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KR102255304B1 - 텔로미어 증폭 방법 - Google Patents

텔로미어 증폭 방법 Download PDF

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KR102255304B1
KR102255304B1 KR1020140129519A KR20140129519A KR102255304B1 KR 102255304 B1 KR102255304 B1 KR 102255304B1 KR 1020140129519 A KR1020140129519 A KR 1020140129519A KR 20140129519 A KR20140129519 A KR 20140129519A KR 102255304 B1 KR102255304 B1 KR 102255304B1
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Abstract

게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법, 이에 사용되는 게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 조성물 및 키트를 제공한다. 이에 의하면, 하나의 어댑터를 사용하므로 반응 효율이 향상되고, 텔로미어 이외의 게놈 DNA의 증폭을 감소시켜 텔로미어 영역의 증폭 효율이 향상되고, 서던 블로팅과 같은 추가적인 과정 없이도 민감도가 높고 간편하게 증폭된 텔로미어 단편을 검출할 수 있고, 단일 염색체의 텔로미어를 증폭하기 때문에 단일 텔로미어의 길이를 측정할 수 있다.

Description

텔로미어 증폭 방법{Method for amplification of telomere}
게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법, 이에 사용되는 게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
진핵 세포에서 DNA 증폭과 관련된 "말단 복제 문제(end replication problem)" 때문에, 지체 가닥(lagging strand)은 DNA 증폭에 의해 짧아진다. 이것은 DNA 복제의 메커니즘의 결과로서 발생한다. 지체 가닥의 복제 과정 동안, 프라이머로서 기능하는 짧은 RNA 서열이 지체 가닥의 개시 위치의 앞에 부착된다. DNA 폴리머라제가 개시 위치로부터 복제를 시작하고 이것은 오카자키(Okazaki) 단편의 형성을 초래한다. 많은 RNA 프라이머들이 DNA 가닥에 더 부착되고 DNA 폴리머라제와 DNA 리가제가 RNA를 DNA로 전환하고 오카자키 단편 간의 틈(gap)을 메운다. 그러나 RNA를 DNA로 전화시키기 위해, RNA 프라이머의 앞에 다른 DNA 가닥이 있어야 한다. 이것은 마지막 RNA 프라이머가 부착된 염색체의 말단을 제외하고, 지체 가닥의 모든 위치에서 일어난다. 결국, RNA는 DNA에 남아 있는 RNA를 절단하는 효소에 의해 분해되고, 염색체 DNA의 말단인 텔로미어(telomere)는 복제의 매 사이클마다 소실된다. 텔로미어의 길이가 점점 짧아지면 세포 복제는 진행되지 않고 세포 사멸이 일어난다. 따라서, 텔로미어의 길이는 노화와 수명을 결정하는 요소이고 암의 예방에 관여할 것으로 추정된다.
암과 노화 관련 질병에서 텔로미어의 역할 때문에, 텔로미어의 길이에 관한 정보가 요구된다. 텔로미어의 길이를 결정하는 방법으로, 텔로미어 제한 단편 길이 분석(telomere restriction fragment length assay; TRF), 프라이머 연장 분석(primer extension assay), 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(quantitiative polymenrase chain reaction; q-PCR), 단일 텔로미어 신장 길이 분석(single telomere elongation length analysis; STELA), 유니버셜(universal) STELA 등이 있다. 그러나, 이들 방법은 염색체 특이적인 텔로미어의 길이를 결정할 수 없거나, 민감도 향상을 위해 서던 블로팅(Southern blotting)을 더 수행하여 텔로미어의 길이를 결정하는 문제가 있다.
따라서, 게놈 DNA의 텔로미어를 간편한 방법으로 텔로미어를 증폭시켜 높은 효율 및 높은 민감도로 텔로미어의 길이를 결정하고, 단일 염색체의 텔로미어의 길이를 측정할 수 있는 방법이 요구된다.
게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법을 제공한다.
게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 조성물을 제공한다.
게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 키트를 제공한다.
일 양상에 따르면, 텔로미어(telomere)를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 수득하는 단계;
상기 텔로미어 단편을 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계로서, 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 것인 단계;
상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 엑소뉴클레아제, 제1 핵산 폴리머라제, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트(blunt) 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계;
상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계; 및
상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계로서,
상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합인 것인 단계를 포함하는, 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 텔로미어를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 수득하는 단계를 포함한다.
