JP2004509613A - 非同調的刺激ｐｃｒ - Google Patents

Abstract

核酸増幅のための非同調的熱サイクルプロトコールは、約１０〜３０℃だけ異なる熱融解温度を有する２つのプライマーを使用する。高い融解温度のプライマーをアニーリングし、そしてポリメラーゼを媒介して伸長した後、非複写一本鎖標的配列をハイブリダイズして、プローブによって検出し得る。ＤＮＡプローブを、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって切断し得る。このプローブは、ＰＮＡのような非切断アナログであり得る。レポーター色素およびエネルギー移動を行うために選択されたクエンチャー（例えば、ＦＲＥＴ）でプローブを標識する場合、このレポーター色素からの蛍光は、プローブが結合していない場合に、効率的にクエンチされ得る。相補的な標的にプローブをハイブリダイズする、またはこの標的に結合している間に切断する際に、レポーター色素は、もはやクエンチされず、検出可能な量の蛍光を生じる。

Description

【０００１】
本願は、本明細書中で参考として援用される、２０００年６月６日に出願された仮特許番号６０／２０９８８３の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は一般に、核酸ハイブリダイゼーションの分野、そしてより具体的には核酸増幅の方法に関する。
【０００３】
（ＩＩ．導入）
核酸増幅アッセイは、現代生物学において、遺伝性疾患の診断、ヒトの同定、微生物の同定、親子鑑定、ウイルス学およびＤＮＡ配列決定における多様な適用を有する、特定の標的配列の検出法の重要なクラスを含む。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法は、大きな感度および特異性によって、標的核酸配列の生成および検出を可能にする。ＰＣＲ法は、クローニング、遺伝子発現の分析、ＤＮＡ配列決定、遺伝子マッピング、薬物発見などに不可欠である（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：２７２５−２７２９；Ｂｅｖａｎ（１９９２）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１：２２２−２２８；Ｇｒｅｅｎ（１９９１）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１：７７−９０；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｑｕｉｒｋｅ，Ｐ．およびＴａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｒ．、ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。標的配列またはアンプリコンにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブを使用してＰＣＲ産物（アンプリコン）を検出するための方法は、Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＥＰ第２３７，３６２号に記載される。
【０００４】
従来のＰＣＲにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、目的の標的配列に隣接する相補的な標的鎖中の配列にアニーリングされ、そしてアニーリングされたプライマーは、標的配列の二本鎖（ｄｓ）コピーを生成するために、同時に伸長される。これらのプライマーは、ポリメラーゼ、好ましくは末端安定性ポリメラーゼによって伸長される（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．編（１９９５）ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄで、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）。従来、ＰＣＲにおいて使用される２つのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、類似のアニーリングおよび伸長の効率を促進するために、等しいかまたは類似のＴｍ値を有するように設計および選択される。
【０００５】
非対称ＰＣＲは、標的配列由来のＤＮＡの一本鎖コピーの生成のための用途を見出した（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ、８５：７６５２；ＭｃＣａｂｅ，Ｐ．（１９９０）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ　ｂｙ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ＰＣＲ」、ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、７６−８３頁）。非等量の２つの増幅プライマーが使用される（例えば、低濃度プライマーおよび高濃度プライマーについて、それぞれ、１〜５ｐｍｏｌおよび５０〜１００ｐｍｏｌ）。最初の２０〜２５サイクルの間、二本鎖ＤＮＡが指数関数的に生成され、そして、限定的なプライマーが涸渇した場合、一本鎖ＤＮＡが、残りの５〜１０サイクルの間、直線的に蓄積する。ＰＣＲは最適状態には及ばない条件（すなわち、低濃度の１つのプライマー）で実行されなければならない点で、不利である。従って、増幅は、不十分であり得るか、または再現不能であり得る（Ｈｏｐｇｏｏｄ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：８２；Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２：９２）。一本鎖アンプリコンを生成する他のＰＣＲ法は、二本鎖アンプリコンの１本の鎖の酵素的消化、プライマー対の多重化セット、プライマーのネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）セット、および逆増幅を含む。しかし、各方法は、扱いにくいか、または制限を有する（Ｈｉｇｕｃｈｉ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１７：５８６５；Ｓａｒｋａｒ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１６：５１９７；Ｓｔｏｆｌｅｔ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４９１；Ｂｅｖａｎ（１９９２）ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：２２；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ，Ｕ．（１９８９）「Ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ」、ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、５０〜５３頁）。
【０００６】
（ＩＩＩ．発明の要旨）
本発明は、核酸増幅のための新規熱サイクルプロトコールを含む、核酸増幅の方法に関する。進行（すなわち、増幅産物の生成）の検出は、標的配列の一本鎖形態に対して、検出可能なプローブをハイブリダイズさせることによって、容易化および改善され得る。一本鎖標的は、２つの段階、アニーリングプロトコールおよび伸長プロトコールにおける、中間体である。最初に、より高い融点のプライマーが標的の１本の鎖に選択的にアニーリングし、そして伸長され、二本鎖コピーおよび、未コピーの一本鎖標的を生じる。
【０００７】
第一の局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するための方法を含む。互いにハイブリダイズして塩基対形成構造体を形成し得る第一および第二の標的ポリヌクレオチド鎖を含む混合物が獲得され、この混合物は、標的配列、第一の標的ポリヌクレオチド鎖の第一の領域に相補的な第一のプライマー、および第二の標的ポリヌクレオチド鎖の第二の領域に相補的な第二のプライマーを含み、その結果、第一および第二の領域は、標的配列に隣接する。第一のプライマーは、第一の温度で伸長されて、第二のプライマーが第二の領域に実質的にハイブリダイズしないような条件下で第一の標的鎖にハイブリダイズする第一の相補鎖を含む第一の複合体を形成する。第二のプライマーは、第一の温度よりも低い第二の温度で伸長されて、第二の標的鎖にハイブリダイズする第二の相補鎖を含む第二の複合体を形成する。第二のプライマーを伸長させる前に、検出可能なプローブは、第二の標的鎖における相補的結合領域にハイブリダイズされ、そしてハイブリダイズしたプローブは、第二の標的鎖の測定として検出される。
【０００８】
別の局面において、非同調的熱サイクルプロトコールは、以下の工程を包含する：
第一のアニーリング温度で、第一のプライマーを、変性した標的核酸の第一鎖にアニーリングさせる工程；
伸長温度または第一のアニーリング温度で、プライマー伸長試薬を用いて第一のプライマーを伸長させて、二本鎖の核酸を生成する工程であって、ここで、このプライマー伸長試薬は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド５’−トリホスフェートおよび緩衝液を含む、工程；
プローブハイブリダイゼーション温度で、検出可能なプローブを、変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングさせる工程；
第二のアニーリング温度で、第二のプライマーを、変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングさせる工程であって、ここで、第二のアニーリング温度は、第一のアニーリング温度および伸長温度よりも低い、工程；
伸長温度で、プライマー伸長試薬を用いて第二のプライマーを伸長させて、二本鎖の核酸を生成する工程；ならびに
変性温度で、二本鎖標的核酸を第一鎖および第二鎖に変性させる工程。
【０００９】
本発明の上記の方法によって、検出可能なプローブは、未コピーの一本鎖標的にアニーリングされる。このハイブリダイゼーション事象は、例えば、このプローブが標識のレポーター／クエンチャー（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）対を有する場合に、ＦＲＥＴによって検出される。このプローブは、ＤＮＡであり得、そしてポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって切断され得る。あるいは、このプローブは、切断不能であり得る。このプローブは、核酸アナログモノマー単位（例えば、２−アミノエチルグリシン）を含む核酸アナログまたはキメラであり得る。このプローブは、ＰＮＡまたはＰＮＡ／ＤＮＡキメラであり得る。ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、レポーターおよびクエンチャーの対に隣接する核酸塩基単位を有する、２−アミノエチルグリシンの配列から構成され得る。
【００１０】
このプローブは、標的にハイブリダイズしたまま検出され得る。プローブの検出は、ＰＣＲ（リアルタイム）の間の各サイクルで実施され得る。あるいは、プローブは、ＰＣＲの最後（例えば、２〜５０サイクルの完了の後）、またはさらに、幾何級数的な増幅もしくは直線的な増幅の最後（終点）で検出または定量され得る。
【００１１】
プローブの検出後、第一のプライマーよりも低いＴｍを有する第二のプライマーは、一本鎖の標的に選択的にアニーリングされ、そして、標的のコピーを作製するために伸長される。プローブ検出を伴う非同調的熱サイクル方法は、多サイクル反復され得、ここで、この混合物は、規定された時間にわたる規定された温度での変性、アニーリングおよびプライマー伸長の工程をもたらす温度変化を経る。
【００１２】
非同調的熱サイクルプロトコールの１つの実施形態の間に、プローブは、増幅された核酸に特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズした場合、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性は、ヌクレオチド間切断によってプローブを分解し得、それによって、インタクトなプローブによって維持される分子内クエンチを除外する。このプローブは、増幅された標的核酸（アンプリコン）に特異的にハイブリダイズするように設計されることから、プローブの切断によって生じるＰＣＲ反応混合物由来の蛍光強度の増大は、増幅の進行（すなわち、標的配列の量および増幅の量）に相関し得る。
【００１３】
一般に、サンプル中の標的核酸は、ＤＮＡ、最も通常はゲノムＤＮＡの配列である。しかし、本発明はまた、他の核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはクローニングされたＤＮＡ）を用いて実行され得る。適切な標的核酸サンプルは、本発明において使用するための一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチドの相補的ポリヌクレオチド鎖を生成するための方法を含む。互いにハイブリダイズして塩基対形成構造体を形成し得る第一および第二の標的ポリヌクレオチドを含む混合物が獲得され、この混合物は、標的配列、第一の標的ポリヌクレオチドの第一の領域に相補的な第一のプライマー、および第二の標的ポリヌクレオチドの第二の領域に相補的な第二のプライマーを含み、その結果、第一および第二の領域は、標的配列に隣接する。第一のプライマーは、第一の温度で伸長されて、第二のプライマーが第二の領域に実質的にハイブリダイズしないような条件下で第一の標的鎖にハイブリダイズする第一の相補鎖を含む第一の複合体を形成する。第二のプライマーは、第一の温度よりも低い第二の温度で伸長されて、第二の標的鎖にハイブリダイズする第二の相補鎖を含む第二の複合体を形成する。第一の複合体および第二の複合体は、変性され得る。第一のプライマー伸長、第二のプライマー伸長、および変性の工程は、１以上のサイクルで反復され得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、過剰のｓｓアンプリコンを生成するための非同調的熱サイクル方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：
第一のアニーリング温度で、第一のプライマーを、変性した標的核酸の第一鎖にアニーリングさせる工程；
伸長温度または第一のアニーリング温度で、プライマー伸長試薬を用いて第一のプライマーを伸長させて、二本鎖の核酸を生成する工程であって、ここで、このプライマー伸長試薬は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド５’−トリホスフェートおよび緩衝液を含む、工程；
第二のアニーリング温度で、第二のプライマーを、変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングさせる工程であって、ここで、第二のアニーリング温度は、第一のアニーリング温度および伸長温度よりも低い、工程；
伸長温度で、プライマー伸長試薬を用いて第二のプライマーを伸長させて、二本鎖の核酸を生成する工程；ならびに
変性温度で、二本鎖標的を第一鎖および第二鎖に変性させる工程。
【００１６】
工程のサイクルは、２〜５０サイクルまたはそれ以上反復されて、二本鎖（ｄｓ）アンプリコンを生成し得る。第二のプライマーのアニーリングおよび第二のプライマーの伸長の工程は、最後の１以上のサイクルを省略されて、過剰の一本鎖（ｓｓ）アンプリコンを生成し得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、配列決定、すなわちハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）によってｃＤＮＡライブラリーを特徴付ける方法を含む。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、サンプル核酸中の標的配列の存在または非存在を検出する非同調的熱サイクルプロトコールによってＰＣＲアッセイを実行するために適切なキットに関する。このキットは、サンプル中の１以上の標的配列のリアルタイム検出または終点検出、あるいは定量を可能にし得る。１つの実施形態において、このキットは、約１０〜３０℃の異なる融点を有するプライマーを含む。このキットはまた、ＰＣＲまたは標的の測定および検出を実行するために選択される１以上のプローブ、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および他の試薬または組成物を含み得る。
【００１９】
（Ｖ．詳細な説明）
ここで本発明の特定の実施形態（これらの例は、添付の図面において例示される）を詳細に言及る。本発明は、例示的な実施形態と組み合わせて記載されるが、これは、発明をこれらの実施形態に制限することを意図しないことが理解される。これに反して、本発明は、全ての代替案、改変および等価物を含むことが意図される。これらは、請求される本発明の範囲に含まれ得る。
【００２０】
（Ｖ．１定義）
「核酸塩基」は、相補的な核酸塩基または核酸塩基アナログ（例えば、プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン）との対合においてＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合を形成し得る窒素含有複素環部分を意味する。代表的な核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン）および天然に存在する核酸塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−クアニン、２−チオーピリミジン、６−チオーグアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ^６−メチル−グアニン、Ｎ^６−メチル−アデニン、Ｏ^４−メチル−チミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドールおよびエテノアデニン）である（Ｆａｓｍａｎ（１９８９）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌｕａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３８５〜３９４頁，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆ１）。
【００２１】
「ヌクレオシド」は、リボース糖のＣ−１’炭素に結合した核酸塩基からなる化合物をいう。リボースは、置換されとも良いし、または置換されなくてもよい。置換されたリボース糖としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない；１つ以上の炭素原子（例えば、２’炭素）が、１つ以上の同じかまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ_２またはハロゲン基で置換されるリボース糖、ここで各Ｒは、独立してＨ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、またはＣ_５−Ｃ_１４アリールである。リボースの例としては、以下が挙げられる：リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−シクロリボースおよび２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル）、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’，４’−および３’，４’−結合ならびに他の「結合」または「ＬＮＡ」、二環状糖改変（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）。オリゴヌクレオチド内のＬＮＡ糖アナログは、以下の構造：
【００２２】
【化３】

