０％（ｗ／ｗ）（約１％〜約３０％（ｗ／ｗ）など）で存在する。特定の態様において、安定化ＦＳＨ製剤中に存在するＦＳＨの量は、前記安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約３％（ｗ／ｗ）〜約３０％（ｗ／ｗ）でありうる。前記糖は、前記安定化製剤中において、安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約３０％（ｗ／ｗ）〜約９９％（ｗ／ｗ）、例えば、約５０％（ｗ／ｗ）〜約９９％（ｗ／ｗ）で存在しうる。特定の態様において、前記糖は、前記安定化製剤の総乾燥重量に基づいて約７０％（ｗ／ｗ）〜約９７％（ｗ／ｗ）で存在する。前記バッファー塩は、安定化ＦＳＨ製剤中において、該安定化製剤の総乾燥重量の約０％（ｗ／ｗ）〜約２５％（ｗ／ｗ）、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）で存在しうる。

ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（以下、「ＰＬＧ」）は、例えば、約１０：９０、２５：７５、５０：５０、７５：２５または９０：１０のラクチド：グリコリド比を有し得る。本発明の好ましい態様において、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーのラクチド：グリコリド比は、５０：５０である。ある態様において、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）の末端基は、メチルエステル型である。他の態様において、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーの末端基は、酸型である。さらなる態様において、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）のエステル型および酸型は、適切な比率でブレンドされ得る。例えば、それぞれ、約１０％のエステル型または酸型のいずれか〜約９０％の酸型またはエステル型である。好ましくは、持続放出組成物は、ヒトにおいて、少なくとも５日間にわたってＦＳＨを放出する。

本明細書に記載のように本発明の組成物は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーとその内部に分散された安定化ＦＳＨ製剤とを含有する組成物を投与することにより、それを必要とする患者において治療効果を顕在化する手段を提供する。

本明細書中で規定される「安定化ＦＳＨ製剤」は、ＦＳＨおよび少なくとも一つの糖を含有する。ＦＳＨ製剤は、少なくとも一つのバッファー塩を任意に含んでもよい。安定化ＦＳＨ製剤は、ＦＳＨの分解、凝集、その有効性の喪失および／またはその生物学的活性の喪失（全ては、持続放出組成物の製剤中、ならびにインビボでの放出前および／またはその間に生じうる）を低減することができる。

本明細書中で規定される「糖」は、単糖、二糖もしくは三糖または多糖などのポリオールである。適切な単糖類としては、グルコース、フルクトースおよびマンノースが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に規定される場合、「二糖」は、加水分解の際に２分子の単糖を生じる化合物である。適切な二糖類としては、スクロース、ラクトースおよびトレハロースが挙げられるが、これらに限定されない。適切な三糖類としては、ラフィノースおよびアカルボース（acarbose) が挙げられるが、これらに限定されない。糖は、非還元性の二糖であることが好ましい。安定化ＦＳＨ製剤中に存在する糖の量は、前記安定化製剤の総乾燥重量の約３０％（ｗ／ｗ）〜約９９％（ｗ／ｗ）の範囲（例えば、約５０％（ｗ／ｗ）〜約９９％（ｗ／ｗ））の範囲でありうる。特定の態様において、糖は約７０％（ｗ／ｗ）〜約９７％（ｗ／ｗ）で存在する。

本明細書中で規定される「バッファー塩」は、バッファーから溶媒の除去後に残存している塩である。バッファーは、弱酸と該酸の関連する塩または弱塩基と該塩基の塩のいずれかを含有する溶液である。バッファーは、前記製剤を安定化するために所望のｐＨを維持しうる。例えば、バッファーは、一塩基リン酸塩または二塩基リン酸塩またはそれらの組み合わせまたは重炭酸アンモニウムなどの揮発性のバッファーでありうる。他のバッファーとしては、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩およびアミノ酸（グリシン、アルギニンおよびヒスチジンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。バッファーは、安定化製剤中、安定化製剤の総重量の約０％〜約１０％で存在しうる。好ましい態様において、バッファー塩は、リン酸ナトリウム塩である。

本明細書で使用される用語「界面活性剤」は、混合できない液体の間の表面張力を低減することができる任意の物質をいう。持続放出組成物に添加することができる適切な界面活性剤としては、非イオン性ポリマー状界面活性剤などのポリマー状界面活性剤、例えば、ポロキサマー、ポリソルベート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリビニルピロリドンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明での使用に適切なポロキサマーの例としては、商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７として販売されているポロキサマー４０７、ならびに商標ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８として販売されているポロキサマー１８８（両方ともＢＡＳＦＷｙａｎｄｏｔｔｅから入手できる）が挙げられる。本発明での使用に適切なポリソルベートの例としては、商標ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０として販売されているポリソルベート２０および商標ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０として販売されているポリソルベート８０が挙げられる。陽イオン性界面活性剤、例えば、塩化ベンザルコニウムも、本発明での使用に適切である。また、デオキシコール酸塩およびグリココール酸塩などの胆汁酸塩は、薬剤としてのその高い有効な性質に基づく界面活性剤として適切である。界面活性剤は、ポリマー相中に存在しうるまたは安定化ＦＳＨ製剤中に存在しうる。界面活性剤は、ポリマーマトリックスからのＦＳＨの放出を緩和するように作用することができ、ＦＳＨまたはその組み合わせを安定化するように作用することができる。

また、他の賦形剤は、持続放出組成物からのＦＳＨの放出を緩和するためにポリマー相に添加することができる。かかる賦形剤としては、塩化ナトリウムなどの塩が挙げられる。

「抗酸化剤」も持続放出組成物に添加することができる。適切な抗酸化剤には、メチオニン、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびマレイン酸が含まれうるが、これらに限定されない。抗酸化剤は、安定化ＦＳＨ製剤中に存在するまたはポリマー相中に添加されうる。特定の態様において、メチオニンは、ＦＳＨ中のジスルフィドおよびメチオニン残基の酸化を低減するために添加されうる。

本発明の方法は、本明細書に記載のＦＳＨ持続放出組成物を投与する工程を含み、かかる処置の必要な患者における治療効果または診断効果を提供する。好ましい態様において、持続放出組成物は、注射または移植により投与されうる。

治療効果または診断効果は、例えば、卵胞発達の刺激でありうる。かかる効果は、体外受精（ＩＶＦ）、胎芽移植（ＥＦ）および無排卵不妊症の女性（例えば多のう胞卵巣疾患を患っているヒト）を含む、女性に行なわれている補助生殖技術に有用でありうる。このように、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーおよびその中に分散された安定化ＦＳＨ製剤を含有する本発明の持続放出組成物は、不妊症を処置するのに使用されうる。例えば、安定化ＦＳＨ製剤が中に取り込まれた生体適合性ポリマーを有する持続放出組成物は、小胞成熟に関連した不妊症の問題を抱えた女性の処置時の使用に適切でありうる。細胞内ＬＨサージ（surge)の不存在下で小胞および卵胞の最終的な成熟をもたらすため、患者のモニタリングが十分な小胞発達が生じていることを示す場合、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は持続放出組成物の投与後に同時に供され、または持続放出組成物中の安定化ＦＳＨと共カプセル化されうる。

別の態様において、持続放出組成物は、不妊症処置用の試験において精子形成を刺激するために、患者に投与されうる。オスの不妊症の放出プロフィールは、少なくとも３０日、好ましくは約６０日間または約９０日間などのより長い期間でありうる。オスにおいて、ＦＳＨは、セルトリ細胞による精子形成の阻害をブロックする。

目下、ＦＳＨは、毎日の注射により卵胞発達を刺激するために投与されている。毎日の注射は、典型的には、不十分な患者のコンプライアンスを生じる。メスの不妊症についての現在の毎日の注射プロトコールの例は、サンチブリンク(Santibrink)およびファウザー(Fauser)(Santibrink,E.およびFauser,B. “Urinary Follicle-Stimulating Hormone for Normogonadotropic Clomiphene-Resistant Anovulatory Infertility: Prospective, Randomized Comparison Between Low Dose Step-Up and Step-Down Dose Regimens," J. Clin. Endocrinology Metab. 82:3597-3602, 1997) に示されている。本明細書に記載のように、ＦＳＨ持続放出組成物は、都合のよい期間の間、持続放出形式でＦＳＨを放出しうる。