게놈 DNA는 텔로미어를 포함한다. 용어 "게놈(genome)"은 한 생물이 갖는 모든 유전 정보를 말하고, '유전체'라고도 한다. 게놈은 진핵 생물의 게놈일 수 있다. 진핵 생물은 예를 들어, 포유동물을 포함하는 척추 동물, 균류, 점균류(slime mould), 원생동물(protozoa), 고등 식물, 조류(algae), 곤충류, 또는 효모일 수 있다. 포유동물은 예를 들어 인간, 개, 소, 말, 염소, 마우스(mouse), 또는 래트(rat)일 수 있다. DNA는 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid)를 말한다.
용어 "텔로미어(telomere)"는 단순한 반복 서열의 핵산과 단백질을 포함하는 염색체의 말단 영역을 말하고, 진핵 세포의 복제시 선형의 DNA는 복제할 때마다 길이가 짧아지게 되기 때문에 염색체의 말단을 보호하는 역할을 한다. 상기 반복 서열을 텔로미어 핵산 서열(telomere nucleic acid sequence)이라고도 부르고, 텔로미어 핵산 서열의 반복의 수는 개개의 세포에 따라 일정하지 않을 수 있고, 텔로미어 핵산 서열의 반복의 수는 노화 또는 암과 밀접한 관계가 있다. 텔로미어 핵산 반복 서열은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어, 척추동물의 텔로미어 핵산 서열은 5'-TTAGGG-3'(서열번호 1)일 수 있다.
상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들어, 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포 및 생검물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 시료는 당해 기술 분야에 알려진 방법으로 보관된 생물학적 시료 또는 그로부터 분리된 핵산일 수 있다. 보관된 생물학적 시료는 1년 이상, 예를 들어, 1년 내지 10년 동안 보관된 것일 수 있고, 냉동 보관 또는 포르말린 고정된 파라핀 임베드된 조직을 상온에서 보관한 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있을 수 있다.
핵산 절단 효소(nuclease)는 핵산의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소를 말한다. 핵산 절단 효소는 서열 특이적 핵산 절단 효소일 수 있다. 핵산 절단 효소는 폴리뉴클레오티드 사슬 내부의 3', 5'-포스포디에스테르 결합을 절단하는 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 폴리뉴클레오티드 사슬의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 차례로 절단하는 엑소뉴클레아제(exonuclease)일 수 있다. 핵산 절단 효소는 제한 효소(restriction enzyme)일 수 있다. 제한 효소는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제를 말한다. 제한 효소는 제한 효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)라고 부르는 핵산 내부에 존재하는 짧은 핵산 서열을 인지하여 작용한다. 제한 효소 인식 부위는 예를 들어, 4개의 폴리뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함), 6 nt, 또는 8 nt일 수 있다. 하나 이상의 제한 효소를 이용하여 게놈 DNA를 절단하면 게놈 중 텔로미어에 인접한 부위가 절단될 수 있다. 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션은 인큐베이션은 인 비트로에서 수행되는 것일 수 있다. 인큐베이션은 제한 효소의 활성에 적절한 온도에서 수행될 수 있고, 절단에 적절한 시간, 예를 들어, 10 분 내지 12 시간(밤새), 1 시간 내지 12 시간(밤새), 또는 3 시간 내지 12 시간(밤새) 동안 수행될 수 있다. 반응물의 조성은 절단 효소에 따라 결정될 수 있고, 당해 기술 분야에 알려져 있을 수 있다.
상기 방법은 상기 텔로미어 단편을 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 텔로미어 단편(telomere fragment)은 텔로미어를 포함하는 염색체의 일부를 말한다.