によって示される。ここでＢは、任意の核酸塩基である。
【００２３】
リボースの２’位または３’位における改変としては、以下が挙げられる：水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然のＤ光学異性体形態およびＬ光学異性体形態を含む（Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：４１５９−６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９−７０）。核酸塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖は、核酸塩基のＮ^９位に結合する。核酸塩基が、ピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）の場合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ^１位に結合する（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，（１９９２）ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，第２版，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）。
【００２４】
「ヌクレオチド」は、モノマー単位としてまたは核酸内のヌクレオシドのリン酸エステルをいう。ヌクレオチドは、時々、リボース糖の構造的な特徴を特に指摘するために、「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」として示される。「ヌクレオチド５’−トリホスフェート」は、５’位におけるトリホスフェートエステル基を有するヌクレオチドをいう。トリホスフェートエステル基は、種々の酸素に対する置換イオウ置換を含み得る（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−トリホスフェート）。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、そしてヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマー（ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合連結またはヌクレオチ間アナログおよび関連するカウンターイオン（例えば、Ｈ^＋、ＮＨ_４ ^＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ^＋、Ｎａ^＋、など）によって結合される２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む）を意味する。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチドから、完全にリボヌクレオチドからまたはそれらの化学的混合物を構成し得る。ポリヌクレオチドは、核酸塩基アナログおよび糖アナログから構成され得る。ポリヌクレオチドは、典型的に、少数の単量体単位（例えば、これらが、オリゴヌクレオチドとして当該分野で頻繁にいわれる場合、５〜４０）から数千の単量体ヌクレオチド単位のサイズの範囲である。他に示さない限り、いつポリヌクレオチド配列が、示されようとも、これは、ヌクレオチドが、左から右の５’→３’順序であり、そして他に示さない限り、「Ａ」は、デオキシアデノシンを示し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを示し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」は、チミジンを示すことが理解される。
【００２６】
「ヌクレオチド間アナログ」は、オリゴヌクレオチドのリン酸エステルアナログまたは非リン酸アナログを意味する。リン酸エステルアナログとしては、以下が挙げられる：（ｉ）（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート）；（ｉｉ）ホスホラミダイト：（ｉｉｉ）（Ｃ_１−Ｃ_６）アルキルまたは置換アルキルホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエート。非リン酸アナログは、糖／リン酸部分が、アミド結合によって置換される場合、例えば、２−アミノエチルグリシン単位（通常、ＰＮＡとして称される）を含む（Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９７−１５００）。
【００２７】
「結合部位」とは、リンカーに共有的に結合するか、または共有的に結合し得る、部分または分子（例えば、色素、ヌクレオチドまたはＰＮＡ）における部位を意味する。
【００２８】
「リンカー」とは、１つの部分または分子（例えば、色素をポリヌクレオチドに、または１つの色素と別の色素に共有結合する）を共有結合するケ有結合される原子の鎖をいう。
【００２９】
「反応性結合基」は、別の分子と反応して、共有結合を形成し得る化学的に反応性の置換基または部分（例えば、求核剤または求電子剤）をいう。
【００３０】
「複素環」とは、環系を伴う分子をいい、ここで、１つ以上の環原子は、ヘテロ原子（例えば、窒素、酸素およびイオウ（炭素に対して））である。
【００３１】
「酵素学的に伸長可能な」は、以下のヌクレオチドをいう：（ｉ）ポリメラーゼ酵素の作用を介してポリヌクレオチド鎖の末端に酵素学的に組み込まれ得るヌクレオチド、および（ｉｉ）さらにプライマー伸長を支持し得るヌクレオチド。酵素学的に伸長可能なヌクレオチドとしては、ヌクレオチド５’−トリホスフェート、すなわち、ｄＮＴＰおよびＮＴＰが挙げられる。
【００３２】
「酵素学的に組み込み可能な」とは、ポリメラーゼ酵素の作用を介してポリヌクレオチド鎖の末端に酵素学的に組み込まれ得るヌクレオチドをいう。酵素学的に組み込み可能なヌクレオチドとしては、ｄＮＴＰ、ＮＴＰおよび２’，３’−ジデオキシ、ヌクレオチド５’−トリホスフェート、すなわち、ｄｄＮＴＰが挙げられる。
【００３３】
「標的配列」とは、相補的なポリヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）とのハイブリダイズの対象であるポリヌクレオチド配列を意味する。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログそしてそれらの組み合わせをから構成され得る。
【００３４】
用語「プローブ」とは、標的核酸の配列との相補的な塩基対形成による二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを意味する。本発明において、プローブは、例えば、蛍光色素、または蛍光レポーター色素およびクエンチャーから構成される標識の組を用いて、検出可能に標識され得る。
【００３５】
用語「標識」とは、分子に結合し得、そして：（ｉ）検出可能なシグナルを提供するか；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第２の標識（例えば、ＦＲＥＴ）によって提供される検出可能なシグナルを改変するか；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション（すなわち、二重鎖形成）を安定化するかまたは（ｉｖ）捕捉部分（すなわち、親和性、抗体／抗原、イオン性錯体化）を提供する任意の部分をいう。標識化は、公知の標識、結合、結合基、試薬、反応条件ならびに分析方法および精製方法を使用する、多くの公知の技術のうちのいずれかを使用して達成され得る。標識としては、蛍光、化学発光または生物発光によって検出可能なシグナルを生じる光放射化合物が挙げられる（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．ｉｎ　Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，３−２８頁）。標識の別のクラスは、二重鎖のハイブリダイゼーションを増大、安定化、または影響を与えるのに役立つハイブリダイゼーション安定化部分である（例えば、インターカレーター、副溝結合剤および架橋官能基）（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編，「ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１５−８１頁）。標識のなお別のクラスは、特異的な捕捉基または非特異的な捕捉基によって分子の分離または固定化をもたらす（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンおよび他のハプテン）（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）　ｉｎ　ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｏｘｆｏｒｄ，３９−５４頁）。
【００３６】
用語「クエンチング」とは、機構に関係なく第２の部分（クエンチャー）によって起こされる第１の部分（レポーター色素）の蛍光の減少することをいう。
【００３７】
本明細書中において使用される場合、「キメラ」は、１つ以上のヌクレオチドおよび１つ以上のヌクレオチドアナログ単位を含むオリゴヌクレオチドをいう。
【００３８】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、交換可能に使用され、そして二重鎖構造または他の高次構造の形成を生じる別の核酸と１つの核酸の塩基対形成相互作用を意味する。第１の相互作用は、塩基特異的である（すなわち、Ｗａｔｓｏｎ／ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合によるＡ／ＴおよびＧ／Ｃ）である。
【００３９】
用語「終点分析」は、反応が、実質的に完全である場合、データ収集が生じる方法をいう。
【００４０】
用語「リアルタイム分析」は、ＰＣＲの間の定期的なモニタリングをいう。特定の系（例えば、ＡＢＩ　７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ））は、予め決定した時点または使用者が規定した時点で各熱サイクルの間モニタリングを実行する。ＦＲＥＴプローブを用いたＰＣＲのリアルタイム分析は、サイクルからサイクルの蛍光色素の変化（好ましくは、任意の内部コントロールシグナルを差し引いて）を測定する。
【００４１】
（Ｖ．２ａ．プライマーおよびプローブの合成）
オリゴヌクレオチドは、市販のホスホラミダイトヌクレオシド（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，４１５，７３２号）、支持体（例えば、シリカ、制御された細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，４５８，０６６号）およびポリスチレン（Ａｎｄｒｕｓ，米国特許第５，０４７，５２４号および同５，２６２，５３０号）ならびに自動合成機（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，４５８，０６６号；Ｍｏｄｅｌｓ　３９２，３９４，３９４８，３９００　ＤＮＡ／ＲＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，　ＣＡ）を使用して、ホスホラミダイト方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，米国特許第４，９７３，６７９号；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４８：２２２３−２３１１）によって固体支持体において通常合成される。
【００４２】
（Ｖ．２ｂ．プライマーおよびプローブ設計および選択）
非同調的熱サイクルプロトコールを実施するため、および伝統的かつ非同調的熱サイクルプロトコールを用いた比較実験のためのＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を使用して設計され得る。他のオリゴヌクレオチド選択および評価ソフトウェアプログラムは、報告または市販されている。標的核酸配列は、データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．　ｎｉｈ．ｇｏｖ／；Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０００　Ｊａｎ　１；２８（１）：１５−８））のような遺伝子コードから入力されるかまたは読み込まれる。いくつかの実施形態において、標的に相補的なプライマーの結合部位の位置は、特定の部位において特定の長さのアンプリコンを増幅するために選択される。他の実施形態において、汎用なプライマー（すなわち、無作為にプライミングするプライマーまたは重複した冗長な塩基対を形成するヌクレオチドまたは乱交雑な塩基対を形成するヌクレオチドを用いてプライマーのセット）の使用における場合、プライマーの結合部位は、未知であり得る。
【００４３】
加熱において、二重鎖は、融解し、そして濃色効果のシフトを起こす。特定のプライマーまたはプローブについてのＴｍは、集団の半数が、標的にハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、吸光度（例えば、２６０ｎｍ）対温度をプロットすることによって生じる特徴的な正弦波における変曲点として示される。ハイブリダイゼーション親和性は、プライマーの長さ、Ｇ＋Ｃ含量、塩濃度、プライマーの化学的改変（例えば、２’−Ｏ−メチル（Ｓｔｕｍｐ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：４６４２−４８））、プライマーにおける標識、および安定化し得る試薬（例えば、インターカレーター）または不安定化し得る試薬（例えば、変性剤）、二重鎖形成によって影響を受ける。プライマーおよびプローブのＴｍ値は、配列、長さ、Ｇ＋Ｃ含量およびハイブリダイゼーション安定化改変を含むパラメーターのいくつかの組み合わせの選択によって設計され得て、特定の非同調的熱サイクルプロトコールにおける十分な増幅をもたらす特定のＴｍ値を有する。
【００４４】
非同調的ＰＣＲ法において使用されるプライマーの配列および長さは、第２の、より低い温度で融解するプライマーが、標的にアニーリングしない第１のアニーリング温度で、第１の、より高い温度で融解するプライマーとの標的とするアニーリングが、起きるように選択される。プライマーの組または組のセットは、より高い温度で融解するプライマーとより低い温度で融解するプライマーとの間のＴｍにおける約１０〜３０℃の差異を確立するように選択される。例として、図２は、より高い温度で融解するプライマーの組は、約６０〜７０℃のＴｍを有するように設計され得、そしてより低い温度で融解するプライマーの組は、約４５〜５５℃のＴｍを有するように選択され得る。Ｔｍ値は、標準的な塩基対形成および最隣接のアルゴリズムを使用して推定され得る。典型的には、標的とのプライマーおよびプローブのアニーリングは、二重鎖の推定融解温度、１０℃下までの温度で実施される（Ａｕｓｕｂｅｌら編「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＤＮＡ」，および「Ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ」ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９３）Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。
【００４５】
プローブについてのＴｍ値は、より短く、高親和性のプローブ（例えば、ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ）を除いて、６８〜７０℃であり得る。これは、より低いＴｍを有し得る。プローブ配列は、標的ポリヌクレオチドに相補的であるように選択され、そして標的のプライマー結合部位間にある。プローブ配列は、第２の、より低いＴｍプライマーによって伸長される鎖に相補的であるように選択されるべきである。この鎖は、他の鎖をコピーするために第１の、より高いＴｍプライマーにアニーリングおよび伸長の後、実質的に一本鎖になる（図１）。プローブ配列は、レポーター色素標識およびクエンチャー標識の実行される近接を支持する非標的特異的な、自己相補的な配列を含むように設計され得る。自己相補的な配列は、プローブの５’末端および３’末端に位置し得る。このような「ヘアピン」配列は、分子間「ステム」領域および非塩基対形成「ループ」領域を有する。標的への結合において、レポーター色素およびクエンチャーは、空間的に分離され、そして蛍光は、増大する。
【００４６】
プローブは、ＰＣＲの間、ポリメラーゼによって伸長不可能であるように設計される。ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、一般に、ポリメラーゼに対する基質ではない。ＤＮＡプローブは、３’ヒドロキシルにおいて、３’リン酸基または他の基で３’末端をブロックするかあるいは３’末端ヌクレオチドの核酸塩基をブロックすることによって伸長不可能にされ得る（Ｌｉｖａｋ，米国特許第５，７２３，５９１号）。
【００４７】
（Ｖ２ｃ．核酸アナログ）
核酸アナログは、ＤＮＡおよびＲＮＡの構造的なアナログであり、そして相補的な核酸配列にハイブリダイズするように設計される。ヌクレオチド間結合の改変を介して、本発明の糖および／または核酸塩基、核酸アナログは、以下の所望の性質のいずれかまたは全てを達成し得る：１）最適化されたハイブリダイゼーション特異性または親和性、２）ヌクレアーゼ耐性、３）化学的安定性、４）可溶性、５）膜透過性ならびに６）合成および精製の容易さまたは低費用。
【００４８】
核酸アナログの有用かつアクセス可能なクラスは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のファミリーであり、ここで、ＤＮＡまたはＲＮＡの糖／リン酸骨格は、非環式、アキラルおよび中性のポリアミド結合に置換される。アミド骨格を介して連鎖に結合される核酸塩基を有する２−アミノエチルグリシンポリアミド連結は、ＰＮＡの実施形態として非常に研究されており、そして例外的なハイブリダイゼーション特異性および親和性を有することが示される（Ｂｕｃｈａｒｄｔ，ＷＯ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：１４９７−１５００；Ｅｇｈｏｌｍ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６−６８）。
【００４９】
（Ｖ．２ｄ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴ　プローブ）
ＰＮＡは、平行方向または逆平行方向のいずれかにおいてその標的相補鎖にハイブリダイズし得る。しかし、逆平行二重鎖（ＰＮＡのカルボキシル末端が、ＤＮＡの５’末端と整列化され、そしてＰＮＡのアミノ末端が、ＤＮＡの３’末端と整列化される場合）は、典型的により安定である（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６５：５６６−６８）。ＰＮＡプローブは、高い特異性および親和性を有する標的ＤＮＡ配列に結合することが公知である（Ｃｏｕｌｌ，米国特許第６，１１０，６７６号）。レポーター部分およびクエンチャー部分を有する、本発明のＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブの例は、ＰＮＡが、標的配列に逆平行方向にアニーリングするように設計される。相補的な標的配列に結合されるＰＮＡプローブは、一般に、ＰＣＲの間ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって認められるほどには開裂しない、ハイブリダイズのみが、レポーター部分およびクエンチャー部分の十分な分離を起こして、クエンチングの減少によって蛍光の増大を生じる（図５）。
【００５０】
ＰＮＡは、任意の規模で合成され得る。最も好都合なことに、ＰＮＡは、ＸＡＬまたはＰＡＬ支持体を備えるＥｘｐｅｄｉｔｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；あるいはＭＢＨＡ支持体を備えるＭｏｄｅｌ　４３３Ａ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；あるいは他の自動化合成機においてＦｍｏｃ／Ｂｈｏｃ、ｔＢｏｃ／Ｚ、またはＭＭＴ保護基モノマーを使用して、２μモルの規模で合成される。ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、一般に、ペプチド合成に使用される多くの固体支持体において合成され得る。固相ペプチド合成の総説に関して、Ｊ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｙｏｕｎｇ，「Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４；Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，「Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ」，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９；Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ（編）「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，第３５巻：Ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４），９１頁；Ｇ．Ｇｒａｎｔ（編），「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９２；Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ．（１９９０）３５：１６１；Ａ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ　ｉｎ「ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ＩＩＩ」，Ｒ．Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ，１９９２，２１９頁；Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（編），「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：第２８９巻」，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９７；Ｗ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，「Ｆｍｏｃ　ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，２０００；Ｐ．Ｌｌｏｙｄ−ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＦ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ（編），「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ　１９９７を参照のこと。
【００５１】
合成が完了した後、粗ＰＮＡは、例えば、トリフルオロ酢酸を用いて、支持対から開裂され得、次いで、ジエチルエーテルを用いて沈殿され、そしてジエチルエーテルで２回洗浄される。ＰＮＡは、逆相ＨＰＬＣによって精製され得、質量分析法によって分析され得、そして質量を使用して２６０ｎｍの吸光度の補正することによって、定量化され得る。蛍光標識ＰＮＡプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおける所望の性質を実証する（Ｈｙｌｄｉｇ−Ｎｉｅｌｓｅｎ，米国特許第５，９８５，５６３号；Ｃｏｕｌｌ，ＷＯ９８／２４９３３；Ｃｏｕｌｌ，ＷＯ９９／２２０１８；Ｇｉｌｄｅａ，ＷＯ９９／２１８８１；Ｃｏｕｌｌ，ＷＯ９９／４９２９３）。
【００５２】
ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、別個のＰＮＡ部分およびヌクレオチド部分を伴うオリゴマー分子である。これらは、実質的に任意の組換せまたは配列におけるＰＮＡモノマーおよびヌクレオチドを共有結合することによって合成され得る。効率的かつ自動化された方法は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラ合成のために開発されている（Ｖｉｎａｙａｋ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１６：１６５３−５６；Ｕｈｌｍａｎｎ（１９９６）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔｌ．編，Ｅｎｇ．３５：２６３２−３５；Ｕｈｌｍａｎｎ，ＥＰ　８２９５４２；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌａａｎ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．３８：２２４９−５２；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌａａｎ（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：６６３−６８）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、ＰＮＡおよびＤＮＡに見られる所望の性質（例えば、ＰＮＡのより良いハイブリダイゼーション性質およびＤＮＡのような生物学的機能（ＤＮＡ部分の３’ＯＨ末端を介するプライマー伸長を含む））を有するように設計される（Ｕｈｌｍａｎｎ（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：１０４５−５２）。
【００５３】
ＰＮＡモノマー単位と標識の間のリンカーは、以下を含む：（ｉ）共有結合；（ｉｉ）アルキリジイルスペーサー−（ＣＨ_２）_ｎ−、ここでｎは、１〜１２である；（ｉｉｉ）エチレンオキシ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−、ここでｎは、１〜１２である；（ｉｖ）アリールジイル（Ｃ_６−Ｃ_２０）；または（ｖ）１つ以上のアミノ酸。リジン側鎖、アスパラギン酸側鎖およびグルタミン酸側鎖は、ＰＮＡ、ＦＲＥＴプローブにおける連鎖部位であり得る。リジンの側鎖のε−アミノ基は、標識（例えば、レポーター色素またはクエンチャー）の結合のための反応連結基であり得る。リンカーは、典型的には、ＰＮＡモノマー単位および固体支持体との縮合のための適合性のある保護基および反応性機能基を伴う対応するモノマー単位によってＰＮＡのアミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合される。例えば、「Ｏリンカー」（２−（２−アミノエトキシ）酢酸）の単位）は、任意のＰＮＡ骨格アミノ基または固体支持体のアミノ官能基のアミノ末端に結合し得る。
【００５４】
（Ｖ．２ｅ　標識化）
標識されたオリゴヌクレオチドは、当該分野において周知の方法（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．４０−５５頁，６４３−７１を参照のこと）を使用して、適切な反応性標識と適切な溶媒中のオリゴヌクレオチドと適切な溶媒（両方とも可溶性である）中で反応させることによって形成され得る。粗標識化オリゴヌクレオチドは、任意の開始物質または所望でない副産物から精製され得、そして後の使用のために（好ましくは、低温で）乾燥貯蔵され得るか、または溶液中で貯蔵され得る。
【００５５】
標識は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに対する、１つの結合を介す共有結合性結合のための、１つの置換基の位置における反応性連結基（例えば、フルオレセインまたはローダミンの５−カルボキシまたは６−カルボキシ）の１つに反応性連結基を有し得る。一般に、この標識とオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドとを連結する結合は、（ｉ）プライマー伸長を妨害すべきではなく、（ｉｉ）ポリメラーゼ活性を阻害すべきではなく、また（ｉｉｉ）色素標識の蛍光特性に悪影響（例えば、クエンチまたは漂白）を与えるべきではない。反応性連結基は、共有結合の形成が可能な部分であり、代表的にはオリゴヌクレオチド上の求核性基（例えば、アミンおよびチオール）との反応が可能な求電子性官能基である。反応性連結基の例としては、活性エステル、例えば、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、スルホン酸エステル、シリルハライド，２，６−ジクロロトリアジニル、ホスホルアミダイト、マレイミド、ハロアセチル、エポキシド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリル、アルデヒド、ケトン、アシルアジド、無水物、およびヨードアセトアミドが挙げられる。活性エステルとしては、スクシンイミジル（ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾーリル（ＨＯＢｔ）およびペンタフルオロフェニルエステルが挙げられる。
【００５６】
蛍光色素の１つの反応性連結基は、この蛍光色素のカルボキシル置換基のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）である。この色素のＮＨＳエステルは実施され得、単離され得、精製され得、そして／また特徴付けられ得、あるいはこれはインサイチュで形成され得、そしてオリゴヌクレオチドの求核性基と反応し得る。代表的には、この色素のカルボキシル形態は、以下の幾つかの組み合わせと反応することによって活性化されて、この色素のＮＨＳエステルを与える：（１）カルボジイミド試薬、（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ジイソプロピルカルボジイミド、またはウロニウム（ｕｒｏｎｉｕｍ）試薬、（例えば、ＴＳＴＵ（Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、ＨＢＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオホスフェート）、またはＨＡＴＵ（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート））；（２）アクチベーター（例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ））；および（３）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド。
【００５７】
標識の別の反応性連結基は、蛍光色素、クエンチャー、小溝結合剤、および移動度改変因子（ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｒ）のホスホルアミダイト形態である。ホスホルアミダイト色素試薬は、標識化されたオリゴヌクレオチドの自動合成機にとって特に有用である。このホスホルアミダイト試薬は、ヌクレオシド性（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ）であるか、または非ヌクレオシド性（ｎｏｎ−ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ）であり得る。非ヌクレオシド性形態のホスホルアミダイト色素試薬は、以下の一般式：
【００５８】
【化４】

