JP2004536599A - テロメア長の決定方法 - Google Patents
テロメア長の決定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004536599A JP2004536599A JP2003507308A JP2003507308A JP2004536599A JP 2004536599 A JP2004536599 A JP 2004536599A JP 2003507308 A JP2003507308 A JP 2003507308A JP 2003507308 A JP2003507308 A JP 2003507308A JP 2004536599 A JP2004536599 A JP 2004536599A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- telomere
- primer
- dna
- sequence
- terrorette
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 title claims abstract description 261
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 title claims abstract description 257
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 title claims abstract description 230
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 107
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 90
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 29
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 20
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 108091081400 Subtelomere Proteins 0.000 claims description 9
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940124650 anti-cancer therapies Drugs 0.000 claims description 3
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 claims description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 3
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 claims description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 74
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 52
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000002585 base Substances 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 101000775498 Homo sapiens Adenylate cyclase type 10 Proteins 0.000 description 3
- 101000843809 Homo sapiens Hydroxycarboxylic acid receptor 2 Proteins 0.000 description 3
- 101001057159 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C3 Proteins 0.000 description 3
- 102100027248 Melanoma-associated antigen C3 Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282405 Pongo abelii Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 2
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 2
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000032677 cell aging Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000037051 Chromosomal Instability Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940123582 Telomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000033781 Thyroid carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000003793 centrosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001540 depurinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000005014 ectopic expression Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 238000002789 length control Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005312 nonlinear dynamic Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000003277 telomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 208000013077 thyroid gland carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
哺乳動物の染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するための方法であって、
（ａ）一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「テロレット」と称する）の３’末端を、Ｇに富んだ側のテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を有する）から形成されるテロメアの一本鎖オーバーハングにアニールし、前記テロレットをＣに富んだ側のテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列を有する）の５’末端と共有結合させることによってライゲーション産物を生成する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成したライゲーション産物を増幅してプライマー伸長産物を生成する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程のプライマー伸長産物の長さを検出する工程とを含む方法を開示する。好ましくは前記（ｂ）工程は、
（ｉ）ＤＮＡのテロメア隣接領域にアニール可能であるが、Ｃに富んだテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）にはアニールしない第１のプライマーと、（ｉｉ）前記（ａ）工程のテロレットの５’末端配列と同じ配列を有する第２のプライマー（以下、「テルテール」プライマーと称する）とを用いて行われ、該増幅反応は、前記第１のプライマーがＣに富んだテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列からなる）とハイブリダイズし、伸長されて第１のプライマー伸長産物を形成するとともに、前記テルテールプライマーが前記第１のプライマーの伸長産物とハイブリダイズし、伸長されて第２のプライマー伸長産物を形成するような条件下で行われる。更に、本方法を行うためのテロレット及びテルテールなどの特定のプライマー、本方法で用いるためのキット、及びテロメア長の決定及びテロメア長に関連した生物学的条件の評価における本方法の使用法を開示する。
（ａ）一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「テロレット」と称する）の３’末端を、Ｇに富んだ側のテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を有する）から形成されるテロメアの一本鎖オーバーハングにアニールし、前記テロレットをＣに富んだ側のテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列を有する）の５’末端と共有結合させることによってライゲーション産物を生成する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成したライゲーション産物を増幅してプライマー伸長産物を生成する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程のプライマー伸長産物の長さを検出する工程とを含む方法を開示する。好ましくは前記（ｂ）工程は、
（ｉ）ＤＮＡのテロメア隣接領域にアニール可能であるが、Ｃに富んだテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）にはアニールしない第１のプライマーと、（ｉｉ）前記（ａ）工程のテロレットの５’末端配列と同じ配列を有する第２のプライマー（以下、「テルテール」プライマーと称する）とを用いて行われ、該増幅反応は、前記第１のプライマーがＣに富んだテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列からなる）とハイブリダイズし、伸長されて第１のプライマー伸長産物を形成するとともに、前記テルテールプライマーが前記第１のプライマーの伸長産物とハイブリダイズし、伸長されて第２のプライマー伸長産物を形成するような条件下で行われる。更に、本方法を行うためのテロレット及びテルテールなどの特定のプライマー、本方法で用いるためのキット、及びテロメア長の決定及びテロメア長に関連した生物学的条件の評価における本方法の使用法を開示する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は哺乳動物のテロメア長の決定、特にヒトのテロメア長の決定のための方法に関するものである。本発明は更に本方法で使用するためのプライマーや他の試薬、ならびにこうしたプライマーや試薬の１以上からなる本方法を行うためのキットに関するものである。
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の端部をキャップするＤＮＡ構造であり、染色体の安定性及び機能の維持において重要である。ヒトのテロメアは例えば２０ｋｂ程度とキロベース単位の塩基から構成され、ＴＴＡＧＧＧのＤＮＡ配列のモチーフがタンデムに繰り返した構造となっている。これらの繰り返しは、グアニンに富んだ鎖が染色体端部へと５’→３’方向に延び、時として５’末端を越えて延出してＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位からなる一本鎖のオーバーハングを形成するように配されている（図１に模式的に示す）。
【０００３】
細胞分裂に際し、染色体の分裂にともなってテロメア配列は端部から失われてゆく。酵素であるテロメラーゼは、末端にＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位を新たに合成し、ＤＮＡを伸長してこれが短くなることを防止することが可能である。この酵素は体細胞では殆どが不活性であるため、体細胞では細胞分裂毎にテロメアは短くなってゆく。テロメア配列が失われていく度合いは、年齢、複製歴や特定の組織でのテロメラーゼ活性に依存している。したがってテロメアの損失は、細胞老化として知られる、生化学的に活性ではあるが細胞分裂は行わない状態の誘導との相関が考えられる。
【０００４】
対照的に生殖細胞ではテロメラーゼは活性であり、このため生殖細胞では後継世代にわたってテロメア長は維持される。更にこの酵素は悪性腫瘍細胞やある種の増殖性の体組織の幹細胞でも活性である。
【０００５】
加齢の過程でテロメアＤＮＡが失われる機序としては多くが考えられ、不完全な複製、末端の分解、及びより短いテロメアを有する細胞における不等組換えなどが考えられる。腫瘍が悪性に進行するためには、酵素テロメラーゼが活性化されることによって腫瘍細胞が分裂し続けなければならないことから、細胞老化は腫瘍の防御機構として進化してきた可能性が考えられる。このことは、正常な体細胞では、テロメラーゼが抑制された結果、テロメアＤＮＡが失われるために加齢にともなう老化細胞の蓄積につながっている可能性を示唆するものである。このことは更に、加齢による椎間板の変性（繊維細胞の老化）、アテローマ性動脈硬化（血管内皮細胞の老化）、眼変性（網膜色素上皮細胞の老化）や免疫老化（Ｔ細胞の老化）ならびに創傷の治癒における障害（繊維芽細胞の老化）など、一部の加齢に関係した病態の素因となっている可能性がある。
【０００６】
テロメア長及びテロメラーゼ活性の有無について知ることによって、細胞の複製歴及び増殖能についての情報を得ることも可能である。したがってたかだか１０００個程度の細胞を用いることでテロメア長を決定する、さらには１個のＤＮＡ分子のテロメア長を決定するための正確な方法が求められている。
【０００７】
ゲノムＤＮＡの制限酵素による消化、ならびにプローブを含むＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列へのサザンハイブリダイゼーションによって、すべての染色体の端部から得られる末端制限フラグメント（ＴＲＦ）の平均サイズが同時に明らかとなる。ＴＲＦの分析は、現在、大半の生物のＤＮＡ試料でテロメア長を推定するための方法として選択されている。しかしながらこれらの試験方法は、充分なＤＮＡ（１μｇ）を得るために最低でも２００，０００個の細胞を必要とすること、また一回の試行では全テロメアの平均の長さが求められるだけであり、単一のテロメアの配列内容や長さについての詳細な情報を得ることはできない、といった多くの難点を有するものである。更にこれらの試験方法は、生成する制限フラグメントにテロメア周囲の異なる長さのＤＮＡが含まれることから、ＴＴＡＧＧＧの正確な含量が測定されないために比較的に不正確である。Ｑ−ＦＩＳＨと呼ばれる別の方法では、分裂中期の染色体に対する定量的な（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いている。この方法はＴＲＦ分析と異なり、すべての染色体端部におけるＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列の含量を個別に決定することができるという利点を有するが、得られるのは比較的小さなデータセットのみであり、高品質の中期染色体の調製が必要であることから、この分析法はカルチャー中で効率よく増殖する細胞に限定して用いられる。
【０００８】
米国特許第５，７４１，６７７号明細書は、細胞や組織試料中のテロメアの平均長を測定するための一方法について述べている。この方法では、テロメアの３’末端とオリゴヌクレオチドリンカーとをリンカーがテロメアの３’末端に共有結合するような条件下で接触させる。次いでこのＤＮＡを、例えばオリゴヌクレオチドリンカーと相補的な第１のプライマーと、染色体のサブテロメア領域、すなわち、テロメア配列の５’末端側の染色体部分と相補的な第２のプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。伸長産物を生成する際に第１及び／または第２のプライマーが伸長された量を測定することによって、平均のテロメア長が求められる。
【０００９】
米国特許第５，８３４，１９３号明細書は、テロメア長を測定するための一方法について述べている。この方法では、ゲル電気泳動によって画分化されなかった変性染色体ＤＮＡを、テロメアの繰り返し配列と相補的な配列を有する標識プローブと、プローブがテロメアＤＮＡに特異的にハイブリダイズするような条件下で接触させる。次いで結合したプローブの量を測定し、既知のテロメア長のコントロールとの比較を行う。
【００１０】
いずれの特許明細書も、テロメアの３’末端に非相補的オリゴヌクレオチドリンカーをライゲートさせることについて記載している（図２に模式的に示した）。米国特許第５，８３４，１９３号明細書では、「テロメアの繰り返し配列と異なるリンカー配列であれば任意の二本鎖リンカーの使用が可能である」旨述べている。当該明細書の好ましい一実施形態における開示では、図３に示されるように最初にヌクレアーゼにより末端の平滑化処理を行った後、オリゴヌクレオチドリンカー配列を平滑末端にライゲートする。
【００１１】
ヒトテロメアのタンデム繰り返し配列であるＴＴＡＧＧＧと相同な一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端にライゲートし、その５’末端にＰＣＲなどによる増幅に適したプライマーと同じ配列をライゲートして、このライゲーション産物を増幅することによって、従来の方法よりも少ない数の細胞（２桁程度）を用いてテロメア長を決定することが可能であることが示されている。更に、単一のＤＮＡ分子からの増幅が可能であることからそのテロメア上のＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列の正確な数を決定できる可能性がある（図４に模式的に示した）。
【００１２】
具体的には、３’末端側のオーバーハングを形成するＧに富んだ側のテロメア鎖に、６塩基からなるテロメア繰り返し単位の６つの可能な位置のいずれか１つの位置でアニールするようなオリゴヌクレオチドリンカー（後述する「テロレット」１〜６）を設計することが可能である。これらの特異的な「テロレット」リンカーはテロメアと相同な７塩基の配列と、２０個のヌクレオチドからなる５’末端側の非相補的テール配列を有する。この「テロレット」リンカーの５’末端側テールと同じ配列を有する更なるオリゴヌクレオチドプライマー（「テルテール」）が設計されている。Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端側テールに「テロレット」をライゲートした後、例えばＰＣＲを行うと、テロレットの５’末端側テールの相補的配列を合成しかつテルテールプライマーのアニーリング及びテルテールプライマーからの第２の鎖の合成を促進するテロメア隣接プライマーからの鎖伸長が起きる場合にのみ、特定のテロメア産物が指数関数的に増幅される（図９）。
【００１３】
この方法は、テロメアに隣接するＤＮＡ配列が分かっているならば、任意の染色体のテロメアに適用することができるため有利である。この方法はまた、染色体が３’末端側のオーバーハングを有し、テロメアが２５キロベース以下の大きさであり、かつテロメアの隣接配列が分かっているのであれば、ヒト以外の他の哺乳動物に適用することも可能である。
【００１４】
したがって本発明の一態様に基づけば、哺乳動物の染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するための方法であって、
（ａ）一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「テロレット」と称する）の３’末端を、Ｇに富んだ側のテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を有する）から形成されるテロメアの一本鎖オーバーハングにアニールし、前記テロレットをＣに富んだ側のテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列を有する）の５’末端と共有結合させることによってライゲーション産物を生成する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成したライゲーション産物を増幅してプライマー伸長産物を生成する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程のプライマー伸長産物の長さを検出する工程とを含む方法が提供されるものである。
【００１５】
前記（ａ）工程は、ライゲーションによる共有結合が起きるような条件下で行われることが好ましい。この条件は同じ工程（１回のポット反応）でアニーリングとライゲーションが行われるような条件であることが好ましい。
【００１６】
前記（ｂ）工程は、例えば、
（ｉ）ＤＮＡのテロメア隣接領域にアニール可能であるが、Ｃに富んだテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）にはアニールしない第１のプライマーと、
（ｉｉ）前記（ａ）工程のテロレットの５’末端配列と同じ配列を有する第２のプライマー（以下、「テルテール」プライマーと称する）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが好ましく、
該増幅反応は、前記第１のプライマーがＣに富んだテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列からなる）とハイブリダイズし、伸長されて第１のプライマー伸長産物を形成するとともに、前記テルテールプライマーが前記第１のプライマーの伸長産物とハイブリダイズし、伸長されて第２のプライマー伸長産物を形成するような条件下で行われる。
【００１７】
このテルテールプライマーはそれ自体がテロレット配列全体を含んでいてもよいが、好ましくはテロレット配列の５’末端に固有かつこれと同じ配列を有する短い配列であり、いずれの場合もテロレットと相補的ではない。
【００１８】
本発明の理解を助けるべく以下の記載で使用する用語を下記に定義する。
【００１９】
「プライマー」とは、標的核酸とハイブリダイズ（結合）するように設計されたオリゴヌクレオチドであり、ハイブリダイズした配列がヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの付加によって伸長されることが可能なものを意味する。プライマーは通常、ポリメラーゼやリガーゼの作用によって伸長される。オリゴヌクレオチドプライマーは通常ヌクレオチド８個以上、好ましくは１２〜１５個の長さであるが、ヌクレオチド２０個以上の長さであってもよい。