さらに、持続放出組成物は、肺または血管の合併症をともなうまたはともなわないで生じうる、卵巣過刺激症候群などのＦＳＨの毎日の投与で見られるいくつかの副作用を最小限にしうる。さらに、持続放出組成物はＦＳＨのみを投与することに比べた場合、より低いＦＳＨの初期の突発を生じる。

本明細書に記載される発明は、本発明での使用に適切な医薬組成物にも関する。一つの態様において、医薬組成物は、約５ｋＤ〜約４０ｋＤ、好ましくは約７ｋＤ〜約２０ｋＤ（例えば、約１０ｋＤ〜約２０ｋＤ）の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーの生体適合性マトリックスおよびその中に分散された安定化ＦＳＨ製剤を含有する持続放出組成物を含有する。持続放出組成物中のＦＳＨの濃度は、約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１５％ｗ／ｗである。ある態様において、前記組成物は、ヒトにおいてインビボで、少なくとも５日、例えば、約５日〜約３０日の持続放出期間を有しうる。女性についてなどの他の態様において、ＦＳＨは１４日までに放出される。男性において、ＦＳＨは少なくとも３０日の期間および約９０日まで（例えば約６０日）放出されうる。

本発明は、約５ｋＤ〜約４０ｋＤの分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーとＦＳＨおよび少なくとも１つの糖を含む安定化ＦＳＨ製剤とを含有し、安定化ＦＳＨ製剤が治療使用用薬剤の製造のためにポリマー内に分散された、持続放出デバイスの使用にも関する。

生物学的活性ＦＳＨ製剤の持続的な放出は、活性ＦＳＨ製剤の持続放出組成物からの放出であり、これは治療上有意な量の生物学的活性ＦＳＨ製剤が生物学的活性ＦＳＨの溶液の直接投与後に利用可能である期間よりも長い期間にわたって生じる。持続放出組成物から得られるＦＳＨのインビボＰＫプロフィールは、また、溶液中へのＦＳＨの投与後に観察されるプロフィールよりもより矛盾なく適合される（所望の治療ウインドウに維持される）。

薬物動力学（ＰＫ）をモニターする方法は、実施例に記載のような生物学的体液中のＦＳＨのＩＲＭＡ分析などの広範に利用できる技術を用いてなされうる。

卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、本明細書に規定される場合、全ての形態のＦＳＨを含み、動物源、好ましくはヒト源に由来し得、または組み換え的に製造され得る。本明細書に規定されるＦＳＨは、天然のＦＳＨの一次、二次および／または三次の分子構造を有する化合物をいい、それは標準ＦＳＨバイオアッセイで測定されるような少なくとも１つのＦＳＨ薬力学的効果を有する。ＦＳＨには、アナログ、脱グリコシル化型、非グリコシル化型および修飾グリコシル化型が挙げられる。最も好ましい型は、組み換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、ＧＯＮＡＬ−Ｆ（登録商標）（Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）は、注射により提供される、現在利用可能なＦＳＨ製剤の例である。

本明細書中で使用する用語「患者」は、処置対象のレシピエントをいう。哺乳類または非哺乳類の患者が含まれる。具体的な態様では、患者は哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ科、ネズミ科、ネコ科、ウシ科、ヒツジ科、ブタまたはヤギである。好ましい態様において、患者はヒトである。最も好ましい態様において、患者は女性のヒトである。

「持続放出組成物」という用語は、本明細書で規定されるように、約５ｋＤ〜約４０ｋＤ、好ましくは約７ｋＤ〜約２０ｋＤ（例えば、約１０ｋＤ〜約２０ｋＤ）の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーおよびその中に分散された安定化ＦＳＨ製剤を含有する。好ましい態様において、持続放出組成物中に存在するＦＳＨの量は、組成物の総乾燥重量の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）である。このように、持続放出組成物中のＦＳＨのこの濃度を達成するのに必要とされる安定化ＦＳＨ製剤の量は、安定化製剤中のＦＳＨの量に基づいて決定されうる。投与されるＦＳＨの量は、所望の効果、患者の評価、計画した放出レベル、およびＦＳＨが放出される期間に基づいて変化するだろう。

別の組成物において、持続放出組成物は１５％（ｗ／ｗ）を超えるＦＳＨ（組成物の総乾燥重量）を含有しうる。例えば、別の組成物は、持続放出組成物の総乾燥重量に基づいて２０％〜５０％のＦＳＨを含有しうる。

一つの態様において、持続放出組成物は、本明細書に記載のような５０：５０２Ｍ／５０：５０２ＡＰＬＧの７５／２５ブレンドである生体適合性ポリマーと、持続放出組成物の総乾燥重量の約０．５％（ｗ／ｗ）の標的負荷をかけた１０％ＦＳＨ、１０％リン酸ナトリウムおよび８０％スクロースを含有する安定化ＦＳＨ製剤を含有する持続放出組成物ではない。

本発明の持続放出組成物は、フィルム、錠剤、ロッド、フィラメント、シリンダー、ディスク、ウェハー、ゲル、または微粒子などの多くの形態に形成されうる。微粒子が好ましい。本明細書に規定される場合、「微粒子」は、約１ｍｍ未満の直径を有し、その内部に分散された安定化ＦＳＨ製剤を有する、記載のようなポリマー成分を含有する。微粒子は、球状、非球状または不規則な形状を有しうる。典型的には、微粒子は、注射に適切な大きさのものであろう。微粒子にとって好ましい大きさの範囲は、直径約１〜約１８０ミクロンである。

本発明の組成物は、インビボで、例えば、ヒトに対して、または動物に対して、経口的、あるいは、注射、移植（例えば、皮下、筋肉内、腹膜内、頭蓋内、および皮内）、粘膜への投与（例えば、鼻腔内、膣内、肺内、頬または座剤により）、またはインサイチュ送達（例えば、注腸またはエアゾル噴霧）などにより非経口的に投与して、特定の医学状態のＦＳＨを用いた処置についての公知のパラメータに基づく所望の用量のＦＳＨを提供することができる。

好ましい態様において、本明細書に記載されるように、持続放出組成物は、注射により投与される。本明細書で使用される用語である「注射」としては、送達口のみを経るまたは腹腔鏡、内視鏡、喉頭鏡、膀胱鏡、プロトスコープまたは腹部鏡などの外科用鏡と組み合わせた投与が挙げられる。送達口は、例えば、適当な大きさの孔、または針もしくは針様口をもつカテーテルなどの外科用チューブでありうる。このように、送達には、針もしくはカテーテルなどの送達口の挿入、または送達口および外科用鏡の組み合わせの挿入を可能にするため患者における小さな切開を含みうる。都合のよいことに、前記組成物の注射は、送達部位を曝露する切開外科手法の必要性を回避する。

ＦＳＨの持続放出は、約５ｋＤ〜約４０ｋＤ、好ましくは約７ｋＤ〜約２０ｋＤ（例えば、約１０ｋＤ〜約２０ｋＤ）の分子量を有するポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーを含有するポリマーマトリックスからのＦＳＨの放出であり、これはＦＳＨの溶液の直接投与後に生物学的に有意な量のＦＳＨが利用可能である期間よりも長い期間にわたって生じる。本発明のある態様では、ＦＳＨの持続放出期間は、少なくとも５日、例えば、約５日〜約３０日の期間にわたって生じる。別の態様では、持続放出期間は、約７日〜約１４日である。さらなる態様においては、持続放出期間は、約３０日よりも長い、例えば、約６０日または約９０日でありうる。持続放出組成物からの生物学的に活性なＦＳＨの持続的な放出は、比較的一定または変化した放出速度での、連続的または断続的な放出でありうる。放出の連続性および放出のレベルは、使用されるポリマー組成（例えば、分子量ならびに、末端基の選択および界面活性剤および塩などの放出を緩和する他の賦形剤の添加などのポリマー化学）およびＦＳＨ負荷により影響を受けうる。