を有し、そしてこの試薬は、単一蛍光色素でのオリゴヌクレオチドの標識化を達成する。ＤＹＥは、保護された蛍光色素または保護されていない蛍光色素である。あるいは、蛍光色素の代りに、ＤＹＥは、クエンチャー、小溝結合剤、または移動度改変因子であり得る。Ｌは、リンカーである。Ｒ^２４およびＲ^２５は別個に、Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル、Ｃ_４−Ｃ_１０アリール、および１０までの炭素原子を含むシクロアルキルであり得るか、またはＲ^２４およびＲ^２５は、ホスホルアミダイト窒素原子と一緒になって飽和窒素複素環式を形成する。Ｒ^２６は、オリゴヌクレオチドの望まない伸長を阻止する亜リン酸エステル保護基である。一般に、Ｒ^２６は、オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であり、さらに、合成オリゴヌクレオチド生成物から、オリゴヌクレオチドまたはこの色素の完全性への悪影響を与えない試薬を用いて取り除かれ得る。Ｒ^２６は、（ｉ）メチル、（ｉｉ）２−シアノエチル；−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ、または（ｉｉｉ）２−（４−ニトロフェニル）エチル；−ＣＨ_２ＣＨ_２（ｐ−ＮＯ_２Ｐｈ）であり得る。
【００５９】
上記の一般的なホスホルアミダイト色素試薬は、ヒドロキシル基（例えば、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドの５’末端のＯＨ）と穏やかな酸活性化下で反応し、ヌクレオチド間亜リン酸基を形成し、次いでこの亜リン酸基は、ヌクレオチド間リン酸基へと酸化される。いくつかの例において、この色素は、ホスホルアミダイト試薬の合成の間、またはこれに続く分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を標識するための使用の間のいずれかで、保護を必要とする官能基を含み得る。使用される保護基は、官能基の性質に依存し、そしてこれは当業者にとって明らかである（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１）。この色素は、３’から５’への方向の合成結果として、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。ヌクレオシド性および非ヌクレオシド性である、他のホスホルアミダイト色素試薬は、オリゴヌクレオチドの他の部位（例えば、３’末端、核酸塩基、ヌクレオチド間結合、糖）で標識を可能にする。核酸塩基、ヌクレオチド間結合、および糖部位での標識によって、蛍光色素での、内部標識および複数の標識が可能なる。
【００６０】
ヌクレオチド５’−トリホスフェートは、本発明の特定の実施形態における使用のために標識され得る。ヌクレオチドの、糖部分または核酸塩基部分は、標識され得る。核酸塩基標識部位としては、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基の７−Ｃまたは８−Ｃ、およびピリミジン核酸塩基の５−位置が挙げられる。この標識されたヌクレオチドは、酵素的に取りこみ可能であり、かつ酵素的に伸長可能である。標識されたヌクレオチド５’−トリホスフェートは、以下の式：
【００６１】
【化５】

を有し、ここで、ＤＹＥは、エネルギー転移色素（ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｄｙｅ）を含む、保護された色素または保護されていない色素である。あるいは、ＤＹＥは、クエンチャー、ビオチン、小溝結合剤、または移動度改変因子であり得る。Ｂは、核酸塩基、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８デアザグアノシンである。Ｒ^１９は、トリホスフェート、チオホスフェート、またはホスフェートエステルアナログである。Ｒ^２０およびＲ^２１は、単独の場合、各々独立して、Ｈ、ＨＯ、およびＦである。リンカーＬとしては、アルキニル基、プロパルギル基、プロパルギルエトキシアミド基、ビニル基、およびアリル基が挙げられ得る。例えば、Ｌは以下：
【００６２】
【化６】

であり得、ここで、ｎは、０、１、または２である（Ｋｈａｎ，米国特許第５，７７０，７１６号および同第５，８２１，３５６号；Ｈｏｂｂｓ，米国特許第５，１５１，５０７号）。
【００６３】
核酸塩基標識された、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、以下の式を有し得る：
【００６４】
【化７】

ここで、このプライマーまたはプローブは、２〜１００ヌクレオチドを含む。ＤＹＥは、蛍光色素（エネルギー転移色素を含む）である。Ｂは、核酸塩基であって、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン，７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシンである。Ｌは、リンカーであって、例えば、プロパルギル、プロパルギルエトキシアミド、アリル、ビニル、またはＣ_１−Ｃ_１２アルキルジイルである。Ｒ^２１は、Ｈ，ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＯＣＨ_３、または−ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２である。Ｒ^２２は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｒ^２３は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。この実施形態において、この核酸塩基標識化オリゴヌクレオチドは、核酸塩基を介して結合する、複数の蛍光標識、例えば、色素を保持し得る。核酸塩基標識化オリゴヌクレオチドは、以下によって形成され得る：（ｉ）酵素的に取り込み可能なヌクレオチド試薬（ここで、Ｒ^ｌ９は、トリホスフェートである）の、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼによる酵素的な取り込み、および（ｉｉ）自動合成によるヌクレオチドホスホルアミダイト試薬のカップリング（Ｔｈｅｉｓｅｎ（１９９２）、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｄｙｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｎｏ．２７，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．９９−１００）。ところが、核酸塩基が標識化されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の取り込み可能ヌクレオチドの取り込みによって複数標識され得、ホスホルアミダイト色素標識試薬での標識によって、５’で１つ標識化されたオリゴヌクレオチドを生じ、これは以下の式に従う：
【００６５】
【化８】

ここで、Ｘは、Ｏ、ＮＨ、またはＳであり；Ｒ^２１は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＯＣＨ_３、または−ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２であり；Ｒ^２２は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログであり；およびＲ^２３は、Ｈ、ホスフェート、ヌクレオチド間ホスホジエステル、またはヌクレオチド間アナログである。Ｌはリンカーであり、Ｃ_１−Ｃ_ｌ２アルキルジイル、例えば、ｎ−ヘキシルジイル、アリールジイル、またはポリエチレンオキシ（米国特許第４，７５７，１４１号；Ａｎｄｒｕｓ、”Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ”（１９９５）ｉｎ　ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．ｐｐ．４０−５５，６４３−７１；Ｍｕｌｌａｈ（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１）を含む。
【００６６】
種々の標識は、オリゴヌクレオチドプローブの３末端に共有結合的に結合され得る。標識を保有するか、または合成後反応によって標識され得る官能基を保有する、固体支持体は、オリゴヌクレオチド合成のための固体支持体として使用され得る（米国特許第５，１４１，８１３号；同第５，２３１，１９１号、同第５，４０１，８３７号；同第５，７３６，６２６号）。このアプローチによって、この標識またはこの官能基は、オリゴヌクレオチドの合成の間に存在する。切断および脱保護の間、この標識または官能基は、オリゴヌクレオチドに共有結合したままである。３’末端において標識されるオリゴヌクレオチドプローブは、以下の式を有し得る：
【００６７】
【化９】

ここで、このプローブは、２〜１００ヌクレオチドを含む。ＤＹＥは、蛍光色素、クエンチャー、小溝結合剤または他の標識であり得る。ＤＹＥは、標識（例えば、小溝結合剤およびクエンチャー）の組み合わせであり得る。Ｂは、核酸塩基、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、および８−デアザグアノシンである。Ｌは、リンカー、例えば、プロパルギル、プロパルギルエトキシアミド、アリル、ビニル、またはＣ_１−Ｃ_１２アルキルジイルである。Ｒ^２１は、Ｈ、ＯＨ、ハライド、アジド、アミン、Ｃ_１−Ｃ_６アミノアルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、アリル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、−ＯＣＨ_３、または−ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２である。Ｒ^２３は、ヌクレオチド間ホスホジエステルまたはヌクレオチド間アナログである。
【００６８】
１つの合成後化学標識方法において、オリゴヌクレオチドは以下のように標識される：ＮＨＳ形態の６−カルボキシフルオレセインを、ＤＭＳＯに溶解または懸濁し、そして、０．２５Ｍ重炭酸／炭酸緩衝液中の５’−アミノへキシルオリゴヌクレオチドに対して、過剰（１０〜２０倍）に約ｐＨ９で、添加し、６時間反応させる（Ｆｕｎｇ、米国特許第４，７５７，１４１号）。色素標識されたオリゴヌクレオチド生成物は、緩衝液、例えば、０．１モル濃度の酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）で溶出する、サイズ除去クロマトグラフィーカラムを通過させることによって未反応の色素から分離され得る。例えば、この粗標識化オリゴヌクレオチドを含むこの画分は、勾配溶離を使用する逆相ＨＰＬＣによってさらに精製され得る。
本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、電気泳動移動の速度に影響を与える部分、すなわち移動度改変標識で標識され得る。移動度改変標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ビオチン、蛍光色素、コレステロール、およびポリエチレンオキシ単位、―（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−（ここで、ｎは１〜１００であり得る）（Ｇｒｏｓｓｍａｎ，米国特許第５，６２４，８００号）。好ましくは、ｎは２〜２０である。このポリエチレンオキシ単位は、リン酸基と共に散在され得る。蛍光標識プライマーを、別個で既知サイズであるポリエチレンオキシのさらなる標識で特異的に標識することによって、アンプリコンのサイズ（すなわちヌクレオチドの数）に実質的に依存しないアンプリコンの電気永動による分離を可能にする。すなわち、同じ長さのポリヌクレオチドは、分光学的に分離可能な色素標識の検出によって区別され得、そして移動度改変標識に基づいて分離され得る。色素標識および移動度改変標識の両方を保持するポリヌクレオチドは、単一標識したオリゴヌクレオチド成分または単一標識したヌクレオチド成分の、連結またはポリメラーゼ伸長、例えば、非同調的ＰＣＲによって、酵素的に形成され得る。
標識の１つのクラスは、蛍光、化学発光、および電気化学的発光によって、標識された伸長生成物および標識された増幅生成物の検出のためのシグナルを提供する（Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．　Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．３−２８）。化学発光標識としては、１，２−ジオキセタン化合物（米国特許第４，９３１，２２３号；Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ（１９９４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２１９：１６９−８１）が挙げられる。プローブ、プライマー、およびヌクレオチド５’−トリホスフェートの標識化のために有用な蛍光色素としては、フルオレセイン，ローダミン（米国特許第５，３６６，８６０号；同第５，９３６，０８７号；同第６，０５１，７１９号）、シアニン（Ｋｕｂｉｓｔａ，ＷＯ　９７／４５５３９）、および金属ポルフィリン錯体（Ｓｔａｎｔｏｎ，ＷＯ　８８／０４７７７）が挙げられる。
【００６９】
蛍光レポーター色素としては、キサンテン化合物（例えば、フルオレセインＩおよびローダミンＩＩ：
【００７０】
【化１０】

）が挙げられる。
【００７１】
ＩおよびＩＩの環の位置は、置換され得る。ＩＩのアミノＲ基は、置換され得る。これらの置換基は、本発明のプライマー、プローブおよびヌクレオチドに対する共有結合を含む。ＩおよびＩＩの例としては、Ｘが、カルボキシル基、クロロ基、および他の基で置換されたフェニルである場合（米国特許第５，８４７，１６２号；同第６，０２５，５０５号；同第５，６５４，４４２号；同第５，１８８，９３４号；同第５，８８５，７７８号；同第６，００８，３７９号；同第６，０２０，４８１号；同第５，９３６，０８７号）、およびＸが水素である場合（Ｂｅｎｓｏｎ，米国特許第．６，０５１，７１９）が挙げられる。
【００７２】
プローブ標識の別のクラスとしては、蛍光クエンチャーが挙げられる。クエンチャーの発光スペクトルは、蛍光色素の蛍光が、分子間の蛍光色素とオーバーラップし、その結果、蛍光共鳴エネルギー転移「ＦＲＥＴ」現象によって減少またはクエンチされる（Ｃｌｅｇｇ（１９９２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１１：３５３−３８８）。発蛍光団からクエンチャーへのエネルギー転移を許容する配置で、プローブに結合された、蛍光レポーター色素およびクエンチャーは、蛍光色素による蛍光の減少を生じ得る。このレポーターは、化学反応によって励起して化学発光を生成するか、または光吸収によって励起して蛍光を生成するかのいずれかである、蛍光化合物である。このクエンチャーは、レポーターと相互作用して、発光を変更し、通常はこのレポーターの発光効率を減少し得る。このクエンチ減少の効率は、レポーター分子とクエンチャー分子との間の距離に直接的に相関する（Ｙａｒｏｎ（１９７９）　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−３５）。この自己クエンチ効果は、プローブのその相補体に対するハイブリダイゼーションの際、または蛍光レポーターおよびクエンチャーが分離してすぐのヌクレアーゼ切断の際に減少され得るか、または消失され得る（図５）。
特定のクエンチャーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）以下からなる群より選択されるローダミン色素：テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラプロパノ−６−カルボキシローダミン（ＲＯＸ）（Ｂｅｒｇｏｔ，米国特許第５，３６６，８６０号）：
【００７３】
【化１１】