【００２０】
「サブテロメアＤＮＡ」または「サブテロメア領域」は、「テロメア隣接」ＤＮＡまたは「テロメア隣接」領域と同じ意味で用いられている。これはテロメアＤＮＡ上のタンデムに配されたテロメア繰り返し配列に隣接して位置する（好ましくは繰り返し配列から１００〜５００ｂｐの範囲に位置するが、最大で２０ｋｂの場合もあり、好ましくは最大で１ｋｂまたは２ｋｂの位置である）染色体ＤＮＡを意味する。したがって、上記の第１のプライマーが（増幅後に）テロメアＤＮＡ自体の内部に位置することはない。プライマーの伸長反応は、第１のプライマーがＣに富むテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）を有するのと同じＤＮＡ鎖にアニールするような条件下で行われる。一般にサブテロメアＤＮＡは、しばしばテロメア上に散在する「ミニサテライト」などの異なるクラスの繰り返し要素や変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）テロメア繰り返し配列を含んでいる。
【００２１】
「テロメアＤＮＡ」または「テロメア領域」とは、染色体の末端に位置する染色体ＤＮＡであり、タンデムに反復したヌクレオチド配列からなるものである。ヒトではテロメア領域は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返しとこれに対応した相補的配列から構成される。ヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂは、通常のテロメア繰り返し配列であるＴＴＡＧＧＧの他にも、ＴＧＡＧＧＧ、ＴＣＡＧＧＧ及びＴＴＧＧＧＧなどのテロメア繰り返し配列の変型配列も含んでいる。他の動物種のテロメア領域は、テロメア繰り返し配列及び全体のテロメア長に関して異なっているが、哺乳動物間ではテロメア配列は保存されている。
【００２２】
したがってヒトまたは他の哺乳動物に用いるかによらず同じテロレット及びテルテールプライマーを本発明の方法で使用することが可能である。目的とする動物種の各染色体末端のテロメア隣接配列のみを詳細に分析すればよい。ヒトと同様、他の哺乳類でもこれらの配列でキャラクタライズされているものはほとんどない。チンパンジー、ゴリラ、及びオランウータンにおいてＸｐＹｐテロメア隣接配列が分析されているが、このうちオランウータンでのみＸｐＹｐ配列がテロメアのすぐ近傍に位置していることの根拠が示されている。したがってＸｐＹｐＥｏｒａｎｇ（下記に配列を示す）という特定のプライマーによってオランウータンのＸｐＹｐテロメア長を決定することが可能となる可能性がある。
【００２３】
「プロキシマル」及び「ディスタル」とは当該技術分野における通常の意味を有するものであり、それぞれ染色体の「中心近く」か「末端」かを示すものである。すなわち、ヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂとは最も中心体（染色体の中心）側に位置するヒトテロメアＤＮＡの２ｋｂの部分を示すものであり、逆に末端側２ｋｂとはその染色体の末端に最も近いＤＮＡの部分である。
【００２４】
「テロレット」とは、３’末端にテロメア繰り返し配列（ヒトではＴＴＡＧＧＧ）と相同なヌクレオチド配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを意味するものである。この３’末端は、テロメア配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能とするうえで、特に、例えばＰＣＲを用いる場合の比較的高いライゲーション温度（少なくとも約３５℃）といった使用条件下でのアニーリングを可能とするうえで充分に長く、かつ、後の増幅反応においてテロレット内部の繰り返し配列へのハイブリダイゼーションが防止されるよう、例えば後のＰＣＲにおいてアニーリングが防止されるように充分に短い相同領域を有する必要がある。一般にテロレットはその３’末端において、Ｇに富んだテロメアのオーバーハング（ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列からなる）に対して相補的かつこれにアニールすることが可能な６〜１２個、好ましくは７〜１０個、最も好ましくは８〜９個のヌクレオチド塩基を有する。
【００２５】
テロレットは更にその５’末端において、ヒトのＤＮＡ配列といかなる既知の実質的相同性も有さず、効率的なＰＣＲ増幅が行われるように選択された１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基、最も好ましくは２０塩基の配列を有する。ヒトＤＮＡに対する実質的相同性がある場合、非テロメア生産物がアッセイで生じ、これによって、ライゲーションを行わない場合には指数関数的ＰＣＲ増幅反応が見られないというアッセイの目的が損なわれる。こうした観点から、利用可能なゲノム配列ライブラリに照会することにより潜在的テロレット配列の適当性を判定することが可能である。
【００２６】
したがって本発明の方法で用いる一本鎖オリゴヌクレオチド（テロレット）は上述の２つの米国特許明細書に関して述べた二本鎖のリンカーとは異なるものである。第１に、こうしたテロレットは好ましくは最初の７個の塩基においてテロメア配列（ヒトではＴＴＡＧＧＧ）と相補的な配列を有している。このため、このオリゴヌクレオチドをテロメアの３’末端のオーバーハングにアニールすることが可能であり、テロメア末端に特異性を与えるものである。従来のオリゴヌクレオチドは相補的なものではなかったことからテロメアの３’末端にアニールされることがなくライゲートされるのみであった。更にテロメアに相補的な３’末端の塩基を充分に短く設計することによって、後の増幅（例、ＰＣＲ）反応で用いるアニーリング温度においてテロレットリンカーが鎖の合成を開始できなくすることが好ましい。したがって重要な相違点としては、こうした一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーすなわちテロレットは特定のゲノム構造すなわちテロメアの３’末端を標的として設計されていることである。米国特許第５，８３４，１９３号明細書に述べられる二本鎖リンカーはこうした構造に何らの特異性も有さないために任意のＤＮＡの切断箇所にライゲートすることが可能である。このためこのリンカーが両端にライゲートされたＤＮＡフラグメントが生成することが予想される。こうした分子は同様の（またはより高い）ＰＣＲ効率で増幅されて（特にこうしたフラグメントが実際のテロメア分子よりも短い場合）アッセイにおいて多量の副産物を生ずる。更に、テロメア自体のＤＮＡ切断箇所にこうしたリンカーがライゲートする場合があり、こうした短い分子が選択的に増幅されてこれらの分子を本物のテロメア分子と区別することが不可能となる。
【００２７】
第２に、テロレットリンカーの残りの５’末端の塩基が、ヒトのＤＮＡ配列といかなる既知の実質的相同性をも有さず、かつ、サブテロメアＤＮＡにアニールするように設計されたプライマーまたはテロメアのプロキシマル領域の変異繰り返し配列から開始される第１の鎖の合成が起きる場合にのみＰＣＲ増幅反応において効率的に用いられるように設計された配列を有している点である。（前述の米国特許で提案されているオリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーの代わりに）非相補的なプライマーを使用することにより、（テロメア隣接プライマーから開始される第１の鎖の合成により）リンカーに対して相補的な鎖が形成され、その結果、「非相補的」プライマーがアニールして第２の鎖の合成のプライマーとして機能することが可能となる。これによって反応の特異性が高くなり、テロメア隣接プライミング部位とライゲートされたテロレットの双方を有する分子のみが指数関数的に増幅されることとなる。これは、リンカーが両端にライゲートされたすべてのＤＮＡ分子が指数関数的に増幅される上述の米国特許の方法と比較して対照的である。
【００２８】
サムブルック Ｊ、フリッシュ Ｅ．Ｆ、及びマニアティス Ｔにより述べられる標準的な実験手法を用いて哺乳動物の染色体ＤＮＡを細胞及び組織から抽出することが可能である（Sambrook J, Fritsch E F and Maniatis T in Molecular cloning: A laboratory manual (second edition) page 9.16）。また、アマシャム・ファーマシア社（Amersham Pharmacia）のＢｉｏｔｅｃｈ−Ｎｕｃｌｅｏｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、プロメガ社（Promega）のＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、キアゲン社（Qiagen）のＤＮｅａｓｙ（登録商標）及びカムバイオ社（Cambio）のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することも可能である。
【００２９】
本発明の方法は、ヒト染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するために用いられることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法の前記（ａ）工程では、選択したＤＮＡの抽出の後、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）や、隣接ＤＮＡ分子同士を５’末端側のリン酸基と３’末端側の水酸基との間で前記の反応条件下で連結することが可能な任意のＤＮＡリガーゼなどの適当なリガーゼを用いて、Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端にテロレットをライゲートする。テロレットの３’末端の一般に最大で１２個までの最初の塩基はヒトのテロメア配列であるＴＴＡＧＧＧと相同であるため、これらの塩基はＧに富んだ側のテロメア鎖に必要に応じてアニールされる。
【００３１】
テロレットリンカーの正確な配列は、プライマーがアニールするように設計された、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の内部の位置においてのみ異なり得る。例えば、後述する実施例１の方法では２種類の異なるテロレットが用いられているが、このうちのテロレット２が好ましく、したがって示された結果はテロレット１ではなくテロレット２に関するものとなっている。後述の実施例３及び４に示されるようにこのリンカーの他の変型も考えられる。テロレットの効率は、後述するように一種類の分子の希釈液のポアソン分析によって計算される、ハプロイドのゲノム当たりの増幅可能な分子のパーセンテージとして定義される。効率を高めるため、各テロレットを別個にライゲートし、増幅（例、ＰＣＲによる）に先立ってこれらのライゲーション反応液を加え合わせることが可能である。ＴＴＡＧＧＧのテロメア繰り返し配列の任意の部分にハイブリダイズするように設計された６種類のテロレットの組を使用することが有利である。したがってこのようなテロレットの組の６種類の要素の３’末端の配列としては以下のものが挙げられる：ＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＣＣＣＡ、ＴＣＣＣＡＡ、ＣＣＣＡＡＴ、ＣＣＡＡＴＣ、及びＣＡＡＴＣＣ。ヒト以外の動物種にはこれに対応した配列が用いられる。
【００３２】
テロレットのみを用いたこのライゲーション反応は、テロレットがＣに富んだ側のテロメア鎖の５’末端に特異的にライゲートし、低温で生成する可能性のある他の非特異的ライゲーション産物の生成が防止されるように、３５℃〜３７℃の比較的高いライゲーション温度で行われることが好ましい。ライゲーションの後、温度を例えば１５分間にわたって例えば７０℃に昇温することによってリガーゼ酵素を熱失活させる。
【００３３】
このライゲーション反応及び後の（ＰＣＲ）増幅反応のフィデリティのネガティブコントロールとして、３’末端のオーバーハングを、例えばマング・ビーン・ヌクレアーゼなどの適当なヌクレアーゼによって平滑末端化することが可能である（図７及び図９に示した）。これによりテロメアの５’末端へのテロレットリンカーのライゲーションが防止され、ライゲーション反応が起こるためのテロレットプライマーとテロメアのオーバーハングとの間の塩基の対合条件が示される。
【００３４】
本発明の方法の前記（ｂ）工程では、ライゲーションの後、得られたライゲーション産物をＰＣＲなどにより好ましくはロングレンジＰＣＲ条件を用いて増幅することによって長いテロメアを確実に増幅する（参照、Cheng, "Efficient PCR of Long Targets", New Horizons in Gene Amplification Technology: New Techniques and Applications, San Francisco, Calif. (1994)）。
【００３５】
ＰＣＲ増幅反応を行うには、例えば１２ｑやＸｐ／Ｙｐテロメアなどの特定のテロメアに隣接するＤＮＡにアニールするように設計されているか、あるいはヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂの部分の内部に見られるテロメアの変型繰り返し配列を検出するように設計された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、上述したようにテロレットの５’末端の配列と同じ配列を有する第２のプライマーとしての「テルテール」プライマーとともに使用する。
【００３６】
テロメアの隣接ＤＮＡ内の対立遺伝子特異的なＰＣＲプライマーを用いてテロメアの隣接ＤＮＡ内の配列多型についてヘテロである個体の単一のテロメア対立遺伝子を増幅することも可能である。これはプライマーであるＸｐＹｐ−４１３ＡＴ及びＸｐＹｐ−４２３ＧＣ（下記に配列を示した）を例えば約６５〜６８℃、好ましくは約６６．５℃のアニーリング温度で用いることで行うことが可能である。
【００３７】
これらのプライマーを使用すると、第１のプライマー、すなわちテロメアに隣接するＤＮＡかまたは変型テロメア繰り返し配列にアニールするプライマーから特定のプライマー伸長産物が最初に生成する場合にのみ指数関数的なＰＣＲ増幅反応が見られる。この第１のプライマーからの、ライゲートされたテロメア配列にわたったプライマーの伸長によって、その３’末端に「テルテール」プライマーの配列に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡが形成される。この後、ＰＣＲサイクル反応において、第２の「テルテール」プライマーの相補的な配列へのアニーリング、さらにこれに続くプライマー伸長反応によって、特定のテロメア産物が指数関数的に増幅される。この第２のプライマーすなわち「テルテール」プライマーは、第１のプライマーからの相補鎖が合成されない場合にはアニールできず伸長産物の形成を開始させることもできない。
【００３８】
このＰＣＲ増幅反応は、バーンズによって述べられるような、ロングレンジＰＣＲ条件を用いて行うことが好ましい（Barnes W M, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 912216-2220 (1994)）。この記載は、緩衝剤の使用によってｐＨを維持し、グリセロールなどの共溶媒の使用によって変性温度を限定することによってより低温かつより短時間で変性が起きるようにすることによってサイクル反応の際のＤＮＡの損傷を抑える特定の条件の使用に関する最初の記述である。更に、標準的な熱安定性ポリメラーゼとプルーフリード機能を有するポリメラーゼの混合物の使用によって長鎖のＰＣＲ産物の生成が可能である。ロングレンジＰＣＲは、ヒトの精子にみられるような長いテロメアの増幅を可能とするものであり、すべてのテロメアを確実に増幅することによって、長さの異なるすべてのテロメアの検出を可能とするものである。
【００３９】
更に反応の特異性をできるだけ高める目的で「ホットスタート」及び「タッチダウン」サイクル法のいずれをも用いることが可能である。チョウ等（Chou Q et al, NAR 20 1717-1723 (1992)）によって述べられるように、「ホットスタート」ＰＣＲはミスプライミング産物の生成を抑制し、反応の収率及び整合性を高めるものである。反応の成分は最初の変性工程に先立って物理的に分離されるかもしくは化学的に不活化される。この方法は最初の変性の前に誤ってアニールしたＰＣＲプライマーの鎖の伸長を防止することによって機能すると考えられる。ドン等（Don R H et al, NAR 19 4008 (1991)）によって述べられるように、「タッチダウン」ＰＣＲのプロトコルは反応の特異性を高め、ひいては収率を高めるものである。この方法は、アニーリング温度を高めに設定し、後のサイクルで最終的なアニーリング温度に下げてこの温度で複数のサイクルを行うというサイクル反応を行うものである。このプロトコルでは、ＰＣＲ反応の最初のサイクルにおけるミスプライミングによって生成するノイズ産物よりも特定の産物が優先的に生成すると考えられる。「ホットスタート」法では市販の熱活性化ＤＮＡポリメラーゼや、反応系を加熱するまでの間、反応成分同士を分離するためのワックスビーズを使用することが可能である。また、最初のＰＣＲ変性工程の後で適当な反応成分を加えることも可能である。
【００４０】
ＰＣＲ増幅反応において約６５℃のアニーリング温度でアニーリングが行われるようにするためには、ホットスタートやタッチダウン法は用いないことが好ましい。ＰＣＲ増幅反応の使用が好ましいが、他の増幅法を用いることも可能である。
【００４１】
ＰＣＲ反応の後、ＤＮＡプライマーの伸長産物を、アガロースゲル電気泳動の後に標準的なサザンブロット法やインゲルハイブリダイゼーション法によってゲルからナイロン膜にトランスファーすることによって分離することが可能である。次いで得られたＤＮＡフラグメントを、目的とするテロメアのサブテロメアＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることによって検出する。また、得られたＤＮＡフラグメントは、必要に応じて例えば３２Ｐなどで標識したＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列のプローブとハイブリダイズさせることによって検出することも可能である。
【００４２】
ハイブリダイゼーションの後、標準的なオートラジオグラフィー、ホスホイメージングや蛍光イメージングを用いてハイブリダイズしたフラグメントを検出することが可能である。フラグメントのサイズは１ｋｂラダー（１〜１２ｋｂのサイズレンジ）や２．５ｋｂラダー（２．５〜３５ｋｂのサイズレンジ）などのＤＮＡサイズスタンダードとの比較によって算出する。
【００４３】
ハイブリダイズしたフラグメントのサイズを求めるうえで、ＤＮＡサイズラダーが検出されるように更なるハイブリダイゼーションプローブを加えることが可能である。これは、ホスホイメージングによってＰＣＲ産物とともにＤＮＡサイズラダーが検出されるようにして行う。ホスホイメージングによる検出は、コンピュータによるフラグメントサイズの計算が可能であるという利点を有する。
【００４４】
フラグメントのサイズの計算法は、ＤＮＡサイズマーカーがゲル中を移動した距離をマーカーの分子量に対してプロットするという標準的な実験法である。得られたグラフを用いて目的のフラグメントのサイズを求める。
【００４５】
増幅されるＤＮＡ分子が１種類である場合には、この方法を用いると一本のバンドとして観察されるためにテロメア長の計算が簡単であるが、増幅されるＤＮＡ分子が１種類よりも多い場合にはハイブリダイズしたフラグメントのスメアとなる。これはテロメア長が均一ではなく、平均のテロメア長を中心として異なる値を有するためであるが、これは恐らくテロメアの繰り返し配列がランダムに失われることによるものと考えられる。こうした場合には、スメアの平均テロメア長を計算する。モレキュラーダイナミクス社（Molecular Dynamics）のImageQuantソフトウェアなどの適当なコンピュータソフトウェアを用いることにより、ゲルの各レーンに例えば１×３０列ずつ配されたグリッドによる容量分析を行うことが可能である。
【００４６】
これらのデータをスプレッドシート化してオートラジオグラフを数値化することが可能である。グリッドを更にＤＮＡマーカー上に置き、各分子量マーカーのグリッドにおける位置を求め、データをスプレッドシートに入力して分子サイズのグラフを求める。グリッド上の各位置におけるサイズをこの分子サイズのグラフより計算する。ここでＭＷ＝グリッド位置ｉにおける分子量、ＯＤｉ＝位置ｉにおける容積として、式、ＭＴＬ＝Σ（ＭＷｉ×ＯＤｉ）／Σ（ＯＤｉ）によって平均テロメア長（ＭＴＬ）を計算する。これはＭＴＬを計算するための標準的な方法でありクルック等（Kruk et al, PNAS 92 258-262 (1995)）によって述べられているものであるが、サザンハイブリダイゼーション工程でＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を含むプローブが用いられる場合にはハーレイ等（Harley et al, Nature 345 458-60 (1990)）によって述べられるような、ＭＴＬ＝Σ（ＯＤｉ）／Σ（ＯＤｉ／ＭＷｉ）といった別の式を用いることも可能である。
【００４７】
最終工程では、テロメア隣接ＤＮＡ上のオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング点からテロメア開始点までの距離を、ＭＴＬまたは単一のバンド長から差し引く。これによりテロメア隣接ＤＮＡを除いたテロメア繰り返し配列の量を求めることが可能である。これは、各末端制限フラグメント上に未知量かつ可変量のテロメア隣接ＤＮＡが存在する標準的なテロメア長分析では不可能なことである。
【００４８】
本発明のアッセイの感度は極めて高いことから単一のＤＮＡ分子を増幅してそのテロメア長を求めることが可能である。実際、このアッセイの感度は、１種類よりも多いＤＮＡ分子が増幅される場合には、テロメア長と相関するスメアがほぼ常に得られるというものである。試料を希釈して分析することでアッセイの精度を高めることが可能である。単一の分子が増幅されるようになるまで連続希釈を行うことが可能である。ＤＮＡを含有する試料を希釈、好ましくは連続希釈する。これはライゲーション反応の前に行うか、あるいはライゲーション後の反応混合物自体を希釈してもよい。しかしながらテロメア長の不均一度（平均テロメア長の外側の更なるフラグメント）の詳細な定量化を行う目的でこの方法を用いる場合には、一連のより高度な実験を行う必要がある。これは、既知量のＤＮＡの単一の分子レベルにまでの連続希釈は不正確であり、ライゲーション反応の効率が１００％ではなく各試料間で異なることによるものである。したがって単一分子のテロメア長分析によって試料の定量化及び異なる試料同士の比較が可能であるためには、希釈ＤＮＡ中の増幅可能な分子の数が求められなければならない。これは、ＰＣＲ反応の一部が増幅可能な分子を含まなくなるまでＤＮＡを希釈することによって行うことが可能である。多数のＰＣＲ反応を行って（６０以上）、ポジティブ及びネガティブな反応の数を計数する。次いでポアソン解析を用いることによって最初の試料中の単位量のＤＮＡ当たりの増幅可能な分子の数を求める。これらの実験はジェフリー等によって述べられる、特定の「ミニサテライト」座位に隣接するＤＮＡのＰＣＲにおいて単一分子の増幅効率の定量化を行うための実験に類似したものである（Jeffreys AJ et al, Nature Genetics 6 136-145 (1994)）。