상기 방법은 상기 텔로미어 단편을 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함한다. 상기 제1 영역은 단일 가닥 어댑터 핵산의 3' 말단을 포함하는 영역일 수 있다. 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 어댑터 핵산의 3' 말단으로부터 상기 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역, 정방향 프라이머와 동일한 핵산 서열을 포함하는 제2 영역, 및 역방향 프라이머에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 제3 영역을 포함할 수 있다. 어댑터 핵산 중 제1 영역을 제외한 다른 핵산 서열은 텔로미어에 상보적이지 않을 수 있다. 상기 제1 영역은 서열번호 2 내지 7 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 단일 가닥 어댑터 핵산의 길이는 예를 들어, 6 nt 내지 60 nt, 10 nt 내지 55 nt, 20 nt 내지 50 nt, 30 nt 내지 50 nt, 또는 40 nt 내지 50 nt일 수 있다. 상기 제1 영역의 길이는 예를 들어, 2 nt 내지 20 nt, 4 nt 내지 10 nt, 또는 6 nt 내지 8 nt일 수 있다.
상기 리가제(ligase)는 ATP 등 뉴클레오티드 3 인산의 분해에 따라 포스포디에스테르 결합을 형성하여 뉴클레오티드간의 결합을 촉매하는 효소를 말한다. 상기 리가제는 DNA 리가제일 수 있다. 상기 DNA 리가제는 T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, Ampligase DNA 리가제, 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제, 또는 이들의 조합일 수 있다. 인큐베이션은 리가제의 활성 온도에 적절한 온도에서 수행될 수 있고, 라이게이션에 적절한 시간 예를 들어 10 분 내지 12 시간(밤새), 또는 30 분 내지 12 시간(밤새) 동안 수행될 수 있다.
텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 텔로미어 단편과 어댑터 핵산의 제1 영역이 상보적으로 결합한 선형의 연결체일 수 있다. 어댑터 핵산 중 제1 영역을 제외한 다른 핵산 서열은 텔로미어에 상보적이지 않은 경우, 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 그의 3' 말단에 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 엑소뉴클레아제, 제1 핵산 폴리머라제, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트(blunt) 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계를 포함한다.
용어 "엑소뉴클레아제(exonuclease)"는 핵산 분해 효소 중 폴리뉴클레오티드 사슬의 5' 말단 또는 3' 말단으로부터 뉴클레오티드를 차례로 절단하는 효소를 말한다. 상기 엑소뉴클레아제는 예를 들어 단일 가닥의 핵산을 특이적으로 절단하는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제일 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 3'에서 5' 방향으로 핵산을 절단하는 엑소뉴클레아제일 수 있다. 상기 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I일 수 있다. 엑소뉴클레아제 I은 대장균의 엑소뉴클레아제로서, 단일 가닥의 DNA를 3'에서 5' 방향으로 절단한다.
용어 "핵산 폴리머라제(nucleic acid polymerase)"는 핵산의 중합 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 제1 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 T4 DNA 폴리머라제, T7 폴라머라제, 크레나우(Klenow) 단편, DNA 폴리머라제 I, Taq DNA 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제(엑소뉴클레아제 마이너스), 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, 핫 스타트(hot start) 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
블런트(blunt) 말단은 두 가닥의 폴리뉴클레오티드 사슬이 말단까지 상보적으로 결합하여 단일 가닥이 없는 말단을 말한다. 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 엑소뉴클레아제, 핵산 폴리머라제, 또는 이들의 조합에 의해 형성될 수 있다. 예를 들어, 엑소뉴클레아제는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체의 단일 가닥을 3'에서 5' 방향으로 절단하여 어댑터 핵산의 5' 오버행(overhang)을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 핵산 폴리머라제는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체의 5'- 또는 3'-오버행(overhang)을 주형으로 핵산을 중합하여 5', 3', 또는 이들의 조합의 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성할 수 있다. 오버행을 주형으로 핵산을 중합하여 블런트 말단을 갖는 핵산을 형성하는 과정을 필-인(fill-in)이라고 부를 수 있다.
상기 방법은 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계 후에, 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체의 5'-말단을 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)에 의해 인산화시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 5'-말단을 인산화시키는 효소는 당해 기술 분야에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들어, 5'-말단을 인산화시키는 효소는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(T4 PNK) 또는 그의 변이체인 것일 수 있다. 인산화시키는 조건은 선택되는 효소에 따라 당해 기술 분야의 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 단계는 5'-말단을 인산화시키기에 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 리가제 및 인큐베이션은 전술한 바와 같다.
상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 단일 분자의 말단이 라이게이션된 자가-라이게이션(self-ligation)에 의해 형성된 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계를 포함한다.