（ｉｉ）アリールジアゾ化合物（例えば、ＤＡＢＳＹＬおよびＤＡＢＣＹＬ）、１つ以上のさらなるジアゾ基を含むホモログ；例えば、Ｆａｓｔ　Ｂｌａｃｋ，（Ｎａｒｄｏｎｅ、米国特許番号第６，１１７，９８６号）、および以下の構造に従う、置換化合物（ここでＺは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１４アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、ＮＲ_２、−ＯＲ、およびＣＯ_２Ｈのような置換基であり、ここで各Ｒは、独立してＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたはＣ_５〜Ｃ_１４アリールである：
【００７４】
【化１２】

（ｉｉｉ）シアニン色素（Ｌｅｅ，米国特許第６，０８０，８６８号）（例えば、ＮＴＢ：
【００７５】
【化１３】

）および、（ｉｖ）他の発色団（例えば、アントラキノン化合物、マラカイトグリーン化合物、ニトロチアゾール化合物、およびニトロイミダゾール化合物など）。このＸ基は、本発明の方法の、プライマー、プローブ、およびヌクレオチド５−トリホスフェートの共有結合部位である。
標識の別のクラスは、特異的捕捉手段または非特異的捕捉手段による、標識化したアンプリコンの分離および固定を実施する役割を果たす（例えば、ビオチン；２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；およびジゴキシゲニン（Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）　ＰＣＲ　２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．３９−５４））。
【００７６】
標識の別のクラスは、移動度改変因子（例えば、ポリエチレンオキシ（ＰＥＯ）単位）である。このＰＥＯ標識は、荷電基（例えば、ホスホジエステル）が含まれ得、電荷を与え、そして電気泳動移動度（速度）を上昇する。このＰＥＯ標識は、非荷電であり得、そして電気泳動移動度またはクロマトグラフィー移動度を抑制するように作用する。このような改変因子は、例えば、蛍光検出による分析の間、増幅生成物の電気泳動速度に影響を与えるかまた標準化するように働き、分解能および分離を改善する（米国特許第５，４７０，７０５号）。
【００７７】
プローブ標識およびプライマー標識の別のクラスは、本明細書中でハイブリダイゼーションスタビライザーとして称され、これには以下が挙げられるが、これらに限定されない：小溝結合剤、インターカレーター、ポリカチオン（例えば、ポリリジンおよびスペルミン）、および架橋官能基。ハイブリダイゼーションスタビライザーは、プライマーと標的との、またはプローブと標的との塩基対合の安定性、すなわち親和性またはハイブリダイゼーションの速度を増加し得る（Ｃｏｒｅｙ（１９９５）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：９３７３−７４）。ハイブリダイゼーションスタビライザーは、完全に相補的なオリゴヌクレオチド配列と標的配列との間のＴｍの大きな差違で例示される、塩基対形成の特異性を増加すように働き、ここで、得られる２重鎖は、１つ以上のワトソン／クリック塩基対形成のミスマッチを含む（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編「ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．　１５−８１および３３７−４６）。小溝結合剤としては、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８　Ｒａｊｕｒ、（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５２３−２９）、ＭＧＢ１（Ｇｏｎｇ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４０：５５７−６０）およびＣＤＰＩ_１−３（米国特許第．５，８０１，１５５；ＷＯ　９６／３２４９６）、例えば、ＣＤＰＩ３：
【００７８】
【化１４】