【００４９】
従来のテロメア分析法では約１０５個の集団から平均のテロメア長が求められるだけであり、単一分子のテロメア長を決定することはできない。本発明の方法を用いることにより、単一のテロメアを求めることが可能であり、ひいてはテロメア長の不均一度を完全に求めることも可能である。例えば、標準的なテロメア長の検討において本発明の方法を用いてヒト生殖細胞系の分析を行った場合、テロメア長は１２ｋｂであり、最大で２０ｋｂのテロメア長がゲノムＤＮＡで観察されているが、単一分子の分析では多くのテロメアが１２ｋｂよりも大幅に短いことが示されている。例えば、後述する実施例２でより詳細に述べる研究では、大半のバンドが約１２ｋｂに見出されたが、約２．２ｋｂ、４ｋｂ、及び７ｋｂに更なるバンドが見られた。その長さのテロメアは従来のテロメア長分析法を用いた場合には見られなかったものである。
【００５０】
可能な最小のテロメア長である４０６ｂｐよりも小さい増幅産物は検出されていない（図９）。このことと、この増幅反応の量子的な性質（単一のバンドが同様の強度を有する）とを併せ考えると、この増幅反応は目立ったＰＣＲ産物の生成をともなうことなく高度にテロメア特異的であることが示される。この見方はまた生物学的データによっても裏打ちされるものであり、テロメアの生物学の現在の理解と符合する。各バンドの分子量はゲルから求めることが可能であり、テロメア隣接ＤＮＡ上のＰＣＲプライマーの位置が分かることから、テロメア繰り返し配列の正確な量をテロメアの各バンドについて求めることが可能である。更に、テロメアの変型繰り返し配列のマッピング（ＴＶＲ−ＰＣＲ）（Baird, et al, EMBO J 14 5433-5443 (1995); Coleman, et al, Hum. Mol. Genet. 8 1637-1646 (1999); and Baird, et al Am. J. Hum. Genet. 66 235-250 (2000)）と併せると、各テロメア分子の正確な配列を決定することが可能である。
【００５１】
本アッセイの感度の更なる利点としては、このアッセイによって分析用の試料が極少量しかない場合にもテロメア長の決定が可能であることがある。
【００５２】
本発明の方法では複数の既存及び市販の製品の使用が可能であり、テロメア長の決定を行うためのいずれのキットもすべての反応成分を提供するものである必要は必ずしもない。しかしながら、本発明に基づくアッセイキットの不可欠な要素として、本明細書で定義した「テロレット」及び「テルテール」配列から選択される１以上のオリゴヌクレオチド、好ましくは更に、１以上のテロメア隣接（サブテロメア）染色体特異的プライマー（例、ＸｐＹｐのみについて、及び／または１２ｑ）及び／またはハイブリダイゼーションプローブが挙げられる。
【００５３】
完全なキットでは、更に必要に応じて、リガーゼ、ロングレンジＰＣＲの反応成分、及びこれらの酵素用の各種バッファなどの上記に述べた各種反応成分の１以上を含んでいてもよい（ゲノムＤＮＡの単離に必要な試薬は含まれていなくともよい）。更にキットには必要に応じてＭＴＬの計算を可能とするコンピュータソフトウェア及び／またはスプレッドシートが含まれていてもよい。
【００５４】
テロメア長の検討における用途の他にも、本発明の方法及びキットは、可能性のある抗癌療法の評価や、生検試料の分析などの他の癌関連の処置、または骨髄移植における幹細胞の効果の評価といった、テロメラーゼ阻害剤の効果の測定が重要と考えられる用途で用いることが可能である。本発明の方法及びキットは短いテロメアに偏らず、これを検出可能であることから、短いテロメアの場合に好適である。
【００５５】
本発明は更に本発明の方法で用い、本発明のキットに組み入れるための特定のプライマーを提供するものである。このプライマーとしては以下のものが挙げられる。
XpYp-415GC: 5'-GGTTATCGACCAGGTGCTCC-3',
XpYp-415AT: 5'-GGTTATCAACCAGGTGCTCT-3'
XpYpE: 5'-GCGGTACCTAGGGGTTGTCTCAGGGTCC-3'
12ｑA: 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3'
XpYpEorang: 5'-CTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
XpYpE2: 5'-TTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
XpYpB2: 5'-TCTGAAAGTGGACC(AT)ATCAG-3'
12qB: 5'-ATTTTCATTGCTGTCTTAGCACTGCAC-3'
（ＸｐＹｐＢ２及び１２ｑＢはテロメアから遠ざかる向きであり、それぞれＸｐＹｐＥ／Ｅ２及び１２ｑＡと共に使用して、これらのテロメアに対するテロメア隣接プローブを形成する。）
7qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTTCC-3'
Nitu14eD 5'-CTCTGAGTCAGGAGCGTCTCC-3'
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT-3'
テロレット３: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGGATCCCTAACC-3'
テロレット４: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC-3'
テロレット５: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA-3'
テロレット６: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA-3'
テルテール: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATC-3'
【００５６】
染色体特異的プライマーは、特定の染色体の末端からテロメア隣接ＤＮＡ上にアニールし、合成をプライミングするように設計されたものである。ハイブリダイゼーションプローブは、目的とする染色体のテロメア隣接ＤＮＡに対して特異的であるか、またはＴＴＡＧＧＧのテロメア繰り返し配列に対して特異的である。そのためこれらはテロメア特異的プライマーとも呼ばれる。テロメア特異的プライマーの例としては以下のものが挙げられる。
【００５７】
12qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3' （１２ｑのテロメアを特異的に検出する）
7qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTTCC-3' （７ｑのテロメアを特異的に検出する）
Nitu14ED 5'-CTCTGAGTCAGGAGCGTCTCC-3' （１６ｐ及び１６ｑの特定のコピー上のテロメアを検出する）
【００５８】
上記の記載より、本発明によれば更に本発明の方法における上述のプライマーまたはキットの使用法が提供されることは明らかであろう。また更に下記のものが提供される。
（ａ）可能性のある抗癌療法及び／または他の癌に関連した方法の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｂ）生検試料の分析または骨髄移植における幹細胞の効果の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｃ）加齢にともなうテロメアの動力学の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｄ）テロメラーゼ活性の調節の効果の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｅ）男性の不妊症の評価、治療、または診断に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｆ）上記に実質的に述べたような、本明細書に記載の方法、キット、プライマー、または使用法。
本発明を以下の実施例にもとづいて更に説明する。
【００５９】
実施例１
【００６０】
材料及び方法
ＤＮＡの抽出に用いた材料はすべて分子生物学グレードの試薬（ＤＮアーゼやＲＮアーゼを含まないことを確認したもの）であり、シグマ・アルドリッチ・カンパニー社（Sigma-Aldrich Company Ltd. 英国、ドーセット州、プール所在）から購入した。
【００６１】
ＤＮＡ抽出及び定量化
１．５００μｌの１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．５％ＳＤＳ中で細胞溶解する。
２．プロテイナーゼＫを最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加えた上記の溶液中で５０℃にて一晩消化する。
３．フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）（５００μｌ）で２回抽出、１３，０００ｒｐｍでスピンし、水相を除去する。
４．３００ｍＭの酢酸ナトリウム及び３倍量の１００％エタノールの存在下でエタノール沈澱する（ヘイマン社（Hayman Limited, イーストウェイズパーク、ウィサム、エセックス州 ＣＭ６ ３ＹＥ）より入手した無水アルコールＡ．Ｒ．品質）。
５．１３，０００ｒｐｍで５分間スピンして上清を捨てる。
６．７０％エタノールでＤＮＡペレットを洗浄し、風乾する。
７．ＤＮＡペレットを５０μｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。
８．蛍光測定や他の方法によってＤＮＡ濃度を定量する。
【００６２】
ライゲーション
アマシャム／ファーマシア社（Amersham/Pharmacia）から入手したＴ４ ＤＮＡリガーゼと反応バッファを用い、下記の要領でライゲーション反応を行った。
【００６３】
１．１０ｎｇ以下のゲノムＤＮＡ、製造者のリガーゼ反応バッファ×１、及び０．９μｌのオリゴヌクレオチドリンカーである「テロレット」の１０μＭ溶液を含む５μｌの反応溶液を調製する。
２．標準的な実験用サーマルサイクラーで反応溶液を６０℃に５分間加熱してから３５℃に冷却する。
３．反応溶液が３５℃となった時点で５μｌの次の溶液を各反応に加える（０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む製造者のリガーゼ反応バッファ×１）。
４．反応溶液を６〜１２時間にわたって３５℃でインキュベートし、７０℃で１５分間酵素を加熱して失活させる。
【００６４】
ＰＣＲ増幅反応
市販のロングレンジＰＣＲ反応成分（ここではＡＢＧｅｎｅ社から販売されるＥｘｔｅｎｓｏｒ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキット）を用い、最初の変性後に反応成分を加える「ホットスタート」法によって次のＰＣＲ反応を行った。ロングレンジＰＣＲ反応は、低変性温度を可能とするためのグリセロールなどの添加物、高いｐＨを維持するためのＴｒｉｓ塩基の添加、及びＴａｑポリメラーゼとプルーフリード能を有するポリメラーゼ（例、Ｐｗｏ、Ｐｆｕ及びＶｅｎｔ）との混合物を用いたものであればいずれの市販のシステムを用いたものでもよい。２０μｌのＰＣＲ反応では、
１．ロングレンジ反応バッファ×１（ここではＥｘｔｅｎｓｏｒ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキットのバッファ（このバッファはＭｇＣｌ２を２２．５ｍＭの濃度で含む））を含む最初の反応液を調製する。ＭｇＣｌ２の最終濃度は０．６μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２のストック溶液を加えることによって６ｍＭに調整する。オリゴヌクレオチドプライマーである「テルテール」及び適当なサブテロメアプライマー（この場合、「ＸｐＹｐＥ」（ＸｐＹｐテロメアの分析用）または「１２ｑＡ」（１２ｑテロメアの分析用））を最終濃度が２μＭとなるように混合物に加える。最後に１μｌのライゲーション反応溶液をこの反応混合物に加える。
【００６５】
２．反応混合物を９４℃で１分間熱変性し、８０℃に冷却し、１×反応バッファ１、濃度０．６ｍＭの各ＮＴＰ、及び１単位のＡＢＧｅｎｅ製Ｔａｑ／Ｐｗｏミックスを含み、８０℃に予備加温した混合物１０μｌを加える。
【００６６】
３．したがって各反応成分の最終濃度は以下のとおり：ＭｇＣｌ２＝３ｍＭ、オリゴヌクレオチドプライマー＝１μＭ、ＮＴＰｓ＝０．３ｍＭ。
【００６７】
４．サイクル反応は次のように行う：６８℃で１０分の後、９４℃で１５秒、６８℃で３０秒（１サイクル毎に０．３℃づつ下げる）、及び６８℃で１０分を１０サイクル行う。この後、９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、及び６８℃で１０分間を１４サイクル行う。
【００６８】
ゲル電気泳動／サザンブロッティング
ＰＣＲ反応の産物は以下の要領でアガロースゲル電気泳動で分離した。０．８％のゲルを調製した。ゲルは、長鎖のテロメアが充分に分離するように２０ｃｍ以上の長さであれば理想的である。また、分析を行う組織のテロメア長に応じて、高分子量のＤＮＡフラグメントの分離が可能なゲル電気泳動システムを使用することも可能である。こうしたシステムとしては、フィールドインバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）やパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）が挙げられる。この例ではＤＮＡフラグメントは０．８％アガロースゲル電気泳動及びＦＩＧＥによって分離した。ＦＩＧＥは０．５×ＴＢＥ中で１％アガロース（ＳｅａＫｅｍ（登録商標）Ｇｏｌｄ、エフエムシー・バイオプロダクツ社（FMC Bioproducts,米国メーン州ロックランド所在））を用い、下記のスイッチ条件で行った：０．２〜０．４秒（直線状）順方向電圧１８０、逆方向電圧１２０にて２０時間とし、１６〜１８℃の温度でバッファを再循環させた。フィコールに基づいたゲルローディングバッファをＰＣＲ反応液に加え、２０μｌのＰＣＲ反応液の半分をゲルのウェルにロードした。ＤＮＡサイズマーカーも用いた。電気泳動は７０Ｖで一晩行った（ゲルの長さ１ｃｍ当たり２．５〜３ボルト）。ゲルをエチジウムブロマイド染色し、増幅産物が充分に分離したことを確認した。標準的なサザンブロッティング法によってＤＮＡをゲルからナイロンメンブレンにトランスファーした。この場合、ゲルを０．２５ＭのＨＣｌ中で１０分間洗浄してＤＮＡをまず脱プリン化し、０．５Ｍ ＮａＯＨと１．５Ｍ ＮａＣｌを含むトランスファーバッファ中で１５分間ゲルを洗浄することによって変性を行ってアルカリトランスファーを行った。このＤＮＡを、正に帯電したナイロンメンブレン（この場合、アマシャム／ファーマシア社の製造するＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋）上に最低４時間にわたってキャピラリーブロッティングすることによってトランスファーした。次いでこのメンブレンを１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及びＮａＣｌ５００ｍＭを含む溶液中で２０秒間洗浄して中和を行った。
【００６９】
増幅されたテロメアフラグメントの検出
得られたＤＮＡフラグメントは、目的とするテロメアのサブテロメアＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブ（この場合、ＸｐＹｐテロメアに隣接するＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブ）とのハイブリダイゼーションによって検出した。ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによってフラグメントを検出することも可能である。これらのプローブは、市販のアマシャム／ファーマシア社製Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ ｋｉｔによって与えられるような標準的なランダムヘキサ−プライミング反応によって３２Ｐで標識した。ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ Ｎａ３ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１％ＢＳＡを含む１５ｍｌのバッファ中で一晩、６０℃にて行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを６０℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、洗浄液が検出可能な放射能を示さなくなるまで洗浄した。ハイブリダイズしたフラグメントは標準的なオートラジオグラフィかホスホイメージングによって検出した。
【００７０】
ＰＣＲプライマー配列
２種類のテロレットを使用したが、テロレット２はテロレットよりも約２０倍効率が高く、示した結果はテロレット２のものである。これらのリンカーは最も３’末端側の塩基の設計においてのみ異なっている。
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGOCATCTAACCCT-3'
テルテール: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATC-3'
XpYpE2: 5'-TTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
12qA: 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3'
【００７１】
結果
この分析はＸｐＹｐテロメアに行った。
【００７２】
レーン１〜６はヒト甲状腺癌細胞系（異なる６つのクローン）である。
【００７３】
レーン７〜９は３人の無関係な男性から採取したヒト精子試料である。
【００７４】
ＦＩＧＥゲルのレーン１〜２、４〜５、７〜９についてＭＴＬ分析を行った（レーン３及び６はＦＩＧＥゲルの下部から低分子量のフラグメントが失われたために除外した。これらのフラグメントは０．８％アガロースゲルで確認される。）。ＦＩＧＥゲルの結果を図５に、０．８％アガロースゲルの結果を図８に示す。ＭＴＬ分析の結果は以下のとおり：
【００７５】
レーン１ ３．３０ｋｂ
レーン２ ２．２５ｋｂ
レーン３ ――――――
レーン４ ５．２４ｋｂ
レーン５ ２．０７ｋｂ
レーン６ ――――――
レーン７ １１．２３ｋｂ
レーン８ １２．４２ｋｂ
レーン９ １４．５８ｋｂ
【００７６】
本発明の方法を用いた上の結果（図５）と、従来のＴＲＦ分析を用いた結果（図６）との比較によって本発明の方法は分離能が高く、より鮮明であることが示される。
【００７７】
実施例２−単一分子分析
更に、実施例１で述べたロングレンジＰＣＲの条件を用いてヒト精子から得たＤＮＡからテロメア長を求めることが可能である。ヒト精子のＤＮＡは、人体で見られる最長のテロメアを有している（一般に１０〜１８ｋｂの長さ）。ＰＣＲによるテロメア長の決定法の一例を図７に示した。ここでは、「テロレット」リンカーに４ｎｇ、１ｎｇ、及び２５０ｐｇのＤＮＡがライゲートするように後に詳述する要領でライゲーション工程に先立ってヒト精子から得たＤＮＡを希釈した。後のＰＣＲ反応はこのライゲーション反応液の１／１０、したがって４００ｐｇ、１００ｐｇ、及び２５ｐｇのＤＮＡを含むようにした。これはそれぞれハプロイドゲノムの１３３、３３、および８当量に相当する量である。４ｎｇのライゲーション反応（ＰＣＲ反応では４００ｐｇ）では平均長が１２ｋｂのフラグメントのスメアが認められた。ライゲーション反応液中のＤＮＡ量が減少するのにしたがって、単一のフラグメントが認められるようになった。これらのフラグメントは単一分子から増幅されたテロメアを表すものである。
【００７８】
連続希釈
ライゲーション反応で５００ｎｇのＤＮＡを用いた場合、したがってＰＣＲ反応で５０ｎｇのＤＮＡを用いた場合には、標準的なテロメア長分析から予想されるテロメア長と相関したスメアが得られたが、このスメアには結果の解釈を困難にするような多くの他のバンドが重複して認められた。ＰＣＲの条件（サイクル数）を３２Ｐプローブへのハイブリダイゼーションによる増幅産物の検出と併せると、単一分子が増幅されたことが示される。したがってこの方法はこの量のＤＮＡに対しては感度が高すぎるといえる。付加的なバンドパターンを低減させるべく希釈実験を行ってＤＮＡ量を減らした。一部の反応で単一の増幅産物が認められるようになるまで（一部の反応に増幅産物が含まれなくなるまで）ＤＮＡを連続希釈した。ＤＮＡは、連続希釈し、（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で５倍に希釈）、１０μｌのライゲーション反応液に１００ｎｇのＤＮＡを加え、次いでこの反応液を５倍づつ希釈して２０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、８００ｐｇ／μｌ、１６０ｐｇ／μｌ、３２ｐｇ／μｌ、６．４ｐｇ／μｌ、１．３ｐｇ／μｌの連続希釈液を調製した。ハプロイドのヒトのゲノムの重さは３ｐｇであるので、この連続希釈液の最終希釈液に含まれる分子は１μｌ当たり１個よりも少ないことになる。
【００７９】
これら一連の希釈液のそれぞれに上記の要領でＰＣＲ反応を行って希釈の効果を観察した。希釈の効果は、ＤＮＡ量が多い場合には反応の結果、ハイブリダイズしたフラグメントのスメアが得られるが、低濃度の希釈液ではこのスメアは単一のハイブリダイズバンドに分離して現れるというものである。この効果を図７に見ることができる。この場合、１２ｋｂの生殖細胞のテロメアのスメアが４００ｐｇ／μｌの希釈液で見られ、このスメアは２５ｐｇ／μｌの希釈液では２本のバンドに分かれている。これらの実験は単一分子の増幅が行われたことを示すものである。
【００８０】