ポリマーは、このポリマーとこのポリマーの任意の分解産物とがレシピエントに非毒性であり、レシピエントの身体に対して有意に有害なまたは都合の悪い作用（例えば、注射部位での免疫応答）も伴わない場合、生体適合性である。

本明細書に規定される場合、「生物分解性」とは、その組成物がインビボで分解または腐食してより小さい化学種を形成することを意味する。分解は、例えば、酵素的、化学的および物理的プロセスにより生じうる。

別の態様に関する適切な生体適合性生分解性ポリマーとしては、例えば、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、約５ｋＤ未満または４０ｋＤを超える分子量のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリカーボネート、ポリエステルアミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（アルキレンアルキレート）、ポリエーテルエステル、ポリホスホエステル、生分解性ポリウレタン、これらのブレンド、およびこれらのコポリマーが挙げられる。

さらなる別の態様において、適切な生体適合性、非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、エチレン−ビニル酢酸と他のアシル置換セルロース酢酸とのポリマー、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホネートポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリプロピレンオキシド、これらの混合物、およびこれらのコポリマーからなる群より選ばれる非生分解性ポリマーが挙げられる。

別の態様において、ポリマーに適切な分子量は、所望のポリマー分解速度、機械的強度などの物理学的特性、および溶媒中のポリマーの溶解速度などの要因を考慮して当業者により決定されうる。典型的には、許容できる範囲の分子量は、５，０００ダルトン未満または約４０，０００ダルトン〜約２，０００，０００ダルトンである。

安定化ＦＳＨ製剤は、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥、噴霧乾燥およびその全てを参照により取り込んだコスタンチノ(Costantino)らによる米国特許第６，２８４，２８３号に記載のものなどの当該分野で公知の方法により調製されうる。例えば、安定化ＦＳＨ製剤は、多流体霧状化を用いて、ＦＳＨ、少なくとも一つの糖および少なくとも一つの溶媒を含有する流体を約０．３以上の質量流量比で霧状にして液滴を形成し、液滴を凍結して凍結液滴を作製し、この凍結液滴から溶媒を除去して破砕性微細構造物を作製し、この破砕性微細構造物の少なくとも一つのＦＳＨの非溶媒中の懸濁物を形成し、そして懸濁した破砕性微細構造物を破砕することで、安定化ＦＳＨ製剤の粒子を製造することにより、調製することができる。

持続放出組成物（ポリマー／活性剤マトリックス）を形成することができる多くの方法が知られている。このプロセスの一つの段階では、溶媒が微粒子から除去され、その後、微粒子産物が得られる。生物学的活性剤の持続放出用組成物の製造方法は、ゴンボッズ（Gombotz)らに付与された米国特許第５，０１９，４００号、およびハーバート（Herbert)らに付与された米国特許第５，９２２，２５３号に開示され、これらの教示はすべて参照により本明細書に援用される。

この方法では、生物学的活性剤、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などの生体適合性ポリマーおよび塩化メチレンなどのポリマー溶媒を含有する混合物が処理されて、液滴を形成し、ここで少なくとも有意な部分の液滴がポリマー、ポリマー溶媒および活性剤を含有している。これらの液滴は、次いで、適切な手段により凍結される。液滴を形成するための前記混合物を処理する手段の例には、超音波ノズル、加圧ノズル、レイリー射出口を通して、または溶液から液滴を作製する他の公知の手段により分散液を導入することが含まれる。

液滴を凍結するのに適切な手段は、液滴を、液体アルゴンまたは液体窒素などの液化ガス内またはその付近に導入して、凍結微小液滴を形成することを含み、これはついで液化ガスから分離される。凍結微小液滴は、次いで、エタノール、ヘキサン、ヘキサンを混合したエタノール、ヘプタン、ヘプタンを混合したエタノール、ペンタンまたは油などの液体または固体状非溶媒に曝露される。

凍結微小液滴中の溶媒は、固体および／または液体として非溶媒中に抽出され、生体適合性ポリマーおよび生物学的活性剤を含有するポリマー／活性剤マトリックスを形成する。エタノールと、ヘキサン、ヘプタンまたはペンタンなどの他の非溶媒との混合は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーなどの、あるポリマーからの溶媒の抽出速度を、エタノール単独で達成されるものよりも増大することができる。

液滴径を変えることにより、例えば、超音波ノズル径を変えることにより、広範囲の大きさの持続放出組成物が作製されうる。持続放出組成物が微粒子の形態であり、非常に大きな微粒子が所望されている場合、この微粒子は、例えば、冷却した液体中に直接シリンジを通して押し出し成形されうる。ポリマー溶液の粘度を増大することでも、微粒子径を増大することができる。このプロセスにより作製されうる微粒子の大きさは、例えば、直径約１０００μｍより大きい〜約１μｍまでの範囲である。

殺菌した製造物が所望される場合、処理工程が行なわれる環境は無菌状態でありうる。一般に、蛋白質粉末またはポリマーの定期的な(terminal)殺菌は推奨されていない。しかしながら、障壁（またはアイソレーター）技術の使用は無菌環境を提供しうる。例えば、障壁技術（ワーク・ステーション・アイソレーター（Work Station Isolator), ラカルヘン社(LaCalhene, Inc.))を使用して、以下のような操作プロセス、製造プロセスおよび回収プロセスについて無菌環境を提供することができる：

１）アイソレーターの内部環境（任意の装置の表面または存在する材料のパッケージを含む）は、蒸発した過酸化水素（ＶＨＰ）、強酸化剤を用いる汚染除去処置を受けることができる。
２）ユニットの空気濾過システムを具備する汚染除去処理が、アイソレーターの内部環境がクラス１００に合うおよび／または超えることを確実にすることができる。
３）オペレーターは、ハーフスーツの使用および／またはアイソレーターのグローブ伸長を通して内部アイソレーター環境から完全に分離され得る。
４）製造物に接触する材料は、アイソレーター内への投入前に濾過、蒸気、または加熱乾燥を経て殺菌され得る。
５）アイソレーター汚染除去の間に殺菌されない材料（上記１を参照）は、アイソレーター内への投入前に殺菌されうる。
−全ての処理ガスおよび溶液は、０．２μｍ滅菌フィルターを通してアイソレーター内に投入されうる。
−材料および装置は、加熱乾燥オーブンまたはオートクレーブにおいて先ず殺菌されうる。
−前記材料または装置が前記に示されたように殺菌されない場合、これらの部材の表面（部材のパッケージ）は、輸送アイソレーター（すなわち、部材をワーク・ステーション・アイソレーターまで送達するための小さなアイソレーター）内のＶＨＰを用いて汚染除去されうる。

ワークステーション・アイソレーターは、ＰＶＣおよびＤｉｖｅｔｅｘから作製することができる可撓性の壁で囲まれたアイソレーターでありうる。それは、入口および出口のＨＥＰＡ濾過、通風／再循環システムおよび複数の自動推進ファンを有することができ、これはチャンバーの乱れた空気の流れのパターンを提供する。ＶＨＰ−消毒凍結乾燥機に接続する一つの輸送口でありうる。アイソレーターは、内部環境を汚染除去するのに予めプログラムされた確認された、サイクルを用いてＡｍｓｃｏ社から入手できるものなどのＶＨＰジェネレーターから発生しうる気化過酸化水素を使用することができる。すべての製造物の操作、製造物の輸送および回収の手法は、アイソレーターの領域内で行なわれうる。

ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーおよび安定化ＦＳＨ製剤を含有する懸濁液から持続放出組成物を形成するさらに別の方法には、フィルムまたは形状を形成するために、鋳型などにおける注型を含む。例えば、懸濁液を型に入れた後、次いで当該分野で公知の手段により、好ましくは、低温で一定の乾燥重量をもつフィルムまたは形状が得られるまでポリマー溶媒は除去される。