が挙げられる。
【００７９】
（Ｖ．３　非同調的熱サイクルプロトコール）
本発明は、標的核酸のＰＣＲ増幅のための新規の非同調的熱サイクル方法を含む。標的は、プライマーの伸長および増幅が可能な任意のポリヌクレオチドであり得る。標的核酸としては、例えば、プラスミド、ｃＤＮＡ，アンプリコン、ゲノムＤＮＡ、制限消化ＤＮＡ、および連結生成物が挙げられる。標的核酸は、様々な反復配列および単一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、多型であり得る。この方法は、異なるＴｍ値のプライマーを使用する、多段階のアニーリングおよび伸長プロセスを使用する。このＰＣＲ増幅試薬は、プライマー伸長試薬（例えば、ポリメラーゼ）、ヌクレオチド５’−トリホスフェート、および緩衝液を含む。２つの有意な利点が、以下この方法のから認識され得る：（１）２本鎖標的よりもむしろ１本鎖標的の、ＰＣＲ混合物中に存在するプローブでの標的化、および（２）１本鎖アンプリコンの過剰な生成または主要な生成。
【００８０】
この本発明の熱サイクルプロトコールは、代表的には、規定された温度における、１連の時限工程を含む。一連の工程は、ＰＣＲプロセスが完了するまで、または所望の成果（例えば、特定のシグナル検出、またはデータの回収）が達成されるまで反復され得る。これらの工程の個々のパラメーターは、以下を含むＰＣＲ中の各事象を最適化するように選択される：（１）変性（１本鎖への二重鎖の熱融解）；（２）アニーリング（標的に対するプライマーのハイブリダイゼーション）；および（３）プライマー伸長（酵素的に伸長可能なヌクレオチドの取り込み）。いくつかのプロトコールにおいて、プローブハイブリダイゼーション工程を、このサイクルに取り込み得る。また、これらの事象のうちいくつかは、単一工程で実施され得る。例えば、１つ以上のプライマーのプローブハイブリダイゼーションおよびアニーリングは、同じ温度で起こり得る。プライマーのアニーリングおよび伸長は、単一の温度で起こり得る。
【００８１】
これらの工程のパラメーター（例えば、順序、持続時間、および温度）は、成果を最適化するように選択され、そしてこれらのパラメーターは以下の様々な因子によって、おおきく左右される：プライマーおよびプローブのＴｍ、（存在する場合）アンプリコンの長さ、標的の量および純度ならびに検出方法。低コピー数のゲノムＤＮＡ標的配列は、特定の工程の長い持続時間または高サイクル数を必要とし得る。
【００８２】
本発明の方法における特定の実施形態は、ある変性温度における２つの鎖への二本鎖標的核酸の変性工程を含む。図１は、以下の工程を含む本発明の１つの実施形態に従う非同調的ＰＣＲ熱サイクル法の概略図を示す：（ｉ）二本鎖標的の変性工程、（ｉｉ）第１のプライマーのアニーリング工程、（ｉｉｉ）第１のプライマーの伸長工程、（ｉｖ）プローブハイブリダイゼーション、（ｖ）第２のプライマーのアニーリング工程、および（ｖｉ）第２のプライマーの伸長工程。これらの温度および時間は、単なる例示である。他の実施形態において、この方法は、１本鎖標的核酸で開始し得る。
【００８３】
第１の、より高い親和性のプライマーは、第１のアニーリング温度で、標的の一本鎖のその相補的な配列にアニーリングされる（図１のアニーリングＩ）。このより高い親和性のプライマーは、反応容器中の、第２の、より低い親和性のプライマーに比べより高いＴｍを有する。第１のアニーリング温度で、第２のプライマーは、第１のプライマーがその相補的な標的配列にアニールするより低い程度で、標的の他の鎖においてその相補的な配列にアニーリングする。なぜならば、第２のプライマー／標的の２重鎖は、第１のアニーリング温度で十分な安定性を有しないからである。この第１のプライマーは、ヌクレオチドの取り込み（すなわち、ポリメラーゼに媒介されるヌクレオチド５’―トリホスフェートの付加）によって、第１のアニーリング温度、すなわち伸長温度で伸長される（図１での伸長Ｉ）。この第１のアニーリング温度および伸長温度は単一の温度であり得、この温度において、第１のプライマーのアニーリングおよび伸長が、共通温度で起こり得る。本発明のこの実施形態のこの方法のこの段階において、この標的の一方のストランドは、２重鎖の一部分であり、そして他のストランドは１本鎖である。
【００８４】
温度は、検出可能なプローブが、標的核酸の一本鎖形態にハイブリダイズするプローブハイブリダイゼーション温度（図１におけるハイブリダイゼーション）まで低められ得る。この検出可能なプローブは、ハイブリダイゼーションの際、またはポリメラーゼのヌクレアーゼ活性による切断の際に、蛍光において、例えばＦＲＥＴによって、増加を示し得る。
【００８５】
次いでこの温度は、第２アニーリング温度（図１におけるアニーリングＩＩ）に変えられるか、またはプローブハイブリダイゼーション温度に一定に保たれ、それによりこの第２プライマーは、標的のその相補鎖にアニーリングする。この第２アニーリング温度は、第１アニーリング温度よりも低く、そして第１プライマーの伸長温度よりも低い。第２プライマーは、第２アニーリング温度、またはより高い伸長温度で伸長する。伸長ＩＩ温度は、伸長Ｉ温度と同じであっても異なっていても良い。サイクル中のこの時点で、標的の各鎖のコピーが作製される。図１は、非同調的熱サイクルプロトコールの１つの実施形態のサイクルを図示する。この工程の温度および時間は、単に例である。
【００８６】
図１において示される本発明の実施形態において、第２サイクルおよび引く続くサイクルは、二本鎖標的の変性を伴って再び開始し、前述の他の工程が続く。このサイクルは、所望するだけの回数が繰り返され得るが、代表的に、検出可能なシグナルが明白化もしくは安定化されるまで、または十分な量のアンプリコンが産生されるまで繰り返される。代表的に、５０サイクルが、アンプリコンを検出または産生するのに十分である。このサイクルにおける各工程の持続時間は、事象を完了させるために十分である（すなわち、変性、アニーリング、伸長、およびプローブハイブリダイゼーションが実質的に完了する）。
【００８７】
非同調的熱サイクルプロトコールの代替的な実施形態は、検出可能なプローブもプローブハイブリダイゼーション工程も使用しない。この実施形態は、第１プライマーおよび第２プライマーの時間的に連続したアニーリング工程および伸長工程が、第１段階：変性、アニーリングＩ、伸長Ｉ、アニーリングＩＩおよび伸長ＩＩ、続いて変性工程、アニーリングＩ工程および伸長Ｉ工程のみのサイクルの第２段階において行なわれる場合に有用であり得る。この第１段階は、２〜５０サイクル行われ得、続いてプロトコールの後半部分として１〜２５サイクルの第２段階が行われ得る。第２段階におけるアニーリングＩＩ工程および伸長ＩＩ工程の省略は、第１プライマーに対する相補体のみのコピーまたは主にこの相補体のコピーを可能にする。従って、この生じたアンプリコンは、一本鎖核酸が優勢である。
【００８８】
１つの実施形態において、第１プライマーと第２プライマーとの間のＴｍの差（ΔＴｍ）は、より高い温度の第１アニーリング工程および第１伸長工程の間、より高いＴｍプライマーのみがアニーリングおよび伸長を受けるように、十分大きい。代表的に、アニーリング温度は、アニーリングおよび伸長されるべきプライマーのＴｍの０〜１０℃下に設定される。第１アニーリング温度は、標的への第１プライマーのアニーリングを可能にし、そして標的への第２プライマーのアニーリングは実質的に行なわれないような任意の温度であり得る。第１プライマーについての伸長温度は、標的に対する第２プライマーの伸長を可能にし、そして標的への第２プライマーのアニーリングは実質的に行なわれないような任意の温度である。第１プライマーの伸長温度は、標的に対する第２プライマーの伸長を可能にする任意の温度である。第２プライマーについての伸長温度は、第２アニーリング温度と同じであっても異なっていても良い。より低いＴｍの第２プライマーのアニーリング工程および伸長工程の間、より高いＴｍの第１プライマーに対して相補的な、ほとんど全てまたは実質的に全ての標的配列は、図１において示されるように、伸長され、二重鎖として存在する。図２は、例示的なＴｍ範囲（第１プライマーについて、例えばＴｍ＝６０〜７５℃、および第２プライマーについて、例えばＴｍ＝４５〜５５℃）を示す。
【００８９】
１対よりも多くのプライマーは、本発明の非同調的熱サイクルプロトコールによって行われるＰＣＲ反応中に存在し得る。１対よりも多くのプライマーは、特定のアンプリコンを増幅し得る。１対よりも多くのプライマーが本発明のＰＣＲ反応物中に存在する場合、１つよりも多くのアンプリコンが生じ得る（すなわち、１つよりも多くの標的配列が増幅され得る）。特定のプライマー（例えば、より高温で融解する第１のプライマー、またはより低温で融解する第２のプライマー）は、１対よりも多くのプライマーを形成し得、そして１つより多くの標的配列を増幅し得る。例えば、より高温で融解するプライマーは、より低温で融解する１つのプライマーと１００ｂｐのアンプリコン、およびより低温で融解する異なるプライマーと２００ｂｐのアンプリコンを産生し得る。１つより多くのプローブが、本発明の非同調的熱サイクルプロトコールによって行われるＰＣＲ反応中に存在し得る。各プローブは、独特のの色素を有し得、そして特定の標的配列の相補鎖を検出するように（例えば、遺伝子の２つの対立遺伝子形態を検出するように）設計された配列を有し得る。
【００９０】
ＰＣＲ反応は、熱サイクルが可能である任意の囲いまたは部位中で行われ得る。容器としては、チューブ、フラスコ、ウェル、凹部（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、フリット（ｆｒｉｔ）、多孔性部位、および表面上のアドレス可能な位置（すなわち、アレイ）が挙げられる。
【００９１】
（Ｖ．４　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いる非同調的ＰＣＲのモニタリング）
本発明の１つの実施形態において、レポーター色素およびクエンチャーで標識されたＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、ハイブリダイゼーションによって標的ポリヌクレオチドのリアルタイム増幅を検出およびモニタリングし得る。ＰＮＡプローブ（プライマー配列に対して内部のアンプリコン配列に相補的である）は、より高いＴｍのプライマーがアニーリングおよび伸長した後に、ｓｓアンプリコンにハイブリダイズする。相補的な標的にハイブリダイズしたＰＮＡプローブは、酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性）によって、ＰＣＲ中に識別できるほどは切断されない。相補体に結合しない場合、このレポーター色素はクエンチされる。相補的配列にハイブリダイズした場合、このレポーター色素とクエンチャーとは、空間的に離れており、そして蛍光における増加が検出され得る。図５は、クエンチされた（離れた、ハイブリダイズされていない）状態およびクエンチされない（ハイブリダイズした）状態における、例示的な８〜１８ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを示す。この蛍光強度の変化は、相補的なポリヌクレオチド（すなわち、アンプリコン）のハイブリダイゼーション（従って、存在および量）と相関し得る。このＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、逆に荷電したリンカー（例えば、カルボキシル化アミノ酸鎖（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、ならびにアンモニウムアミノ酸側鎖（例えば、リジン）を取り込むことによって結合していない状態におけるクエンチングを最適化するように設計され得る。あるいは、このプローブの配列は、５’末端および３’末端で、分子内の塩基対形成の立体配置（すなわち、ヘアピン構造）をとる非標的相補的配列を含むように設計され得、この構造は蛍光色素部分とクエンチャー部分とを近位にする。
【００９２】
（Ｖ．５　リアルタイム検出を用いる非同調的ＰＣＲの応用）
非同調的ＰＣＲプロトコールの１つの実施形態のリアルタイムモニタリングにおける工程は、高特異性条件下（すなわち、比較的高い温度）での検出可能なプローブのハイブリダイゼーションである。より高い特異性は、単一塩基対の区別を可能にする。このプローブは、切断性（例えば、ＤＮＡ）でも良いし、または、非切断性（例えばＰＮＡもしくはそのアナログ）でも良い。このプローブハイブリダイゼーション工程および検出工程は、任意の温度で実行され得、そしてより長い対応するプローブよりも内因的により特異的である非常に短いプローブの使用を可能にする。例示として、図１３は、第２プライマーアニーリング工程の前に使用される、３０〜３７℃のプローブアニーリング工程を示す。このような低温のプローブアニーリング工程は、８ｎｔおよび９ｎｔほどの短いＰＮＡプローブを使用して実行され得る（実施例５、図８）。
【００９３】
ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、伝統的な熱サイクルプロトコールよりも非同調的熱サイクルＰＣＲプロトコールの間に、より効果的にＤＮＡ標的に結合する。図９は、非同調的ＰＣＲ（Ａ−ＰＣＲ）および伝統的な（通常）ＰＣＲの各々の間の、２５〜３０サイクルでの平均蛍光変化を示す。６５℃でのアニーリング工程で、蛍光強度は、伝統的なＰＣＲについて、Ａ−ＰＣＲプロトコールについての、２倍のシグナル増加と比較してごくわずかに増加し、これは標準に対するＰＮＡプローブのより少ない結合を示す。シグナルにおける、より大きな増加は、標的のより低いコピー数でのより高い検出感度（すなわち、より高いシグナル／ノイズ）を意味する。
【００９４】
非同調的ＰＣＲ方法の代替的な実施形態は、２つのうち１つのプライマーが、ＧもしくはＣ含有テイル、または「クランプ」（例えば５’（ＧＣ）_{− ｎ}または（ＣＣ）_ｎ（ここで、ｎは１〜４である）を有するように設計される、より少ないサイクルの伝統的な熱サイクルプロトコールを実行することである。あるいは、このテイルは、ポリＧまたはポリＣモチーフであり得る。このＧＣまたはＣＧテイルユニットは、あらゆる特定の標的配列に非相補的であるように設計される。このテイルは、「テイル付加していない」配列に比較してプライマーのＴｍを増加するのに役立つ。最初の数サイクルの間、両方のプライマーは標的に等しく良好にアニーリングし、単一アニーリング温度が、テイル付加していないプライマーのＴｍに等しいか、またはほとんど等しい、伝統的な熱サイクルプロトコールの間、比較的同調的な伸長を生じる。図１４ａは、アンプリコン中へのＧＣテイルの複製を伴う伝統的な熱サイクルプロトコールの２つのサイクルを示す。いくつかのサイクルの後、大多数のアンプリコンは５’末端でＧＣテイルを取り込み、そしてその相補体は３’末端でＧＣテイルを取り込む。次いでこのプライマーのＧＣテイルは、アンプリコンに対して相補的であり、そしてより高い温度（テイル付加していないプライマーはアニーリングしない温度）でアニーリングする。いくつかのサイクル（例えば、１〜５サイクルの伝統的なプロトコール）の後、熱サイクルプロトコールは、非同調的プロトコールに移行し、それによってｓｓアンプリコンは、プライマーアニーリング工程と伸長工程との間で、プローブによって標的化され得るか、または過剰なｓｓアンプリコンを産生するために標的化され得る。あるいは、非同調的プロトコールは、単独で使用され得る。ＧＣテイルプライマー方法の１つの利点は、プライマーまたはアンプリコンの設計に存在し得る。
【００９５】
非同調的ＰＣＲサイクルはまた、切断性ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いるヌクレアーゼ切断アッセイにおいて有用性を有する。本発明の１つの実施形態は、５’−エキソヌクレアーゼ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））増幅および検出プローブに対する改良を提供する（Ｈｏｌｌａｎｄ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８：７２７６〜８０；Ｌｉｖａｋ、米国特許第５，５３８，８４８号；Ｇｅｌｆａｎｄ、米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，５３８，８４８号）。プライマー伸長を行い、そしてポリヌクレオチドを増幅するポリメラーゼはまた、「レポーター」色素および「クエンチャー」が結合し、そして配列が標的ＤＮＡに相補的である、標的にアニーリングしたプローブのホスホジエステル結合を切断することに役立つヌクレアーゼ活性を有し得る。切断は、検出のための、クエンチされていない標識化したフラグメントを放出し得る。プローブの切断は、レポーターとクエンチャーとの間の空隔間が、ハイブリダイゼーションの結果として調節されるＦＲＥＴプローブを設計することによってハイブリダイゼーション事象の検出が達成されるいくつかのアッセイにおいて、必要ではない。（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９２）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｋｒｉｃｋａ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．第１３章；ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｒａｐｉｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ａｇｅｎｔｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、２４５〜２５６ページ）。この方法は、ＦＲＥＴ、蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）、非放射性エネルギー転移、長期エネルギー転移、双極子結合エネルギー転移またはＦｏｒｓｔｅｒエネルギー転移として文献中に種々に記載される、適切な蛍光標識が密接に近位にされた場合に生じる蛍光における変化に依存する。ＦＲＥＴプローブは、（標的へ結合していない場合、「ダーク（ｄａｒｋ）」状態にする自己相補性「ヘアピン」配列を含み得、そしてハイブリダイゼーションアッセイにおける特異性を増大させ得る（Ｔｙａｇｉ、米国特許第５，９２５，５１７号；同第６，０３７，１３０号；同第６，１０３，４７６号；同第６，１５０，０９７号）。エキソヌクレアーゼアッセイおよび他の定量的蛍光ベースのアレイを実行するシステムの例は、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ^ＴＭ７７００、７２００、および７９００ＨＴ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）である。
【００９６】
（Ｖ．６　終点検出を用いる非同調的ＰＣＲの応用）
非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールによる感度性および特異性の増大の利点は、ヒト疾患診断、食物が原因となる病原体の検出、および微生物の検出についてのアッセイにおいて実現され得る。得られたアンプリコンは、ＰＣＲの終点で、電気泳動系（例えば、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７７、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１００、およびＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））、または蛍光プレートリーダー、蛍光スキャナーもしくは画像化デバイスによって検出され得る。アンプリコンは、蛍光色素で標識化されたプライマーを用いてＰＣＲによってか、またはインターカレーター色素染色（例えば、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）によって検出され得る。
【００９７】
ＰＣＲの終点分析は、熱サイクルおよび増幅が完了したときの蛍光色素シグナル測定を含む。結果は、ＰＣＲ熱サイクルの最初から終わりまでの蛍光色素シグナル（好ましくは、あらゆる内部コントロールシグナル（を差し引く）の蛍光における変化（すなわち、蛍光強度ユニット）に関して報告される。
【００９８】
本発明の非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールは、標的ＤＮＡの対立遺伝子の区別のために有用である。各対立遺伝子に特異的なプローブは、閉じたチューブの均一なＰＣＲアッセイにおいて、モニタリングされ得る。例えば、二対立遺伝子系において、２つのプローブは、各々異なる色素（例えば、ＦＡＭおよびＴＥＴ）で、および各々の対立遺伝子形態について特異的な配列を伴って標識され得る（Ｌｉｖａｋ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９：３４１〜２；Ｌｉｖａｋ（１９９９）「Ａｌｌｅｌｉｃ　ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　５’ｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｓｓａｙ」Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｒｅｓｓ、１４：１４３〜４９）。プローブと標的との間のミスマッチは、このプローブがＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブであろうがまたはヌクレアーゼ切断性ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブであろうが、プローブハイブリダイゼーションの効率を大いに減少させる。従って、ＦＡＭまたはＴＥＴの蛍光シグナルにおける実質的な増加は、ＦＡＭ特異的対立遺伝子またはＴＥＴ特異的対立遺伝子のホモ接合性を示す。両方のシグナルにおける増加は、ヘテロ接合性を示す。
【００９９】
本発明の非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールはまた、遺伝子型決定および遺伝子発現分析について有用であり得る。ＦＲＥＴプローブを使用する遺伝子決定は、蛍光の測定がＰＣＲが完了した後（終点）でなされることを要求する。実験のこれらの型は、ＡＢＩ　７２００または７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対して便利に行われる。このシステムは、約５００〜６５０ｎｍの完全な蛍光スペクトルを、ＰＣＲ反応チューブにおいて直接測定する。このシステムソフトウェアは、遺伝的区別をするために蛍光データを自動的に処理する。
【０１００】
（Ｖ．６．ａ　ｃＤＮＡライブラリースクリーニング、ハイブリダイゼーションによる均質配列決定（ＳＨＢ））
非同調的ＰＣＲは、に対して特徴的なｓｓ　ｃＤＮＡアンプリコンを産生してｃＤＮＡライブラリーを特徴付けるために有用である。ｃＤＮＡクローンは、寒天プレート上で、通常の実験室手順によって増殖され得、そして９６または３８４ウェルプレートにおいて接種されて、マスター培養物を産生し得る。ＤＮＡ精製は、対応する数のウェルを有する新しいプレート上の１０〜２０μｌ培養物を使用して、沸騰方法によって実行され得る。これらの手順は、自動化され得る（ＡＢＩ　６７００、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。次いで、このｃＤＮＡ挿入物は、非同調的ＰＣＲによって、例えばプレート中の約１００μｌの量で、増幅され得る。このＤＮＡは、必要であれば、＜１００ｂｐのフラグメントに物理的に共有し得る。次いで、各ＰＣＲ産物は、蒸留した、脱イオン水中で、例えば、２倍希釈され、そして３２の同一のマイクロタイタープレート中でアリコートに分けられる。次いでこのＰＣＲ産物は、１つ以上の固有のＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブと混合され得る。各プローブは、アミノ末端で固有の色素（例えば、６ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸ）およびカルボキシル末端でクエンチャー（例えば、ＮＴＢ、ＤＡＢＣＹＬ）で標識される。次いで、蛍光は、蛍光マルチウェルプレートリーダー（例えば、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で測定され得る。標準化した、適切な大きさにされた、９８プローブの単一クローンに対するこの生じた蛍光強度は、ハイブリダイゼーションの表示であり、そして「ハイブリダイゼーションサイン」として規定される（Ｄｒｍａｎａｃ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６０：１６４９〜５２）。ｃＤＮＡアンプリコンのハイブリダイゼーション部分の配列は、異なる既知の配列の多くのＦＲＥＴプローブに対するハイブリダイゼーションに起因した、蛍光強度の逆重畳によって決定され得る（Ｄｒａｍａｎａｃ（１９９４）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１７：３２８〜９；Ｍｉｌｏｓａｖｌｊｅｖｉｃ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．６：１４３〜１４１）。このシグナルの標準化は、特異的なプラスミド配列を標的化する内部コントロールプローブからのシグナルを越える個々の色素についてシグナルの比を使用することによって、実現され得る。ハイブリダイゼーションサインは、個々のクローン間またはｃＤＮＡ配列間の配列類似性を割当てるために使用される。類似のハイブリダイゼーションサインを有するクローンは、１つの遺伝子提示クラスター中にグループ分けされる。クラスターは、特異的な全長ｃＤＮＡまたは新規な遺伝子を、組織間または処置間のｃＤＮＡサインプロファイリングの差に基づいて同定するために有用である。
【０１０１】
図１７は、ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを使用する均一なＳＢＨの概略図を示す。例示的な方法の工程は以下を包含する：（ｉ）ｓｓ　ｃＤＮＡアンプリコンを作製するための非同調的ＰＣＲによって増幅されるｃＤＮＡ；（ｉｉ）ｓｓ　ｃＤＮＡアンプリコンを整列させる；（ｉｉｉ）ＰＮＡプローブを、各ｓｓ　ｃＤＮＡアンプリコンにハイブリダイズする；（ｉｖ）蛍光検出によってハイブリダイゼーションサインを得る。この方法の利点としては、以下が挙げられる：（ｉ）均一の条件；（ｉｉ）ハイスループット適用（すなわち、多くのサンプルを並行して処理すること）のための多重化；（ｉｉｉ）高いＴｍの短いＰＮＡプローブを用いる、迅速なハイブリダイゼーション反応速度論、および（ｉｖ）より短いプローブのコストの利点。
【０１０２】
代表的な哺乳動物細胞は、１０，０００〜３０，０００の間の異なるｍＲＮＡ配列を含む。これらの全てのｍＲＮＡが、ｃＤＮＡライブラリーに等しく提示されているわけではない。少量のｍＲＮＡ（約１０コピー／細胞未満）は、全部のｍＲＮＡの約３０％を構成し、従ってこの少量クラスに分けられる約１１，０００個の異なるｍＲＮＡが存在する（Ｗｏｏｄ（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３１２：３３０〜７）。所定のｃＤＮＡライブラリー中に存在する任意の珍しいｃＤＮＡクローンを得る少なくとも９９％の確立を達成するために、１，０００，０００個までのクローンをスクリーニングしなければならない。図８は、８ｎｔおよび９ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブとの配列の特異性を用いた効率的な検出を示す。８ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブの完全ライブラリーは、４^８／２＝３２，０００プローブからなり；ヒトゲノムにおける１，０００，０００よりも多いＳＮＰを、ｃＤＮＡライブラリースクリーニングによって検出するのに十分である。このライブラリーはまた、遺伝子発現モニタリングに適用可能である。
【０１０３】
ｃＤＮＡスクリーニングに対するＳＢＨ法の利点は、ｃＤＮＡライブラリー中の全ての遺伝子を一度に特徴付けする能力である。ｃＤＮＡライブラリーを特徴付けするために１，０００，０００個のクローンが必要とされると仮定して、３８４ウェル形式の２６０４枚のプレートが、１，０００，０００個のＰＣＲ反応のために必要とされる。非同調的ＰＣＲは、ハイブリダイゼーションについて準備されている単一鎖アンプリコンの効率的な産生、およびアンプリコンの単離、変性、および精製の除外することによる顕著な利点を提供する。ｓｓ標的配列の産生には、しばしば、アレイ上のプローブに対する効率的なハイブリダイゼーションが必要とされる。
【０１０４】
（Ｖ．７　非同調的ＰＣＲによって産生されるｓｓＤＮＡについての応用）
非同調的ＰＣＲは、プライマー配列の選択に依存して、ＤＮＡ標的の＋鎖または−鎖のいずれかの増幅を可能にする。高いＴｍのプライマー相補鎖は、低いＴｍプライマー相補鎖に対して形成される。各非同調的サイクルには、２つのアニーリング工程および２つの伸長工程が含まれる。このプライマーは、プライマー長によって大部分もたらされる、顕著に異なるＴｍ値を有する。Ｔｍによって測定される親和性はまた、塩基含量（Ｇ＋Ｃ含量）、配列およびハイブリダイゼーション安定化標識によって影響される。
【０１０５】
大多数の一本鎖ＤＮＡアンプリコンを生成するための方法は、一対の異なるＴｍのプライマーを用いて開発された。非同調的ＰＣＲは、指数関数的な増幅をもたらす多数のサイクル数について行なわれ、次いで、より高い融解プライマーによってハイブリダイゼーションおよび伸長のみを可能にするアニーリング温度および伸長温度で１つ以上のサイクルの熱サイクルが行なわれた（図２０ｂ）。これは、ＤＮＡアンプリコンの一方の鎖のみの直線的な増幅に役立つ、過剰または大多数のｓｓＤＮＡを生成する（図２０ａ）。
【０１０６】
（Ｖ．８　キット）
本発明は、本発明の非同調的ＰＣＲ方法に従った、標的核酸を増幅するための試薬を含むキットを含む。このキットは、第１プライマーおよび第２プライマーを含む。この第１プライマーおよび第２プライマーは、第１プライマーは標的にアニーリングし、そして伸長するが、第２プライマーはアニーリングも伸長もしない十分異なるＴｍ差を有する。代表的に、ΔＴｍは、約１０〜３０℃である。第１プライマーまたは第２プライマーの１つは、標識化され得る。この標識は、蛍光色素、移動度改変因子、またはハイブリダイゼーション安定化部分であり得る。
【０１０７】
このキットはまた、検出可能なプローブ、ポリメラーゼ、およびヌクレオチドを含み得る。このプローブおよび／またはヌクレオチドは、蛍光標識され得る。このプローブは、蛍光部分およびクエンチャー部分で標識され得る。このプローブは、ＤＮＡ、ＰＮＡまたは核酸アナログであり得る。
【０１０８】
このキットは、４つの異なるヌクレオチドのセットを含み得、これらは各々Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ核酸塩基を保有する。このセットは、核酸塩基、リンカー、および蛍光色素の組み合わせが、電気泳動条件下で分離するアンプリコンを生じる４つのヌクレオチドのセットを産生するように、設計され得る。
【０１０９】
（Ｖ．９　実施例）
本発明を記載してきたが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定ではない。プライマー、プローブおよび標的配列について、ＤＮＡヌクレオチドは、大文字で記され、変異部位は下線および太字で記される。ＰＮＡプローブ配列は、小文字で記載される。他に記載しない限り、ＤＮＡ配列の配向は、左が５’末端および右が３’末端である。ＰＮＡ配列の配向は、左がアミノ末端および右がカルボキシル末端である。
【０１１０】
以下の実施例におけるＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ（バージョン１．０、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を使用して設計された。熱融解すなわちＴｍの値は、ＤＮＡプライマーおよびＤＮＡプローブについて、基本式を使用する計算によって評価された：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、
ここで、Ｎ＝ヌクレオチド数でオリゴヌクレオチドの長さである（Ｂｏｌｔｏｎ（１９６２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、４８：１３９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｃｈ，Ｅ，Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．編（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、第２巻、１１．４６頁、９．５０〜９．５１頁。基本式に対する精密化は、最近接効果および溶媒効果についてなされ得る。
【０１１１】
（実施例１）
（プライマーおよびＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブの融解温度Ｔｍの決定）
ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブの融解温度（Ｔｍ）の測定を、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度コントローラーを備えるλ１４分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して実行した。温度傾斜速度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｒａｍｐ　ｒａｔｅ）は、２６０ｎｍで連続モニタリングしながら１℃／分であった。Ｔｍ値を、製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して、Ａ２６０　対　温度プロットの第１誘導体曲線の最大値を使用して計算した。Ｔｍの決定を、１０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液において行った。各々のＴｍの測定の前に、種々のＤＮＡテンプレートおよびＰＮＡプローブの各々の鎖を、ＵＶ分光学を使用して定量し、そして最終濃度１μＭの最終融解緩衝液になるように希釈した。この最終光学密度の範囲は、２６０ｎｍで、０．２ＯＤ（光学密度単位）と０．８ＯＤとの間であった。このサンプルを、９０℃で５分間加熱することによって「前融解」し、そして融解プロファイルを実行する前に周囲温度までゆっくりと冷却した。あるいは、この前融解を、融解プロファイルを実行する前に、分光光度計で、高温までの迅速な傾斜（５℃／分）および出発温度まで温度を下降し戻す傾斜（２〜３℃／分）によって、実行した。
【０１１２】
（実施例２）
（ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡに対するＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ結合反応速度論）（図６）
ＦＲＥＴ　ＰＮＡプローブのｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの反応速度を測定した（図６）。プローブが標的に結合しない場合、または標的の存在下においてプローブのＴｍより低い場合、蛍光色素およびクエンチャーは、蛍光色素の実質的に完全なクエンチングが可能になる平均化された形態で存在する（図５）。プローブが標的にハイブリダイズする場合、蛍光色素およびクエンチャーは、空間的に分離されて、蛍光の増大をクエンチングの損失に依存して測定し得る。１６ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１）の蛍光強度の測定は、蛍光の基準を提供する。コントロール実験は、ＰＮＡプローブのみを含み、標的を含まない（図６上）。クエンチングは、温度の増大を通じて、実質的に完了する。プローブとｄｓ標的ＤＮＡの混合物を９５℃に維持した。６８ｎｔ（配列番号２）と７４ｎｔ相補体（配列番号３）とをアニールすることによってｄｓＤＮＡを形成して、３ｎｔのオーバーハングを有する６８ｂｐ二重鎖を形成した。次いで温度を６０℃まで下げた（図６中）。
【０１１３】
蛍光を約５〜１０秒間隔の時間の関数として１０分間測定した（ＡＢＩ　７７００，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。蛍光強度は、約４倍増大し、いくらかのハイブリダイゼーションを示した。温度を約６０℃まで下げた場合、両方のテンプレート鎖の存在下で、ＰＮＡの相補的テンプレート鎖に対する結合は、他の相補的ＤＮＡ鎖によって競合（ｏｕｔ−ｃｏｍｐｅｔｅ）されることが、蛍光がわずかに増大することからわかる（図６中）。ＰＮＡの結合が緩やかに置換されたことを示す、シグナルの緩やかな低下もまた注目される。最終的に、プローブおよびｓｓ標的ＤＮＡ（配列番号２）の混合物を、９５℃に維持し、次いで温度を６０℃まで下げた（図６下）。１６ｎｔ　ＰＮＡプローブは、ｓｓＤＮＡ標的に１分以内に結合することが、蛍光の８倍の増大からわかる（図６下）。しかし、サンプルプローブは、ｄｓＤＮＡ標的により少なく結合する。ｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡテンプレートの両方は、２５、５０、〜１００ｎＭの範囲である。濃度範囲を、指数関数的相からプラトー相までのＰＣＲ段階を模倣するよう選択した。この結果は、プローブ（例えば、ＰＮＡ　ＦＲＥＴ　１６ｎｔ）は、ｄｓＤＮＡより迅速にｓｓＤＮＡにハイブリダイズすることを示す（図３）。この結果はまた、ｄｓテンプレートへのプローブ結合が、反応速度的および熱力学的の両方で支持されないことを例証する。
ＰＮＡ　１６ｎｔ：
【０１１４】
【化１５】