したがって本発明の方法は単一分子のレベルでテロメア長を検出するように構成されたものであり、少量の試料から平均のテロメア長を求めるうえで充分である。ヒト生殖細胞の標準的なテロメア長分析の結果、テロメアの長さは１２ｋｂであることが明らかとなった。これに対し単一分子分析によれば、図７に示されるように１２ｋｂよりも大幅に短い多くの更なるテロメアの存在が示された。図中、大半のバンドは１２ｋｂのサイズの周辺に見られ、これらのバンドは４００ｐｇのＰＣＲ反応ではスメアを形成している。しかしながら、約２．２ｋｂ、４ｋｂ、及び７ｋｂ付近に小さなバンドも確認される。この長さのテロメアは従来のテロメア長分析では見られなかったものである。
【００８１】
他の結果
この実験はまた、制限酵素による消化によって可溶化された（これにより正確なＤＮＡ濃度の測定が可能となる）ＤＮＡにおいてテロメアの検出が可能であることを実証するものである。更にこの実験では、ライゲーションに先立ってマング・ビーン・ヌクレアーゼによる処理を行う。この処理はテロメア末端を平滑末端化するものであり、ライゲーション反応を効果的に防止することによってテロレットリンカーの３’鎖に対する塩基対合の必要条件が示されるものである。
【００８２】
実施例３：改変例
（ａ）下記のオリゴヌクレオチドを用い、上記の要領で実施例１及び２の方法を行った。これらのオリゴヌクレオチドは上記の実施例で詳述したようにライゲーション反応液に等モル量で加え、同じ最終濃度とすることが可能である。これらのテロレットは３’末端の７個の塩基を除けば相同である。これら７個の塩基はテロメアの繰り返し配列内の可能な６つの位置をすべて網羅するような相違を有する。
【００８３】
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT-3'
【００８４】
実施例１で使用したもの。この他に以下の更なるテロレットを用いる。
【００８５】
テロレット３: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCTAACC-3'
テロレット４: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC-3'
テロレット５: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA-3'
テロレット６: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA-3'
【００８６】
テロレット２、３及び４は約１０％の同様の効率を有するのに対し、他のテロレットの効率は約０．４３％であることが示された。
【００８７】
（ｂ）別の改変例は、オリゴヌクレオチドとテロメア鎖の５’末端との間のすべてのギャップをＤＮＡポリメラーゼを用いて充填するというものである。この方法では、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠く任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることが可能である。充填反応は、ＤＮＡポリメラーゼ（例、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（アマシャム／ファルマシア社））ならびにｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ（いずれも濃度０．０２ｍＭ（プロメガ社））、をライゲーション反応液自体に添加することによってライゲーション工程で行う（ライゲーションバッファとＤＮＡポリメラーゼがそれぞれ影響を及ぼさないものとして）ことが可能である。
【００８８】
実施例４：単一テロメア長分析（ＳＴＥＬＡ）
【００８９】
材料及び方法
細胞培養
繊維芽細胞株であるＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＷＩ−３８、ＡＧ０８０４９、ＡＧ０８０４８、ＡＧ１１２４１、ＡＧ０７１１９Ａ、ＡＧ１０９３７、及びＡＧ１０９３８をコリエール細胞レポジトリ（Coriell Cell Repository（キャムデン、米国））より入手した。ヒト２倍体繊維芽細胞であるＭＲＣ−５をＥＣＡＣＣ（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セルカルチャーズ（European Collection of Cell Cultures）（ポートンダウン、英国））より入手した。ＨＣＡ２繊維芽細胞、ＨＣＡ２−ｈＴＥＲＴ（Wyllie, F.S. et al.. Nat. Genet. 24, 16-17 (2000)）、ＭＲＣ５ ｈＴＥＲＴ（McSharry, B.P., et al J. Gen. Virol. 82, 855-63 (2001)）、及びＫ１ ヒト甲状腺癌細胞株（Jones, C.J. et al. Exp. Cell Res. 240, 333-339 (1998).）。
【００９０】
細胞はすべて、２×非不可欠アミノ酸、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１×１０５ＩＵ／Ｉのペニシリン、１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを含むＥａｒｌｅ’ｓ塩類を加えたイーグルＭＥＭ培地で培養した。少なくとも２週間の細胞増殖停止期間をもって細胞が分裂老化状態となったことを判定し、ボンド等により述べられるようにＢｒｄＵ標識率が１％未満であることによって確認した（Bond, J.A. et al in Mol. Cell Biol. 19, 3103-3114 (1999)）。
【００９１】
ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ
細胞にトリプシン処理を行ってＰＢＳで洗浄し、ゲノムＤＮＡをプロテイナーゼＫ、ＲＮアーゼＡ、フェノール／クロロフォルムを用いた標準的なプロトコルによって抽出した（Sambrook et al, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CITY (1989)）。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して可溶化し、ヘキスト３３２５８蛍光測定法（バイオラド社（Biorad、ハーキュリーズ、米国））によって定量し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０ｎｇ／μｌにまで希釈した。１０ｎｇ ゲノムＤＮＡ、０．９μＭの本発明のテロレットリンカー（下記参照）、０．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（アマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）リトルシャルフォント、英国）、及び１×の同製造業者によるライゲーションバッファを含んだ１０μｌの反応液中、３５℃にて１２時間、ＤＮＡをライゲートした。
【００９２】
コントロールとして、４０単位のマングビーンヌクレアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）及び１×の同製造業者によるヌクレアーゼバッファを用いて２μｇのゲノムＤＮＡを消化することによって５’末端のオーバーハングを除去したものを用いた。フェノール／クロロフォルムによる抽出後、ＤＮＡをエタノール沈澱し、７０％エタノール中で洗浄してから１０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、ヘキスト３３２５８蛍光測定法（バイオラド社（ハーキュリーズ、米国））によって定量した。
【００９３】
ライゲートしたＤＮＡをＨ２Ｏで２５０ｐｇ／μｌにまで希釈した。１００〜２５０ｐｇのライゲートしたＤＮＡ、０．５μＭの本発明のテロメア隣接プライマー及びテルテールプライマー（下記参照）、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％トウィーン２０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び、１単位のＴａｑポリメラーゼ（ＡｂＧｅｎｅ社、エプソム、英国）とＰｗｏポリメラーゼ（ロシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社、ルイス、英国）の２５：１混合物を含んだ１０μｌの反応液中で、各試験ＤＮＡについて複数回のＰＣＲ（各試料につき９〜１８回の反応）を行った。ＭＪ ＰＴＣ−２２５サーマルサイクラー（ＭＪリサーチ社（MJ Research）、ウォータータウン、米国）を用い、次の条件でサイクル反応をおこなった：９４℃で１５秒、６５℃（ＸｐＹｐＥ２）または６６．５℃（ＸｐＹｐ−４１５ＧＣ／ＡＴ対立遺伝子特異的プライマー）で３０秒、及び６８℃で１０分間を２５サイクル。
【００９４】
０．５％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動によってＤＮＡフラグメントを分離し、ＸｐＹｐＥ２とＸｐＹｐＢ２プライマーの間のＰＣＲ（図９）で作成した３２Ｐ標識（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）テロメア隣接プローブと、３２Ｐ標識（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）した２５ｎｇの１ｋｂ分子量マーカー（ストラタジーン社（Stratagene）ラホーヤ、米国）からなる１ｋｂ分子量マーカー（ストラタジーン社、ラホーヤ、米国）を検出するためのプローブ５００ｐｇを用いたサザンハイブリダイゼーションによってＤＮＡフラグメントを検出した。モレキュラーダイナミクス Ｓｔｏｒｍ８６０ホスホイメージャー（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）を用いたホスホイメージングによってハイブリダイズしたフラグメントを検出した。Ｐｈｏｒｅｔｉｘ１Ｄ定量器（ノンリニアダイナミクス社（Nonlinear Dynamics）タイン州ニューカッスル、英国）を用いてこれらのＤＮＡフラグメントの分子量を計算した。
【００９５】
使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおり。
【００９６】
XpYpE2: 5´- TTGTCTCAGGGTCCTAGTG -3´
XpYpB2: 5´- TCTGAAAGTGGACC(AT)ATCAG -3´
XpYp-415GC: 5´- GGTTATCGACCAGGTGCTCC -3´
XpYp-415AT: 5´- GGTTATCAACCAGGTGCTCT -3´
テロレット１: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC -3´
テロレット２: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT -3´
テロレット３: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCTAACC -3´
テロレット４: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC -3´
テロレット５: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA -3´
テロレット６: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA -3´
テルテール: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATC -3´
【００９７】
結果
要約すると、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで加齢したヒト２倍体繊維芽細胞の分析にＳＴＥＬＡを適用したものである。ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の量に関して最大で８ｋｂと対立遺伝子間で大きな差異が認められたが、この差異はテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）のエクトピック（ｅｃｔｏｐｉｃ）な発現によって解消された。更に注目すべき点として、テロメア長の不均一度が徐々に大きくなっている点と、老化時の最短のテロメア対立遺伝子は個人に固有であり（１．２ｋｂ〜７．４ｋｂ）、テロメア繰り返し配列が事実上存在しないテロメアが含まれる点である。したがってＳＴＥＬＡは、多くの生物学的状況においてテロメア繰り返し配列の動力学の果たす役割の完全な評価を可能とする技術といえる。
【００９８】
表１にＳＴＥＬＡデータをまとめたデータを示した。一次繊維芽細胞については老化の時点のデータのみを示している。ａ．両方の対立遺伝子から得られたＳＴＥＬＡデータは次のとおり。全体の平均値に基づいて分布を割り、分布の商の平均値を計算することによって上方及び下方分布の平均値を計算した。テロメア長の変化は分布の全体の平均値を用いて計算した。ＩＭＲ−９０では老化時の下方分布のデータの大半が失われたようで、下方分布の平均値及びテロメア崩壊速度を正確に決定することが不可能であった。ｂ．表に示した対立遺伝子に固有のＳＴＥＬＡデータは、対立遺伝子に固有のテロメア長の変化を示したものである。
【００９９】
【表１ａ】
【０１００】
【表１ｂ】
【０１０１】
この実施例を以下に図９〜１１に基づいて更に説明する。
【０１０２】
図９は３つの部分からなる。すなわち、ａ．ＸｐＹｐテロメアにおけるＳＴＥＬＡの模式図。ｂ．２個のＫ１クローンのＳＴＥＬＡ分析結果をコントロールとともに示したもの。Ａ及びＢ＝テロレット２をライゲートしたクローン３及び４。Ｃ及びＤ＝無関係なリンカーをライゲートしたクローン３及び４。Ｅ＝リンカーをライゲートさせないクローン３及び４、Ｆ及びＧ＝ヌクレアーゼ処理によって５’末端のオーバーハングを除去し、テロレット２をＤＮＡにライゲートしたクローン３及び４。同じライゲーション反応液を用いた４つのＰＣＲ反応と使用したプライマーを上記に詳しく示した。これらのフラグメントはＸｐＹｐテロメア隣接プローブとのサザンハイブリダイゼーションによって検出した。ｃ．Ｋ１ ＤＮＡの希釈によって示されるＳＴＥＬＡの感度、各反応のＤＮＡ量を下記に詳しく示した。Ａ＝クローン３、Ｂ＝クローン４。
【０１０３】
図１０は３つの部分からなる。ａ．若い一次繊維芽細胞株及び老化した一次繊維芽細胞株に行ったＳＴＥＬＡの結果。ＨＹ＝ＨＣＡ２「若い」ＰＤ２８．５、ＨＳ＝ＨＣＡ２老化ＰＤ６４、ＭＹ＝ＭＲＣ５「若い」ＰＤ２９、ＭＳ＝ＭＲＣ５老化ＰＤ５５、Ｍ＝１ｋｂ ＤＮＡ分子量マーカー（ストラタジーン社、ラホーヤ、米国）、ＴＬ＝第１番目のテロメア反復配列から計算したテロメア長。ｂ．特定の家系に由来する老化一次繊維芽細胞に行ったＳＴＥＬＡの結果。Ａ＝ＡＧ１１２４１（兄弟）、Ｂ＝ＡＧ０８０４９（系図の出発点である個人、男性）、Ｃ＝ＡＧ０１１９Ａ（母）。老化したＭＲＣ５クローン５，３及び７。ｃ．対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ。ｂと同じＤＮＡを使用。ＡはＧＣハプロタイプについてホモである。Ｂ及びＣは、ＧＣ／ＡＴハプロタイプについてヘテロである。老化したＭＲＣ５クローン１及び３。ＭＲＣ５はＧＣ／ＡＴハプロタイプについてヘテロである。パネルｂ及びｃ中の矢印は、それぞれの平均値に標準偏差の３倍を加えた値よりもテロメア長が大きいことを示す。
【０１０４】
図１１は、ＭＲＣ５細胞に行った対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ分析から得られた４つのヒストグラムであり、ＡＴ対立遺伝子についての分布は青、ＧＣ対立遺伝子については赤で示されている。Ｘ軸はキロベースで表したテロメアのサイズ、Ｙ軸は相対比率、テロメアのサイズは１ｋｂ間隔で示した。ａ．ＭＲＣ５「若い」ＰＤ２９、ｂ．ＭＲＣ５老化ＰＤ５５、ｃ．ＭＲＣ５ クローン８老化ＰＤ２４、ｄ．ＭＲＣ５ ｈＴＥＲＴ ＰＤ２００＋。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】５’末端を越えて延出してＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位からなる一本鎖のオーバーハングの模式図。
【図２】テロメアの３’末端に非相補的オリゴヌクレオチドリンカーをライゲートさせる従来技術の模式図。
【図３】本発明の好ましい一実施形態を説明する模式図。
【図４】本発明の好ましい一実施形態を説明する模式図。
【図５】実施例１のＦＩＧＥゲルの結果を示す図。
【図６】従来のＴＲＦ分析を用いた結果を示す図。
【図７】３’末端のオーバーハングを、マング・ビーン・ヌクレアーゼによって平滑末端化した例を示す図。
【図８】実施例１の０．８％アガロースゲルの結果を示す図。
【図９】特定のテロメア産物が指数関数的に増幅されることを示す図。
【図１０】ａ．若い一次繊維芽細胞株及び老化した一次繊維芽細胞株に行ったＳＴＥＬＡの結果を示す図。 ｂ．特定の家系に由来する老化一次繊維芽細胞に行ったＳＴＥＬＡの結果を示す図。 ｃ．対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡを示す図。
【図１１】ＭＲＣ５細胞に行った対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ分析から得られた４つのヒストグラムを示す図。
【０００１】
本発明は哺乳動物のテロメア長の決定、特にヒトのテロメア長の決定のための方法に関するものである。本発明は更に本方法で使用するためのプライマーや他の試薬、ならびにこうしたプライマーや試薬の１以上からなる本方法を行うためのキットに関するものである。
【０００２】
テロメアは真核生物の染色体の端部をキャップするＤＮＡ構造であり、染色体の安定性及び機能の維持において重要である。ヒトのテロメアは例えば２０ｋｂ程度とキロベース単位の塩基から構成され、ＴＴＡＧＧＧのＤＮＡ配列のモチーフがタンデムに繰り返した構造となっている。これらの繰り返しは、グアニンに富んだ鎖が染色体端部へと５’→３’方向に延び、時として５’末端を越えて延出してＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位からなる一本鎖のオーバーハングを形成するように配されている（図１に模式的に示す）。
【０００３】
細胞分裂に際し、染色体の分裂にともなってテロメア配列は端部から失われてゆく。酵素であるテロメラーゼは、末端にＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位を新たに合成し、ＤＮＡを伸長してこれが短くなることを防止することが可能である。この酵素は体細胞では殆どが不活性であるため、体細胞では細胞分裂毎にテロメアは短くなってゆく。テロメア配列が失われていく度合いは、年齢、複製歴や特定の組織でのテロメラーゼ活性に依存している。したがってテロメアの損失は、細胞老化として知られる、生化学的に活性ではあるが細胞分裂は行わない状態の誘導との相関が考えられる。
【０００４】
対照的に生殖細胞ではテロメラーゼは活性であり、このため生殖細胞では後継世代にわたってテロメア長は維持される。更にこの酵素は悪性腫瘍細胞やある種の増殖性の体組織の幹細胞でも活性である。
【０００５】
加齢の過程でテロメアＤＮＡが失われる機序としては多くが考えられ、不完全な複製、末端の分解、及びより短いテロメアを有する細胞における不等組換えなどが考えられる。腫瘍が悪性に進行するためには、酵素テロメラーゼが活性化されることによって腫瘍細胞が分裂し続けなければならないことから、細胞老化は腫瘍の防御機構として進化してきた可能性が考えられる。このことは、正常な体細胞では、テロメラーゼが抑制された結果、テロメアＤＮＡが失われるために加齢にともなう老化細胞の蓄積につながっている可能性を示唆するものである。このことは更に、加齢による椎間板の変性（繊維細胞の老化）、アテローマ性動脈硬化（血管内皮細胞の老化）、眼変性（網膜色素上皮細胞の老化）や免疫老化（Ｔ細胞の老化）ならびに創傷の治癒における障害（繊維芽細胞の老化）など、一部の加齢に関係した病態の素因となっている可能性がある。
【０００６】
テロメア長及びテロメラーゼ活性の有無について知ることによって、細胞の複製歴及び増殖能についての情報を得ることも可能である。したがってたかだか１０００個程度の細胞を用いることでテロメア長を決定する、さらには１個のＤＮＡ分子のテロメア長を決定するための正確な方法が求められている。
【０００７】
ゲノムＤＮＡの制限酵素による消化、ならびにプローブを含むＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列へのサザンハイブリダイゼーションによって、すべての染色体の端部から得られる末端制限フラグメント（ＴＲＦ）の平均サイズが同時に明らかとなる。ＴＲＦの分析は、現在、大半の生物のＤＮＡ試料でテロメア長を推定するための方法として選択されている。しかしながらこれらの試験方法は、充分なＤＮＡ（１μｇ）を得るために最低でも２００，０００個の細胞を必要とすること、また一回の試行では全テロメアの平均の長さが求められるだけであり、単一のテロメアの配列内容や長さについての詳細な情報を得ることはできない、といった多くの難点を有するものである。更にこれらの試験方法は、生成する制限フラグメントにテロメア周囲の異なる長さのＤＮＡが含まれることから、ＴＴＡＧＧＧの正確な含量が測定されないために比較的に不正確である。Ｑ−ＦＩＳＨと呼ばれる別の方法では、分裂中期の染色体に対する定量的な（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いている。この方法はＴＲＦ分析と異なり、すべての染色体端部におけるＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列の含量を個別に決定することができるという利点を有するが、得られるのは比較的小さなデータセットのみであり、高品質の中期染色体の調製が必要であることから、この分析法はカルチャー中で効率よく増殖する細胞に限定して用いられる。
【０００８】
米国特許第５，７４１，６７７号明細書は、細胞や組織試料中のテロメアの平均長を測定するための一方法について述べている。この方法では、テロメアの３’末端とオリゴヌクレオチドリンカーとをリンカーがテロメアの３’末端に共有結合するような条件下で接触させる。次いでこのＤＮＡを、例えばオリゴヌクレオチドリンカーと相補的な第１のプライマーと、染色体のサブテロメア領域、すなわち、テロメア配列の５’末端側の染色体部分と相補的な第２のプライマーとを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。伸長産物を生成する際に第１及び／または第２のプライマーが伸長された量を測定することによって、平均のテロメア長が求められる。
【０００９】