市販のマイクロカプセル化プロセスおよびそれにより製造された微粒子のさらなる例は、米国特許第３，７３７，３３７号に開示され、その全ては参照により本明細書に援用され、ここで溶媒中で壁または外殻を形成するポリマー状物質の溶液が調製される。この溶媒は、水に部分的にのみ混和できる。固体またはコアな物質は、ポリマー含有混合物中に溶解または分散され、その後、コア物質含有混合物は、微粒子から溶媒を除去するために、有機溶媒に混和しない水性の液体中に分散される。

物質を含有する微粒子から溶媒を除去するプロセスの他の例は、米国特許第３，５２３，９０６号に開示され、その全ては参照により本明細書に援用される。このプロセスにおいて、カプセル化される物質は、水に混和しない溶媒中でポリマー物質の溶液で乳化され、次いでエマルジョンは、親水性コロイドを含有する水溶液中で乳化される。微粒子からの溶媒の除去は、次いで、エバポレーションにより行なわれ、製造物が得られる。

米国特許第３，６９１，０９０号（その全てが参照により本明細書に援用される）に示されるようなさらに別のプロセスにおいて、有機溶媒は、水性媒体中、好ましくは減圧下で微粒子の分散液からエバポレートされる。

同様に、米国特許第３，８９１，５７０号の開示（その全てが参照により本明細書に援用される）は、多価アルコール媒体中の微粒子の分散液由来の溶媒が、加熱の適用によりまたは減圧に微粒子を供することにより微粒子からエバポレートされる方法を示す。

溶媒除去プロセスの別の例は、米国特許第３，９６０，７５７号に示され、その全てが参照により本明細書に援用される。

タイス(Tice)ら、米国特許第４，３８９，３３０号は、以下の工程を含む方法による活性剤を含有する微粒子の調製を記載している：（ａ）溶媒中において活性剤を溶解または分散し、かつその溶媒中において壁形成物質を溶解する工程；（ｂ）連続相処理媒体中に活性剤と壁形成物質を含有する溶媒を分散する工程；（ｃ）工程（ｂ）の分散液から一部の溶媒をエバポレートし、それにより懸濁液中において活性剤を含有する微粒子を形成する工程；および（ｄ）微粒子から溶媒の残りを抽出する工程。

特定の理論により拘束されずに、ＦＳＨの放出が２つの異なるメカニズムで発生しうる。第１では、ＦＳＨが、ポリマーマトリックス中に生成される水性充填チャンネルを経る拡散により（例えば、ＦＳＨの溶解により）、または持続放出組成物の調製中にポリマー溶媒の除去で作りだされた空間により放出されうる。第２のメカニズムは、ポリマーの分解による、生物学的活性剤の放出である。分解速度は、ポリマーの水和速度に影響を及ぼすポリマー特性を変えることにより調節することができる。これらの特性は、例えば、ポリマーを構成する、ラクチドおよびグリコリドなどの異なるモノマーの割合；ラセミ体混合物にかえたモノマーのＬ−異性体の使用；および、ポリマーの分子量とポリマーの末端基化学（すなわち、酸対エステル）が挙げられる。これらの特性は、ポリマーの水和速度を調節する、親水度および結晶化度に影響を与えうる。

ポリマーの特性を変えることにより、拡散および／またはＦＳＨ放出へのポリマー分解の寄与が制御されうる。例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーのグリコリド含量を増加することおよびポリマーの分子量を低減することは、ポリマーの加水分解を増大し得、したがって、ポリマーの腐食から生物学的活性剤放出の増大を提供する。

ＦＳＨ含有持続放出組成物の製造およびキャラクタライゼーションの際に作製したサンプルを分析するのに以下の方法を使用した。

分析方法
サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
サイズ除外クロマトグラフィーを用いて、モノマー組み換えヒトＦＳＨ（ｒｈＦＳＨ）を定量し、サンプル中において二量体、単量体および凝集したｒｈＦＳＨの相対量を測定した。ＴＯＳＯＨＡＡＳカラムＧ２０００ＳＷｘ１７．８Ｘ３００、５μを利用した。流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎであった。移動相は、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．７、０．１Ｍ硫酸ナトリウムであった。

逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）
逆相ＨＰＬＣを用いて、ＦＳＨサンプルの純度、特に酸化されたｒｈＦＳＨおよび元のｒｈＦＳＨの量を測定した。ＶＹＤＡＣカラムＣ４、４．６ｍｍ、５ミクロン、３００Åを利用した。溶出システムは、移動相Ａ、０．１Ｍリン酸トリエチルアミン、移動相Ｂ、１００％アセトニトリルおよび移動相Ｃ、３０％アセトニトリルと０．１％ＴＦＡから成り、以下のグラジエントを使用した。流速は、１ｍＬ／分であった。

（分）移動相Ａの割合移動相Ｂの割合移動相Ｃの割合
０８６１４０
５６７２２８０
５７００１００
７２００１００
７３８６１４０
９３８６１４０

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、非還元条件下で行なわれ、ＦＳＨのサブユニットの脱解離度を測定した。サンプルをサンプルバッファーで溶解した。サンプルを調製して、エクセル・ゲル・ＳＤＳ・グラジエント８〜１８％に負荷した。銀染色プラスで染色することにより得られたバンド形成パターンを検出した。タンパク質の純度は、デンシトメトリーおよびサブユニット濃度の標準曲線との比較により評価した。その結果は、同じＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル調製手順により行った大量の薬剤と比較した。

粒径分析
微粒子の粒径を測定した。平均粒径は、コールター・マルチサイザーIIe を用いて決定した。簡単には、約１０ｍｇの微粒子を粒径分析用のＩｓｏｔｏｎ（登録商標）（市販の緩衝化生理食塩水溶液）に添加した。懸濁液を次いで、２８０ミクロン開口チューブを用いて分析し、粒径分布を決定した。ＮＩＳＴ保証ポリスチレンビーズを、較正標準として使用した。その結果を容積−重量メジアン径として報告した。

ポリマー同一性／ゲル浸透クロマトグラフィー
持続放出組成物に使用されるポリマーの平均分子量の決定を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて行なった。サンプルをクロロホルム中に約１ｍｇ／ｍＬに溶解し、移動相としてクロロホルムを用いてポリマーラボラトリーズ（Ａｍｈｅｒｓｔ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）ＰＬゲル混合−Ｅカラム（３００ｍｍ×７．５ｍｍ、３μｍ粒子）上で分離した。ピークを屈折率検出器により検出した。ポリスチレン標準品を使用した。

負荷量測定
持続放出組成物中のFSH負荷量を、標準炭素／水素／窒素(CHN)元素解析装置を用いる窒素解析により測定した。試料（約１〜５mg）を酸素雰囲気中980℃で燃焼させると窒素および窒素酸化物が生成した。ガス流を700℃の金属銅にて還元すると、熱伝導度検出器により定量される窒素元素が生成した。NIST検出可能なアセトアニリドを標準として使用した。

MAIACLONE IRMAアッセイ
生物学的液体中のFSHの量を、MAIACLONEキット(BioChem. Immunosystems Italia S.P.A.)を用いることにより、製造業者の指示書にしたがって測定した。簡単には、試料、標準および対照を、２つの高親和性モノクローナル抗体の混合物（一方は放射性ヨウ素で標識され、他方はフルオレセインに結合）と反応させた。磁気粒子に結合した抗フルオレセイン抗体を過剰に添加する。この抗体は、FSHモノクローナル複合体に特異的に結合し、磁場内で沈降する。抗原の濃度は、磁気粒子に結合した放射能に正比例する。各試料の結合画分を、I¹²⁵-ヨウ素を検出するように較正したγ線計数器にて測定する。４パラメータフィット標準曲線を用い、試料中のFSHの濃度が測定され得る。このアッセイでは検出限界は0.5mIU/mLであり、定量限界は1.5mIU/mLである。