용어 "프라이머(primer)"는 주형 의존적 핵산 합성에서 합성의 개시점으로 작용하는 짧은 핵산 가닥을 말한다. 상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 프라이머는 예를 들어 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 텔로미어의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 프라이머는 예를 들어 텔로미어의 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 프라이머의 길이는 5 nt 내지 30 nt, 7 nt 내지 30 nt, 9 nt 내지 30 nt, 12 nt 내지 30 nt, 15 nt 내지 30 nt, 17 nt 내지 27 nt, 20 nt 내지 27 nt일 수 있다.
상기 제2 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. DNA 폴리머라제는 T4 DNA 폴리머라제, T7 폴라머라제, 크레나우(Klenow) 단편, DNA 폴리머라제 I, Taq DNA 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제(엑소뉴클레아제 마이너스), 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제, Pfx DNA 폴리머라제, Tfi DNA 폴리머라제, Tfl DNA 폴리머라제, 핫 스타트(hot start) 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제, 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "증폭(amplification)"은 핵산의 카피 수를 증가시키는 것을 의미하며, DNA로부터 DNA를 생성시키거나 RNA로부터 DNA를 생성시키는 것을 포함한다. 증폭은 당해 기술 분야에 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 상기 텔로미어 단편의 증폭은 열순환(thermal cycling)을 필요로 하는 것(즉, 열순환 증폭), 등온(isothermal)에서 수행되는 것(즉, 등온 증폭), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 상기 텔로미어 단편의 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR), 다중 치환 증폭(multiple displacement amplification; MDA), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. "PCR"은 폴리머라제를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법일 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭은 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 및 신장(elongation)의 단계를 반복한다. 상기 용어 "어닐링(annealing)"은 용어 "혼성화(hybridization)"와 혼용될 수 있다. 상기 텔로미어 단편의 증폭은 예를 들어 정량적 PCR(quantitative PCR; q-PCR)에 의해 수행될 수 있다. 상기 정량적 PCR은 PCR 산물의 증가를 PCR의 매 사이클마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 산물과 반응하는 형광물질의 검출 및 정량에 의해 시료를 분석하는 방법이다.
상기 방법은 증폭된 텔로미어 단편의 길이를 측정하여 상기 게놈 DNA의 텔로미어의 길이를 산출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 증폭된 텔로미어 단편의 길이는 당해 기술 분야에 알려진 방법으로 측정될 수 있고, 예를 들어 정량적 PCR, 전기영동 등에 의해 측정될 수 있다.
다른 양상에 따르면, 텔로미어를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계로서, 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 것인 단계;
상기 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계;
상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 엑소뉴클레아제, 제1 핵산 폴리머라제, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계;
상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계; 및
상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계로서,
상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합인 것인 단계를 포함하는, 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 텔로미어를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 텔로미어, 게놈, 게놈 DNA, 시료, 단일 가닥 어댑터, 리가제, 및 인큐베이션은 전술한 바와 같다.
상기 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체는 게놈 DNA의 텔로미어와 어댑터 핵산이 라이게이션된 연결체일 수 있다.
상기 방법은 상기 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 핵산 절단 효소, 인큐베이션, 및 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 엑소뉴클레아제, 제1 핵산 폴리머라제, 또는 이들의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계를 포함한다.
상기 엑소뉴클레아제, 제1 핵산 폴리머라제, 인큐베이션, 블런트 말단, 및 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계를 포함한다.
상기 리가제, 인큐베이션, 및 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계를 포함한다.
상기 프라이머, 제2 핵산 폴리머라제, 인큐베이션, 및 증폭은 전술한 바와 같다.
상기 방법은 상기 방법은 증폭된 텔로미어 단편의 길이를 측정하여 상기 게놈 DNA의 텔로미어의 길이를 산출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 양상에 따르면, 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 단일 가닥 어댑터 핵산을 포함하는 게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 텔로미어 핵산 서열, 제1 영역, 단일 가닥 어댑터 핵산, 게놈, 게놈 DNA, 텔로미어, 및 증폭은 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 서열번호 2의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 3의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 5의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 6의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 서열번호 7의 핵산 서열을 갖는 제1 영역을 포함하는 어댑터 핵산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 양상에 따르면, 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 단일 가닥 어댑터 핵산, 및 프라이머를 포함하고, 상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합인 것인, 게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 키트를 제공한다.