米国特許第５，８３４，１９３号明細書は、テロメア長を測定するための一方法について述べている。この方法では、ゲル電気泳動によって画分化されなかった変性染色体ＤＮＡを、テロメアの繰り返し配列と相補的な配列を有する標識プローブと、プローブがテロメアＤＮＡに特異的にハイブリダイズするような条件下で接触させる。次いで結合したプローブの量を測定し、既知のテロメア長のコントロールとの比較を行う。
【００１０】
いずれの特許明細書も、テロメアの３’末端に非相補的オリゴヌクレオチドリンカーをライゲートさせることについて記載している（図２に模式的に示した）。米国特許第５，８３４，１９３号明細書では、「テロメアの繰り返し配列と異なるリンカー配列であれば任意の二本鎖リンカーの使用が可能である」旨述べている。当該明細書の好ましい一実施形態における開示では、図３に示されるように最初にヌクレアーゼにより末端の平滑化処理を行った後、オリゴヌクレオチドリンカー配列を平滑末端にライゲートする。
【００１１】
ヒトテロメアのタンデム繰り返し配列であるＴＴＡＧＧＧと相同な一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーを、Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端にライゲートし、その５’末端にＰＣＲなどによる増幅に適したプライマーと同じ配列をライゲートして、このライゲーション産物を増幅することによって、従来の方法よりも少ない数の細胞（２桁程度）を用いてテロメア長を決定することが可能であることが示されている。更に、単一のＤＮＡ分子からの増幅が可能であることからそのテロメア上のＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列の正確な数を決定できる可能性がある（図４に模式的に示した）。
【００１２】
具体的には、３’末端側のオーバーハングを形成するＧに富んだ側のテロメア鎖に、６塩基からなるテロメア繰り返し単位の６つの可能な位置のいずれか１つの位置でアニールするようなオリゴヌクレオチドリンカー（後述する「テロレット」１〜６）を設計することが可能である。これらの特異的な「テロレット」リンカーはテロメアと相同な７塩基の配列と、２０個のヌクレオチドからなる５’末端側の非相補的テール配列を有する。この「テロレット」リンカーの５’末端側テールと同じ配列を有する更なるオリゴヌクレオチドプライマー（「テルテール」）が設計されている。Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端側テールに「テロレット」をライゲートした後、例えばＰＣＲを行うと、テロレットの５’末端側テールの相補的配列を合成しかつテルテールプライマーのアニーリング及びテルテールプライマーからの第２の鎖の合成を促進するテロメア隣接プライマーからの鎖伸長が起きる場合にのみ、特定のテロメア産物が指数関数的に増幅される（図９）。
【００１３】
この方法は、テロメアに隣接するＤＮＡ配列が分かっているならば、任意の染色体のテロメアに適用することができるため有利である。この方法はまた、染色体が３’末端側のオーバーハングを有し、テロメアが２５キロベース以下の大きさであり、かつテロメアの隣接配列が分かっているのであれば、ヒト以外の他の哺乳動物に適用することも可能である。
【００１４】
したがって本発明の一態様に基づけば、哺乳動物の染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するための方法であって、
（ａ）一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「テロレット」と称する）の３’末端を、Ｇに富んだ側のテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を有する）から形成されるテロメアの一本鎖オーバーハングにアニールし、前記テロレットをＣに富んだ側のテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列を有する）の５’末端と共有結合させることによってライゲーション産物を生成する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成したライゲーション産物を増幅してプライマー伸長産物を生成する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程のプライマー伸長産物の長さを検出する工程とを含む方法が提供されるものである。
【００１５】
前記（ａ）工程は、ライゲーションによる共有結合が起きるような条件下で行われることが好ましい。この条件は同じ工程（１回のポット反応）でアニーリングとライゲーションが行われるような条件であることが好ましい。
【００１６】
前記（ｂ）工程は、例えば、
（ｉ）ＤＮＡのテロメア隣接領域にアニール可能であるが、Ｃに富んだテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）にはアニールしない第１のプライマーと、
（ｉｉ）前記（ａ）工程のテロレットの５’末端配列と同じ配列を有する第２のプライマー（以下、「テルテール」プライマーと称する）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われることが好ましく、
該増幅反応は、前記第１のプライマーがＣに富んだテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列からなる）とハイブリダイズし、伸長されて第１のプライマー伸長産物を形成するとともに、前記テルテールプライマーが前記第１のプライマーの伸長産物とハイブリダイズし、伸長されて第２のプライマー伸長産物を形成するような条件下で行われる。
【００１７】
このテルテールプライマーはそれ自体がテロレット配列全体を含んでいてもよいが、好ましくはテロレット配列の５’末端に固有かつこれと同じ配列を有する短い配列であり、いずれの場合もテロレットと相補的ではない。
【００１８】
本発明の理解を助けるべく以下の記載で使用する用語を下記に定義する。
【００１９】
「プライマー」とは、標的核酸とハイブリダイズ（結合）するように設計されたオリゴヌクレオチドであり、ハイブリダイズした配列がヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの付加によって伸長されることが可能なものを意味する。プライマーは通常、ポリメラーゼやリガーゼの作用によって伸長される。オリゴヌクレオチドプライマーは通常ヌクレオチド８個以上、好ましくは１２〜１５個の長さであるが、ヌクレオチド２０個以上の長さであってもよい。
【００２０】
「サブテロメアＤＮＡ」または「サブテロメア領域」は、「テロメア隣接」ＤＮＡまたは「テロメア隣接」領域と同じ意味で用いられている。これはテロメアＤＮＡ上のタンデムに配されたテロメア繰り返し配列に隣接して位置する（好ましくは繰り返し配列から１００〜５００ｂｐの範囲に位置するが、最大で２０ｋｂの場合もあり、好ましくは最大で１ｋｂまたは２ｋｂの位置である）染色体ＤＮＡを意味する。したがって、上記の第１のプライマーが（増幅後に）テロメアＤＮＡ自体の内部に位置することはない。プライマーの伸長反応は、第１のプライマーがＣに富むテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）を有するのと同じＤＮＡ鎖にアニールするような条件下で行われる。一般にサブテロメアＤＮＡは、しばしばテロメア上に散在する「ミニサテライト」などの異なるクラスの繰り返し要素や変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）テロメア繰り返し配列を含んでいる。
【００２１】
「テロメアＤＮＡ」または「テロメア領域」とは、染色体の末端に位置する染色体ＤＮＡであり、タンデムに反復したヌクレオチド配列からなるものである。ヒトではテロメア領域は５’−ＴＴＡＧＧＧ−３’の繰り返しとこれに対応した相補的配列から構成される。ヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂは、通常のテロメア繰り返し配列であるＴＴＡＧＧＧの他にも、ＴＧＡＧＧＧ、ＴＣＡＧＧＧ及びＴＴＧＧＧＧなどのテロメア繰り返し配列の変型配列も含んでいる。他の動物種のテロメア領域は、テロメア繰り返し配列及び全体のテロメア長に関して異なっているが、哺乳動物間ではテロメア配列は保存されている。
【００２２】
したがってヒトまたは他の哺乳動物に用いるかによらず同じテロレット及びテルテールプライマーを本発明の方法で使用することが可能である。目的とする動物種の各染色体末端のテロメア隣接配列のみを詳細に分析すればよい。ヒトと同様、他の哺乳類でもこれらの配列でキャラクタライズされているものはほとんどない。チンパンジー、ゴリラ、及びオランウータンにおいてＸｐＹｐテロメア隣接配列が分析されているが、このうちオランウータンでのみＸｐＹｐ配列がテロメアのすぐ近傍に位置していることの根拠が示されている。したがってＸｐＹｐＥｏｒａｎｇ（下記に配列を示す）という特定のプライマーによってオランウータンのＸｐＹｐテロメア長を決定することが可能となる可能性がある。
【００２３】
「プロキシマル」及び「ディスタル」とは当該技術分野における通常の意味を有するものであり、それぞれ染色体の「中心近く」か「末端」かを示すものである。すなわち、ヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂとは最も中心体（染色体の中心）側に位置するヒトテロメアＤＮＡの２ｋｂの部分を示すものであり、逆に末端側２ｋｂとはその染色体の末端に最も近いＤＮＡの部分である。
【００２４】
「テロレット」とは、３’末端にテロメア繰り返し配列（ヒトではＴＴＡＧＧＧ）と相同なヌクレオチド配列を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドを意味するものである。この３’末端は、テロメア配列への特異的ハイブリダイゼーションを可能とするうえで、特に、例えばＰＣＲを用いる場合の比較的高いライゲーション温度（少なくとも約３５℃）といった使用条件下でのアニーリングを可能とするうえで充分に長く、かつ、後の増幅反応においてテロレット内部の繰り返し配列へのハイブリダイゼーションが防止されるよう、例えば後のＰＣＲにおいてアニーリングが防止されるように充分に短い相同領域を有する必要がある。一般にテロレットはその３’末端において、Ｇに富んだテロメアのオーバーハング（ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列からなる）に対して相補的かつこれにアニールすることが可能な６〜１２個、好ましくは７〜１０個、最も好ましくは８〜９個のヌクレオチド塩基を有する。
【００２５】
テロレットは更にその５’末端において、ヒトのＤＮＡ配列といかなる既知の実質的相同性も有さず、効率的なＰＣＲ増幅が行われるように選択された１５〜３０塩基、好ましくは１８〜２２塩基、最も好ましくは２０塩基の配列を有する。ヒトＤＮＡに対する実質的相同性がある場合、非テロメア生産物がアッセイで生じ、これによって、ライゲーションを行わない場合には指数関数的ＰＣＲ増幅反応が見られないというアッセイの目的が損なわれる。こうした観点から、利用可能なゲノム配列ライブラリに照会することにより潜在的テロレット配列の適当性を判定することが可能である。
【００２６】
したがって本発明の方法で用いる一本鎖オリゴヌクレオチド（テロレット）は上述の２つの米国特許明細書に関して述べた二本鎖のリンカーとは異なるものである。第１に、こうしたテロレットは好ましくは最初の７個の塩基においてテロメア配列（ヒトではＴＴＡＧＧＧ）と相補的な配列を有している。このため、このオリゴヌクレオチドをテロメアの３’末端のオーバーハングにアニールすることが可能であり、テロメア末端に特異性を与えるものである。従来のオリゴヌクレオチドは相補的なものではなかったことからテロメアの３’末端にアニールされることがなくライゲートされるのみであった。更にテロメアに相補的な３’末端の塩基を充分に短く設計することによって、後の増幅（例、ＰＣＲ）反応で用いるアニーリング温度においてテロレットリンカーが鎖の合成を開始できなくすることが好ましい。したがって重要な相違点としては、こうした一本鎖オリゴヌクレオチドリンカーすなわちテロレットは特定のゲノム構造すなわちテロメアの３’末端を標的として設計されていることである。米国特許第５，８３４，１９３号明細書に述べられる二本鎖リンカーはこうした構造に何らの特異性も有さないために任意のＤＮＡの切断箇所にライゲートすることが可能である。このためこのリンカーが両端にライゲートされたＤＮＡフラグメントが生成することが予想される。こうした分子は同様の（またはより高い）ＰＣＲ効率で増幅されて（特にこうしたフラグメントが実際のテロメア分子よりも短い場合）アッセイにおいて多量の副産物を生ずる。更に、テロメア自体のＤＮＡ切断箇所にこうしたリンカーがライゲートする場合があり、こうした短い分子が選択的に増幅されてこれらの分子を本物のテロメア分子と区別することが不可能となる。
【００２７】
第２に、テロレットリンカーの残りの５’末端の塩基が、ヒトのＤＮＡ配列といかなる既知の実質的相同性をも有さず、かつ、サブテロメアＤＮＡにアニールするように設計されたプライマーまたはテロメアのプロキシマル領域の変異繰り返し配列から開始される第１の鎖の合成が起きる場合にのみＰＣＲ増幅反応において効率的に用いられるように設計された配列を有している点である。（前述の米国特許で提案されているオリゴヌクレオチドリンカーに相補的なプライマーの代わりに）非相補的なプライマーを使用することにより、（テロメア隣接プライマーから開始される第１の鎖の合成により）リンカーに対して相補的な鎖が形成され、その結果、「非相補的」プライマーがアニールして第２の鎖の合成のプライマーとして機能することが可能となる。これによって反応の特異性が高くなり、テロメア隣接プライミング部位とライゲートされたテロレットの双方を有する分子のみが指数関数的に増幅されることとなる。これは、リンカーが両端にライゲートされたすべてのＤＮＡ分子が指数関数的に増幅される上述の米国特許の方法と比較して対照的である。
【００２８】
サムブルック Ｊ、フリッシュ Ｅ．Ｆ、及びマニアティス Ｔにより述べられる標準的な実験手法を用いて哺乳動物の染色体ＤＮＡを細胞及び組織から抽出することが可能である（Sambrook J, Fritsch E F and Maniatis T in Molecular cloning: A laboratory manual (second edition) page 9.16）。また、アマシャム・ファーマシア社（Amersham Pharmacia）のＢｉｏｔｅｃｈ−Ｎｕｃｌｅｏｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、プロメガ社（Promega）のＷｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、キアゲン社（Qiagen）のＤＮｅａｓｙ（登録商標）及びカムバイオ社（Cambio）のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）などの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することも可能である。
【００２９】
本発明の方法は、ヒト染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するために用いられることが好ましい。
【００３０】
本発明の方法の前記（ａ）工程では、選択したＤＮＡの抽出の後、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）や、隣接ＤＮＡ分子同士を５’末端側のリン酸基と３’末端側の水酸基との間で前記の反応条件下で連結することが可能な任意のＤＮＡリガーゼなどの適当なリガーゼを用いて、Ｃに富んだ側のテロメア鎖の５’末端にテロレットをライゲートする。テロレットの３’末端の一般に最大で１２個までの最初の塩基はヒトのテロメア配列であるＴＴＡＧＧＧと相同であるため、これらの塩基はＧに富んだ側のテロメア鎖に必要に応じてアニールされる。
【００３１】
テロレットリンカーの正確な配列は、プライマーがアニールするように設計された、ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の内部の位置においてのみ異なり得る。例えば、後述する実施例１の方法では２種類の異なるテロレットが用いられているが、このうちのテロレット２が好ましく、したがって示された結果はテロレット１ではなくテロレット２に関するものとなっている。後述の実施例３及び４に示されるようにこのリンカーの他の変型も考えられる。テロレットの効率は、後述するように一種類の分子の希釈液のポアソン分析によって計算される、ハプロイドのゲノム当たりの増幅可能な分子のパーセンテージとして定義される。効率を高めるため、各テロレットを別個にライゲートし、増幅（例、ＰＣＲによる）に先立ってこれらのライゲーション反応液を加え合わせることが可能である。ＴＴＡＧＧＧのテロメア繰り返し配列の任意の部分にハイブリダイズするように設計された６種類のテロレットの組を使用することが有利である。したがってこのようなテロレットの組の６種類の要素の３’末端の配列としては以下のものが挙げられる：ＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＣＣＣＡ、ＴＣＣＣＡＡ、ＣＣＣＡＡＴ、ＣＣＡＡＴＣ、及びＣＡＡＴＣＣ。ヒト以外の動物種にはこれに対応した配列が用いられる。
【００３２】
テロレットのみを用いたこのライゲーション反応は、テロレットがＣに富んだ側のテロメア鎖の５’末端に特異的にライゲートし、低温で生成する可能性のある他の非特異的ライゲーション産物の生成が防止されるように、３５℃〜３７℃の比較的高いライゲーション温度で行われることが好ましい。ライゲーションの後、温度を例えば１５分間にわたって例えば７０℃に昇温することによってリガーゼ酵素を熱失活させる。
【００３３】
このライゲーション反応及び後の（ＰＣＲ）増幅反応のフィデリティのネガティブコントロールとして、３’末端のオーバーハングを、例えばマング・ビーン・ヌクレアーゼなどの適当なヌクレアーゼによって平滑末端化することが可能である（図７及び図９に示した）。これによりテロメアの５’末端へのテロレットリンカーのライゲーションが防止され、ライゲーション反応が起こるためのテロレットプライマーとテロメアのオーバーハングとの間の塩基の対合条件が示される。
【００３４】
本発明の方法の前記（ｂ）工程では、ライゲーションの後、得られたライゲーション産物をＰＣＲなどにより好ましくはロングレンジＰＣＲ条件を用いて増幅することによって長いテロメアを確実に増幅する（参照、Cheng, "Efficient PCR of Long Targets", New Horizons in Gene Amplification Technology: New Techniques and Applications, San Francisco, Calif. (1994)）。
【００３５】
ＰＣＲ増幅反応を行うには、例えば１２ｑやＸｐ／Ｙｐテロメアなどの特定のテロメアに隣接するＤＮＡにアニールするように設計されているか、あるいはヒトテロメアのプロキシマルの２ｋｂの部分の内部に見られるテロメアの変型繰り返し配列を検出するように設計された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、上述したようにテロレットの５’末端の配列と同じ配列を有する第２のプライマーとしての「テルテール」プライマーとともに使用する。
【００３６】
テロメアの隣接ＤＮＡ内の対立遺伝子特異的なＰＣＲプライマーを用いてテロメアの隣接ＤＮＡ内の配列多型についてヘテロである個体の単一のテロメア対立遺伝子を増幅することも可能である。これはプライマーであるＸｐＹｐ−４１３ＡＴ及びＸｐＹｐ−４２３ＧＣ（下記に配列を示した）を例えば約６５〜６８℃、好ましくは約６６．５℃のアニーリング温度で用いることで行うことが可能である。
【００３７】
これらのプライマーを使用すると、第１のプライマー、すなわちテロメアに隣接するＤＮＡかまたは変型テロメア繰り返し配列にアニールするプライマーから特定のプライマー伸長産物が最初に生成する場合にのみ指数関数的なＰＣＲ増幅反応が見られる。この第１のプライマーからの、ライゲートされたテロメア配列にわたったプライマーの伸長によって、その３’末端に「テルテール」プライマーの配列に相補的な配列を有する一本鎖ＤＮＡが形成される。この後、ＰＣＲサイクル反応において、第２の「テルテール」プライマーの相補的な配列へのアニーリング、さらにこれに続くプライマー伸長反応によって、特定のテロメア産物が指数関数的に増幅される。この第２のプライマーすなわち「テルテール」プライマーは、第１のプライマーからの相補鎖が合成されない場合にはアニールできず伸長産物の形成を開始させることもできない。
【００３８】
このＰＣＲ増幅反応は、バーンズによって述べられるような、ロングレンジＰＣＲ条件を用いて行うことが好ましい（Barnes W M, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 912216-2220 (1994)）。この記載は、緩衝剤の使用によってｐＨを維持し、グリセロールなどの共溶媒の使用によって変性温度を限定することによってより低温かつより短時間で変性が起きるようにすることによってサイクル反応の際のＤＮＡの損傷を抑える特定の条件の使用に関する最初の記述である。更に、標準的な熱安定性ポリメラーゼとプルーフリード機能を有するポリメラーゼの混合物の使用によって長鎖のＰＣＲ産物の生成が可能である。ロングレンジＰＣＲは、ヒトの精子にみられるような長いテロメアの増幅を可能とするものであり、すべてのテロメアを確実に増幅することによって、長さの異なるすべてのテロメアの検出を可能とするものである。
【００３９】
更に反応の特異性をできるだけ高める目的で「ホットスタート」及び「タッチダウン」サイクル法のいずれをも用いることが可能である。チョウ等（Chou Q et al, NAR 20 1717-1723 (1992)）によって述べられるように、「ホットスタート」ＰＣＲはミスプライミング産物の生成を抑制し、反応の収率及び整合性を高めるものである。反応の成分は最初の変性工程に先立って物理的に分離されるかもしくは化学的に不活化される。この方法は最初の変性の前に誤ってアニールしたＰＣＲプライマーの鎖の伸長を防止することによって機能すると考えられる。ドン等（Don R H et al, NAR 19 4008 (1991)）によって述べられるように、「タッチダウン」ＰＣＲのプロトコルは反応の特異性を高め、ひいては収率を高めるものである。この方法は、アニーリング温度を高めに設定し、後のサイクルで最終的なアニーリング温度に下げてこの温度で複数のサイクルを行うというサイクル反応を行うものである。このプロトコルでは、ＰＣＲ反応の最初のサイクルにおけるミスプライミングによって生成するノイズ産物よりも特定の産物が優先的に生成すると考えられる。「ホットスタート」法では市販の熱活性化ＤＮＡポリメラーゼや、反応系を加熱するまでの間、反応成分同士を分離するためのワックスビーズを使用することが可能である。また、最初のＰＣＲ変性工程の後で適当な反応成分を加えることも可能である。