抽出
FSHを、フィルター法を利用して持続放出組成物から抽出した。この方法は、タンパク質完全性およびタンパク質含量を測定するために使用した。簡単には、60mgのミクロスフェアを１mLの塩化メチレン中に懸濁してポリマーを溶解させた。懸濁したタンパク質含有粒子を0.65ミクロン孔径フィルター上に回収した。フィルターを乾燥させた後、FSHを、１mLの水性媒質中で再構成した。再構成後、タンパク質の完全性および含量を、既に記載したSEC、RPHPLCおよびSDS-PAGE法を用いて測定した。

あるいはまた、懸濁したタンパク質含有粒子を遠心分離により回収し、上清みを除去した。ペレットを乾燥させ、次いでFSHを１mLの水性媒質中で再構成し、次いで、フィルター法について記載のようにしてタンパク質の完全性および含量について解析した。

製剤化
FSH、糖および任意にバッファーの混合物の凍結乾燥による安定化FSH製剤の形成。製剤の凍結乾燥は、混合物の液滴上、またはLyoguardトレイ(W.L. Gore and Associates, Delaware)内でのバルク凍結乾燥にて行なった。さらなる詳細は、本明細書の実施例５に記載する。

無菌手順が望ましい場合、ミクロ粒子の形成について上記したようなWorkstation IsolatorおよびTransfer Isolatorを使用し得、例えば、VHPを用いて消毒し得る。使用前に過酸化水素レベルを目的レベル未満と確認し得る。バッファーおよび溶液は、注射用水(WFI)を用いて調製し得る。FSHおよび任意の他の所望の成分を含有する溶液を、例えば、0.2μmフィルターを通してWorkstation Isolator内に滅菌濾過し得る。製剤化されたFSH溶液を噴霧ノズルを用いて液体窒素床内に噴霧し得る。次いで、凍結FSHを適当な乾燥サイクルを用いて凍結乾燥し得る。次いで、凍結乾燥FSH含有粉末を回収し、約-80℃で保存し得る。

使用したポリマーは、Cincinnati, OHのAlkermes, Inc.から購入した。
ポリマー2A (Alkermes, 5050 2A)ポリ(ラクチド-コ-グリコリド); 50:50ラクチド:グリコリド比; 10kD Mol. Wt.;カルボン酸末端基。
ポリマー2M (Alkermes, 5050 2M)ポリ(ラクチド-コ-グリコリド); 50:50ラクチド:グリコリド比; 18kD Mol. Wt.;メチルエステル末端基。
ポリマー2A:2M 75%(w/w) 2Mおよび25% 2A w/w。
ポリマー1A:Alkermes, 5050 1A ポリ(ラクチド-コ-グリコリド); 50:50ラクチド:グリコリド比; Mol. Wt.５kD;カルボン酸末端基
ポリマー1A 45:55 (Alkermes, 45/55 1A)ポリ(ラクチド-コ-グリコリド); 45:55ラクチド:グリコリド比; Mol. Wt.５kD;カルボン酸末端基

ミクロ粒子の調製方法
ポリマーを適当なポリマー溶媒に溶解することによるポリマー溶液の形成。
ポリマー／タンパク質混合物を形成するためのポリマー溶液への安定化FSH製剤凍結乾燥物の添加。
ポリマー／タンパク質混合物の任意のホモジナイズ。
超音波処理または液滴形成の他の手段によるポリマー／タンパク質混合物の微粉化、および液体窒素との接触による液滴の凍結。
ポリマー／タンパク質液滴から抽出溶媒（例えば、-80℃エタノール）中へのポリマー溶媒の抽出、それによるポリマー／安定化タンパク質マトリックス含有粒子の形成。
濾過による抽出溶媒からの粒子の単離。
エバポレーションによる残留溶媒の除去。
注射可能な産物が作製されるよう適切なサイズのメッシュ通過による粒子の篩い分け。

無菌処理
Workstation IsolatorおよびTransfer Isolatorを、上記のようにして消毒した。アイソレータ内の過酸化水素レベルのレベルを測定した。すべての処理液は滅菌0.2μmフィルターを通してWorkstation Isolator内に入れた。ポリマー溶液を、ポリマーをジクロロメタンに溶解し、次いで、Workstation Isolator内に濾過することにより調製した。以下の工程をWorkstation Isolator内において行なった：ａ）必要な質量のFSH含有凍結乾燥粉末を計りとり、必要な容量のポリマー溶液をFSH含有凍結乾燥粉末に添加した。タンパク質／ポリマー懸濁液を超音波処理してFSH含有凍結乾燥粉末の粒径を縮小した。タンパク質／ポリマー懸濁液を、凍結エタノールベンド(bend)の上部で液体窒素中に微粉化した。ミクロ粒子を、アイソレータにフリーザーとして取り付けた凍結乾燥ヤーを用いてエタノール中で硬化した。ミクロ粒子およびエタノールのスラリーを濾過し、回収したミクロ粒子を滅菌凍結乾燥ヤー内で乾燥させた。ステンレス製篩によりWorkstation Isolator内でミクロ粒子を篩い分けした。

実施例１：PLG化学の効果
PLG化学（末端基、分子量およびラクチド対グリコリド比）の組換えFSH (rhFSH)完全性および持続放出組成物からの放出に対する効果を評価した。

いくつかのポリマー、すなわち、2M、2Aおよび1A（すべて1.0% rhFSH名目負荷量で）を試験し、45:55ラクチド:グリコリド比の1A型ポリマーおよび2A:2Mの1:3ブレンドも調べた。

安定化FSH製剤を、10%FSH、80%スクロースおよび10%リン酸塩により作製した。いくつかの異なるポリマータイプをスクリーニングし、それを表IIにまとめる。注射用量は、１% rhFSHを負荷量した名目上10mgのミクロ粒子、または100μgタンパク質とした。PKデータを200μg rhFSH/kgラットに対して用量基準化したデータとして示す（表１）。C_maxを、試験中に観察された最高rhFSH濃度として実験的に決定する。持続期間は、定量限界未満のレベルである２つの連続した時間点の最初の時間点、または定量限界未満のレベルである２つの連続した時間点がない場合は、測定可能な値を有する最後の時間点と規定する。

製剤1-1を注射した動物の１匹は、注射後36日（採用した最後の時間点）まで測定可能な血清rhFSHレベルを有するが、同じ製剤を与えた別の動物は、第10日および第31日に測定可能なレベルを有したが両日間では有さず、これは、後者の場合、rhFSHが、IRMAアッセイの定量限界付近であるにもかかわらず、試験の終了時に血清中に存在したことを示す（図１）。

さらなる試験において、FSH血清濃度対時間プロフィールを、製剤3-1で繰り返した。この製剤は、約825 mIU/mLのC_maxおよび約15時間のT_maxを有した。

実施例２：賦形剤の効果
持続放出組成物の製剤化の間に凍結乾燥物と同じカプセルに包まれた種々の賦形剤の効果を試験した（表III）。表IIIに列挙した製剤のうちあるものは、先に記載のようなスクロース凍結乾燥物製剤（80:10:10、スクロース:FSH:リン酸ナトリウム塩）を用いて作製し、またあるものはトレハロース含有凍結乾燥物（スクロースをトレハロースに置き換える）を用いて作製した。

同じカプセルに包まれた種々の賦形剤を、最終組成物の持続放出プロフィールからのrhFSH放出の調節に対する効果について試験した。賦形剤は、例えば、持続放出組成物の多孔性を増強することにより、種々の機構によってタンパク質放出を調節し得る。例えば、水に対する親和性を有する賦形剤は、持続放出組成物内への水吸収を増強し得、溶解すると、タンパク質が該組成物から放出されるためのさらなる多孔性を作り出し得る。以下に示すように、試験した潜在的放出モディファイアには、塩化ナトリウム塩、およびポロキサマーPruronic F-127などの界面活性剤、およびポリ（エチレングリコール）、(PEG) 8000 kD MWを含めた。これらの化合物は、水に対する親和性を有し、ミクロ粒子から速やかに拡散する高度に可溶性の低分子量塩から、ミクロ粒子からより低速で拡散するはずの可溶性ポリマー(PEG)までを包含する。