（実施例３）
（非同調的、伝統的、および非対称的なＰＣＲ熱サイクルプロトコールの比較）（図４ａおよび４ｂ）
非同調的な熱サイクルプロトコールを、伝統的な熱サイクルプロトコールと直接比較した。ＰＣＲ反応を以下の条件を独立して変えることによって行った：（ｉ）非同調的および伝統的（１回のアニーリングおよび１回の伸長工程）熱サイクルプロトコール；（ｉｉ）プライマーのＴｍ；および（ｉｉｉ）プライマー濃度。他の条件は、一定に維持した。フォワードおよびリバースプライマーの３つの組み合せを用いて、標的ＤＮＡを増幅した。
【０１１５】
非同調的ＰＣＲ（Ａ−ＰＣＲ）についてのサイクルを、図４ａにおいて概説し、ここでプライマーを、これらのＴｍ値が約１５℃離れるように設計した。増幅サイクルの最初の半ばにおいて、高いＴｍプライマーは、標的にアニーリングして、次いで十分に伸長する。その後温度が下げて（例えば、５２℃）、そしてこのサイクルの部分で蛍光を測定する。このサイクルの部分において、低温度プライマーは、標的配列に結合するが、実質的な範囲までプライマーを伸長し得ない。温度を上げて、第２のプライマーの伸長を完全にすることによって、このサイクルを完了する。
【０１１６】
同調的、伝統的および非対称的なＰＣＲ熱サイクルプロトコールからの結果を比較した（図４ｂ）。２つのフォワードプライマーおよび２つのリバースプライマーを、４つの可能な組み合わせのうち３つ（６６／５２；６６／６１；６０／６１）において比較し、不同性Ｔｍの対およびほぼ等しいＴｍの対を作った。非対称的ＰＣＲを、２００ｎＭおよび２０ｎＭのプライマー濃度で行った。アンプリコンおよび標的サイズは、６８ｎｔであった。フォワードプライマー（各プライマー対において、Ｔｍ＝６６℃および６０℃）を、電気泳動可動性修飾因子として、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を用いて、５’標識した。ＦＡＭ標識は、アンプリコンの電気泳動を遅延させて、変性分析ゲル条件において、鎖の分析を可能にする。標識化バンド（ゆっくり移動）および非標識化バンド（速く移動）の各レーンにおける分析は、種々の条件でのＰＣＲの結果に由来する、二重鎖（ＦＡＭ標識、ゆっくり移動、上のバンド）アンプリコンおよび一本鎖（非標識、速く移動、下のバンド）アンプリコンの存在を示す。電気泳動を１５％ポリアクリルアミドで、変性条件下（電気泳動の間のゲル温度約５５〜６０℃、および７Ｍ尿素）において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ^ＴＭインターカレーター（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）の存在下で行い、アンプリコンを染色および可視化した。
【０１１７】
図４ｂは、標的を増幅させたＰＣＲ産物のゲル電気泳動分析を示す。６６℃および５２℃のＴｍプライマーを用いた非同調的ＰＣＲ（左から３番目のレーン）は、上のバンドが下のバンドに対して４：１の割合であることを、デンシトメトリー定量によって提示し、６６℃および５２℃のＴｍプライマーを用いた伝統的ＰＣＲよりもアンプリコンを多く生じることを示した。実際に、非同調的なプロトコールは、プライマーの全ての３つの組み合せを用いて、大量の産物を提供するが、ここで伝統的なプロトコール（真中のレーン）は、ほぼ等しいＴｍのプライマー対（６１℃および６０℃）に対してのみ有効であった。非同調的熱サイクルプロトコール（右レーン）は、全ての３つのプライマーの組み合せで相対的に、非能率的であった。従って、不同性のＴｍプライマーを用いて、プロトコールが、より高い温度でのみアニーリングして終了する場合、非同調的な熱サイクルプロトコールが効率的な増幅を行い、過剰のｓｓアンプリコンの産生を可能にすることを、図４ｂは示す。
【０１１８】
【化１６】

ＰＣＲプライマーおよび二重色素標識化プローブをＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ^ＴＭ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．０，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を用いて設計した。プライマーを様々なＴｍ、不同性のＴｍで選択し、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの４つの潜在的組み合せのうち３つにおいて使用した。Ｔｍは、プライマーに対して５８〜６０℃の範囲、およびプローブに対して６８〜７０℃の範囲にあった（ただし、短いＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを除く）。非同調的ＰＣＲプライマーを、ＰＣＲプライマーの５’末端から塩基を添加または除去することによって設計した。特定のプライマーのＴｍ（６６〜７５℃）および他のプライマーのＴｍ（５０〜５５℃）の間における少なくとも１５℃の相違は、予想された。
【０１１９】
ＰＣＲ増幅反応物（５０μｌ）は、以下を含んだ：ＤＮＡまたはＲＮＡ標的核酸、ＰＣＲ緩衝液を含む２×Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ（２５μｌ）、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、およびＭｇＣｌ_２（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各２００〜９００ｎＭ）、ならびにプローブ（２００〜２５０ｎＭ）。
【０１２０】
（非対称的ＰＣＲ）
非対称的ＰＣＲのための５０μｌ混合物は、全ての反応成分を、伝統的および非同調的プロトコールにおけるものと同一量含んだ（ただし、特定のプライマーの量（２５〜５０ｐｍｏｌ）が他方のプライマー（１．２５〜２．５ｐｍｏｌ）の２０倍量であったことを除く）。非対称的ＰＣＲの熱サイクルプロトコールは、対称的、伝統的ＰＣＲプロトコールと同一であった（図４ｂ下）。
【０１２１】
（変性ＰＡＧＥおよび画像解析：）
ＰＣＲ産物アンプリコン（０．５〜５μｌ）を最終濃度が１×ローディング緩衝液（４５ｍＭ　Ｔｒｉｓベース、４５ｍＭ　ホウ酸、０．４ｍＭ　ＥＤＴＡ、３％フィコール、０．０２％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレンシアノール）と混合して、９５℃で１０〜２０分間変性した。サンプルを１０〜１５％変性ＰＡＧＥゲル上にロードし、１×ＴＢＥ（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓベース、８９ｍＭホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中で１００〜１６０Ｖ、７０℃で２５〜６０分間電気泳動した。ゲルを４０〜１２０ｍｌ容量の１×ＴＢＥ中で１０〜３０分間ｌ×ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて染色することによって、伸長された産物を可視化した。ＣｈｅｍｉＩｍａｇｉｎｇ　２０００ゲルドキュメンテーションシステムによって、画像を取り込んだ。ＳｐｏｔＤｅｎｓｏプログラム（Ａｌｐｈａ　Ｉｎｎｏｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐ．，ＣＡ）によって、ゲル上のバンド内のＤＮＡの相対量を比較し、比率を算出し得る。
【０１２２】
（実施例４）
（短いＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いた、ＡＢＩ　Ｓｙｓｔｅｍ上での、完全な一致および不一致の標的の増幅のリアルタイム検出）（図７ａおよび７ｂ）　非同調的ＰＣＲ法を用いた高い特異性の達成を例証するため、以下の２つの異なる不一致を合成標的テンプレート中に導入した；許容性の弱いＣＴ不一致および一般によく許容されるＧＴ不一致（すなわち、対する識別が難しい）。ＰＮＡ　ＦＲＥＴ　１６ｎｔプローブ（配列番号１）は、不一致とこれら間の数サイクルによる完全なテンプレートを容易に識別する（図７ｂ）。蛍光を、各サイクルの間検出され、蛍光における対数的な変化（ΔＲｎ）をサイクル数に対してプロットする。蛍光における変化（ΔＲｎ）が閾値を越えるＰＣＲプロトコールのサイクルは、Ｃ_Ｔとして示される。相対的に低いＣ_Ｔ値は、アンプリコンの効率的な検出を示す。許容限界サイクルは、複製数量またはサンプル中の標的ポリヌクレオチド量に高い関連がある。図７ｂの完全一致実験は、プローブ／標的の検出を示し、ここで不一致標的実験は、Ｃ_Ｔ閾値に達しなかった。従って、１６ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、１つの塩基対不一致特異性を示した。同じ標的に対して相補的な１４ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号８）を調製して、上記のような同じサイクルおよび同じプライマーセットで用いる。１４ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブは、いずれの不一致標的でも、アンプリコンとさらに良好な認識を示した。いずれの不一致実験も、ＣＴ閾値に達せず、そしてΔＲｎは、増幅の後期のラウンドにおいてさえも、ほとんど明白でない（図７ａ）。
【０１２３】
リアルタイムＰＣＲについて、因習的な熱サイクルプロトコールを、５０℃で２分および９５℃で１０分で始め、次いで９５℃で１５秒および６０℃で１分間を４０サイクル進めた。リアルタイム非同調的ＰＣＲについて、各サイクルは、２回のアニーリングおよび伸長の工程（９５℃で３０秒、６６〜６９℃で３０〜１２０秒、７２℃で３０〜６０秒、５２〜５５℃で６０〜１２０秒、および７２℃で６０秒を含む）を有する。全ての反応をＡＢＩ　７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で実施した。反応条件を、ＡＢＩ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒに直接連結したＰｏｗｅｒ　Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｇ３（Ａｐｐｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，ＣＡ）上でプログラムした。データ分析をまた収集および分析ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュータ上で実施した。
【０１２４】
【化１７】

（実施例５）
（短いＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いた非同調的ＰＣＲによるリアルタイム検出）（図８）
蛍光の変化（ΔＲｎ）とＣ_Ｔ閾値の間のシヌソイド相関特異性から、特異性を例証した（図８）。ＡＢＩ　７７００上ならびに実施例３および４と同様の条件化でＰＣＲを実施した。
【０１２５】
【化１８】

（実施例６）
（ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いた非同調的ＰＣＲによるリアルタイム検出）（図１０、１１、１２）
一連の３つのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（１５〜１７ｎｔ、および合成ｓｓ６８ｎｔ標的ＤＮＡに相補的）を、Ｎ末端（ＤＮＡ上の５’末端に等しい）に、レポーター色素（Ｆ）としてカルボキシフルオレセインを用意し、Ｃ末端にクエンチャー（Ｑ）としてｄａｂｃｙｌを用意した。ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブをさらに、ＰＮＡオリゴマーとＦの間の陰性荷電グルタミン酸部分に配置し、ＱとＰＮＡオリゴマーの間に挿入されたさらなる陽性荷電リジンに配置した。反対の荷電を帯びたアミノ酸は、蛍光色素およびクエンチャーの近位を強いられ、従って、プローブが相補的配列（すなわち、標的核酸配列）にハイブリダイズしない場合、クエンチングの程度はより高くなる。ＡＢＩ７７００上ならびに実施例３および４と同様の条件でＰＣＲを実施した。
【０１２６】
ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを、非同調的熱サイクルプロトコールによる、合成ＤＮＡ標的のリアルタイム検出に用いた。プライマーのＴｍは、１４℃異なった。６つの異なる濃度の出発複製物：１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８および１０^９を含む希釈によって標的サンプルを調製した。３つのプローブ（１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ）の各々を用いて、プローブをアニーリングすることによって各標的サンプル濃度を検出する（ここでプロトコール中のプローブをアニーリングする工程および蛍光（バックグラウンドから差し引かれ、標的へのプローブのハイブリダイゼーションにおけるＦＲＥＴクエンチングの損失によって生じる）を測定する工程がある）。図１０は、各プローブが効率的に、閾値の蛍光レベルを超えるアンプリコンを、標的の濃度の関数として検出することを示す。終点（４０サイクル）においての蛍光の約２０倍の増大（ΔＲｎ）によって、各増幅を検出する。図１１は、許容限界サイクルＣ_Ｔおよび出発複製数のプロットであり、標的サンプルと標準コントロールの間で高い相関係数を有する線形相関を示す。対照的に同じＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブおよびプライマーを用いて、伝統的な熱サイクルプロトコール（６０）サイクルで同じ標的を増幅した。図１２は、最も高い複製数標的サンプル（１０^８および１０^９）のみが、効率的な増幅および検出を提供することを示す。図１２はまたＣ_Ｔと出発複製数の間に相関がないことを明らかにする。どの伝統的なプロトコール増幅も蛍光の約３倍を超える増大を示さなかった。
【０１２７】
【化１９】