【００４０】
ＰＣＲ増幅反応において約６５℃のアニーリング温度でアニーリングが行われるようにするためには、ホットスタートやタッチダウン法は用いないことが好ましい。ＰＣＲ増幅反応の使用が好ましいが、他の増幅法を用いることも可能である。
【００４１】
ＰＣＲ反応の後、ＤＮＡプライマーの伸長産物を、アガロースゲル電気泳動の後に標準的なサザンブロット法やインゲルハイブリダイゼーション法によってゲルからナイロン膜にトランスファーすることによって分離することが可能である。次いで得られたＤＮＡフラグメントを、目的とするテロメアのサブテロメアＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることによって検出する。また、得られたＤＮＡフラグメントは、必要に応じて例えば３２Ｐなどで標識したＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列のプローブとハイブリダイズさせることによって検出することも可能である。
【００４２】
ハイブリダイゼーションの後、標準的なオートラジオグラフィー、ホスホイメージングや蛍光イメージングを用いてハイブリダイズしたフラグメントを検出することが可能である。フラグメントのサイズは１ｋｂラダー（１〜１２ｋｂのサイズレンジ）や２．５ｋｂラダー（２．５〜３５ｋｂのサイズレンジ）などのＤＮＡサイズスタンダードとの比較によって算出する。
【００４３】
ハイブリダイズしたフラグメントのサイズを求めるうえで、ＤＮＡサイズラダーが検出されるように更なるハイブリダイゼーションプローブを加えることが可能である。これは、ホスホイメージングによってＰＣＲ産物とともにＤＮＡサイズラダーが検出されるようにして行う。ホスホイメージングによる検出は、コンピュータによるフラグメントサイズの計算が可能であるという利点を有する。
【００４４】
フラグメントのサイズの計算法は、ＤＮＡサイズマーカーがゲル中を移動した距離をマーカーの分子量に対してプロットするという標準的な実験法である。得られたグラフを用いて目的のフラグメントのサイズを求める。
【００４５】
増幅されるＤＮＡ分子が１種類である場合には、この方法を用いると一本のバンドとして観察されるためにテロメア長の計算が簡単であるが、増幅されるＤＮＡ分子が１種類よりも多い場合にはハイブリダイズしたフラグメントのスメアとなる。これはテロメア長が均一ではなく、平均のテロメア長を中心として異なる値を有するためであるが、これは恐らくテロメアの繰り返し配列がランダムに失われることによるものと考えられる。こうした場合には、スメアの平均テロメア長を計算する。モレキュラーダイナミクス社（Molecular Dynamics）のImageQuantソフトウェアなどの適当なコンピュータソフトウェアを用いることにより、ゲルの各レーンに例えば１×３０列ずつ配されたグリッドによる容量分析を行うことが可能である。
【００４６】
これらのデータをスプレッドシート化してオートラジオグラフを数値化することが可能である。グリッドを更にＤＮＡマーカー上に置き、各分子量マーカーのグリッドにおける位置を求め、データをスプレッドシートに入力して分子サイズのグラフを求める。グリッド上の各位置におけるサイズをこの分子サイズのグラフより計算する。ここでＭＷ＝グリッド位置ｉにおける分子量、ＯＤｉ＝位置ｉにおける容積として、式、ＭＴＬ＝Σ（ＭＷｉ×ＯＤｉ）／Σ（ＯＤｉ）によって平均テロメア長（ＭＴＬ）を計算する。これはＭＴＬを計算するための標準的な方法でありクルック等（Kruk et al, PNAS 92 258-262 (1995)）によって述べられているものであるが、サザンハイブリダイゼーション工程でＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を含むプローブが用いられる場合にはハーレイ等（Harley et al, Nature 345 458-60 (1990)）によって述べられるような、ＭＴＬ＝Σ（ＯＤｉ）／Σ（ＯＤｉ／ＭＷｉ）といった別の式を用いることも可能である。
【００４７】
最終工程では、テロメア隣接ＤＮＡ上のオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング点からテロメア開始点までの距離を、ＭＴＬまたは単一のバンド長から差し引く。これによりテロメア隣接ＤＮＡを除いたテロメア繰り返し配列の量を求めることが可能である。これは、各末端制限フラグメント上に未知量かつ可変量のテロメア隣接ＤＮＡが存在する標準的なテロメア長分析では不可能なことである。
【００４８】
本発明のアッセイの感度は極めて高いことから単一のＤＮＡ分子を増幅してそのテロメア長を求めることが可能である。実際、このアッセイの感度は、１種類よりも多いＤＮＡ分子が増幅される場合には、テロメア長と相関するスメアがほぼ常に得られるというものである。試料を希釈して分析することでアッセイの精度を高めることが可能である。単一の分子が増幅されるようになるまで連続希釈を行うことが可能である。ＤＮＡを含有する試料を希釈、好ましくは連続希釈する。これはライゲーション反応の前に行うか、あるいはライゲーション後の反応混合物自体を希釈してもよい。しかしながらテロメア長の不均一度（平均テロメア長の外側の更なるフラグメント）の詳細な定量化を行う目的でこの方法を用いる場合には、一連のより高度な実験を行う必要がある。これは、既知量のＤＮＡの単一の分子レベルにまでの連続希釈は不正確であり、ライゲーション反応の効率が１００％ではなく各試料間で異なることによるものである。したがって単一分子のテロメア長分析によって試料の定量化及び異なる試料同士の比較が可能であるためには、希釈ＤＮＡ中の増幅可能な分子の数が求められなければならない。これは、ＰＣＲ反応の一部が増幅可能な分子を含まなくなるまでＤＮＡを希釈することによって行うことが可能である。多数のＰＣＲ反応を行って（６０以上）、ポジティブ及びネガティブな反応の数を計数する。次いでポアソン解析を用いることによって最初の試料中の単位量のＤＮＡ当たりの増幅可能な分子の数を求める。これらの実験はジェフリー等によって述べられる、特定の「ミニサテライト」座位に隣接するＤＮＡのＰＣＲにおいて単一分子の増幅効率の定量化を行うための実験に類似したものである（Jeffreys AJ et al, Nature Genetics 6 136-145 (1994)）。
【００４９】
従来のテロメア分析法では約１０５個の集団から平均のテロメア長が求められるだけであり、単一分子のテロメア長を決定することはできない。本発明の方法を用いることにより、単一のテロメアを求めることが可能であり、ひいてはテロメア長の不均一度を完全に求めることも可能である。例えば、標準的なテロメア長の検討において本発明の方法を用いてヒト生殖細胞系の分析を行った場合、テロメア長は１２ｋｂであり、最大で２０ｋｂのテロメア長がゲノムＤＮＡで観察されているが、単一分子の分析では多くのテロメアが１２ｋｂよりも大幅に短いことが示されている。例えば、後述する実施例２でより詳細に述べる研究では、大半のバンドが約１２ｋｂに見出されたが、約２．２ｋｂ、４ｋｂ、及び７ｋｂに更なるバンドが見られた。その長さのテロメアは従来のテロメア長分析法を用いた場合には見られなかったものである。
【００５０】
可能な最小のテロメア長である４０６ｂｐよりも小さい増幅産物は検出されていない（図９）。このことと、この増幅反応の量子的な性質（単一のバンドが同様の強度を有する）とを併せ考えると、この増幅反応は目立ったＰＣＲ産物の生成をともなうことなく高度にテロメア特異的であることが示される。この見方はまた生物学的データによっても裏打ちされるものであり、テロメアの生物学の現在の理解と符合する。各バンドの分子量はゲルから求めることが可能であり、テロメア隣接ＤＮＡ上のＰＣＲプライマーの位置が分かることから、テロメア繰り返し配列の正確な量をテロメアの各バンドについて求めることが可能である。更に、テロメアの変型繰り返し配列のマッピング（ＴＶＲ−ＰＣＲ）（Baird, et al, EMBO J 14 5433-5443 (1995); Coleman, et al, Hum. Mol. Genet. 8 1637-1646 (1999); and Baird, et al Am. J. Hum. Genet. 66 235-250 (2000)）と併せると、各テロメア分子の正確な配列を決定することが可能である。
【００５１】
本アッセイの感度の更なる利点としては、このアッセイによって分析用の試料が極少量しかない場合にもテロメア長の決定が可能であることがある。
【００５２】
本発明の方法では複数の既存及び市販の製品の使用が可能であり、テロメア長の決定を行うためのいずれのキットもすべての反応成分を提供するものである必要は必ずしもない。しかしながら、本発明に基づくアッセイキットの不可欠な要素として、本明細書で定義した「テロレット」及び「テルテール」配列から選択される１以上のオリゴヌクレオチド、好ましくは更に、１以上のテロメア隣接（サブテロメア）染色体特異的プライマー（例、ＸｐＹｐのみについて、及び／または１２ｑ）及び／またはハイブリダイゼーションプローブが挙げられる。
【００５３】
完全なキットでは、更に必要に応じて、リガーゼ、ロングレンジＰＣＲの反応成分、及びこれらの酵素用の各種バッファなどの上記に述べた各種反応成分の１以上を含んでいてもよい（ゲノムＤＮＡの単離に必要な試薬は含まれていなくともよい）。更にキットには必要に応じてＭＴＬの計算を可能とするコンピュータソフトウェア及び／またはスプレッドシートが含まれていてもよい。
【００５４】
テロメア長の検討における用途の他にも、本発明の方法及びキットは、可能性のある抗癌療法の評価や、生検試料の分析などの他の癌関連の処置、または骨髄移植における幹細胞の効果の評価といった、テロメラーゼ阻害剤の効果の測定が重要と考えられる用途で用いることが可能である。本発明の方法及びキットは短いテロメアに偏らず、これを検出可能であることから、短いテロメアの場合に好適である。
【００５５】
本発明は更に本発明の方法で用い、本発明のキットに組み入れるための特定のプライマーを提供するものである。このプライマーとしては以下のものが挙げられる。
XpYp-415GC: 5'-GGTTATCGACCAGGTGCTCC-3',
XpYp-415AT: 5'-GGTTATCAACCAGGTGCTCT-3'
XpYpE: 5'-GCGGTACCTAGGGGTTGTCTCAGGGTCC-3'
12ｑA: 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3'
XpYpEorang: 5'-CTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
XpYpE2: 5'-TTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
XpYpB2: 5'-TCTGAAAGTGGACC(AT)ATCAG-3'
12qB: 5'-ATTTTCATTGCTGTCTTAGCACTGCAC-3'
（ＸｐＹｐＢ２及び１２ｑＢはテロメアから遠ざかる向きであり、それぞれＸｐＹｐＥ／Ｅ２及び１２ｑＡと共に使用して、これらのテロメアに対するテロメア隣接プローブを形成する。）
7qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTTCC-3'
Nitu14eD 5'-CTCTGAGTCAGGAGCGTCTCC-3'
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT-3'
テロレット３: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGGATCCCTAACC-3'
テロレット４: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC-3'
テロレット５: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA-3'
テロレット６: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA-3'
テルテール: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATC-3'
【００５６】
染色体特異的プライマーは、特定の染色体の末端からテロメア隣接ＤＮＡ上にアニールし、合成をプライミングするように設計されたものである。ハイブリダイゼーションプローブは、目的とする染色体のテロメア隣接ＤＮＡに対して特異的であるか、またはＴＴＡＧＧＧのテロメア繰り返し配列に対して特異的である。そのためこれらはテロメア特異的プライマーとも呼ばれる。テロメア特異的プライマーの例としては以下のものが挙げられる。
【００５７】
12qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3' （１２ｑのテロメアを特異的に検出する）
7qA 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTTCC-3' （７ｑのテロメアを特異的に検出する）
Nitu14ED 5'-CTCTGAGTCAGGAGCGTCTCC-3' （１６ｐ及び１６ｑの特定のコピー上のテロメアを検出する）
【００５８】
上記の記載より、本発明によれば更に本発明の方法における上述のプライマーまたはキットの使用法が提供されることは明らかであろう。また更に下記のものが提供される。
（ａ）可能性のある抗癌療法及び／または他の癌に関連した方法の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｂ）生検試料の分析または骨髄移植における幹細胞の効果の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｃ）加齢にともなうテロメアの動力学の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｄ）テロメラーゼ活性の調節の効果の評価に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｅ）男性の不妊症の評価、治療、または診断に用いるための本明細書に記載の方法、キット、またはプライマー。
（ｆ）上記に実質的に述べたような、本明細書に記載の方法、キット、プライマー、または使用法。
本発明を以下の実施例にもとづいて更に説明する。
【００５９】
実施例１
【００６０】
材料及び方法
ＤＮＡの抽出に用いた材料はすべて分子生物学グレードの試薬（ＤＮアーゼやＲＮアーゼを含まないことを確認したもの）であり、シグマ・アルドリッチ・カンパニー社（Sigma-Aldrich Company Ltd. 英国、ドーセット州、プール所在）から購入した。
【００６１】
ＤＮＡ抽出及び定量化
１．５００μｌの１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び０．５％ＳＤＳ中で細胞溶解する。
２．プロテイナーゼＫを最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加えた上記の溶液中で５０℃にて一晩消化する。
３．フェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）（５００μｌ）で２回抽出、１３，０００ｒｐｍでスピンし、水相を除去する。
４．３００ｍＭの酢酸ナトリウム及び３倍量の１００％エタノールの存在下でエタノール沈澱する（ヘイマン社（Hayman Limited, イーストウェイズパーク、ウィサム、エセックス州 ＣＭ６ ３ＹＥ）より入手した無水アルコールＡ．Ｒ．品質）。
５．１３，０００ｒｐｍで５分間スピンして上清を捨てる。
６．７０％エタノールでＤＮＡペレットを洗浄し、風乾する。
７．ＤＮＡペレットを５０μｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。
８．蛍光測定や他の方法によってＤＮＡ濃度を定量する。
【００６２】
ライゲーション
アマシャム／ファーマシア社（Amersham/Pharmacia）から入手したＴ４ ＤＮＡリガーゼと反応バッファを用い、下記の要領でライゲーション反応を行った。
【００６３】
１．１０ｎｇ以下のゲノムＤＮＡ、製造者のリガーゼ反応バッファ×１、及び０．９μｌのオリゴヌクレオチドリンカーである「テロレット」の１０μＭ溶液を含む５μｌの反応溶液を調製する。
２．標準的な実験用サーマルサイクラーで反応溶液を６０℃に５分間加熱してから３５℃に冷却する。
３．反応溶液が３５℃となった時点で５μｌの次の溶液を各反応に加える（０．５単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む製造者のリガーゼ反応バッファ×１）。
４．反応溶液を６〜１２時間にわたって３５℃でインキュベートし、７０℃で１５分間酵素を加熱して失活させる。
【００６４】
ＰＣＲ増幅反応
市販のロングレンジＰＣＲ反応成分（ここではＡＢＧｅｎｅ社から販売されるＥｘｔｅｎｓｏｒ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキット）を用い、最初の変性後に反応成分を加える「ホットスタート」法によって次のＰＣＲ反応を行った。ロングレンジＰＣＲ反応は、低変性温度を可能とするためのグリセロールなどの添加物、高いｐＨを維持するためのＴｒｉｓ塩基の添加、及びＴａｑポリメラーゼとプルーフリード能を有するポリメラーゼ（例、Ｐｗｏ、Ｐｆｕ及びＶｅｎｔ）との混合物を用いたものであればいずれの市販のシステムを用いたものでもよい。２０μｌのＰＣＲ反応では、
１．ロングレンジ反応バッファ×１（ここではＥｘｔｅｎｓｏｒ Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲキットのバッファ（このバッファはＭｇＣｌ２を２２．５ｍＭの濃度で含む））を含む最初の反応液を調製する。ＭｇＣｌ２の最終濃度は０．６μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２のストック溶液を加えることによって６ｍＭに調整する。オリゴヌクレオチドプライマーである「テルテール」及び適当なサブテロメアプライマー（この場合、「ＸｐＹｐＥ」（ＸｐＹｐテロメアの分析用）または「１２ｑＡ」（１２ｑテロメアの分析用））を最終濃度が２μＭとなるように混合物に加える。最後に１μｌのライゲーション反応溶液をこの反応混合物に加える。
【００６５】
２．反応混合物を９４℃で１分間熱変性し、８０℃に冷却し、１×反応バッファ１、濃度０．６ｍＭの各ＮＴＰ、及び１単位のＡＢＧｅｎｅ製Ｔａｑ／Ｐｗｏミックスを含み、８０℃に予備加温した混合物１０μｌを加える。
【００６６】
３．したがって各反応成分の最終濃度は以下のとおり：ＭｇＣｌ２＝３ｍＭ、オリゴヌクレオチドプライマー＝１μＭ、ＮＴＰｓ＝０．３ｍＭ。
【００６７】
４．サイクル反応は次のように行う：６８℃で１０分の後、９４℃で１５秒、６８℃で３０秒（１サイクル毎に０．３℃づつ下げる）、及び６８℃で１０分を１０サイクル行う。この後、９４℃で１５秒、６５℃で３０秒、及び６８℃で１０分間を１４サイクル行う。
【００６８】
ゲル電気泳動／サザンブロッティング
ＰＣＲ反応の産物は以下の要領でアガロースゲル電気泳動で分離した。０．８％のゲルを調製した。ゲルは、長鎖のテロメアが充分に分離するように２０ｃｍ以上の長さであれば理想的である。また、分析を行う組織のテロメア長に応じて、高分子量のＤＮＡフラグメントの分離が可能なゲル電気泳動システムを使用することも可能である。こうしたシステムとしては、フィールドインバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）やパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）が挙げられる。この例ではＤＮＡフラグメントは０．８％アガロースゲル電気泳動及びＦＩＧＥによって分離した。ＦＩＧＥは０．５×ＴＢＥ中で１％アガロース（ＳｅａＫｅｍ（登録商標）Ｇｏｌｄ、エフエムシー・バイオプロダクツ社（FMC Bioproducts,米国メーン州ロックランド所在））を用い、下記のスイッチ条件で行った：０．２〜０．４秒（直線状）順方向電圧１８０、逆方向電圧１２０にて２０時間とし、１６〜１８℃の温度でバッファを再循環させた。フィコールに基づいたゲルローディングバッファをＰＣＲ反応液に加え、２０μｌのＰＣＲ反応液の半分をゲルのウェルにロードした。ＤＮＡサイズマーカーも用いた。電気泳動は７０Ｖで一晩行った（ゲルの長さ１ｃｍ当たり２．５〜３ボルト）。ゲルをエチジウムブロマイド染色し、増幅産物が充分に分離したことを確認した。標準的なサザンブロッティング法によってＤＮＡをゲルからナイロンメンブレンにトランスファーした。この場合、ゲルを０．２５ＭのＨＣｌ中で１０分間洗浄してＤＮＡをまず脱プリン化し、０．５Ｍ ＮａＯＨと１．５Ｍ ＮａＣｌを含むトランスファーバッファ中で１５分間ゲルを洗浄することによって変性を行ってアルカリトランスファーを行った。このＤＮＡを、正に帯電したナイロンメンブレン（この場合、アマシャム／ファーマシア社の製造するＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋）上に最低４時間にわたってキャピラリーブロッティングすることによってトランスファーした。次いでこのメンブレンを１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及びＮａＣｌ５００ｍＭを含む溶液中で２０秒間洗浄して中和を行った。
【００６９】
増幅されたテロメアフラグメントの検出
得られたＤＮＡフラグメントは、目的とするテロメアのサブテロメアＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブ（この場合、ＸｐＹｐテロメアに隣接するＤＮＡの配列を有するＤＮＡプローブ）とのハイブリダイゼーションによって検出した。ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによってフラグメントを検出することも可能である。これらのプローブは、市販のアマシャム／ファーマシア社製Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓ ｋｉｔによって与えられるような標準的なランダムヘキサ−プライミング反応によって３２Ｐで標識した。ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ Ｎａ３ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１％ＢＳＡを含む１５ｍｌのバッファ中で一晩、６０℃にて行った。ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを６０℃にて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、洗浄液が検出可能な放射能を示さなくなるまで洗浄した。ハイブリダイズしたフラグメントは標準的なオートラジオグラフィかホスホイメージングによって検出した。