FSH持続放出組成物のインビボ放出プロフィールを解析した。典型的なPK実験において、３匹の雄スプレーグ・ドーリーラット(450±50 g)に、３%カルボキシメチルセルロース、0.9% NaClおよび0.1% TWEEN-20を注射用水中に含む希釈剤の0.75 mLに懸濁したミクロ粒子10 mgを皮下注射した。第１日ではいくつかの時間点で、および試験した製剤の予測される持続期間に応じて35日まで、１日約１回、血清試料を回収した。BioChem. Immunosystems Italia S.P.A.により提供されたMAIAclone (IRMA)を用いて血清試料からFSHを定量した。示したデータは、典型的には、200マイクログラムFSH/kgに対して用量-基準化してある。

rhFSH放出プロフィールは、10% F127、製剤3-3、または５% F127および5% NaCl、製剤3-4の1Aポリマーへの添加は、モディファイアを含まない1Aポリマーの場合と比べて、放出プロフィールを実質的に改変しないことを示した。これらのすべての場合において、C_maxおよび持続期間は同様であった。高濃度の放出モディファイア、例えば、10% NaCl含有1Aポリマー相(3-5)、および5% PEGと10% NaClの組み合わせを含有する1Aポリマー(3-7)では、放出モディファイアの存在により、持続期間は、それぞれ14日および10日に短縮された。これらの結果を、10% F127を添加し、持続放出持続期間が17日であった製剤3-3と同等であり得る。放出モディファイアを含有する2Aポリマーについても同様の結果が得られた。10% NaCl (2-3)または5% PEGおよび10% NaCl、製剤2-4を2Aポリマーミクロ粒子に添加した場合、測定可能なrhFSHレベルの最終日は注射後17日であったが、5% F127および5% NaClとともに製剤2-2を添加した場合、持続期間は21日間であった。放出モディファイアの添加の結果としてのC_maxにおける傾向はなかった。放出モディファイアを含有する1Aポリマー試料は、約800〜1100 mIU/mLの範囲のC_maxを有し（表III）、放出モディファイア無含有試料と同等であった（表II）。2Aポリマー持続放出組成物試料についても同様の結果が得られた。

また、表IIIは、酸化割合および塩化メチレン遠心分離法を用いたミクロ粒子からの抽出後のタンパク質のサブユニット形成割合のデータを示す。サブユニットの形成は、すべての製剤において非常に少なく、１%以下であった。SECデータ（示さず）は、すべての試料について約100%単量体タンパク質を示した。すべての製剤について酸化は、放出モディファイア含有製剤について３〜５%であった。

実施例３：タンパク質負荷量、用量および安定化賦形剤としてのスクロース対トレハロースの効果
タンパク質完全性および放出に対するタンパク質負荷量の効果を評価した。上記の１%負荷量に加え、0.5%および0.25%の低FSH負荷量も試験した。それぞれ、10、20および40 mgの持続放出組成物の投与に相当する、ラットあたりrhFSH 100μgの同じ投与量でPK試験を行なった。この試験は、2Aおよび2Mポリマー型についてスクロース含有凍結乾燥物製剤を利用した。また、同じ負荷量範囲系列のポリマー型を、代替トレハロース凍結乾燥物を用いて作製した。データを表IVに示す。

表IVに示したすべての試料は、SECによる約100%単量体タンパク質および約４%までの酸化されたサブユニット種を含んだ。タンパク質安定性と負荷量または糖の選択との間で傾向は観察されず、例えば、糖はスクロースまたはトレハロースなどの二糖であり得る。放出プロフィールは同様であった。したがって、スクロースおよびトレハロースは、ともに、凍結乾燥およびその後のPLG持続放出組成物へのカプセル化の際のrhFSHの好適な安定化剤である。

カプセル化rhFSHの投与量の変更もまた試験した。2Aポリマーに0.5% rhFSHで負荷したスクロース含有凍結乾燥物では、15 mg、5 mgおよび2 mgの投与量（名目上）の持続放出組成物の投与を試験した。21日までの血清プロフィールを図２に示す。基準化の際、２〜15 mg (10〜75μg rhFSH/ラット)の2Aポリマー持続放出組成物では、すべての投与量で、７日間にわたって同様の放出プロフィールが得られた。同じ凍結乾燥物および負荷量を用い、16 mgおよび8 mgの2A:2Mポリマーブレンド製剤（５型）もまた投与した。これらの投与量のブレンドに関する血清データを図２に示す。同じ投与量に基準化すると、rhFSHレベルは、16 mgおよび8 mg投与量で同等であった。また、2A:2Mポリマーブレンド持続放出組成物の放出プロフィールは、用量に関係なく2Aポリマー持続放出組成物とは明白に異なった。これらの同じデータもまた図３に非投与量基準化形態で示す。すべての2A投与量について、17日以降のデータはアッセイ定量限界未満であった。

実施例４：rhFSH持続放出組成物の特性付け
表Ｖは、rhFSH持続放出組成物の３つの製剤のいくつかのバッチ（すべて0.5%タンパク質負荷量、３種の異なるポリマー、すなわち、2M、2Aおよび2A:2Mの1:3 (w/w)ブレンド、それぞれ、製剤１，２および５）に関するデータを示す。これらの持続放出組成物バッチは、スクロース含有凍結乾燥物製剤（80:10:10;スクロース、FSH、リン酸塩）を用いて作製した。抽出したタンパク質のデータを、（表Ｖで注釈した以外は）フィルター抽出法を用いて作製した。（フィルター法を用いて）抽出したタンパク質の完全性データに加え、表は、持続放出組成物特性付けデータ：メジアン粒子径(D_v.50)および含水率も示す。比較のため、表Ｖはまた、2A (製剤2-5)、2M (製剤1-2)および2A:2Mブレンド製剤(5-1)の実施例１のデータを含む。データは、カプセル化に対するrhFSHの安定性が、以前の同じ製剤のバッチにおいて観察されたものと類似したことを示す。すべてのバッチについて、メジアンミクロ粒子径は約40〜60μmであった。すべてのポリマーバッチの含水量は、約0.5〜1.0%であった。主なrhFSHのミクロ粒子製剤の種々のバッチの放出プロフィールを図４（2Aポリマー製剤）、図５(2Mポリマー製剤)および図６(2A:2M2Aポリマーブレンド製剤)に示す。図４、５および６ならびに表Ｖは、各製剤のバッチ間でインビトロ結果およびインビボ結果が類似することを示す。

実施例５：安定化FSH製剤
上記の持続放出組成物において使用した安定化凍結乾燥物を、分解、凝集、有効性の喪失および／またはFSHの損失（これらすべては、持続放出組成物の製剤化の際に起こり得る）を最小限にする能力により同定した。後にポリマー内にカプセル化される安定なFSH含有凍結乾燥物を作製した。凍結乾燥物製剤試験は、噴霧凍結乾燥処理工程中、FSHを安定化する添加剤を同定するため、およびタンパク質の溶解およびミクロ粒子からの放出の初期段階を模倣した条件である生理学的温度での湿気への曝露後の凍結乾燥物の安定性を評価するために行なった。

凍結乾燥中および湿気への曝露後にFSH製剤を安定化する塩および添加剤を同定するため、７種のFSH含有凍結乾燥物を作製した。各凍結乾燥物は10% FSH、10%塩および残部(80%)安定化添加剤を含有した。凍結乾燥物組成物は、週１回注射の１回に送達されるFSHの推定合計負荷量100μgおよび10 mgのミクロ粒子に含まれる標的凍結乾燥物負荷量(FSH質量+塩+安定化剤)10%に基づいて測定した。製剤を表VIにまとめる。