상기 텔로미어 핵산 서열, 제1 영역, 단일 가닥 어댑터 핵산, 프라이머, 게놈, 게놈 DNA, 텔로미어, 및 증폭은 전술한 바와 같다.
상기 키트는 리가제, 핵산 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 및 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 상기 리가제, 핵산 폴리머라제, 및 엑소뉴클레아제는 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따른 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법, 이에 사용되는 게놈 DNA의 텔로미어 증폭용 조성물 및 키트에 의하면, 하나의 어댑터를 사용하므로 반응 효율이 향상되고, 텔로미어 이외의 게놈 DNA의 증폭을 감소시켜 텔로미어 영역의 증폭 효율이 향상되고, 서던 블로팅과 같은 추가적인 과정 없이도 민감도가 높고 간편하게 증폭된 텔로미어 단편을 검출할 수 있고, 단일 염색체의 텔로미어를 증폭하기 때문에 단일 텔로미어의 길이를 측정할 수 있다.
도 1a는 일 구체예에 따른 어댑터 폴리뉴클레오티드의 모식도이고, 도 1b는 일 구체예에 따른 텔로미어의 증폭 방법의 모식도이다(1: 어닐링 영역(제1 영역), 2: 정방향 프라이머 영역(제2 영역), 3: 역방향 프라이머 결합 영역(제3 영역), 및 4: 텔로미어 영역).
도 2a는 정량적 PCR의 반응 산물을 전기영동한 이미지이고(레인 1: 자가-라이게이션 이전 핵산의 증폭, 레인 2: 자가-라이게이션 이후 핵산의 증폭), 도 2b 및 도 2c는 각각 정량적 PCR에 의한 Ct(cycle threshold)(사이클 수) 및 정량적 PCR에 의한 증폭 배수(amplification fold)를 나타낸다(흰 막대: C-유전자, 점을 갖는 막대: 텔로미어).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 텔로미어의 증폭 및 길이 측정
1-1. 어댑터 폴리뉴클레오티드 및 프라이머 쌍의 준비
텔로미어 영역에 결합하는 어닐링 영역, 정방향 프라이머 서열과 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머 영역, 및 역방향 프라이머 서열에 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머 결합 영역을 포함하는 어댑터 폴리뉴클레오티드를 준비하였다.
구체적인 어댑터 폴리뉴클레오티드와 프라이머 쌍의 핵산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
명칭 핵산 서열
텔로-어댑터 1 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCCCCTAAC-3' (서열번호 8)
텔로-어댑터 2 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCTAACCCT-3' (서열번호 9)
텔로-어댑터 3 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCTCTAACC-3' (서열번호 10)
텔로-어댑터 4 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCTTAACCC-3' (서열번호 11)
텔로-어댑터 5 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCTACCCTA-3' (서열번호 12)
텔로-어댑터 6 5'-AGATCGGAAGAGCTCGTATGCTGCTCCGTGCATCTGGCATCTCCCTAA-3' (서열번호 13)
정방향 프라이머 5'-TGCTCCGTGCATCTGGCATCT-3' (서열번호 14)
역방향 프라이머 5'-GCATACGAGCTCTTCCGATCT-3' (서열번호 15)
1-2. 게놈 DNA 의 절단
텔로미어 영역을 수득하기 위해 게놈 DNA를 제한 효소를 사용하여 절단하였다.
구체적으로, 1 ㎍의 게놈 DNA(Promega, G1471), 20 유닛의 MseI(NEB, R0525L), 20 유닛의 NdeI(NEB, R0111L), 1X NEB buffer2(NEB), 및 물을 혼합하여 총 100 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. 준비된 반응 혼합물을 37℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하여 게놈 DNA를 절단하였다.
1-3. 어댑터 폴리뉴클레오티드의 라이게이션
제한 효소로 절단된 게놈 DNA에 어댑터 폴리뉴클레오티드를 라이게이션시켰다.
구체적으로, 100 ng의 실시예 1-2에 기재된 바와 같이 준비된 제한 효소에 의해 절단된 게놈 DNA, 각각 100 pmol의 표 1의 6 종의 텔로-어댑터 1 내지 6, 2000 유닛의 T4 DNA 리가제(NEB, M0202M), 1X 반응 완충액(NEB), 1 mM의 ATP(NEB, #9804), 및 물을 혼합하여 총 100 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. 준비된 반응 혼합물을 16℃에서 12 시간 동안 인큐베이션하여 게놈 DNA에 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션시켰다.