【００７０】
ＰＣＲプライマー配列
２種類のテロレットを使用したが、テロレット２はテロレットよりも約２０倍効率が高く、示した結果はテロレット２のものである。これらのリンカーは最も３’末端側の塩基の設計においてのみ異なっている。
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGOCATCTAACCCT-3'
テルテール: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATC-3'
XpYpE2: 5'-TTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3'
12qA: 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3'
【００７１】
結果
この分析はＸｐＹｐテロメアに行った。
【００７２】
レーン１〜６はヒト甲状腺癌細胞系（異なる６つのクローン）である。
【００７３】
レーン７〜９は３人の無関係な男性から採取したヒト精子試料である。
【００７４】
ＦＩＧＥゲルのレーン１〜２、４〜５、７〜９についてＭＴＬ分析を行った（レーン３及び６はＦＩＧＥゲルの下部から低分子量のフラグメントが失われたために除外した。これらのフラグメントは０．８％アガロースゲルで確認される。）。ＦＩＧＥゲルの結果を図５に、０．８％アガロースゲルの結果を図８に示す。ＭＴＬ分析の結果は以下のとおり：
【００７５】
レーン１ ３．３０ｋｂ
レーン２ ２．２５ｋｂ
レーン３ ――――――
レーン４ ５．２４ｋｂ
レーン５ ２．０７ｋｂ
レーン６ ――――――
レーン７ １１．２３ｋｂ
レーン８ １２．４２ｋｂ
レーン９ １４．５８ｋｂ
【００７６】
本発明の方法を用いた上の結果（図５）と、従来のＴＲＦ分析を用いた結果（図６）との比較によって本発明の方法は分離能が高く、より鮮明であることが示される。
【００７７】
実施例２−単一分子分析
更に、実施例１で述べたロングレンジＰＣＲの条件を用いてヒト精子から得たＤＮＡからテロメア長を求めることが可能である。ヒト精子のＤＮＡは、人体で見られる最長のテロメアを有している（一般に１０〜１８ｋｂの長さ）。ＰＣＲによるテロメア長の決定法の一例を図７に示した。ここでは、「テロレット」リンカーに４ｎｇ、１ｎｇ、及び２５０ｐｇのＤＮＡがライゲートするように後に詳述する要領でライゲーション工程に先立ってヒト精子から得たＤＮＡを希釈した。後のＰＣＲ反応はこのライゲーション反応液の１／１０、したがって４００ｐｇ、１００ｐｇ、及び２５ｐｇのＤＮＡを含むようにした。これはそれぞれハプロイドゲノムの１３３、３３、および８当量に相当する量である。４ｎｇのライゲーション反応（ＰＣＲ反応では４００ｐｇ）では平均長が１２ｋｂのフラグメントのスメアが認められた。ライゲーション反応液中のＤＮＡ量が減少するのにしたがって、単一のフラグメントが認められるようになった。これらのフラグメントは単一分子から増幅されたテロメアを表すものである。
【００７８】
連続希釈
ライゲーション反応で５００ｎｇのＤＮＡを用いた場合、したがってＰＣＲ反応で５０ｎｇのＤＮＡを用いた場合には、標準的なテロメア長分析から予想されるテロメア長と相関したスメアが得られたが、このスメアには結果の解釈を困難にするような多くの他のバンドが重複して認められた。ＰＣＲの条件（サイクル数）を３２Ｐプローブへのハイブリダイゼーションによる増幅産物の検出と併せると、単一分子が増幅されたことが示される。したがってこの方法はこの量のＤＮＡに対しては感度が高すぎるといえる。付加的なバンドパターンを低減させるべく希釈実験を行ってＤＮＡ量を減らした。一部の反応で単一の増幅産物が認められるようになるまで（一部の反応に増幅産物が含まれなくなるまで）ＤＮＡを連続希釈した。ＤＮＡは、連続希釈し、（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で５倍に希釈）、１０μｌのライゲーション反応液に１００ｎｇのＤＮＡを加え、次いでこの反応液を５倍づつ希釈して２０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、８００ｐｇ／μｌ、１６０ｐｇ／μｌ、３２ｐｇ／μｌ、６．４ｐｇ／μｌ、１．３ｐｇ／μｌの連続希釈液を調製した。ハプロイドのヒトのゲノムの重さは３ｐｇであるので、この連続希釈液の最終希釈液に含まれる分子は１μｌ当たり１個よりも少ないことになる。
【００７９】
これら一連の希釈液のそれぞれに上記の要領でＰＣＲ反応を行って希釈の効果を観察した。希釈の効果は、ＤＮＡ量が多い場合には反応の結果、ハイブリダイズしたフラグメントのスメアが得られるが、低濃度の希釈液ではこのスメアは単一のハイブリダイズバンドに分離して現れるというものである。この効果を図７に見ることができる。この場合、１２ｋｂの生殖細胞のテロメアのスメアが４００ｐｇ／μｌの希釈液で見られ、このスメアは２５ｐｇ／μｌの希釈液では２本のバンドに分かれている。これらの実験は単一分子の増幅が行われたことを示すものである。
【００８０】
したがって本発明の方法は単一分子のレベルでテロメア長を検出するように構成されたものであり、少量の試料から平均のテロメア長を求めるうえで充分である。ヒト生殖細胞の標準的なテロメア長分析の結果、テロメアの長さは１２ｋｂであることが明らかとなった。これに対し単一分子分析によれば、図７に示されるように１２ｋｂよりも大幅に短い多くの更なるテロメアの存在が示された。図中、大半のバンドは１２ｋｂのサイズの周辺に見られ、これらのバンドは４００ｐｇのＰＣＲ反応ではスメアを形成している。しかしながら、約２．２ｋｂ、４ｋｂ、及び７ｋｂ付近に小さなバンドも確認される。この長さのテロメアは従来のテロメア長分析では見られなかったものである。
【００８１】
他の結果
この実験はまた、制限酵素による消化によって可溶化された（これにより正確なＤＮＡ濃度の測定が可能となる）ＤＮＡにおいてテロメアの検出が可能であることを実証するものである。更にこの実験では、ライゲーションに先立ってマング・ビーン・ヌクレアーゼによる処理を行う。この処理はテロメア末端を平滑末端化するものであり、ライゲーション反応を効果的に防止することによってテロレットリンカーの３’鎖に対する塩基対合の必要条件が示されるものである。
【００８２】
実施例３：改変例
（ａ）下記のオリゴヌクレオチドを用い、上記の要領で実施例１及び２の方法を行った。これらのオリゴヌクレオチドは上記の実施例で詳述したようにライゲーション反応液に等モル量で加え、同じ最終濃度とすることが可能である。これらのテロレットは３’末端の７個の塩基を除けば相同である。これら７個の塩基はテロメアの繰り返し配列内の可能な６つの位置をすべて網羅するような相違を有する。
【００８３】
テロレット１: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3'
テロレット２: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT-3'
【００８４】
実施例１で使用したもの。この他に以下の更なるテロレットを用いる。
【００８５】
テロレット３: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCTAACC-3'
テロレット４: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC-3'
テロレット５: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA-3'
テロレット６: 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA-3'
【００８６】
テロレット２、３及び４は約１０％の同様の効率を有するのに対し、他のテロレットの効率は約０．４３％であることが示された。
【００８７】
（ｂ）別の改変例は、オリゴヌクレオチドとテロメア鎖の５’末端との間のすべてのギャップをＤＮＡポリメラーゼを用いて充填するというものである。この方法では、５’→３’のエキソヌクレアーゼ活性を欠く任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることが可能である。充填反応は、ＤＮＡポリメラーゼ（例、１単位のＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（アマシャム／ファルマシア社））ならびにｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ（いずれも濃度０．０２ｍＭ（プロメガ社））、をライゲーション反応液自体に添加することによってライゲーション工程で行う（ライゲーションバッファとＤＮＡポリメラーゼがそれぞれ影響を及ぼさないものとして）ことが可能である。
【００８８】
実施例４：単一テロメア長分析（ＳＴＥＬＡ）
【００８９】
材料及び方法
細胞培養
繊維芽細胞株であるＩＭＲ−９０、ＩＭＲ−９１、ＷＩ−３８、ＡＧ０８０４９、ＡＧ０８０４８、ＡＧ１１２４１、ＡＧ０７１１９Ａ、ＡＧ１０９３７、及びＡＧ１０９３８をコリエール細胞レポジトリ（Coriell Cell Repository（キャムデン、米国））より入手した。ヒト２倍体繊維芽細胞であるＭＲＣ−５をＥＣＡＣＣ（ヨーロピアン・コレクション・オブ・セルカルチャーズ（European Collection of Cell Cultures）（ポートンダウン、英国））より入手した。ＨＣＡ２繊維芽細胞、ＨＣＡ２−ｈＴＥＲＴ（Wyllie, F.S. et al.. Nat. Genet. 24, 16-17 (2000)）、ＭＲＣ５ ｈＴＥＲＴ（McSharry, B.P., et al J. Gen. Virol. 82, 855-63 (2001)）、及びＫ１ ヒト甲状腺癌細胞株（Jones, C.J. et al. Exp. Cell Res. 240, 333-339 (1998).）。
【００９０】
細胞はすべて、２×非不可欠アミノ酸、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、１×１０５ＩＵ／Ｉのペニシリン、１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンを含むＥａｒｌｅ’ｓ塩類を加えたイーグルＭＥＭ培地で培養した。少なくとも２週間の細胞増殖停止期間をもって細胞が分裂老化状態となったことを判定し、ボンド等により述べられるようにＢｒｄＵ標識率が１％未満であることによって確認した（Bond, J.A. et al in Mol. Cell Biol. 19, 3103-3114 (1999)）。
【００９１】
ＤＮＡ抽出およびＰＣＲ
細胞にトリプシン処理を行ってＰＢＳで洗浄し、ゲノムＤＮＡをプロテイナーゼＫ、ＲＮアーゼＡ、フェノール／クロロフォルムを用いた標準的なプロトコルによって抽出した（Sambrook et al, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CITY (1989)）。このＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化して可溶化し、ヘキスト３３２５８蛍光測定法（バイオラド社（Biorad、ハーキュリーズ、米国））によって定量し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で１０ｎｇ／μｌにまで希釈した。１０ｎｇ ゲノムＤＮＡ、０．９μＭの本発明のテロレットリンカー（下記参照）、０．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（アマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）リトルシャルフォント、英国）、及び１×の同製造業者によるライゲーションバッファを含んだ１０μｌの反応液中、３５℃にて１２時間、ＤＮＡをライゲートした。
【００９２】
コントロールとして、４０単位のマングビーンヌクレアーゼ（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）及び１×の同製造業者によるヌクレアーゼバッファを用いて２μｇのゲノムＤＮＡを消化することによって５’末端のオーバーハングを除去したものを用いた。フェノール／クロロフォルムによる抽出後、ＤＮＡをエタノール沈澱し、７０％エタノール中で洗浄してから１０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、ヘキスト３３２５８蛍光測定法（バイオラド社（ハーキュリーズ、米国））によって定量した。
【００９３】
ライゲートしたＤＮＡをＨ２Ｏで２５０ｐｇ／μｌにまで希釈した。１００〜２５０ｐｇのライゲートしたＤＮＡ、０．５μＭの本発明のテロメア隣接プライマー及びテルテールプライマー（下記参照）、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０１％トウィーン２０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び、１単位のＴａｑポリメラーゼ（ＡｂＧｅｎｅ社、エプソム、英国）とＰｗｏポリメラーゼ（ロシュ・モレキュラーバイオケミカルズ社、ルイス、英国）の２５：１混合物を含んだ１０μｌの反応液中で、各試験ＤＮＡについて複数回のＰＣＲ（各試料につき９〜１８回の反応）を行った。ＭＪ ＰＴＣ−２２５サーマルサイクラー（ＭＪリサーチ社（MJ Research）、ウォータータウン、米国）を用い、次の条件でサイクル反応をおこなった：９４℃で１５秒、６５℃（ＸｐＹｐＥ２）または６６．５℃（ＸｐＹｐ−４１５ＧＣ／ＡＴ対立遺伝子特異的プライマー）で３０秒、及び６８℃で１０分間を２５サイクル。
【００９４】
０．５％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動によってＤＮＡフラグメントを分離し、ＸｐＹｐＥ２とＸｐＹｐＢ２プライマーの間のＰＣＲ（図９）で作成した３２Ｐ標識（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）テロメア隣接プローブと、３２Ｐ標識（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）した２５ｎｇの１ｋｂ分子量マーカー（ストラタジーン社（Stratagene）ラホーヤ、米国）からなる１ｋｂ分子量マーカー（ストラタジーン社、ラホーヤ、米国）を検出するためのプローブ５００ｐｇを用いたサザンハイブリダイゼーションによってＤＮＡフラグメントを検出した。モレキュラーダイナミクス Ｓｔｏｒｍ８６０ホスホイメージャー（アマシャムバイオサイエンス社、リトルシャルフォント、英国）を用いたホスホイメージングによってハイブリダイズしたフラグメントを検出した。Ｐｈｏｒｅｔｉｘ１Ｄ定量器（ノンリニアダイナミクス社（Nonlinear Dynamics）タイン州ニューカッスル、英国）を用いてこれらのＤＮＡフラグメントの分子量を計算した。
【００９５】
使用したオリゴヌクレオチドは以下のとおり。
【００９６】
XpYpE2: 5´- TTGTCTCAGGGTCCTAGTG -3´
XpYpB2: 5´- TCTGAAAGTGGACC(AT)ATCAG -3´
XpYp-415GC: 5´- GGTTATCGACCAGGTGCTCC -3´
XpYp-415AT: 5´- GGTTATCAACCAGGTGCTCT -3´
テロレット１: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC -3´
テロレット２: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT -3´
テロレット３: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCTAACC -3´
テロレット４: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC -3´
テロレット５: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA -3´
テロレット６: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA -3´
テルテール: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATC -3´
【００９７】
結果
要約すると、これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで加齢したヒト２倍体繊維芽細胞の分析にＳＴＥＬＡを適用したものである。ＴＴＡＧＧＧの繰り返し配列の量に関して最大で８ｋｂと対立遺伝子間で大きな差異が認められたが、この差異はテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）のエクトピック（ｅｃｔｏｐｉｃ）な発現によって解消された。更に注目すべき点として、テロメア長の不均一度が徐々に大きくなっている点と、老化時の最短のテロメア対立遺伝子は個人に固有であり（１．２ｋｂ〜７．４ｋｂ）、テロメア繰り返し配列が事実上存在しないテロメアが含まれる点である。したがってＳＴＥＬＡは、多くの生物学的状況においてテロメア繰り返し配列の動力学の果たす役割の完全な評価を可能とする技術といえる。
【００９８】
表１にＳＴＥＬＡデータをまとめたデータを示した。一次繊維芽細胞については老化の時点のデータのみを示している。ａ．両方の対立遺伝子から得られたＳＴＥＬＡデータは次のとおり。全体の平均値に基づいて分布を割り、分布の商の平均値を計算することによって上方及び下方分布の平均値を計算した。テロメア長の変化は分布の全体の平均値を用いて計算した。ＩＭＲ−９０では老化時の下方分布のデータの大半が失われたようで、下方分布の平均値及びテロメア崩壊速度を正確に決定することが不可能であった。ｂ．表に示した対立遺伝子に固有のＳＴＥＬＡデータは、対立遺伝子に固有のテロメア長の変化を示したものである。
【００９９】
【表１ａ】
【表１ｂ】
この実施例を以下に図９〜１１に基づいて更に説明する。
【０１０２】
図９は３つの部分からなる。すなわち、ａ．ＸｐＹｐテロメアにおけるＳＴＥＬＡの模式図。ｂ．２個のＫ１クローンのＳＴＥＬＡ分析結果をコントロールとともに示したもの。Ａ及びＢ＝テロレット２をライゲートしたクローン３及び４。Ｃ及びＤ＝無関係なリンカーをライゲートしたクローン３及び４。Ｅ＝リンカーをライゲートさせないクローン３及び４、Ｆ及びＧ＝ヌクレアーゼ処理によって５’末端のオーバーハングを除去し、テロレット２をＤＮＡにライゲートしたクローン３及び４。同じライゲーション反応液を用いた４つのＰＣＲ反応と使用したプライマーを上記に詳しく示した。これらのフラグメントはＸｐＹｐテロメア隣接プローブとのサザンハイブリダイゼーションによって検出した。ｃ．Ｋ１ ＤＮＡの希釈によって示されるＳＴＥＬＡの感度、各反応のＤＮＡ量を下記に詳しく示した。Ａ＝クローン３、Ｂ＝クローン４。
【０１０３】
図１０は３つの部分からなる。ａ．若い一次繊維芽細胞株及び老化した一次繊維芽細胞株に行ったＳＴＥＬＡの結果。ＨＹ＝ＨＣＡ２「若い」ＰＤ２８．５、ＨＳ＝ＨＣＡ２老化ＰＤ６４、ＭＹ＝ＭＲＣ５「若い」ＰＤ２９、ＭＳ＝ＭＲＣ５老化ＰＤ５５、Ｍ＝１ｋｂ ＤＮＡ分子量マーカー（ストラタジーン社、ラホーヤ、米国）、ＴＬ＝第１番目のテロメア反復配列から計算したテロメア長。ｂ．特定の家系に由来する老化一次繊維芽細胞に行ったＳＴＥＬＡの結果。Ａ＝ＡＧ１１２４１（兄弟）、Ｂ＝ＡＧ０８０４９（系図の出発点である個人、男性）、Ｃ＝ＡＧ０１１９Ａ（母）。老化したＭＲＣ５クローン５，３及び７。ｃ．対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ。ｂと同じＤＮＡを使用。ＡはＧＣハプロタイプについてホモである。Ｂ及びＣは、ＧＣ／ＡＴハプロタイプについてヘテロである。老化したＭＲＣ５クローン１及び３。ＭＲＣ５はＧＣ／ＡＴハプロタイプについてヘテロである。パネルｂ及びｃ中の矢印は、それぞれの平均値に標準偏差の３倍を加えた値よりもテロメア長が大きいことを示す。
【０１０４】
図１１は、ＭＲＣ５細胞に行った対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ分析から得られた４つのヒストグラムであり、ＡＴ対立遺伝子についての分布は青、ＧＣ対立遺伝子については赤で示されている。Ｘ軸はキロベースで表したテロメアのサイズ、Ｙ軸は相対比率、テロメアのサイズは１ｋｂ間隔で示した。ａ．ＭＲＣ５「若い」ＰＤ２９、ｂ．ＭＲＣ５老化ＰＤ５５、ｃ．ＭＲＣ５ クローン８老化ＰＤ２４、ｄ．ＭＲＣ５ ｈＴＥＲＴ ＰＤ２００＋。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】５’末端を越えて延出してＴＴＡＧＧＧの繰り返し単位からなる一本鎖のオーバーハングの模式図。
【図２】テロメアの３’末端に非相補的オリゴヌクレオチドリンカーをライゲートさせる従来技術の模式図。
【図３】本発明の好ましい一実施形態を説明する模式図。
【図４】本発明の好ましい一実施形態を説明する模式図。
【図５】実施例１のＦＩＧＥゲルの結果を示す図。
【図６】従来のＴＲＦ分析を用いた結果を示す図。
【図７】３’末端のオーバーハングを、マング・ビーン・ヌクレアーゼによって平滑末端化した例を示す図。
【図８】実施例１の０．８％アガロースゲルの結果を示す図。
【図９】特定のテロメア産物が指数関数的に増幅されることを示す図。
【図１０】ａ．若い一次繊維芽細胞株及び老化した一次繊維芽細胞株に行ったＳＴＥＬＡの結果を示す図。 ｂ．特定の家系に由来する老化一次繊維芽細胞に行ったＳＴＥＬＡの結果を示す図。 ｃ．対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡを示す図。
【図１１】ＭＲＣ５細胞に行った対立遺伝子特異的ＳＴＥＬＡ分析から得られた４つのヒストグラムを示す図。
Claims (29)
- 哺乳動物の染色体ＤＮＡのテロメア長を決定するための方法であって、
（ａ）一本鎖オリゴヌクレオチド（以下、「テロレット」と称する）の３’末端を、Ｇに富んだ側のテロメア鎖（ＴＴＡＧＧＧ繰り返し配列を有する）から形成されるテロメアの一本鎖オーバーハングにアニールし、前記テロレットをＣに富んだ側のテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列を有する）の５’末端と共有結合させることによってライゲーション産物を生成する工程と、