製剤は、添加剤および塩の溶液をバルク薬物に添加することにより調製した。次いで、各製剤化溶液を噴霧凍結乾燥し、凍結乾燥粉末を作製した。各粉末の試料をDI水に溶解し、凍結乾燥後の安定性を評価するためにSECにより評価した。また、各粉末を100%相対湿度に37℃で24時間曝露し、続いて加湿後の安定性を評価するためにSECにより評価した。これらの実験の結果を、それぞれ表VIIおよびVIIIに示す。

表VIIのデータは、７つの製剤中６つで、SECにより評価されるように、FSHが凍結乾燥中安定であることを示す。試料L-7（ｗ／酢酸亜鉛）での低回収率およびクロマトグラムで観察されたピークテーリングは、分解を示し得る。

表VIIIは、塩および添加剤が、加湿後のFSHの安定性に対して有意な効果を有することを示す。データは、これらの製剤が、凍結乾燥および加湿中安定であることを示唆する。炭酸水素塩を用いて作製したスクロース製剤およびトレハロース製剤はともに、SECにより13.7分に小さなピークを示し、これは、凝集の存在を示す。製剤L-5、L-6およびL-7は、凝集および／またはサブユニットを有した。硫酸アンモニウムは、FSHに対する強力な不安定化剤であると思われる。

これらの結果に基づき、トレハロース／リン酸塩凍結乾燥物製剤およびスクロース／リン酸塩凍結乾燥物製剤は、安定な凍結乾燥物であると認められる。

安定化FSH製剤は、FSH、安定化賦形剤（例えば、糖）および可能であれば、少なくとも１つのバッファー塩を含有する製剤化水溶液から調製される。この製剤化水溶液は、バルク凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥、回転式エバポレーション真空乾燥、および超臨界流体乾燥などの多種多様な薬剤加工方法により、持続放出組成物を作製するための加工に適切なもろい形態に乾燥させ得る。特に噴霧凍結乾燥は、非常にもろい乾燥固体の作製に好ましく、加工条件に応じてミクロンからサブミクロンまでの粉末を生じ得る(Costantinoら、米国特許第6,284,283号、参照により本明細書に取りこまれる)。幾分もろさの劣る粉末は、バルク凍結乾燥により達成され得る。好ましい態様では、製剤化水溶液を容器、例えばLYOGUARDトレイ(W.L. Gore & Associates, Elkton, MD)内に注入し、凍結乾燥機の棚上で凍結させ、凍結乾燥機内で乾燥させ得る。別の好ましい態様では、製剤化水溶液を、微粉化技術（例えば、単一流体、高圧ノズル）を用いて凍結媒質（例えば、液体窒素）中に噴霧し、液体窒素スラリーを容器内に注入し、凍結物質を凍結乾燥機内で凍結乾燥により乾燥する。後者の態様は、噴霧凍結乾燥により作製したものと比べ、より大粒径の粉末の作製を可能にする。

10% FSH、80%スクロースおよび10%リン酸塩安定化FSH製剤について、これらの異なるアプローチを用いて作製した粒径の比較を以下の表に示す。

実施例６：非カプセル化FSHの薬物動態試験
組換えヒト卵胞刺激ホルモン(rhFSH) (Serono)のバルク投与の薬物動態(PK)を、体重約400 g±50 g (SD)の雄スプレーグドーリーラットにおいて評価し、血清中でFSHを検出する能力を示した。rhFSH PK特性付けのための投与量は、
Ａ）静脈内(IV)ボーラスとして0.5μg/0.5 mL
Ｂ）皮下ボーラス(SC)として10μg/0.5 mL、５μg/0.5 mLおよび１μg/0.5 mL
Ｃ） ALZET（登録商標）浸透圧ポンプ(モデル2001、1.0μl/時、１週間持続期間)からの連続SC送達として0.5μg/時 (0.5 ug/μL)、0.25μg/時 (0.25μg/μL)および0.05μg/時 (0.05μg/μL)とした。IVおよびSCボーラス試験およびSC浸透圧ポンプ試験のためのビヒクルは0.9%生理食塩水とした。

血液試料を種々の時間点において採取し、アッセイのために血清を分離した。試料を、免疫放射定量測定法(IRMA)にしたがって解析した。rhFSHについて以下のパラメータ：分布相半減期および排出相半減期（αおよびβHL）、時間０から無限大までの血清濃度-時間曲線下面積(AUC)、最大観察濃度(C_max)での最大観察濃度時間(T_max)およびSCポンプ埋め込み後２日〜７日までの平均定常状態濃度(C_SS)を推定した。以下の試験を完了したrhFSH 01-rhFSH 03。

0.5μg/0.5 mL (実際の投与量：0.455μg/0.5 mL)の単回IV投与後のラットにおけるrhFSHの単回投与薬物動態学を測定した。平均AUC_0-last およびAUC_0-infinity は、それぞれ3535および3852 mIU/時/mLであり、分布相および排出相のαおよびβ半減期はそれぞれ、0.46±0.19および4.02±1.04時間であり、クリアランスは36.43 mL/時/kgであった。

rhFSHの３つの投与量を、SC単回ボーラスとして与えた。rhFSHは用量比例的に吸収され、約9.4〜10時間で最大平均血清濃度であった。SCボーラス処置の３つの投与群Ａ、ＢおよびＣの平均PKパラメータの比較は、αおよびβ半減期が、10 ug投与群（実際の投与量：9:02μg）では5.5±0.97および8.0±1.6時間；ならびに５μg投与群（実際の投与量：4.55μg)では4.8±1.6および8.6±1.3時間；ならびに１μg投与群（実際の投与量：１μg)では5.4±0.98および10.3±5.0時間であることを示す。T_max値は、それぞれ、一群あたり、9.5±0.4、9.4±0.6および10.0±0.9時間であった。平均C_max値は、10μg投与群では235±27 mIU/mL、５μg投与群では90±9.3 mIU/mLおよび１μg投与群では16.1±2.0であった。SCボーラス群の平均バイオアベイラビリティは、それぞれ、82.2±6.7および63.7±18.7パーセントであった。C_max、AUCおよび相対バイオアベイラビリティはすべて、用量の増加とともに、やや非比例的に増加した。

浸透圧ポンプ試験において、非免疫抑制ラットモデル対免疫抑制ラットモデルにおけるrhFSHの薬物動態をまず比較した。各々１時間あたり0.25μgのrhFSH注入(実際の投与量：0.273μg/時)を受けた、一方の群は腹腔内(IP)Sandimmune シクロスポリンを受けた２つの群を比較した。ＢとＤとの群間で有意差は認められなかった。

また、浸透圧ポンプからの持続放出レベルを、すべての用量および0.25μg/時免疫抑制群について評価した。免疫抑制群において、平均C_ss（第２日〜第７日まで）は、0.5μg/時群では149±5.2 mIU/mL、0.25 ug/時群では70±4.1 mIU/mL、0.05μg/時群では13±1.8 mIU/mLおよび0.25μg/時では79±7.1 mIU/mLであった。４群について絶対バイオアベイラビリティは37%〜42%の範囲であり、SCボーラス投与に基づく相対バイオアベイラビリティは47%〜57%の範囲であった。本研究を通して群C_ss値について直線性が観察された。

実施例７：lot 2-14、1-11および5-5のラットにおける薬物動態プロフィールならびにヒトデータとの比較

表Ｘの各製剤を３匹の雄スプレーグドーリーラットに200μg/kgの投与量で持続放出組成物を注射した。血清試料を定期的に採取し、rhFSH血清濃度を、MAIAclone IRMAアッセイを用いて測定した。図7aは、表示した製剤の投与後のrhFSH血清濃度対時間（日）を示す。図7bは、同じ製剤を７μg/kgで皮下投与した後のrhFSH血清濃度対時間（日）のヒトデータを示す。

本明細書に引用したすべての参考文献は、参照によりそのまま援用される。本発明は、その好ましい態様を参照して、詳細に示され、そして記載されているが、形態および詳細における種々の変化が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずに、その中でなされ得ることは、当業者によって理解される。