1-4. 단일 가닥 핵산의 절단 및 필-인( fill - in )
텔로미어와 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 산물에서 단일가닥 핵산을 3' 말단으로부터 5' 방향으로 절단하고 필-인(fill-in)하여 블런트(blunt) 말단의 폴리뉴클레오티드를 준비하였다.
구체적으로, 100 ng의 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 준비된 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 게놈 DNA, 20 유닛의 엑소뉴클레아제 I(E. coli)(NEB, M0293L), 50 유닛의 크레나우(Klenow) 단편(NEB, M0210L), 1X NEBuffer2(NEB), 33 μM의 dNTP(NEB, N0447S), 및 물의 혼합하여 총 100 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. 준비된 반응 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 게놈 DNA를 블런트(blunt) 말단을 갖도록 만들었다. 텔로미어의 3' 말단은 긴 단일 가닥 영역을 갖기 때문에 블런트 말단으로 만드는 것이 용이하지 않을 수 있다. 이것을 해결하기 위해, 단일 가닥에 특이적이고 3'->5' 방향성을 갖는 엑소뉴클레아제를 사용하여 크레나우 단편에 의한 필-인(fill-in) 단계를 용이하도록 만들었다. 엑소뉴클레아제에 의한 단일 가닥 핵산의 절단 및 필-인을 통해 선형의 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA의 연결체를 수득할 수 있다.
1-5. 자가- 라이게이션
블런트 말단을 갖는 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 게놈 DNA를 자가-라이게이션(self-ligation)시켜서 원형 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA를 준비하였다.
구체적으로, 100 ng의 실시예 1-4에 기재된 바와 같이 준비된 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 게놈 DNA, 20 유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)(NEB, M0201L), 1x 반응 버퍼(70 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT)(NEB), 1 mM의 ATP(NEB, #9804), 및 물의 혼합하여 총 100 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. 준비된 반응 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 65℃에서 20 분 동안 인큐베이션하였다.
그 다음, 반응 혼합물에 1 ㎕(2000 유닛)의 T4 DNA 리가제를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 어댑터 폴리뉴클레오티드가 라이게이션된 게놈 DNA를 자가-라이게이션시켰다. 자가-라이게이션을 통해 원형의 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA의 연결체를 수득할 수 있다.
1.6. 텔로미어의 증폭
자가-라이게이션에 의해 준비된 원형의 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA를 어댑터 폴리뉴클레오티드의 바깥 방향으로 증폭시키는 프라이머 쌍을 사용하여 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭시켰다.
구체적으로, 1 ng의 실시예 1-5에 기재된 바와 같이 준비된 원형의 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA의 연결체 또는 실시예 1-4에 기재된 바와 같이 준비된 선형의 어댑터 폴리뉴클레오티드-게놈 DNA의 연결체, 10 μM의 정방향 프라이머(서열번호 14), 10 μM의 역방향 프라이머(서열번호 15), 10 ㎕의 LightCycler 480 SYBR Green 1 master(ROCHE, 04-887-352-001), 및 물을 혼합하여 총 20 ㎕의 반응 혼합물을 준비하였다. 준비된 반응 혼합물을 Lightcycler 480 (Roche) 기기에서 PCR을 수행하였다. PCR은 95℃에서 10 초, 55℃에서 10 초, 72℃에서 1 분 30 초를 1 사이클로 하여 50 사이클을 반복하여 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 게놈 DNA의 C-유전자(control gene)를 증폭하는 하기 프라이머 쌍을 사용하여 게놈 DNA의 증폭 대비 텔로미어 영역의 증폭을 확인하였다.
정방향 프라이머: 5'-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3' (서열번호 16)
역방향 프라이머: 5'-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3' (서열번호 17)
정량적 PCR을 수행한 반응 산물을 전기영동하여 텔로미어 영역이 증폭되었는지 여부를 확인하였다. 정량적 PCR의 반응 산물을 전기영동한 결과를 도 2a에 나타내고(레인 1: 자가-라이게이션 이전 핵산의 증폭, 레인 2: 자가-라이게이션 이후 핵산의 증폭), 정량적 PCR의 Ct(cycle threshold)(사이클 수)와 증폭 배수(amplification fold)를 각각 도 2b 및 도 2c에 나타내었다(흰 막대: C-유전자, 점을 갖는 막대: 텔로미어).