（ｂ）前記（ａ）工程で生成したライゲーション産物を増幅してプライマー伸長産物を生成する工程と、
（ｃ）前記（ｂ）工程のプライマー伸長産物の長さを検出する工程とを含む方法。 - 前記（ｂ）工程は、
（ｉ）ＤＮＡのテロメア隣接領域にアニール可能であるが、Ｃに富んだテロメア繰り返し配列（ＣＣＣＴＡＡ）にはアニールしない第１のプライマーと、
（ｉｉ）前記（ａ）工程のテロレットの５’末端配列と同じ配列を有する第２のプライマー（以下、「テルテール」プライマーと称する）とを用いて行われ、
該増幅反応は、前記第１のプライマーがＣに富んだテロメア鎖（ＣＣＣＴＡＡ繰り返し配列からなる）とハイブリダイズし、伸長されて第１のプライマー伸長産物を形成するとともに、前記テルテールプライマーが前記第１のプライマーの伸長産物とハイブリダイズし、伸長されて第２のプライマー伸長産物を形成するような条件下で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 前記テルテールプライマーは前記テロレットの固有の配列からなることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 前記テロレットは、３’末端においてヒトテロメア繰り返し配列ＴＴＡＧＧＧに相補的であるとともにこれにアニール可能な６〜１２個のヌクレオチドからなる一本鎖オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
- 前記テロレットは、更に５’末端においてヒトＤＮＡ配列といかなる既知の相同性も有さないように選択された１５〜３０個の塩基からなる配列を有することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
- テロメアに相補的な前記テロレットの３’末端の塩基は、前記（ｂ）工程で用いられるアニーリング温度においてテロレットリンカーがＤＮＡ鎖の合成を開始できないように充分に短いことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
- テロレットリンカーの残りの５’末端の塩基が、ヒトのＤＮＡ配列といかなる既知の実質的相同性をも有さず、かつサブテロメアＤＮＡにアニール可能なプライマーまたはテロメアのプロキシマル領域の変異繰り返し配列から開始される第１の鎖の合成が起きる場合にのみＰＣＲ増幅反応において効率的に用いられるように設計された配列を有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
- テロメアは、一般的なテロメア繰り返し配列であるＴＴＡＧＧＧ、及び場合によりＴＧＡＧＧＧ、ＴＣＡＧＧＧ及びＴＴＧＧＧＧといったテロメア繰り返し配列の変型からなるヒトテロメアであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
- 前記テロメアはヒト染色体ＤＮＡのテロメアであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
- 前記（ａ）工程において、前記テロレットは、前記反応条件下で、隣接ＤＮＡ分子同士を５’末端のリン酸基と３’末端の水酸基の間で連結することが可能なリガーゼを用いてＣに富んだ側のテロメア鎖の５’末端にライゲートされることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
- 前記テロレットは、以下の配列（３’→５’方向で示してある）：ＡＡＴＣＣＣ、ＡＴＣＣＣＡ、ＴＣＣＣＡＡ、ＣＣＣＡＡＴ、ＣＣＡＡＴＣ、及びＣＡＡＴＣＣの１以上を有する１以上の一本鎖オリゴヌクレオチドから選択されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
- 前記（ａ）工程のライゲーション反応は３５℃〜３７℃の範囲の温度で行われることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の方法。
- ライゲーションの後に、温度を上げることによってリガーゼ酵素を熱失活することを特徴とする請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
- ライゲーション後の前記（ｂ）工程において得られるライゲーション産物をＰＣＲによって増幅することを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の方法。
- ロングレンジＰＣＲ条件を用いることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
- 前記増幅工程は６０〜７０℃の範囲の温度で行われることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれかに記載の方法。
- 重さが１０〜１０００ｐｇの範囲であるＤＮＡ試料に行われることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
- 請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法を行うための要素からなるキットであって、
（ａ）上記に定義したテロレット及びテルテール配列から選択される１以上のオリゴヌクレオチドからなるキット。 - 更に、
（ｂ）染色体特異的プライマー、対立遺伝子特異的プライマー、及び／またはハイブリダイゼーションプローブの１以上を含む請求項１８に記載のキット。 - 更に、
（ｃ）リガーゼ、（ｄ）ロングレンジＰＣＲ用の特定の成分、及び／または（ｅ）要素（ｃ）及び／または（ｄ）用の１以上のバッファを含むことを特徴とする請求項１８または１９に記載のキット。 - 更に、
（ｆ）コンピュータソフトウェア及び／または（ｇ）ＭＴＬの計算を可能とするためのスプレッドシートを含む請求項１８乃至２０のいずれかに記載のキット。 - 請求項１乃至１７のいずれかに記載の方法を行うためのインストラクションが付属していることを特徴とする請求項１８乃至２１のいずれかに記載のキット。
- 以下から選択される請求項１乃至２２のいずれかに記載の方法またはキットで使用するためのプライマー：
XpYp-415GC: 5´- GGTTATCGACCAGGTGCTCC -3´,
XpYp-415AT: 5´- GGTTATCAACCAGGTGCTCT -3´
XpYpE: 5'-gcggtacctaggggTTGTCTCAGGGTCC-3'
12qA: 5'-GGGACAGCATATTCTGGTTACC-3'
XpYpEorang: 5´-CTGTCTCAGGGTCCTAGTG-3´
XpYpE2: 5´- TTGTCTCAGGGTCCTAGTG -3´
XpYpB2: 5´- TCTGAAAGTGGACC(AT)ATCAG -3´
テロレット１: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC -3´
テロレット２: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT -3´
テロレット３: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCCTAACC -3´
テロレット４: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCCTAACCC -3´
テロレット５: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCAACCCTA -3´
テロレット６: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATCACCCTAA -3´
テルテール: 5´- TGCTCCGTGCATCTGGCATC -3´
12qA 5´- GGGACAGCATATTCTGGTTACC -3´
7qA 5´- gggacagcatattctggtttcc-3´; 及び
Nitu14eD 5´- CTCTGAGTCAGGAGCGTCTCC -3´ - 可能性のある抗癌療法及び／または他の癌に関連した方法の評価に用いるための請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法、キット、またはプライマー。
- 生検試料の分析または骨髄移植における幹細胞の効果の評価に用いるための請求項２４に記載の方法、キット、またはプライマー。
- 加齢にともなうテロメアの動力学の評価に用いるための請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法、キット、またはプライマー。
- テロメラーゼ活性の調節の効果の評価に用いるための請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法、キット、またはプライマー。
- 男性の不妊症の評価、治療、または診断に用いるための請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法、キットまたはプライマー。
- 実施例及び図面に基づいて上記に概ね記載された請求項１乃至２８のいずれかに記載の方法、プライマーまたは使用法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0115451A GB0115451D0 (en) | 2001-06-23 | 2001-06-23 | Method for the determination of telomere length |
| GB0122755A GB0122755D0 (en) | 2001-09-21 | 2001-09-21 | Method for the determination of telomere length |
| PCT/GB2002/002855 WO2003000927A2 (en) | 2001-06-23 | 2002-06-21 | Method for the determination of telomere length |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004536599A true JP2004536599A (ja) | 2004-12-09 |
Family
ID=26246243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003507308A Withdrawn JP2004536599A (ja) | 2001-06-23 | 2002-06-21 | テロメア長の決定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040265815A1 (ja) |
| EP (1) | EP1399591A2 (ja) |
| JP (1) | JP2004536599A (ja) |
| CA (1) | CA2450580A1 (ja) |
| WO (1) | WO2003000927A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017532040A (ja) * | 2014-10-14 | 2017-11-02 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド | ハイスループットシーケンシング |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2513747C (en) | 2003-01-24 | 2017-03-07 | University Of Utah | Methods of predicting mortality risk by determining telomere length |
| US20110244462A1 (en) * | 2007-08-10 | 2011-10-06 | Tina Holding Aps | Method for Estimating Telomere Length |
| CN102439171B (zh) | 2008-12-22 | 2017-07-14 | 犹他大学研究基金会 | 单色多重定量pcr |
| US10378065B2 (en) * | 2011-08-15 | 2019-08-13 | University College Cardiff Consultants Limited | Prognostic mean telomere length |
| CN102618633A (zh) * | 2012-02-03 | 2012-08-01 | 常州亚当生物技术有限公司 | 一种用改良stela法测细胞中最短端粒长度的方法 |
| RU2508407C9 (ru) * | 2012-10-10 | 2014-05-20 | Елена Андреевна Чирясова | Способ количественной оценки терминальных нуклеотидов g-цепи теломерной днк человека с помощью полимеразной цепной реакции и дуплекс-специфического анализа, наборы синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления этого способа |
| WO2014190138A2 (en) | 2013-05-22 | 2014-11-27 | Telomere Diagnostics, Inc. | Measures of short telomere abundance |
| KR102255304B1 (ko) | 2014-09-26 | 2021-05-24 | 삼성전자주식회사 | 텔로미어 증폭 방법 |
| CA2971169A1 (en) | 2014-12-30 | 2016-07-07 | Telomere Diagnostics, Inc. | Multiplex quantitative pcr |
| CN114134239B (zh) * | 2021-11-25 | 2023-09-15 | 广州烨善生物科技有限公司 | 一种pcr法快速评价哺乳动物细胞质量的试剂盒及其检测方法 |
| WO2023193765A1 (en) * | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Zheng Zongli | Methods of preparing ligation product and sequencing library, identifying biomarkers, predicting or detecting a disease or condition |
| WO2023222657A1 (en) * | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Oxford Nanopore Technologies Plc | Method and adaptors |
| WO2024098029A2 (en) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Methods of measuring absolute length of individual telomeres |
| CN117230171B (zh) * | 2023-11-13 | 2024-04-12 | 元码基因科技（北京）股份有限公司 | 端粒扩增子测序用试剂盒及预文库构建方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996012821A1 (en) * | 1994-10-21 | 1996-05-02 | Zeneca Limited | Method for characterising variability in telomere dna by pcr |
| US5741677A (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-21 | Geron Corporation | Methods for measuring telomere length |
| US6197557B1 (en) * | 1997-03-05 | 2001-03-06 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for analysis of nucleic acids |
-
2002
- 2002-06-21 JP JP2003507308A patent/JP2004536599A/ja not_active Withdrawn
- 2002-06-21 CA CA002450580A patent/CA2450580A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-21 EP EP20020732965 patent/EP1399591A2/en not_active Withdrawn
- 2002-06-21 US US10/482,596 patent/US20040265815A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-21 WO PCT/GB2002/002855 patent/WO2003000927A2/en not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017532040A (ja) * | 2014-10-14 | 2017-11-02 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド | ハイスループットシーケンシング |
| JP7117846B2 (ja) | 2014-10-14 | 2022-08-15 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド | ハイスループットシーケンシング |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003000927A2 (en) | 2003-01-03 |
| EP1399591A2 (en) | 2004-03-24 |
| WO2003000927A3 (en) | 2003-11-27 |
| CA2450580A1 (en) | 2003-01-03 |
| US20040265815A1 (en) | 2004-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2527653T3 (es) | Amplificación específica de alelo usando un cebador con un nucleótido modificado | |
| EP1130113A1 (en) | Multiplex ligation dependent amplification assay | |
| JP5886755B2 (ja) | 核酸の対立遺伝子特異的増幅 | |
| JP5637850B2 (ja) | 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬 | |
| JP2004536599A (ja) | テロメア長の決定方法 | |
| CN109251907B (zh) | 基因突变特异性扩增效率提高的dna聚合酶 | |
| CN108291253A (zh) | 用于变体检测的方法 | |
| JP2008119005A (ja) | テロメア長を測定するための方法 | |
| EP3475449A1 (en) | Cell-free nucleic acid standards and uses thereof | |
| WO2012135125A1 (en) | Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr | |
| JP2014501533A (ja) | 突然変異解析 | |
| AU2014268510A1 (en) | Measures of short telomere abundance | |
| ES2656961T3 (es) | Uso de G-Clamp para mejorar la PCR específica de alelo | |
| JP2001204483A (ja) | ｈＴＥＲＴｍＲＮＡの発現の定量 | |
| US11345955B2 (en) | Hybridization-extension-ligation strategy for generating circular single-stranded DNA libraries | |
| JP6964900B2 (ja) | 核酸増幅の特異的抑制方法 | |
| JP2020532976A (ja) | 環状一本鎖ｄｎａライブラリーを生成するための新規な方法 | |
| KR101739876B1 (ko) | 표적핵산의 대립형질 또는 돌연변이 특이적 프라이머를 이용한 lamp 기반의 단일염기 변화 검출 방법 | |
| JP2008537676A (ja) | 核酸の検出 | |
| JP7160142B2 (ja) | 核酸増幅用試薬及び核酸増幅法 | |
| KR20160037009A (ko) | 텔로미어 증폭 방법 | |
| ES2843848T3 (es) | Ensayo de referencia para múltiples copias | |
| EP1402072A1 (en) | Accurate and efficient quantification of dna sensitivity by real-time pcr | |
| RU2831226C1 (ru) | Способ оценки активности системы эксцизионной репарации нуклеотидов млекопитающих | |
| AU2002304455A1 (en) | Method for the determination of telomere length |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20050207 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050207 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050517 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20071211 |