（実施例７）
（３セットのプライマーおよびＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いた、Ｋ−ｒａｓ遺伝子標的上での非同調的ＰＣＲのリアルタイム検出）（図１４ｂ）
図１４ｂは、３つの異なるプライマー対および１６ｎｔ　ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いた、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を標的核酸とした、リアルタイムＰＣＲ検出アッセイを示す。ＡＢＩ７７００上で、図１４ａのサイクルに続いて４０サイクルの非同調的熱サイクルプロトコールを用いて、アッセイを実施した。プライマー対は、以下を含む：（Ａ）等価なＴｍ（５２℃）のフォワードおよびリバースプライマー、（Ｂ）５’（ＧＣ）_４クランプフォワードプライマー（Ｔｍ　７７．５℃）およびリバースプライマー（Ｔｍ　５２℃）、ならびに（Ｃ）不同性Ｔｍのフォワードおよびリバースプライマー（６５℃および５２℃）。全ての３つのプライマー対が、約１６〜１７のほぼ等価なＣＴ値を伴う効率的な増幅を行ったことは、ＰＣＲの経過の間のΔＲｎのプロット（図１４ｂ）から見受けられ得る。ＧＣクランプ対（Ｂ）は、蛍光強度に最も大きな増大を生じた。不同性のＴｍプライマー対（Ｃ）は、等しいＴｍプライマー対（Ａ）より大きな蛍光強度の増大を提供し、このことは、小さい複製数標的サンプルに対して、より大きな感度を予測する。ＡＢＩ７７００上ならびに実施例３および４と同様の条件でＰＣＲを実施した。
【０１２８】
【化２０】

（実施例８）
（ヌクレアーゼ切断アッセイのリアルタイム検出）（図１５ａ、ｂ、ｃ）
非同調的および伝統的な熱サイクルプロトコールを、ＡＢＩ　７７００　Ｓｙｓｔｅｍ上で、切断ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いて比較した。プローブ、プライマーおよび標的以外のＰＣＲ増幅反応物は、実施例２と同じ試薬を含む。標的核酸は、ゲノムＤＮＡのβアクチン遺伝子内のアンプリコンであった。
【０１２９】
図１５ａは、伝統的ＰＣＲを実施した場合に、市販のアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いた、ゲノムＤＮＡ中のヒトβアクチン遺伝子に対する等価なＴｍプライマーでのＰＣＲ検出の結果を示す。一連のゲノムＤＮＡ濃度（０．６ｐｇ〜５０，０００ｐｇの範囲）を用いた。この範囲内において、連続的に５倍異なる濃度の８つの標的サンプルを用いた。伝統的ＰＣＲサイクルは、１回のアニーリング工程および１回の伸長工程を有する（図１６下）。異なる長さおよび不同性のＴｍ値を有するプライマーを非同調的な熱サイクルプロトコールを伴うアッセイに対して設計した（図１６上）。図１５ｂは、不同性Ｔｍのプライマーを非同調的な熱サイクルプロトコールで用いた結果、およびβアクチン遺伝子に対する別の同じアッセイ中の８つの異なる濃度においての結果を示す。同じ切断可能なＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号２３）を用いて、両方のプロトコールを実施した（図１５ｃ）。蛍光シグナル強度は顕著に増大し、そしてＣ_Ｔ値は、伝統的プロトコール（図１５ａ）と比較した非同調的プロトコール（図１５ｂ）について、かなり低かった。非同調的プロトコールによる検出制限は、１つの複製検出を可能にする。言い換えると、ヌクレアーゼ切断アッセイは、非同調的ＰＣＲ方法によって顕著に増大される。非同調的ＰＣＲ法はまた、特定の条件下で、より短い、切断ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（すなわち、低いＴｍ）の使用を可能にし得る。
【０１３０】
【化２１】

（実施例９）
（５’標識化プライマーを用いたＰＣＲの終点検出）（図２０ａ）
Ａ−ＰＣＲにおける増幅が、非同調的な様式で進むことを証明するために、フォワード（より高いＴｍ）プライマーをビオチンで５’標識し、２つの産物の鎖が変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の間によく分離するようにした。この実施例の設計は、図２０ａ下に概説した。最初の２５サイクル、続く１サイクルの最初の半ばで非同調的ＰＣＲサイクルを実施し、ここで標識化プライマーのみがハイブリダイズして伸長する。２×ローディング色素（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を添加し、９５℃で２０分間変性することによって、反応を直ちに停止した。増幅が本当に非同調的である場合、産物の鎖は、理論的に２：１の割合であるはずである。２５回の十分なサイクルの後に止めた場合、割合は、１：１であったが、さらなる半サイクル後に１：０．６７まで進んだ（図２０ａ）。これは、実際に増幅が非同調的であり、好ましくは、より高い融解温度のプライマーが伸長し、そして過剰の一本鎖アンプリコンが産生されることを示す。２５サイクルの非同調的熱サイクルプロトコールおよび高い温度での最後のアニーリングおよび伸長によって、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件および分析は、実施例３の条件を用いた。
【０１３１】
【化２２】

（実施例１０）
（非同調的ＰＣＲプロトコールによるｓｓＤＮＡ増幅および標識）（図２２）　ｓｓアンプリコンを相補的なアレイ、固相支持体結合プローブに対してハイブリダイズすることの有用性を調査した。２対のＰＣＲプライマーを設計して伝統的ＰＣＲを非同調的ＰＣＲと、ガラススライドアレイ上にスポットされたプローブにハイブリダイズするアンプリコンの産生において比較した。フォワードプライマーの各対は、５’Ｃｙ５色素標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を有した。リバースプライマーは、非標識であった。２１ｎｔのフォワードプライマーおよび２０ｎｔのリバースプライマーの伝統的な対は、およそ等しく算出されるＴｍ値を有した。２５ｎｔのフォワードプライマーおよび１８ｎｔのリバースプライマーの非対称的な対は、約１５〜２０℃の算出されたΔＴｍを有した。非同調的な対のフォワードプライマーは、伝統的な対のフォワードプライマーと相対的に、５’ＣＧＧＣ非標的相補テイルを有した。伝統的な熱サイクルプロトコールによってＰＣＲを実施して、９６ｂｐのｄｓアンプリコンを生じ、非対称的な熱サイクルプロトコールによってＰＣＲを実施して、１００ｎｔのｓｓアンプリコンを生じた。各固定化プローブは、各アンプリコンに相補的な２４ｎｔの配列を有した。
【０１３２】
図２２は、４つの異なる標的由来のＣｙ色素５’標識化Ａ−ＰＣＲ（主にｓｓＤＮＡ）および伝統的ＰＣＲ（ｄｓＤＮＡ）産物のガラススライドアレイへのハイブリダイゼーションを示す。４つの標的の例示的な列を、比較のため各アレイ位置上の四角で囲む。シグナルをコントロールハイブリダイゼーションによって規準化した。標識化Ａ−ＰＣＲ産物からの蛍光シグナルの平均化中央値（右）は、伝統的な熱サイクルプロトコールによって産生されたｄｓアンプリコンからのもの（左）に比べて、３〜４倍高かった。この結果は、ガラス表面に付着したアレイプローブが、ｓｓＤＮＡにより効果的にハイブリダイズしたことを示唆する。
【０１３３】
標的サンプルは、アレイプローブ特異的配列を含む。ＰＣＲをＡＢＩ　７７００　Ｓｙｓｔｅｍ上で実施した。ＰＣＲ反応物は、総容積５０μｌ中に以下を含む：１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ　ＫＣ１、２〜５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．０１％ゼラチン、２５０μＭ各ｄＮＴＰ、０．５〜１μＭフォワードプライマー、０．０５〜０．１μＭリバースプライマー、１０μｌの９６ｎｔ合成標的ＤＮＡ（１：１０００希釈）、１〜５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。オリゴヌクレオチドのテンプレート依存的ライゲーションによって９６ｎｔ合成標的ＤＮＡを調製した。非同調的ＰＣＲは、一連で実施される２つの熱サイクルプロトコールを含む。第１のプロトコールは、以下からなっていた：最初の９５℃で１０分間の変性に続いて、９５℃で１５秒、６５℃で６０秒（フォワードのプライミング）、５２．５℃（５０〜５５℃）で６０秒（リバースのプライミング）、７２℃で６０秒の１５〜２５サイクル、そして７分間の余分な伸長。一本鎖形態の色素標識化アンプリコンを生じるために直ちに続けられる第２のプロトコールは、９５℃で３０秒、６７（６６〜６９）℃で９０秒、および７０℃で６０秒の１０〜８０サイクルからなっていた。伝統的ＰＣＲは、実施例４におけるプロトコールによって実施された（５０℃で２分そして９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒そして６０℃で１分；または５０℃で２分そして９５℃で１０分を４０サイクル、次いで９５℃で１５秒、６０℃で１分そして７２℃で１分を４０サイクル）。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上で３回洗浄してＰＣＲ産物を精製した。
【０１３４】
（マイクロアレイハイブリダイゼーション、洗浄、データ収集および分析）
合計６４の異なる２４ｎｔ　ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをガラススライド上にスポットした。各プローブの８つの複製をスライドごとにスポットした。ハイブリダイゼーション混合物（２０〜３０μｌ／スライド）は、以下を含む：４×ＳＳＣ（生理食塩水−クエン酸ナトリウム）、０．３％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ、１μｇ／μｌポリ（Ａ）、および１〜２μｌの５０μｌ　ＰＣＲ産物。混合物を９５℃で２〜４分間変性し、スライドに各２０〜３０μｌを適用した。スライドをアレイチャンバー内に配置した。１６〜２０時間の５０〜５５℃の水浴中におけるハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを５０〜５５℃の４×ＳＳＣおよび０．３％ＳＤＳで簡単に洗浄し、室温の１×ＳＳＣおよび０．３％ＳＤＳで１回、２分間洗浄し、続いて室温の０．０６×ＳＳＣで２回、各２分間洗浄した。マイクロアレイをＡｘｏｎスキャナーを用いて画像化し、画像をＧｅｎｅＰｉｘ　Ｐｒｏ　３．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で分析した。
【０１３５】
【化２３】

本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が特異的かつ個別に参照として援用されることが示されるのと同程度に、参照として本明細書中において援用される。
【０１３６】
ここで十分に記載される本発明は、本発明の精神または範囲から逸脱することなしに、本発明に対して多くの変更および改変がなされ得ることが当業者によって、理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の１つの実施形態に従う非同調的ＰＣＲ熱サイクル方法についての模式図を示し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ｉ）二本鎖標的を変性させる工程、（ｉｉ）第一のプライマーをアニーリングさせる工程、（ｉｉｉ）第一のプライマーの伸長、（ｉｖ）プローブハイブリダイゼーション、（ｖ）第二のプライマーのアニーリング、および（ｖｉ）第二のプライマーの伸長。温度および時間は、例示である。
【図２】
図２は、本発明の１つの実施形態に従う、標的核酸に対する、第二のプライマー（短い矢印）よりも高い温度での第一のプライマー（長い矢印）のハイブリダイゼーションについての模式図を示す。
【図３】
図３は、従来のＰＣＲの間に（部分的に）二本鎖の標的に対してプライマーおよびプローブをハイブリダイズさせる工程（上）、ならびに本発明の１つの実施形態に従うプローブによる非同調的ＰＣＲの間に一本鎖標的に対してプライマーおよびＦＲＥＴプローブをハイブリダイズさせる工程（下）の模式図を示す（Ｆ＝レポーター色素、Ｑ＝クエンチャー）。
【図４ａ】
図４ａは、特定の温度での連続的かつサイクル的な持続期間と共に、本発明の１つの実施形態に従う非同調的ＰＣＲ（上）および従来のＰＣＲ（下）の熱サイクルプロトコールを示す。
【図４ｂ】
図４ｂは、以下の３つのＰＣＲプロトコール：非同調的、従来のおよび非対称的後の、変性条件（約５５〜６０℃、７Ｍ　尿素）下でのポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動分析、およびアンプリコンのＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ染色（上）、ならびに順方向および逆方向のプライマーの３つの組み合わせを用いた標的ＤＮＡの増幅の模式図（下）を示す。順方向プライマーは、電気泳動移動度改変因子（例えば、ビオチンまたはＦＡＭ）で５’標識されている。
【図５】
図５は、グルタミン酸結合およびリジン結合によるレポーター色素（Ｆ）およびクエンチャー（Ｑ）を含む、例示的なＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを示す（上）。このプローブは、相補的な標的にハイブリダイズされる場合、レポーター色素のクエンチを引き起こす、少なくとも１つの立体構造で存在する（左下）。標的へのハイブリダイズに際して、クエンチは消失して、蛍光強度が増大する（右下）。
【図６】
図６は、１６ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１）の、ＡＢＩ　７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）による、ある時間にわたる蛍光強度の測定を示す：相補的ＤＮＡなし（上）；相補的な６８ｎｔのＤＮＡ（配列番号２）および７４ｎｔのＤＮＡ（配列番号３）の二本鎖形態に対してハイブリダイズした（中）；そして相補的な６８ｎｔのｓｓＤＮＡ（配列番号２）に対してハイブリダイズした（下）。
【図７ａ】
図７ａは、１４ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号８）が、相補的な標的に対して、完全一致、単一のＧ−Ｔミスマッチ、および単一のＣ−Ｔミスマッチでハイブリダイズする場合の、非同調的ＰＣＲの間にＡＢＩ　７７００で測定された蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。
【図７ｂ】
図７ｂは、１６ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１）が、相補的な標的に対して、完全一致、単一のＧ−Ｔミスマッチ、および単一のＣ−Ｔミスマッチでハイブリダイズする場合の、非同調的ＰＣＲの間にＡＢＩ　７７００で測定された蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。
【図８】
図８は、８ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１１）および９ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１２）を用いる、本発明の１つの実施形態に従う非同調的熱サイクルプロトコール（下）によって増幅される非同調的ＰＣＲの間に、ＡＢＩ　７７００で測定された蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。
【図９】
図９は、例示的な、平均的な非同調的ＰＣＲ熱サイクルおよび平均的な従来のＰＣＲ熱サイクルの過程の間の、１６ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１）からの蛍光強度における２倍の増大を示す。各プロットは、合計４０サイクルのうちの２５〜３０サイクルからの平均である。温度プロフィールが示される。
【図１０】
図１０は、本発明の１つの実施形態に従う非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールの間、１５ｎｔ（配列番号１４）、１６ｎｔ（配列番号１）および１７ｎｔ（配列番号１５）のＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブの各々が、６個のサンプル（６８ｎｔの合成ｓｓＤＮＡ標的の１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８および１０^９の開始コピー）を検出する場合に、ＰＣＲの間に、ＰＮＡプローブを使用してＡＢＩ　７７００でリアルタイム定量測定された蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。
【図１１】
図１１は、本発明の１つの実施形態に従う非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールの間の、検出可能な幾何級数的増幅の閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）と図１０からの６８ｎｔの合成ｓｓＤＮＡ標的の開始コピー数との間の線形の相関を示す。
【図１２】
図１２は、１６ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１）、６８ｎｔの合成ｓｓＤＮＡ標的の１０^４〜１０^９の開始コピー、および図１０と同じ他の試薬を用いる従来のＰＣＲ熱サイクルプロトコールを使用する、ＰＣＲのリアルタイム定量についてのＡＢＩ　７７００からのデータの表示を示す。
【図１３】
図１３は、本発明の１つの実施形態に従う、低Ｔｍの低温のハイブリダイゼーション温度（３０〜３７℃）、短いＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いる非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールについての模式図を示す。
【図１４ａ】
図１４ａは、５’（ＧＤ）_４クランプ（ｃｌａｍｐ）プライマーを用いるＰＣＲ熱サイクルプロトコールの最初の２サイクル、続く非同調的熱サイクルプロトコールの模式的例を示す。
【図１４ｂ】
図１４ｂは、１６ｎｔのＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号１６）が、以下：（Ａ）等しいＴｍのプライマー、（Ｂ）５’（ＧＣ）_４クランププライマー、および（Ｃ）別個のＴｍのプライマー、を用いる非同調的熱サイクルプロトコールの間に、Ｋ−ｒａｓ遺伝子中のその完全一致の相補的な標的にハイブリダイズする場合に、ＰＣＲの間にＡＢＩ　７７００で測定された蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。
【図１５】
図１５ａ（上）は、等しいＴｍのプライマーおよび８つの標的サンプル（５つの区切りによって異なる量のβ−アクチンゲノム標的ｄｓＤＮＡを含む）（左から右へ：５０，０００、１０，０００、２０００、４００、８０、１６、３、０．６ｐｇ）を用いる、従来のＰＣＲ熱サイクルプロトコールの間の、ＡＢＩ　７７００で測定される蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。アンプリコンを、ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号２３）を用いるヌクレアーゼ切断法によって検出した。
図１５ｂ（下）は、別個のＴｍのプライマーおよび８つの標的サンプル（図１５ａのβ−アクチンゲノム標的ｄｓＤＮＡの０．６〜５０，０００ｐｇ）（右から左へ）を用いる、非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールの間の、ＡＢＩ　７７００で測定される蛍光の変化（ΔＲｎ）を示す。アンプリコンを、ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブ（配列番号２３）のヌクレアーゼ切断アッセイによって検出した。
【図１５ｃ】
図１５ｃは、等しいＴｍのプライマーおよび従来のＰＣＲ熱サイクルプロトコール（上）、ならびに別個のＴｍの例示的なプライマーおよび例示的な非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコール（下）を使用する、ＤＮＡ　ＦＲＥＴプローブのヌクレアーゼ切断によるＰＣＲ検出のための模式図を示す。
【図１６】
図１６は、図１５ａの従来のＰＣＲ熱サイクルのための熱サイクルプロトコールおよび図１５ｂで使用される例示的な非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールを示す。
【図１７】
図１７は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）による、ＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブを用いるＰＣＲ　ｃＤＮＡクローンの均質な検出を示す。
【図１８】
図１８は、例示的な非同調的熱サイクルプロトコールによる、２つの別個のＴｍのプライマーを用いる指数関数的増幅、続いて、ハイブリダイゼーションおよび伸長が、より高いＴｍのプライマーのみがアニーリングおよび伸長するような十分に高い温度で実行される、多サイクルの高温プロトコールを含むＰＣＲの方法についての模式図を示す。
【図１９】
図１９は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によるｓｓアンプリコンおよびｄｓアンプリコンの検出ならびに定量と共に、実験的設計、および従来のＰＣＲプロトコールと例示的な非同調的熱サイクルプロトコールとの間の比較を示す。
【図２０ａ】
図２０ａは、非同調的ＰＣＲ由来の産物の、変性条件（約５５〜６０℃、７Ｍ　尿素）下でのポリアクリルアミド（１５％）ゲル電気泳動分析およびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ染色を示す。二本鎖から分離される得られたｓｓＤＮＡは、濃度測定によって定量され、そして各レーンにおける上のバンドと下のバンドの比として示される。
【図２０ｂ】
図２０ｂは、図２０ａの実験についての、非同調的ＰＣＲ熱サイクルプロトコールを示す。
【図２１】
図２１は、例示的なＦＡＭおよびＤＡＢＣＹＬで標識されたＰＮＡ　ＦＲＥＴプローブ構造：６−ＦＡＭ−Ｇｌｕ−ＮＨ−ＰＮＡ−Ｃ（Ｏ）−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＤＡＢＣＹＬの構造を示し、ここで、ｎは、２−アミノエチルグリシン単位の数である。
【図２２】
図２２は、従来の熱サイクルプロトコール（左）、および本発明の１つの実施形態に従う非同調的な熱サイクルプロトコール（右）によって生成される、５’標識されたＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションの比較の、アレイ蛍光シグナル画像の結果を示す。