도 2a에 나타난 바와 같이, 자가-라이게이션을 수행한 후 핵산을 주형으로 하여 증폭한 결과 자가-라이게이션에 특이적으로 증폭된 것을 확인하였다. 또한, 도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 게놈 DNA 대비 텔로미어의 영역이 증폭된 것을 확인하였다.
<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> Method for amplification of telomere <130> PN106580 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> telomere nucleic acid sequence <400> 1 ttaggg 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> telomere fragment sequence <400> 2 cctaac 6 <210> 3 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First region of single strand adaptor nucleic acid <400> 3 aaccct 6 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First region of single strand adaptor nucleic acid <400> 4 ctaacc 6 <210> 5 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First region of single strand adaptor nucleic acid <400> 5 taaccc 6 <210> 6 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First region of single strand adaptor nucleic acid <400> 6 acccta 6 <210> 7 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> First region of single strand adaptor nucleic acid <400> 7 ccctaa 6 <210> 8 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 8 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat cccctaac 48 <210> 9 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 9 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat ctaaccct 48 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 10 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat ctctaacc 48 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 11 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat cttaaccc 48 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 12 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat ctacccta 48 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand adaptor nucleic acid <400> 13 agatcggaag agctcgtatg ctgctccgtg catctggcat ctccctaa 48 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 14 tgctccgtgc atctggcatc t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer <400> 15 gcatacgagc tcttccgatc t 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for control gene <400> 16 cagcaagtgg gaaggtgtaa tcc 23 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for control gene <400> 17 cccattctat catcaacggg tacaa 25

Claims (20)

  1. 텔로미어(telomere)를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 수득하는 단계;
    상기 텔로미어 단편을 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계로서, 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 것인 단계;
    상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 3'에서 5' 방향으로 핵산을 절단하는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 및 제1 핵산 폴리머라제의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트(blunt) 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계;
    상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계; 및
    상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계로서,
    상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합인 것인 단계를 포함하는, 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시료는 생물학적 시료인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 절단 효소는 제한 효소인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 어댑터 핵산은 어댑터 핵산의 3' 말단으로부터 상기 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역, 정방향 프라이머와 동일한 핵산 서열을 포함하는 제2 영역, 및 역방향 프라이머에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 영역은 서열번호 2 내지 7 중 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I인 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 핵산 폴리머라제 또는 제2 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계 후에, 상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체의 5'-말단을 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; PNK)에 의해 인산화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체는 자가-라이게이션(self-ligation)에 의해 형성된 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 텔로미어 단편의 증폭은 열순환 증폭, 등온 증폭, 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 텔로미어 단편의 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR), 다중 치환 증폭(multiple displacement amplification; MDA), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification; RCA), 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 증폭된 텔로미어 단편의 길이를 측정하여 상기 게놈 DNA의 텔로미어의 길이를 산출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 텔로미어를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는 시료를 단일 가닥 어댑터 핵산 및 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계로서, 상기 단일 가닥 어댑터 핵산은 텔로미어 핵산 서열 또는 그의 단편에 상보적인 제1 영역을 포함하는 것인 단계;
    상기 게놈 DNA-어댑터 핵산 연결체를 하나 이상의 핵산 절단 효소의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계;
    상기 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 3'에서 5' 방향으로 핵산을 절단하는 단일 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 및 제1 핵산 폴리머라제의 조합의 존재 하에서 인큐베이션시켜 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 것인 단계;
    상기 블런트 말단을 갖는 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 형성하는 단계; 및
    상기 원형의 텔로미어 단편-어댑터 핵산 연결체를 프라이머 및 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 텔로미어 단편을 증폭하는 단계로서,
    상기 프라이머는 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드와 동일한 핵산 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 상기 단일 가닥 어댑터의 제1 영역의 5' 방향에 위치하는 2 이상 연속 폴리뉴클레오티드에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 역방향 프라이머, 또는 이들의 조합인 것인 단계를 포함하는, 게놈 DNA의 텔로미어를 증폭하는 방법.
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