図１は、示されるFSH持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図２は、示されるFSH持続放出組成物の種々の投薬量（投薬量規準化されている）の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図３は、示されるFSH持続放出組成物の種々の投薬量（投薬量規準化されていない）の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図４は、示される持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図５は、示される持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図６は、示される持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図7aは、示される持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するラットのFSH血清濃度のプロットである。図7bは、示されるFSH持続放出組成物の投与後の時間（日）に対するヒトのFSH血清濃度のプロットである。

Claims

ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤
を含有してなり、該安定化FSH製剤がポリマー内に分散しているFSHの持続放出用組成物。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項１記載の組成物。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項１記載の組成物。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項３記載の組成物。
微粒子の形態である請求項１記載の組成物。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約90％(w/w)で存在する請求項１記載の組成物。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項６記載の組成物。
糖が二糖である請求項１記載の組成物。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項８記載の組成物。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項１記載の組成物。
バッファー塩が、製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項１０記載の組成物。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項１０記載の組成物。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項１記載の組成物。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項１記載の組成物。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項１記載の組成物。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項１５記載の組成物。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項１５記載の組成物。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが、少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項１記載の組成物。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項１８記載の組成物。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項１記載の組成物。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤；
を含有し、該安定化FSH製剤が該ポリマー内に分散しているFSHの持続放出用組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、FSHの送達を必要とする患者へのFSHの送達方法。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項２１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項２１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項２３記載の方法。
組成物が微粒子の形態である請求項２１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約99％(w/w)で存在する請求項２１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項２６記載の方法。
糖が二糖である請求項２１記載の方法。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項２８記載の方法。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項２１記載の方法。
バッファー塩が製剤の総乾燥重量の約１(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項３０記載の方法。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項３０記載の方法。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項２１記載の方法。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項２１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項２１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項３５記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項３５記載の方法。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項２１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項２１記載の方法。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項３９記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤
を含有してなり、該安定化FSH製剤がポリマーに分散しているFSHの治療的に有効な血液レベルを患者に持続した期間提供する方法。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項４１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項４１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項４３記載の方法。
組成物が微粒子の形態である請求項４１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約99％(w/w)で存在する請求項４１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項４６記載の方法。
糖が二糖である請求項４１記載の方法。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項４８記載の方法。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項４１記載の方法。
バッファー塩が、製剤の総乾燥重量の約１(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項５０記載の方法。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項５０記載の方法。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項４１記載の方法。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項４１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項４１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項５５記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項５５記載の方法。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項４１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが、少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項４１記載の方法。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項５９記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤；
を含有し、該安定化FSH製剤が該ポリマー内に分散している持続放出組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む患者の卵巣内の卵胞の成熟を促進する方法。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項６１記載の方法。
FSHが、安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項６１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項６３記載の方法。
前記組成物が微粒子の形態である請求項６１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約99％(w/w)で存在する請求項６１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項６６記載の方法。
糖が二糖である請求項６１記載の方法。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項６８記載の方法。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項６１記載の方法。
バッファー塩が製剤の総乾燥重量の約１(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項７０記載の方法。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項７０記載の方法。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項６１記載の方法。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項６１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項６１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項７５記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項７５記載の方法。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項６１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項６１記載の方法。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項７９記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤；
を含有し、該安定化FSH製剤が該ポリマー内に分散している持続放出組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む患者の精巣において精子形成を促進する方法。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項８１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項８１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項８３記載の方法。
組成物が微粒子の形態である請求項８１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約99％(w/w)で存在する請求項８１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項８６記載の方法。
糖が二糖である請求項８１記載の方法。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項８８記載の方法。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項８１記載の方法。
バッファー塩が製剤の総乾燥重量の約１(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項９０記載の方法。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項９０記載の方法。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項８１記載の方法。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項８１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項８１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項９５記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項９５記載の方法。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項８１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項８１記載の方法。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項９９記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマー；および
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤；
を含有し、該FSHがそこに分散している持続放出組成物の治療有効量を、処置を必要とする患者に投与することを含む繁殖能力障害の処置方法。
FSHが持続放出組成物の総乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)で存在する請求項１０１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約１％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項１０１記載の方法。
FSHが安定化製剤の総乾燥重量の約３％(w/w)〜約30％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項１０３記載の方法。
組成物が微粒子の形態である請求項１０１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約50％(w/w)〜約99％(w/w)で存在する請求項１０１記載の方法。
糖が安定化製剤の総乾燥重量の約70％(w/w)〜約97％(w/w)で存在する請求項１０６記載の方法。
糖が二糖である請求項１０１記載の方法。
二糖がスクロース、ラクトースまたはトレハロースである請求項１０８記載の方法。
安定化FSH製剤が少なくとも１つのバッファー塩をさらに含有してなる請求項１０１記載の方法。
バッファー塩が製剤の総乾燥重量の約１(w/w)〜約10％(w/w)で安定化製剤中に存在する請求項１１０記載の方法。
バッファー塩がリン酸バッファー塩である請求項１１０記載の方法。
FSHが少なくとも５日間放出される請求項１０１記載の方法。
FSHが少なくとも30日間放出される請求項１０１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが約10kD〜約20kDの分子量を有する請求項１０１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが酸末端基を有してなる請求項１１５記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーがメチルエステル末端基を有してなる請求項１１５記載の方法。
安定化FSH製剤が、約１％(w/w)〜約30％(w/w)のFSH、約50％〜約99％の糖および約１％〜約10％のバッファー塩を含有してなる請求項１０１記載の方法。
ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーが少なくとも１つの酸末端基ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）および少なくとも１つのメチルエステル末端ポリ（ラクチド-コ-グリコリド）を含有するブレンドである請求項１０１記載の方法。
コポリマーのブレンドが３エステル末端基に対して１酸末端基の比である請求項１１９記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーをポリマー溶媒に溶解させ、ポリマー溶液を形成する工程；
ｂ）FSHおよび少なくとも１つの糖を含有する安定化FSH製剤をポリマー溶液に添加し、ポリマー／安定化FSH製剤混合物を形成させる工程、ここでFSHは組成物の乾燥重量の約0.05％(w/w)〜約15％(w/w)の最終濃度で存在する；
ｃ）ポリマー／安定化FSH混合物から溶媒を除去する工程；および
ｄ）ポリマーを凝固させ、分散した安定化FSH製剤を含むポリマーマトリックスを形成する工程、
を含む、FSHの持続放出用組成物の製造方法。
ａ）ポリマー／安定化FSH製剤混合物の液滴を形成する工程；
ｂ）ポリマー／安定化FSH製剤混合物の液滴を凍結させる工程
をさらに含み、該形成および凍結の工程が溶媒の除去の前に行われる請求項１２１記載の方法。
溶媒が抽出溶媒を用いた抽出により除去される請求項１２１記載の方法。
液滴が微小液滴である請求項１２１記載の方法。
抽出溶媒がエタノールである請求項１２１記載の方法。
持続放出組成物が微粒子の形態である請求項１２１記載の方法。
ａ）約５kD〜約40kDの分子量を有するポリ（ラクチド-コ-グリコリド）コポリマーをポリマー溶媒に溶解させ、ポリマー溶液を形成する工程；
ｂ）安定化FSH製剤を添加し、ポリマー／安定化FSH製剤を含有する混合物を達成する工程；および
ｃ）ポリマー／安定化FSH混合物から溶媒を除去し、それによりそこに分散した固体FSHを含むポリマーマトリックスを形成させる工程、
を含む方法により調製されたFSHの持続放出用組成物。
ａ）ポリマー／安定化FSH製剤混合物の液滴を形成する工程；
ｂ）ポリマー／安定化FSH製剤混合物の液滴を凍結させる工程
をさらに含み、該形成および凍結の工程が溶媒の除去の前に行われる請求項１２７記載の組成物。
溶媒が抽出溶媒を用いた抽出により除去される請求項１２７記載の組成物。
液滴が微小液滴である請求項１２９記載の組成物。
抽出溶媒がエタノールである請求項１２７記載の組成物。
微粒子の形態である請求項１２７記載の組成物。