Claims (66)

1. 核酸増幅の方法であって、該方法は、以下の工程：
   第一のアニーリング温度で、第一プライマーを変性した標的核酸の第一鎖にアニーリングする工程；
   伸長温度または該第一のアニーリング温度で、プライマー伸長試薬を用いて該第一プライマーを伸長させて、二本鎖核酸を生成する工程であり、ここで、該プライマー伸長試薬が、ポリメラーゼ、ヌクレオチド５’−トリホスフェート、および緩衝液を含む、工程；
   プローブのハイブリダイゼーション温度で、検出可能なプローブを変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングする工程；
   第二のアニーリング温度で、第二プライマーを該変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングする工程であり、ここで、該第二のアニーリング温度が、該第一のアニーリング温度および伸長温度よりも低い、工程；
   該伸長温度で、プライマー伸長試薬を用いて該第二プライマーを伸長させて、二本鎖核酸を生成する工程；ならびに、
   変性温度で、該二本鎖標的核酸を第一鎖と第二鎖とに変成させる工程、
   を包含する、方法。
2. 前記検出可能なプローブが、蛍光部分およびクエンチャー部分を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記蛍光部分が、前記プローブの５’末端または３’末端に結合されており、かつ前記クエンチャー部分が、該プローブの５’末端または３’末端に結合されている、請求項２に記載の方法。
4. 前記プローブが、前記第二プライマーの伸長前に検出される、請求項１に記載の方法。
5. 前記工程が２〜５０サイクル繰り返される、請求項１に記載の方法。
6. 前記プローブが酵素学的に切断される、請求項１に記載の方法。
7. 前記プローブが酵素学的に切断されない、請求項１に記載の方法。
8. 前記標的核酸が、プラスミド、ｃＤＮＡ、アンプリコン、ゲノムＤＮＡ、制限消化物、およびライゲーション産物から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記標的核酸が単一のヌクレオチド多型を含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記第一プライマーおよび第二プライマーがＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
11. 前記第一プライマーまたは第二プライマーがＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項１に記載の方法。
12. 前記第一プライマーまたは第二プライマーが共有結合した蛍光色素を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記第一プライマーまたは第二プライマーが共有結合した移動度改変因子を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記第一プライマーまたは第二プライマーが共有結合した副溝結合剤を含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記プローブが、標的結合配列および２つの分子内塩基対形成配列を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記プローブが、ヘアピン幹構造体およびループ構造体を形成する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記分子内塩基対形成配列が前記プローブの５’末端および３’末端に位置している、請求項１５に記載の方法。
18. 前記プローブが、核酸塩基アナログ、２’−デオキシリボースアナログ、ヌクレオチド間アナログおよび光学異性体から選択される、１つ以上のヌクレオチドアナログを含む、請求項１に記載の方法。
19. 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記核酸塩基アナログが、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノ−プリン、ヒポキサンチン、プソイドウリジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、５−プロピニル−シチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザ−クアニン、２−チオ−ピリミジン、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、４−チオ−ウラシル、Ｏ^６−メチル−グアニン、Ｎ^６−メチル−アデニン、Ｏ^４−メチル−チミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチル−インドール、およびエテノアデニンから選択される、方法。
20. 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記ヌクレオチドアナログは、２’−炭素原子において、Ｃｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲまたは−ＮＲ_２で置換されている２’−デオキシリボースアナログであり、ここで各Ｒは、独立して、−Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたはＣ_５〜Ｃ_１４アリールである、方法。
21. 前記ヌクレオチドアナログがＬＮＡである、請求項１８に記載の方法。
22. 前記ヌクレオチドアナログが、２’−デオキシリボースのＬ型光学異性体である、請求項１８に記載の方法。
23. 前記プローブが、１つ以上の２−アミノエチルグリシン（ＰＮＡ）モノマー単位を含む、請求項１に記載の方法。
24. 前記プローブがＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項２３に記載の方法。
25. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記プローブは、以下の構造：
    

    

    を有し、ここで：
    Ｒは、蛍光部分であり；
    Ｌ_１およびＬ_２は、リンカーであり；
    Ｂは、核酸塩基であり；
    Ｑは、クエンチャー部分であり；そして、
    ｎは、５〜２５の間の整数である、方法。
26. Ｌ_１またはＬ_２が１つ以上のアミノ酸単位を含む、請求項２５に記載の方法。
27. Ｌ_１およびＬ_２が、独立して、アスパラギン酸、グルタミン酸およびリジンから選択される、請求項２６に記載の方法。
28. Ｌ_１が１つ以上のアスパラギン酸単位またはグルタミン酸単位であり、Ｌ_２が１つ以上のリジン単位である、請求項２７に記載の方法。
29. Ｂがウラシル、チミン、シトシン、アデニン、７−デアザアデニン、グアニン、７−デアザグアノシン、７−デアザ−８−アザグアニン、および７−デアザ−８−アザアデニンから選択される、請求項２５に記載の方法。
30. 前記蛍光部分が、フルオレセイン色素、ローダミン色素またはシアニン色素である、請求項２に記載の方法。
31. 前記クエンチャー部分が、ローダミン色素である、請求項２に記載の方法。
32. 前記クエンチャー部分が、ニトロ置換シアニン色素である、請求項２に記載の方法。
33. 請求項２に記載の方法であって、ここで、前記クエンチャー部分は、以下の構造：
    

    

    から選択され、
    ここで、Ｚは、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、Ｃ_５〜Ｃ_１４アリール、ニトロ、シアノ、スルホネート、ＮＲ_２、−ＯＲ、およびＣＯ_２Ｈから選択され、ここで、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルまたはＣ_５〜Ｃ_１４アリールである、方法。
34. 蛍光強度の変化が、標的増幅の終点において検出される、請求項２に記載の方法。
35. 蛍光強度の変化が、リアルタイムでモニターされる、請求項２に記載の方法。
36. 蛍光強度の変化が、標的配列の存在の指標として検出される、請求項２に記載の方法。
37. 前記第一のアニーリング温度が、前記第二のアニーリング温度よりも１０〜３０℃高い、請求項１に記載の方法。
38. 前記第一のアニーリング温度が、前記第二のアニーリング温度よりも１２〜１６℃高い、請求項１に記載の方法。
39. 前記第一のアニーリング温度が、６０〜７５℃である、請求項１に記載の方法。
40. 前記第二のアニーリング温度が、４５〜５５℃である、請求項１に記載の方法。
41. 前記第一プライマーが、５’末端において（ＧＣ）_ｎ配列または（ＣＧ）_ｎ配列を有し、ここで、ｎが１〜４である、請求項１に記載の方法。
42. 標識が、プリン核酸塩基の８−Ｃ、７−デアザプリン核酸塩基の７−Ｃもしくは８−Ｃ、またはピリミジン核酸塩基の５位において、１つ以上のヌクレオチド５’−トリホスフェートに共有結合している、請求項１に記載の方法。
43. 標識が、５’末端、糖、ヌクレオチド間連鎖または核酸塩基において、前記第一プライマーまたは前記第二プライマーに共有結合している、請求項１に記載の方法。
44. 標的ポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するための方法であって、該方法は以下：
    混合物を得る工程であり、該混合物は、相互にハイブリダイズして塩基対形成構造体を形成し得る、第一の標的ポリヌクレオチド鎖および第二の標的ポリヌクレオチド鎖を含み、該塩基対形成構造体は、標的配列、該第一の標的ポリヌクレオチド鎖の第一領域に相補的な第一プライマー、および該第二の標的ポリヌクレオチド鎖の第二領域に相補的な第二プライマーを含み、その結果、該第一領域および該第二領域が、該標的配列に隣接する、工程、
    第一温度において該第一プライマーを伸長させて第一複合体を形成する工程であり、該第一複合体は、該第二プライマーが該第二領域に実質的にハイブリダイズしないような条件下で該第一標的鎖にハイブリダイズする、第一の相補鎖を含む、工程、ならびに、
    該第一温度よりも低い第二温度において、該第二プライマーを伸長させて第二複合体を形成する工程であり、該第二複合体は、該第二標的鎖にハイブリダイズする第二の相補鎖を含む、工程、
    を包含する方法であり、
    ここで、該第二プライマーを伸長させる前に、検出可能なプローブが、該第二標的鎖の相補的な結合領域にハイブリダイズし、そして該ハイブリダイズしたプローブが、第二標的鎖の基準として検出される、方法。
45. 核酸増幅の方法であって、該方法は、以下の工程：
    第一のアニーリング温度で、第一プライマーを変性した標的核酸の第一鎖にアニーリングする工程；
    伸長温度または該第一のアニーリング温度で、プライマー伸長試薬を用いて該第一プライマーを伸長させて、二本鎖核酸を生成する工程であり、ここで、該プライマー伸長試薬が、ポリメラーゼ、ヌクレオチド５’−トリホスフェート、および緩衝液を含む、工程；
    第二のアニーリング温度で、第二プライマーを該変性した標的核酸の第二鎖にアニーリングする工程であり、ここで、該第二のアニーリング温度が、該第一のアニーリング温度および伸長温度よりも低い、工程；
    該伸長温度で、プライマー伸長試薬を用いて該第二プライマーを伸長させて、二本鎖核酸を生成する工程；ならびに、
    変性温度で、二本鎖標的を第一鎖と第二鎖とに変成させる工程、
    を包含する、方法。
46. 前記工程が２〜５０サイクル繰り返される、請求項４５に記載の方法。
47. 前記第一プライマーの濃度が、前記第二プライマーの濃度よりも２〜１０倍高い、請求項４６に記載の方法。
48. 請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記第二プライマーを変性した標的の第二鎖にアニーリングする工程、および前記第二プライマーを伸長させる工程が、最後の１〜２５サイクル省略され、それによって、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの混合物を生成する、方法。
49. 請求項４６に記載の方法であって、ここで、前記第二プライマーを変性した標的の第二鎖にアニーリングする工程、および前記第二プライマーを伸長させる工程が、最後の１〜１０サイクル省略され、それによって、優勢なｓｓＤＮＡを生成する、方法。
50. 前記標的がｃＤＮＡである、請求項４５に記載の方法。
51. 前記第一プライマーが蛍光色素で標識される、請求項４５に記載の方法。
52. 前記一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとの生成混合物を、アレイ上に固定化された複数のプローブにハイブリダイズさせる工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
53. 前記プローブがＦＲＥＴプローブである、請求項５２に記載の方法。
54. 標的ポリヌクレオチドの相補的なポリヌクレオチド鎖を生成するための方法であって、該方法は以下：
    混合物を得る工程であり、該混合物は、相互にハイブリダイズして塩基対形成構造体を形成し得る、第一の標的ポリヌクレオチドおよび第二の標的ポリヌクレオチドを含み、該塩基対形成構造体は、標的配列、該第一の標的ポリヌクレオチドの第一領域に相補的な第一プライマー、および該第二の標的ポリヌクレオチドの第二領域に相補的な第二プライマーを含み、その結果、該第一領域および該第二領域が、該標的配列に隣接する、工程、
    第一温度において該第一プライマーを伸長させて第一複合体を形成する工程であり、該第一複合体は、該第二プライマーが該第二領域に実質的にハイブリダイズしないような条件下で該第一標的鎖にハイブリダイズする、第一の相補鎖を含む、工程、ならびに、
    該第一温度よりも低い第二温度において、該第二プライマーを伸長させて第二複合体を形成する工程であり、該第二複合体は、該第二標的鎖にハイブリダイズする第二の相補鎖を含む、工程、
    を包含する、方法。
55. 前記第二プライマーが伸長された後に、前記第一複合体および前記第二複合体を変性させる工程をさらに包含する、請求項５４に記載の方法。
56. 前記第一プライマーを伸長させる工程、前記第二プライマーを伸長させる工程、および前記変性させる工程を１サイクル以上繰り返す工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
57. 前記変性後に、前記第一温度で第一プライマーを伸長して、一本鎖形態の前記第二標的のポリヌクレオチドと二重鎖形態の前記第一複合体とを含む混合物を形成する、請求項５５に記載の方法。
58. ２つ以上のプライマーを含む標的ポリヌクレオチドを増幅するためのキットであって、ここで、第一プライマーおよび第二プライマーが、１０〜３０℃のＴｍ差を有する、キット。
59. 前記プライマーが蛍光色素で標識される、請求項５８に記載のキット。
60. ポリメラーゼをさらに含む、請求項５８に記載のキット。
61. 検出可能なプローブをさらに含む、請求項５８に記載のキット。
62. 前記検出可能なプローブがＤＮＡであり、そして該プローブが蛍光部分およびクエンチャー部分を含む、請求項６１に記載のキット。
63. 前記検出可能なプローブがＰＮＡであり、そして該プローブが蛍光部分およびクエンチャー部分を含む、請求項６１に記載のキット。
64. 前記プローブが、核酸塩基アナログ、２’−デオキシリボースアナログ、ヌクレオチド間アナログおよび光学異性体から選択される核酸アナログを含む、請求項６１に記載のキット。
65. １つ以上の酵素学的に伸長可能なヌクレオチドをさらに含む、請求項５８に記載のキット。
66. ヌクレオチドが蛍光色素で標識される、請求項６５に記載のキット。

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